JP2005512989A

JP2005512989A - ウイルス性または真菌性の皮膚病または腫瘍疾患の処置のためのサイトカインおよびケモカインの局所使用

Info

Publication number: JP2005512989A
Application number: JP2003541736A
Authority: JP
Inventors: ニーラント，ヨーン; レーフース，クリストフ
Original assignee: メディジーン・アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2005-05-12
Also published as: WO2003039444B1; US20050008614A1; DE10154579A1; WO2003039444A3; WO2003039444A2; CA2474196A1; EP1441755A2

Abstract

本発明は、ウイルス性および／または真菌性の皮膚病および／または腫瘍疾患を処置するための局所作用性薬剤の製造における少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインの使用に関する。

Description

本発明は、ウイルス性および／または真菌性の皮膚病または腫瘍疾患を処置するための少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインの局所使用、および局所作用性医薬製剤およびその製造に関する。

サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、初めは、マクロファージまたは顆粒球を含有するコロニーの成長を刺激した因子として単離された。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球およびマクロファージの前駆細胞の成長および発生に必要である。それは、骨髄芽球および単芽球を刺激し、そしてこれら細胞の不可逆的分化を開始する。それは、赤血球および巨核球の前駆細胞の増殖に関連してエリスロポエチン（ＥＰＯ）を支持する。更に、ＧＭ−ＣＳＦは、好中球を引きつけることができる。それは、好中球およびマクロファージの抗微生物活性、酸化的代謝および食作用活性を増大させる。それは、これら細胞の細胞傷害性も増大させる。ＧＭ−ＣＳＦは、炎症性反応部位に存在する細胞（Ｔリンパ球、組織マクロファージ、内皮細胞およびマスト細胞）によって生産されるので、ＧＭ−ＣＳＦは、炎症性反応の重要なメディエーターであると考えることができる。

ＧＭ−ＣＳＦは、皮膚のランゲルハンス細胞の機能にも影響を及ぼす。これら細胞は、一次免疫反応を誘発することができない。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ４と一緒に、きわめて活性な免疫刺激性樹状細胞へと変換する。

ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ１、ＩＬ３およびＩＬ４というインターロイキンおよび顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含めた他のサイトカインと相乗的に作用する。
ＧＭ−ＣＳＦは、臨床的には、血球の不適当な成熟または減少した白血球生産を伴う疾患の全ての場合において、造血を生理学的に再構成するのに用いられる。ＧＭ−ＣＳＦのおそらくは最も重要な臨床的使用であるのは、化学療法および／または放射線療法後の生命を危うくする好中球減少の処置の場合である。ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法に誘発される血球減少、および血球減少に依存性の感染症および出血への疾病素質を処置するのに用いることもできる。これらの場合、ＧＭ−ＣＳＦは、通常は、５〜１０μｇ／ｋｇ／日の用量で、４〜６時間持続する静脈内注入によってかまたは皮下注射によって投与される。

更に、ＧＭ−ＣＳＦは、自己または同種異系の骨髄移植後に造血系を再構成するのに用いられる。この場合、治療的作用は、絶対的好中球減少の期間を減少させることのみならず、患者がほとんど僅かしか感染しないこと、抗生物質の静脈内投与を僅かしか与えられないこと、およびより短い期間入院することに基づく。

現在のところ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ２、ＩＬ１２若しくはＩＬ１８などのサイトカイン、そして更には、インターフェロンＩＦＮγおよびＩＦＮαが、腫瘍疾患の分野における種々の適応に用いられているしまたは調べられている。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、免疫系を刺激するためにいろいろな方法で抗原と組み合わせて、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ発現性腫瘍細胞の形で、または例えば、腫瘍抗原に由来するペプチド抗原の先行または同時投与の形で用いられている。これら治療的形態は、平行して投与される抗原のためのアジュバントのタイプとして機能するＧＭ−ＣＳＦに基づいている（Lawson D, Kirkwood JM (2000) Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: another cytokine with adjuvant therapeutic benefit in melanoma J Clin Oncol 18(8):1603-5）。

本発明の目的は、したがって、サイトカインの更に別の用途を見出すことであった。
ここで、驚くべきことに、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインおよび／またはケモカインの局所使用は、ウイルス性および／または真菌性の皮膚病、更には、腫瘍疾患を処置するのに適当であるということを発見した。

本発明は、したがって、ウイルス性および／または真菌性の皮膚病および／または腫瘍疾患を処置するための局所用薬剤を製造するための少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインの使用に関する。

異なったサイトカインおよび／またはケモカインの間に認められる相乗的作用のために、２種類、３種類または３種類をも超えるサイトカインおよび／またはケモカインが、特に、３種類、またはとりわけ、２種類のサイトカインおよび／またはケモカインが用いられて、同時にまたは時差的に（in a chronologically staggered manner）同化される
(assimmilated)ならば、それは特に好都合である。特に好ましい組合せは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳまたはＭＩＰ１αと、ＩＬ４、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＦＮγまたはＴＮＦαである。

別の好ましい態様において、この薬剤は、腫瘍抗原またはウイルス抗原のような、本質的には抗原作用を有するいずれの成分も含まない。抗原作用を有する成分は、患者に免疫応答を誘発することがありうる抗原またはそれらの部分を意味すると理解される。本発明の意味の範囲内で、「本質的には抗原作用を有さない成分」という用語は、患者が処置を危うくする免疫反応を有する可能性が一般的に除外されうるほど僅かな抗原作用を有する成分を意味すると理解される。

「サイトカイン」という用語は、体液性調節因子として、好ましくは、ナノモル〜ピコモル濃度で機能する可溶性タンパク質およびペプチドの大グループについて普遍的に用いられる名称である。これらタンパク質およびペプチドは、正常なまたは病理学的条件下における個々の細胞または組織の機能的活性をモジュレーションする。それらは、更に、細胞間の相互作用を直接的に媒介し、細胞外環境において選択的に生じる過程を調節する。「ケモカイン」は、サイトカインのサブグループである。それらは、特に、走化性によって細胞に作用する比較的小さいタンパク質である。

サイトカインという用語には、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｆｌｔ３およびＴＮＦαが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦは、特に好ましいサイトカインである。ケモカインという用語には、例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＩＰ１γ、ＭＩＰ１δ、ＭＩＰ２、ＭＩＰ２α、ＭＩＰ２β、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＭＩＰ４、ＭＩＰ５、ＭＣＰ１、ＭＣＰ１β、ＭＣＰ２、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、ＭＣＰ５、ＭＣＰ６、６ｃｙｋｉｎｅ、Ｄｃｃｋ１および／またはＤＣＤＦが含まれる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＩＰ１αは、特に好ましいケモカインである。（サイトカインおよびケモカインに関して：Cytokines Online Pathfinder Encyclopedia, Horst Ibelgauft’s Hypertext Information Universe of Cytokines, Version 4.0, August 1999; Website: http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi）。更に、本発明の文脈中において、サイトカインおよびケモカインという用語は、これらサイトカインおよびケモカインの変異型、そして更には、これらサイトカインおよびケモカインを含有する融合タンパク質を意味するとも理解される。それによって、これは、例えば、点突然変異、挿入および欠失、更には、他のポリペプチドとの、例えば、タグと称されるもの、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭｙｃタグまたはＧＦＰタグとの融合、または他のポリペプチドの機能性ドメイン、例えば、免疫グロブリンまたは他のサイトカイン若しくはケモカインのドメインとの融合を包含する。

「局所使用」は、活性化合物の皮膚への外用を意味すると理解される。好ましくは、活性化合物は、軟膏剤、ゲル剤、硬膏剤または別の皮膚適合性製剤の形で存在する。活性化合物は、好ましくは、皮膚変化および／または皮膚病が存在する領域に局所適用される。

ウイルス性皮膚病は、ウイルスによって誘発されるまたは引き起こされるおよび／またはウイルス感染に関連している皮膚病を意味すると理解される。これらには、例えば、少なくとも一つの乳頭腫ウイルス、特に、ヒト乳頭腫ウイルス、例えばＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４６、４７、４８、４９、５０、５６および５８などによって引き起こされる皮膚いぼ、性器いぼ、肛門性器いぼまたは粘膜いぼなどの皮膚病（表１を参照されたい）が含まれる。それらには、少なくとも一つのヘルペスウイルスによって、特に、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）１、ＨＨＶ２、ＨＨＶ３、ＨＨＶ４、ＨＨＶ７およびＨＨＶ８によって引き起こされる疾患、更には、水痘・帯状疱疹、すなわち、口唇ヘルペス、カポージ肉腫、水痘および／または帯状疱疹も含まれる。

ＧＭ−ＣＳＦの局所適用によって処置することができる腫瘍疾患は、例えば、皮膚の腫瘍、例えば、黒色腫または急性ケラチノーシス、生殖管および肛門管の新形成(neoplasias)、例えば、頚部上皮内新形成、肛門上皮内新形成または陰茎上皮内新形成である（表２も参照されたい）。

真菌性皮膚病は、真菌感染によって引き起こされる皮膚病を意味すると理解される。これらには、外性器および内性器を含めた、皮膚、皮膚付属器および粘膜の疾患が含まれる。それらは、特に、皮膚真菌症（表３を参照されたい）、および真菌性皮膚病を生じることがありうる他の真菌症（表４および表５を参照されたい）であると理解される。

本発明によれば、薬剤は、概して、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインを、少なくとも一つの適当な添加物質および／または補助物質と接触させることによって、例えば、混合または溶解によって製造される。したがって、本発明は、更に、局所作用性薬剤を製造する方法であって、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインを、少なくとも一つの補助物質と、具体的には、ヒト血清アルブミン、ＣｐＧまたは酸化型グルタチオンと接触させる方法に関する。このサイトカインおよび／またはケモカインは、好ましくは、組換えによって、当業者に知られている方法を用いて製造される。

したがって、例えば、サイトカインおよび／またはケモカインを組換えによって製造するのに適当である発現構築物であって、しかもサイトカインおよび／またはケモカインをコードしている核酸と、更には、好ましくは、細菌、例えば、大腸菌（E. coli）中、または酵母などの真核細胞中、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）またはＳ．ポンベ（S. pombe）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）中、または高等真核細胞中、例えば、昆虫細胞またはヒト細胞中での発現に適しているプロモーターを含有する発現構築物を用いることが可能である。その後、サイトカインおよび／またはケモカインは、自然または非自然条件下において当業者に知られている方法を用いて精製することができる。

工業薬剤学において慣例である方法を用いて、一定含有量の少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインを有する薬剤を製造し、そしてこれら薬剤を本発明による用途で使用する。このためには、活性化合物を、好ましくは、適当な薬学的に許容しうる補助物質および担体物質と一緒に処理して、いろいろな適応症および適用部位に適している剤形にする。これに関して、薬剤は、各々の場合に望まれる放出速度、例えば、急速流出（rapid flooding）および／または遅延または徐放作用が達せられるように製造することができる。

混合相または両親媒性エマルジョン系（油／水〜水／油混合相）の慣例的な乳剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、そして更には、リポソームおよびトランスファーソーム（transfersomes）、または硬膏剤、好ましくは、軟膏剤およびクリーム剤、特に好ましくは、軟膏剤は、皮膚または粘膜への慣用的な適用の例として引用することができる。活性化合物は、好ましくは、皮膚または粘膜の変化および／または疾患が存在する領域に局所適用される。

製造することができる更に別の局所適用可能な形は、パスタ剤、散剤および液剤である。コンシステンシーを与える基剤として、パスタ剤は、しばしば、疎水性および親水性の補助物質を含むが、しかしながら、好ましくは、きわめて多い固形分を有する疎水性補助物質を含む。それらの分散性および流動性および滑性（glidability）を増加させ、そして更には、凝集物を防止するために、散剤または局所適用可能な散剤は、例えば、コムギデンプンまたはコメデンプンなどのデンプンタイプ、火炎分散二酸化ケイ素または珪土も含有することができ、これらは、希釈剤としても役立つ。

皮膚および／または粘膜への既知の用途に加えて、次の特別な調剤は、好ましくは、局部、局所または部位的に投与することができる薬剤、すなわち、生殖器、膣または直腸に、特に、生殖器および膣に適用することができる乳剤、クリーム剤、軟膏剤、発泡錠剤または坐剤として用いるのに適している。直腸用カプセル剤は、ゼラチンまたは他の担体物質を基剤として製造することもできる。適当な坐剤基剤の例は、Witepsol（登録商標）、Massa Estarium（登録商標）、Novata（登録商標）などの水素化脂肪、ヤシ油、グリセロール／ゼラチン組成物、グリセロール／石けん状ゲルおよびポリエチレングリコールである。

各々の場合に適している剤形は、製剤の規格および手順に当てはめて、当業者に知られている薬学的／物理的原則に基づいて製造することができる。
適当な補助物質および／または担体物質の例は、適当な基剤を生じるためのゲル化剤としてのアルギン酸ナトリウム、またはグアーガムまたはキサンタンガムなどのセルロース誘導体；水酸化アルミニウムまたはベントナイトなどの無機ゲル化剤（チキソトロープゲル化剤と称されるもの）；Carbopol（登録商標）、ポリビニルピロリドン、微結晶性セルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどのポリアクリル酸誘導体である。更に、両親媒性の低分子量およびより高分子量の化合物、そして更には、リン脂質が適している。ゲル剤は、例えば、低分子量および高分子量のパラフィン炭化水素およびワセリンの混合物を基剤として、水性ヒドロゲルとしてかまたは疎水性オルガノゲルとして存在することができる。親水性オルガノゲルは、例えば、高分子量ポリエチレングリコールを基剤として製造することができる。これらゼラチン状の形は、洗浄除去することができる。しかしながら、好適であるオルガノゲルは、疎水性オルガノゲルである。特に好ましくは、石油ゼリー、ロウ、オレイルアルコール、プロピレングリコールモノステアラートおよびプロピレングリコールモノパルミトステアラートなどの疎水性補助物質および添加剤である。更に、色調整の目的には、染料、例えば、黄色および／または赤色の酸化鉄および／または二酸化チタンを加えることが可能である。

用いることができる乳化剤の例は、アニオン、カチオンまたは中性の界面活性剤、例えば、アルカリ石けん、金属石けん、アミン石けん、硫化およびスルホン化化合物、逆性石けん、高脂肪アルコール、ソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタンの部分脂肪酸エステル、例えば、ラネットタイプ（lanette types）、羊毛脂、ラノリン、および油／水および／または水／油エマルジョンを生じるための他の合成品である。適当な補助物質の他の例は、Triton Ｘ−１００、Tween、デオキシコール酸ナトリウムなどのイオンまたはアニオン系の洗浄剤、そして更には、ポリエチレングリコールまたはグリセロールなどのポルオール；糖類、例えば、スクロースまたはグルコース；リポ多糖類；アミノ酸などの双性イオン化合物、例えば、グリシン、または特に、タウリンまたはベタイン；または脂質である。

ワセリン、天然または合成のロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、例えば、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド、パラフィンまたは植物油、水素化ヒマシ油またはヤシ油、ラード、合成脂肪、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸およびステアリン酸に基づくもの、例えば、Softisan（登録商標）、またはトリグリセリド混合物、例えば、Miglyol（登録商標）は、軟膏剤、クリーム剤または乳剤を製造するための脂肪および／または油状および／またはロウ質の成分の形で脂質として用いることができる。

製剤のｐＨを調整するためには、例えば、適当な有機または無機緩衝剤、浸透活性な酸およびアルカリ溶液、例えば、塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液または炭酸水素ナトリウム、そして更に、緩衝液系、例えば、クエン酸、リン酸緩衝液、Tris 緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）またはトリエタノールアミンを用いることが可能である。概して、緩衝液の選択は、望まれる緩衝液モル濃度に依存する。

安定性を増加させるためには、更に、安息香酸メチルまたは安息香酸プロピル（パラベン）、ソルビン酸などの保存剤；タンパク質、例えば、ウシ、ヒトまたは合成の血清アルブミン；および／またはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸、ペプスタチンＡ、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのプロテアーゼ阻害剤を加えることが可能である。

補助物質は、浸透増進剤（penetration amplifiers）、例えば、ラウリン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ミリスチン酸エチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチルおよび／またはオレイン酸エチルなどの疎水性エステル、特に、ミリスチン酸イソプロピルでもありうる。これに関連して、「疎水性」という用語は、水への溶解度が、多くとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、特に、多くとも約０．１ｍｇ／ｍｌである化合物に当てはまると理解される。

他の適当な補助物質は、抗原の免疫原性（感作）作用を増幅するアジュバントである。これに関して、免疫原性作用を達成させる抗原は、特に、疾患の焦点における皮膚で発現される、ウイルス、真菌および／または腫瘍に特異的な抗原であるということが注目されるはずである。適当なアジュバントは、特に、トール様レセプター（toll-like receptors）を活性化させるアジュバント、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Chen Y et al. (2001) Int. Immunol. 13, 1013-20）、リポ多糖類（Alexander C and Rietschel ET (2001) J. Endotoxin Res. 7, 3, 167-202）、Calmette-Guerin 桿菌細胞壁骨格（Matsumoto M et al (2001) Int. Immunopharmacol. 1, 8, 1559-69）、そして更に、スーパー抗原（Osanto S et al (2001) Infect. Immun. 69, 11, 6633-42）、およびＣＴＬＡ−４のシグナル作用を阻害する物質（ＷＯ００／３２２３１号、ＷＯ９７／２０５７４号）のようなアジュバントである。他の適当なアジュバントの例は、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、酸化型グルタチオン、二本鎖ＲＮＡおよび Iscom である。

皮膚を局所刺激する物質を補助物質として用いることは、それによって、サイトカインおよび／またはケモカインの作用を増加させるので、これも好ましい。例えば、ＤＭＳＯは、これら物質の内の一つである。

本発明により、薬剤は、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインと、緩衝液または塩溶液および／または軟膏基剤と、そして更に、適当なところでは、少なくとも一つの適当な添加剤および／または補助物質を含む製剤として存在することもできる。

製剤という用語は、これらサイトカインおよび／またはケモカインの溶液または懸濁液の形の組成物を意味すると理解され、これに関して、製剤は、本質的には、その製剤を約４℃で比較的長時間貯蔵した場合でさえも、成分の沈降を認めることができない均一な製剤である。

特に好ましくは、存在する一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数のケモカインが、天然および／または活性のままである製剤である。これらタンパク質の活性は、個々のタンパク質各々の場合において、適当な活性試験で示すことができる。

塩は、製剤の代表的な成分として、概して、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、好ましくは、ハロゲン化物またはリン酸塩、特に、アルカリ金属ハロゲン化物、とりわけ、ＮａＣｌおよび／またはＫＣｌである。ＮａＣｌの使用は、特に好適である。

好ましい軟膏基剤の例は、油中水軟膏剤、例えば、セチルステアリルアルコール、羊毛脂アルコールおよびワセリンを含む羊毛脂アルコール軟膏剤、または水中油軟膏剤（親水性軟膏剤）、例えば、乳化性セチルステアリルアルコール、半流動パラフィン油およびワセリンを含むものである。

特に好ましくは、前記の製剤を、吸蔵のための、すなわち、製剤を皮膚、粘膜および皮膚付属器に適用した後に、被処置部位を被覆するための手段と組み合わせて用いる。これは、例えば、硬膏剤またはスプレードレッシングの形で創傷を被覆する手段によって行うことができる。

結果として、本発明は、更に、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインと、そして更に、吸蔵手段を含む処置用キットに関する。
図面および次の実施例は、本発明および本発明の他の好ましい態様および特徴を、それらに制限することなく明らかにするものである。

実施例：１ＧＭ−ＣＳＦ含有製剤
１．製剤の説明
各々の場合において、１００μｇ／ｇのヒトリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（Sandoz AG, Basel, Switzerland 製の Leucomax ４００）を含有する次の製剤混合物を製造した。

軟膏剤の製造：
軟膏剤は全て、無菌条件下（層流、滅菌グローブ、マウスガード等）で製造した。

４３４００と称される２０ｇの軟膏剤を、次のように製造した：
最初に、羊毛脂アルコール軟膏剤を製造するために、１ｇのセチルステアリルアルコール、１２ｇの羊毛脂アルコールおよび１８７ｇの白色ワセリンを、ガラスビーカー中に秤量し、７０℃で溶融させた後、絶えず撹拌しながら室温に冷却した。Leucomax ４００を、１ｇの７０％グリセロール溶液中に溶解させた（５ｘ４００μｇ／ｇ容器＝２０００μｇ／５ｇ）。次に、１５ｇの羊毛脂アルコール軟膏剤を乳鉢に入れ、その後、５ｇの Leucomax／グリセロール溶液（４００μｇ／ｇ）を加え、均一に混合した。１ｇの量の軟膏剤を、各々の場合に容器中に小分けした。

４３５００という名称を有する２０ｇの軟膏剤を、次のように製造した：
最初に、羊毛脂アルコール軟膏剤を製造するために、１ｇのセチルステアリルアルコール、１２ｇの羊毛脂アルコールおよび１８７ｇの白色ワセリンを、ガラスビーカー中に秤量し、７０℃で溶融させた後、絶えず撹拌しながら室温に冷却した。Leucomax ４００を、１ｇのきわめて純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させた（５ｘ４００μｇ／ｇ容器＝２０００μｇ／５ｇ）。１５ｇの羊毛脂アルコール軟膏剤を乳鉢に入れ、その後、５ｇの Leucomax／ＤＭＳＯ溶液（４００μｇ／ｇ）を加え、均一に混合した。１ｇの量の軟膏剤を、各々の場合に容器中に小分けした。

３４６００という名称を有する２０ｇの軟膏剤を、次のように製造した：
最初に、７０ｇの白色ワセリン、７０ｇの半流動パラフィン油および６０ｇの乳化剤セチルステアリルアルコールを、ガラスビーカー中に秤量し、７０℃で溶融させた後、絶えず撹拌しながら室温に冷却した。Leucomax ４００を、１ｇの７０％グリセロール溶液中に溶解させた（５ｘ４００μｇ／ｇ容器＝２０００μｇ／５ｇ）。１５ｇのこの親水性軟膏剤を乳鉢に入れ、その後、Leucomax／グリセロール溶液（４００μｇ／ｇ）を加え、均一に混合した。１ｇの量の軟膏剤を、各々の場合に容器中に小分けした。

１０１０１という名称を有する２０ｇの軟膏剤を、次のように製造した：
最初に、１００ｇのポリエチレングリコール３００および１００ｇのポリエチレングリコール１５００を、６０〜７０℃で撹拌しながら溶融させた後、その混合物が冷却するまで撹拌した。Leucomax ４００を、１ｇの７０％グリセロール溶液中に溶解させた（５ｘ４００μｇ／ｇ容器＝２０００μｇ／５ｇ）。１５ｇのこのポリエチレングリコール混合物を乳鉢に入れ、その後、Leucomax／グリセロール溶液（４００μｇ／ｇ）を加え、均一に混合した。１ｇの量の軟膏剤を、各々の場合に容器中に小分けした。

２． ^１２５Ｉ標識ヒトＧＭ−ＣＳＦを含有する製剤の製造
^１２５Ｉ標識ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＮＥＮ Life Sciences, Cologne, Germany，^１２５Ｉ−ＰＡＣＡＰ２７，ＮＥＸ２９４，ロット番号ＧＣＢ１５００）を検定した。実験の開始時に、比活性は５．２μＣｉ（１９２．４ｋＢｑ）であった。このタンパク質は、凍結乾燥した形で得、７０μｌの蒸留水中に入れた（３５μｌ中にそれを入れた場合、均一溶液は得られなかった）。得られたその溶液の比活性は、０．０７４μＣｉ／μｌ（２．７５ｋＢｑ／μｌ）であった。

約２６０ｍｇの３種類の異なったＧＭ−ＣＳＦ製剤を、４８ウェル細胞培養皿に入れた。１５μｌの^１２５Ｉ標識ＧＭ−ＣＳＦを加え、製剤と一緒に室温でスパチュラを用いて混合した。３〜５ｍｇのその混合物を、シンチレーション容器に移し、２ｍｌの Packard Microscint−２０を加えた。それら試料を６０℃で数分間加熱後、もう一度混合した。その後、それらをシンチレーション計数計で測定した（表７を参照されたい）。混合された製剤を、Eppendorf 管に移し、４℃で貯蔵した。

対照として、２μｌの^１２５Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦ溶液（０．０７４μＣｉ／μｌ，２．７５ｋＢｑ／μｌ）を、２ｍｌの Packard Microscint−２０中で直接的に測定した。

対照を基準として、この方法は、理論的に予想される活性の２３％を測定するのに用いることができるにすぎないということが理解されうる。

この実験系列は、ＧＭ−ＣＳＦ（この場合、^１２５Ｉ標識ＧＭ−ＣＳＦとして存在する）の水溶液を全３種類の製剤中に導入することが可能であったということを明らかにする。個々の製剤の平行分析が、僅かな相違を示すにすぎないという事実より理解されうるように、記載された製剤中に^１２５Ｉ標識ＧＭ−ＣＳＦを均一に導入することは可能である。異なった製剤において、理論上、初めに加えられたＧＭ−ＣＳＦの１１．８〜１７．６％の量を検出することが可能であったが、そのシステムによって測定したところ、最大検出可能量は２３％であった。

実施例２：異なったＧＭ−ＣＳＦ製剤による皮膚浸透
異なったＧＭ−ＣＳＦ製剤の皮膚に浸透する能力を、in vitro 皮膚浸透検定によって測定した（例えば、Bronaugh RL et al., (1982) Toxicol Appl Pharmacol 15;62(3): 481-488; Bronaugh RL, (2000) Ann N Y Acad Sci 919: 188-191 を参照されたい）。

美容手術による女性腹部由来の皮膚試料を用いた。角質層、表皮および真皮部分が含まれた皮膚ディスク（４５０μｍ）を、皮膚採取器で調製した。１０ｍｍの直径を有する皮膚ディスクを打ち抜き、拡散セル中に入れた。これら皮膚片を、≦−１５℃において顕微鏡スライドの間に凍結させた。皮膚ディスクの厚みは、スライド固定台の間で測定した。膜標品は、皮膚への損傷を伴うことがありうるので、皮膚膜の完全性を顕微鏡検査した後、膜を拡散セル中に装着した。

用いられた拡散セルは、ＢＳＬＢＩＯＳＥＲＶＩＣＥ，Planegg, Germany によって提供されたものであった。このセルを、皮膚表面の水平暴露のためのフロースルー拡散用のＰＴＦＥドナーおよびＰＴＦＥアクセプターについて設計する。暴露される皮膚面積は１９．６３ｍｍ^２である。これら拡散セルの温度は、一定に保持した。マルチチャンネル蠕動ポンプを、拡散セルのレセプター部分に連通し、プログラム可能なフラクションコレクターを、試料を採取するのに用いた。

凍結した皮膚を、ＰＢＳで洗浄し、アクセプター部分に置いた。拡散セルを、レセプター部分で密閉し、そして水平位置において、脱気されたアクセプター液（０．１％ＢＳＡおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足された生理学的リン酸緩衝化塩化ナトリウム溶液（ＲＴ，ｐＨ７．５±０．３）；脱気された）で少なくとも１時間平衡させた（０．６ｍｌ／時の流速および３２±１℃の温度への調整）。その後、実施例１．２に述べられた^１２５Ｉ標識ＧＭ−ＣＳＦ製剤の一定量を、スパチュラを用いて皮膚表面に塗布した。アクセプター液の採取を、３６時間開始し、採取用容器を６時間毎に取り替えた。連続測定の最後に、残りの軟膏剤を、脱脂綿棒を用いてドナー部位から拭き取った。拡散セルを取り外した後、皮膚膜を脱脂綿棒でもう一度拭き取り、残りの未浸透軟膏剤残留物を全て、シンチレーション容器中に集めた。

各２００μｌの採取された画分を、２ｍｌのシンチレーション液（Microscint^ＴＭ２０，Canberra Packard, Dreieich, Germany）と混合した。集められた未浸透軟膏剤残留物を、４ｍｌのシンチレーション液と混合し、超音波水浴中において６０℃で少なくとも３０分間インキュベートした。暴露された皮膚ディスクを、５００μｌの組織溶解剤（Solvable^ＴＭ，Packard）と一緒に５０℃で少なくとも３時間インキュベートした。室温に冷却後、５０μｌの溶解した皮膚を、４ｍｌのシンチレーション液に加えた。これら試料全ての放射能を、シンチレーション計数計において（ｃｐｍで）測定し、そして活性（μＣｉ）として表される［^１２５Ｉ］−ＧＭ−ＣＳＦの皮膚、未浸透軟膏剤残留物およびアクセプター液における分布を、次の式にしたがって決定した。

Ｐ値は、不対ｔ検定を用いて計算した。記載された実験において、適用された［^１２５Ｉ］−ＧＭ−ＣＳＦの１．４〜３．７％が、暴露された皮膚層を介してアクセプター液中に３６時間以内に浸透したということが示された。これに関連して、製剤４３６００は、最低の浸透を与えることが判明したが、４３４００は、最高の浸透を与えた。実験終了後、［^１２５Ｉ］−ＧＭ−ＣＳＦの適用量の２．６％（４３４００）、２．２％（４３５００）および３．５％（４５６００）が皮膚で検出された。皮膚におけるＧＭ−ＣＳＦと、皮膚を介して移動したＧＭ−ＣＳＦの双方が、治療的に活性であると仮定するならば、適用されたＧＭ−ＣＳＦの＞６％は、製剤４３４００の場合に活性であるが、製剤４３５００の場合、＜５％は活性であり、製剤４３６００の場合、＜４％は活性である。

実施例３：異なったＧＭ−ＣＳＦ製剤の安定性
異なったＧＭ−ＣＳＦ製剤の安定性を調べるために、実施例１．１に述べられた製剤約１０ｍｇを、滅菌条件下において秤量し、４０℃で７日間インキュベートした。次に、５μｌ／ｍｇのＤＭＳＯクリーム剤を、そのクリーム剤中に存在したＧＭ−ＣＳＦを抽出するために、試料に加えた。それら試料を充分に（渦巻）混合し、ＲＴで約２時間インキュベートしたが、試料は、約３０分毎の渦巻によってもう一度混合した。それら試料を短時間遠心分離し、そしてそれらを更に処理するまで４℃で貯蔵した。

単球を、既知の方法（例えば、Current Protocols in Immunology, Editors Coligan JE et al. 1999, pages 7.32.1-4 を参照されたい）を用いて単離した。次に、それらを培地（ＲＰＭＩ−Gibco, Paisley, Scotland−５％ＦＣＳ含有）中に取って、１７５０００〜２２００００個／５００μｌの細胞濃度が得られるようにした。ヒトリコンビナントＩＬ４（Pharmingen, Heidelberg, Germany）を、２倍濃度で加える（５００単位／ｍｌ最終濃度）。抽出された軟膏剤試料を、ＲＴまで平衡させ；３０分後、それらを充分に渦巻混合し、短時間遠心分離した。

各々の場合において、最初に、１ｍｌの培地（５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ）を、４８ウェルプレートの各ウェル中に入れ、その後、２．５μｌのクリーム剤抽出物、または対照として０．５μｌのヒトリコンビナントＧＭ−ＣＳＦ（０．２５％抽出物または５００単位のＧＭ−ＣＳＦに相当する）を加えた。各々のこれら出発混合物から、５００μｌの導入された培地がそれぞれ入ったウェル中に、それぞれより高い濃度の混合物であるその５００μｌを、それぞれピペッティングすることによって、希釈列を調製した。次に、この希釈列の外観は、表８に示される通りであった。

その後、５００μｌの単球懸濁液を、各ウェルに加えた。それらプレートを３７℃で７日間インキュベートした後、細胞を採取し、そしてマウス抗ヒトＣＤ１ａ（１：５０，Pharmingen, Heidelberg, Germany）および抗マウスＩｇＧＦＩＴＣ（３／５０，Sigma, Deisenhofen, Germany）で染色した。最後に、これら細胞のＣＤ１ａ免疫染色を、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Calibur，Beckton Dickenson, Hamburg, Germany 製）において分析した。

５００μｌの培地および２．５μｌのヒトリコンビナントＧＭ−ＣＳＦから構成される混合物を正対照として用い、ＧＭ−ＣＳＦ不含の５００μｌの培地を負対照として用いた。

安定性実験は、４０℃で７日後に、製剤４３６００が、製剤４３４００の場合より顕著に大きいＧＭ−ＣＳＦ活性を有したということを示した（図２を参照されたい）。製剤１０１０１は、そのインキュベーション時間後でも、ＧＭ−ＣＳＦ活性がほとんど残っていなかった（図３を参照されたい）。

図１は、３種類のＧＭ−ＣＳＦ製剤についてフロースルー拡散セル中で行った皮膚浸透実験の図式分析を示す。適用された［^１２５Ｉ］−ＧＭ−ＣＳＦの３６時間後のレセプター液（透過）、皮膚および軟膏剤残留物における（全活性の％での）分布を、製剤に対してプロットする。図２は、製剤４３６００および４３４００について、ＧＭ−ＣＳＦと比較して、０時および４０℃で７日間インキュベート後に行われた安定性実験の図式分析を示すが、増加量のＧＭ−ＣＳＦが、一定量のＤＭＳＯ軟膏剤抽出物に加えられ（Ｘ軸、対数でのＧＭ−ＣＳＦ含有軟膏剤抽出物の％および加えられたＧＭ−ＣＳＦの単位／ｍｌ）、単球の活性化は、それらのＣＤ１ａ発現（Ｙ軸）によって測定されている。図３は、製剤１０１０１について、０時および４０℃で７日間インキュベート後に行われた安定性実験の図式分析を示すが、増加量のＧＭ−ＣＳＦが、一定量のＤＭＳＯ軟膏剤抽出物に加えられ（Ｘ軸、対数％）、単球の活性化は、それらのＣＤ１ａ発現（Ｙ軸）によって測定されている。

Claims

ウイルス性および／または真菌性の皮膚病および／または腫瘍疾患を処置するための局所作用性薬剤を製造するための少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインの使用。
薬剤が、３種類を超える、特に、３種類、好ましくは、２種類のサイトカインおよび／またはケモカインを含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
薬剤が、本質的には、抗原として作用する成分を含まないことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の使用。
サイトカインおよび／またはケモカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｆｌｔ３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＩＰ１γ、ＭＩＰ１δ、ＭＩＰ２、ＭＩＰ２α、ＭＩＰ２β、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＭＩＰ４、ＭＩＰ５、ＭＣＰ１、ＭＣＰ１β、ＭＣＰ２、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、ＭＣＰ５、ＭＣＰ６、６ｃｙｋｉｎｅ、Ｄｃｃｋ１および／またはＤＣＤＦ、特に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳおよび／またはＭＩＰａαであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
ウイルス性皮膚病および／または腫瘍疾患が、少なくとも一つの乳頭腫ウイルスによって、具体的には、ＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３４、３６、３７、３８、４６、４７、４８、４９、５０、５６または５８などの少なくとも一つのヒト乳頭腫ウイルスによって、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘・帯状疱疹ウイルスまたはヒトヘルペスウイルス１、２、３、４、７または８などの少なくとも一つのヘルペスウイルスによって引き起こされることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
ウイルス性皮膚病が、いぼ、性器いぼ、乳頭腫ウイルスによって引き起こされる皮膚または粘膜の良性腫瘍、例えば、足底ゆうぜい、尋常性ゆうぜい、青年性扁平ゆうぜい、ゆうぜい状表皮異形成、尖圭コンジローム、扁平コンジローム、ボーエノイド・パピュローシス、喉頭または粘膜の乳頭腫、局所性上皮肥厚、口唇ヘルペス、カポージ肉腫、水痘および／または帯状疱疹であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
腫瘍疾患が、ボーエン病、陰茎、肛門および外陰部の癌、頚部癌、喉頭癌および／または舌癌であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
真菌性皮膚病が、皮膚真菌症、クロモブラストミコーシス、スポロトリクス真菌症、真正菌腫または全身性真菌症であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
局所作用性薬剤を製造する方法であって、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインを、少なくとも一つの補助物質と、特に、ヒト血清アルブミン、ＣｐＧまたは酸化型グルタチオンと接触させることを特徴とする方法。
サイトカインおよび／またはケモカインを、組換えによって製造することを特徴とする請求項９に記載の方法。
局所作用性医薬製剤であって、少なくとも一つのサイトカインおよび／またはケモカインと、そして更に、セチルステアリルアルコール、ワセリンおよび羊毛脂アルコールまたはパラフィン油を含む医薬製剤。
処置用キットであって、請求項１１に記載の製剤および吸蔵手段を含む処置用キット。
吸蔵手段が、硬膏剤またはスプレードレッシングであることを特徴とする請求項１２に記載の処置用キット。