RO118299B1 - Polipeptida trombopoietina, secventa adn care o codifica, procedeu pentru prepararea polipeptidei trombopoietine si compozitie farmaceutica cu aceasta - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la o polipeptida trombopoietina, care prezinta activitate de stimulare sau crestere a productiei de plachete in vivo sau de a spori proliferarea si diferentierea celulelor megacariocite, la secventa DNA care o codifica, la un procedeu pentru prepararea polipeptidei trombopoietine si la o compozitie farmaceutica cu aceasta polipeptida trombopoietina, care se administreaza in tratamentul unor disfunctii ale plachetelor sanguine.

Description

Invenția se referă la o polipeptidă trombopoietină, la o secvență DNA care o codifică, la un procedeu pentru producerea unei polipeptide trombopoietine și la o compoziție farmaceutică cu această proteină trombopoietină destinate tratamentului unor disfuncții ale plachetelor sanguine, deoarece polipeptida trombopoietină are o activitate de stimulare sau creș5 tere a producției de plachete in vivo într-un mod specific sau de a spori proliferarea și diferențierea celulelor megacariocite progenitoare.

Se cunoaște faptul că megacariocitele sunt celule multinucleate mari bogate în citoplasmă care produc plachetele sanguine și pot fi găsite, în principal, în măduva osoasă. Megacariocitele sunt originare din sistemul celular pluripotent hematopoietic din măduva 10 osoasă. Un stern celular pluripotent primitiv se diferențiază în celule megacariocite progenitoare care sunt trecute spre linia megacariocitică. Celulele progenitoare megacariocite proliferează și se diferențiază în megacariocite. Megacariocitele suferă suplimentar poliploidizare și maturare citoplasmatică și, în final, eliberează fragmentele lor citoplasmatice anucleate denumite plachete, în circulație. în medie de la o celulă megacariocitică matură se formează 15 două până la patru mii de plachete. Mecanismul formării plachetelor este încă neclar în numeroase puncte, se consideră că megacariocitele sunt localizate de obicei pe suprafața albuminală a sinusului endotelial în măduva osoasă și produc procese citoplasmice care se extind în sinusoid unde ele suferă fragmentarea plachetelor.

Există numeroase puncte neclare în legătură cu mecanismul pentru generarea pla20 chetelor, deși este probabil că megacariocitele sunt prezente local în stratul dermic al pielii sinusului venos al măduvei osoase și că citoplasmă vine prin stratul dermal spre a produce o proiecție asemănătoare unui cordon pe perete intern al sinusului venos prin care se eliberează plachetele.

S-a sugerat că există o funcție specifică pentru producerea și controlul producerii pla25 chetelor prin hematopoieza megacariocitară. La oamenii și animalele sănătoase, numărul efectiv al plachetelor se menține deși este cunoscut că la administrarea unui anticorp antiplachetar, de exemplu la animalele sănătoase, duce la descreșterea promptă a numărului de plachete, apoi ele cresc temporar la un număr mai mare decât cel obișnuit și ,în final, ele revin la un nivel normal. De asemenea, în domeniul clinic este cunoscută o scădere a numă30 rului plachetelor trombocitopenice și trombocitozei chiar când numerele eritrocitelor și leucocitelor sunt la un nivel normal.

întâmplător, cea mai importantă funcție a unei plachete este producerea unui trombus într-un mecanism homeostatic. Dacă mecanismul hemostatic nu funcționează corespunzător datorită unei descreșteri în numărul plachetelor, rezultă o tendință spre hemostază.

S-a sugerat prezența unui mecanism de reglare specific legat de megacariocito-poieză și trombopoieză. Plachetele se mențin la numere eficiente la oamenii sănătoși și animale normale. Totuși, este cunoscut că dacă se administrează un anticorp anti-plachet la un animal normal, doar numărul de plachete descrește rapid într-o scurtă perioadă de timp, începând să crească după aceea și temporar să depășească nivelul normal, dar, în final, re40 vine la nivel normal. De asemenea, se cunoaște din practica clinică că o descreștere a numărului plachetelor (trombocitopenie) sau o creștere a numărului lor (trombocitoză) se întâlnește chiar când numărul eritrocitelor și leucocitelor este normal. Până în prezent, totuși, nu s-a raportat reușita în izolarea și identificarea unui factor reglator specific implicat în producerea de plachete (de exemplu, ca în cazul eritropoietinei în formarea eritrocitului).

Cea mai importantă funcție a plachetelor este formarea cheagului sanguin în mecanismul hemostatic. Tendința de sângerare se întâlnește când funcția normală a mecanismului hemostatic este compromisă prin trombocitopenie. în domeniul radio-terapiei și chemoterapiei cancerelor, trombocitopenia produsă prin supresia măduvei osoase este o complicație mortală și la asemenea pacienți se aplică transfuzia de plachete în vederea prevenirii 50 tendinței spre sângerare. Transfuzia de plachete se aplică, de asemenea, la pacienți după î transplant de măduvă osoasă sau anemie aplastică.

R0118299 Β1

Plachetele utilizate în astfel de transfuzie plachetară se prepară prin placheto-foreză din sângele donatorilor sănătoși, dar astfel de plachete pentru transfuzie au o viață proprie scurtă și există o posibilitate de producere a contaminării prin infecție bacteriană. Transfuzia de plachete are, de asemenea, un pericol posibil de expunere a paciențiior la virusuri pericu- 55 loase precum, virusul imunodeficienței umane (HIV) sau diferite virusuri hepatitici, de inducere a anticorpilor specifici pentru un antigen principal de histocompatibilitate (HLA) al plachetelor transfuzate sau de producere a grefei față de boala gazdei (GVHD) datorită limfocitelor contaminate din plachetele folosite pentru transfuzie.

Ca urmare, va fi un mare beneficiu dacă formarea intrinsecă a plachetei ar putea fi 60 stimulată la pacienți trombocitopenici, și în același timp, s-ar putea reduce dependența lor de transfuzia plachetelor. în plus, dacă trombocitopenia din pacienții cu cancer supuși radioterapiei sau chemoterapiei ar putea fi corectată sau prevenită, asemenea tratamente pot fi făcute mai în siguranță, creșterea intensității tratamentului poate deveni posibilă și este de așteptat o îmbunătățire suplimentară a efectelor anticancer. 65

Din aceste motive s-au făcut studii numeroase și intensive asupra izolării și identificării factorilor reglatori specifici implicați în reglarea producerii megacariocitelor și plachetelor. Conform studiilor in vitro, factorii reglatori care guvernează mega-cariocitopoieza sunt împărțiți în mare în următorii doi factori (conform Williams și colab., J.Cell.Physid., vol.110, pp.101-104,1982). Factorul stimulator de colonie mega-cariocitar (Meg-CSF) este un factor 70 regulator care stimulează proliferarea și diferențierea CFU-MK pentru a forma colonii de megacariocite într-un mediu de cultură semisolid. Alt factor reglator numit factorul potențiator megacariocitar (Meg-Pot) factor de stimulare megacariocitar, factorul de stimulare a trombopoiezei sau altele asemenea, acționează ,în principal, asupra megacariocitelor imature sau mature prin aceasta sporind diferențierea și maturarea lor. Meg-Pot-ul este detectabil 75 în combinație cu activitate Meg-CSF în unele cazuri. în plus, deoarece numărul plachetelor crește când serul sau plasmă colectată de la animale cu trombocitopenie indusă experimental s-a administrat la altele normale, s-a sugerat că există un factor umoral numit trombopoietină (TPO), capabil să promoveze producerea in vivo a plachetelor.

în ultimii ani, câteva citokine ale căror gene s-au donat s-au examinat pentru capa- 80 citățile lor de a stimula megacariocitopoieza și trombopoieza. IL-3 umană a stimulat formarea coloniilor de megacariocite umane (Bruno și colab., Exp.Hematol., vol.16, pp.371 - 377, 1988) și cel puțin la maimuțe a crescut numărul de plachete (Donahue și colab. Science, vol.241, pp.1820,1988). Totuși, deoarece IL-3 este un factor care exercită efectele sale asupra proliferării și diferențierii tuturor celulelor hematopoetice, el poate fi deosebit de factorii 85 de reglare specifici care controlează megacariocitopoieza și producerea plachetelor. IL-6 umană nu prezintă activitate Meg-CSF, dar a acționat asupra megacariocitelor imature și apoi a sporit diferențierea lor la megacariocite mature (Williams și colab., Exp.Hematol., vol.18.p.69, 1990). Administrarea in vivo de IL-6 a indus producția de plachete și a inițiat, atât maturarea, și a comutat spre ploidie mai ridicată megacariocitele măduvei osoase la pri- 90 mate, dar, de asemenea, a produs efecte secundare precum reducerea greutății corporale, inducerea fazei acute a proteinei (Asano și colab., Blood, vol.75, p.1602-1605,1990); Stahl și colab., Blood, vol.78, pp.1467-1475,1991). IL-11 umană nu a prezentat activitate MegCSF, dar a exercitat activitate Meg-Pot și a promovat producerea de plachete la șoareci (Neben și colab., Blood, vol.81, pp.901 -908,1993). în plus, LIF uman a crescut semnificativ 95 numărul de plachete la primate (Mayer și colab., Blood, vol.81, pp.3226-3233, 1993), dar acțiunea sa in vitro asupra megacariocitelor a fost slabă (Burstein și colab., C-Cell.Physiol., voi.153, pp. 305-312, 1992).

RO 118299 Β1

Deși este așteptată aplicarea clinică a acestor citokine ca factor de creștere plache100 tară, funcțiile lor nu sunt specifice pentru linia megacariocitară și ele produc efecte secundare. Prin urmare, pentru domeniul clinic s-a dorit dezvoltarea unui factor de creștere plachetară care este specific pentru sistemul megacariocit-plachetă și produce mai puține efecte secundare.

Activitate Meg-CSF, Meg-Pot, sau TPO s-a găsit în ser, plasmă sau urina pacienților 105 sau animalelor trombocitopenice sau în supernatantul culturii anumitor linii celulare umane cultivate. Totuși, până în prezent nu se cunoaște dacă aceste activități sunt datorate prezenței unui sigur factor sau unei combinații a câtorva factori sau dacă ei sunt acoperiți de citokinele cunoscute.

Hoffman a găsit că serurile pacienților cu anemie plastică și purpura magacariocitică 1 io trombocitopenică au conținut activitate Meg-CSF care a mărit semnificativ formarea coloniilor de megacariocite (Hoffman și colab.; N.Eng.D.Med., vol.305, pp.533-538,1981). După aceea, Mazur și colab., au raportat că activitatea Meg-CSF prezentă în serul pacienților cu anemie aplastică a fost diferită atât de IL-3 ,cât și GM’CSF (Mezur și colab., Blood, vol.76, pp.290-297,1990). în mod similar s-a găsit activitate Meg-CSF în serurile pacienților cu can115 cer care au primit chemoterapie citotoxică intensivă și la pacienții cu transplant de măduvă osoasă (Mezur și colab., Exp.Hematol. vol.12, pp.624-628,1984, de Alarcon și Schmieder, Prog.Clin.Bio.Res., vol.215, pp.33-340,1986). Hoffman și colab., au raportat că Meg-CSF cu o greutate moleculară aparentă de 46000 s-a purificat din plasma pacienților cu trombocitopenie hipomegacariocitică/Hoffman și colab., D.CIin.Invest., voi ./5, p.ll/4-1182,1985), 120 dar s-a găsit în studii ulterioare că materialul nu a fost la un nivel de puritate care să permită secvențarea aminoacidă de precizie (Hoffman, Blood, vol./4, pp.1196-1212,1989). O substanță care are activitate asemenea TPO care sporește încorporarea ⁷⁵Selenometinoninei în plachetele nou formate la șoareci a fost parțial purificată în plasma pacienților trombocitopenici sau urina pacienților cu purpură trombocitopenică idiopatică (TTP) și greutatea 125 moleculară aparentă a factorului derivat plasmatic s-a determinat a fi 40000 (Grossi și colab., Hematologica, vol.72, pp.291-295,1987; Vannuchi și colab. Leukemis, vol.2, pp.236240,1988).

Activități Meg-CSF și like-TPO au fost determinate, de asemenea, în probe de urină ale pacienților cu anemie aplastică și ITP severă (Kawakita și colab., Br.D.Haematol., vol.48, 130 pp.609-615,198; Kawakita și colab., Blood, vol.556-500,1983). Kawakita și colab., au raportat ulterior că activitatea Meg-CSF găsită în extractul de urină al pacienților cu anemie aplastică a prezentat o greutate moleculară aparentă de 45000 prin filtrare în gel în condiția unei disocieri (Kawakita și colab., Br.J.Hematol., vol.62, p.15722,1986). Erikson-Miller și colab., au raportat, de asemenea, despre purificarea Meg-CSF din probe de urină similare, dar fără 135 nici o informație asupra structurii sale (Erikson-Miller și colab., “Blood Cell Growth Factors: their present and future use in hematology and ecology” ed. de către Murphy, AlphaMed Press, Dayton, Chio, pp.204-220,1992). Turnel și colab., au purificat un factor de stimulare megacariocitar (MSF) care are activitate Meg-CSF, din urina pacienților cu transplant de măduvă osoasă și au donat gena sa (Turner și colab., Blood, vol.78, p.1100 279a, 1991, 140 (abstr., supple.1)). Acest MSF are o greutate moleculară de 28000 până la 35000. Identitatea acestui factor cu Meg-CSF detectat mai devreme în probe de ser și plasmă ale pacienților trombocitopenici și activitatea sa de creștere plachetară rămân să fie elucidate.

O substanță care are o activitate like-TPO cu o greutate moleculară de 39000 a fost purificată din supernatantul de cultură a unei linii celulare umane derivată din rinichi embrio145 nar (MEK) și proprietățile sale biologice și biochimice au fost studiate pe larg, dar structura sa este încă necunoscută (McDonald și colab., D.Lab. Clin.Med., voi. 106, pp. 102-104,1985;

i

R0118299 Β1

M.Donald, Int.D.Cell Cloning, vol.7, pp139-155,1989). Pe de altă parte, alți cercetători au raportat că principala activitate din mediul condiționat al celulelor HEK, care sporește maturarea in vitro a megacariocitelor, se datorează citokinelor cunoscute, și anume, IL-6 și EPO (Withy și colab., J.Cell.Physiol., vol.15.pp.362-372,1991). 150 în legătură cu factorii derivați de la animal, Evatt și colab., au raportat că o activitate like-TPO care a sporit încorpoirarea de ⁷⁵SE-selenometionină în plachete nou formate la iepuri și șoareci s-a găsit în plasma iepurilor trombocitopenici indusă prin injectare de ser antiplachetar (Evatt și colab., J.Lab.Clin.Med., vol.83, pp.304-371,1974). în plus la aceasta, un număr de studii similare au raport din anii 1960 - 1970 (de exemplu, Odei și colab., 155 Proc.Soc.Biol.Med., vol.108,pp.428-431,1961; Evatt și Levin, J.CIin.Invest., vol.48, pp.16151026, Harker, Am.J.Physiol., vol.211,pp.1370-1380,1970; Shreiner și Levin, Invest., vol.49, pp.1/09-1/13,1970; și Pennington, Br.Med.J., și 1, pp-606-608,19/0). Evatt și colab., și Hill și Levin au dirijat purificarea parțială a activității like-TPO din plasma iepurilor trombocitopenici (Evatt și colab., 8/oodvol.54, pp.377-388,1979; Hill și Levin Exp.Hematol., vol.14, 160 pp.752-759,1986). în continuare, a urmat purificarea acestui factor, urmărind o activitate de a spori diferențierea și maturarea in vitro a megacariocitelor și anume, activitatea Meg-Pot pentru a arăta că această activitate are o greutate moleculară aparentă de 40000-46000, când s-a determinat prin filtrare în gel (Kell și colab., Exp.Hematol., vol.16, pp.202-207,1988;

Hill și colab., Exp.Hematol., vol.20, pp.354-360,1992). Deoarece activitatea IL-6 nu a fost 165 detectabilă în plasma iepurilor cu trombocitopenie severă acută indusă prin administrare de ser antiplachetar, s-a sugerat că această activitate like-TPO s-ar datora unui factor, altul decât IL-6 (Hill și colab., Blood, vol.80, pp.346-351,1992).

Tayrien și Rosenberg au purificat, de asemenea, un factor care are o greutate moleculară aparentă de 150000 din plasma iepurilor trombocitopenici și supernatantul celulelor 170 HEK, care stimulează producerea factorului plachetar 4 într-o linie celulară megacariocitică de șobolan, dar fără informații asupra structurii sale (Tayrien și Rosenberg, D.Biol.Chem., vol.262, pp.3202-3258, 1987).

în plus, Nakeff a găsit o activitate Meg-CSF în serul șoarecilor trombocitopenici indusă prin administrare de antiplachete (Nakeff, Experimental Hematology Todayed. de 175 către Baum și Ledney, Springer-Verlag, N.Y.P.111-123, 1977). Pe de altă parte, seruri de la iepuri trombocitopenici au sporit maturarea megacariocitelor (Keller și colab., Exp. Hematol., vol.16, pp.262-267,1988; Hill și colab., Exp.Hematol., voi.17, pp.903-907,1989) și au stimulat transformarea morfologică a megacariocitelor în plachete (Leven și Yee,

Blood, vol.69, p.1046-1052,1989), dar nu au avut activitate Meg-CSF detectabilă. 180

Miura și colab., au detectat o activitate Meg-CSF în plasma șobolanilor transformați trombocitopenici prin iradiere subletală a întregului corp (Miura și colab., Blood, vol.63, pp.1060-1066,1984), și au sugerat că inducerea activității Meg-CSF in vivo este legată de descreșterea megacariocitelor, dar nu și de descreșterea plachetelor, deoarece această activitate nu se schimbă prin transfuzie de plachete (Miura și colab., Exp.Hematiol., vol.16, 185 pp.139-144,1988). Mazur și South au detectat o activitate Meg-CSF în serul câinilor iradiați subletal și au raportat că acest factor are o greutate moleculasră aparentă de 175000 când s-a măsurat prin filtrare în gel (Mazur și Soth, Exp.Hematol., vol.13, pp.1164-1172,1985). în plus la cele de mai sus, factori derivați din ser, plasmă, și urină au fost raportați de către alți investigatori de exemplu, de către Straneva și colab., (Straneva și colab., Exp.Hematol., 190 voi. 15, pp.65-663, 1987).

Astfel, așa cum s-a descris mai sus, diferite activități care stimulează megacariocitopoieză și trombopoieza s-au găsit în probe biologice derivate de la pacienți și animale trombocitopenice, dar izolarea acestor factori, identificarea lor biochimică și biologică și determinarea caracteristicilor lor nu s-a reușit datorită conținutului lor extrem de mic în surse 195 naturale ca sânge și urină.

R0118299 Β1

Problema pe care o rezolvă invenția este o polipeptidă trombopoietină, secvența DNA care o codifică, procedeu pentru producerea unei polipeptide trombopoietină și o compoziție farmaceutică cu această polipeptidă trombopoietină care prezintă activitate biologică de stimulare specifică sau de creștere a producției plachetelor sanguine.

Polipeptidă trombopoietină, conform invenției, prezintă activitate biologică de stimulare specifică sau creștere a producerii plachetelor sanguine și are succesiunea de aminoacizi prezentată în secvența nr.6, de la aminoacidul 1 la 332.

Secvența DNA care codifică polipeptidă trombopoietină, conform invenției, este aleasă dintre:

a) secvențele DNA care sunt prezentate în secvența nr.194,195 sau 196 sau catene complementare acestora;

b) secvența DNA care hibridizează în condiții de stringență la secvențele DNA de la punctul a) sau fragmentele acestora;

c) secvența DNA care hibridizează la secvențele DNA definite la a) și b) fără degenerarea codului genetic;

d) secvențe DNA care codifică o polipeptidă definită în oricare dintre revendicările

1...11,14 și 15.

Procedeu pentru producerea unei polipeptide trombopoietine, conform invenției, cuprinde etapele:

- introducerea unei secvențe DNA definită în oricare din revendicările 17...22 într-un vector adecvat ales dintre pKC30, pTrc99A sau alții asemenea pentru transformarea celulei E.colr, psV2-neo, pCAGGS, pCDL-SRa296 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de mamifere; pG-1 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de drojdii; pAC373 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de insecte; și care poate conține o origine de replicare, markeri de selecție, un promotor, un situs de îmbinare ARN, un semnal de poliadenilare;

- introducerea DNA-ului recombinam în celule receptoare adecvate;

- donarea DNA-ului recombinant;

- multiplicarea celulelor care conțin DNA-ul recombinant pentru a produce proteina TPO;

- izolarea polipeptidei TPO;

Compoziția farmaceutică, conform invenției, conține o cantitate eficientă de polipeptidă trombopoietină, definită în revendicările 1...16 și un purtător acceptabil farmaceutic.

Prin aplicarea invenției se obține următorul avantaj:

- tratarea tulburărilor plachetare, în special, tratamentul trombocitopeniei cum ar fi, cea indusă prin chemoterapie, radioterapie sau transplant de măduvă osoasă.

Se prezintă, în continuare, descrierea în detaliu, în legătură cu următoarele 34 fig., care reprezintă:

- fig.1, cromatografie de filtrare în gel Sephacryl S-200HR a Phenyl Sepharose 6 FF/LS F2 derivată de la XRP;

- fig.2, cromatografie în fază inversă Capcell Pak CI a fracțiunii active TPO YMC-pack CN-AP derivată de la proba TPO moleculară scăzută (Sephaxryl S-200HR F3) a XRP;

- fig.3, o analiză SDS-PAGE a fracției active TPO (FA) Capcell Pak CI de la proba TPO molecular scăzută a XRP;

- fig.4, hărți peptidice pe C18 HPLC în fază inversă a TPO de șobolan izolată prin SDS-PAGE. Fragmentele peptidei s-au obținut prin hidroliză sistematică cu 3 proteaze;

- fig.5, activitatea TPO derivată de la XRP în sistemul de cercetare CBU-MK de șobolan;

- fig.6, o construcție a vectorului de expresie pEF 18S;

R0118299 Β1

- fig.7, prezintă activitate TPO în supematantul culturii celulelor COS1 în care s-a introdus pEF18S-A2a în sistemul de testare CFU-MK la șobolan;

- fig.8, prezintă activitate TPO îri supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pEF18S-HL34 în sistemul de testare CFU-MK la șobolan;

- fig.9, activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-au introdus 250 pHT1-231 în sistemul de testare CFU-MK la șobolan;

- fig. 10a, prezintă activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pHTFIîn sistemul de testare CFU-MK la șobolani;

- fig. 10b, activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pHTFIîn sistemul de testare M-07e; 255

- fig.11, prezintă o hartă de restricție a clonei λ HGTI și construcția lui pHGTI și PEFHGTE. (E:EcoRI, H:Hindlll, S;Sall);

- fig. 12a, prezintă activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pEFHGTE în sistemul de testare CFU-MK la șobolani;

- fig. 12b, prezintă activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a 260 introdus pEFHGTE în sistemul de testare M-07e;

- fig. 13a, activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pHTI-211#1, pHTI-191#1, sau pHTI-171#2 în sistemul de testare CFU-MK la șobolani;

- fig. 13b, arată activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-a introdus pHTI-163#2 în sistemul de testare CFU-MK la șobolan; 265

- fig. 14, prezintă activitate TPO în supematantul culturii celulelor COSI în care s-au introdus pHTI-211#1, pHT1-191#1, pH1-1,1#2, sau pHT1-163#2 în sistemul de testare M-07e;

- fig.15, este o cromatogramă a unei cromatografii în fază inversă (coloană C4 Vydac) pentru purificarea TPO-ului uman din supematantul culturii celulelor CHO în care s-a 270 introdus pDEF202-hTPO-P1 și s-a permis TPO-ului să se exprime;

- fig. 16, este o fotografie care arată separarea SDS-PAGE de TPD uman purificat din supematantul culturii celulelor CHO în care a fost introdus pDEF202-hTPO-P1 și s-a lăsat să se exprime TPO;

- fig.17, este o cromatogramă a unei cromatografii în fază inversă pentru purificare 275 de TPO uman de la E.coli în care s-a introdus pCFM536/h6T(1-103) și s-a permis să se exprime TPO;

- fig. 18, este o fotografie care arată separarea SDS-PAGE a variantului TPO uman, h6T (1-163) izolat și purificat din E.coliîn care s-a introdus pCFM530/h6T(1-103) și s-a permis să se exprime TPO; 280

- fig.19, arată o imagine de eluție a hTP0163 pe coloană Superdex 75 pg în legătură cu purificarea hTP0163 din supematantul culturii ca un material inițial, preparat prin transfectarea plasmidului de expresie TPO uman pDEF202-hTPO163în celule CHO. Cantitatea de proteină s-a determinat la 220 nm;

- fig.20, arată o analiză SDS-PAGE a hTPO163 standard eluat din coloana Superdex 285 pg la purificarea hTPO163 din supematantul culturii ca material inițial preparat prin transfecția plasmidului de expresie TPO uman pDEF202-hTPO163 în celule CHO. Pe gel ΙΤΓΡΟ163 s-a colorat cu argint;

- fig.21. arată o structură a vectorului de expresie pSMT201',

- fig.22, prezintă un grafic care arată activitatea TPO așa cum s-a determinat prin 290 analiză M-072 în supematantul celulelor COS7 în care s-au introdus și apoi, exprimat pGLTPO, N3/TPO sau 09/TPQ,

- fig.23, este un grafic care prezintă o activitate TPO așa cum s-a determinat prin test M-07e, în supernatantele culturilor celulelor COS7 în care a fost introdusă și exprimată un derivat cu inserție sau deleție de la TPO uman;

295

RO 118299 Β1

- fig.24 arată creșterea numărului plachetelor la șoareci la care s-a administrat TPO pe calea injectării intravenoase și subcutanate;

- fig.25, arată creșterea numărului plachetelor în funcție de doză la șoareci după injectarea subcutanată de TPO;

- fig.26, arată creșterea numărului de plachete indusă TPO după tratamentul șoarecilor cu 5-FU pentru inducerea trombocitopeniei;

- fig.27, arată creșterea numărului plachetelor induse TPO după tratamentul șoarecilor cu hidroclorură himustină pentru inducerea trombocitopeniei;

- fig.28, arată creșterea numărului de plachete induse TPO la șoareci trombocitopenici după transplant de măduvă osoasă;

- fig.29, arată numărul plachetelor induse TPO după iradierea cu raze X a șoarecilor pentru inducerea trombocitopeniei;

- fig.30, arată creșterea numărului plachetelor în funcție de doză după administrarea de TPO trunchiat (aminoacizii 1-163 din Secv.lD nr.6);

- fig.31, arată creșterea numărului plachetelor după administrare de TPO trunchiat (aminoacizii 1-163 din Secv.lD nr.6), după administrarea hidroclorurii denimustină pentru inducerea trombocitopeniei;

- fig.32, arată cum creșterea concentrațiilor de Mpi-X adăugată în sistemul de cultură de megacariocite umane împiedică creșterea dezvoltării megacariocitelor;

- fig.33, descrie activitate TPO așa cum s-a determinat prin test M-07e, a derivaților TPO (Met ², Lys’¹, Ala¹, Val³, Alg¹³³) TPO (1-163), (Met², Lys¹, Ala¹, VaP, Pro¹⁴⁸) TPO(1-163) și (Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵) TPO(1-163) exprimați în E.coli;

- fig.34, descrie activitatea TPO așa cum s-a determinat prin testul M-07e al derivaților TPO (Met², Lys·¹, Ala¹, Val³, Alg¹²⁹). TPO(1-163), (Met², Ly^¹, Ala¹, Val³, Arg¹⁴³) TPO(1-163), (Met ², Lys'¹, Ala¹, Val³. Leu⁸²) TPO(1-103), (Met'², Lys’¹, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶) TPO(1-163) și (Met'², Lys'¹, Ala¹, Val³, Arg⁵⁹)TPO (1-163) exprimați în E.coli.

Prin prezenta invenție se asigură în mod specific polipeptide trombopoietine (TPO) care au activitate biologică de stimulare specifică sau creștere a producției de plachete și cuprind secvența de aminoacizi 1 la 332 a Secv.lD nr.6 sau derivații acestora. Peptidele ilustrative includ pe cele care constau din secvențele de aminoacizi 1 la 163 ale Secv.lD nr.6; 1 la 232 ale Secv.lD nr.8; 1 la 151 ale Secv.lD nr.6; secvența matură a aminoacizilor a Secv. ID nr.:2, 4 și 6; inclusiv cele care au secvența aminoacidă NH₂ terminală de la 1 la 6 deletată. Polipeptide suplimentare ilustrative ale invenției includ (Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴,IleGly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³) TPO, (Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴,Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷; His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³) TPO, (Asn²⁵) TPO și (Thr³³) TPO. Alte polipeptide ale invenției includ derivații unei polipeptide TPO (ĂHis^TPO (1-163), (AArg¹¹⁷)TPO(1-163), (AGIy¹¹⁶)TPO(1163), (His³³, Thr^'.Pro^TPOțl-ieS), (His³³, Ala³³', Pro³⁴) TPO(1-163), (His³³, Gly³³', Pro³⁴, Ser^TPO (1-163), (Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶', Arg¹¹⁷)TPO(1-163), Gly³¹⁶, Ala¹¹⁶', Arg¹¹⁷)TPO(1-163), (Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷) TPO(1-163), (Ala¹, Val³, Arg¹²⁹)TPO(1-163), (Ala¹, VaP, Arg¹³³)TPO(1163), (Ala¹, Val³, Arg¹⁴³) TPO(1-163), (Ala¹, Val³, Leu⁸²)TPO(1-163), (Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶)TPO(1-163), (Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸)TPO(1-163), (Ala¹, Val³, Arg⁵⁹) TPO(1-163) și (Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵)TPO (1-163).

Polipeptidele TPO ale invenției includ, de asemenea, pe acelea care sunt legate covalent la un polimer, de preferință, polietilenglicol. Polipeptidele TPO ale invenției pot cuprinde suplimentar aminoacizii (Met'², Lys’¹), (Met'¹) sau (Gly¹). DNA-urile asigurate prin invenție le includ pe cele care codifică polipeptidă TPO și derivații descriși mai sus și sunt asigurate în mod corespunzător ca cDNA, DNA genomic și DNA-uri preparate.

R0118299 Β1

De asemenea, prin invenție sunt asigurate procedee pentru producerea unei polipeptide TPO ca cea descrisă mai sus care cuprind etapele exprimării unei polipeptide codificate printr-un DNA al invenției într-o gazdă adecvată și izolarea numitei polipeptide TPO. Când polipeptidă TPO exprimată este o polipeptidă Met’² - Lys'¹, astfel de procedee vor include în plus etapa clivării Met'² - Lys’¹ de la numita polipeptidă TPO izolată.

De asemenea, prin invenție sunt asigurate procedee pentru producerea polipeptidelor TPO ca polipeptide de fuziune glutation-S-transferază (GST). DNA care codifică o peptidă GST aminoterminală o peptidă care recunoaște trombina și o polipeptidă TPO se introduc într-o gazdă adecvată, se izolează fuziunea polipeptidică și jumătatea GST se îndepărtează prin tratament cu trombină. Polipeptidele TPO care rezultă sunt de structură (Gly¹).

Suplimentar, s-au asigurat celule gazdă procariote sau eucariote transformate sau transfectate cu o secvență DNA .conform prezentei invenții, într-un mod care face posibil ca numita celulă gazdă să exprime o polipeptidă care are activitate biologică de stimulare specifică sau de creștere a producerii de plachete.

Compozițiile farmaceutice ale invenției cuprind o cantitate eficientă dintr-o polipeptidă TPO sau un derivat în combinație cu un purtător acceptabil farmaceutic și sunt susceptibile de a fi folosite în tratamentul tulburărilor plachetare, în special, tratamentul trombocitopeniei precum, cea indusă prin chemoterapie, radioterapie sau transplant de măduvă osoasă. Prin invenție, sunt asigurate metode de tratament corespunzătoare.

în sfârșit, prezenta invenție asigură anticorpi specifici imunoreactivi cu polipeptide TPO și derivații acestora precum cei descriși mai sus. Astfel de anticorpi sunt utili în metode pentru izolarea și cuantificarea polipeptidelor TPO ale prezentei invenții.

Conform invenției de față, există asigurată o nouă secvență ADN care codifică o proteină având o activitate TPO (denumită ca “secvență ADN a prezentei invenții”. Secvența ADN a prezentei invenții include o secvență de aminoacizi prezentată în SECV.ID nr.2,4 sau 6 din lista de secvențe atașată.

De asemenea, inclusă în secvența ADN a prezentei invenții este o secvență ADN care codifică o versiune parțial modificată (substituție, deleție, inserție sau adăugare) a secvenței de aminoacizi menționată mai înainte prezentată în SECV.ID nr.2,4 sau 6 cu condiția ca asemenea modificări să nu reducă activitatea TPO. Astfel, secvențele ADN care codifică derivații TPO sunt, de asemenea, incluse în invenția de față.

Cu alte cuvinte, secvența ADN a invenției de față include secvența ADN care codifică molecule de proteine ale căror secvențe de aminoacizi sunt în principal, secvențele de aminoacizi prezentate în SECV.ID. Nr.2,4 sau 6. Formularea “secvențe aminoacide sunt substanțial secvențele aminoacide prezentate în SECV.ID nr.2,4 sau 6 așa cum s-a folosit aici înseamnă că numitele secvențe aminoacide includ pe cele reprezentate prin SECV.ID nr.2, 4 sau 6 precum și pe cele reprezentate în SECV.ID nr.2,4 sau 6 care au aici codificare parțială precum substituție, deleție, inserție, adiție sau altele asemenea cu condiția ca asemenea modificări să nu reducă activitatea TPO.

Suplimentar, secvența ADN a prezentei invenții constă în esență dintr-o secvență ADN care codifică o proteină având o activitate TPO.

Formularea “o secvență ADN care codifică secvența aminoacidă” include toate sec1 » vențele ADN care pot avea degenerare în secvențele nucleotidice.

Secvența ADN a prezentei invenții cuprinde, de asemenea, următoarele secvențe:

(a) secvențe ADN reprezentate prin SECV.ID nr.7,194,195 și 198 sau benzi complementare ale acestora.

(b) secvențe ADN care hibridizează în condiții stringente la secvențele ADN așa cum s-au definit în (a) sau fragmente ale acestora, sau (c) secvențe ADN care ar hibridiza la secvențele ADN așa cum s-au definit în (a) și (b), dar pentru degenerarea codului genetic.

345

350

355

360

365

370

375

380

385

390

RO 118299 Β1

Cu alte cuvinte, secvența ADN a invenției de față cuprinde, de asemenea, următoarele secvențe:

(a) secvența ADN care este integrată în vectorul pEF 183-A2a (depozit nr.FERM BP4505) purtată de o tulpină DH5 a E.coli, un vector pHT1-231 (depozit nr.FERM BP-4564) conținută în tulpina CHS E.coli, un vector pHTF1 (depozit nr.FERM BP-4617) purtată de o tulpină DH5 E.coli, un vector pHGT1 (depozit nr.FERM GP-4611) purtată de către o tulpină DH5 E.coli șt codifică secvența aminoacidă a unei proteine care are activitate TPO; sau (b) secvențe ADN care hibridizează (în condiții de stringență) la secvențele ADN definite la (a) sau fragmente ale acestora, și codifică secvența aminoacidă a unei proteinei care are activitate TPO.

Așa cum s-au folosit aici, condițile de hibridizare sunt cele folosite în exemplele privind amplificarea POR a ADN-urilor invenției care folosesc secvențe oligonucleotidice de inițiere degenerate și/sau unice (sonde). Vezi, de asemenea, de exemplu, capitolele XI și XIV din Molecular Cloning (Sambrook etal., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) și Unit 2.10 în Current Protocole in Molecular Biology, Ausubel și colab., Eds., Current Protocole, USA, 1993.

De asemenea, inclusă în secvența ADN a prezentei invenții este o secvență ADN care codifică o proteină având activitate TPO și cuprinde secvența nucleotidică care codifică pozițiile 1-183 ale secvenței de aminoacizi reprezentată prin SECV. ID Nr.6.

Asemenea secvențe ADN pot fi suplimentate cu un sit de clivaj printr-o enzimă de restricție și/sau o secvență ADN adițională la situsul de inițiere, terminare și intermediar care facilitează construcția vectorilor exprimați rapid. Când se folosește o gazdă nemamiferă în gazdă poate fi încorporat un codon preferat pentru expresia genei.

Un exemplu al secvenței ADN a prezentei invenții este o moleculă cADN care se obține prin prepararea mARN din celule de mamifere inclusiv umane, și apoi trierea cADN-ului în mod uzual dintr-o bancă cADN preparată printr-o metodă cunoscută. Sursa de mARN în acest caz include celule ale unei linii celulare McA-RH8994 derivate din hepatocitul de șobolan, celula HTC, celula M4-II-E, ficat de șobolan, rinichi, creier și intestin subțire uman, ficat și altele asemenea.

Alt exemplu al secvenței ADN a invenției de față este o moleculă de ADN genomic care se obține prin cercetarea ei în mod obișnuit dintr-o bancă genomică preparată printr-o metodă cunoscută de la o celulă de mamifer inclusiv umană. Surse de ADN genomic în acest caz includ preparate de ADN cromozomal obținute de la om, șobolan, șoarece, etc.

O secvență ADN care codifică un derivat TPO poate fi obținută de la secvența cADN obținută astfel care codifică o proteină având activitate TPO prin modificarea secvenței cADN folosind cunoscuta mutageneză direcționată în sit prin care se efectuează modificarea parțială a secvenței aminoacide corespondente.

Având clarificată secvența aminoacidă sau secvența ADN a unei proteine care are activitate TPO din prezenta invenție se poate obține ușor prin sinteză chimică o secvență ADN care codifică o secvență aminoacidă parțial modificată.

Secvența ADN a prezentei invenții este un material util pentru producerea pe scară mare a unei proteine care are activitate TPO făcând uz de diverse tehnici ADN recombinant.

De asemenea, secvența ADN a prezentei invenții este utilă ca sondă de marcaj pentru izolarea unei gene care codifică o proteină înrudită TPO, precum cADN și ADN genomic care codifică pentru TPO de la alte specii mamifere. Ea este, de asemenea, utilă în terapie genetică a omului și altor specii mamifere. în plus, secvența ADN a prezentei invenții este utilă pentru dezvoltarea unei specii de mamifer transgenic care se poate folosi ca o gazdă eucariotă pentru producerea pe scară mare a TPO (Palmiter și colab., Science, vol.222, pp.809-814, 1983).

RO 118299 Β1

De asemenea, prin prezenta invenție se asigură un vector în care este integrată secvența ADN menționată anterior care codifică o proteină având activitate TPO, celule gazdă transformate cu numitul vector și un procedeu pentru producerea unei proteine având activitate TPO care cuprinde cultivarea numitelor celule gazdă, separarea și purificarea proteinei exprimate care are activitate TPO.

Exemple de celule gazdă utile în acest caz includ celulele procariotelor precum E.coli și altele asemenea, și eucariote precum drojdii, insecte, mamifere și altele asemenea. Exemple ilustrative de celule de mamifere includ celule COS, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), celule C-127, celule reale de pui de hamster (BHK) și altele asemenea. Exemple ilustrative de drojdii includ o drojdie de panificație (Saccharamyces cerevisiae), o drojdie asimilatoare de metanol (Pichia pastoris) și altele asemenea. Exemple ilustrative de celule de insecte includ celule cultivate de vierme de mătase și altele asemenea.

în legătură cu vectorii de utilizat în transformarea acestor celule gazdă, pot fi folosiți pentru transformarea celulelor E.coli pKCSo (Shimatake H. și M.Rosenberg Nature, 292, 128 -132,1981), pTrc99A (Amann E. și colab., Gene, 89, 301 - 315,1988) sau alții asemenea. Pentru transformarea celulelor mamifere se pot folosi pSV2-neo (Berg și Southern, C.MoLAppI.Genet., 1,327-341,1982), pCAGGS (Niws și colab., Gene, 108,193-200.1991), pcDL-SRw296 (Takebe și colab., Mol.Cell.Biol., 8, 446-472, 1988) sau alții asemenea. Pentru celule de drojdie se pot folosi pG-1 (Schena M. și Yamamoto K.R., Science, 241, 965 - 967,1988) sau alții asemenea. Pentru transformarea celulelor de vierme de mătase se poate folosi un vector de transfer pentru construcția virusului recombinant, de exemplu, pAc373 (Luckow și colab., Bio/Technology, 6, 47-55,1988).

în funcție de cerințe, fiecare dintre acești vectori poate conține o origine de repliere marker(i) de selecție, un promotor și altele asemenea și un situs de îmbinare ARN, un semnal de poliadenilare și altele asemenea în cazul vectorilor folosiți în celule eucariote.

în legătură cu originea replicării, pot fi folosite în vectorii pentru celule de mamifere, o secvență derivată de la, de exemplu, SV40, adenovirus, virusul papiloma bovin sau altele asemenea. în vectorii pentru celule E.colise poate folosi o secvență derivată de la ColE1, factor R, factor F sau altele asemenea. Pentru celule de drojdie se pot folosi o secvență derivată de la ADN 2 μΜ, ARS1 sau altele asemenea.

Ca promotori pentru expresia genei, se pot folosi în vectori pentru celule de mamifere cei care sunt derivați, de exemplu, retrovirus, virusul polioma, adenovirus, SV40 și alții asemenea. în vectorii pentru celule E.coli se poate folosi un promotor derivat de la bacteriofagul, de exemplu, trp, Ipp, lac, sau tac. în vectori pentru celulele drojdiei de panificație se poate folosi promotorul ADH, PHO⁵, GPD, PGK sau MAFa, și promotorul AOX 1 sau alții asemenea, în vectorii pentru celulele de drojdie asimilatoare de metanol. în vectorii pentru celulele de vierme de mătase, poate fi folosit un promotor derivat de la un virus al poliedrozei nucleare.

Exemple tipice de markeri de selecție utili în vectori pentru celule mamifere includ o genă de rezistență la neomicină (neo), o genă timidinchinază, o genă dihidrofolat reductază (DHFR), o genă E.coli xantin-guanin fosforiboziltransferază (Ecogpt) și altele asemenea. Exemple ilustrative de markeri de selecție utili în vectori pentru celule E.coli includ o genă de rezistență la kanamicină, o genă de rezistență la ampicilină, o genă de rezistență la tetraciclină și cele pentru celule de drojdie includ Leu2, Trp1, Ura3 și alte gene asemenea.

Producerea unei proteine care are activitate TPO făcând uz de combinații corespunzătoare ale acestor sisteme gazdă-vectori se poate realiza prin transformarea celulelor gazdă adecvate cu un ADN recombinant obținut prin inserția genei prezentei invenții într-un sit adecvat al vectorului menționat anterior, cultivarea transformantului rezultat și apoi separarea și purificarea polipeptidei de interes din celulele care rezultă, sau din mediul de cultură, sau din filtrat. Mijloacele obișnuite folosite se pot aplica în acest procedeu în combinație.

445

450

455

460

465

470

475

480

485

490

RO 118299 Β1

Când se exprimă gena de interes, secvența semnal originală se poate modifica sau înlocui printr-o secvență semnal derivată de la altă proteină în vederea obținerii capătului N-terminal omogen al produsului exprimat. Omogenizarea capătului N-terminal poate fi realizată prin modificarea (substituție sau adăugare) resturilor de aminoacizi la capătul N-terminal sau vecinătățile sale. în cazul expresiei prin folosirea celulelor E.coli ca gazdă, de exemplu, restul de lizină poate fi suplimentat ulterior prin adăugarea la restul de metionină.

Proteina nouă a prezentei invenții care are activitate TPO (la care se va face referire în continuare ca “proteina prezentei invenții”) include proteine ce au fiecare secvența de aminoacizi prezentată în Secv.lD nr.2, 4 sau 6. Derivați TPO ale căror secvențe de aminoacizi sunt modificate parțial (substituție, deleție, inserție sau adăugare) sunt, de asemenea, incluse în invenția de față, cu condiția ca prin modificare să nu fie redusă activitatea TPO.

Cu alte cuvinte, proteina prezentei invenții include moleculele de proteină ale căror secvențe de aminoacizi sunt substanțial secvențele aminoacide prezentate în SECV. ID Nr.2, 4 sau 6.

Formularea “secvențele de aminoacizi sunt substanțial secvențele de aminoacizi prezentate în (sau reprezentate prin) SECV.ID.Nr.2,4 sau 6 așa cum s-au folosit aici înseamnă că numitele secvențede aminoacizi includ pe cele prezentate în SECV.ID.Nr.2, 4 sau 6 la fel de bine ca și cele prezentate în SECV.ID Nr.2, 4 sau 6 care aici au modificare parțială precum substituție, deleție, inserție, adiția și altele asemenea cu condiția că astfel de modificări să nu reducă activitatea TPO.

Proteina acestei invenții include o proteină care conține pozițiile 7-151 a secvenței de aminoacizi prezentate SECV.ID Nr.6 și care are o activitate TPO. De asemenea, inclusă în proteina prezentei invenții este o proteină care are activitate TPO și cuprinde pozițiile 1163 ale secvenței aminoacide reprezentate prin SECV.ID Nr.6.

Exemple de alți derivați TPO ai prezentei invenții includ un derivat a cărui stabilitate și durabilitate in vivo s-a îmbunătățit prin modificarea unui aminoacid (substituție, deleție, inserție sau adiție) un derivat în care cel puțin un potențial de glicozilare s-a schimbat prin deleție sau adiție, un derivat în care cel puțin un rest cisteinic s-a deletat sau substituit prin alt rest de aminoacid (de exemplu, rest de alanină sau serină).

De preferință, proteina prezentei invenții se caracterizează prin aceea că s-a separat și s-a purificat din celule gazdă transformate cu un vector recombinant care conține o moleculă cADN, un ADN genomic, sau un fragment ADN obținut prin sinteză chimică.

Când expresia intracelulară se efectuează folosind o bacterie precum E.coli drept gazdă, se obține o proteină în care un rest de inițiere metionină este adăugat la partea N-terminală a unei molecule care are activitate TPO, care de asemenea este inclusă în prezenta invenție. în funcție de gazda folosită, proteina produsă având activitate TPO poate sau nu poate să fie glicozilată, și fiecare din astfel de cazuri este inclus în proteina prezentei invenții.

I

Proteina prezentei invenții include, de asemenea, proteine TPO active întâlnite în mod natural, purificate și izolate din surse naturale, precum mediul de cultură celulară care are activitate TPO sau urină, ser sau plasmă umană.

în invenția de față este inclus, de asemenea, un procedeu pentru purificarea TPO din astfel de surse naturale. Un astfel de procedeu de purificare poate fi realizat prin folosirea uneia sau a unei combinații de etape de purificare folosite în mod obișnuit pentru purificarea proteinei, precum a cromatografiei de schimb ionic, o cromatografie de afinitate lectină, o cromatografie de afinitate de colorant triazinic, o cromatografie de interacțiune hidrofobă, o cromatografie de filtrare în gel, o cromatografie în fază inversă, o cromatografie de afinitate heparină, o cromatografie de gel sulfatat, o cromatografie hidroxilapatită, o cromatografie de focalizare izoelectrică, o cromatografie de chelare de metal, o electroforeză

R0118299 Β1

545 preparativă, o electroforeză de focalizare izoelectrică în gel și altele. Un procedeu de purificare în care sunt folosite anumite tehnici în combinație făcând uz de proprietățile fizicochimice ale TPO care pot fi deduse din exemplele acestei descrieri este, de asemenea, inclus în prezenta invenție. în plus, o cromatografie de afinitate anticorp la care se aplică un anticorp capabil să recunoască TPO poate, de asemenea, să fie folosită. Mai mult decât atât, s-a descoperit că TPO este ligandul pentru Mpl (de Sauvage $/ colab., Nature, 369, 533-538, (1994); Bartley și colab., Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushanski $/ colab., Nature 369; 565-568 (1994), prin care TPO poate fi purificat folosind o coloană de gel de afinitate la care Mpl fusese cuplat la o rășină. Mai ales un exemplu de coloană este o coloană Mpl-X care se prepară prin cuplarea unei rășini cu regiunea extracelulară a lui Mpl (Mpl-X) produsă prin tehnicile ADN recombinant înlocuind celula CHO ca gazdă (Bartley și colab. (1994)).

Așa cum s-a descris aici, polipeptidele TPO ale acestei invenții sunt caracterizate în plus prin capacitatea de legare la receptorul Mpl și specific la domeniul extracelular (solubil) al acestuia.

De asemenea, inclusă în invenția de față este o proteină codificată printr-o jumătate ADN care este complementară la banda care codifică proteina unui cADN uman sau secvență ADN genomică a genei TPO denumită “proteina complementar inversată” descrisă de către Tramontano ș/ colab. (Nuci. Acids Res., voi. 12, pp.5049-5059.1984).

De asemenea, inclusă în prezenta invenție este o proteină a prezentei invenții care este marcată cu un marker detectabil de exemplu ¹²⁵l marcat sau biotinilat, oferind astfel prevederea posibilă a unui reactiv care este util pentru detectarea și cuantificarea TPO sau receptor TPO din celule de expresie în probe solide precum țesuturi și probe lichide ca sânge, urină și altele.

Proteina biotinilată a invenției de față este utilă în cazul legării sale la streptavidină imobilizată în vederea îndepărtării megacarioblastelor din măduva osoasă la momentul transplantării de măduvă osoasă autogenă. Ea este ,de asemenea, utilă în cazul legării sale la streptavidina imobilizată în vederea concentrării celulelor megacariocitice autogene sau alogene la momentul transplantării măduvei osoase autogene sau alogenă. Un conjugat al TPO cu o toxină precum ricin, toxina difteriei, sau altele, sau cu un izotop radioactiv este util în terapie antitumorală și în pregătirea pentru transplantul de măduvă osoasă.

Invenția de față asigură, de asemenea, un acid nucleic care este util când este marcat cu un marker detectabil incluzând un marker radioactiv sau un marker neradioactiv cum ar fi, biotină sau când este folosit în procedura de hibridizare pentru detectarea poziției speciei TPO umane și/sau familiei sale genetice înrudite pe o hartă cromozomală. Un astfel de material este util, de asemenea, pentru confirmarea tulburărilor genei TPO umane la nivelul ADN-ului și poate fi folosită ca marker genetic pentru confirmarea genelor învecinate și tulburărilor lor.

De asemenea, inclusă în prezenta invenție, este o compoziție farmaceutică care conține o cantitate eficientă terapeutic a proteinei invenției de față împreună cu un diluent util și eficient, agent antiseptic, agent de solubilizare, agent de emulsionare, adjuvant, și/sau purtător. Termenul “cantitate eficientă terapeutic așa cum s-a folosit aici înseamnă o cantitate care asigură un efect terapeutic pentru condițiile specificate și căile de administrare condiționate. O astfel de compoziție se folosește sub formă lichidă, preparat uscat prin înghețare sau uscat și cuprinde un diluent ales dintre diferite tampoane (de exemplu, tris-HCI, acetat și fosfat) care au diferite valori de pH și tării ionice, un aditiv de suprafață care previne adsorbția, precum albumină sau gelatină, un agent activ de suprafață precum Tween 20, Tween 80, F68Pluronic sau sare de acid biliar, un agent de solubilizare ca glicerolul sau polietilenglicolul, un agent antioxidant precum acid ascorbic sau metabisulfit de sodiu, un agent antiseptic precum thimerosal, alcool benzilic sau paraben și un vehicul sau un agent de

550

555

560

565

570

575

580

585

590

RO 118299 Β1 tonicitate precum lactoza sau manitolul. De asemenea, este folosită o compoziție care cuprinde legarea covalentă a proteinei prezentei invenții la un polimer, precum polietilenglicol, chelarea proteinei cu ioni metalici, încorporarea proteinei într-un preparat granular sau la suprafață, constând dintr-un compus polimeric, precum acid polilactîc, acid poliglicolic sau hidrogen, sau încorporările proteinei în lipozomi, microemulsie, micele, vezicule mono- sau multistrat, cele roșii fantomă sau sferoplaste. O astfel de compoziție va exercita influențe asupra condițiilor fizice, solubilității, stabilității ratei de eliberare in vivo și purității in vivo a TPO. Selectarea compoziției poate fi descrisă în funcție de proprietățile fizice și chimice ale proteinei TPO active folosite. De asemenea, inclusă în prezenta invenție este o compoziție granulară în care granulele sunt acoperite cu un polimer precum poloxamer sau polaxamină și TPO care se leagă la anticorp la receptorii tisulari specifici, liganzi sau antigeni sau la liganzi receptori tisulari specifici. Alte exemple ale compoziției prezentei invenții, sunt cele care sunt sub formă de granule, au un înveliș protector și conțin un inhibitor proteazic sau un intensificator de penetrare pentru utilizare în diverse căi de administrare ca cea parenterală, pulmonară, transnazală și administrare orală.

Compoziția farmaceutică care cuprinde proteina invenției de față poate fi administrată de câteva ori pe zi, de obicei într-o cantitate de 0,05 pg până la 1 mg/kg corp (ca proteină TPO) în funcție de condițiile și sexul pacientului, calea de administrare și altele.

Compoziția famaceutică care conține proteina invenției de față poate fi administrată la o doză de 25000-500000000 ingredient activ (în termenii activității relative prin testul M-07e care va fi dat mai târziu) pe kg pentru una până la câteva ori într-o zi și pentru una până la 7 zile într-o săptămână depinzând de simptome, sex și calea administrării.

Inventatorii au confirmat că respectând situsul C-terminal al TPO uman activitatea se menține chiar când resturile de aminoacizi până la cel de-al 152-lea aminoacid al secvenței prezentate în SECV.ID Nr.8 sunt deletate și că, respectând situsul N-terminal, activitatea se menține chiar când resturile de aminoacizi până la secvența celui de-al 6-lea aminoacid sunt deletate.

în conformitate cu aceasta, proteina având activitate TPO, care conține secvența aminoacidă a celui de-al 7-lea până la cel de-al 151-lea aminoacid al SECV.ID Nr.6 și fiind modificată (substituție, deleție, inserție sau adiție) în alte părți poate fi folosită la fel de bine ca ingredient efectiv al prezentei invenții. Derivatul TPO mai preferat este cel care are secvența aminoacidă de la primul aminoacid până la cel de-al 163-lea aminoacid ai secvenței SECV.ID Nr.6.

De asemenea, este inclusă în prezenta invenție o compoziție care conține cel puțin unul dintre factorii hematopoietici suplimentari precum: EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF. IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6. IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, LIF și SCF.

Proteina, conform invenției, este utilă pentru tratamentul a diverselor boli trombocitopenice, atât singură, cât și în combinație cu alți factori hematopoietici suplimentari. Exemple de alți factori hematopoietici suplimentari incluși sunt EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, UF și SCF.

Există numeroase boli caracterizate prin tulburări plachetare precum trombocitopenia, datorată dereglărilor în producerea plachetelor sau reducerii vieții plachetelor (produsă prin distrugerea sau consumul plachetelor), care pot fi tratate cu proteina invenției de față. De exemplu, ea poate fi folosită pentru sporirea refacerii plachetelor la un pacient trombocitopenic datorită anemiei congenitale Fanconi sau anemiei aplastice produsă prin chemoterapie sau iradiere, sindrom mielodisplastic, leucemie mielocită acută, crize aplastice după transplant de măduvă osoasă. De asemenea, ea este folositoare în tratamentul trombocitopeniei datorate producerii reduse de TPO. Trombocitopenia datorată reducerii vieții plachetelor sau megacariocitelor include purpura trombocitopenică idiopatică, anemia hipoplastică,

RO 118299 Β1

645 sindromul imunodeficitar dobândit (SIDA), sindrom de coagulare intravascular diseminat și trombocitopenie trombotică. în plus, de asemenea, ea este utilă în cazul autotransfuziei de plachete în care TPO se administrează la un pacient înainte de o operație chirurgicală în vederea creșterii numărului de plachete proprii pacientului și astfel plachetele crescute se folosesc ca plachete de transfuzie la momentul operației. Altă utilizare a proteinei invenției de față este tratamentul bolilor rezultate din pierderea sau distrugerea temporară de plachete produsă prin alte chimicale sau medicamente sau tratamente curative. TPO poate fi folosită în scopul sporirii eliberării de plachete noi “intacte” la astfel de pacienți.

Prezenta invenție se referă, în continuare, la un anticorp specific pentru TPO. Proteina invenției se poate folosi ca antigeni și anticorpii corespunzători incluzând, atât anticorpi monodonali ,cât și policlonali, și anticorpi himerici, denumiți anticorpi “recombinanți” preparați prin metode convenționale. Pentru a prepara un astfel de anticorp anti-TPO, TPO umană însăși poate fi folosită ca antigen sau alternativ poate fi utilizată ca antigen o peptidă parțială de TPO uman. Când un anticorp pentru antigenul unei astfel de peptide se utilizează, epitopul se poate defini prin specificarea regiunii antigen. Pe de altă parte, când se utilizează un anticorp față de proteina antigen (TPO) însăși, regiunea antigenică se poate clarifica prin analizarea epitopului anticorpului. în asemenea cazuri, acești anticorpi fiecare având astfel clarificat epitopul, pot fi folosiți pentru fracționarea, detectarea, cuantificarea și purificarea a diverse TPO-uri care diferă prin proprietățile lor cum ar fi tipul catenei de zahăr adăugat, lungimea catenei peptidice, etc.

O peptidă TPO care conține secvența aminoacidă astfel selectată se sintetizează și se leagă la o proteină purtător adecvată, de exemplu, albumină, KLH (limpetemoceanină key hole) sau altele prin legare covalentă pentru prepararea unui antigen imunoreactiv. Alternativ, se produce o peptidă de tipul unei peptide antigen multiplu (MAP) pentru a fi antigen, conform metodei Tam (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413, 1988). Apoi, cu antigenul astfel preparat împreună cu un adjuvant sunt imunizate mamifere, păsări, etc., care sunt utilizate de obicei pentru a face să producă anticorpi: șoarecii, iepurii, șobolanii, caprele, oile, puii, hamsterii, caii, cobaii, etc. De la animalul astfel imunizat, s-au recuperat celule și antigenul său, de la care se obține un anticorp policlonal. Când se folosește ca antigen o peptidă, epitopul se poate defini prin specificarea regiunii antigenice. în acest caz, regiunile a diferite molecule TPO care au greutăți moleculare diferite sunt selectate și identificate prin inginerie imunologică. Ca un exemplu, poate fi selectată și identificată regiunea unei peptide deletate. în plus, o genă anticorp sau o parte a genei se donează de la celule care exprimă anticorpul de interes pentru a obține o moleculă anticorp care să fie exprimată prin inginerie genetică.

Comparativ cu un anticorp policlonal care, în general, conține diferiți anticorpi specifici pentru diverși determinanți antigenici (epitopi), un anticorp monoclonal este specific pentru un determinant antigenic unic pe antigen. Un anticorp specific TPO este utilizat în îmbunătățirea selectivității și specificității unei reacții antigen-anticorp în sprijinul diagnosticării și ca metodă de analiză analitică în realizarea separării și purificării de TPO. în plus, asemenea anticorpi se pot aplica pentru neutralizarea sau îndepărtarea TPO din ser. Anticorpii monoclonali sunt folositori, de asemenea, pentru detectarea și cuantificarea TPO în, de exemplu, serul sângelui integral.

Anticorpul anti-TPO uman al prezentei invenții se poate folosi ca ligand în cromatografia de afinitate pentru purificarea și izolarea de TPO uman. Pentru a fixa anticorpul, astfel, încât să-l facă util în asemenea cromatografie de afinitate pot fi folosite orice metode convenționale pentru fixarea diverselor enzime. De exemplu, se poate folosi o metodă cu un purtător de Sepharose 48 activată CNBr (produsă de către Pharmacie Fine Chemicals CO.) sau altele asemenea. Pentru a purifica acum TPO uman prin folosirea anticorpului anti-TPO

650

655

660

665

670

675

680

685

RO 118299 Β1 fixat, anticorpul anti-TPO uman fixat se încarcă într-o coloană și un lichid care conține TPO uman se trece prin coloană. Prin această operație o mare cantitate de TPO uman se absoarbe pe purtătorul din coloană. Ca solvent pentru eluție, de exemplu, se poate folosi tampon glicină-HCI (pH=2,5), soluție de NaCI, acid propionic, dioxan, etilen glicol, sare caotropică, guanidină hidroclorică, uree, etc. Prin eluție cu un asemenea solvent se eluează TPO uman având o înaltă puritate.

Anticorpul prezentei invenții poate fi folosit pentru determinarea TPO uman prin test imunochimic cantitativ, în special, prin imunotest enzimatic dirijat printr-un procedeu sandwich în fază solidă.

Un avantaj al anticorpilor monoclonali este acela că ei pot fi produși prin celule hibridoma într-un mediu care nu conține nici o altă moleculă de imunoglobulină. Anticorpii monoclonali pot fi preparați din supernatantele culturii de celule hibridoma sau din ascite de șoarece induse prin injectarea intraperitoneală a celulelor hibridom. Tehnica celulelor hibride descrisă inițial de către Kohler și Milstein (Eur.J.lmmunol.6:511-519,1976) poate fi folosită pe larg pentru formarea liniilor celulare hibride care sunt posesoare ale unui nivel ridicat de anticorpi monoclonali pentru numeroși antigeni specifici.

Pentru izolarea anticorpului dorit de la un material conținând un anticorp astfel obținut, ca antiser, pentru purificarea lui se pot folosi una sau mai multe etape (cromatografie de afinitate, precum cromatografia de afinitate proteină A, cromatrografie de afinitate proteină G, cromatografie Avid gel, cromatografie în gel anti-imunoglobulină fixată, etc.; la fel de bine ca cromatografia de schimb cationic, cromatografia de schimb anionic, cromatografia de afinitate lectină, cromatografia de absorbție de colorant, cromatografia de interreacție hidrofobă, cromatografia în gel de permeație, cromatografia în fază inversă, cromatografie hidroxil-apatită, cromatografia fluorapatită, cromatografia de chelare metalică, cromatografia de punct izoelectric, electroforeza de divizare, electroforeza de punct izoelectric, etc.) pentru purificarea proteinei care pot fi și combinate. în afară de acestea, se poate folosi, de asemenea, o metodă de purificare de afinitate antigenică, în care un gel purtător sau o membrană la care a fost chimic legată însăși o proteină umană TPO sau o peptidă care conține regiunea antigenului sau o parte a regiunii, sau o moleculă capabilă să recunoască anticorpul dorit, se prepară un material care conține anticorpul, se adaugă la acesta, astfel, încât anticorpul de interes să fie absorbit pe purtător sau membrană și anticorpul astfel absorbit se eluează și se recuperează în condiții corespunzătoare.

Invenția de față permite utilizarea secvențelor ADN endogene care codifică o polipeptidă TPO pentru producerea unei mari cantități de produse polipeptidice. De exemplu, procedurile de recombinare omologă in vitro și ex vivo pot fi folosite pentru a transforma celulele gazdă pentru a asigura expresia sau expresia sporită a polipeptidelor. Celule gazdă preferate includ celule umane (de exemplu, ficat, măduvă osoasă și altele) în care se inserează un promotor sau secvență intensificare folosind secvențele de plantare care sunt omologe la o regiune țintă dintr-un genom celular cu rolul de a realiza sau spori expresia polipeptidei TPO. Vezi de exemplu, publicația de brevet US 5272071, publicațiile PCT WO 90/14092, 91/06666 și 91/09955.

De asemenea, prin invenție se asigură procedee pentru producerea unei polipeptide TPO așa cum s-a descris mai sus care cuprinde etapele unei polipeptide codificate printr-unul din ADN-urile invenției într-o gazdă adecvată și izolarea numitei polipeptide TPO. Când polipeptida TPO exprimată este o polipeptidă Met'²-Lys'¹, astfel de procedee pot include suplimentar, etapa de clivare Met ²-Lys’¹ denumită polipeptidă TPO izolată.

De asemenea, sunt asigurate procedee pentru producerea polipeptidelor TPO care au structură (Gly¹) cuprinzând etapele de introducere într-o celulă gazdă adecvată a

ADN-ului care codifică o polipeptidă 5‘ glutation-S-transferază (GST) la secvențele care

R0118299 Β1 codifică polipeptidă TPO, secvențele care codifică GST și polipeptidă TPO separate ADN care codifică o polipeptidă de recunoaștere trombină, izolarea produsului de expresie GST- 740

TPO și tratarea polipeptidei exprimate cu trombină pentru a îndepărta aminoacizii GST. Polipeptidele TPO care rezultă au o structură (Gly¹).

în continuare se descrie invenția în detaliu.

(A) Purificarea TPO de șobolan, analiza parțială a secvențelor de aminoacid a TPO de șobolan purificată și analiza caracteristicilor biologice a TPO de șobolan 745 purificate

Inventatorii prezentei invenții și-au îndreptat inițial atenția spre purificarea unei proteine (TPO de șobolan) care are activitatea de a spori proliferarea și diferențierea de CFUMK de șobolan. în acest studiu de purificare au fost făcute numeroase selecții și încercări eronate asupra procedurilor de purificare cum ar fi, selecția a diferite surse naturale, alege- 750 rea gelurilor pentru cromatografii și modul de separare. Ca urmare, inventatorii au urmărit în purificare o proteină care are o activitate TPO din plasma sângelui șobolanilor trombocitopenici indusă prin raze X sau iradiere cu raze-γ făcând uz de activitatea TPO ca marker bazat pe un test CFU-MK la șobolan care va fi descris mai târziu în “exemplul de referință” și în determinarea secvențelor aminoacide parțiale ale proteinei purificate exemple 1 și 2. 755

Caracteristicile biologice ale TPO de șobolan derivată din plasmă s-au examinat, de asemenea, în exemplul 3.

O prezentare generală a procedurilor de la purificarea TPO de șobolan până la determinarea secvențelor aminoacide parțiale a proteinei purificate este prezentată în cele ce urmează. 760 (i) S-a preparat o probă de plasmă din sângele a circa 11 șobolani trombocitopenici induși prin iradiere cu raze X sau raze γ și s-a supus la o cromatografie Sephadex G-25, o cromatografie de schimb anionic (Q-Sepharose FF) și o cromatografie lectină (WGAAgarose) urmărind ca prin aceasta să se obțină o fracțiune TPO activă adsorbită - WGAAgarose. 765 (ii) Fracțiuna activă TPO adsorbită WGA-Agarose astfel obținută s-a supus la o cromatografie de afinitate de colorant triazinic (TSKAF-BLUE 650MH), o cromatografie interacțiune hidrofob (phenyl)sepharose 6 FF/LS) și o cromatografie de filtrare în gel (sephacryl 5200HR) în același scop. Deoarece, activitatea TPO a fost împărțită în 4 maxime (F1 ca fracțiunea cu cea mai mare greutate moleculară, urmată de F2, F3 și F4) prin filtrarea în gel 770 Sephacryl S-200 HR, fiecare din fracțiunile active TPO F2 și F3 s-au concentrat pentru a obține o probă TPO cu greutate moleculară ridicată F2 și o probă TPO cu greutate moleculară scăzută F3 care s-au folosit separat în etapele următoare de purificare.

(iii) Proba TPO F3 cu greutate moleculară scăzută s-a supus unei cromatografii preparative în fază inversă (YMC-Pack, PROTEIN-RP), o cromatografie în fază inversă (YMC- 775 Pack CN-AP) și o altă cromatografie în fază inversă (Capcell Pack CI) în același scop. Când fracțiunea TPO activă astfel obținută s-a aplicat la dodecilsulfat de sodiu (SDS), apoi electroforeză în gel poliacrilamidic (SDS-PAGE) și s-a extras substanța TPO activă din gel, s-a confirmat prezența activității TPO într-o bandă corespunzătoare la greutăți moleculare aparente de circa 17000 -19000 într-o condiție nereducătoare. 780 >

(iv) Ca urmare, toate fracțiunile TPO active s-au aplicat la SDS-PAGE la o condiție nereducătoare și s-au transferat pe o membrană PVDF. Prin realizarea hidrolizei enzimatice limitate sistematice a proteinei pe membrană PVDF în fragmente peptidice s-au determinat secvențele aminoacide parțiale ale proteinei TPO de șobolan. Pe baza informației secvenței aminoacide a două fragmente peptidice s-a realizat donarea genei TPO de șobolan. 785

Separat de aceasta, proba TPO cu greutate moleculară F₂ obținută prin Sephacyl 5200 HR s-a supus purificării în același mod ca în cazul probei TPO F3 de greutate moleculară scăzută. Când s-a obținut o fracțiune TPO activă prin etapa finală a

RO 118299 Β1 cromatografiei în fază inversă, (Capcell Pack Cl) s-a aplicat la SDS-PAGE și substanța activă TPO s-a extras din gel, s-a confirmat prezența activității TPO într-o bandă corespunzătoare greutăților moleculare aparente de circa 17000 - 22000 într-o condiție nereducătoare.

(B) Specializarea celulelor care produc TPO la șobolani, prepararea de mARN și construcția unei bănci cADN la șobolan

Deoarece, TPO de șobolan astfel purificată provenită din plasma sanguină, a fost necesar să se caute organe sau celule ca sursă de mARN pentru folosire în donarea cADN-ului. Ca urmare s-au căutat activități TPO în diverse organe și supematante de culturi de celule pe baza proprietăților biochimice și biologice ale TPO derivată din plasmă de șobolan. Ca urmare, activități TPO aproape egale cu ale TPO-ului derivat din plasma de șobolan, s-au găsit în supernatantul culturii liniilor de celule McA-RH8994, HTC și H4-II-E derivate din hepatocite de șobolan, la fel de bine ca și în supernatantul culturii de hepatocite primare de șobolan (exemplul 4).

Pe de altă parte, expresia cADN-ului vectorului pEF18S în celule COSI s-a construit din 2 vectori de expresie pME18S și pEFBOS (exemplul 5). Construcția acestui vector a oferit posibilitatea de donare ușoară a cADN folosind un vector de expresie de eficiență ridicată având multiple situsuri de donare care pot fi folosite pentru integrarea inserțiilor.

în plus, față de vectorul de expresie de mai sus s-au folosit, în principal, pentru construcția bibliotecilor cADN, vectori plasmidici, pUC și pBR și vector fagy.

S-au cultivat celule McA-RH8994, s-au omogenizat prin adăugare de soluție tiocianat de guanidină și apoi, s-au supus centrifugării în gradient de densitate CsCI pentru obținerii ARN-ului total (exemplul 6).

Prepararea ARN-ului se poate face, de asemenea, printr-o metodă de fenol fierbinte, o metodă acid guanidiu fenol cloroform și altele asemenea.

După purificarea ARN poli (A)⁺ din ARN-ul total folosind oligodT imobilizat pe particule de latex, s-a sintetizat prima bandă cADN prin acțiunea reverstranscriptazei folosind ca primer oligodT la care fusese adăugat o secvență de recunoaștere a enzimei de restricție Notl, urmată de sinteza celei de-a doua benzi cADN folosind RNază H și ADN polimerază I E.coli. S-a adăugat un adaptor EcoRI la cADN-ul dublu catenar astfel obținut. cADN-ul rezultat s-a ligat într-un vector de expresie pEF18S pentru o celulă de mamifer construit în exemplul 5, care fusese digerat cu Notl și EcoRI și apoi cADN-ul astfel ligat s-a transformat în celule competente ale unei tulpini DH5 E.coli pentru a construi o bibliotecă cADN (exemplul 7).

(C) Prepararea (donarea) fragmentului cADN TPO de șobolan prin PCR

S-a dedus o secvență ADN din secvența aminoacidă parțială a TPO de șobolan care a fost purificată din plasmă sanguină de șobolan, în scopul sintetizării primerilor degenerați ce trebuie folosiți în reacția de polimerizare în lanț (PCR). Primerii necesari pot fi obținuți, de asemenea, pe baza unei secvențe aminoacide, alta decât poziția primerilor folosiți aici. Primeri strict degenerați pot fi, de asemenea, folosiți fără a utiliza inozină. în plus, se pot desemna primeri cu degenerescență redusă făcând uz de un codon care are o practică ridicată la șobolani (Wada și colab. Nucleic Acids Res., vol.18, pp.2367-2411,1990).

Când plasmidul ADN s-a extras din întreaga porțiune a bibliotecii cADN preparată mai sus și s-a realizat PCR folosind ca matriță ADN-ului extras, s-a detectat o bandă de circa 330 bp care a fost ulterior determinată prin analiza secvenței nucleotidice ca un fragment ADN (fragmentul A1) care codifică o porțiune a TPO de șobolan (exemplul 8).

(D) Selectarea cADN TPO de șobolan prin PCR, secvența cADN TPO de șobolan și confirmarea activității TPO

Biblioteca cADN preparată mai sus s-a împărțit în 2 depozite, fiecare conținând circa

10000 clone, și s-a extras plasmidul ADN din fiecare 100 depozite. Când s-au realizat PCR folosind fiecare depozit de plasmid ADN ca matriță și primerii sintetizați de nou pe baza

R0118299 Β1

840 secvenței nucleotidice a fragmentului Al s-au detectat în 3 depozite benzi considerate a fi specifice. Unul din aceste 3 depozite s-a împărțit în subdepozite, fiecare conținând circa 900 clone și s-a purificat plasmidul ADN din 100 subdepozite pentru realizarea PCR în același mod. Ca rezultat s-a detectat o bandă specifică în 3 subdepozite. Unul din aceste depozite s-a divizat în 2 subdepozite fiecare conținând 40 de clone și, în final, fiecare clonă s-a selectat prin PCR în același mod. Ca rezultat s-a izolat o clonă pEF183-A2a care părea a codifica cADN TPO de șobolan (exemplele 9 și 10).

Când secvența nucleotidică a acestei clone s-a analizat, s-a văzut că ea codifică secvența aminoacidă parțială a proteinei purificată din plasmă sanguină de șobolan, confirmând astfel o posibilitate puternică ca această clonă să conțină cADN-ul TPO de șobolan exemplul 10.

Când plasmidul ADN s-a purificat de la clona pEF18S-A2a obținută mai sus și s-a transfectat în celule COS 1, s-a găsit activitate TPO în supematantul culturii celulelor transfectate. Ca urmare, s-a confirmat că clona pEF18S-A2a conține un cADN care codifică TPO de șobolan (exemplul 11).

(E) Detectarea mARN-ului TPO în diverse țesuturi de șobolan

Expresia mARN-ului TPO în țesuturi de șobolan s-a analizat prin PCR și s-a detectat expresia specifică în creier, ficat, intestinele subțiri și rinichi (exemplul 12).

(F) Construcția bibliotecii cADN uman

Pe baza rezultatelor exemplelor 4 și 12, ficatul s-a selectat ca țesut inițial pentru donarea cADN TPO uman. Prin urmare, s-a construit o bibliotecă cADN folosind un mARN comercial derivat din ficatul normal uman. Folosind pEF-18S ca vector, ca și în cazul bibliotecii de șobolan, s-a sintetizat cADN prin aceiași procedură ca în cazul șobolanului pentru obținerea unei biblioteci cADN donată direcțional folosind enzime de restricție Notl și EcoRI. Biblioteca preparată prin introducerea vectorului ligat cADN în E.coli DHS a conținut circa 1200000 clone (exemplul 13).

(G) Prepararea (donarea) fragmentului cADN TPO uman prin PCR

S-au sintetizat câțiva primeri pentru PCR pe baza secvenței nucleotidice a clonei pEF18S-A2a care codifică cADN TPO de șobolan. Când s-a sintetizat cADN folosind un mARN comercial derivat din ficat uman normal și s-au realizat PCR folosind acești primeri și cADN ca matriță, s-a observat o bandă în jur de 620 bp. Când s-a analizat secvența nucleotidică s-a văzut că această clonă conține un fragment ADN care are o omologie de circa 86% cu cADN TPO de șobolan, confirmând astfel o puternică posibilitate că aceasta este o parte a unei gene care codifică TPO uman (exemplul 14).

(H) Selectarea cADN TPO uman prin PCR, secvența cADN TPO uman și confirmarea activității TPO *

Biblioteca cADN uman preparată mai sus s-a amplificat, s-a împărțit în rezerve, fiecare conținând circa 100000 de clone și plasmidul ADN s-a extras din fiecare 90 depozite. Când s-a realizat PCR folosind fiecare rezervă de moleculă de plasmid ADN ca matriță și primeri nou sintetizați pe baza secvenței nucleotidice a fragmentului TPO uman obținut în exemplul 14, s-au detectat benzi posibile în 3 depozite. Unul din aceste depozite s-a împărțit în subdepozite, fiecare conținând 5000 clone și s-a purificat plasmid ADN din fiecare 90 subdepozite. Când s-a realizat PCR folosind fiecare rezervă de plasmidă ADN ca matriță în același mod, s-au detectat benzi posibile în 5 subdepozite. Când unul din aceste depozite s-a împărțit în subdepozite, fiecare conținând 250 clone, și s-a purificat plasmid ADN din fiecare 90 subdepozite și s-a supus la PCR s-au detectat benzi posibile în 3 subdepozite. Când unul din aceste depozite s-a împărțit în subdepozite, fiecare conținând 30 clone, și s-a purificat plasmid ADN din fiecare 90 subdepozite și s-a supus la PCR s-au detectat benzi posibile în 3 subdepozite. După aceasta s-au izolat 90 colonii de la unul din aceste subdepozite și plasmidul ADN purificat de la fiecare colonie s-a supus la PCR pentru a obține în final o clonă numită HL34 (exemplul 15).

845

850

855

860

865

870

875

880

885

RO 118299 Β1

Când s-a analizat secvența nucleotidică a plasmidului ADN din această clonă s-a văzut că această clonă conține un cADN care are circa 84% omologie cu secvența nucleotidică cADN TPO de șobolan (exemplul 16).

Când s-a purificat plasmidul ADN donat și s-a transfectat în celule COS 1 s-a găsit activitate TPO în supernatantul culturii celulelor transfectate. Ca urmare s-a confirmat că această clonă plasmid conține cADN-ul care codifică TPO uman (exemplul 17).

Totuși, acest cADN a părut a fi un produs artificial de donare deoarece, nu s-a găsit nici un codon de terminare în această clonă și s-a găsit o secvență poliA asemenea capătului său terminal 3'. Ca urmare s-a construit un vector de expresie care codifică secvența aminoacidă excluzând o porțiune corespunzătoare secvenței poliA asemănătoare capătului terminal. Când vectorul astfel construit s-a exprimat în celule COS 1, s-a găsit adivitate TPO în supernatantul culturii rezultate (exemplul 18).

Fragmentul ADN din regiunea capătului 3' al TPO umane s-a obținut prin PCR, astfel, încât să se analizeze structura unui cADN de lungime integrală.

Determinarea secvenței nucleotidice a acestui fragment a demonstrat că el se suprapune parțial cu cADN-ul purtat de către dona HL34 obținută în exemplul 15. De asemenea, a fost de așteptat ca un cADN TPO uman de lungime integrală să poată conține un cadru deschis de citire al acestuia și să codifice pentru o proteină constând din 353 aminoacizi. Astfel, s-a sugerat că TPO uman constă din 353 aminoacizi incluzând o secvență semnal de 21 aminoacizi (exemplul 19).

Suplimentar, la metoda de donare de mai sus, donarea cADN TPO uman poate fi atinsă prin hibridizare de colonie sau hibridizare o placă folosind un fragment cADN TPO de șobolan ca o sondă făcând uz de o bibliotecă construită folosind un vector bazat pe plasmidul pUC sau pBR, un vector bazat pe fagul Ă sau altele asemenea. La desemnarea unei sonde degenerate se poate folosi inozina pentru descreșterea gradului degenorescenței. Când este accesibilă o metodă de analiză care poate detecta activitatea TPO într-un mod specific sau cu o sensibilitate ridicată este posibil să se realizeze expresia donării folosind o bibliotecă de expresie ca cea folosită în prezenta invenție.

Cu toate acestea, deoarece conținutul ARN care codifică TPO uman pare a fi extrem de scăzut în ficatul normal uman așa cum se va descrie mai târziu în exemplul 15, (conținutul calculat din rezultatul acestui exemplu a fost într-un raport de 1 la 3000000) selectarea hibridizării în care o oligonucleotidă sintetizată sau un fragment cADN TPO de șobolan sau uman se folosește ca sondă va fi extrem de greu de efectuat, deoarece numărul clonelor sau plăcilor de tratat devine foarte mare și sensibilitatea și specificitatea metodei de hibridizare sunt inferioare celei a metodei PCR. Ca o problemă de fapt, inventatorii prezentei invenții au trebuit să realizeze hibridizarea de colonie a 2 milioane clone într-o bibliotecă cADN din ficat uman normal preparată în exemplul 13 folosind ca sondă un fragment cADN TPO de șobolan, dar nu a fost posibil să se obțină o clonă cADN TPO umană.

(I) Reconstrucția cADN-ului derivat de la ficat uman normal

Deoarece, clona HL34 obținută în exemplul 15 părea să conțină un cADN incomplet, s-a reconstruit o bibliotecă cADN folosind un ARN poli (A)⁺ derivat de la ficat uman normal, comercial pentru a obține un cADN TPO uman complet. Biblioteca (hTPO-F1) s-a preparat prin introducerea vectorului - cADN ligat în E.coli DHS și a conținut 1,0 - 10°C transformanți, (exemplul 20).

(J) Selectarea clonei cADN TPO, determinarea secvenței și expresiei cADN TPO uman, și confirmarea activității TPO

Primerii pentru PCR s-a sintetizat pe baza secvenței nucleotidice (Secv.lD Nr.3) a unui cADN parțial obținut în exemplul 14 și secvența nucleotidică (Secv.lD Nr.196) a unui cADN complet al TPO uman prezis în exemplul 19.

RO 118299 Β1

940

Biblioteca cADN de ficat uman (hTPO-F1) construită în exemplul 20 s-a împărțit în 3 depozite (# = nr., depozit nr.1 - 3). S-au realizat PCR folosind plasmidul ADN preparat de la fiecare depozit ca matriță și s-au sintetizat primeni. Ca urmare, un fragment ADN având mărimea așteptată s-a amplificat când s-a folosit plasmidul ADN preparat din depozitul Nr.3. apoi depozitul nr.3 s-a divizat în subdepozite fiecare conținând 15000 transformanți și s-a sitat folosind PCR realizat ca mai sus. Ca urmare, s-a găsit amplificarea ADN-ului care are mărimea așteptată în 6 din 90 depozite. Când unul dintre aceste depozite pozitive s-a divizat în subdepozite fiecare conținând 1000 clone, și plasmidul ADN s-a extras și s-au realizat PCR în același mod, nu s-a observat amplificarea ADN. Aceasta, s-a considerat a fi produsă printr-o recuperare slabă a plasmidului ADN datorită creșterii mai sărace a clonei de interes față de alte clone. De aceea, bazinul nr.3 inițial s-a diseminat pe plăci 100RS la o astfel de mărime a inoculului, încât au crescut 4100 de colonii pe fiecare placă RB și s-a preparat o placă replică de la fiecare din plăcile astfel inoculate. Când s-a realizat PCR în același mod cum s-a descris mai sus, folosind aceste ADN-uri extrase din coloniile crescute pe placă s-a observat amplificarea unei benzi așteptate în unul din 100 subdepozite.

S-au preparat 2 filtre replică la placa acestui subdepozit și s-a realizat hibridizarea de colonie folosind o sondă marcată (fragmentul EcoRI/BamHI al plasmidului pEF18SHM34). Ca urmare, s-a observat un semnal unic considerat a fi pozitiv. Coloniile s-au colectat de pe placa inițială și s-au inoculat din nou pe o placă RB. S-au preparat probe de ADN de la un total de 50 colonii crescute pe placă și s-au supus la PCR pentru obținerea în final, a clonei denumite pHTF1, exemplul 21. în selectarea clonei cADN în principal, au fost folosite metode precum hibridizarea, PCR, și expresia donării, iar combinația acestor metode a crescut eficiența și sensibilitatea selectării sau a scăzut munca depusă pentru ea. Când s-a determinat secvența nucleotidică a acestei clone obținute pHF1, și secvența amioacidă a unei proteine considerate a fi codificată prin cadrul deschis de citire a coincis complet cu secvența aminoacidă dedusă (Secv.lD Nr.6) a TPO uman. Secvența nucleotidică a fost diferită de una dedusă (Secv.lD Nr.196) la pozițiile 3, dar aceste diferențe nu au produs nici o schimbare de aminoacid. Se confirmă că proteina TPO umană cuprinde 353 resturi aminoacide având o secvență semnal de 21 aminoacizi. Când plasmidul ADN s-a preparat de la clona pHTF1 astfel obținută, și s-a transfectat în celule COS 1, s-a găsit activitatea TPO în supematantul culturii (exemplul 23).

(K) Selectarea ADN-ului cromozomal TPO uman cu ajutorul hibridizării de placă, determinarea secvenței și expresia ADN-ului cromozomal TPO uman și confirmarea activității TPO »

O bibliotecă genomică dată de prof.T.Yamamoto de la Gene Reaserch Center, Tohuku University s-a inoculat pe 18 plăci NZYM cu un inocul de o astfel de mărime, încât o placă a conținut 30000 particule fagice și s-au preparat 2 filtre replică de la fiecare din cele 18 plăci astfel preparate. S-a amplificat prin PCR un fragment cADN TPO uman (baza de la pozițiile numerele 178, până la 1025 din SECV.ID Nr.7) și s-a purificat. Folosind fragmentul purificat marcat cu ^P ca sondă, s-a realizat hibridizarea pe placă. Ca urmare s-au obținut 13 semnale pozitive. S-au colectat plăcile de la plăcile inițiale și s-au inoculat din nou pe plăci NZYM la o astfel de mărime a inoculului încât s-au format 1000 de plăci pe fiecare placă. în continuare, s-au preparat 2 filtre replică de la fiecare placă rezultată pentru a realiza hibridizarea de placă în aceleași condiții ca cele descrise mai sus. în final, s-au detectat semnale pozitive pe toate filtrele celor 13 grupe. S-a recuperat o placă unică de la fiecare dintre plăcile rezultate pentru prepararea de fag ADN. Probele de fag ADN astfel preparate de la cele 13 clone s-au verificat pentru prezența regiunii de codare cADN prin PCR. Din aceste 13 clone 5 au părut a conține întreaga regiune de codificare aminoacidă prezisă de la cADN. Ca urmare, s-a selectat una dintre aceste clone (clona λ HGT1) și s-a analizat prin

945

950

955

960

965

970

975

980

985

RO 118299 Β1

Southern blotting (folosind sonda menționată mai înainte). Deoarece, s-a observat o bandă unică de circa 10 kb în cazul digestiei Hindlll, ADN-ul clonei ĂHGT1 s-a digerat cu Hindlll și s-a supus electroforezei în gel de agaroză. Banda 10 kb s-a excizat din gel, s-a purificat și s-a subclonat într-un vector de donare pUC13 pentru a obține în final, o clonă numită pHGT 1 (exemplul 24).

Când s-a determinat secvența nucleotidică a clonei pHGT 1 astfel obținută, s-a constatat că ADN-ul cromozomal purtat de către clonă conține o regiune de codare întreagă a proteinei prezise în exemplul 19, și secvența nucleotidică a regiunii de codare a coincis complet cu cea a secvenței nucleotidice prezise (SECV.ID Nr.196).

în plus, o regiune corespunzătoare la exonul care codifică aminoacizii a conținut 4 introni și secvența nucleotidică a fost diferită de cea a cADN-ului complet purtat de către clona pHTF1 obținută în exemplul 21 (SECV.ID Nr.7).

Când s-au determinat secvențele nucleotidice a 4 clone rămase printre clonele ADN cromozomale 5 selectate independent prin sitare, s-a găsit că două din cele 4 clone au fost identice clonei pHGT1 și alte două clone au fost la fel cu clona pHGT1 cu excepția că ele au avut o nucleotidă diferită în regiunea 3' care nu codifică așa cum s-a observat cu clona pHTF1 (exemplul 25).

Un fragment EcoRI din clona plasmid pHGT 1 astfel obținută s-a ligat cu un vector de expresie pEF185 pentru a obține plasmidul de expresia pEFHGTE TPO uman. Când s-a preparat plasmidul ADN (pEFHGTE) și s-a transfectat în celule COS 1 s-a găsit activitate TPO în supematantul culturii (exemplul 26).

(L) Prepararea derivaților de deleție TPO uman, expresia lor în celule COS1 și confirmarea activității TPO

Rezultatele exemplelor 18 și 22 au arătat că proteina TPO umană ar putea prezenta activitatea s-a biologică, chiar după îndepărtarea celui de-al 3-lea carboxil terminal al său. Astfel, în scopul analizării în continuare a porțiunilor active biologic s-au realizat experimente cu derivat de deleție. S-au preparat o serie de plasmizi de expresie prin PCR folosind ADN-ul plasmidului clonă pHT1-231 obținută în exemplul 18 ca matriță și oligonucleotide sintetizate ca primeri.

S-au obținut plasmizi de expresie care conțin ADN care codifică derivați de deleție TPO uman lipsiți de regiunea carboxil-terminală a proteinei TPO, astfel fiind derivați de deleție care codifică pozițiile secvenței aminoacide 1-211,1-191,1-171 și 1-163. Când s-a preparat plasmidul ADN de la fiecare clonă și s-a transfectat în celule COS 1, s-a detectat activitate TPO în fiecare supernatant de cultură (exemplul 27).

Când s-au desemnat derivați care au o serie de deleții de resturi aminoacide C-terminale până la poziția 151 și alți derivați care au respectiva deleție a resturilor aminoacide la partea N-terminală până la poziția 6, 7 și 12 și s-a măsurat activitatea după expresia lor în celule COS 1, în vederea analizării activității TPO purtate de regiunea suplimentară în detaliu, activitatea a devenit nedetectabilă când resturile aminoacide pe partea N-terminală s-au deletat până la poziția 7 sau resturile aminoacide pe partea C-terminală s-au deletat până la poziția 161 (exemplele 28 și 29).

Derivați ai unei proteine având activitatea sa biologică TPG se pot obține prin modificarea (deleție, substituție, inserție sau adiție) cADN care codifică proteina. Astfel de metode ca PCR, mutageneza reacționată în sit și sinteza chimică pot fi folosite pentru modificare.

(M) Expresia cADN TPO uman în celule CHO și purificarea TPO

S-a construit un vector de expresie pHTP1 care poate exprima cADN care codifică o secvență aminoacidă dedusă a TPO uman cum s-a prezentat în SECV.ID Nr.6, în celule animale (exemplul 30).

R0118299 Β1

Regiunea cADN TPO din pHTP1 s-a folosit pentru a construi un vector pDEF202hTPO-P1 pentru expresia sa în celula CHO (exemplul 31).

Ca urmare a transfecției vectorului în celule CHO și selecția ulterioară a celulelor transfectate s-au obținut celule transfectate în care vectorul de expresie purtător de cADN TPO uman a fost integrat în cromozomii celulelor CHO (exemplul 32).

în exemplul 32 s-a realizat cultivarea pe scară mare a unei linii celulare CHO producătoare de TPO uman (celulă CHO 28 - 30, rezistență la 25nM MIX) care s-a preparat prin transfectarea plasmidului de expresie pDEF202-hTPO-P1 TPO uman în celulele CHO (exemplul 55).

Din supernatantul culturii de 1001 s-a purificat TPO uman (exemplul 56).

Alternativ, TPO uman s-a purificat din supernatantul culturii din exemplul 55 într-un mod diferit (exemplul 57).

(N) Expresia cADN TPO uman în celule X63.6.5.3. și confirmarea activității

Folosind regiunea cADN TPO codificată în plasmidul pBLTEN preparat în exemplul 30, s-a construit un vector de expresie BMCGSneohTPO-P1 pentru utilizare în celule X63.6.5.3. (exemplul 33).

Când celulele X63.6.5.3. s-au transfectat cu acest vector s-au obținut o celulă transformantă în care vectorul de expresie care codifică cADN s-a integrat în cromozomul său. Când s-a cultivat această cultură s-a detectat activitate TPO în supernatantul culturii (exemplul 34).

(O) Expresia în cantitate mare a TPO uman în celule COS1, purificare măsurarea greutății moleculare și caracteristicile biologice ale acesteia

Vectorul de expresie pHTP1 preparat în exemplul 30, s-a transfectat în celule COS1, pentru obținerea unei cantități mari (un total de circa 401) de supernatant de cultură conținând produsul exprimat (exemplul 35).

Purificarea TPO s-a realizat din circa 71 de supernatant de cultură lipsit de ser a celulei COS1 preparată la exemplul 35 care conține vectorul de expresie pHTP1-derivat TPO. El a fost apt pentru obținerea activitate TPO înaltă prin etapele unui cromatografii de interacțiune hidrofobă, o cromatografie în coloană de schimb cationic o cromatografie în coloană WGA și o cromatografie în coloană în fază inversă (exemplul 35).

TPO astfel purificat parțial din supernatant de cultură de celulă COS1 s-a supus măsurătorii greutății moleculare și analizei caracteristicilor biologice (exemplele 37 și 38).

(P) Expresia TPO uman în E.coli

S-a construit un vector pGEX-2T/hT(1-174) pentru utilizarea în expresia unei proteinei fuzionate (la care se va face referire ca “GST-TPO(1-174)”) de glutation-S-transferază și TPO uman (resturile aminoacide ale pozițiilor 1-174) în E.coli. în acest caz o porțiune a secvenței nucleotidice cADN TPO uman (aproximativ jumătatea ariei părții 5') s-au schimbat cu codenii de preferință E.coli (exemplul 39).

S-a exprimat în E.coli GST-TPO (1-174), celulele rezultate s-au dezintegrat și apoi GST-TPO (1.174) conținut în fracțiunea precipitată s-a solubilizat. în continuare, ca urmare a combinării a diferite etape incluzând examinarea condițiilor TPO de mai multe ori, examinarea purificării (coloană de afinitate glutation, coloană de schimb cationic și altele asemenea) și digestia regiunii proteinei GST cu trombină a fost posibil să se realizeze purificarea parțială a unei proteine conținând secvența aminoacidă TPO așa cum s-a desemnat. S-a confirmat că această proteină prezintă activitate TPO în sistemul de testare CFU-MK de șobolan (exemplele 40 și 41).

1040

1045

1050

1055

1060

1065

1070

1075

1080

RO 118299 Β1

De asemenea, s-a construit un vector pCFM536/h6T (1-163) pentru folosire în expresie în E.coli a unei proteine TPO umane mutante (la care se va face referire ca “hST(1-163)”) în care poziția 1, restul ser și poziția 3 restul ala al TPO uman (resturile aminoacide de la pozițiile 1 până la 163) au fost respectiv înlocuite printr-un rest Ala și un rest Val, și în același timp s-au adăugat respectiv un rest Lys și un rest Met la pozițiile -1 și -2. întreaga porțiune a secvenței nucleotidice cADN TPO uman (corespunzătoare resturilor aminoacide 1 -163) purtată de către acest vector s-a schimbat cu codonii de preferință E.coli (exemplul 42).

în E.coli s-a exprimat h6T(1-163), celulele rezultate s-au lizat și apoi s-a solubilizat h6T (1-163) conținută în fracțiunea precipitată și s-au examinat condițiile pentru obținerea de câteva ori și proteinei, prin aceasta urmărind purificarea parțială a proteinei conținând o secvență aminoacidă TPO așa cum s-a desemnat. S-a confirmat că proteina prezintă activitate TPO în sistemul de testare CFU-MK de șobolan (exemplele 43 și 44).

în plus, s-a construit un vector pCFM536/hMKT (1-163) pentru expresie în E.coli a unei proteine TPO umane de tip mutant (se va face referință la ea ca “hMKT (1-163)”) în care un rest Lys și un rest XL Met au fost respectiv adăugate la pozițiile -1 și -2. S-a exprimat în E.coli hMKT(1-163) în același mod cum s-a descris în exemplul 43 și expresia proteinei s-a supus la SDS-PAGE, s-a transferat pe o membrană PVDF și apoi, s-a supus analizei secvenței aminoacide N-terminale, prin aceasta confirmăm că această proteină conține secvența aminoacidă desemnată (exemplul 52).

în plus, s-a construit vectorul pCFM536/hMKT (1-332) pentru expresia în Eco/ia unei proteine TPO umane de tip mutant în care s-a adăugat la poziția 1 și respectiv, la poziția 2 a TPO uman a unui rest Met (pozițiile aminoacide 1-332) (denumită ca “hMKT (1-332)”). S-a exprimat în E.coliîn același mod ca în exemplul 42 hMKT (1 -332), și expresia sa s-a confirmat prin Western blotting folosind anticorpul peptidic TPO anti-uman preparat în exemplul 45 menționat mai jos (exemplul 66).

(Q) Prepararea anticorpului peptidă anti-TPO și coloană anticorp peptidic antiTPO

S-au preparat anticorpi peptidici policlonali anti-TPO de iepure prin sinteza peptidelor corespunzătoare la 3 regiuni parțiale ale secvenței aminoacide TPO de șobolan determinate în exemplul 10. S-a confirmat că acești anticorpi pot recunoaște molecule TPO de șobolan și uman. Mai mult decât atât, peptidele corespunzătoare la 6 regiuni parțiale din secvența aminoacidă a TPO uman prezentate în SECV. ID.Nr.6, (sau SECV.ID Nr.7), s-au sintetizat și apoi s-au folosit pentru a prepara anticorpi peptidici policlonali anti TPO de iepure. Anticorpii rezultați au fost confirmați ca recunoscând TPO uman (exemplul 45).

Este posibil să se purifice TPO printr-o cromatografie pe coloană de afinitate folosind o coloană pregătită cu anumite molecule care au afinitate de legare pentru TPO, precum anticorpi anti-TPO, receptori TPO și altele asemenea. Ca urmare, s-a pregătit inițial o coloană anticorp anti-TPO prin legarea anticorpului peptidic anti-TPO obținut în exemplul 45 și 46.

(R) Purificarea de TPC uman exprimat în celule COS 1 folosind o coloană anticorp peptidic anti-TPO, greutatea moleculară cu caracteristice ale acesteia

Folosind un supernatant de cultură de la transfecția celulelor COS 1, cu vectorul de expresie pHTP1 ca material de start, s-au obținut TPO parțial purificată și s-a aplicat la coloana anticorp anti-TPO. Deoarece, activitatea TPO s-a găsit în fracțiunea adsorbită, această fracțiune s-a supus ulterior la o cromatografie de coloană în fază inversă pentru a purifica proteina și a examina greutatea moleculară și caracteristicile biologice (exemplul 47).

RO 118299 Β1

1130 (S) Confirmarea activității probei parțial purificată a TPO umane exprimate în celule COS 1

Fracțiunea TPO activă purificată în exemplul 36, numită proba TPO s-a purificat până la etapa coloanei Capcell Pack C1 300A dintr-un supernatant de cultură obținut prin transfectarea celulelor COS 1 cu vectorul de expresie pHTP1, s-a verificat pentru activitățile sale biologice pentru a determina dacă ea exercită o creștere a numărului de plachete într-un organism viu (exemplul 48).

De asemenea, o fracțiune TPO brută obținută printr-o coloană de schimb cationic din 331 supernatant de cultură preparat prin transfectarea celulelor COS1 cu vectorul de expresie pHTP1 s-a verificat pentru activitățile sale biologice pentru a găsi că ea crește numărul de plachete din organism (exemplul 49).

(T) Expresia ADN-ului cromozomal TPO uman în celule CHO și confirmarea activității

S-a construit un vector pentru folosire în exprimarea cromozomală TPO uman în celule CHO (exemplul 50).

Când acest vector s-a introdus în celule CHO s-a obținut o celulă transformantă în care s-a integrat în cromozomul său vectorul de expresie care codifică ADN cromozomal TPO uman. Când s-a cultivat această celulă clonă s-a detectat activitate TPO în supernatantul culturii (exemplul 51).

(U) Purificarea parțială și confirmarea activității TPO uman de tip mutant exprimată în E.coli

TPO uman de tip mutant derivată din secvența nucleotidică TPO uman care codifică clona pCFM536/h6T(1-163) și exprimată în E.coli s-a supus la redublare folosind guanidină hidroclorică și glutation pentru a găsi că cea astfel obținută h6T(1-163) exercită o acțiune de creștere a numărului de plachete în organismul viu (exemplul 53).

TPO uman de tipul mutant derivată de la secvența nucleotidică RPO umană care codifică clona pCFM536/h6T(1-163), și exprimată în E.coli s-a supus la redublare folosind N-lauroil sarcozinat de sodiu și sulfat de cupru pentru a găsi că h(1 -163) obținută exercită o acțiune de creștere a numărului de plachete în organismul viu (exemplul 53).

TPO uman de tip mutant derivată de la secvența nucleotidică care codifică TPO umană, clona pCFM536/h6T(1-163), și exprimată în E.coli s-a supus la redublare folosind N-lauroil sarcozinat de sodiu și sulfat de cupru și apoi la o cromatografie de schimb cationic pentru a găsi că astfel purificată h6T (1-163) crește numărul de plachete în organismul viu (exemplul 54).

Suplimentar, redublarea și purificarea TPO uman de tip mutant, h6T (1-163) s-a dirijat folosind alte proceduri (exemplele 60 și 61).

(V) Expresie cADN TPG uman în celule de insecte și identificarea activității TPO

S-a preparat un virus recombinant pentru expresia TPO umane în celule de insecte (exemplul 58), s-a exprimat în celulă de insectă Sf 21, și ulterior s-a identificat activitatea TPO în supernatantul culturii (exemplul 59).

(W) Expresia TPO umane (pozițiile aminoacide lia 163) în celule CHO și purificarea acesteia

S-a construit vectorul pDEF202-hTPO163 pentru expresie în celule CHO a proteinei TPO umane (cunoscută ca “hTPO 163) care are aminoacizii 1 la 163 din secvența aminoacidă prezentată în SECV.ID Nr.7 vectorul de expresie pDEF202-hTPO163 s-a transfectat în celule CHG și astfel obținută linia celulară CHO producătoare hTPO163 s-a cultivat pe scară mare. Din supernatantul culturii s-a purificat hTPO103 (exemplul 62 la 65).

1135

1140

1145

1150

1155

1160

1165

1170

1175

RO 118299 Β1 (X) Prepararea derivaților substituiți ai TPO umane

S-a preparat un derivat (denumit ca “Ν3/ΓΡΟ”) în care Arg-25 și Glu-231 TPO uman a fost substituit prin Asn și respectiv Lys, ca și un derivat (denumit “09/TPO”) în care His-33 s-a înlocuit prin Thr.

S-a transfectat o plasmidă care codifică pentru fiecare derivat în celule COS 7 care apoi s-au cultivat. S-a detectat activitate TPO în supernatantul culturii (exemplul 67).

S-au preparat derivați în care un aminoacid al lui hST (1-163) s-a substituit prin alt aminoacid folosind sistemul de expresie E.coli. S-a găsit activitate TPO în fiecare derivat (exemplul 94).

(Y) Prepararea derivaților de deleție sau inserție și TPO umane

S-a inserat în, sau s-a deletat din, un aminoacid de la hTPC 163 pentru a prepara derivații săi de inserție sau deleție, și după aceea, s-au transfectat celule COS 7 cu plasmizi care codifică derivații rezultați. în supernatantul culturilor celulelor COS 7, s-a detectat activitatea TPO (exemplul 68).

O metodă pentru măsurarea activității TPO (un sistem test in vitro) folosit în invenția de față este descris în cele ce urmează ca “exemplul de referință”.

(Z) Prepararea și purificarea anticorpilor anti TPO umană

S-au preparat anticorpi policlonali folosind fragmente peptidice ale TPO umane (exemplul 69) și în continuare s-au utilizat în analiza Western Blot (exemplul 70) și în construcția coloanelor de afinitate anticorp-anti-TPO (exemplul 71).

(AA) Activitatea TPO umane in vivo

TPO umană purificată s-a administrat la șoareci cu trombocitopenie indusă și s-au urmărit schimbările în umărul plachetelor față de un grup de control (exemplul 72 și 79) sunt descrise ca metode potențial utile în tratamentul trombocitopeniei. Compoziții farmaceutice (exemplul 80 și 89).

(BB) Activitatea TPO ca o funcție a receptorului de legare MLP

Se dă un test în care activitatea TPO se definește în termeni interacțiunii de legare specifice cu receptorul Mpl. (exemplul 90 și 93).

Exemplul de referință.

A. Sistem de testare a celulei progenitoare megacariocită de șobolan (test CFU-MK de șobolan) (sistem lichid de cultură)

Megacariocitele încorporează și depozitează serotonina extracelulară în granule citoplasmice dense printr-un proces activ dependent de energie (Fedorko, Lab.lnvest., vol.36, pp.310-320, 1977). Acest fenomen se poate observa deja în celule mici și mononucleare acetincolinesterază pozitive care sunt considerate a fi plasate între CFU-MK și megacariocite care pot fi recunoscute (Bricker și Zuckerman, Exp.Hematol., vol.12, p.672, 1984). Cantitatea de serotonina încorporată crește ca răspuns la creștere în mărimea megacariocitelor (Schick și Weinstein, J.Lab.Clin.Med., vol.98, pp.607-615,1981), în plus, se cunoaște că acest fenomen este specific numai pentru celulele megacariocite din celulele de măduvă osoasă (Schick și Weinstein, D.Lab.Clin.Med., vol.99, pp.609-615, 1981). în prezentul sistem de testare celule CFU-MK de șobolan puternic îmbogățite (fracțiune Gpllb/llla⁺CFU-MK care va fi descrisă mai târzie) se cultivă în prezența probelor de testat și se măsoară încorporarea de ¹⁴C-serotonină (¹⁴C-hidroxi triptamin creatin sulfat; ¹⁴C-bHT) în megacariocitele crescute din CFU-MK.

Avantajele acestui sistem de testare sunt acelea că influențează indirect celulele contaminate (de exemplu, formarea activității Meg-CSF prin celule contaminate stimulate printr-o anumită substanță, alta decât factorul de interes, sau formarea unui anumit factor de către celulele contaminate care exercită o acțiune combinată cu factorul de interes/ poate

R0118299 Β1

1225 fi redusă, deoarece procentul de CFU-MK în celulele fracțiunii Gpllb/llla* CFU-MK este marcat ridicat (vezi .următoarea (Metodă de testare)) în timp ce numărul celulelor de contaminare este mic. în plus, pot fi mehținute condiții de cultură corespunzătoare pentru o perioadă relativ lungă deoarece numărul total de celule însămânțate pe un godeu este mic. Alt avantaj este acela că un număr de megacariocite mature de mărime mare crescute din CFU-MK în prezența unei probe active în timpul unei perioade de cultură pot fi detectate vizual în microscopie contrast de fază, aceasta permițând posibilitatea judecării calitative a prezenței și gradului de activitate. Rezultatele aprecierii calitative corespunde rezultatelor determinărilor cantitative bazată pe încorporarea de ^uC-serotonină. Prin urmare siguranța determinării cantitative poate fi îmbunătățită în continuare, prin utilizarea împreună cu aprecierea calitativă.

Metoda de testare

Celule CFU-MK de șobolan puternic îmbogățite (fracția Gpllb/IIla⁺ CFU-MK) folosite în test s-au preparat prin modificarea ușoară a metodei Miyazaki și colab. (Exp.Hematol., vol.20, pp. 855-861,1992).

Pe scurt, se îndepărtează femurul și tibia de la șobolani Wister (masculi, în vârsta de 8 -12 săptămâni) pentru a prepara suspensie celulară de măduvă osoasă așa cum s-a descris. Pentru prepararea suspensiei de celule de măduvă osoasă s-a folosit un mediu de suspendare (o soluție constând din 13,6 mM citrat trisodic, 11,1 mM glucoză, 1 mM adenozină, 1 mM teofilină, 10 mMHEPES /pH=7,25), 0,5% albumină serică bovină (la care ,în continuare, se va face referință ca în “BSA”) (Path-O-Cyte 4; Seikagaku Kogyo Co., Ltd.), și soluție Hanks de săruri echilibrată fără Ca²⁺ și Mg²⁺: la care se va face referire, în continuare, ca “soluție HATCH”) care este o versiune ușor modificată a mediului de separare a megacariocitelor raportat de către Levine și Fedoroko (Levine și Fedoroko, Blood, vol.50, pp. 713-725,1977). Suspensia de celule de măduvă osoasă astfel preparată se depune pe o soluție în gradient de densitate discontinuu Percoll (densitate; 1050 g/ml/ 1063 g/ml/ 1082 g/ml) care se prepară prin diluarea soluției Percoll (fabricată de către Pharmacia) cu soluție HATCH, și s-au centrifugat la 20°C la 400 x g, timp de 20 min. După centrifugare se recuperează celulele dintre straturile de densitate 1063 și 1082 g/ml. După spălare, celulele recuperate se suspendă în mediu de cultură Iscove modificat Dulbecco (la care se va face referință, în continuare, ca “mediu de cultură IMDM”) care conțin 10% serfetal de cal (la care se va face referință în continuare, ca “FCS”) pus în discuri de cultură de țesut din plastic de 100 mm și s-au cultivat la 37°C, timp de 1 h într-un incubator în atmosferă 5% CO₂. După incubare celulele neaderente se recuperează și se cultivă din nou în discuri de plastic la 37°C, 1 h. Celulele neaderente s-au suspendat în soluție HATCH și s-au incubat 1 h pe plăci bacteriologice Petri de 100 mm la care a fost anterior adsorbit un anticorp monoclonal Gpllb/llla anti plachete de șobolan, anticorpul P55 (Miyazaki și colab.,Throm.Res., vol.59, pp. 941-952,1990). După incubare, celulele neaderente se îndepărtează prin spălare completă cu soluție HATCH, și celulele care rămân adsorbite la anticorpul imobilizat P55 se detașează prin pipetare și se colectează. în general, de la un șobolan se obțin 3-4 x 10⁵ celule. Fracțiunea de celule astfel obținute conține CFU-MK de șobolan puternic îmbogățite (la care se va face referință în continuare, ca “fracțiune Gpllb/llla* CFU-MK”, și se cunoaște că această fracțiune de celule conține circa 5 până la 10% CFU-MK pe baza măsurătorii printr-un sistem test de colonie în prezența unei concentrații saturate de IL-3 de șobolan. Un hibridom capabil să producă anticorpul P55 menționat anterior s-a depozitat sub numărul de depozit FERM BP-4563 în Național Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional Trade and Industry în 14 februarie, 1994.

1230

1235

1240

1245

1250

1255

1260

1265

1270

RO 118299 Β1 în continuare, celulele fracțiunii GplIb/IIla⁺ CFU-MK sunt astfel obținute, se suspendă în mediul de cultură IMDM care conține 10% FCS și se repartizează în porțiuni de 10⁴ celule per godeu în 96 godeuri de cultură de țesut. Fiecare godeu este alimentat ulterior cu o probă standard (va fi descrisă mai târziu în detaliu), sau o probă de cercetat, prin aceasta corectând volumul final de mediu la 200 μΙ/godeu. Placa astfel preparată se pune într-un incubator prevăzut cu CO₂ și se incubează 4 zile la 37°C. în ziua a 4-a de incubare se adaugă 0,1 μΟϊ (3,7 KBq) de ¹⁴C-serotonină la fiecare godeu cu 3 h înainte de finalizarea cultivării, iar incubarea finală se continuă la 37°C. După incubare 3 h, placa este centrifugată la 100 rpm 3 min și supernatantul fluid rezultat se îndepărtează prin aspirare. Se adaugă o porțiune de 200 μ\ PBS care, conține 0,05% EDTA la fiecare godeu și placa s-a centrifugat pentru spălarea plăcii prin îndepărtarea fluidului supernatant rezultat. Această etapă de spălare se repetă încă o dată. Se adaugă o porție de 200 μ\ de Triton X-100 2% la peletul de celule astfel obținut din fiecare godeu și placa se agită pe un amestecător de plăci timp de aproximativ 5 ... 10 min pentru a liza celulele complet. O porțiune de 150 μ\ din Uzatul celular astfel obținut se transferă într-un scintilator de solide comercial (Ready Cap; fabricat de către Beckmen) care este în continuare lăsat peste noapte la 50°C într-un cuptor pentru uscarea lizatului. în ziua următoare, Ready Cap se pune într-o fiolă de sticlă pentru a măsura radioactivitatea ¹⁴C printr-un numărător de scintilație în lichid.

în această situație, se pot obține aproape aceleași rezultate ca cele ale testului de încorporare ¹⁴C-serotonină când activitatea acetilcolinesterazei în lizatul celular menționat anterior este măsurat, conform procedurii lui Ishibashi și Burstein (Blood, vol.67, pp. 15121514,1986).

Probe standard

Inițial, s-au preparat plasme sanguine ale șobolanilor trombocitopenici pentru utilizare în prepararea probelor standard în modul următor.

Șobolani normali masculi Wistar (în vârstă de 7 - 8 săptămâni) aduși în stare trombocitopenică prin administrare intravenoasă a anticorpului P55 menționat anterior cu o doză de 0,5 mg/animal, de 2 ori într-un interval de circa 24 h. După 24 h, de la a 2-a administrare s-a colectat sânge din aorta abdominală sub anestezie cu eter folosind o seringă cu capacitatea de 10 ml în care fusese introdusă ca agent anticoagulant 1 ml soluție de cifrat trisodic 3,8% (v/v). Proba de sânge astfel conectată s-a repartizat în eprubete de centrifugare din plastic și s-a centrifugat la 1200 x g, 10 min pentru recuperarea fracțiunii plasmatice sanguine. Fracțiunea plasmatică sanguină astfel recuperată s-a centrifugat din nou la 1200 x g, 10 min și fracțiunea plasmatică recuperată având grijă să se evite pelete constând din celule, plachete și altele asemenea și s-a depozitat. (Plasma sanguină obținută în acest mod se va referi în continuare, ca ‘TRP”). TRP tratată ca(probă standard C), fracțiunea activă coloană WGA-Agaroză (proba standard W), sau fracțiunea activă coloană PHENYL SPEHAROSE 6 FF/LS (Proba standard P) obținute de la TRP în conformitate cu procedura de la exemplul 1, s-au dializat extensiv împotriva unui volum suficient de mediu de cultură IMDM și s-au folosit ca standarde de testare.

în procedeul purificării TPO de șobolan descris în exemplul 1, proba standard C s-a folosit în etapa timpurie, dar s-a schimbat la proba standard W după jumătatea procedurii și apoi la proba standard P. Activitatea specifică a probei standard C s-a notat cu 1 și activitățile relative ale probelor standard W și P s-au calculat pe baza acestei notări. Activitatea relativă a fiecărei probe de testat s-a determinat prin compararea curbei doză-răspuns a probei standard față de cele ale probelor de testat, și activitatea relativă a probei de testat s-a notat cu n când activitatea sa este de n ori mai ridicată decât cea a probei standard C.

RO 118299 Β1

B. Sistemul test de colonie în acest sistem de testare celule de măduvă osoasă se cultivă într-un mediu de cultură semisolid în prezența unei probe de' cercetat și se măsoară activitatea Meg-CSF prin numărarea numărului coloniilor de megacariocite formate prin proliferarea și diferențierea CFU-MK.

Metoda de testare (a) în cazul folosirii celulelor de măduvă osoasă neseparate și altele asemenea într-un disc de plastic pentru cultură de țesut de 35 mm s-a pus 1 ml volum final de mediu de cultură IMDM conținând celule de măduvă osoasă neseparate, celule obținute din fiecare etapă de separare a Gpllb/llla⁺ CFU-MK de la sistemul de analiză A, menționat anterior, sau celule ale fracțiunii Gpllb/llla⁺ CFU-MK, și 10% FCS, 2 mM glutamină, 1 mM piruvat de sodiu, 50 μΜ 2-mercaptoetanol, și 0,3% agar (AGAR NOBLE, fabricat de către DIFCO) și după solidificare la temperatura camerei s-au cultivat la 37°C într-un incubator CO₂. în general, numărul de celule pe un disc se ajustează până la 2-4 x 10⁵ în cazul celulelor de măduvă osoasă neseparate, 2-5 x 10⁴ în cazul celulelor de la etapa gradientului de densitate Percoll sau reducerea aderenței, sau 0,5-2 x 10³ în cazul celulelor fracțiunii Gpllb/llla* CFU-MK. După 6-7 zile de cultură, discurile de agar se detașează de pe plăci și se plasează pe lame de sticlă (76 mm x 52 mm). Pentru a usca fiecare disc de agar, se plasează o bucată de sită de naylon 50 μηΊ și hârtie de filtru, peste gel în acest scop. Fâșiile de agar, astfel uscate, s-au fixat prin încălzire timp de 5 min, la 50°C pe o placă fierbinte și s-au îmbibat 2 - 4 h într-o soluție de colorare acetilcolinesterază preparată conform procedurii lui Jackson (Blood, vol.42, pp.413-421,1973). Când s-a confirmat colorarea suficientă a megacariocitelor, fâșiile de agar s-au spălat cu apă, s-au uscat, s-au supus la postcolorare cu soluție de hematoxilină Horris 30 s, s-au spălat cu apă și apoi s-au uscat la aer. Coloniile de megacariocite sunt definite ca 3 sau mai multe celule acetilcolinesterază pozitive grupate compact.

(b) în cazul utilizării celulelor de măduvă osoasă de șoarece neseparate

Testul de colonie poate fi realizat în același mod ca procedura (A) descrisă mai sus folosind 2-4 x 10⁵ celule/disc.

(c) în cazul folosirii celulelor de măduvă osoasă umană sau celule sanguine cordale umane

Celulele de măduvă osoasă umană sau celule sanguine cordale umane pot fi folosite ca atare sau ca fracțiuni CFU-MK îmbogățite în modul următor.

Inițial, măduvă osoasă fluidă sau sânge cordal se depune pe Lymhoprep (fabricată de Daiichi Kagaku Co., Ltd.) și s-au centrifugat și s-a recuperat fracțiunea leucocitară rezultată la interfață. Din fracțiunea celulară astfel recuperată, celule la care se leagă anticorpii monoclonali biotinilați specifici pentru antigene umane de suprafață (CD2, CD11c și CD19) se îndepărtează cu bile magnetice legate avidină. Celulele îndepărtate prin metoda bilelor magnetice sunt, în principal, celule B, celulele T, macrofage și o parte din granulocite. Celulele care rămân se colorează cu anticorp anti-CD34 marcat FITC și anticorp anti-HLA-DR marcat PE, și apoi se recuperează o fracțiune pozitivă CD34 și HLA-OR folosind un sortator de celule (de exemplu, ELITE fabricat de către COULTER). Celulele CFU-MK se concentrează în această fracțiune (la care se va face referință în continuare, ca: fracțiunea CD34⁺DR⁺ CFU-MK. Testul de colonie al celulelor umane se poate realiza ca în cazul menționat anterior al utilizării celulelor de măduvă osoasă de șoboloan, cu excepția că se folosesc 3-5 x 10³ celule ale fracțiunii CD34⁺DR⁺ CFU-MK într-un disc și se folosește în loc de 10% FCS un amestec de 12,5% plasmă umană AB și 12,5% FCS. Perioada de cultură pentru formarea coloniilor de megacariocite este 12-14 zile. Pentru detectarea megacariocitelor umane colorarea imunologică a megacariocitelor se realizează printr-o metodă anticorp

1320

1325

1330

1335

1340

1345

1350

1355

1360

1365

RO 118299 Β1 alcalin fosfatază-anti-alcalin-fosfatază cu un anticorp monoclonal de șoarece specific pentru antigenul de suprafață megacariocitar Gpllb/llla (de exemplu, Teramura și colab.

Exp.Hematol.vol.16, pp.843-848,1988), și fiecare colonie care constă din 3 sau mai multe megacariocite se numără.

C. Sistemul de testare cu o linie celulară megacarioblastică umană (test M-07e)

Celule M-07e, o linie celulară megacarioblastică umană, proliferează în răspuns la GM-CSF, IL-3, SCF, IL-2 și altele asemenea (Avanzi și colab. J.Cell. Physiol., voi.145, pp.458-464,1990). Deoarece aceste celule răspund, de asemenea, la TPO, ele sunt aplicabile la un sistem de testare substitutiv pentru sistemul de testare CFU-MK de șobolan.

Metoda de testare

Se recuperează celule M-07e menținute în prezență de GM-CSF, se spală complet și apoi se suspendă mediu de cultură IMDM care conține 10% FCS. Suspensia de celule M-07e rezultată se repartizează în porțiuni de 10⁴ celule în godeurile unei plăci de cultură de țesut cu 96 godeuri, și fiecare godeu este alimentat ulterior cu o probă standard sau o probă de testat, prin aceasta ajustând volumul final la 200 μΙ/godeu. Placa astfel preparată se pune într-un incubator 5% CO₂ și se incubează la 37°C. După 3 zile de cultură se adaugă la fiecare godeu 1 ^Ci (37 KBq) de ³H-timidină, 4 h înaintea completării culturii. După completarea cultivării, celulele se colectează pe un filtru de fibră de sticlă folosind un recoltator de celule pentru a măsura radioactivitatea ³H cu un contoar de scintilație în lichid (de exemplu, Beta Plate fabricat de Pharmacia).

D. Un sistem de testare (Ba/F3 test) în care se folosește o linie celulară pro-B de șoarece

Linia celulară pro-B Ba/F3 de șoarece este cunoscută ca o linie celulară care proliferează în răspuns la IL-3, IL-4 și altele asemenea (Palacios și colab., Cell, vol.41, pp.727-734). Deoarece, substratul său BF-TE22 este capabil de proliferare celulară nu numai ca răspuns la IL3 și IL4 ci, de asemenea, la TPO, ea poate fi aplicată la un sistem de testare ca un înlocuitor pentru testul CFU-MK de șobolan sau testul cu sprijinul liniei celulare megacarioblastică umană (test M-070) care este după cum urmează. Pe scurt, celule BF-TE22 crescute în mediu Iscove modificat DME (IMDM: GIBCO) în prezența a 1 ng/ml IL-3 de șoarece se recuperează, se spală de 3 ori cu IMDM și se suspendă în mediu IMDM care conține 10% FCS. în continuare, suspensia de celule se repartizează în godeurile unei plăci de cultură de țesut cu 96 de godeuri la o densitate de 1 x 10⁴ celule/godeu, fiecare godeu se suplimentează ulterior cu o soluție TPO standard sau o probă de testat și se ajustează la un volum final de 200 μΙ/godeu. Placa rezultată se incubează 2-3 zile într-un incubator cu 5% CO₂. în ziua a 2-a sau a 3-a se adaugă la fiecare godeu un μθΐ (37 KBq) de ³H-timidină la fiecare godeu și cultivarea se continuă pentru încă 4 h. în final, se colectează celulele pe un filtru de fibră de sticlă folosind un recoltator de celule pentru măsurarea radioactivității ³H cu un contoar de scintilație în lichid. în acest sistem de testare, aproape toate celulele cultivate în mediu lipsite de activitate TPO, mor și prin urmare nu încorporează ³Htimidină. Cu toate acestea, celulele cultivate în mediul care conține activitatea TPO prezintă proliferare activă într-un mod dependent de concentrația TPO și încorpora ³H-timidină. în plus, rezultatele acestui test sunt paralele celor ale testelor M-07e și CFU-MK.

în continuare, se prezintă 94 de exemple de realizare a invenției.

Exemplul 1-1. Purificarea TPO de șobolan din plasma sanguină a șobolanilor trambocitopenici induși prin administrare de anticorp anti-plachetar. Prepararea plasmei sanguine a șobolanilor trombocitopenici induși prin administrare de anticorp anti-plachetar

S-au preparat TRP ca sursă purificată de la circa 1000 șobolani în conformitate cu procedura descrisă la exemplul de referință A, menționat mai sus, sistemul test de celule precursoare megacariocite de șobolan (CFU-MK).

R0118299 Β1

1420

Purificarea TPO de șobolan din TRP

Inițial, purificarea s-a realizat folosind TRP a circa 1000 șobolani presupunând că, conținutul în TPO din TRP va fi la majoritatea de unul pe 3 milioane și s-au obținut sub 1 μωοΙ de TPO de șobolan parțial purificată. Cu toate că, în general, este dificil, s-a făcut o încercare de a analiza secvențele sale aminoacide parțiale și s-au obținut 3 secvențe aminoacide, dar cu o precizie redusă. Aceste secvențe au coincis cu, sau sunt apropiate de secvența aminoacidă a unui inhibitor serinprotează (SPI) produs în ficat. Nu a fost clar din aceste rezultate dacă TPO are o structură similară celei a inhibitorului serinproteazei sau dacă secvențele sunt derivate de la cele ale proteinelor contaminate, altele decât TPO. Folosind aceste secvențe nesigure s-a realizat donarea genei TPO de la o bibliotecă cADN de șobolan, dar nu s-au putut obține gene potențiale care codifică TPO. în continuare, s-au realizat studii intensive pe baza unei presupuneri că un astfel de eșec s-a datorat purității scăzute și cantității insuficiente a probei analizate. în scopul obținerii unei probe finale purificate necesară pentru a analiza aminoacizii, s-a realizat purificarea în conformitate cu un procedeu descris în exemplul 1-2, care urmează. în mod surprinzător, s-a estimat din rezultatele exemplului 1-2 că, conținutul TPO în TRP sau XRP (va fi descris în continuare) a fost o cantitate extrem de mică de ordinul 1 la 100 milioane până la 1 la 1 miliard din totalul proteinelor plasmatice, astfel, încât purificarea sa completă a fost extrem de dificilă.

Exemplul 1-2. Purificarea TPO de șobolan din plasma sanguină a șobolanilor trambocitopenici induși prin iradiere totală a corpului cu Raze X sau γ. Prepararea plasmei sanguine a șobolanilor trombocitopenici induși prin iradierea întregului corp cu raze X sau γ)

La șobolani Wister masculi normali (în vârstă de 7 - 8 săptămâni) s-a indus trombocitopenia prin iradierea întregului corp cu raxe X sau la o doză subletală (6 până la 7 Gy). S-a colectat sângele de la șobolani în ziua a 14-a după iradiere și o fracțiune de plasmă sanguină (pentru a fi în legătură cu “XRP” în continuare) s-a preparat în același mod cum s-a menționat anterior la procedura pentru prepararea TRP.

în acest caz, XRP (circa 81) s-a preparat dintr-un total de circa 1100 șobolani și s-a folosit ca sursă de purificare.

Purificarea TPO de șobolan din XRP

Proba de plasmă sanguină a circa 1100 șobolani a fost atât de mare pentru prelucrare la un moment dat, deoarece conținutul său de proteină totală a atins 493000 mg. Ca urmare, proba de plasmă sanguină s-a împărțit în 11 loturi, fiecare corespunzând la circa 100 șobolani pentru următoarele etape de purificare (1) la (4). în etapele următoare de purificare (5) la (7), proba s-a împărțit în 6 șarje. în timpul și după etapa de purificare (8), s-a folosit o probă purificată brut de la plasma sanguină totală de circa 1100 șobolani. în cele ce urmează se descrie un exemplu tipic a fiecărei etape de purificare în cazul unui lot (XW9) și a unei șarje (XB6).

în toate etapele purificării s-a măsurat activitatea TPO folosind sistemul de testare CFU-MK descris în “exemplul de referință”. în afară de cazul când s-a notat în alt fel, toate etapele de purificare s-au realizat la 4°C, excluzând cromatografiile în fază inversă și filtrarea în gel Superdex 75 pg în prezența unui agent tensioactiv care s-au realizat la temperatura camerei. Testul de proteină s-a realizat printr-un test de legare a unui colorant Coomassie (un sistem de reactivi fabricat de PIERCE, număr de catalog 23236X) sau o metodă care folosește acid bicinconinic (un sistem de reactiv fabricat de către PIERCE, număr de catalog 23225).

1425

1430

1435

1440

1445

1450

1455

1460

RO 118299 Β1

O schiță a purificării este prezentată în tabelul 1.

Tabelul 1

Purificarea plasmei TPO de șobolan

	Etapa	Proteină totală ,mg	Activitate relativă	Activitate totală	Activitate recuperată,%
	Plasmă totală	493000	-	-	-
	Plasmă trat.Ca/G25	480300	2	864600	100
Schimb ionic	Q-Sepharose FF	314400	9	704000	313
Lectină	WGAAgarose	15030	132	1987000	230
Triazină colorant	TSK-gel AFBlue 650 MH	4236	905	3834000	443
Hidrofobic	PhenylSepharose 6 FF/LS	2762	847	2339000	271
Filtrare în gel	S-200HR F3 (TPO molec. scăzută)	51	20000	1020000	118
	S-200HR F2 (TPO molec. ridicată	262	7838	2055000	238

TPO molec. scăzută (din S-200HR F3)

	Etapa	Proteină totală, mg	Activitate relativă	Activitate totală	Activitate recuperată, %
Filtrare în gel	S-200HR F3 (TPOmolec. scăzută)	50,3300	20000	1007000	116
Fază inversă	YMC proteinăRP-prep	2,8540	130000	371000	43
Fază inversă	YMC CN-AP	0,3730	800000	298400	35
Fază inversă	Capcell Pak CI	0,0396	4890000	193600	22
Electroforeză	SDS-PAGE 15%	0,0017	149000000	2503000	29

(în condiții nereducătoare)

R0118299 Β1

1505

TPO molec.ridicată (din S-200HR F2)

	Etapa	Proteină totală ,mg	Activitate relativă	Activitate totală	Activitate recuperată, %
Filtrare în gel	S-200HR F2 (TPO molec. ridicată)	257,0000	7840	2015000	233
Fază inversă	YMC protein RP prep	11,4000	227000	2588000	300
Filtrare în gel	Superdex 75pg/CHAPS	1,1660	1750000	2041000	236
Fază inversă	YMC CN-AP	0,6200	700000	434000	50
Fază inversă	Capcell Pak CI	0,0630	20000000	1260000	146
Electroforeză	SDS-PAGE 15%	0,0030	330000000	990000	117

(în condiții nereducătoare)

1510

1515 (1) Tratamentul clorură de calciu, centrifugarea și tratamentul inhibitori de protează a plasmei sanguine de șobolan în cazul lotului nr.XW9

S-a dezghețat XRP (742 ml; concentrat de proteină, 54,8 mg/ml; proteină totală, 40696 mg) corespunzătoare la circa 100 șobolani, care fusese depozitată la -80°C, și s-a repartizat în tuburi de centrifugare din polipropilenă (fabricate de către Nalgene). S-a adăugat clorură de calciu pudră la fiecare eprubetă până la o concentrație finală de 100 mM. După incubare peste noapte la 4°C, amestecul rezultat s-a centrifugat la 8000 rpm, 60 min. La fluidul supernatant TPO-activ rezultat (742 ml; concentrația proteinei, 54,9 mg/ml; proteina totală, 40740 mg) s-a adăugat un inhibitor de protează p-APMSF ((p-aminodifenil) metasulfonil fluorură hidroclorică, fabricat de către Wako Pure Chemical Industries, LTD., Număr de catalog 010-10393) până la o concentrație finală de 1 mM. Proba astfel obținută s-a folosit în următoarea etapă coloană Sephadex G-25 tampon schimb.

în acest mod, tratamentul cu clorură de calciu/p-APMSF a întregului XRP derivat de la circa 1100 șobolani (volum total, 8184 ml; proteină totală, 493000 mg) s-a efectuat prin divizarea ei în 11 loturi, fiecare lot fiind echivalentul a circa 100 șobolani și s-a realizat tratamentul acestor loturi unul câte unul. Cele 11 probe rezultate s-au prelucrat separat în etapa următoare coloană Sephadex G-25.

(2) Sephadex G-25 “tampon de schimb” în cazul lotului nr.XW9

Fluidul supernatant obținut după tratamentul Ca de la etapa (1) (742 ml; concentrația proteinei, 54,9 mg/ml; proteina totală, 40740 mg) s-a aplicat la o rată de curgere de 40-70 ml/min la o coloană Sephadex G-25 (fabricată de către Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0033-03; diametru, 11,3 cm; înălțimea patului, 47 cm) care a fost echilibrată înainte cu 20 mM Tris-HCI, pH=8. Eluția s-a realizat cu același tampon. S-a îndepărtat o porțiune de 1300 ml eluat înaintea de eluarea proteinei. Când s-a detectat absorbția UV din eluat, fracțiunile s-au depozitat până la conductivitatea electrică care a atins 500 pS/cm, prin aceasta recuperând o fracțiune de proteină TPO activă schimbată prin 20 mM Tris-HCI, pH=8 (1377 ml; concentrația de proteină, 27,56 mg/ml; proteina totală 37882 mg; randamentul proteinei, 93%). Activitatea relativă a TPO din fracțiune a fost găsită a fi 2,3.

1520

1525

1530

1535

1540

1545

RO 118299 Β1

Ca urmare a tratamentului pe coloană Sephadex G-25 a tuturor loturilor de probe, s-au obținut pe coloană Sephadex G-25 un total al fracțiunii TPO active de 21117 ml (proteină totală, 480300 mg; activitate relativă medie,2; activitate totală, 864600).

(3) Q-Sepharose FF “cromatografie de schimb anionicputernică” în cazul lotului nr.XW9

Fracțiunea TPO activă obținută în etapa (2) de mai sus prin tratamentul Sepharose G-25 (1377 ml; concentrația proteinei, 27,5 mg/ml; proteina totală, 37841 mg; activitate relativă, 2,3) s-a aplicat la o Q-Sepharose FF (fabricată de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0510-01; diametru 5 cm; înălțimea patului 27 cm) la o rată de curgere de 40 ml/min, eluată cu 20 mM Tris-HCI (pH=8) și o fracțiune F1 care trece prin coloană s-a depozitat (3949 ml; concentrația proteinei, 0,98 mg/ml; proteina totală, 3870 mg; activitatea relativă, 0).

în continuare, tamponul s-a schimbat la 20 mM Tris-HCI, (pH=8) conținând 175 mM NaCI pentru a elua o fracțiune F2 TPO activă (4375 ml; concentrația proteinei, 5,36 mg/ml).

în sfârșit, o fracțiune F3 (1221 ml; concentrația proteinei, 3,9 mg/ml; proteină totală, 4783 mg; activitate relativă, 3,8) s-a eluat cu 20 mM Tris-HCI (pH=8) conținând 100 mM NaCI. Proteina totală din fracțiunea F2 TPO activă s-a găsit a fi 23440 mg și randamentul proteinei lui F2 prin această etapă a fost 61,9%. Suplimentar, activitatea relativă a TPO s-a crescut până la 6,8.

Rezultatul aplicării tuturor loturilor de fracțiunile TPO active Sephadex G-25 la Q-Sepharose FF s-a obținut un total de 35842 ml fracțiune F2 TPO activă Q-Sepharose FF (proteină totală, 314384 mg; activitate relativă medie, 8,6; activitate totală, 2704000).

(4) Aglutinină grâu germinat (WGA)-Agarose “cromatografie de afinitate lectină” în cazul lotului nr.XW9

Fracțiunea F2 TPO activă obținută în etapa (3) de mai sus prin tratament Q-Sepharose FF s-a împărțit în 3 porțiuni și s-a aplicat la WGA-Agarose (fabricată de către Honen Corp., număr de catalog 800273; diametru 5 cm; înălțimea patului 22,5 cm) la o rată de curgere de 5 ml/min, și s-a eluat cu tampon fosfat izotonic Dulbecco (DPBS). S-a depozitat o fracțiune F1 care a trecut prin coloană (în 9336 ml; concentrația proteinei, 2,30 mg/ml; proteina totală, 21407 mg; activitate relativă, 6,9).

în continuare, tamponul s-a schimbat la tampon 20 mM fosfat de sodiu (pH=7,2) conținând 0,2M N-acetil-D-glucozamină (GlcRAc, fabricat de către Nacalai tesque, număr de catalog 005-20), 150 mM NaCI și 0,02% azidă de sodiu, și eluatele rezultate s-au depozitat și concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Uldtrasette, greutatea moleculară nominală de separare, 8000; fabricată de către Filtron), prin aceasta obținând o WGA-Agarose care absoarbe fracțiunea F2 TPO activă (2993 ml; concentrația proteinei, 0,376 mg/ml).

Proteina totală din fracțiunea F2 TPO activă s-a găsit a fi 1125 mg, și randamentul proteinei lui F2 prin aceasta etapă a fost 4,8%. în plus, activitatea relativă a TPO a crescut până la 101. Fracțiunea F2 astfel obținută s-a depozitat la - 80°C.

Ca urmare a aplicării tuturor loturilor fracțiunilor F2 TPO active Q-Sepharose FF la WGA-Agarose, s-a obținut un total de fracțiuni F2 TPO activă WGA-Agarose de 33094 ml (proteina totală, 15030 mg; activitatea relativă medie, 132; activitate totală, 1987000).

(5) TSK-gel AF-BLUE 650 MH “cromatografie de adsorbție dye” în cazul șarjei nr.XB6

WGA-Agarose care a absorbit fracțiunea TPO activă a lotului nr.XWS și

WGA-Agarose care a absorbit fracțiunea F2 TPO activă a lotului nr. XW9 obținute în etapa (4) de mai sus plecând de la XP echivalentul a 215 șobolani s-au combinat ca șarja nr.XB6 (5947 ml; concentrația proteinei 0,388 mg/ml; proteina totală 2319 mg; activitate relativă, 150).

RO 118299 Β1

1600

O porțiune de 5974 ml a probei combinate s-a amestecat cu 0,85 mol de NaCI pentru 1000 ml (295,76 g în total) pentru a face 61,32 ml de soluție având o concentrație finală de NaCI de 0,822 M, și soluția rezultată s-a aplicat la o rată de curgere de 7 ml/min la o coloană TSK-gel AF-BLUE 650 MH (TOSOH CORP., număr de catalog 08705; diametru 5 cm; înălțimea patului 23 cm) care fusese echilibrată în avans cu un tampon 20 mM fosfat de sodiu (pH=7,2) conținând 1M NaCI.

După completarea cererii, proteina s-a eluat folosind tampon 20 mM fosfat de sodiu (pH=7,2) conținând 1M NaCI la o rată de curgere de 10 ml/min. Eluatele rezultate s-au strâns și concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultrasette, greutatea moleculară nominală de separare, 8000) prin aceasta obținând fracțiunea F1 (543 ml; concentrația proteinei 2,05 mg/ml; proteina totală 1112 mg; activitatea relativă 31).

în continuare, tamponul de eluție s-a schimbat la 2 M NaSCN pentru a obține un eluat TSM-gel AF-BLUE 650MH care adsoarbe fracțiunea F2 TPO activă (1427 ml; concentrația proteinei, 0,447 mg/ml).

Proteina totală din fracțiunea F2 TPO activă s-a găsit a fi 638 mg și randamentul proteinei lui F2 prin această etapă a fost 27,5%. în plus, activitatea relativă a TPO a crescut la 1500.

Ca rezultat al aplicării tuturor șarjelor de WGA-Agarose care au adsorbit fracțiunile F2 TPO active la TSK-gel AF-BLUE 650 MH s-au obținut un total de 10655 ml de fracțiune F2 TPO activă TSK-gel AF-BLUE 650 MH (proteină totală 4236 mg; activitate relativă medie, 905 activitate totală, 3834000).

(6) Phenyl Sepharose 6 FF+LS “cromatografie de interacțiune hidrofobică” în cazul șarjei nr.XB6

O porțiune de 1424 ml a fracțiunii F2 TPO activă TSK-gel AF-BLUE 650 MH (1424 ml; concentrația proteinei 0,447 mg/ml; proteină totală 638 mg; activitate relativă, 1500) s-a amestecat cu 1,5 mol de sulfat de amoniu pudră pe 1000 ml (282,2 g în total) pentru a face 1581 ml de soluție care are o concentrație finală de sulfat de amoniu de 1,35 M.

Soluția rezultată s-a aplicat la o rată de curgere de 7 ml/min la o coloană Phenyl Sepharose 6FF (LowSub) (Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0965-05; diametru 5 cm; înălțimea patului 10 cm) care fusese echilibrată în avans cu tampon 50 mM fosfat de sodiu (pH=7,2) conținând 1,5 M sulfat de amoniu. După completarea aplicării, eluția s-a realizat folosind tampon 36 mM fosfat de sodiu conținând 0,8 M sulfat de amoniu la o rată de curgere de 10 ml/min. Eluatele rezultate (circa 3150 ml) s-au strâns și concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultrasette, greutatea moleclară nominală de separare, 8000), prin aceasta obținând o fracțiune F1 (485 ml; concentrația proteinei 0,194 mg/ml; proteina totală 94,2 mg; activitatea relativă, 0).

în continuare, tamponul de eluție s-a schimbat la tampon 20 mM fosfat de sodiu (pH=7,2) pentru a obține o fracțiune F2 eluată TPO activă (circa 3500 ml). Fracțiunea eluată s-a concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultrasette, greutatea moleculară nominală de separare, 8000) și s-a luat o probă pentru analiză. La această etapă, concentrația proteinei și proteina totală a fracțiunii F2 TPO activă (220 ml) s-au găsit a fi 1,45 mg/ml și, respectiv, 319 mg, randamentul proteinei lui F2 prin această etapă a fost 50,0%. Activitatea relativă a TPO s-a găsit a fi 1230.

Ca rezultat al aplicării tuturor șarjelor de fracțiunii F2 TPO active TSK-gel AF-BLUE 650 MH la Phenyl Sepharose 6 FF/LS s-a obținut un total de 1966 ml de fracțiuni F2 TPO activă Phenyl Sepharose 6 FF/LS (proteina totală 2762 mg; activitatea relativă medie, 847; activitatea totală, 2339000).

1605

1610

1615

1620

1625

1630

1635

1640

1645

RO 118299 Β1 (7) Sephacryl S-200 HR “cromatografie de filtrare în gel” în cazul șarjei nr.XB6 (fig. 1)

Fracțiunea F2 TPO activă Phenyl Sepharose 6 FF/LS (217 ml; concentrația de proteină 1,75 mg/ml; proteina totală, 315 mg; activitatea relativă, 1230) s-a amestecat cu 144,8 ml de soluție NaCI 5M pentru a face 362 ml soluție având o concentrație finală NaCI de 2M și soluția rezultată s-a concentrat până la circa 50 ml folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM3 (76 mm diametru, fabricată de Amicon Corp).

La aceasta s-a adăugat același volum (50 ml) de uree 8M, prin aceasta obținând circa 100 ml de soluție având concentrații finale de 1M NaCI și 4M uree. Aceasta s-a concentrat până la circa 80 ml transformând-o într-o probă de 88,78 ml și apoi s-a aplicat la o coloană Sephacryl S-200HR (fabricată de către Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0584-01; diametru 7,5 cm și înălțimea patului 100 cm).

în continuare, eluția s-a efectuat cu DPBS la o rată de curgere de 3 ml/min, și eluatele după aruncarea unul volum de 1200 ml s-au colectat în porțiuni de 45 ml în 60 eprubete de polipropilenă. Analiza s-a efectuat pe fiecare 2 eprubete și restul s-a depozitat la -85°C până când s-a terminat tratamentul Sephacryl S-200 HR al tuturor probelor derivate de la 1100 șobolani. Pe baza rezultatelor analizei, fracțiunile șarjei nr.XB6 s-au grupat după cum urmează.

(F1) Eprubetele nr.1-15 (fracțiuni în jurul volumului eliminat; greutatea moleculară);

(F2) Eprubetele nr. 16-26 (greutate moleculară 94000 până la 33000);

(F2) Eprubetele nr.27-44 (greutate moleculară 33000 până la 3000);

(F2) Eprubetele nr.45-55 (greutate moleculară 3000 sau mai puțin).

în acest mod, toate șarjele de fracțiuni F2 TPO active obținute prin Phenyl Sepharose 6 FF/LS s-au separat, s-au supus la Sephacryl S-200 HR, s-au analizat și s-au depozitat la - 85°C. După terminarea tratamentului S-200 HR al tuturor șarjelor și chiar înaintea operației următoare de cromatografie în fază inversă (YMC-Pak PROTEIN-RP), aceste probe depozitate s-au dezghețat și s-au concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM3 (76 mm diametru, fabricată de către Amicon Corp.) pentru obținerea următoarelor 2 probe. Proba concentrată de fracțiunea F2 TPO activă obținută prin Sephacryl S-200 HL se va denumi “probă F2 TPO de greutate moleculară ridicată” și cea a F3 ca probă F3 TPO de greutate moleculară scăzută”.

Proba F2 TPO de greutate moleculară ridicată și proba F3 TPO de greutate moleculară scăzută sunt fracțiunile strânse din diferite zone de eluție de la cromatografia de filtrare în gel și ca o problemă de convenție, termenul “molecular înalt” și “molecular scăzut” nu înseamnă neapărat greutățile lor moleculare reale.

	Molecular ridicat Proba F2 TPO	Molecular scăzut Proba F3 TPO
Greutate moleculară	94000-33000	33000-3000
Volum total	3420 ml	6480 ml
Volum total (după concentrare)	293 ml	280 ml
Proteină totală	262 mg	51,3 mg
Activitate relativă medie	7838	20000
Activitate totală	2055000	1020000

RO 118299 Β1

Probele F2 TPO molecular ridicat și F3 TPO molecular scăzut sunt supuse separat la următoarele etape de purificare.

Purificarea probei F3 TPO molecular scăzut se descrie în următoarele etape (8) până la (11).

(8) YMC-Pack PROTEIN-RP “cromatografie în fază inversă”

Proba F3 TPO molecular scăzută (proteină totală, 50,3 mg; concentrația proteinei, 0,184 mg/ml; activitate relativă 20000; activitate totală 1007000; volumul total 274 ml) obținută în etapa 7) de mai sus s-a amestecat cu un solvent A (0,025% acid trifluoracetic (TFA) și un solvent B (1-propanol conținând 0,025% TFA) pentru a obține o soluție având un volum total de 508,63 ml și concentrațiile finale de propanol, TFA și proteină de circa 20%, 0,012% și respectiv 0,0989 mg/ml. Materialele insolubile formate în timpul preparării acestei soluții s-au separat prin centrifugare și supernatantul rezultat s-a împărțit în 2 porții de 254,3 ml (25,2 mg proteină) și s-au aplicat la o rată de curgere de 2 ml/min la o coloană pregătită cu YMC-PACK PROTEIN-RP (fabricată de către YMC, număr de catalog A-PRRP-33-03-15; diametru 3 cm și înălțimea patului 7,5 cm) care fusese echilibrată în avans cu 30% B. Precipitatul rezultat de la centrifugare s-a dizolvat în 20 ml acetat de sodiu 20 mM (pH=5,5) care conține 5 MM CHAPS (3-(3-colamidopropil)dimetilamonio)-1-propansulfonat; fabricat de către Dojindo Laboratories, număr de catalog 75612-03-3) și, de asemenea, s-a aplicat la coloană.

După încărcarea probei, aproximativ 50 ml dintr-un solvent (solvenți A:B=3:1) s-au trecut prin coloană pentru obținerea unei fracțiuni. în continuare, a fost început un program de dezvoltare (120 min de gradient linear din 30 la 45% B) și eluatele s-au colectat în 36 eprubete de polipropilenă în porții de 10 ml. Acest proces s-a repetat din nou pentru proba rămasă folosind aceleașai tuburi de colectare, obținând astfel un total de 36 eprubete de fracțiunea fiecare conținând 20 ml eluat. Fracțiunea trecută prin sită s-a concentrat direct la 20 ml folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM3 (76 mm diametru, fabricată de către Amicon Corp.).

O porțiune de 0,1 ml din fiecare fracțiune trecută prin / și fracțiunile de 20 ml din eprubetele, numerele 1-36, s-au amestecat cu 20 μΙ 5% BSA, s-au uscat prin evaporare, s-au dizolvat în 0,25 ml mediu de cultură test IMDM și apoi, s-au analizat pentru fracțiunile TPO active specific. S-a găsit activitate TPO în fracțiunile din tuburile cu numerele 17-27 (36,0 până la 43,0% domeniu de concentrație propanol) care s-au combinat și s-au folosit ca probă F3 TPO molecular scăzut derivată fracțiunii F2 TPO activ YMC-Pack PROTEINRP. Această fracțiune s-a depozitat la - 85°C până la folosirea sa în etapa următoare YMCPack CN-AP. Proba F3 TPO molecular scăzut derivată TPO-YMC-Pack PROTEIN-RP fracțiunea F2 activă.

1695

1700

1705

1710

1715

1720

1725

Volum total	220 ml
Concentrația proteinei	0,0130 mg/ml
Proteină totală	2,85 mg
Activitate relativă	130000
Activitate totală	371000

1730 (9) YMC-Pack CN-AP “cromatografie fază inversă”

O porțiune de 214,9 ml a probei F3 TPO molecular scăzută derivată fracțiunii F2 YMC Pack PROTEIN-RP (Proteină totală, 2,79 mg; concentrația proteinei, 0,0130 mg/ml; activitate relativă, 130000; activitate totală, 36300) obținută în etapa (8) de mai sus s-a

1735

RO 118299 Β1 amestecat cu 0,6 ml glicerol 50% și s-a concentrat la 1,8 ml. Concentratul s-a ajustat, în final, până la un volum de 5 ml conținând 20% sau mai puțin propanol și circa 5% glicerol.

Concentratul s-a împărțit în 5 porții pentru utilizare în următoarea operare de coloană (0,555 mg proteină și 1 ml volum pentru fiecare operare). Fiecare din aceste probe divizate s-a aplicat la o rată de curgere de 0,6 ml/min la o coloană pregătită cu YMC-Pack CN-AP (fabricată de către YMC, număr de catalog AP-513; 6 mm în diametru și 250 mm înălțimea patului) care fusese echilibrată în avans cu 15% B, folosind 0,1% TFA ca solvent a și 0,05% TFA conținând 1 -propanol ca solvent B. După aplicare, concentrația propanolului s-a crescut de la 15% B până la 25% B și s-a realizat un gradient linear de 65 min, de la 25 până la 50% B. După definitivarea operației finale (a 5-a) s-a aplicat 1 ml de soluție având aceiași compoziție excluzând proteina la coloană și s-a dezvoltat în același mod pentru recuperarea activității TPO reținută de coloană. Deoarece s-au folosit aceleași eprubete de polipropilenă pentru a strânge eluatele de la cele 6 operațiuni, s-au obținut un total de 44 eprubete fiecare conținând 7,2 ml eluat.

O porțiune de 30 μΙ din fiecare din aceste fracțiuni obținute (1/240 părți din fiecare fracțiune) s-a amestecat cu 20 μΙ de BSA 5%, s-a uscat prin evaporare, s-a dizolvat în 0,24 ml mediu de cultură test IMDM și apoi, s-a analizat specific pentru fracțiuni TPO active. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO puternică în fracțiunile eprubetelor cu numerele 28 - 33 (domeniul concentrației propanolului 37,0-42,0%) care s-au combinat ca probă F3 TPO molecular scăzută derivată fracție FA TPO activă YMC-PackCN-AP:

Proba F3 TPO molecular scăzută derivată fracție FA TPO activă YMC-Pack CN-AP

Volum total	43,20 ml
Concentrația proteinei	0,00863 mg/ml
Proteină totală	0,373 mg
Activitate relativă	800000
Activitate totală	298400

(10) Capcell Pack CI 300 “cromatografia finală în fază inversă”

O porțiune de 43,12 ml proba F3 TPO molecular scăzută derivată din fracțiunea FA TPO activă (proteină totală 0,372 mg; concentrația proteinei 0,00863 mg/ml; activitate relativă 800000; activitate totală 297500) obținută în etapa (9) de mai sus s-a amestecat cu 0,2 ml 50% glicerol și s-a concentrat pentru a obține 0,1 ml soluție glicerol.

Această soluție s-a amestecat cu 2 ml de soluție solvent A (0,1% TFA): solvent B (1-propanol conținând 0,05% TFA) = 85:15 (15% B) pentru a prepara 2,1 ml probă care conține circa 14% propanol, circa 4,8% glicerol și 0,177 mg/ml proteină. Proba astfel preparată s-a aplicat la o coloană pregătită cu Capcell Pack CI 300 A (fabricată de către Shiseido Co., Ltd., număr de catalog CI TYPE:SG300A; de 4,6 mm diametru și 250 mm înălțimea patului) care fusese echilibrată înainte cu 15% B și s-a dezvoltat pe 65 min de gradient linear de a 27 până la 38% B la o rată de curgere de 0,4 ml/min. Eluatele s-au colectat în 72 eprubete de polipropilenă în porțiuni de 0,6 ml.

O porțiune de 3 μΙ din fiecare din fracțiunile astfel obținute (1/200 porțiunea fiecărei fracțiuni) s-a amestecat cu 20 μΙ 5% BSA, mediul s-a schimbat la 225 μΙ mediu de cultură test IMDM și s-au analizat fracțiunile diluate de 75 ori.

O porțiune de 1 μΙ a fiecărei fracțiuni (1/600 fracțiune) s-a luat pentru utilizare la electroforeză, s-a uscat prin evaporare și s-a tratat la 95°C 5 min cu 10 μΙ de tampon probă nereducător pentru SDS-PAGE. Proba astfel tratată s-a supus la SDS-PAGE folosind un gel

RO 118299 Β1

1785 preturnat 15-25% SDS-poliacrilamidă (fabricat de către Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.). Și apoi s-a colorat cu un kit de colorare argint 20-Silver Stain-ll “DAIICHI” (fabricat de către Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., număr'de catalog 167997; la care se va face referință în continuare ca “kit de colorare argint”. Ca marker de greutate moleculară s-au folosit [DAIICHIJ-III Low Molecular Weight Markers (fabricat de către Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., număr de catalog 181061; care vor fi denumiți în continuare “DPCIU”).

Ca urmare a analizei de mai sus s-a găsit activitate TPO semnificativă în eprubetele cu numerele 35-40 (domeniul de concentrație propanol 30,0-32,5%). Dintre acestea, fracțiunile din eprubetele cu numerele 36-42 (domeniul de concentrație propanol 30,5-32,0%) s-au combinat și s-au folosit ca principală fracțiunea FA TPO activă. Rezultatele sunt prezentate în fig.2.

Când s-au comparat conținutul redus al proteinei din cromatogramă cu rezultatele analizei, fracțiunea astfel obținută s-a găsit a avea o proteină totală de 39,6 ^g, o concentrație a proteinei de 9,4 ^g/ml, o activitate relativă de 4890000 și o activitate totală de 193600. Examinarea imaginilor SDS-PAGE a fracțiunii TPO activă, numerele 36-42 a relevat prezența unei benzi a cărei densitate de colorare se corelează cu tăria activității. în plus, greutatea moleculară aparentă a acestei benzi nereduse s-a găsit a fi 17000 la 19000 când s-a comparat cu cea a greutății moleculare a proteinelor standard pe același gel care s-au redus, aceasta arătând că această bandă este un candidat puternic al TPO.

(11) Extracția proteinei TPO activă din electroforeza în gel “15% SDS-PAGE” Exemplul din analiză a fracțiunii FA TPO activă

Din proba F3 TPO molecular scăzută derivată, fracțiunea FA TPO activă 4200 μΙ (proteină totală 39,6 ^g; concentrația proteinei 9,4 /zg/ml; activitate relativă 4890000; activitate totală 193600) obținută în etapa (10) de mai sus, 5,5 μ\ (1/764 fracțiune) pentru folosire în extracția proteinei activer și 2,5 μ\ (1/1680 fracțiune) pentru folosire în colorația argint s-au transferat în eprubetele probei respective, s-au uscat prin evaporare, au reacționat cu 10 μ\ dintr-o probă dintr-un tampon reducător pentru SDS-PAGE la 37°C, 1 h, și apoi s-au lăsat să stea încă 18 h la temperatura camerei efectuând prin aceasta reacția SDS.

Ca markeri de greutate moleculară s-au folosit markerul de domeniu scăzut precolorat (fabricat de către Bio-Rad Laboratories, Inc., 161-0305) și DPCIII menționat mai înainte. Apelând la o microplacă de gel, aceste probe 15% SDS-PAGE s-au realizat la 4°C în conformitate cu procedura folosită în mod obișnuit (Laemmli, Nature, vol.227, pp. 780685,1970). După definitivarea electroforezei, porțiunile de gel pentru colorarea argint s-au tăiat imediat cu un cuțit, s-au pus într-o soluție de fixare și apoi s-au colorat folosind kitul de colorare argint menționat anterior.

Separat de aceasta, tot domeniul de greutate moleculară al gelului folosit pentru detectarea activității s-a tăiat cu un cuțit în 54 felii și fiecare felie de gel având o lățime de

1,5-2,5 mm s-a sfărâmat printr-o metodă ușor modificată a metodei Kobayaschi (Kobayaschi, M., Seikagaku (biochemistry), vol.59, nr.9,1987, publicată de către Japanese Biochemical Society). Fiecare fâșie de gel astfel fărâmată în fragmente mici s-a amestecat cu 0,3 ml dintr-un tampon de extracție (20 mM Tris-HCI, pH=8, 500 mM NaCI, 0,05% BSA) și s-a agitat 6 h, la 4°C pentru efectuarea extracției.

La aceasta s-au adăugat 500 mM fosfat de potasiu (pH=6,8) până la o concentrație finală de 29 mM. După 1 h de agitare, la 4°C amestecul rezultat s-a transferat într-o unitate de filtrare Ultra Free C3GV 0,22 μΜ (fabricată de către Milliph Corp., UFC3OGV oS) și s-a centrifugat la 1000 x g (4000 rpm) 15 min pentru îndepărtarea SDS-ului precipitat și recuperarea fluidului supernatant care rezultă. Filtratul s-a transferat într-o unitate de ultrafiltrare Uita Free C3-LGC (de greutate moleculară de separare 10000, fabricată de către Milliph Corp., UFC3LGCOO) și s-a centrifugat la 3000 x g (7000 rpm). Când volumul soluției concentrate a atins circa 50 μ\ s-au adăugat 300 μ\ de 20 mM tampon fosfat de sodiu (pH=7,2) și s-a supus din nou ultrafiltrării.

1790

1795

1800

1805

1810

1815

1820

1825

1830

1835

RO 118299 Β1

S-a repetat de 2 ori ultrafiltrarea folosind 300 μΙ de tampon fosfat de sodiu 20 mM pentru a îndepărta SDS-ul rămas. După aceea, s-a repetat o etapă similară pentru schimbarea mediului de cultură test pentru prepararea uneui probe (300 μΙ) care ulterior s-a sterilizat și s-a supus măsurătorii activității TPO.

S-au detectat 3 benzi de proteină clare prin colorare argint care au prezentat greutăți moleculare aparente de circa 17000 la 19000,14000 și 11000 pe baza markerilor de greutate moleculară DPCIII.

în etapa anterioară, (10), s-a observat în electroforeza fracțiunii TPO active pe coloană Capcell Pak CI, o bandă având o corelație între tăria activității și densitatea de colorare și care are o greutate moleculară aparentă de circa 17000-19000. în experimentul acestei etape (II) activitatea TPO s-a găsit, de asemenea, în banda care are o greutate moleculară aparentă de circa 17000-19000 (fig.3).

Pe baza rezultatelor de mai sus, s-a confirmat că proteina TPO activă s-a purificat în fracțiunea activă a coloanei Capcell Pack CI 300 A, până la un nivel detectabil pe electroforeza în gel. Pe baza densității de colorare argint, a benzii obținute prin SDS-PAGE 15%, cantitatea proteinei candidat TPO (o greutate moleculară aparentă de circa 17000 până la 19000) din totalul fracțiunii active TPO s-a determinat a fi de circa 1,7 μg.

Purificarea probei F2 TPO molecular ridicat se descrie în următoarele etape (12) până la (15).

(12) YMC-Pack PROTEIN-RP “cromatografie în fază inversă”

Proba F2 TPO molecular ridicată (proteină totală, 257 mg; concentrația proteinei 0,894 mg/ml; activitate relativă, 7840; activitate totală 2015000; volum total 287 ml) obținută în etapa (7) de mai sus, s-a amestecat cu 95,8 ml (1/3 volum al probei) dintr-un solvent B (1-propanol conținând 0,025% TFA) pentru a obține o soluție care are un volum total de 383 ml și concentrații finale de propanol, TFA și proteină de circa 25%, 0,006% și respectiv, 0,671 mg/ml. Pentru solvent A s-a folosit o soluție de 0,025% TFA. Materialele insolubile formate în timpul preparării probei de început s-au separat prin centrifugare, și fluidul supernatant rezultat s-a împărțit în 6 porțiuni de 62,3 ml (42,8 mg proteină) și s-au aplicat la o rată de curgere de 2 ml/min la o coloană pregătită cu YMC-Pack PROTEIN-RP (fabricată de către YMC, număr de catalog A-PRRP-33-03-15; 3 cm în diametru și 7,5 cm înălțimea patului) care fusese echilibrată anterior cu 30% B. Precipitatul care rezultă de la centrifugare s-a dizolvat în 10 ml de acetat de sodiu 20 mM (pH=5,5) conținând CHAPS 5 mM și s-a aplicat, de asemenea, la coloană.

După încărcarea probei, s-au trecut prin coloană aproape 50 ml solvent solvenții A:B = 3:1) pentru obținerea unei fracțiuni trecute prin sită. în continuare, s-a început un program de dezvoltare (120 min de gradient linear de la 30 până la 45% B) și eluatele s-au colectat în 24 eprubete de polipropilenă în porțiuni de 15 ml. Acest proces s-a repetat pentru cele 6 probe divizate folosind aceleași eprubete de colectare, obținând astfel un total de 24 eprubete de fracțiune, fiecare conținând 90 ml eluat. Fracțiunea trecută prin/și eprubeta fracțiunii 1 s-au combinat și s-au concentrat direct până la 90 ml folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM3 (76 mm în diametru, fabricată de către Amicon, Corp.).

O porțiune de 0,3 ml de la fiecare fracțiune trecută prin sită plus eprubeta fracțiunii 1 și fracțiunile din eprubetele 2-24, s-au amestecat cu 10 μΙ BSA 5%, s-au uscat prin evaporare, s-au dizolvat în 0,30 ml de mediu de cultură test IMDM și apoi s-au analizat pentru fracțiunile active TPO specific. Ca rezultat, activitate TPO s-a găsit în fracțiunile eprubetelor cu numerele 10-15 (domeniul concentrației de propanol 34,0-39,5%) care s-a combinat și s-au folosit ca probă F2 TPO molecular ridicată derivată de la fracțiunea F2 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO activă. Această fracțiune s-a depozitat la - 85°C până la folosirea sa în etapa următoare YMC-Pack CN-AP.

R0118299 Β1

Fracțiune F2 TPO molecular ridicată derivată de la fracțiuneia F2 YMC-Pack PROTEIN-RP TPO activă

1885

Volum total	540 ml
Concentrația proteinei	0,021 mg/ml
Proteină totală	11,4 mg
Activitate relativă	227000
Activitate totală	2588000

1890 (13) Superdex 75 pg “cromatografie de filtrare în gel în prezență de CHAPS”

O porțiune de 538,2 ml a probei F2 TPO molecular ridicată derivată fracțiunii F2 YMCPack PROTEIN-RP TPO activă (proteină totală, 11,3 mg; concentrația proteinei 0,021 mg/ml; activitate relativă, 227000; activitate totală, 2565000) obținută în etapa (12) de mai sus s-a amestecat cu 0,6 ml glicerol 50% ș s-a concentrat prin evaporare. La aceasta s-au adăugat 18 ml de CHAPS 20 mM urmată de agitare și o incubare ulterioară de 41 h, la 4°C. După aceea, prima probă s-a aplicat la o coloană pregătită cu HiLoad 26/60 Superdex 75 pg (fabricată de către Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-1070-01; 2,6 cm în diametru și 60 cm înălțimea patului) și s-a eluat cu DPBS conținând CHAPS 5 mM la o rată de curgere de 1 ml/min. La coloană s-a aplicat o porțiune de 4 ml din fiecare probă (concentrația proteinei, 0,466 mg/ml; proteină 1,86 g).

în acest caz, operarea coloanei Superdex 75 s-a repetat de 6 ori prin împărțirea întregii fracțiuni YMC-Pack PROTEIN-RP TPO active în 6 porțiuni. Eluatele de la fiecare operare s-au colectat în porțiuni de 5 ml în 45 de eprubete, obținând astfel, în final, 45 de fracțiuni, fiecare conținând 30 ml eluat după definitivarea celor 6 operări ale coloanei.

O porțiune de 0,1 ml din fiecare fracțiune astfel obținută s-a amestecat cu 10 μΙ BSA 5%, s-a uscat prin evaporare, s-a dizolvat în 0,25 mediu de cultură IMDM și apoi, s-a analizat pentru precizarea fracțiunilor active TPO. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO în fracțiunile din eprubetele cu numerele 13-31, (greutate moleculară în domeniul 78000 până la 3000) care s-au combinat și s-au folosit ca o probă F2 TPO molecular ridicată derivată de la fracțiunea F2 Superdex 75 pg TPO activă.

Probă F2 TPO molecular ridicată derivată de la fracțiunea F2 Superdex 75 pg TPO activă

1895

1900

1905

1910

1915

Volum total	540 ml
Concentrația proteinei	0,00216 mg/ml
Proteină totală	1,17 mg
Activitate relativă	1750000
Activitate totală	2041000

1920 (14) YMC-Pack CN-AP “cromatografie în fază inversă”

O porțiune de 513,2 ml din proba F2 TPO molecular ridicată derivată din fracțiunea

F2 de 540 ml Superdex 75 pg TPO activă (greutate moleculară 78000 - 3000) (proteină totală 1,11 mg; concentrația proteinei 0,00216 mg/ml; activitate relativă 1750000; activitate totală 1943000) obținută în etapa (13) de mai sus, s-a amestecat cu 1/10 volum din solventul

B (1-propanol conținând TFA 0,05%) și s-a aplicat la o rată de curgere de 0,6 ml/min la o coloană pregătită cu YMC-Pack CN-AP (fabricată de către YMC, număr de catalog AP-513;

1925

RO 118299 Β1 mm în diametru și înălțimea patului 250 mm) care fusese echilibrată anterior cu 15% B folosind un solvent A (TFA 0,1%) și solventul B. După aplicare, concentrația de propanol a crescut de la 15 până la 25% și s-a realizat un gradient linear de 65 min de la 25 până la

50% B.

înaintea începerii cromatografiei de coloană YMC-Pack CN-AP o porțiune 1/20 din totalul probei introduse s-a supus unei operații de triere în vederea confirmării recuperării propriei activități. După aceea, porțiunea 19/20 rămasă s-a împărțit în 2 probe pentru a realiza operarea de 2 ori. Cu alte cuvinte, operarea coloanei s-a repetat de 3 ori. Deoarece aceleași 44 eprubete de polipropilenă s-au folosit pentru a strânge eluatele celor 3 operări, s-au obținut un total de 44 eprubete fiecare conținând 3,6 ml eluat.

O porțiune de 5 μ\ din fiecare fracțiune astfel obținută (1/720 porțiunea fiecărei fracțiuni) s-a amestecat cu 0,25 ml mediu de cultură test IMDM și apoi s-a analizat pentru precizarea fracțiunilor TPO active. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO puternic marcată în fracțiunile din eprubetele cu numerele 24-30 (domeniul concentrației propanolului 36,0-42,0%) care s-au combinat și s-au folosit ca probe F2 TPO molecular ridicată derivată în principal de la fracțiunea FA YMC-Pack CN-AP TPO activă.

Probă F2 TPO molecular ridicată derivată de la fracțiunea FA YMC-Pack CN-AP TPO activă

Volum total	25,20 ml
Concentrația proteinei	0,0246 mg/ml
Proteină totală	0,620 mg
Activitate relativă	700000
Activitate totală	434000

(15) Capcell Pack CI 300A “cromatografia finală în fază inversă”

O porțiune de 24,66 ml a probei F2 TPO molecular ridicată de 25,20 ml fracțiune derivată FA YMC-Pack CN-AP TPO activă (proteină totală 0,606 mg; concentrația proteinei 0,0246 mg/ml; activitate relativă 700000; activitate totală 424000) obținută în etapa (14) de mai sus, s-a amestecat cu 0,4 ml glicerol 50% și s-a concentrat prin evaporare.

în acest mod s-au obținut 2 ml de probă concentrată cu o concentrație de propanol de câteva procente, o concentrație de glicerol de 10% și o concentrație de proteină de 0,303 mg/ml. Aceasta s-a aplicat la o coloană pregătită cu Capcell Pak CI 300A (fabricată de către Shiseido Co., Ltd., număr de catalog CI ΤΥΡΕ: SG 300 A; 4,6 mm diametru și 250 mm înălțimea patului) care fusese echilibrată anterior cu 15% B, folosind un solvent A (TFA 0,1%) și un solvent B (1-propanol conținând TFA 0,5%) și s-a dezvoltat printr-un gradient linear 65 min, de la 27 până la 38% B la o rată de curgere de 0,4 ml/min. Eluatele s-au colectat în 72 tuburi de propilenă în porții de 0,6 μ\.

O porțiune de 0,75 μ\ din fiecare fracțiune astfel obținută (1/800 porțiunea fiecărei fracțiuni) s-a amestecat cu 20 μ\ BSA 5%, mediul s-a schimbat la 225 μ\ mediu de cultură test IMDM și s-a analizat astfel fracțiunea diluată de 300 de ori.

S-au luat probe de câte 2 μ\ din fiecare fracțiune (1/300 fracțiune) pentru folosire la electroforeză, s-a uscat prin evaporare și s-a tratat 5 min, la 95°C cu 10 μΙ dintr-o probă de tampon nereducător pentru SDS-PAGE. Proba astfel tratată s-a supus la SDS PAGE folosind un gel preturnat SDS-poliacrilamidă 15-25% (fabricat de către Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) și apoi s-a colorat folosind kit-ul de colorare argint menționat anterior. Ca marker de greutate moleculară s-au folosit DPCIII descriși înainte.

Ca rezultat al analizei de mai sus, s-a găsit o activitate TPO semnificativă în fracțiunile din eprubetele cu numerele 33-39 (domeniul concentrației propanolului 29,5-31,5%). Fracțiunile din eprubetele cu numerele 34-39 (domeniul concentrației propanolului

R0118299 Β1

30,0-31,5%) au fost combinate și s-au folosit ca principală fracțiune FA TPO activă. Examinarea imaginii SDS-PAGE a principalei fracțiuni TPO active a relevat prezența unei benzi / a cărei densitate de colorare crește cu tăria activității într-un domeniu de greutate moleculară aparentă de 17000 până la 19000 în condiții nereducătoare, care a fost similară cazului probei F3 TPO molecular scăzută, derivată de la fracțiunea TPO activă descrisă în etapa menționată anterior (10).

Exemplul 2. Analiza secvențelor aminoacide parțiale ale TPO de șobolan purificate Analiza secvenței aminoacide a proteinei de șobolan candidată TPO în fracțiunea FA coloană Capcell Pack Cl 300 activă TPO obținută în etapa de purificare (10) a exemplului 1, s-a realizat în conformitate cu procedura lui Iwamatsu (Iwamatsu și colab., “Shin Kiso Seikagaku Jikkenho (New Basic Biochemical Experimente)” vol.4, pp.33-84, Pub.Maruzen; Iwamatsu A, Seikagaku (Biochemistry) vol.63, nr.2, pp.139-143,1991; Iwamatsu A, Electrophhsis, vol.13, pp.142-147,1992).

Astfel, proba s-a supus la SDS-PAGE și s-a transferat electric pe o membrană difluorură de poliviniliden (PVDF). După reducere, și S-alchilarea proteinei pe membrana PVDF, proteina astfel tratată s-a digerat în fragmente peptidice prin hidroliză sistematică și hidroliză enzimatică restrictivă, in situ, cu 3 proteaze, iar fragmentele peptidice rezultate pe fiecare etapă de digestie s-au separat și s-au purificat prin cromatografie în fază inversă și s-au analizat pentru secvențele lor aminoacide printr-o metodă de determinare a secvenței aminoacide de înaltă sensibilitate. în continuare se descrie acest procedeu în amănunt.

Exemplul analizei proteinei candidată TPO din proba F3 TPO molecular scăzută derivată fracțiunii FA Capcell Pack Cl 300A TPO (1) Concentrarea fracțiunii FA a coloanei Capcell Pack Cl 300A TPO (eprubetele numerele 36-42)

Din 4200 μ\ TPO molecular scăzută, proba F3 derivată fracțiunii FA pe coloană Capcell Pack Cl 300A TPO activă (eprubetele numerele 36 - 42) obținute din etapa de purificare (10) a exemplului 1, (proteină totală 39,5 Mg; concentrația proteinei 9,4 Mg/ml; activitate relativă 489000; activitate totală 193600), 4151 μ\ (98,8% din totalul fracțiunii) s-a folosit în analiza secvenței aminoacide. Totalul proteinei dedusă din cromatogramă a fost 39,1 μ$, din care circa 1,6 j^g a fost proteina candidată TPO colorată cu argint după SDS-PAGE și care are o greutate moleculară aparentă de circa 17000 la 19000.

Această probă s-a amestecat cu glicerol și s-a concentrat prin evaporare pentru a obține 5 μ\ dintr-o soluție glicerol. La aceasta s-au adăugat un tampon nereducător pentru SDS-PAGE și Tris-HCI 1M (pH=8) în vederea ajustării pH-ului său, prin aceasta obținând circa 25 μ\ de probă care conține Tris-HCI 200 mM (pH=8,0), Tris-HCI 50 mM (pH=6,8), SDS 1,1%, EDTA 2mM, albastru bromfenol 0,02% și glicerol 30%.

Proba astfel preparată s-a menținut 14 h la temperatura camerei și apoi s-a tratat 5 min la 60°C în scopul efectuării reacției SDS proprii fără exces de încălzire.

(2) Electroforeze

S-au preparat microplăci de gel (gel acrilamidă 4,0% de stocare și gel acrilamidă 15% de separare) și s-au realizat SDS-PAGE la temperatura camerei, timp de 2 h la un curent constant de 12,5 mA și apoi 17,5 mA. S-au folosit ca markeri de greutate moleculară, marker precolorat de domeniu scăzut (Bio-Rad, 161-0305) și DOCIII. Imediat după electroforeză, moleculele de proteină rezultate s-au transferat pe o membrană PVDF (vezi etapa următoare).

O porțiune a probei s-a folosit, de asemenea, în altă electroforeză folosind gel poliacrilamidic 15-25% preturnat (Multi Gel 15/25 fabricat de către Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd., număr de catalog 211072) în condiții nereducătoare sau după reducerea probei cu ditiotreitol (DTT). Când s-a colorat gelul rezultat folosind kit-ul de colorare argint descris mai înainte, s-a confirmat că greutate moleculară a benzii de proteină așteptată a fi TPO a fost circa 19000 într-o condiție de nereducere și puritate a proteinei candidat TPO a coloanei Capcell Pack Cl 30A a avut câteva procente. în plus, deoarece mobilitatea benzii a variat în condiții nereducătoare și reducătoare, s-a sugerat că proteina candidat conține cel puțin o legătură disulfidică.

1980

1985

1990

1995

2000

2005

2010

2015

2020

2025

2030

RO 118299 Β1 (3) Transferul proteinei pe membrană PVDF prin electroblotting și detectarea benzii

Transferul proteinei la o membrană PVDF (ProBlott, fabricată de către Applied

Biosystemss; număr de catalog 400994) s-a realizat timp de o oră la un curent constant de 160 mA (11 la 17V) folosind un aparat de transfer semi-uscat (Model KS-8460, fabricat de către Marysol). Ca anolit s-a folosit o soluție Tris 0,3M și metanol 20%, o soluție constând din Tris 25 mM și metanol 20% (pH=10,4) ca soluție de transfer prin membrană și drept catalit o soluție constând din Tris 25 mM, acid aminocaproic 40 mM și metanol 20% (pH=10,4).

Când soluția de transfer prin membrană s-a colorat cu o soluție de colorare Ponceau S (0,1 g Ponceau S și 1 ml acid acetic în 100 ml apă), s-au detectat o multitudine de benzi și una dintre aceste benzi s-a confirmat a fi proteina candidat având o greutate moleculară de circa 19000. Această bandă s-a tăiat pentru folosire în etapele următoare de formare a fragmentului peptidic.

(4) Formarea fragmentului peptidic, configurarea peptidei și analiza secvenței aminoacide în scopul realizării fragmentării sistematice a proteinei candidate TPO care fusese transferată și S-alchilată după reducere pe membrană PVDF, s-a realizat în etapa hidroliza enzimatică restrictivă folosind următoarele trei proteaze.

Prima digestie: Lisil endopeptidază (Achromobacter lyticus m497-1, fabricată de către Wako Pure Chemical Industries, Ltd., număr de catalog 129-02541).

A doua digestie: Endoproteinază Asp-N (fabricată de către Boehringer-Mannheim Corp., număr de catalog 1054589).

A treia digestie: Trypsin-TPCK (fabricată de către Worthingtkon Biochemical, număr de catalog 3740).

Fragmentele peptidice obținute prin fiecare digestie enzimatică s-au recuperat, s-au aplicat la o coloană în fază inversă Wakosil-ll 5C18 (fabricată de către Wako Pure Chemical Industries, Ltd., cu diametrul 2,0 mm și lungime 150 mm) și s-a eluat cu un solvent A (TFA 0,05%) și cu un solvent B (izopropanol:acetonitril=7:3, TFA 0,02%), la un gradient linear de la 1 până la 50% B, timp de 30 min la o rată de curgere de 0,25 ml/min și la o temperatură a coloanei de 30°C. în acest mod s-a făcut configurarea peptidică (fig.4). Fragmentele peptidice rezultate s-au recuperat și s-au supus la degradare Edman folosind un secvențier de aminoacizi în gaz (PPSQ-2, fabricat de Shimadzu Corp.). După aceea, fiecare aminoacid recuperat din secvențier, al cărui capăt N-terminal s-a cuplat cu PTH, s-a identificat folosind cromatografia de coloană în fază inversă C 18 prin eluție izocratică. Rezultatele sunt prezentate pe scurt în continuare. Secvențele aminoacide ale fragmentelor peptidice obținute prin prima digestie cu lisil endopeptidază:

Fragment	Secvența aminoacidă
AP3	(K)XYYESZ (X este A, S,G,M sau Q și Z este E sau K) (SECV.ID.Nr.184)
AP6	(K)XRAAZ (X este E sau Q și Z este E sau N) (SECV.ID.Nr.185)
AP7	(K)AGXCSG (nu poate fi identificată total) (SECV.ID.Nr.186)
AP8	(K)XPVPPACDPRLL (X este I, T sau S) (SECV.ID.Nr.187)
AP12	(K) DSFLADVK (SECV.ID.Nr.188)
AP5	(nu poate fi identificată)
AP20	(nu poate fi identificată)
AP21	(nu poate fi identificată)
AP23	(nu poate fi identificată)

R0118299 Β1

Secvențele aminoacide ale fragmentelor peptidice obținute prin cea de-a doua digestie cu endoproteinază Asp-N

2085

Fragment	Secvență aminoacidă
ASP1	(nu poate fi identificat)
ASP2	(nu poate fi identificat)
ASP6	(nu poate fi identificat)
ASP11	(nu poate fi identificat)

Secvențele aminoacide ale fragmentelor peptidice obținute prin cea de-a treia digestie cu trypsin-TPCK

2090

Fragment	Secvență aminoacidă
TP2	(K sau R) TLPTXAVP (SECV.ID.Nr.189)
TP3	(K sau R) TLPTXAVP

2095 în secvențele de mai sus, cele prezentate în paranteze la capătul N-terminal sunt resturi aminoacide care pot fi deduse de la digestia enzimatică sistematică.

(5) Analiza omologiei secvențelor aminoacide obținute”'cercetarea omologiei” în scopul cunoașterii dacă secvențele aminoacide astfel obținute sunt conținute într-o proteină cunoscută raportată, sau există o proteină având secvențe similare, ele s-au analizat folosind soft-ul de analizare a secvențelor Mac Vector (Kodak Internațional Biotechnologies, Inc.). Pentru informare asupra proteinelor sau genelor cunoscute, s-a folosit Entrez Release 6 bază de date (Național Center for Biotechnology Information, Național Library of Medicine, Național Institute of Health, USA, Pub. în 15 august 1993). Bazele de date incluse aici sunt cele care urmează.

Entrez Release 6 database

NCBI-GenBank, 15 august 1993 (Release 78,0) EMBL-15 iuliel 993 (release 35,0 plus până în prezent) DOBJ, 15 iuliel 993

SWISS-PROT, aprilie 1993 (release 25,0)

PIR, 30 iunie 1993 (release, 37,0)

PDB, aprilie 1993

PRF, mai 1993 dbEST, 15 iulie 1993 (release 1,10)

Brevete SUA și europene

Ca urmare, secvența (K) DSFLADVK a lui AP12 a coincis complet cu o secvență internă KDSFLADVK a unui precursor globulinic de legare a corticosteroidului de șobolan (CBG) (baza de date PIR numărul de acces A40066; Smith și Hammond; “Rat corticosteroidbinding globulin: primary structure and messenger ribonucleic acid levels in the liver under different physiological conditions”. Mol.Endocrinol., (1989), 3, 420-426).

Examinarea ulterioară în detaliu a arătat că o secvență KQYYESE (SECV.ID.Nr.193) având similaritate înaltă la secvența (K) XYYESZ (X este A, S, G, M sau Q și Z este E sau K) ale lui AP3 este conținută în secvența aminoacidă CBG de șobolan. în CBG de șobolan, secvențele care corespund la cele AP12 și AP3 sunt legate la fiecare alta prin aceasta formând o secvență aminoacidă internă KDSFLADVKQYYESE (SECV.1D.Nr. 190).

în legătură cu secvențele aminoacide ale altor fragmente decât AP12 și AP3, nu s-a găsit nici o proteină sau genă a cărei similaritate ar fi putut fi luată în seamă.

2100

2105

2110

2115

2120

2125

RO 118299 Β1

Exemplul 3. Analiza caracteristicilor biologice ale TPO derivate din plasmă sanguină a șobolanilor trombocitopenici (1) în sistemul test CFU-MK de șobolan (sistem de cultură în lichid)

Ca un exemplu tipic, fig.5 arată o curbă de răspuns a dozei în cazul folosirii unei probe TPO parțial purificată din plasmă de șobolan trombocitopenic (fracțiunea F2 TPO activă din coloană YMC Pack PROTEIN - RP descrisă în etapa de purificare (8) de la exemplul 1-2). Când s-au cultivat celulele, s-au observat periodic la microscop generarea și maturarea megacariocitelor și anume, creșterea celulelor în mărime, și s-a recunoscut probabil împreună cu creșterea numărului de megacariocite. în mod special, o schimbare semnificativă în procesul formării megacariocitelor s-a găsit în ziua a 4-a care a fost ziua finală de cultivare (ele au fost greu de recunoscut în ziua a 3-a). Un astfel de proces de formare este numit proces de formare citoplasmică (Leven și Yee, Blood, vol.69, P 1046-1052,1987) sau procesul de formare proplachetară (Topp și colab., Blood, vol.76, pp. 912-924,1990) care este considerat a fi o structură precursoare de plachetă derivată diferențiată ulterior de la megacariocite mature și este considerată a fi etapa finală de diferențiere megacariocitară observabilă in vitro. Deoarece, o asemenea schimbare morfologică s-a observat cu o frecvență ridicată folosind proba TPO singură, este posibil ca acest singur factor să poată stimula și diferenția CFU-MK, să poată produce megacariocite mature și să poată elibera, în final, plachete.

(2) Sistemul analizei de colonie

O probă TPO parțial purificată din plasmă sanguină de șobolani trombocitopenici s-a examinat prin sistemul de analiză de colonie folosind celule neseparate de măduvă osoasă de șobolan, celule de la fiecare etapă de separare/concentrare sau o fracțiune Gpllb/llla⁺ CFU-MK, TPO derivată din plasmă de șobolan a stimulat formarea coloniilor de megacariocite. în comparație cu coloniile de megacariocite induse prin alte citokine precum IL-3 de șobolan, GM-CSF de șoarece sau EPO uman, coloniile de megacariocite induse TPO se caracterizează prin aceea că fiecare colonie constă din numere mai mici de megacariocite, dar fiecare megacariocită este de mărime mai mare, ceea ce înseamnă maturitate pronunțată. în plus, deoarece TPO nu a produs sau a produs câteva colonii ale altor linii celulare, activitatea Meg-CSF a TPO poate fi considerată ca megacariocitar specifică. Pe baza acestor fapte este evident că TPO are proprietăți biologice diferite de cele ale altor citokine cum ar fi IL-3 de șobolan GM-CSF de șoarece și EPO uman și exercită activitate unică Meg-CSF.

Proba TPO parțial purificată din plasma sanguină de șobolan trombocitopenic a exercitat, de asemenea, activitatea sa Meg-CSF asupra fracțiunilor celulare CD34⁺, DR⁺, derivate din celule de măduvă osoasă umană sau celule sanguine cordale umane și a indus numere semnificative de colonii megacariocitare umane arătând că acest factor nu are specificitate de specie.

Exemplul 4. Specializarea celulelor care produc TPO de șobolan (1) Căutare organelor care produc TPO de șobolan

Căutarea și specilizarea organelor de șobolan producătoare de TPO s-au realizat în scopul asigurării unei surse de mARN pentru utilizare în donarea unei gene TPO de șobolan. Inițial, s-au luat periodic de la șobolani transformați trombocitopenic prin administrare de anticorp P55, măduvă osoasă, plămân, ficat, și splină, celulele lor (secțiuni de organe în cazul plămânilor și ficatului) s-au cultivat și s-au examinat activitățile în supematantul culturii rezultate prin sistemul de analiză CFU-MK de șobolan. Această încercare inițială nu a dat totuși rezultate deosebite. în consecință, în continuare, s-a făcut încercarea de a cultiva hepatocite preparate prin perfuzie de colagenază din ficat de șobolan trombocitopenic indus prin administrarea de anticorpi P55 luând în considerare o lucrare care a indicat o relație între ficat și producerea TPO la șobolani (Siemensma și colab. J.Lab.Clin.Met., vol.86,

RO 118299 Β1

2180 pp. 817-833,1975). Când supernatantul de cultură rezultat s-a aplicat la o coloană WGAAgarose și apoi, fracțiunea adsorbită s-a fracționat pe o coloană în fază inversă Vydac Phenyl, s-a găsit o activitate extrem de asemănătoare la aceeași poziție a activității TPO derivată din plasmă de șobolan în sistemul de testare CFU-MK de șobolan. Slabă, dar aceeași activitate s-a găsit, de asemenea, în supernatantul culturii de hepatocit normal de șobolan. Aceste rezultate au sugerat pregnant că ficatul ar putea fi unul dintre organele care produc TPO.

(2) Selectarea liniilor celulelor care produc TPO de șobolan

Pe baza rezultatelor de mai sus, s-a realizat căutarea liniilor celulare de șobolan producătoare de TPO. Inițial, fiecare 20 de linii celulare derivate din ficat de șobolan s-au cultivat în mediul de subcultură, respectiv, până când celulele au atins aproape stadiul de confluență, mediul de cultură s-a schimbat cu respectiv același mediu suplimentat cu FCS 5%, și cultivarea s-a continuat timp de 3 zile. Când fiecare supematant de cultură rezultat s-a purificat parțial în conformitate cu procedura descrisă la etapa (1) de mai sus pentru a examina producerea de TPO, s-a găsit activitate TPO distinctă în trei linii celulare derivate din celule parenchimale hepatice, și anume, celule McA-RH8994 (depozit ATCC Nr.CRL 1602; Becker și colab. Oncodevelopmental Gene Expression”, ed. de către Fishman și Sell, Academic Press, New York, pp.259-270,1976; achiziționată de la Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), celule H4-II-E (ATCC depozit nr.CRL1548; Pitot și colab., Nat.Cancer Inst.Monogr., vol.13, pp.229-245, 1964; achiziționate de la Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd) și celule HTC (Thomson și colab., Proc. Natl.Acad.Sci.USA, vol.56 pp.296-303,1966, achiziționate de la Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).

(3) Analiza detaliată a activităților TPO în celule McA-RH8994, H4-II-E și HTC

Proprietățile biochimice și biologice ale procentelor TPO active secretate de cele 3 linii celulare de șobolan s-au examinat în detaliu și s-au comparat cu cele ale TPO derivate din plasma de șobolan.

Celule McA-RH8994 s-au suspendat din mediul de cultură lichid alfa-MEM(-) care conține FCS 10% și s-au transferat într-un balon din plastic pentru cultură pe țesuturi de 175 cm² la 1 x 10⁶ celule/balon. După 3 zile de cultură la 37°C într-un incubator cu 5% CO2, mediul s-a schimbat cu mediu de cultură IMDM conținând FCS 5% și cultura s-a continuat pentru încă 3 zile pentru recuperarea supernatantului de cultură rezultat. Celulele H4-II-E s-au suspendat în mediu de cultură lichid EAGLE modificat Dulbecco (glucoză 4,5 g/l, la care se va face referire în continuare, ca “DMEM”) care conține FCS 10% și s-au transferat într-un balon de plastic pentru culturi de țesături de 175 cm² la 5 x 10⁵ celule/balon. După 3 zile de cultură la 37°C într-un incubator cu 5% CO2, mediul s-a schimbat cu mediu de cultură IMDM conținând FCS 5% și s-a continuat cultura pentru încă 3 zile pentru a recupera supernatantul de cultură rezultat. De asemenea, celule HTC s-au suspendat în mediu de cultură lichid care conține FCS 5% și s-au transferat într-un balon de plastic de culturi de țesut de 175 cm² la 2,5 x 10⁵ celule/balon. După 3 zile de cultură la 37°C într-un incubator la CO₂ 5%, mediul s-a schimbat cu mediu de cultură IMDM conținând FCS 5% și cultura s-a continuat pentru trei zile suplimentare pentru recuperarea supernatantului de cultură rezultat.

Folosind o porțiune de 31 din supernatantul de cultură astfel obținut de la fiecare din cele 3 linii celulare, s-a realizat purificarea parțială a TPO derivat de la liniile de celule în conformitate cu procedura de purificare a TPO din XRP descrisă în exemplul 1 - 2. în continuare, se descrie o schiță a rezultatelor.

Inițial, fiecare supernatant de cultură s-a concentrat de circa 6 ori folosind un aparat de ultrafiltrare și mediul s-a schimbat cu tampon Tris-HCI 20 mM (pH=8,0) folosind o coloană Sephadex G-25. Eluatul rezultat s-a aplicat la o coloană Q-Sepharose FF, coloana s-a spălat

2185

2190

2195

2200

2205

2210

2215

2220

RO 118299 Β1 cu Tris-HCI 20 nM (pH=8,0) și apoi fracțiunea adsorbită s-a eluat cu Tris-HCI 20 mM(pH=8,0) care conține NaC1175 mM. Fracțiunea astfel eluată s-a aplicat la o coloană WGA-Agarose, coloana s-a spălat cu PBS și fracțiunea adsorbită s-a eluat cu fosfat de sodiu 20 mm (pH=7,2) care conține GIcNAc 0,2 M și NaCI 0,15 M. Eluatul rezultat s-a aplicat la o coloană TSK-Gel AF-BLUE 650 MH, coloana s-a spălat cu fosfat de sodiu 20 mM (pH=7,2) conținând NaC11M, și apoi fracțiunea adsorbită s-a eluat cu NaSCN 2M. Eluatul rezultat s-a aplicat la o coloană Phenyl Sepharose 6 FF/LS, coloana s-a spălat cu fosfat de sodiu 50 mM (pH=7,2) conținând sulfat de amoniu 1,5 M, urmat de sulfat de amoniu 0,8 M conținând fosfat de sodiu 36 mM, și apoi fracțiunea adsorbită s-a reluat cu 20 mM fosfat de sodiu (pH=7,2). Fracțiunea de adsorbție astfel obținută s-a concentrat și apoi, s-a fracționat folosind o coloană fază inversă Vydac Protein C4 (fabricată de către The Separations Group, număr de catalog 214TP51015; 1 cm în diametru și 15 cm înălțimea patului). Proba s-a aplicat la coloana C4 care fusese echilibrată anterior cu 20% B și apoi eluția s-a efectuat prin gradient linear 90 min, de la 20 până la 40% B la o rată de curgere de 1 ml/min, folosind TFA 0,1% la dezvoltarea solventului A și 1-propanol care conține TFA 0,05% la developarea solventului B. Ca rezultat, fiecare dintre proteinele TPO active derivate de la aceste linii celulare s-au eluat cu 1-propanol la o concentrație de 30 până la 43%.

Când s-au măsurat activitățile TPO în probe de la fiecare etapă de purificare prin sistemul test CFU-MK de șobolan, rezultatele au arătat că activitățile TPO ale celor 3 linii celulare s-au comportat cu imagini similare celor ale TPO derivate XRP (cf.exemplelor 1-2). Activitatea relativă, activitatea dată și altele asemenea, la fiecare etapă de purificare măsurată prin sistemul test CFU-MK de șobolan sunt prezentate în tabelul 2. în plus, când activitățile TPO din eluatele de la coloana în fază inversă finală s-au măsurat prin sistemul test CFU-MK de șobolan, activitățile TPO ale celor 3 linii celulare și cele TPO derivate XRP s-au găsit în aceiași arie de maxim. Când s-a realizat testul de colonie al fracțiunilor TPO active din coloana în fază inversă folosind celule neaderente obținute din etapa de distrugere a aderenței pentru separarea și separarea Gpllb/llla⁺ CFU-MK de șobolan imaginile eluție activității Meg-CSF s-au asemănat puternic celor ale activității TPO măsurate prin sistemul CFU-MK de șobolan (tabel 3). în plus, ca și în cazul TPO derivată XRP, fiecare dintre activitățile TPO ale celor 3 linii celulare nu a format sau a format câteva colonii ale altor linii și celule.

Fiecare dintre fracțiunile active strânse de la coloana în fază inversă s-a supus la SDS-PAGE în conformitate cu procedura descrisă în exemplele 1-2. Când s-a extras proteina din gelul rezultat, și s-a măsurat activitatea TPO prin sistemul test CFU-MK de șobolan, greutățile moleculare aparente ale TPO derivată XRP, TPO derivată celulă McA-RH8994 și TPO derivată celulă H4-II-E sau găsit a fi 17000 la 22000,33000 la 39000 și respectiv 31000 la 38000 și TPO derivată celulă HTC a prezentat greutăți moleculare aparente de 17000 până la 22000 și 28000 la 35000.

Astfel, aceste rezultate au arătat că proteinele TPO produse de către celule McARH8994, celule H4-II-E și celule HTC sunt echivalente la TPO derivat XRP în termenii proprietăților lor biologice, cu toate proprietăților lor biochimice sunt ușor diferite de la una la alta în termenii greutății moleculare aparente. O constatare remarcabilă din prezenta invenție este posibilitatea ca o moleculă de proteină TPO activă conținută în sânge să poată fi un produs de digestie parțială la situl său specific sau neregulat în celulele pentru producerea acesteia sau după secretarea sa din celulele producătoare. De asemenea, se sugerează existența posibilă a genelor TPO (mARN și cADN) care au lungimi diferite (variate).

R0118299 Β1

Tabelul 2

Purificarea TPO de la linii celulare de șobolan

2275

Linie celulară	McA-RH8994	HTC	H4II-E
Etapă	TP*1 (mg)	RA*2	TA*3	TP (mg)	RA	TA	TP (mg)	RA	TA
Supemat cultură	4806	8	38450	5750	5	28800	4087	5	20440
Sephade xG25	4824	16	77180	6458	12	77500	4011	5	20050
QSepharose FF	1973	20	39460	3112	15	46680	1821	15	27320
WGAAgarose	76,0	1350	102600	132,0	250	33000	80,0	90	7200
TSK-gel AF-Blue 650MH	5,0	12500	62500	9,2	7500	69000	5,4	150	810
PhenylSepharose6 FF/LS	14,7	500	7350	13,1	2500	32750	11,4	170	1940
Vydac Protein C4	0,23			0,75			0,11		•

‘'proteină totală; *²activitate relativă; *³activitate totală

2280

2285

2290

2295

Tabelul 3

Formarea coloniei de megacariocite de șobolan prin TPO de șobolan (fracțiunea de coloană fază inversă C4)

2300

Eluție propanol	Colonii XRP	Colonii McA-RH8994	Colonii HTC	Colonii H4-II-E
30,0-32,6%	0	33	4	18
32,6-34,7%	0	132	19	50
34,7-36,7%	67	290	291	230
36,7-38,8%	70	214	183	103
18,8-40,9%	2	15	5	28
40,9-43,0%	0	4	0	4

2305

Exemplul 5. Construcția vectorului de expresie (pEF18S) pentru bibloteca cDNA

S-a construit un vector în care un fragment cDNA poate fi integrat cu ușurință și care poate exercita o expresie cu înaltă eficiență a cDNA-ului donat pentru utilizare în donarea

2310

RO 118299 Β1 și expresia de cDNA TPO. Astfel, s-a construit un vector de expresie pEF18S de la un vector de expresie pME18S prin înlocuirea promotorului SRa cu un factor de alungire 1a (EF1a) promotor care este cunoscut ca promotor de expresie ridicată (cf.fig.6). Promotorul factorului de alungire 1a s-a obținut digerând parțial 1 dintr-un vector de expresie pEF-BOS (Mizushima șicolab., Nucleic Acids Res., vol.18, pp.5322-1990) cu enzimele de restricție Hindlll și EcoRI, supunerea digestului la electroforeză în gel de agaroză 2% (fabricat de către FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA de circa 1200 bp și purificarea fragmentului DNA folosind un kit de purificare Prep-a-Gene DNA (fabricat de către Bio-Red Laboratories, Inc., un kit pentru utilizare în purificarea selectivă a DNA-ului care se efectuează printr-o matrice poroasă de silice care ajută la adsorbția de DNA, s-a dezvoltat pe baza procedurii raportate de către Willis șicolab., în BioTehniquies, vol.9, pp. 92-99,1990). Din fragmentul DNA astfel obținut o porțiune de 100 ng s-a ligat cu 50 ng de vector de expresie pME18S (Liu și colab., Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, vol.90, pp.89-97-8961, 1993) care a fost digerat anterior cu Hindlll și EcoRI. S-au transformat celulele unei tulpini gazdă comerciale, Competent High E.coli DH5 (fabricată de către Toyobo Co m Ltd.; o tulpină competentă E.coli preparată printr-o metodă modificată a lui Hanahan și colab., J.Mol.Bio., vol.166, pp.557-580, 1983), cu acest vector construit. După cultivarea celulelor transformate, s-au selectat la întâmplare 12 colonii și s-a purificat plasmidul DNA din fiecare colonie. S-a obținut un total de 10 clone care conțin 1 plasmid de interes (pEF18S) prin analizarea imaginilor digestiei enzimatice de restricție a acestor molecule DNA. în continuare, s-a cultivat o clonă selectată de la acestea pentru a prepara în cantitate mare plasmidul DNA.

Purificarea plasmidului DNA s-a realizat, în principal, în conformitate cu procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Astfel, clona pEF18S obținută mai sus s-a cultivat peste noapte la 37°C în 50 ml de mediu LB (Bacto-triptonă 1%, extract de drojdie Lacto 0,5%, NaCI 0,5%) conținând 50 /zg/ml ampicilină, și celulele rezultate colectate prin centrifugare s-au suspendat în 4 ml de soluție TEG-lizozim (Tris-HCI 25 mM, pH=8, EDTA 10 mM, glucoză 50 mM, lizozim 0,5%). La aceasta s-au adăugat 8 ml de soluție SDS 1%/NaOH 0,2N și apoi 6 ml de soluție potasiu 3M/acetat 5M pentru a suspenda celulele complet. După centrifugarea suspensiei, fluidul supernatant rezultant s-a tratat cu fenol(cloroform (1:1), s-a amestecat cu același volum de izopropanol și apoi s-au centrifugat. Peleta rezultată s-a dizolvat în soluție TE (Tris-HCI mM, pH=7,5, EDTA 1 mM) și s-a tratat cu RN-ază și apoi cu fenol/cloroform (1:1) urmat de precipitare cu etanol. Peleta rezultată s-a dizolvat din nou în soluție TE la care s-au adăugat în continuare NaCI și polietilenglicol 3000 până la concentrațiile lor finale de 0,63 M și respectiv, 7,5%. După centrifigare, peleta s-a dizolvat în soluție TE și s-a precipitat cu etanol. în acest mod, s-au obținut circa 300 μ$ de plasmid DNA. O porțiune de 100 pg a DNA-ului s-a digerat complet cu enzime de restricție EcoRI și Notl și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 0,8% (fabricat de către FMC BioProducts), și fragmentele vectorului astfel recuperate s-au purificat folosind un kit de purificare Prep-a-GeneDNA (fabricat de către BioRad Laboratories, Inc.) pentru a obține circa 55 μg de plasmid DNA care s-a folosit în construirea bibliotecii cDNA următoare.

Exemplul 6. Purificarea mARN-ului din celule McA-RH8994

S-au selectat celule McA-RH8994 care au prezentat activitate relativ ridicată în testul de colonie de la exemplul 4 ca material de folosit în donarea cDNA TPO de șobolan și s-au supus la următoarele experimente.

Izolarea de ARN total s-a realizat în principiu, conform cu procedura propusă în

Molecular Cloning (Sambrook șicolab. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Astfel, celule McA-RH8994 s-au crescut până la confluență în 15 discuri de cultură cu diametrul mm. După îndepărtarea mediului lichid, celulele din fiecare disc s-au suspendat complet

RO 118299 Β1

2365 în 0,8 ml de soluție guanidină 5M (tiocianat de guanidină 5M, citrat de sodiu 5MM /pH=7,0), β-mercaptoetanol 0,1 M, sarcosilsulfat de sodiu 0,5%) și suspensiile rezultate din toate discurile s-au colectat într-o singură eprubetă și volumul total s-a cotat la 20 ml cu soluția de guanidină. Amestecul rezultat, care a devenit vâscos datorită distrugerii celulelor, s-a supus la circa 20 repetări de sucțiune/descărcare cu o seringă de 20 ml echipată cu un ac 18G și apoi, cu un ac 21G până când amestecul a devenit aproape lipsit de viscozitate. S-a folosit o porțiune de 18 ml de CsCI 5,7M - EDTA + 0,1 M (pH=7,5) ca tampon de amortizare într-o eprubetă de centrifugare din polialomer pentru folosire în centrifuga Beckman SW28, și amestecul menționat anterior de circa 20 ml s-a așezat cu blândețe peste amortizor în așa fel încât, straturile să nu fie deranjate și eprubetă s-a umplut aproape în întregime. Eprubetă astfel preparată s-a centrifugat 20 h, la 25000 rpm și la 20°C. Peleta rezultată s-a spălat de 2 ori cu o cantitate mică de etanol 80%, s-a dizolvat în soluție TE, s-a extras cu fenol/ cloroform (1:1) și apoi s-a supus precipitării etanolice cu 1/10 voi de acetat de sodiu 3M și 2,5 voi. etanol. în acest mod, s-au obținut circa 2,5 mg de ARN total de la circa 10⁸ celule.

Purificarea ARN-ului poli (A)⁺ din ARN-ul total s-a realizat folosind Oligotex™-dT30 (super) (fabricat de către Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche; moleculele oligo dT sunt imobilizate pe particule de latex prin legare covalentă, și purificarea ARN poli (A)⁺ se poate atinge în mod similar utilizării unei coloane oligo dT care se folosește de obicei în acest scop). Din circa 500 ^g ARN total s-au obținut 20 ^g de ARN poli (A)⁺.

Exemplul 7. Construcția bibliotecii cDNA de șobolan cDNA dublu catenar având un sit de recunoaștere EcoRI la capătul său 5' și un sit de recunoaștere Notl la capătul său 3' s-a sintetizat din 5 pg de ARN poli (A)⁺ obținut în exemplul 6, folosind un kit de sinteză Time Saver™ cDNA (fabricat de către Pharmacia; un kit de sintază cDNA bazat pe metoda modificată a lui Okayama și Berg, Mol.Cell.Biol., vol.2, pp.161-170,1982) și DIRECȚIONAL CLONING TOOLBOX (fabricat de către Pharmacia; un set al unui primer S'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA (TjW^SECV.ID.Nr.lS) care conține o secvență de recunoaștere Notl pentru utilizare în sinteza cDNA și adaptorii 5'-AATTCGGCACGAG-3' (SECV.ID.Nr.16) și 5'-CTCGTGCCG-3' (SECV.ID.Nr.17) pentru folosire la adăugarea unei secvențe de recunoaștere EcoRI). cDNA-ul astfel sintetizat s-a ligat cu 1,2 μg din vectorul de expresie pEF18S (conform exemplului 5) care fusese digerat în avans cu EcoRI și Notl și transformat în 8,4 ml de tulpină E.coli DH5 înalt competentă (fabricată de către Toyobo Co., Ltd.). S-au obținut 5,3 x 10⁵ transformanți.

Exemplul 8. Prepararea (donarea) fragmentului cDNA TPO de șobolan prin PCR Cele 530000 clone ale bibliotecii cDNA McA-RH8994 construite în exemplul 7 s-au cultivat peste noapte în 50 ml de mediu LB care conține 50 Mg/ml ampicilină, și plasmizii cDNA McA-RH8994 s-au purificat din celulele rezultate colectate prin centrifugare, folosind QIAGEN⁺ tip 100 (fabricat de către DIAGEN; o coloană de silice de schimb anionic folosită pentru purificarea DNA). S-a obținut circa 200 ^g plasmid DNA.

S-au sintetizat 2 primeri nucleotidici anti-sens AP8-1R și AP8-2R, care corespund secvenței aminoacide a fragmentului peptidic AP8 descris în exemplul 2, și 2 primeri nucleotidici sens EF1a-1 și EF1a-2, care corespund primului intron al factorului de alungire 1a uman al vectorului plasmid pEF-18S (cf.fig.6) folosit pentru prepararea bibliotecii cDNA. Sinteza acestor primeri s-a efectuat apelând la un Sintetizator 39DNA/RNA (fabricat de către Applied Biosystems; un sintetizator bazat pe metoda β-cianoetilamidită) și purificarea lor s-a efectuat utilizând o coloană OPC pentru purificarea de DNA sintetic (fabricată de către Applied Biosystems; o coloană de silicagel fază inversă utilizată pentru purificarea de DNA sintetic având grupări tritil). Fiecare dintre aceste molecule DNA purificate s-a dizolvat în soluție TE până la o concentrație finală de 50 μΜ și s-a depozitat la - 20°C până la folosirea sa. Oligonucleotida sintetică folosite în procedura următoare s-au sintetizat și s-au purificat în același mod.

2370

2375

2380

2385

2390

2395

2400

2405

2410

RO 118299 Β1

Primerii AP8-1R și AP8-2R sunt primeri amestecați constând din 17 nucleotide continue în care este încorporată deoxiinozină, așa cum s-a raportat de către Takahashi și colab., (Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, vol.82, pp.1931-1935, 1985).

Primerii EF1a-1 și EF1a-2 constând din 21 și .respectiv, 20 nucleotide s-au sintetizat pe baza exemplelor nucleotidice de la pozițiile 1491 la 1512 și 1513 la 1532 ale secvenței genomice raportată de către Uetsuki și colab.,(J.Biol.Chem.,vol.264, pp.5791-5798,1989).

AP8: lle Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Thr

Ser

AP8-1R:3‘- ACG CTG GGG GCI GAI GA - 5'

A A AT A A

T c

AP8-2R: 3‘- GGG GGG CGG ACG CTG GG -5'

A A A A A

T T T

CCC

EF1 a-1: 5* - GGA TCT TGG TTC ATT CTC AAG - 3'

EF1a-1: 5' - CCT CAG ACA GTG GTT CAA AG - 3’ (SECV.ID.Nr.18) (SECV.ID.Nr.19) (SECV.ID.Nr.20) (SECV.ID.Nr.21) (SECV.ID.Nr.22) (SECV.ID.Nr.23) (SECV.ID.Nr.24) (SECV.ID.Nr.25) (SECV.ID.Nr.26) (SECV.ID.Nr.27) (SECV.ID.Nr.28) (SECV.ID.Nr.29) (SECV.ID.Nr.30)

Folosind 3 μ$ de plasmid cDNA McA-RH8994 ca matriță, AP8-1R (500 pM) și EF1a1 (100 pmol) ca primeri și kitul de reactivi PCR GeneAmp™ cu polimeraza DNA AmpliTaq™ (fabricată de către Takara Shuzo Co., Ltd.,; un set de polimeraza Taql termostabilă, un tampon de reacție și dNP de folosit în PCR), s-a realizat PCR prin sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (fabricat de către Perkin-Elmer; un cicler termic pentru PCR) (volum 100 μ\\ încălzire la 95°C, 2 min, un total de 35 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 40°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min și incubare finală la 72°C, 7 min). în scopul îmbunătățirii specificității fragmentelor DNA astfel amplificate, următoarele PCR s-au realizat (volum 100 μΙ; încălzire la 95°C, 2 min, un total de 35 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 45°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min cu o incu bare finală de 7 min la 72°C), folosind 1 μΙ din soluția reacției PCR astfel obținută ca matriță și EF1a-2 (100pmol) și AP8-2R (500 pmol) ca primeri.

Soluția reacției asfel obținute s-a supus electroforezei în gel de agaroză 2% (fabricat de către FMC bioProducts) pentru a izola un fragment DNA de circa 330 bp ca produs principal al PCR care, în continuare, s-a purificat folosind kitul de purificare menționat anterior Prep-A-Gene DNA (fabricat de către Bio-Rad Laboratories, Inc.). Folosind ligaza T4DNA (fabricată de către Life Technologies), fragmentul DNA astfel purificat s-a subclonat în vectorul pCR™lI (un vector pentru donarea TA a produselor PCR fabricat de către Invitrogen). Deoarece, polimeraza termostabilă folosită în PCR are o activitate transferazică terminală, fragmentul DNA amplificat este subclonat direct în vectorul pCR™ll care are capătul 5'-dT coeziv, apelând la proprietatea enzimei de a adăuga un acid deoxiadenilic la capătul 3' al DNA-ului amplificat PCR. Moleculele plasmidului DNA s-au purificat din 28 clone selectate la întâmplare de la clonele rezultate folosind QIAGEN-tip 100 (fabricat de către DIAGEN) și s-au determinat secvențele lor nucleotidice cu un secvențator 373A DNA (un secvențiator de fluorescență, fabricat de către Applied Biosystems) folosind un kit de secvențare Taq Dye

Deoxy™ Terminater Cycle (fabricat de către Applied Biosystems; un kit utilizat în determinarea secvenței nucleotidice cu ajutorul PCR folosind coloranți fluorescenți, pe baza metodei dideoxi a lui Sânger și colab. Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, vol.74, pp. 5463-5467,1977).

R0118299 Β1

2465

Când s-a selectat un fragment DNA care codifică 3 resturi aminoacide (Ile/Thr/Ser)Val-Pro ale secvenței aminoacide a lui AP8 prezentată mai sus, alăturată primerului AP8-2R de la fragmentele DNA astfel obținute, șî s-a secvențat întreaga lungime, cDNA a conținut de 261 bp. Pozițiile 173-175 ale acestui fragment cDNA au codificat metionina, și cadrul de codificarea a coincis cu cadrul aminoacid al AP8. Deoarece, secvența interpusă poziției 173-175 a fragmentului DNA a coincis cu secvența lui Kozak (Kozak, M., Cell, vol.44, pp. 238-292,1986), se pare că acest fragment cDNA conține o regiune de inițiere a translatării, care codifică capătul N-terminal al proteinei TPO de șobolan. Acest fragment cDNA s-a numit Al. Secvența nucleotidică a fragmentului Al excluzând secvența vectorului, și o secvență aminoacidă dedusă de la acesta, sunt prezentate în lista de secvențe (SECV. ID. Nr.1) atașată.

Exemplul 9. Selectarea clonei cDNA TPO prin PCR

Biblioteca cDNA menționată anterior s-a divizat în depozite de circa 10000 clone, s-au cultivat peste noapte în 1 ml de mediu LB menționat deja, care conține 50 ^g/ml ampicilină și apoi s-au supus extracției plasmidului dNA folosind un aparat automat de izolare de plasmizi PI100 (VER-3.0, fabricat de către Kurabo Industries, Ltd., un aparat automat de extracție de plasmid DNA bazat pe o metodă modificată a metodei SDS-alcalin descrisă în Molecular Cloning, Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Separat de aceasta s-au sintetizat următoarele 2 oligonucleotide pe baza fragmentului cDNA Al și s-au purificat.

5' CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG 3' (SECV.ID.Nr.31) (o secvență sens a pozițiilor 1 până la 17 ale secvenței SECV.ID.Nr.1; CGAG reprezintă o secvență adaptor)

5‘ CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG 3' (SECV.ID.Nr.32) (o secvență antisens a pozițiilor 212 până la 232 ale secvenței SECV.ID.Nr.1).

Folosind 1/30 voi. din fiecare probă plasmid DNA obținut mai sus ca o matriță, nucleotidele astfel sintetizate ca primeri și kit de reactivi PCR GeneAmp™ și polimeraza DNA AmpliTaq™ (fabricată de Takara Shuzo Co., Ltd.), s-a realizat PCR prin sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (fabricat de către PERKIN-ELMER) (un total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 94°C, 30 s, normalizare la 66°C, 30 s și sinteză la 72°C, 1 min. Ca urmare, s-a detectat o bandă specifică de 236 bp în 3 din cele 100 rezerve examinate. Când unul dintre aceste 3 depozite s-a divizat în subdepozite de circa 900 clone pentru extracția plasmidului DNA și s-a realizat PCR în același mod, s-a detectat o bandă specifică în 3 din cele 100 subdepozite testate. Când unul dintre aceste subdepozite s-a divizat în continuare în depozite de 40 clone și s-a realizat același proces de screening, banda specifică s-a găsit în 3 din cele 100 depozite testate. Unul dintre depozitele candidat s-au cultivat pe o placă L8(mediu LB conținând 15% agar) suplimentat cu 50 Mg/ml ampicilină și fiecare dintre coloniile astfel formate s-au supus extracției plasmidului DNA și PCR în același mod. Ca urmare, s-a detectat o bandă pozitivă în 2 dintre cele 100 clone examinate.

Exemplul 10. Secvențarea cDNA TPO de șobolan

Purificarea plasmidului DNA s-a efectuat în principiu în conformitate cu procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Fiecare din cele 2 clone obținute la exemplul 9, s-au cultivat peste noapte în 50 ml de mediu LB care conține 50 Mg/ml ampicilină, și s-a obținut după purificarea în același mod cum s-a descris în exemplul 6, circa 300 Mg de plasmid DNA.

Plasmidul DNA astfel obținut s-a supus secvențării în același mod cum s-a descris în exemplul 8, folosind kitul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (fabricat de către Applied biosystems) pentru determinarea secvenței nucleotidice complete care conține fragmentul Al. Ca urmare, secvențele nucleotidice ale celor două clone au coincis complet,

2470

2475

2480

2485

2490

2495

2500

2505

RO 118299 Β1 arătând că ele sunt aceiași clonă. S-a selectat una dintre aceste clone și plasmidul purtat de către această clonă s-a numit pEF18S-A2a. Secvența sa nucleotidică și secvența aminoacidă dedusă de la aceasta sunt prezentate în Lista de Secvențe (SECV.ID.Nr.2).

Secvența prezentată în Lista de secvențe (SECV.ID.Nr.2) are caracteristici distincte. Secvența în aval a regiunii de 172 bp 5' netranslată codifică o secvență aminoacidă bogată în aminoacizi hidrofobi care se presupune a fi o secvență semnal de secreție a proteinei constând din 21 aminoacizi începând cu metionina. Această proteină conține 126 resturi aminoacide, o secvență 3' netranslată de 1025 nucleotide și o coadă poliA care urmează codonului de terminare(TAT). Această proteină conține o secvență care corespunde secvenței aminoacide AP8 analizată în exemplul 2 (aminoacizii numerele 1-12 în SECV.ID.Nr.2), dar nu conține o secvență de consens pentru N-glicozilare. Secvența nucleotidei 1624-1629 localizată imediat la capătul secvenței 3' netranslatat este diferită de o secvență consens, dar pare a fi o secvență potențială de poliadenilare.

Vectorul pEF18S-A2a purtat de către o tulpină DH5 s-a depozitat pe 14 februarie 1994 sub numărul de depozit FERM BP-4565, la Național Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional Trade and Industry, Japonia.

Exemplul 11. Expresia cDNA TPO de șobolan în celule COS1 și confirmarea activității TPO f

Transfectarea plasmidului pEF18S-A2a în celule COS1, s-a realizat în următorul mod prin modificarea ușoară a metodei DEAE-dextran care include tratament clorocoreină (Sonpayrac și colab., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.78, pp. 7575-7578, 1981; Luthman $/ colab., Nuci. Acids Res., vol.11, pp. 1295-1308, 1983). Celule COS 1 (ATCC CRL 1650) s-au suspendat în mediu DMEM menționat anterior care conține FCS 10% s-au pus într-un disc din plastic pentru culturi de țesut de 100 mm, și s-au cultivat la 37°C într-un incubator la CO₂ 5%, până când celulele au atins un stadiu de circa 40% confluență. Separat plasmidul pEF18S-a2a (10 ^g) dizolvat în 30 μ\ HBS (HEPES 21mM, NaCI 145mM, pH=7,1) s-a adăugat la 4 ml mediu de cultură DMEM care fusese suplimentat cu 500 /zg/ml dextranDEAE (fabricat de către Pharmacia), 80 μΜ de clorocoreină (fabricată de către Sigma Chemical Co.), 8% (v/v) de HBS și 9% (v/v) de Nu.Serum (fabricat de către collaborative Research, Inc.). Amestecul astfel preparat s-a adăugat la celulele COS 1 cultivate ca mai sus care s-au spălat de 2 ori cu mediul de cultură DMEM, și cultura s-a menținut 5 h la 37°C în incubator la CO₂ 5%. După aceea supernatantul culturii din disc s-a îndepărtat prin sucțiune, și celulele care au rămas în disc s-au spălat de 2 ori cu mediu de cultură DMEM, suplimentat cu 15 ml mediu de cultură DMEM conținând FCS 10% și s-au cultivat la 37°C, 3 - 5 zile în incubator cu CO₂ 5% .pentru recuperarea supernatantului de cultură rezultat.

Supernatantul de cultură astfel obținut s-a dializat extensiv contra mediului de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan. Activitatea TPO s-a găsit într-un mod dependent de doză în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat plasmidul pEF18S-A2a (fig.7). Ca și în cazul TPO derivat XRP numeroase megacariocite formate au prelungit procesul citoplasmic în ziua a 4-a de cultură. în contrast, nu s-a găsit activitate TPO în supernatantul culturii celulelor COS1 la care s-a transfectat doar plasmidul pEF18S (fig.7). în sistemul de testare M-07e s-a găsit, de asemenea, sporirea proliferării celulei M-07e într-un mod dependent de doză în supernatant în cultura celulelor COS1 în care s-a exprimat plasmidul pEF18S-A2a, dar nu și în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat doar plasmidul pEF18S. Aceste rezultate au demonstrat că A2a conține un cDNA care codifică o proteină cu activitate TPO.

în continuare, s-a preparat o probă TPO parțial purificată în scopul examinării abilității acestei activității TPO de a promova producerea de plachete in vivo. Inițial, celule COS1 transfectate cu plasmidul pEF18S-A2a s-au cultivat 3 zile într-un mediu de cultură fără ser

RO 118299 Β1

2560 care a fost suplimentat cu 0,2 mg BSA, prin aceasta obținând circa 5,81 de supernatant de cultură lipsită de ser. La supernatantul de cultură fără ser s-a adăugat inhibitor proteazic pAPMSF până la concentrația finală de' 1 ml și amestecul s-a filtrat folosind un filtru de 0,22 μΜ. S-au adăugat la 5793 ml de filtrat rezultat (concentrația proteinei, 0,229 mg/ml; proteina totală 1326 mg; activitatea relativă, 1000; activitatea totală 1326000) 0,85 mol de NaCI pentru 1000 ml (288 g în total), prin aceasta obținând 5849 ml de soluție conținând 0,822 M NaCI. Soluția astfel preparată s-a aplicat la o rată de curgere de 7 ml/min la o coloană TSK - gel AF-BLUE 650MH (fabricată de către Tosoh corp., număr de catalog 0,8705; cu diametru de 5 cm și 6 cm înălțimea patului) care a fost echilibrată înainte cu fosfat de sodiu 20 mM (pH=7,2) care conține 1M NaCI. După finalizarea aplicării probei, au trecut prin coloană circa 7900 ml eluat, după eluare cu fosfat de sodiu 20 mM (pH=7,2) care conține 1M NaCI. Acest eluat s-a strâns și s-a concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare de tip (Omega Ultrasette, cu greutatea moleculară nominală de separare 8000; produsă de către Filtron), prin aceasta obținând o fracțiune F1 trecută prin (460 ml; concentrația proteinei 2,11 mg/ml; proteina totală 973 mg; activitatea relativă 16,3). în continuare, soluția de eluție s-a schimbat la NaSCN 2M și fracțiunea F2 eluată adsorbită TSK-gel AF-BLUE 650 MH TPO activă (2840 ml) s-a concentrat până la 6,81 ml folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM3 (77 mm diametru, produsă de Amicon, Corp.). Proteina totală din această fracțiune F2 TPO activă a fost 12,5 mg, iar randamentul proteinei lui F2 la această etapă a fost 0,62%. Activitatea relativă a TPO s-a calculat a fi 240. Imediat F2 s-a aplicat la HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (fabricată de către Pharmacia Biotch., număr de catalog 17-1071-01;

2,6 cm în diametru și 60 cm înălțimea patului) și s-a developat cu acetat de sodiu 20 mM (pH=5,5) conținând NaCI 50mM la o rată de curgere de 1 ml / min. După începerea developării, s-a găsit activitate TPO în eluatele din domeniul de la 194 până la 260 ml după aplicare. Aceste eluate s-au strâns pentru a obține o fracțiune F2 Superdex 200 pg TPO activă (66 ml; concentrația proteinei 0,112 mg/ml; proteina totală, 7,41 mg; activitate relativă 142860; activitate totală 1058600). în continuare, s-au preparat tampon A (acetat de sodiu 20mM, pH=5,5) și tampon B (fosfat de sodiu 20 mM, pH= 7,2 conținând NaCI 500mM) și fracțiunea TPO activă s-a aplicat la o rată de 1 ml/min la o coloană de schimb cationic puternică RESOURCE S (produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-1178-01; 0,74 cm în diametru și 3 cm înălțimea patului) care a fost echilibrată înainte cu 100% A. în continuare, s-a realizat eluția la o rată de curgere de 0,3 ml/min cu 40 min gradient linear de la 100% A până la 100% B. Când s-a analizat activitatea TPO s-a detectat într-o gamă mare de eluate (de la 5% B până la 32%B). Aceste eluate TPO active s-au strâns și s-au concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare cu membrană YM 3 (25 mm diametru, produsă de Amicon Corp.) pentru a obține o fracțiune F2 RESOURCE S TPO activă (1,65 ml concentrația proteinei, 4,74 mg/ml; proteina totală 7,82 mg; activitatea relativă 71400; activitatea totală 559600).

Proba TPO parțial purificată s-a administrat subcutanat 5 zile consecutive (474 μg (100 ^)/șoarece/zi) la șoareci masculi ICR (în vârstă de 9 săptămâni) al căror număr de plachete a fost măsurat în ziua dinaintea administrării. Pentru control, s-a adminitrat în același mod BSA (200 ag (100 ^)/șoarece/zi) sau un tampon folosit ca solvent al TPO parțial purificată (100 μΙ/șoarece/zi). în ziua următoare administrării finale, s-a colectat sânge din inima fiecărui șoarece pentru măsurarea numărului de plachete folosind un hemocitometru (F800, fabricat de către Toa lyo Denshi). La administrarea de TPO parțial purificată în șoareci s-au observat o creștere a numărului de plachete printr-un factor de circa 2,14 comparativ cu numerele de plachete dinaintea administrării. Când s-a comparat cu grupurile de control, numerele plachetelor la șoarecii la care s-a administrat TPO parțial purificată au fost de circa 1,74 ori mai mari decât la șoarecii la care s-a administrat BSA și circa 1,90 ori mai mari decât cele de la șoarecii la care s-a administrat tamponul. Aceste rezultate au demonstrat

2565

2570

2575

2580

2585

2590

2595

2600

2605

RO 118299 Β1 că TPO promovează producerea de plachete in vivo. în plus, deoarece cantitatea proteinei imunosupresoare acide (IAP) cunoscută ca proteină de fază acută la șoarece, nu a fost ridicată la șoarecii la care s-a administrat TPO parțial purificată, sugerează puternic că TPO este diferită de IR-6 și IL-11 considerând inducerea proteinei de fază acută.

Exemplul 12. Detectarea mARN TPO în țesuturi de șobolan în scopul localizării țesutului care exprimă mARN TPO de șobolan în corpul șobolanului, s-a extras ARN din diverse țesuturi de șobolan. Un total de 6 șobolani s-au supus iradierii cu raze X în același mod cum s-a descris în exemplul 1, și s-au excizat diverse țesuturi (creier, timus, plămân, ficat, inimă, splină, intestin subțire, rinichi, testicule și celulele de măduvă osoasă) din șobolani în zilele a 11-a până la 14-a după iradiere cu raze X și s-au înghețat imediat în azot lichid. Extracția ARN-ului total s-a efectuat folosind un reactiv ISOGEN pentru izolarea ARN (produs de Wako Pure Chemical Industries. LTD). Cantitatea de ISOGEN s-a determinat conform greutății fiecărei probe de țesut congelat și proba reactiv-țesut adăugat s-a tratat cu un omogenizator (PHYSCOTRON^R NS-60, produs de NITI-ON Medical & Physical Instrumente MFG.Co.,LTD) până la dezintegrarea completă a țesutului I aproximativ 45-60 s la 10000 RPM. Omogenatul de țesut s-a supus apoi extracției ARN total folosind o procedură bazată pe metoda acid guanidin fenol cloroform a lui Chomczyneski și colab., (Anal.Biochem., voi.162,pp. 156-159,1987). Ca rezutat, s-au obținut 1,1 până la

5,6 ARN total din țesuturile respective. Apelând la Oligotex™-dT30 (Super) produs de către Japan Synthetic Rubber/Nippon Roke), s-au purificat 20 μρ de ARN poli (A)⁺ din circa 500 pg ARN total.

Folosind întâmplător un primer, s-a sintetizat prima bandă a cDNA dintr-un 1 pg de ARN poli(A)⁺ obținut din fiecare țesut. Astfel, 1 pg de ARN poli(A)⁺ s-a dizolvat în 10 μΙ apă sterilă, s-a incubat la 70°C, 15 min și apoi s-a coborât rapid temperatura. La aceasta s-au adăugat 75 pmoli de primer oarecare (Takara Shuzo Co., Ltd.) 10 U inhibitor RNază (Bohringer-Mannheim Corp.) 50 mM de Tris-HCI (pH=8,3), 75 mM de KCI, 3 mM MgCl2, și 200 U de Super Script™ II (o transcriptază inversă produsă de Life Technologies). Soluția astfel preparată (volum total 20 μΙ) s-a incubat 1 h, la 37°C, și soluția de reacție rezultată s-a incubat la 70°C pentru 10 min, pentru inactivarea enzimei și s-a depozitat la - 20°C până la folosirea sa.

Primerii noi pentru PCR s-au sintetizat pe baza secvenței cDNA TPO de șobolan obținută la exemplul 10. Secvențele primerilor astfel sintetizați sunt precum urmează. rTPO-l: 5' - CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG - 3' (SECV.ID Nr-33) (pozițiile 347 până la 367 din SECVENȚA ID Nr.2);

rTPO-N: 5' - TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC - 3' (SECV.ID.Nr.34) (primer antisens corespunzând pozițiilor 1005 până la 1025 din SECVENȚA ID Nr.2).

Folosind 1/10 volum a fiecărei soluții cDNA sintetizate ca o matriță, 1 μΜ fiecare din astfel sintetizați! rTPO-l rTPO-N ca primeri și kit reactiv GeneAmp™ PCR cu ARN polimerază ampliTaq™ (produse de Takara Shuzo Co., Ltd.), s-au realizat PCR într-un volum de 100 μΙ folosind sistemul GeneAmp™ PCR 9600 (fabricat de PERKIN-ELMER) și încălzind la 95°C 2 min, repetând un total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare 1 min, la 95°C normalizare 1 min, la 57°C și sinteză 1 min, la 72°C urmat de incubare finală la 72°C timp de 7 min. Când fiecare din aceste soluții de reacții obținute s-a supus la electroforeză folosind gel de agaroză 2% (produs de FMC BioProducts) și s-au examinat benzile amplificate s-au găsit benzi care păreau a fi specifice pentru mARN TPO pe gelurile rezultate de la creiere, ficat, intestine subțiri și rinichi. Aceste rezultate arată că expresia mARN TPO se întâlnește în șobolan în țesuturile acestor organe, deși expresia sa cantitativă nu poate fi apreciată. Când sunt luate în considerare existența posibilă a unui mod de expresie similar în organismul uman, și rezultatele de la exemplul 4, se pare că ficatul este un material de start corespunzător pentru dobândirea cDNA uman.

R0118299 Β1

Exemplul 13. Construcția bibliotecii cDNA derivată din ficat uman normal

Pe baza rezultatelor exemplului 12 s-a ales ca material inițial ficatul pentru folosire în donarea de cDNA TPO uman. în același mod, cum s-a descris în exemplul 7, s-a sintetizat cDNA dublu catenar având un sit de recunoaștere EcoRI pe capătul său 5' și un sit de recunoaștere Notl pe capătul său 3' din 5 pg poli (A)⁺ ARN derivat din ficat uman normal, comercial, (produs de Clontech., un produs extras bazat pe metoda acid guanidin fenol cloroform al lui Chomczynski și colab.), folosind un kit de sinteză cDNA Time Saver ™ (produs de Pharmacia) și DIRECȚIONAL CLONING TOOLBOX (produsă de Pharmacia). cDNA-ul astfel sintetizat s-a ligat cu 1,2 pg din vectorul de expresie pEF185 care a fost digerat anterior cu EcoRI și Notl și transformat în 8,4 ml de E.coli DH5 înalt competentă (produsă de Toyobo Co., Ltd.). Ca urmare, s-a obținut 1,2 x 10⁶ transformanți.

Exemplul 14. Prepararea (donarea) fragmentului cDNA TPO uman prin PCR

Folosind primeri oarecare, s-a sintetizat prima bandă a cDNA dintr-un 1 pg de ARN poli(A)⁺ s-a dizolvat în 10 pl de apă sterilă, s-a incubat la 70°C ,15 min, și apoi s-a răcit rapid. La aceasta, s-au adăugat 75 pmol de primeri oarecare (Takara shuzo Co., Ltd.), 10 U de inhibitor RNază (Bohringer-Manheim Corp.), 50 mM de Tris-HCI (pH=8,3), 75 mM de KCI, 3 mM de MgC12 și 200 U dintr-o transcriptază inversă Super Script™ II (produsă de Life Tehnologies). Soluția astfel preparată (volum total 20 μΙ) s-a incubat la 37°C, 1 h, și soluție de reacție rezultată s-a incubat la 70°C, 10 min pentru inactivarea enzimei și s-a stocat la - 20°C până când s-au folosit.

Primerii pentru utilizare PCR s-au sintetizat pe baza secvenței cDNA TPO de șobolan (SECV.ID Nr.2). Secvențele primerilor astfel sintetizați sunt cele care urmează. rTPO-AIN: 5* - ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC - 3’ (SECV.ID.Nr.35) (pozițiile 173-193 din SECV.ID.Nr.2);

rTPO-N: 5' - TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC - 3' (SECV.ID.Nr.36) (primer antisens corespunzător la pozițiile 1005 -1025 din SECV.ID.Nr.2.

Folosind 1/10 volum din fiecare soluție cDNA sintetizată ca matriță, 1 μΜ fiecare din primerii sintetizați rTPO-AIN și rTPO-N și kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo Co., Ltd.) S-au realizat PCR cu un volum de 100 pl folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și încălzind la 95°C 2 min, repetând un total de 35 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare 1 min, la 95°C, normalizare 1 min, la 40°C și sinteză 1 min, la 72°C urmat de incubarea finală la 72°C, 7 min.

Soluția reacției astfel obținută s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA de circa 620 bp ca principal produs al PCR care s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare Prep-A-GeneDNA (produs de Bio-Rad Laboratories, Inc.). Secvența nucleotidică a fragmentului DNA astfel purificat s-a determinat direct printr-un secvențe 373 A DNA (fabricat de Applied Biosystems) folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (produs de Applied Biosystems). Secvența nucleotidică astfel determinată excluzând jumătatea primer și o secvență aminoacidă dedusă din acesta sunt prezentate în Lista de secvențe (SECV.ID.Nr.3).

Acest fragment DNA, exclusiv secvențele primer, are o lungime de 580 bp. Când s-au comparat, cDNA-ul uman a prezentat o omologie de 86% cu secvența nucleotidică cDNA de șobolan, indicând că acest fragment DNA codifică o porțiune a cDNA TPO umane.

Exemplul 15. Căutarea clonei cDNA TPO umane prin PCR

Prin primeri pentru PCR corespunzători TPO umane s-au sintetizat pe baza SECV. ID.Nr.3. Secvențele primerilor astfel sintetizați sunt cele care urmează. hTPO-l: 5' - TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG - 3' (SECV.ID.Nr.37) (pozițiile 60 până la 80 în SECV.ID.Nr.3).

HTPO-J: 5' - TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC - 3' (SECV.ID.Nr.38) (primer antisens corespunzător pozițiilor 479 la 499 din SECV.ID.Nr.3).

2660

2665

2670

2675

2680

2685

2690

2695

2700

2705

2710

RO 118299 Β1

Biblioteca cDNA uman construită în exemplul 13 s-a amplificat și s-a împărțit în 2 depozite (fiecare depozit conținând circa 100000 clone), s-au cultivat peste noapte într-un 1 ml în mediu LB care conține 50 ^g/ml ampicilina și apoi, s-a supus extracției plasmidului DNA folosind un aparat de izolare automată de plasmizi PI-100 (VER-3,0, fabricat de către

Kurabo Industries, Ltd.).

DNA-ul astfel extras s-a dizolvat în soluție TE.

S-au realizat PCR folosind 5% din proba de DNA extras ca matriță, 1 μΜ din fiecare oligonucleotidă sintetizată (hTPO-l și hTPO-J) ca primeri și un kit reactiv GeneAmp™ PCR cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo Co., LTD.) în 20 μΙ volum prin sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) (un total de 35 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, I min, normalizare la 59°C, I min și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de o incubare finală la 72°C, 7 min. Ca rezultat, s-a detectat o bandă specifică în 3 din cele 90 depozite folosite. Unul dintre aceste 3 depozite s-a împărțit în subdepozite, fiecare conținând circa 5000 clone, și plasmidul DNA s-a purificat de la 90 subdepozite pentru a realiza PCR în același mod. Ca rezultat, s-a detectat banda specifică în 5 subdepozite. Unul dintre aceste 5 subdepozite s-a divizat în subdepozite fiecare conținând 250 clone și plasmidul DNA s-a extras din 90 subdepozite. Când aceste probe extrase s-au supus la PCR în același mod, s-a detectat o bandă specifică în 3 subdepozite. Unul dintre aceste 3 depozite s-a divizat în continuare în subdepozite fiecare conținând 30 clone și s-a purificat plasmidul DNA din 90 subdepozite pentru a realiza PCR în același mod. Ca rezultat s-a detectat o bandă specifică în 3 subdepozite. Unul dintre depozitele candidat s-a cultivat pe placă LB menționată deja care conține 50 μg/ml ampicilină, și fiecare dintre cele 90 colonii astfel formate s-a supus la extracția de plasmid DNA și PCR, în același mod. Ca rezultat, în final, s-a obtinut o clonă HL 34.

Exemplul 16. Secvențarea cDNA TPO uman

Purificarea plasmidului DNA s-a realizat în principiu în concordanță cu procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook ș/colab., Cold Spring Harbor, Laboratory Press 1989). Clona HL34 s-a cultivat peste noapte în 50 ml de mediu LB care conține 50 μg/ml ampicilină, celulele rezultate s-au colectat prin centrifugare și s-au suspendat în 4 ml de soluție TEG-lizozim menționat anterior. La aceasta s-au adăugat 8 ml de soluție 0,2 N NaOH/1% SDS și apoi 6 ml de soluție 3M potasiu/5M acetat pentru a suspenda celulele complet. După cetrifugarea suspensiei, fluidul supernatant rezultat s-a tratat cu fenol/ cloroform (1:1), s-a amestecat cu același volum de izopropanol și apoi s-a centrifugat. Peleta rezultată s-a dizolvat în soluție TM și s-a tratat cu RNază, și apoi cu fenol/cloroform (1:1) urmat de precipitare cu etanol. Peleta rezultată s-a dizolvat din nou în soluție TE la care s-au adăugat în continuare NaCI și polietilenglicol 3000 până la concentrațiile lor finale de 0,63 M și .respectiv, 7,5%. După centrifugare, peleta s-a dizolvat în soluție Te și s-a precipitat cu etanol. în acest mod, s-au obținut circa 300 μg de plasmid DNA pEF185-HL 34.

Plasmidul DNA astfel purificat s-a aplicat la secventerul DNA 373 A (produs de către Applied Biosystems) pentru a determina secvența s-a nucleotidică completă folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (produs de Applied Biosystems). Secvența nucleotidică astfel determinată și o secvență aminoacidă dedusă de la aceasta sunt prezentate în Lista de secvențe (SECV.ID.Nr.4). în acest caz, oligonucleotidele sintetizate pe baza secvenței nucleotidice a SECV.ID.Nr.3 și oligonucleotidele sintetice desemnate pe baza secvenței interne obținute, prin analiza secvenței s-au folosit în determinarea secvenței nucleotidice ca primeri.

Ca rezultat, s-a confirmat că plasmidul clonă pEF185-HL34 cuprinde un fragment cDNA de 861 bp și conține secvențe strict omologe cu secvențele aminoacide AP8 (aminoacizi numerele 1-12 în SECV.ID.Nr.4) și TP2/TP3 (aminoacizii numerele 157 la 162 din

RO 118299 Β1

2760

SECV.ID.Nr.4) analizate în exemplul 2. Acest fragment DNA pare să codifice un cadru deschis de citire începând la poziția sa 25, dar nu are nici un codon de terminare și conține o secvență poliA asemănătoare cozii de 76 baze pe capătul său 3'. Secvența sa aminoacidă constând din 253 resturi aminoacide chiar înaintea secvenței poliA asemănătoarea cozii, a prezentat 84% omologie cu porțiunea corespunzătoare a cDNA TPO de șobolan (o jumătate de secvență aminoacidă) constând din 147 resturi prezentate în SECV.ID.Nr.2). Ca urmare, această clonă s-a găsit a fi un fragment DNA care codifică o porțiune a cDNA-ului uman care corespunde la cDNA TPO de șobolan. Datorită absenței unui codon de terminare și prezenței unei secvențe poliA asemănătoare terminației pe capătul său 3', această clonă nu pare a fi un cDNA complet, ci un produs artificial care a rezultat în timpul procedurii de construire a bibliotecii cDNA.

Exemplul 17. Expresia cDNA TPO umane în celule COS1 și confirmarea activității TPO

Transfectarea plasmidului clonă pEF18S-HL34 la celule COS1 s-a obținut conform exemplului 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 ^g de plasmid DNA prin metoda DEAE Dextran care include tratamentul clorochină. Celulele COS1 s-au cultivat 3-5 zile la 37°C și apoi s-a colectat supernatantul.

Supernatantul culturii astfel obținute s-a dializat extensiv împotriva mediului de cultură IMDM și s-au evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan. Activitate TPC s-a detectat într-un mod dependent de doză în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat un plasmid pEF185-HL34 (fig.8). După 4 zile de cultură numeroase megacariocite au format procese de. prelungiri citoplasmice. Spre deosebire, de aceasta activitatea TPO nu s-a găsit în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat doar plasmid pEF185 (fig.8). în sistemul de testare M-07e, s-a găsit o creștere a proliferării celulei M-07e numai în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-au exprimat plasmizi pEF18S-HL34 prin transfectarea lor. Aceste rezultate au demonstrat că pEF18S-HL34 conține o genă care codifică o proteină având activitate TPO. în plus, s-a dovedit că TPO umană acționează asupra celulelor megacariocitice progenitoare de șobolan (fără specificitate de specie).

Exemplul 18. Expresia TPO uman cDNA de tip deletatși confirmarea activității TPO Clona HL34 obținută în exemplul 15 a conținut cDNA cuprinzând o secvență continuă poliA asemănătoare terminației de la capătul său 3' care nu există în cDNA TPO de șobolan și prin urmare a părut a fi un produs artificial al experimentului. Ca urmare, s-a preparat o moleculă cDNA din care s-a deletat secvența poliA asemănătoare capătului în scopul de a vedea dacă o proteină exprimată prin cDNA deletat a avut activitate TPO. Deleția cDNA s-a preparat folosind PCR. Secvențele primerilor folosiți pentru PCR sunt asemănătoare cele care urmează, în care s-a adăugat un sit de recunoaștere pentru o enzimă de restricție la capătul 5' al fiecărui primer (EcoRI la hTPO 5 și Notl și 2 codoni stop TAA și TGA la hTPO 3).

hTPO5: 5’ - TTT GAA TTG GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC - 3' (SECV.ID.Nr.170) (pozițiile 1-21 din SECV.ID.Nr.4) hTPO3: 5' - TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC AGG TAT CC 3’ (SECV.ID Nr.171) (primer antisens corespunzător pozițiilor 757-780 din SECV.ID.Nr.4).

S-au realizat PCR utilizând 1 μg de plasmid DNA al clonei plasmid pEF185-HL34 obținută în exemplul 16 ca matriță, 10 μΜ din fiecare hTPO 5 și hTPO 3 ca primeri și kit-ul reactiv GeneAmp™ PCR cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzp Co., Ltd) cu un volum de 100 μΙ folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (fabricat de PERKINELMER) și repetarea unui total de 15 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 65°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min, urmată de incubarea finală 7 min, la 72°C. O bandă de circa 800 bp astfel obținută s-a digerat cu enzimele de restricție

2765

2770

2775

2780

2785

2790

2795

2800

2805

R0118299 Β1

EcoRI și Notl, s-a purificat și apoi s-a subclonat în vectorul de expresie pEF18S care fusese tratat anterior cu aceleași enzime de restricție. De la transformanții rezultați, 5 clone care au conținut un fragment DNA de circa 800 bp S-au selectat pentru a prepara o cantitate mare de plasmid DNA în concordanță cu procedura descrisă în exemplul 5. în continuare, întreaga lungime a regiunii amplificată de circa 800 bp a fiecărui plasmid s-a supus analizei secvenței nucleotidice pentru a găsi identitatea sa completă cu secvența nucleotidică analizată în exemplul 16 (pozițiile 1-780 din SECV.ID.Nr.4).

Clona plasmid astfel obținută s-a numit pHT1-231. Vectorul pHT1-231 conținut de o tulpină DH5 E.coli s-a depozitat pe 14 februarie 1994 sub numărul de depozit FERM BP-4564, la Național Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional Trade and Industry, Japonia.

Transfectarea plasmidului astfel obținut la celule COS1, s-a făcut urmând procedura de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 ^g de plasmid DNA prin metoda DEAE-Dextran care include tratament clorochină. Celulele COS1 s-au cultivat 3-5 zile ,la 37°C și apoi s-a colectat supernatantul.

Supernatantul de cultură astfel obținut s-a dializat extensiv împotriva mediului de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul test CFU-MK de șobolan. S-a găsit activitate TPO în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat plasmidul pHT1-231 (fig.9). în ziua a 4-a de cultură, numeroase cariocite au format procese citoplasmice alungite. în contrast, nu s-a găsit activitate TPC în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat numai plasmidul pEF18S (fig.9). în sistemul de testare M-07e, s-a găsit activitate de sporire a proliferării celulei M-07e ,doar în supernatantul culturii celulelor COS1 în care s-a exprimat plasmidul pHT1-231. Aceste rezultate au demonstrat că pHT1-231 conține un cDNA care codifică o proteină cu activitate TPO.

Exemplul 19. Prepararea regiunii 3' terminale a cDNA TPO umane prin PCR

Clona HL34 preparată în exemplul 15, a conținut cDNA-ul care cuprinde secvența poli(A) asemănătoare capătului, astfel, încât s-a sugerat că regiunea sa 3' terminală a fost incompletă. Prin urmare, s-a încercat obținerea regiunii 3' terminală de lungime întreagă prin PCR. S-au sintetizat următoarele 4 tipuri de primer 5' pentru PCR pe baza secvențelor determinate în exemplul 16.

hTPO-H; 5' - AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC - 3' (SECV.ID.Nr. 39) (pozițiile 574-594 din SECV.ID.Nr.4) hTPO-K; 5¹- ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC - 3' (SECV.ID.Nr.40) (pozițiile 595-615 din SECV.ID.Nr.4) hTPO-N: 5' - AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT - 3' (SECV.ID.Nr.41) (pozițiile 660-680 din SECV.ID.Nr.4)

HTPO-O: 5' - AGG GAT TCA GAG CCA AGA TTC - 3* (SECV.ID.Nr.42) (pozițiile 692-712 din SECV.ID.Nr.4).

S-au sintetizat următorii primeri 3' conținând nucleotide amestecate la cele 4 baze ale capătului 3' în scopul amplificării cDNA-ului de la partea de început a poli(A). Un primer ancoră fără nucleotide amestecate a fost, de asemenea, sintetizat. hTPO3mix: 5' - TAG CGG CCG C(T)₁₇G GGG - 3'(SECV.ID.Nr.43)

A AAA - 3'(SECV.ID.Nr.44)

C TTT - 3'(SECV.ID.Nr.45)

CCC - 3'(SECV.ID.Nr.46) hTPO3 ancoră: 5' - TAG CGG CCG C (T)„ - 3'(SECV.ID.Nr.47)

Prima bandă a cDNA s-a sintetizat de la 1 pg de ARN poli(A)⁺ comercial derivat de la ficat uman normal (produse de Clontech), ca în exemplul 14, dar folosind 0,5 pg de primer oligo dt (este inclus în kit-ul de sinteză cDNA Time Saver™ produsă de Pharmacia).

RO 118299 Β1

2860

S-au realizat PCR folosind 1/10 volum de soluție cDNA sintetizată ca matriță, 20 μΜ de primer hTPO-H și 10 μΜ de primer hTPO3mix și kit-ul reacticv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază Amplitaq™ (produse de Takara Shuzo Co., Ltd), cu volum de 50 μΙ folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (fabricat de PERKIN-ELMER) și încălzind la 96°C, 2 min, repetând un total de 10 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare termică la 96°C, 1 min, normalizare la 48°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmată de incubare finală 7 min la 72°C.

în scopul creșterii cantității expresiei TPO umane (pozițiile 1 la 163) și prevenirii hidrolizei N-terminale prin pretează, s-a construit un vector de expresie pentru folosire în expresia unei TPO umane de tip mutată (pozițiile 1 la 63) (la care se va face referire în continuare ca “h6(1-163)”) care are substituții la poziția 1 (Ser la Ala) și la poziția 3 (Ala la Val) a TPO umane (pozițiile 1 la 163) ((Ala¹ Val³) TPO (1-163)) și, în același timp, codifică Lys la poziția -1 și Met la poziția -2 ((Met ², Lys'¹, Ala¹, Val³) TPO (1-163)). S-au preparat 4 oligonucleotide sintetice prezentate mai jos, și oligonucleotidele prezentate sintetice 2-9 și 3-3 s-au fosforilat cu kinază T4 (produsă de Pharmacia) într-o soluție compusă din 1 mM ATP, 10 mM Tris-acetat, 10 mM-acetat și 50 mM K-acetat. în scopul transformării acestor oligonucleotide sintetice în fragmente DNA dublu împletite, fiecare pereche de fragmente DNA cu împletire simplă 1-9 și 2-9 și 3-3 și 4-3 s-au normalizat într-o soluție compusă din 10 mM Tris/HCI (pH=7,5) 10 mM MgC12 și 50 mM NaCI. în continuare, cele 2 perechi de fragmente DNA cu împletire dublă astfel obținute constând din 1-9 și 2-9 și 3-3 și 4-3 s-au tratat cu kit de ligare DNA (produs de Takara Shuzo). Fragmentul DNA astfel obținut prin reacția de ligare s-a subclonat în pBL (XH) (1-163) care s-a digerat înainte cu Xbal și Nrul, și s-a selectat o clonă substituită corect prin analiza secvenței următoarei oligonucleotide sintetice (gazda folosită a fost E.coli DH5a) și s-a numit pBL (XH)h6T(1-163):

1- 9: 5’ - CTAGAAAAAACCAAGGAGGGTAATAAATAATGAAAGCACCTGTACCA - 3' (SECV.ID.Nr.111);

2- 9: 5' - CAGGTGGTACAGGTGCTTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT - 3' (SECV.ID.Nr.112);

3- 3:5' - CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG - 3' (SECV.ID.Nr.113);

4- 3: 5' - CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG - 3' (SECV.ID.Nr.114);

1-9 20 3040

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT TTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTCGTGGA

Xbal2-9

60 3-3 7080

GTACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG CATGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC ±3 (SECV.ID.Nr.115)

Clona pBL(XH) (1-163) s-a digerat cu bal și Hindlll pentru recuperarea unui fragment în mărime de circa 500 bp care codifică resturile aminoacide 1 la 163 ale TPO umane de tip mutată, și fragmentul s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare DNA Prep-AGene și s-a donat în pCFM536(EP-A-136490) care a fost digerat înainte cu Xbal și Hindlll (drept gazdă s-a folosit E.coli JM109 care a fost transformată înainte cu pMW1 (ATCC nr.39933)). O clonă obținută în acest mod s-a numit pCFM536/h6T(1-163), și o tulpină E.coli având acest vector de expresie s-a folosit ca transformant pentru folosire în expresia TPO umană de tip mutată, și anume, h6T(1 -163). Acest plasmid de expresie conține secvența DNA prezentată în Lista de secvențe (SECV.ID.Nr.11).

2865

2870

2875

2880

2885

2890

2895

2900

2905

RO 118299 Β1

Al doilea PCR s-a realizat folosind 1/10 volum de la prima soluție PCR rezultată ca matriță, 20 μΜ de primer hTPO-K și 10 μΜ de primer hTPO3mix cu volumul de 50 μΙ, încălzire la 96°C, 2 min, repetarea unui total de 10 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturarea termică la 96°C, 1 min, normalizare la 63°C, 1 min și sintază la 72°C, 1 min, urmată de incubarea finală la 72°C, 7 min.

Al treilea PCR s-a realizat folosind 1/10 volum de la a 2-a soluție PCR rezultată ca matriță, 20 μΜ de primer hTPO-N și 10 μΜ de primer hTPO3mix cu volumul de 50 μΙ, încălzire la 96°C, 2 min, repetarea unui total de 10 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare termică la 96°C, 1 min, normalizare la 63°C, 1 min și sinteza la 72°C, 1 min, urmată de incubare finală 7 min la 72°C.

Al patrulea PCR s-a realizat folosind 1/10 volum din a 3-a soluție PCR rezultată ca matriță, 20 μΜ primer hTPO-O și 10 μΜ primer hTPO3mix cu volum de 50 μΙ, încălzire la 96°C, 2 min, repetarea unui total de 10 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturarea termică la 96°C, 1 min, normalizare la 63°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min, urmată de o incubare finală de 7 min la 72°C.

Al cincilea PCR s-a realizat folosind 1/10 volum de la a 4-a soluție PCR rezultată ca matriță, 20 μΜ de primer hTPO-O și 20 μΜ de primer hTPO3 ancoră cu volumul de 50 μΙ, încălzirea la 96°C ,2 min repetarea unui total de 10 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare termică la 96°C, 1 min, normalizare la 58°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmată de incubare finală la 72°C, 7 min.

Soluția reacției astfel obținută s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA de circa 600 bp ca produs principal al PCR care ulterior s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad Laboratiories Inc.). Secvența nucleotidică a fragmentului DNA astfel purificat s-a determinat direct printr-un secvențer DNA 373 A (produs de către Applied Biosystems) folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (produs de Applied Biosystems). Secvența nucleotidică, astfel determinată, și o secvență aminoacidă, dedusă de la aceasta, sunt prezentate în Lista secvențelor (SECV ID Nr.5).

Acest fragment DNA nou are o secvență nucleotidică care codifică 130 aminoacizi începând cu primerul hTPO-O, urmat de sedvențe a mai mult de 190 nucleotide la capătul 3' (nucleotidele după poziția 577 nu s-au putut determina). Secvența de 30 aminoacizi începând cu glicina coincide cu secvența aminoacidă a pozițiilor 203 până la 232 din SECV ID Nr.4. Secvența nucleotidică a pozițiilor 1-94, de asemenea, coincide cu secvența nucleotidică a pozițiilor 692-785 din secvența ID Nr.4.

Ca urmare a analizei secvenței fragmentului cDNA din exemplul 17 și fragmentului PCR amplificat din exemplul prezent, este estimată rezonabil proteina TPO umană care constă din 353 aminoacizi conținând 21 secvențe semnal aminoacide, așa cum este prezentat în SECV.ID Nr.6.

Exemplul 20. Reconstrucția bibliotecii cDNA derivată Idin ficat uman normal

Deoarece, clona HL34 obținută în exemplul 15a conținut secvența poli A asemănătoare terminației directe de la capătul său 3' al cadrului său descris de citire fără codoni de terminare și a apărut prin urmare a fi un produs artificial al sintezei cDNA, s-a reconstruit o bibliotecă cDNA folosind 5 pg ARN preparat poli(A)⁺ comercial, derivat din ficatul uman normal (produs de Clontech). Sinteza cDNA s-a realizat folosind sistemul lambda Superscript™ pentru sinteză cDNA și kit de donare λ și Superscript™ II RNază H‘ (ambele produse de Life Technologies). ARN poli(A)⁺ s-a supus la denaturare termică și apoi s-a adăugat la 20 μΙ de soluție de reacție conținând inclusiv secvența Notl oligo dT ca primer atașat la trusă (TrisHCI 50 mM, pH=8,3, KCI 75 mM, 3mM MaC12, 1 mM DTT, 1mM amestec dNTP, 200U RNază ’, SuperScript™ II) urmată de incubare 60 min la 37°C. După sinteza celei de-a 2-a

RO 118299 Β1

2960 benzi cDNA (2 h de incubare la 16°C în 150 μΙ soluție de reacție conținând 25 mM Tris HCI, pH=8,3,100 mM CaCI₂,5 mM MgC12,250 μΜ amestec dNTP, 5 mMDTT, 40 U DNA polimerază I de E.coli, 2U de HRNază E.coli ș\ 10 U DNA ligază E.coli, s-au adăugat 10 U DNA polimerază T4 și amestecul rezultat s-a incubat la 16°C, 5 min. Soluția de reacție s-a încălzit la 65°C, 10 min, și s-a extras cu același volum de fenol/cloroform și s-au îndepărtat molecule cDNA care au o lungime mai mică de 400 bp folosind o coloană SizeSep™ (o coloană spun pentru îndepărtarea DNA-ului de greutate moleculară mică, atașată la kit-ul de sinteză cDNA TimeSaver™ produsă de Pharmacia). După adăugarea de Adaptor EcoRI (atașat la Direcțional Cloning Toolbox produsă de Pharmacia) proba astfel tratată s-a digerat cu Notl și s-a aplicat din nou la coloană spun SizeSep™ 400 pentru îndepărtarea DNA cu greutate moleculară scăzută. S-au sintetizat astfel 1,3 μ$ de cDNA dublu catenar care are o secvență de recunoaștere EcoRI pe capătul său 5' și o secvență de recunoaștere Notl pe capătul său 3' care s-a ligat cu vectorul de expresie pEF18S care fusese digerat anterior cu EcoRI și Notl și apoi s-a transformat în 9,2 ml E.coli DH5 înalt competentă (produsă de Toyobo Co., Ltd.). Biblioteca cDNA (hTPO-F1) obținută astfel din ficat uman a conținut 1,0 x 10® transformanți.

Exemplul 21. Căutarea clonei cDNA TPO din biblioteca cDNA hTPO-F1 din ficat uman

S-au sintetizat primeri pentru PCR corespunzători cDNA TPO umane pe baza secvențelor nr. 3 și 6, prezentate în Lista secvențelor. Secvențele primerilor astfel sintetizați sunt precum urmează. hTPO-l: 5' - TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG - 3' (SECV.ID Nr.:48) (pozițiile 60-80 din SECV. ID Nr.3).

hTPO-KU: 5' - AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA - 3' (SECV. ID Nr.49) (primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 901 - 921 din SECV. ID Nr.6).

Biblioteca cDNA hTPO-F1 (1,0x10® transformanți) construită în exemplul 20, s-a împărți în 3 depozite (depozit nr.1 - 3) și depozitele s-au înghețat. S-au realizat PCR folosind 2 Mg de plasmid DNA preparat de la fiecare depozit ca matriță și 1 μΜ din fiecare oligonucleotidă sintetizată (hTPO-l și hTPO-KU) ca primeri. S-au realizat PCR în 100 μΙ volum prin sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) folosind kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu polimerază DNA ApliTaq™ (produs de Takara Shuzo Co., Ltd.) (un total de 35 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 59°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de incubare finală la 72°C, 7 min). Ca urmare, s-a amplificat un fragment DNA având mărimea așteptată când plasmidul DNA folosit a fost cel din depozitul nr.3. Depozitul nr.3 s-a divizat apoi în subdepozite, fiecare conținând 15 transformanți, și aceste subdepozite s-au cultivat peste noapte într-un 1 ml de mediu LB conținând 50 μς/πιΙ ampicilină, urmată de extracția plasmidului DNA folosind un aparat automat pentru izolare de plasmizi PI-100. DNA-ul astfel extras s-a dizolvat în soluție TE, și 5% din soluțiile rezultate s-au folosit ca matrițe pentru realizare de PCR folosind aceiași primeri și în aceleași condiții descrise mai sus. Ca rezultat, s-a găsit în 6 din cele 90 depozite DNA care au mărimea așteptată. Una dintre aceste rezerve pozitive s-a divizat în subdepozite fiecare conținând 1000 de clone, s-a extras plasmidul DNA și s-au realizat PCR în același mod cum s-a descris mai sus și nu s-a observat amplificare DNA. Densitatea benzilor pe geluri de electroforeză ale fragmentelor DNA amplificate printr-o serie de PCR au devenit mai subțiri, subdepozitul a fost subdivizat în continuare, deoarece a părut că aceasta s-a produs printr-o recuperare scăzută a plasmidului DNA datorită creșterii sărace a clonei de interes. De aceea, s-a realizat un alt screening prin intermediul hibridizării de colonie folosind depozitul nr.3 original.

Depozitul nr.3 s-a împrăștiat pe plăci cu agar LBIce de 15 cm în diametru la o astfel de mărime a inoculului pe fiecare placă de agar LB au crescut 4100 colonii. După prepararea unei plăci replică de la fiecare din plăcile astfel inoculate, una dintre plăcile duplicar s-a cultivat 6 h la 37°C pentru recuperarea coloniilor crescute pe placă și extracția

2965

2970

2975

2980

2985

2990

2995

3000

3005

RO 118299 Β1 probelor de plasmid DNA. Când s-au realizat PCR ale acestor probe DNA în același mod cum s-a descris mai sus, s-a observat amplificarea unei benzi echivalente mărimii așteptate în unul din 100 subdepozite. De la placa acestui subdepozit s-au preparat 2 filtre replică folosind o membrană de transfer Biodyne™ (produsă de PALL). Denaturarea filtrelor s-a realizat prin îmbinarea lor în 10% SDS 10 min, 0,5N NaOH/1,5 M NaCI, 10 min și în 0,5M Tris-HCI (pH=8,0)/1,5M NaC110 min în același scop, urmat de 30 min de uscare la aer, și în continuare, 1 h de coacere la 80°C într-un cuptor cu vid. Filtrele astfel coapte s-au spălat de 6 x SSC (preparat prin diluarea soluției stoc 20 x SSC constând din 175,3 g NaCI și

88,2 g citrat de sodiu dizolvate în 1 I apă, pH=7,0) suplimentat cu 1% SDS. Prehibridizarea filtrelor astfel spălate s-au obținut prin incubarea lor la 42°C, 30 min cu agitare în 30 ml soluție de reacție constând din 50% formamidă, 5 x SSC, 5 x soluție Denhardt (preparată din 50 x soluție Denhardt, conținând 5 g de Ficoll, 5 g polivinilpirolidonă și 5 g albumină serică bovină fracțiunea V în 500 ml apă), 1% SDS și 20 Mg/ml DNA din spermă de somon. După prehibridizare soluția de reacție s-a schimbat cu 30 ml soluție de hibridizare având aceiași compoziție, amestecată cu o sondă care fusese marcată cu (α - “P) dCTP (produs de Amersham) și apoi, s-au incubat cu agitare la 42°C, 20 h. Sonda marcată folosită în acest experiment a fost fragmentul EcoRI/BamHI al plasmidului pEF185-HL34, care s-a obținut prin purificarea unei porțiuni a SECV. ID Nr.4 din domeniul de la capătul său 5' la bază poziția 458 și prin marcarea porțiunii purificate prin tehnica primerului întâmplător cu Megaprime DNA Labelling System (un kit fabricate Amersham bazat pe metoda descrisă în Anal.Biochem., 132-6-13,1983). Filtrele astfel tratate s-au spălat în soluție 2 x SSC/0,1% SDS la 42°C, 30 min și apoi în 0,2 x SSC/0,1% SDS la 42°C, 30 min. Filtrele s-au supus apoi 16 h autoradiografiei la - 70°C folosind un ecran de intensificare și un film AR5 X-OMAT™ (produs de Eâstman Kodak). Ca rezultat, s-a observat un singur semnal considerat a fi pozitiv. S-au colectat coloniile aproximative corespunzătoare acestui semnal de la placa originală și s-au inoculat din nou pe o placă de agar LB de 10 cm. Pe placă s-au cultivat separat un total de 50 colonii, și probele DNA-ului lor s-au supus la PCR folosind primerii deja menționați hTPO-l și hTPO-KU în aceleași condiții cum s-a descris mai sus. Ca rezultat, s-a găsit amplificarea unei benzi echivalente de mărimea așteptată în numai o clonă, care s-a desemnat pHTS1.

Exemplul 22. Determinarea secvenței nucleotidice a clonei cDNA TPO umane pHTF1

Purificarea plasmidului DNA s-a făcut în principiu conform procedurii descrise în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Clona pHTF1 s-a cultivat peste noapte în 50 ml mediu LB conținând 50 Mg/ml ampicilină. Celulele rezultate s-au colectat prin centrifugare și s-au suspendat în 4 ml de soluție TEG-lizozim menționată anterior. La aceasta s-au adăugat 8 ml de soluție 0,2N NaOH/1% SDS și apoi 6 ml de soluție 3M potasiu/5M acetat pentru a suspenda celulele complet. După centrifugarea suspensiei supematantul rezultant s-a tratat cu fenol/cloroform (1:1), amestecat cu același volum de izopropanol și apoi, s-a centrifugat. Peleta rezultată s-a dizolvat în soluție TE și s-a tratat cu RNază și apoi, cu fenol/cloroform (1:1) urmat de precipitare cu etanol. Peleta rezultată s-a dizolvat din nou în soluție TE la care s-au adăugat în continuare NaCI și polietilenglicol 3000 până la concentrațiile lor finale de 0,63M și,respectiv, 7,5%. după centrifugare, peleta s-a dizolvat în soluție TE și s-a precipitat cu etanol. în acest mod, s-au obținut circa 300 Mg de plasmid DNA pHTF1.

Plasmidul DNA astfel purificat s-a aplicat la secvențerul DNA 373 A (produs de

Applied Biosystems) pentru a determina secvența sa nucleotidică completă folosind kit-ul de secvențare TaqDye Deoxy™ Terminater Cycle (produs de Applied Biosystems). Secvența nucleotidică determinată, astfel și secvența aminoacidă dedusă sunt prezentate în Lista de secvențe (SECV. ID Nr.7). Oligonucleotidele sintetizate pe baza secvenței nucleotidice a

SECV. ID Nr.6 și pe secvența internă obținută prin analiza reacției secvenței lor s-au folosit ca primeri în determinarea secvenței nucleotidice.

RO 118299 Β1

3060

Ca rezultat, s-a confirmat că, clona pHTF1 conține un fragment cDNA de 1721 bp și are omologie ridicată cu secvențele aminoacide AP8 (aminoacizi numerele 1 -12 din SECV ID Nr.7) și TP2/TP3 (aminoacizii numerele 157-162 din SECV. ID Nr:7) analizate în exemplul 2. Acest fragment DNA pare a avea o regiune 5' necodificatoare de 101 baze și un cadru deschis de citire constând din 353 resturi aminoacide începând la un rest metionină codificat la pozițiile nucleotidice 102 -104 și terminându-se la un rest glicină codificat la nucleotidele pozitive 1158-1168, codonul de terminare următor (TAA), o regiune 3' necodificatoare de 531 baze și o secvență poli A terminală de 30 baze. Secvența aminoacidă a unei proteine considerate a fi codificată prin cadrul deschis de citire a coincis complet cu secvența aminoacidă prezisă a TPO umane prezentate în SECV. ID Nr.6. Secvența cDNA a pHTF1 are o mărime mai mare decât secvența cDNA presupusă prezentată în SECV. ID Nr.6 și conține 77 baze suplimentare la capătul 5' și 347 mai multe baze adiționale la partea 3' în fața secvenței sale poliA coadă. De asemenea, secvența nucleotidică a fost diferită de SECV. ID Nr.6 la 3 poziții. Astfel, A (poziția 84), A (poziția 740), și (poziția 1198) din SECV. ID Nr.7 au fost C, T și respectiv A în SECV. ID Nr.6. Numai mutația de la poziția 740 a fost inclusă în regiunea care codifică proteina, dar această mutație nu produce schimbarea aminoacidă .deoarece ambele baze A și T au fost cea de-a treia bază a codonilor treoninei. Deși, cauza acestor substituții de baze nu a fost clară la acel moment, analiza plasmidului clonă pHTF1 a confirmat că proteina TPO umană a cuprins 353 resturi aminoacide având o secvență semnal aminoacidă de 21 aminoacizi. Greutatea moleculară a proteinei mature excluzând secvența semnal s-a estimat a fi 35466.

Vectorul pHTF1 conținut în tulpina DH5 E.coli s-a depozitat pe 24 martie 1994 sub numărul de acces FERM BP-4617 la Național Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional Trade and Industry, Japonia.

Exemplul 23. Expresia clonei cDNA TPO umane pHTF1 în celule COS 1 și confirmarea activității TPO

Transfecția la celule COS 1 a plasmidului clonă pHTF1 s-a făcut conform procedurii de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 μς plasmid DNA prin metoda DEAEdextran care include tratamentul clorochină. Celulele COS 1 transfectate s-au cultivat 3 zile la 37°C și s-a colectat supernatantul culturii.

Supematantul culturii s-a dializat extensiv contra mediu de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul test CFU-MK. S-a detectat activitate TPO în mod dependent de doză în supernatantul celulelor COS 1 în care s-a exprimat plasmidul pHTF1 (fig.10a). Spre deosebire, nu s-a găsit activitate TPO în supematantul culturii celulelor COS 1 în care s-a exprimat numai plasmidul pEF185 (fig.10a). Rezultate similare s-au obținut în sistemul de testare M-07e. Supernatantul celulelor COS 1 în care s-a exprimat plasmidul pHTF1 a mărit semnificativ proliferarea celulei M-07e într-un mod dependent de doză (fig. 10b). Aceste rezultate au demonstrat că pHTF1 conține o genă care codifică o proteină care are activitate TPO.

Exemplul 24. Clonarea DNA-ului cromozomal TPO uman

Clonarea DNA-ului cromozomal TPO uman s-a obținut folosind ca sondă cDNA TPO uman. Biblioteca genomică folosită în donare a fost un dar de la Prof. Yamamoto de la Gene Research Center, Tohoku University (biblioteca a fost raportată de către Sakai și colab.. în J.Biol.Chem., 269,2173-2182,1994, construită prin digestie parțială a DNA-ului cromozomal uman cu o enzimă de restricție Sau3AI și ligarea digestului parțial la situl BamHI al unui vector fag Lambda EMBL 3 produs de către Stratagene). Screening-ul de la această bibliotecă folosind ca sondă cDNA TPO uman s-a realizat, în principiu, conform procedurii descrise în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Hasrbor Laboratory Press, 1989), folosind E.coli LR392 ca gazdă, biblioteca s-a inoculat pe o placă de 15 cm

3065

3070

3075

3080

3085

3090

3095

3100

3105

RO 118299 Β1 care conține NZYM (amină NZ, 5 g NaCI, 5 g extract de drojdie Bacto, 2g MgSO₄: 7H₂O și 15 g agar într-un litru de apă, pH=7,0) într-o astfel de mărime a inoculului că o placă a con3110 ținut 30000 particule fagice. S-au preparat 2 filtre replici de la fiecare din cele 18 plăci astfel preparate, folosind o membrană de transfer BIODYNE™ (produse de PALL). Denaturarea filtrelor s-a realizat prin îmbinarea lor în 0,5 N NaOH/1,5M NaC110 min și apoi în 0,5 Μ TrisHCI (pH= 8,0)/1,5 M NaC110 min urmat de 30 min uscare la aer și în continuare 1,5 h coacere la 80°C într-un cuptor cu vid. Prehibridizarea s-a obținut prin incubarea filtrelor astfel 3115 tratate la 42°C, 1 h în 500 ml dintr-o soluție de reacție constând din 50% formamidă, x SSC, 5 x soluție Denhardt, 1% SDS și 20 /zg/ml DNA din spermă de somon. Pentru utilizare ca sondă s-a amplificat prin PCR și s-a purificat un fragment cDNA TPO uman (bazele de la pozițiile numerele 178 -1025 din SECV. ID Nr.7), și fragmentul implicat s-a marcat cu ³²P folosind o trusă de marcare Random Primer DNA (un kit de marcare DNA produs de 3120 Takara Shuzo Co., pe baza metodei primerului întâmplător descrisă în Anal. Biochem., 132,

6-13,1983). Secvențele primerilor folosiți în acest PCR sunt după cum urmează: hTPO-l: 5' - TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG - 3' (SECV.ID Nr.50) (pozițiile 178-198 din SECV. ID Nr.7) hTPO-N: 5’ - AGG GAA GAG CGT ATA CTG TCC - 3' (SECV. ID Nr.51) 3125 (primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 1005 -1025 din SECV. ID Nr.7).

Folosind sonda marcată cu izotop, s-a realizat hibridizarea la 42°C timp de 20 h în 500 ml soluție de reacție care are aceiași compoziție cu cea a soluției de prehibridizare. Filtrele rezultate s-au spălat de 3 ori în 2 x SSC/0,1% SDS la temperatura camerei, 5 min și apoi o dată în soluție 0,1 x SSC/0,1% SDS la 68°C, 1 h. Apoi, filtrele s-au supus la autora3130 diografie 16 h la - 70°C folosind un ecran de intensificare și un film AR5 X - OMĂT™ (produs de Eastman Kodak). Ca rezultat, s-au obținut 13 semnale pozitive.

S-au colectat plăci corespunzătoare aproximativ la fiecare dintre semnalele pozitive din plăcile originale și s-au inoculat din nou pe plăci NZYM de 15 cm la o astfel de mărime a inoculului, încât s-au format pe fiecare placă 1000 plăci. S-au preparat 2 filtre replică de 3135 la fiecare placă rezultată pentru hibridizare la aceleași condiții cum s-a deschis mai sus. Ca rezultat s-au detectat semnale pozitive pe toate filtrele celor 13 grupări. S-au recuperat o singură placă de la fiecare placă rezultată pentru a prepara un fag DNA prin metoda plăcii lizate descrisă în Molecular Cloning. Probele fag DNA astfel preparate de la cele 13 clone s-au verificat pentru prezența regiunii care codifică cDNA prin PCR folosind primerii care au ur3140 mătoarele secvențe.

hTPO-L: 5' - GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC - 3' (SECV. ID Nr.: 52) (pozițiile 1 - 21 din SECV.ID Nr.6) hTPO-F; 5' - ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT - 3' (SECV. ID Nr.53) (primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 127-147 din SECV.ID Nr.6) 3145 hTPO-P: 5' - TGHC GTT TCC TGA TGC TTG TAG - 3' (SECV.ID Nr.54) (pozițiile 503-523 din SECV.ID Nr:6) h-TPO-V: 5' - AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA - 3' (SECV. ID Nr.55) (primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 1070 -1090 în SECV. ID Nr.6).

Când s-au realizat PCR folosind aceste combinații primer, 4 din cele 13 clone au pă3150 rut să conțină întreaga regiune de codificare aminoacidă presupusă de la cDNA. Molecule DNA cromozomal conținute în aceste 5 clone au avut o lungime similară de circa 20 kb și au prezentat aproape aceiași imagine când s-a realizat o analiză preliminară cu enzimă de restricție. Prin urmare, una dintre aceste clone (clona λ HGT1) s-a selectat și s-a analizat prin Southern Blottins. Astfel, 1 p.g din DNA-ul clonei λ RGT 1 s-a digerat complet cu o en3155 zimă de restricție EcoRI sau Hindlll, s-a aplicat la electroforeză în gel de agaroză 0,8% și benzile de pe gel s-au transferat pe o membrană de transfer BIODYNE™ (produsă de

R0118299 Β1

3160

PALL). Filtrul rezultat s-a uscat la aer, timp de 30 min și s-a supus la coacere 2 h la 80°C într-un cuptor vidat. Prehibridizarea s-a realizat prin incubarea filtrului astfel tratat la 42°C, o oră în 50 ml dintr-o soluție de reacție care constă din 50% formamidă, 5 x SSC, 5 x soluție Denhardt, 1% SDS și 20 Mg/ml DNA din spermă de somon. Pentru a fi folosit ca sondă, s-a amplificat prin PCR și s-a purificat un fragment cDNA TPO uman (bazele de la pozițiia numerelor 178 -1025 din SECV. ID Nr.7), și fragmentul purificat s-a marcat cu “P folosind un kit de marcare Random Primer DNA (produs de Takara Shuzo). Folosind sonda marcată izotop s-a obținut hibridizarea în timp de 20 h la 42°C a 50 ml dintr-o soluție de reacție având aceeași compoziție ca și soluția de prehibridizare. Filtrul rezultat s-a spălat de 3 ori în 2 x SSC/0,1% SDS la temperatura camerei 5 min și apoi o dată în soluție 0,1 x SSC/0,1% SDS la 68°C, 1 h. Apoi, filtrul s-a supus la 16 h de autoradiografie la - 70°C folosind un ecran de intensificare și un film AR5 X-OMAT™ (produsă de Eastman Kodak). Ca rezultat, s-a observat o singură bandă de circa 10 kb în cazul digestiei Hindlll. Prin urmare, 10 mS DNA al clonei ĂHGT1 s-a digerat cu Hindlll și s-a supus electroforezei în gel de agaroză 0,8%, banda 10 kb s-a excizat din gel, s-a purificat folosind un kit de purificare DNA Prep-AGene (produs de Bio-Rad) și s-a subclonat într-un vector de donare pUC13 (fabricat de Pharmacia) care anterior fusese digerat cu Hindlll. în acest caz, ca tulpină gazdă s-a folosit E.coli DH5 înalt competentă produsă de TOYOBO.

Dintre clonele astfel obținute s-a selectat o clonă care conține fragmentul Hindlll 10 kb și s-a desemnat pHGT1

O hartă de restricție a fagului clonă λ HGT1 este prezentată în fig.11.

Exemplul 25., Determinarea secvenței nucleotidice a clonei cromozomale pHGT1 TPO umană

Cultura clonei pHGT1 și purificarea plasmidului DNA s-au realizat în esență conform metodei descrise în Molecular Cloning (Sambrook șicolab.., Cold Spring Harbor Laboratpryy Press, 1989). Clona pHGT1 s-a cultivat peste noapte în 50 ml mediu LB care conține 50 Mg/ml ampicilină. Celulele rezultate s-au colectat prin centrifugare și s-au suspendat în 4 ml de soluție TEG-lizozim. La aceasta s-au adăugat 8 ml 0,2 N NaOH/1% SDS și apoi 6 ml soluție 3M potasiu/5M acetat pentru suspendarea completă a celulelor. După centrifugarea suspensiei, supernatantul rezultant s-a tratat cu fenol/cloroform (1:1), s-a amestecat cu același volum de izopropanol și apoi s-a centrifugat. Peleta rezultată s-a dizolvat în soluție TE și s-a tratat cu RNază și apoi cu fenol/cloroform (1:1) urmat de precipitare cu etanol. Peleta rezultată s-a dizolvat din nou în soluție TE la care s-a adăugat în continuare NaCI și polietilenglicol 3000 până la concentrația lor finală de 0,62M și respectiv, 7,5%. După centrifugare, peleta s-a dizolvat în soluție TE și s-a precipitat cu etanol. Pe această cale, s-a obținut circa 300 Mg de plasmid DNA pHGT1.

Folosind kit-ul de secvențare menționat anterior Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (fabricat de Applied Biosystems) pentru determinarea secvenței sale nucleotidice din jurul regiunii care codifică proteina prezisă din secvența nucleotidică cDNA. Secvența nucleotidică astfel determinată și secvența aminoacidă dedusă sunt prezentate în Lista secvențelor în SECV. ID Nr.8. în acest caz, s-au folosit ca primeri în determinarea secvenței nucleotidice folosite în exemplul 22 pentru analiza secvenței nucleotidice a cDNA și oligonucleotide sintetice bazate pe secvența internă obținute prin analiza reacției secvenței lor.

Ca rezultat, DNA-ul cromozomal conținut de plasmidul clonă pHGT1 s-a găsit a conține o regiune de codificare întreagă a secvenței aminoacide dedusă din SECV.ID Nr.6 și secvența nucleotidică a regiunii de codificare a coincis complet cu cea a SECV.ID Nr.6. Suplimentar, o regiune corespunzătoare exonului care codifică un aminoacid a conținut 4 introni având lungimile de 231 bp, 286 bp, 1932 bp și 236 bp considerați de la partea 5' (fig.11). De asemenea, secvența nucleotidică a fost diferită de secvența nucleotidică cDNA

3165

3170

3175

3180

3185

3190

3195

3200

3205

RO 118299 Β1 a SECV.ID Nr.7 la 3 poziții care au fost aceleași cu pozițiile descrise în exemplul 22 (poziții diferite între SECV.ID Nr.6 și 7). Astfel, A (poziția 84), A (poziția 740) și G (poziția 1198) din SECV.ID Nr.7 au fost respectiv C, T și A în SECV.ID Nr.8. Astfel, s-a constatat că secvența nucleotidică a cDNA TPO umane clonă pHTF1 obținută în exemplul 21 este diferită de secvența nucleotidică a DNA-ului cromozomal uman clonă pHGT 1 la 3 poziții. Prin urmare, în scopul analizării dacă aceste mutații din secvența cDNA clonă pHTF1 se reflectă în secvența DNA cromozomal, s-au determinat secvențele nucleotidice ale altor 4 clone dintre cele 5 clone DNA cromozomal selectată independent prin screening. Analiza secvenței s-a obținut prin metoda determinării directe a secvenței nucleotidice folosind o probă de fag DNA preparată conform metodei lizatului de placă descrisă în Molecular Cloning. Secvențarea fiecărei clone s-a obținut aplicând secvențerul DNA 373 A (fabricat de Applied Biosystems) folosind secvențarea primerilor de la exemplul 22 care s-au sintetizat pe porțiuni de secvență astfel ca pozițiile celor 3 mutații menționate anterior din secvența nucleotidică au putut fi analizate și folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (produs de Applied Biosystems). S-a găsit că secvențele nucleotidice ale tuturor celor 4 clone au fost identice la cea a SECV. ID Nr.6. Pozițiile 84 și 740 corespunzătoare SECV. ID Nr.7 s-au substituit prin C și respectiv T în aceste 4 clone. Dar, poziția 1198 a fost G în 2 clone și A în alte 2 clone. Cu alte cuvinte, s-a dovedit că există două tipuri de secvențe nucleotidice proprii DNA-ului cromozomal original. în momentul de față, nu este clar dacă asemenea diferențe din secvența nucleotidică sunt derivate de la cromozom omolog sau gene multiple. în plus, s-a sugerat că diferențele din secvența nucleotidică pot fi datorate unei diferențe rasiale, deoarece ARN-ul poli (A)* procurat de CLONTECH este de origine caucaziană în timp ce DNA-ul cromozomal este de origine japoneză.

Vectorul pHGT1 conținut în tulpina DH5 E.coli s-a depozitat pe 24 martie 1994 sub numărul de acces FERM BP - 4616 la Național Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional Trade and Industry, Japonia.

Exemplul 26. Expresia DNA-ului cromozal TPO uman în celule COS 1 și confirmarea activității TPO

Plasmidul clonă pHGT 1 obținut prin subclonarea conținutului în total 4 secvențe de recunoaștere EcoRI, 3 în jumătatea inserată și 1 în vector. Analiza secvenței nucleotidice a arătat că întreaga regiune care codifică proteina TPO umană a fost inclusă într-un fragment DNA de circa 4,3 kbp care a fost interpus între secvența de recunoaștere EcoRI foarte aproape de partea 5' din insert și secvența de recunoaștere EcoRI din vector. Ca urmare, acest fragment s-a ligat cu un vector de expresie pEF18S tratat EcoRI, și s-au obținut 4 plasmizi de expresie TPO umană pEFHGTE nr.1 - 4 (vezi fig.11). Prin prepararea acestui plasmid DNA s-a efectuat un experiment de expresie. S-a purificat plasmidul DNA pe baza procedurii descrise în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Herbor Laboratory Press, 1989) prin aceasta obținând circa 250 μ9 de plasmid DNA.

Transfecția la celule COS 1 a clonelor pEFHGTE nr.1 - 4 s-a efectuat conform procedurii de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 ^g de plasmid DNA prin metoda DEAE - dextran care include tratamentul clorochină. Celulele COS 1 transfectate s-au incubat 3 zile la 37°C și apoi s-a colectat supernatantele culturii.

Supernatantele culturii s-au dializat extensiv contra mediu de cultură IMDM și s-au evaluat prin sistemul de testare CFU-MK. Activitatea TPO s-a detectat într-un mod dependent de doză în supernatantul celulelor COS 1 în care s-au exprimat fiecare din cele 4 clone (pEFHGTE nr-1-4). Spre deosebire, nu s-a găsit activitate TPO în supernatantul celulelor

COS 1 în care s-a exprimat doar plasmidul pEF18S. Datele reprezentative cu pEFHGTE nr.1

R0118299 Β1 sunt prezentate în fig. 12a. Rezultate similare s-au obținut în sistemul de testare M-07e. Supernatantul celulelor COS 1, în care fiecare din cele 4 clone (pEFHGTE nr.1-4) s-a exprimat, a crescut semnificativ creșterea celulei M-07e în mod dependent de doză. Date reprezentative cu pBFHGTE nr.1 sunt prezentate în fig.12b.

Aceste rezultate au demonstrat că, clonele plasmid pEFHGTE nr.1-4, poartă DNA-ul cromozomal funcțional al TPO uman.

Exemplul 27. Prepararea DNA-ului TPO uman de tip detetat, expresia sa în celule COS 1 și confirmarea activității TPO

Rezultatele de la exemplul 18 au arătat că TPO uman poate să-și exercite activitatea sa biologică chiar după îndepărtarea celui de-al 3-lea carboxil al său. Astfel, în scopul evaluării suplimentare a porțiunilor biologic active s-au realizat experimente cu derivați de deleție. în acest exemplu, derivați TPO deletați au fost lipsiți de aminoacizii 20, 40, 60 sau 68 de la capătul carboxi terminal, al proteinei TPO (aminoacizii 1 - 231) codificați de către pHT 1 - 231 examinându-se pentru capacitatea lor de a exercita activitate biologică TPO in vitro. Cel mai scurt derivat (aminoacizii 1 - 163) au inclus încă secvențele aminoacide care corespund la TP2/3 ale TPO plasmantic de șobolan descrisă în exemplul 2. S-au preparat plasmizi de deleție prin PCR folosind DNA-ul plasmidului clonă pHT1 - 231 obținut în exemplul 18 ca matriță și s-au sintetizat olsigonucleotide ca primeri. Secvențele primerilor folosiți pentru PCR au fost cele care urmează:

hTPO-5‘ - TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC - 3' (SECV. ID Nr.56) (s-a preparat prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere EcoRI la secvența pozițiilor 1 - 21 din SECV ID Nr.4; aceasta este identică secvenței descrise în fig.9);

hTPO-S:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG GGT - 3' (SECV.ID Nr.57) (un primer antisens corespunzător la secvența pozițiilor 555 - 576 din SECV. ID Nr.4, preparat prin adăugarea a doi codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pentru resturile aminoacide de la pozițiile 1 -163);

hTPO-4:5'-TTT GCG GCCGCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGA GAG GTT CTG-3' (SECV.ID Nr.58) (un primer antisens corespunzător la secvența pozițiilor 576-600 din SECV.ID Nr.4, preparat prin adăugarea a doi codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare la prepararea unui derivat de deleție care codifică resturile aminoacide de la pozițiile 1 -171);

hTPO-30;5'-TTT GCG GCC GCT GAT TAT CTG GCT GAG GCA GTG AAG TTT GTC - 3' (SECV. ID Nr.59) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 636 - 660 din SECV. ID Nr.4, preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru folosință în prepararea unui derivat de deleție care codifică pentru resturile aminoacide de la pozițiile 1 -191); și hTPO-2:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTG GCT CTG AAT 3'(SECV. ID Nr.60) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 696 - 720 din SECV. ID Nr.4, preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1 - 211).

Folosind 1 de plasmid DNA al clonei pHT1 - 231 obținut în exemplul 18 ca matriță, 10 μΜ fiecare din hTPO-5 (pentru partea 5') și hTPO-2, -3, -4 și -S (pentru partea 3') ca primeri și kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo), s-au realizat PCR cu un volum de 100 μΙ, folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELNER) și repetând un total de 20 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, I min, normalizare la 65°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min urmat de incubarea finală la 72°C, timp de 7 min. O bandă de interes obținută astfel prin fiecare PCR s-a

3255

3260

3265

3270

3275

3280

3285

3290

3295

3300

RO 118299 Β1 digerat cu enzimele de restricție EcoRI și Notl și digeratul rezultat s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1% (produs de FMC BioProducts) pentru a izola un fragment DNA principal având mărimea așteptată amplificat prin fiecare PCR. Fragmentul DNA astfel izolat s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și apoi s-au subclonat în vectorul de expresie pEF18S care a fost tratat anterior cu aceleași enzime de restricție. în acest caz, s-a folosit ca tulpină gazdă E.coli DHS înalt competentă produsă de TOYOBO. De la transformanții rezultați care au provenit de la fiecare PCR, s-au selectat 4 - 5 clone care conțin insertul de mărimea așteptată pentru a prepara probe de plasmid DNA urmând procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab.., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). într-o serie de astfel de operațiuni, probe de plasmid DNA s-au obținut de la un derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide de la 1-163 (pHT1-163 nr.1 - 5), un derivat de deleție care codifică pentru resturile aminoacide de la 1 -171 (pHT1 -171 nr.1 - 4), un derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide de la 1 -191 (pHT1 -191 nr.1 - 4) și 1 derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide de la 1 - 211 (pHT 1 -211 nr.1 -4). Lungimea integrală a regiunilor amplificate a fiecărui plasmid DNA s-a supus analizei secvenței nucleotidice pentru a găsi identitatea sa completă cu secvența nucleotidică prezentată în SECV.ID Nr.4.

Transfecția la celule COS 1 a clonelor astfel obținute s-a făcut urmând procedura de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 ^g din fiecare probă de plasmid DNA prin metoda DEAE - dextran care include tratament clorochină. Celulele COS 1 transfectate s-au cultivat 3 zile și apoi s-a recuperat supernatantele culturii.

Supernatantele culturii s-au dializat extensiv contra mediului de cultură IMDM și s-au evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan. Activitate TPO s-a detectat în mod dependent de doză în supernatantul celulelor COS 1 în care s-a exprimat fiecare dintre pHT1-211, pHT1-181, pHT1-171, sau pHT1-163. Datele reprezentative cu pHT1-211 nr.1, pHT1-191 nr.1, și pHT1-171 nr.2 sunt prezentate în fig.13a și cu pHT1-163 nr.2 în fig.13b. Rezultate similare s-au obținut în sistemul de testare M-07e. Supernatantul celulelor COS 1 în care s-au exprimat pHT 1-211, pHT 1-191, pHT 1-171 sau pHT 1 -163, au sporit semnificativ proliferarea celulei M-07e. Datele reprezentative cu pHT1-211 nr.1, pHT1-191 nr.1, pHT1-171 nr.2 sau pHT1-163 nr.2 s-au prezentat în fig.14.

Aceste rezultate au dovedit că TPO uman își păstrează încă activitatea sa biologică in vitro chiar după deleția jumătății carboxil terminală de după Ser (poziția 163), și sugerează că porțiunile biologic active ale TPO umane sunt localizate în jumătatea amino terminală care se sfârșește la Ser (poziția 163).

Exemplul 28. Prepararea TPO umane de tip C-terminal deletat, expresia sa și activitatea în celule COS 1 în scopul analizării regiunii necesare pentru ca proteina TPO umană să-și exercite activitatea, în continuare, s-au deletat aminoacizii C-terminali din derivații de deleție obținuți în exemplul 27 și s-a examinat activitatea TPO exprimată în celule COS 1. Folosind plasmidul clonă pEF18S-HL34 obținut în exemplul 16, s-au preparat plasmizi de expresie prin deleția secvențelor nucleotidice care codifică resturile aminoacide C-terminale începând de la poziția serinei 163. Construcția acestor plasmizi de deleție s-a efectuat prin PCR. Secvențele primerilor folosiți în PCR sunt cele care urmează:

hTPO-5:5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCB GGC-3'(SECV.ID Nr.61) (preparată prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere EcoRI la secvența pozițiilor 1 -21 din SECV.ID Nr.4; aceeași secvență prezentată în exemplul 18);

hTPO-150:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTG GAC CCT CCT ACA AGC AT-3' (SECV.ID Nr.62) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 514-537 din SECV.ID

Nr.4; preparată prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere pentru folosire în prepararea unui mutant de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide de la 1 -150);

RO 118299 Β1 hTPO-151:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGG GTG GAC CCT CCT ACA A-3' (SECV.ID Nr.63) (un primer antisens corespunzător la secvența pozițiilor 518-540 din SECV.ID Nr.4) s-a preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru folosire în prepararea unui derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1-151);

hTPO-153:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACG CAG AGG GTG GAC CC - 3' (SECV.ID Nr.64) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 526-546 din SECV.ID Nr-4 s-a preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru folosire în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-153);

hTPO-154:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTG ACG CAG AGG GTG GA - 3' (SECV.ID Nr.65) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 529-549 din SECV.ID Nr.4; s-a preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizarea în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-154);

hTPO-155:5‘-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGC CTG ACG CAG AGG GT -3' (SECV.ID Nr.66) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 532-562 din SECV.ID Nr.4; preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-155);

hTPO-156:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT GGG GCC CGC CTG ACG CAG AG - 3* (SECV.ID Nr.67) (un primer antisens corespunzător la secvența pozițiilor 535-555 din SECV.ID Nr.4, preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-156); și hTPO-157:5' - TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGG GCC CGC CTG ACG CA - 3' (SECV. ID Nr.68) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 538 - 558 din SECV. ID Nr.4, preparat prin adăugarea a 2 codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-157).

S-au realizat PCR folosind 1 μρ de plasmid DNA al clonei pEF18S - HL34 obținută în exemplul 16 ca matriță și 10 μΜ de la fiecare dintre nucleotidele sinterizate (hTPO-5 pentru partea 5' și hTPO-150, -151, -153, -154, -155, -156 și -157 pentru partea 3') ca primeri. Folosind kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo), s-a realizat reacția PCR în 100 μΙ volum apelând la sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și repetând un total de 20 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 66°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de incubare finală la 72°C, 7 min. O bandă de interes astfel obținută prin fiecare PCR s-a digerat cu enzimele de restricție EcoRI și Notl și digestul rezultat s-a supus electroforezei în gel de agaroză 1% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA principal care are o mărime așteptată prin fiecare PCR. Fragmentul DNA astfel izolat s-a purificat folosind un kit de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și apoi s-a subclonat în vectorul de expresie pEF18S care a fost tratat înainte cu aceleași enzime de restricție. în acest caz, s-a folosit ca tulpină gazdă E.coli DH5 înalt competentă produsă de TOYOBO. De la transformanții rezultați care au provenit de la fiecare experiment PCR s-au selectat 3 - 5 clone care conțin inserturi de mărime așteptată pentru prepararea probelor de plasmid DNA în principiu conform producerii descrise în Molecular Cloning (Sambrook ș/ colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Printr-o serie de astfel de operațiuni s-au obținut probe de plasmid DNA de la un derivat de deleție care codifică resturile aminoacide

3355

3360

3365

3370

3375

3380

3385

3390

3395

3400

RO 118299 Β1

-150 (ΡΗΤ1 -150 nr.21,22 și 25), un derivat de deleție care codifica pozițiile resturilor aminoacide 1-151 (pH-t1 -151 nr.16, 17 și 18), un derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1-153 nr.1-5), un derivat de deleție care codifică resturile aminoacide din pozițiile 1:154 (pHT1-154 nr.1-5) un derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1-156 (pHT1-155 nr.1 la 5), un derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1-165 (pHT1-156 nr.1 la 5) și un derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1-157 (pHT1-157 nr.1 la 5).

Dintre aceste probe de plasmid DNA purificate, secvențele pHT1-150 nr.21,22, și 25 și pHT1-151 nr.16,17 și 18 s-au verificat prin secvențele DNA 373 A fabricat de Applied Biosystems folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (Applied Biosystems) prin aceasta confirmând secvențele cDNA TPO fără nici o substituție pe întregile secvențe nucleotidice.

Transfecția celulelor COS 1 cu fiecare dintre clonele astfel obținute s-a făcut urmând procedura de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 pg din fiecare probă de plasmid DNA prin metoda DEAE - dextran care include tratamentul clorochină, și s-a recuperat supernatantul culturii după 3 zile de cultură. Supernatantele de cultură astfel obținute s-au dializat împotriva mediului de cultură IMDM descris mai înainte și s-au evaluat prin sistemul de testare M-07E. S-au detectat activități TPO în supernatantul celulelor COS 1 transfectate cu clonele respective care codifică derivații de deleție C-terminală constând din aminoacizii din pozițiile 1.151, aminoacizii din pozițiile 1-153, aminoacizii din pozițiile 1-154, aminoacizii din pozițiile 1-155, aminoacizii din pozițiile 1-156 sau aminoacizii din pozițiile 1-157. Toți acești derivați conțin un rest de cisteină la poziția 151. Totuși ,nu s-au detectat activități TPO în supernatantul culturii, celulelor COS 1 care s-au transferat cu clona codificatoare pentru un derivat de deleție în partea C-terminală constând din aminoacizii din poziția 1-150, din care a fost de asemenea deletat, restul cisteinic de la poziția 151.

Exemplul 29. Prepararea TPO de deletat N-terminal, expresia sa și activitaxte în celule COS 1 în scopul analizării regiunii necesare pentru ca proteina TPO să-și exercite activitatea sa biologică, derivații de deleție obținuți în exemplul 28 în care s-au îndepărtat aminoacizii de la partea N-terminală, s-au deletat în continuare și s-a examinat expresia activității TPO a derivaților de deleție astfel obținuți. Folosind plasmidul clonă pEF185-HL34 obținut în exemplul 16 și plasmidul clonă pHT1-163 obținut în exemplul 27, s-au preparat plasmizi de expresie prin deletarea secvențelor nucleotidice care codifică resturile aminoacide N-terminale după secvența semnal. Construcția acestor plasmizi de deleție s-au efectuat folosind PCR. Secvențele primerilor preparați pentru utilizare în PCR au fost după cum urmează: hTPO-5:5'-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3'(SECV.ID Nr.69) (s-a preparat prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere EcoRI la secvența pozițiilor 1 la 21 din SECV.ID Nr.4 aceeași secvență prezentată în exemplul 18);

hTPO3:5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTC AGG TAT CC-3' (SECV.ID Nr.70) (un primer antisens corespunzător secvenței din poziția 757 la 780 din SECV.ID Nr.4; s-a preparat prin adăugarea a doi codoni de terminare TAA și TGA și a unei secvențe de recunoaștere Notl; aceiași secvență s-a sintetizat pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pozițiile resturilor aminoacide 1 la 231);

hTPO-S 5'-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTG GTG-3'(SECV.ID Nr.71) (un primer antisens chorepunzător secvenței pozițiilor 555 la 576 din SECV.ID Nr.4; s-a preparat pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică resturile aminoacide din pozițiile 1 la 163;

hTPO-13:5'-AGTAAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CIT CAC AGC AGA CTG AGC

CAG TG-3' (SECV.ID Nr.71) (un primer antisens corespunzător pozițiilor 555 la 576 din

SECV.ID Nr.4; s-a preparat pentru utilizare în prepararea unui derivat de deleție care codifică pentru pozițiile resturilor aminoacide 1 la 163);

R0118299 Β1

3455 hTPO-13:5'-AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TG-3‘ (SECV.ID Nr.72) (pozițiile 124 la 173 din SECV.ID Nr.4; s-a preparat pentru utilizare în prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 la 12 sunt deletate); hTPO-13R:5'-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TAC TGG ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3' (SECV.ID Nr.73) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 64 la 87 și 124 la 148 din SECV.ID Nr.4, preparat pentru folosire în prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 la 12 sunt deletate);

hTPO-7:5'-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGTZ GAC TCC CAT GTC CTT C-3‘ (SECV.ID Nr.74) (pozițiile 106 la 154 din SECV.ID Nr.4, preparat pentru folosire în prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 1a 6 sunt deletate); hTPO-7R:5'-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACA GGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SECV.ID Nr.75) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 64 la 87 și 106 la 129 din SECV.ID Nr.4, preparat pentru folosire la prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 la 6 sunt deletate);

hTPO-8;5'-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC A-3' (SECV.ID Nr.76) (pozițiile 109 la 157 din SECV.ID Nr.4, preparat pentru folosire în prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 la 7 sunt deletate); Și hTPO-8R:5'-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC GGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3' (SECV.ID Nr.77) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 64 la 87 și 109 la 132 din SECV.ID Nr.4, preparată pentru folosire în prepararea unui derivat în care resturile aminoacide de la pozițiile 1 la 7 sunt deletate).

(1) Prepararea unui derivat (pHT13-231) în care resturile aminoacide ale pozițiilor 1-12 sunt deletate

S-au realizat PCR folosind 1,4 pg de plasmid DNA de la clona pEF18S-HL34 obținută în exemplul 18 ca matriță și 5 μΜ fiecare din oligonucleotidele astfel sintetizate (hTPO-13 și hTPO3 într-o combinație și hTPO-5 și hTPO-13 în altă combinație) ca primeri. Folosind kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo), s-a realizat reacția PCR în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și, după 5 min denaturare la 95°C, repetând un total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 65°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de incubarea finală la 72°C, 7 min. Fiecare dintre produsele PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produs de FMC BioProducts) pentru a izola un fragment DNA principal care are o mărime așteptată și s-a purificat ulterior folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ de tampon TE. După aceea, s-a realizat al 2-lea PCR folosind 1 μΙ din fiecare soluție astfel preparată ca matriță.

Cel de-al 2-lea PCR s-a realizat folosind 5 μΜ din fiecare primer sinterizat (hTPO-5 și hTPO3). Folosind kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo), reacția PCR s-a realizat în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR Gene Amp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și după 5 min denaturare la 95°C, repetarea unui total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 60°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min urmat de incubare finală la 72°C, 7 min. Fiecare dintre produse PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produs de FMC - BioProducts) pentru a izola un fragment DNA principal având o mărime așteptată care s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ de tampon TE. După digestie cu enzimele de restricție EcoRI și Notl, soluția rezultată s-a supus extracției cu același volum de fenol/cloroform și în continuarea precipitării cu etanol. După centrifugare, precipitatul rezultat s-a dizolvat în 15 μΙ tampon TE și apoi s-a

3460

3465

3470

3475

3480

3485

3490

3495

3500

RO 118299 Β1 subclonat în vectorul de expresie pEF18S care a fost tratat înainte cu aceleași enzime de restricție. în acest caz, s-a folosit ca tulpină gazdă E.coli DH5 înalt competentă produsă de către TOYOBO. Din transformanții rezultanți, 45 clone care conțin insertul de mărime așteptată s-au ales pentru prepararea probelor de plasmid DNA pe baza procedurii descrise în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). în acest mod a fost posibil să se obțină plasmid DNA al unui derivat de deleție (pHT13-231) care codifică o moleculă de proteină cu resturile aminoacide rezultate din deleția pozițiilor 1-12 a resturilor aminoacide originale cu 1-231 aminoacizi. Când aceste 45 clone s-au supus la PCR folosind primerii hTPO-5 și hTPO3, s-au confirmat inserți având aproximativ mărimile așteptate în 8 clone. Dintre acestea, secvențele a 3 clone s-au verificat prin secvențare DNA 373 A produs de Applied Biosystems apelând la ciclul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (Applied Biosystems) prin aceasta obținând o clonă pHT13-231 nr.3 care are o secvență cDNA TPO ca cea desemnată și o deleție ca cea așteptată fără nici o substituție și altele asemenea pe întreaga secvență nucleotidică.

(2) Prepararea unui derivat (pHT7-163) în care resturile aminoacide ale pozițiilor 1 la 6 sunt deletate în acest caz, poziția aminoacidă 163 s-a folosit ca C-terminal pentru prepararea derivaților de deleție deoarece, chiar dacă poziția aminoacidă 231 s-a desemnat ca C-terminal al proteinei TPO pentru prepararea derivaților de deleție din etapa (1) de mai sus, s-a găsit că activitatea TPO ar putea fi exprimată chiar când aminoacizii C-terminali au fost în continuare deletați. Pe baza aceluieași motiv, poziția aminoacidă 163 s-a folosit ca C-terminal, de asemenea, în etapa următoare (3). S-au realizat PCR folosind 1,4 pg de plasmid DNA al clonei pHT1-163 obținută în exemplul 27 ca matriță și 5 μΜ din fiecare oligonucleotidă sintetizată (hTPO-7 și hTPO-S într-o combinație și hTPO-5 și hTPO-7R în altă combinație) ca primeri. Folosind trusa reactivă PCR Gene Amp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produse de Takara Shuzo), s-au realizat reacții PCR în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și, după 5 min denaturare la 95°C, repetarea unui total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 65°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de incubare finală la 72°C, 7 min. Fiecare dintre produsele PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produsă de către FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA principal având o mărime așteptată care s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ tampon TE. După aceea, s-a realizat a 2-a PCR folosind 1 μΙ porție din fiecare soluție astfel preparată ca matriță.

Cea de-a 2-a PCR s-a realizat folosind 5 μΜ din fiecare primer sintetizați (hTPO-5 și hTPO-S). Folosind ciclul reactiv PCR GeneAmp™ cu AmpliTaq™ DNA polimerază (produse de Takara Shuzo), reacția PCR s-a realizat în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER) și, după 5 min denaturare la 95°C, repetarea unui total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 60°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min urmată de incubarea finală la 72°C, 7 min. Fiecare dintre produsele PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment ADN principal având o mărime așteptată care s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ de tampon TE. După digestie cu enzimele de restricție EcoRI și Notl, soluția rezultată s-a supus extracției cu același volum de fenol/cloroform și în continuare precipitare cu etanol. După centrifugare, precipitatul rezultat s-a dizolvat în 15 μΙ de tampon TE și apoi s-au subclonat în vectorul de expresie pEF18S care a fost tratat înainte cu aceleași enzime de restricție. în acest caz, s-a folosit ca tulpină gazdă E.coli DH5 înalt competentă produsă de către TOYOBO, din transformanți rezultanți, 30 clone care conțin insertul

RO 118299 Β1

3555 de mărime așteptată, s-au selectat pentru prepararea probelor de plasmizi DNA urmând în principal procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). în acest mod,'a fost posibil să se obțină plasmidul DNA al unui derivat de deleție (pHT7-163) care codifică o moleculă de proteină în care resturile aminoacide ale pozițiilor 1 la 6 au fost deletate de la sevența aminoacidă originală cu 1 la 163 seturi dată în SECV.ID Nr.4. Când aceste clone s-au supus la PCR folosind primeri hTPO-5 și hTPO-S, s-au confirmat inserți având aproximativ mărimile așteptate în toate clonele. Dintre acestea, secvențele a 3 clone s-au verificat prin secvențerul DNA 373A produs de Applied Biosystems, folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy^Tm Terminater Cycle (Applied Biosystems), prin aceasta obținând 2 clone, pHT7-163 nr.4 și nr.29, fiecare având o secvență cDNA TPO cum s-a desemnat și o deleție ca cea așteptată fără nici o altă substituție și altele asemenea pe întreaga secvență nucleotidică.

(3) Prepararea unui derivat (pHT8-163) în care resturile aminoacide ale pozițiilor 1 la 7 sunt deletate

S-a preparat un derivat (pHT8-163) care are deleție a resturilor aminoacide ale pozițiilor 1 la 7 în deletați principiu în aceiași manieră ca în cazul de mai sus pentru prepararea unui derivat (pHT7-163) care are resturi aminoacide ale pozițiilor 1 la 6 deletate. S-a realizat PCR folosind 1,4 μ$ de plasmid DNA al clonei pHT1-163 obținut în exmplul 27 ca matriță și 5 μΜ din fiecare oligonucleotidă sintetizată(hTPO-8 și hTPO-S într-o combinație și hTPO-5 și hTPO-8R în altă combinație) ca primeri. Folosind kit reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază AmpliTaq™ (produsă de Takara Shuzo), s-a realizat reacția PCR în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de PERKIN-ELMER și, după o denaturare de 5 min la 95°C, repetarea unui total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 65°C, 1 min și sinteză la 72°C, 1 min urmat de incubare finală la 72°C, 7 min. Fiecare produs PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment principal care are o mărime așteptată, care în continuare s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ tampon TE. După aceea, s-a realizat un al 2-lea PCR folosind porții de 1 μΙ din fiecare soluție astfel preparată ca matriță.

Cea de-a 2-a PCR s-a realizat folosind 5 μΜ din fiecare primer sintetizat (hTPO-5 și hTPO-S). Folosind kit-ul reactiv PCR GeneAmp™ cu DNA polimerază Ampli Taq™ (produse de Takara Shuzo), s-a realizat reacția PCR în 100 μΙ volum folosind sistemul PCR GeneAmp™ 9600 (produs de perkin-ELMER) și, după 5 min denaturare la 95°C, repetarea unui total de 30 cicluri fiecare ciclu constând din denaturare la 95°C, 1 min, normalizare la 60°C, 1 min, și sinteză la 72°C, 1 min, urmat de incubare finală la 72°C, 7 min. Fiecare dintre produsele PCR s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1,2% (produs de FMC BioProducts) pentru izolarea unui fragment DNA principal având o mărime așteptată care s-a purificat în continuare folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) și s-a dizolvat în 15 μΙ tampon TE. După digestie cu enzimele de restricție EcoRI și Notl, soluția rezultată s-a supus extracției cu același volum de fenol/cloroform și în continuare, la precipitare cu etanol. După centrifugare, precipitatul rezultat s-a dizolvat în 15 μΙ tampon TE și apoi s-a subclonat în vectorul de expresie pEF18S care fusese tratat cu aceleași enzime de restricție. în acest caz, s-a folosit ca tulpină gazdă E.coli DHS înalt competente, produse de TOYOBO. Din transformanții rezultanți, s-au ales 30 de clone care conțin inserturi de mărime așteptată pentru prepararea probelor de plasmid DNA, conform procedurii descrise în Molecular Clonind (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). în acest mod, s-a putut obține plasmid DNA al unui derivat de deleție (pHT8-163) care codifică o moleculă de proteină în care resturile aminoacide ale pozițiilor 1 la 7 au fost deletate de la resturile aminoacide originale ale pozițiilor 1 la 163 din SECV.ID Nr.4. Când aceste clone

3560

3565

3570

3575

3580

3585

3590

3595

3600

RO 118299 Β1 s-au supus la PCR folosind primeri hTPO-5 și hTPO-S, s-au inserți care au aproximativ mărimile așteptate în toate clonele. Dintre acestea, s-au verificat secvențele a 3 clone prin secvențe DNA 373 A produs de Applied BioSystems folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (Applied Biosystems) prin aceasta obținând 2 clone, pHT8-163 nr.33 și nr.48, fiecare având o secvență cDNA TPO ca cea desemnată și o deleție ca cea așteptată fără nici o substituție și altele asemenea, pe întreaga secvență nucleotidică.

(4) Expresia derivatului de deleție în celule COS 1 și confirmarea activității TPO

Transfecția celulelor COS 1 cu fiecare dintre clonele de deleție astfel obținute s-a obținut conform procedurii de la exemplul 11. Astfel, transfecția s-a realizat cu 10 pg din fiecare probă de plasmid DNA prin metode DEAE - dextran care include tratamentul clorochină și supernatantele de cultură s-au recuperat după 3 zile de cultură. Supernatantul de cultură astfel obținut s-a dializat complet contra mediu de cultură IMDM descris mai înainte și s-a evaluat prin sistemul test M-07e.

Ca rezultat, slab dar semnificativ, s-a detectat activitate TPO în supernatantul culturii celulelor COS 1 transfectate cu o clonă care codifică derivatul de deleție constând din pozițiile aminoacide 7-173. Totuși, nu s-a detectat activitate TPO în supernatantul culturii celulelor COS 1 transfectate cu o clonă care codifică pentru derivatul de deleție constând din aminoacizii pozițiilor 8 la 163 sau aminoacizii pozițiilor 13 la 231.

Exemplul 30. Prepararea plasmidului cDNA TPO uman de lungime completă (pHTP1)

S-a construit un vector de expresie care are toate regiunile care codifică aminoacizi ai cDNA TPO umane presupusă din SECV.ID Nr.5 pentru expresie în celule de mamifere.

S-a realizat PCR în același mod în scopul preparării unui fragment DNA care acoperă toate regiunile care codifică cDNA TPO uman.

Secvențele nucleotidice ale primerilor folosiți sunt precum urmează: hTPO-l:5'-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG - 3'(SECV.ID Nr.78) (pozițiile 105 la 125 în SECV.ID Nr.6);

SA:5-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC - 3' (SECV.ID Nr.79) (un primer antisens corespunzător secvenței pozițiilor 745-765 din SECV.ID Nr.6); hTPO-P:5'-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG - 3' (SECV.ID Nr.80) (pozițiile 503-523 din SECV.ID Nr.6); și hTPO-KO:5‘-GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TT-3' (SECV.ID Nr.81) (o secvență preparată prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere a enzimei de restricție Notl și a unei secvențe GAGAGA (SECV.ID Nr.82) la o secvență antisens corespunzătoare la secvența pozițiilor 1066-1086 din SECV.ID Nr.6).

Un prim PCR s-a realizat folosind 300 ng de clonă pEF18S-HL34 obținută în exemplul 16 ca matriță. Folosind 0,5 μΜ din fiecare primer hTPO-l și SA și 1 unitate de ADN polimerază Vent R™ (produsă de New England BioLabs) s-a realizat PCR (repetarea unui total de 30 cicluri, fiecare ciclu constând din incubări la 96°C, 1 min, la 62°C, 1 min și la 72°C, 1 min urmată de incubare finală la 72°C, T min. Compoziția soluției de reacție în concentrație finală este precum urmează: KC110 mM, (NH₄)₂SO₄10 mM, Tris-HCI 20 mM (pH=8,8), MgSO₄ 2 mM, Triton X-100 0,1% și amestec dNTP 200 μΜ.

S-a încălzit la 70°C, o porție de 1 pg preparat ARN poli(A)⁺ derivat din ficat uman normal (produs de Clontech), s-a răcit rapid pe gheață și apoi s-a amestecat cu 10 mM DTT,

500 pg amestec dNTP, 25 ng de primer întâmplător (produs de Takara Shuzo), 10 unități inhibitor RNază (produs de Boehringer - Mannheim) și 200 unități de RNază H SuperScript™

II (produsă de Life Technologies), urmată de incubare o oră la 37°C, pentru realizarea sintezei cDNA-ului, după aceea, s-a realizat al 2-lea PCR (repetarea unui total de 30 cicluri,

R0118299 Β1 fiecare ciclu constând din incubări la 96°C, 1 min, la 58°C, 1 min și la 72°C, 1 min) folosind 1/20 voi a soluției de reacție de cDNA sintetizat ca matriță și 2,5 μΜ fiecare dintre primerii hTPO-P și hTPO-KO și 2,5 unități de DNA polimerază AmpliTaq™ (produsă de Takara Shuzo).

Fiecare dintre soluțiile rezultate de la prima și a 2-a PCR s-au supus la electroforeză în gel de agaroză 1% pentru izolarea fragmentelor DNA principale respective de mărime așteptată care în continuare, s-au purificat folosind un kit de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad). După aceea, s-a realizat al 3-lea PCR folosind 1/20 voi din fiecare dintre soluțiile astfel preparate ca matriță. Această reacție (încălzire la 96°C, 2 min, urmată de repetarea unui total de 3 cicluri, fiecare ciclu constând din incubări la 96°C, 2 min, și la 72°C, 2 min și apoi incubare la 72°C, 7 min) s-a realizat folosind DNA polimerază Vent R™ (produsă de New England BioLabs). Soluția de reacție rezultată s-a amestecat cu 1 μΜ fiecare hTPO-Ι și hTPO-KO, s-a încălzit la 96°C, 2 min, s-a supus la 25 cicluri de reacție, fiecare ciclu constând din incubări la 96°C, 1 min, la 62°C, 1 min și la 72°C, 1 min și apoi s-au incubat 7 min la 72°C. Soluția de reacție rezultată s-a extras cu același volum de apă saturată fenol/doroform și apoi cu același volum de cloroform, extractul s-a supus precipitării cu etanol (2,5 voi de etanol în prezența de acetat de sodiu 0,3M și 0,5 μΙ glicogen produse de Boehringer-Mannheim) pentru recuperare DNA. DNA-ul astfel recuperat s-a digerat cu enzimele de restricție BamHI și Notl și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1% izolând astfel o bandă principală de mărime așteptată care s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad) s-a ligat cu vectorul pBluescrip II SK⁺ produs de Stragene care a fost digerat în avans cu enzimele de restricție BamHI și Notl și apoi s-au transformat.în E.coli DH5 înalt competentă (produse de TOYOBO). Din coloniile rezultate s-au selectat 4 clone pentru prepararea probelor de plasmizi DNA. Secvența probelor de plasmizi DNA purificată s-a verificat prin secvențerul DNA 373A produs de către Applied Biosystems folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminator Cycle (Applied Biosystems), prin aceasta obținând o clonă, pBLTP, care are o secvență cDNA TPO cum s-a desemnat fără nici o substituție în secvența nucleotidică din regiunea dintre BamHI și Notl.

Clona pBLTP s-a digerat cu enzimele de restricție EcoRI și BamHI, s-a supus electroforezei în gel de agaroză 1%, și o bandă de greutate moleculară ridicată astfel izolată s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene (produs de Bio-Rad). în același mod pEF18S-HL34 s-a tratat cu enzimele de restricție pentru purificarea unui fragment DNA de circa 450 bp. Probele DNA astfel obținute s-au supus ligării și s-au transformat în E.coli DH5 înalt competentă (produsă de TOYOBO). Probele DNA s-au preparat de la coloniile rezultate pentru obținerea unei clone, pBLTEN, care conține insertul cDNA TPO uman. Clona pBLTEN astfel obținută s-a digerat cu enzime de restricție EcoRI și Notl și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 1% și un fragment DNA de circa 1200 bp astfel izolat s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Geme (Produs de Bio-Rad), s-a ligat cu vectorul de expresie pEF18S care fusese digerat înainte cu aceleași enzime de restricție și apoi s-au transformat în E.coli DH5 înalt competentă fabricată de TOYOBO. S-au preparat probe de plasmid DNA de la coloniile rezultate pentru obținerea clonei de interes, pHTPl, care conține întreaga regiune de codificare cDNA TPO uman. S-a preparat plasmid DNA de la această clonă într-o cantitate mare și s-a folosit în următoarele experimente. Prepararea plasmidului DNA s-a făcut în concordanță cu procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Exemplul 31 .Construcția plasmidului de expresie mamifer, pDEF202-hTPO-P1, pentru expresia TPO uman în celule ovariene de hamster chinezesc (CHO)

S-a digerat 1 μg de plasmid pMG1 conținând o minigenă dihidrofolat reductază (DHFR) de șoarece cu enzime de restricție, EcoRI și BamHI, și apoi s-a supus la electroforeză în gel de agaroză pentru izolarea unui fragment (circa 2,5 kb) conținând

3650

3655

3660

3665

3670

3675

3680

3685

3690

3695

RO 118299 Β1 minigenă DHFR de șoarece. Fragmentul DNA izolat s-a dizolvat în 25 ml soluție de reacție compusă din Tris-HCI 50 mM (pH=7,5), MgCI₂ 7 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM și amestec dNTP 0,2 mM, s-a amestecat cu 2 unități fragment Klenow și apoi s-a incubat la temperatura camerei 30 min, pentru a forma capete teșite la ambele capete ale fragmentului DNA. După tratament fenol/cloroform și precipitare cu etanol, fragmentul rezultat s-a dizolvat în 10 ml soluție TE (Tris-HC110 mM (pH=8,0)/EDTA 1 mM). Vectorul de expresie mamifer pEF18S s-a digerat cu o enzimă de restricție Smal, s-a defosforilat cu fosfatază alcalină (produsă de Takara Shuzo) și apoi s-a ligat cu un fragment DNA conținând minigenă DHFR de șoarece folosind ligază DNA T4 (produsă de Takara Shuzo) pentru a obține un vector de expresie pDEF 202.

în continuare, vectorul de expresie construit pDEF202 s-a digerat cu enzime de restricție EcoRI și Spel, și apoi s-a supus la electroforeză în gel de agaroză pentru izolarea unui fragment DNA mai mare. cDNA TPO umană care a fost obținut prin digestia plasmidului pHTP1 conținând cDNA TPO uman (clona p1) cu enzimele de restricție EcoRI și Spel s-a ligat cu acest vector linearizat pDEF202 folosind ligază DNA T4 (produsă de Tkara Shuzo) pentru obținerea unui plasmid pDEF202-h-hTPO-P1 pentru expresia cDNA TPO umane. Acest plasmid construit conține originea de replicare SV40, factorul uman de alungire 1-a-promotor și semnal timpuriu de poliadenilare SV40 pentru transcrierea cDNA TPO umane, minigenă DHFR de șoarece, originea replicării pUC18 și gena β-lactamază (Amp^r).

Exemplul 32. Expresia TPO umane în celule CHO

Celule CHO ( o tulpină DHFR-; Urlaub și Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, vol.77, pp.42-16,1980) s-au menținut în mediu esențial minim - α(α-ΜΕΜ(-), suplimentat cu hipoxantină și timidină) conținând 10% ser fetal de vițel (FCS) folosind o placă de cultură de țesut cu diametru 6 cm (Falcon). Transformarea celulelor CHO cu plasmidul pDEF202hTPO-P1 s-a realizat prin metoda fosfat de calciu (CellPhect, produs de Pharmacia) așa cum s-a descris în continuare. S-au amestecat 10 ^g de plasmid pDEF202-hTPO-P1 preparate în exemplul 31, cu 120 ml tampon a și 120 ml H₂O, și amestecul rezultat s-a incubat la temperatura camerei 10 min. Această soluție s-a amestecat în continuare cu 129 ml tampon B și s-a lăsat să stea la temperatura camerei pentru încă 30 min. Această soluție amestec DNA s-a adăugat apoi culturii și s-a incubat 6 h într-un incubator CO₂. După 6 h, cultura s-a spălat de 2 ori cu a-MEM(-) lipsit de ser, s-a tratat cu a-MEM(-) conținând 10% dimetilsulfoxid 2 min și apoi s-a incubat 2 zile în mediu neselectiv (a-MEM(-) suplimentat cu hipoxantină și timidină) conținând 10% dializat FCS. După 2 zile de cultură celulele s-au selectat într-un mediu de selecție (a-MEM(-)) conținând 10% dializat SCS. Pentru selecția celulelor transformate cu fenotip DHFR pozitiv, celulele s-au tratat cu o soluție tripsină/EDTA, și s-au resuspendat cu un mediu de selecție. Celulele din placa de cultură de țesut de 6 cm, s-au împărțit în 5 plăci de cultură de țesut de 10 cm sau 12 plăci de cultură de țesut de 24 godeuri și apoi s-au cultivat în mediu de selecție. Mediul de cultură s-a schimbat la intervale de 2 zile. Activitatea TPO umană în mediu de cultură al celulelor CHO cu fenotip DHFR pozitiv s-a măsurat în test CFU-MK, test M07e sau test Ba/F3. Celulele care secretă TPO uman în mediu de cultură s-au selectat în continuare, în mediu de selecție suplimentat cu metotrexat 25nM în vederea izolării clonei celulare care produce o cantitate mai mare de TPO uman.

în această situație, transfecția celulelor CHO poate fi efectuată de asemenea, prin cotransfecția celulelor CHO cu plasmizi pHTP1 și pMG1.

Tulpina CHO (CHO-DUKXB11) transfectată cu plasmidul pDEF202-hTPO-P1 s-a depozitat sub numărul de acces FERM BP - 4988 la Național Institute of Bioscience and

Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional

Trade and Industry, Japonia.

R0118299 Β1

Exemplul 33. Construcția unui vector recombinant, BMCGSneo-hTPO-P1, pentru folosire în celule 63.6.5.3 pg dintr-un vector de expresie mamifer pBMCGSneo s-a digerat cu enzime de restricție, Xhol și Notl și s-a supus electroforezei în gel de agaroză pentru a izola porțiunea vector DNA. Acest fragment DNA și cDNA TPO uman (clona P1) care a fost obținută prin digestia plasmidului pBLTEN conținând cDNA TPO uman cu enzimele de restricție Xholl și Notl s-au ligat folosind ligază DNA T4 pentru obținerea vectorului de expresie de interes, pBMCGSneo-hTPO-P1. Acest plasmid de expresie conține promotorul timpuriu citomegalovirus, intronul derivat din părți ale genei β globină de iepure și regiune de poliadenilare pentru transcripția cDNA TPO uman, gena β globină umană, 89% din gena virusului papilloma 1 bovin, promotorul timidin chinază și regiune poliadenil gena fosfotransferază I (genă rezistentă la neomicină și originea replicării pBR 322 și gena β-lactamază (Amp') și cDNA TPO uman s-au ligat la un sit în aval al promotorului citomegalovirus.

Exemplul 34. Expresia în celule X 63.6.5.3

S-au cultivat celule X 63.6.5.3. în mediul esențial minim Dulbecco (DME) conținând 10% ser fetal bovin. Transfecția celulelor X 63.6.5.3. cu plasmidul BMCGSneo hTPO s-a realizat prin metoda electroporării cum s-a descris în continuare.

S-a adăugat 20 pg de plasmid BMCGSneo-hTPO-P1 preparat în exemplul 33 la 750 p\ de mediu DME conținând 10⁷ celule și amestecul s-a pus într-o cuvetă de electroporare având o fantă de 4 mm și s-a lăsat să stea 10 min la 4°C. Cuveta s-a montat apoi într-un aparat de electroporare (BTX 600, fabricat de BTX) pentru a realiza transferul genei în condiții de 380 V, 25 mF, și 24 Â. După transferul genei, cuveta s-a lăsat din nou să stea 15 min la 4°C, și celulele s-au spălat o dată cu DEM conținând 10% ser fetal bovin. Celulele transfectate s-au suspendat în 50 ml DEM conținând 10% ser fetal bovin, s-au împărțit în godeurile a 5 plăci de cultură de țesut cu 96 godeuri și apoi s-au cultivat 2 zile într-un incubator la CO₂, după 2 zile de cultură, s-a schimbat mediul de cultură cu DEM conținând 10% ser fetal bovin și 1 mg/ml de G418 (produs de GIBSCO), și schimbarea de mediu s-a făcut după aceea la fiecare 3 zile. Activitatea TPO uman în mediul de cultură al transformanților s-a măsurat prin test CFU-MK, M-07e, sau Ba/F3. Transformanții care secretă TPO uman în mediu de cultură s-au donat de 2 ori printr-o diluție de limitare pentru stabilirea unei linii celulare care produc TPO uman.

Exemplul 35. Expresia pe scară mare a TPO uman în celule COS 1

Transfecția celulelor COS 1 s-a realizat conform metodei DEAE-dextran care include tratament clorochină așa cum s-a descris în exemplul 11. Celule COS 1 (ATCC CRL 1650) s-au cultivat în IMDM conținând 10% (v/v) FCS folosind un balon de cultură de 175 cm² acoperit cu colagen la 37°C, într-un incubator 5% CO2 până când celulele au devenit aproape 100% confluente. în scopul efectuării acoperirii cu colagen a balonului de cultură s-au adăugat 25 ml dintr-o soluție de colagen (Cellmatrix type l-C, produs de Iwaki) a cărui concentrație a fost corectată până la 0,3 mg/ml cu HCI 1mM la fiecare balon de cultură de 175 cm², soluția de colagen s-a recuperat după o oră de stat la temperatura camerei și apoi balonul astfel tratat s-a spălat o dată cu 20 - 50 ml PBS. Transfecția s-a efectuat amestecând 20 ml de soluție IMDM conținând 250 /zg/ml dextranDEAE (produs de Pharmacia), 60 μΜ de clorochină (produsă de Sigma) și 10% (v/v) de Nu-serum (produs de Collaborative) cu plasmidul pHTP1 (40 pg) care a fost dizolvat în 500 pl de HBS, adăugarea amestecului rezultat la celule COS 1 descrise mai sus conținute într-un balon de cultură de 175 cm² care a fost spălat o dată cu IMDM chiar înaintea transfectării și apoi cultivarea celulelor 3 h la 37°C, într-un incubator cu 5% CO2. După aceea, supernatantul culturii s-a îndepărtat prin sucțiune, și celulele s-au spălat o dată cu IMDM amestecat cu 50 ml de mediu fără ser și apoi s-au cultivat 5 zile la 37°C, într-un incubator cu 5% CO₂ pentru recuperarea supernatantului culturii.

3750

3755

3760

3765

3770

3775

3780

3785

3790

3795

RO 118299 Β1 într-una din operări, s-au folosit 100 până la 260 baloane de cultură de 175 cm² și s-au recuperat 5 -131 de supernatant de cultură. Mediul lipsit de ser s-a preparat prin suplimentarea IMDM cu 5 /zg/ml insulină (produsă de Sigma), 5 /zg/ml transferrină (produsă de Sigma), 10 μΜ de monoetanolamină (produsă de Wako Pure Chemical Industries), 25 nM de selenid de sodiu (produs de Sigma) și 200 μς/ιηΙ BSA (albumină bovină de puritate ridicată lipsită de acizi grași, produsă de Nichirei).

Exemplul 36. Purificarea TPO umane de lungime întreagă (derivată de la plasmidul de expresie pHTP1, dona P1) exprimată în celule COS 1 și activitatea sa biologică în continuare, exemplele descriu activitatea și purificare a TPO umane de lungime întreagă (derivată de la plasmidul de expresie pHTP1) exprimată în celule COS1. Inițial, s-a preparat un produs purificat parțial în vederea examinării activității de creștere a plachetului și apoi s-a realizat purificarea pentru obținerea unui produs de înaltă puritate. Pentru măsurarea activității TPO în următoarele etape de preparare s-a folosit în principal, sistemul de testare M-07e. în mod similar, s-a găsit activitatea TPO în sistemul de testare CFU-MK de șobolan. în realizarea acestor teste s-a adăugat la fiecare probă albumină serică umană (HSA) până la o concentrație finală de 0,02 până la 0,55%.

Inițial, celule COS1 transfectate cu plasmidul phTP1, conform metodei Ohashi și Sudo (Hideya Ohashi și Tadashi Sudo, Biosci.Biotech.Biochem., 58 (4), 758-759,1994) s-au cultivat 5 zile la 37°C, în 5% CO₂ folosind mediul de cultură IMDM lipsit de aer conținând 0,2 g BSA, 5 mg insulină bovină, 5 mg transferină umană, 0,02 mM monoetanolamină, și 25 nM selenid de sodiu în 1000 de ml prin aceasta obținând circa 71 supernatant de cultură fără ser. La supernatantul de cultură fără ser s-a adăugat inhibitori de enzime proteolitice pAPMSF și Pefabloc SC (4-(2-aminoetil)-benzensulfonil fluorură clorhidrică, produsă de Merk, număr de catalog 24839) până la o concentrație finală de circa 1 mM, urmată de filtrare folosind un filtru de 0,2 μΜ pentru recuperarea supernatantului. Acesta s-a concentrat printrun factor de circa 10 folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultrasette, cu greutatea moleculară nominală de separare de 8000 fabricată de Filtron; sau PLGC Pellicon Cassette, greutatea moleculară nominală de separare de 10000, produsă de Milliph), 723 ml din concentrat (concentrația proteinei 3,38 mg/ml) proteină totală 2445 mg; activitate relativă 43000; și activitate totală 105100000), s-a amestecat cu 1,6 mol/1000 ml sulfat de amoniu (288 g în total) pentru a obține 804 ml de soluție care conține 1,5 M în concentrație finală sulfat de amoniu și apoi, soluția astfel obținută s-a aplicat la o rată de curgere de 10 ml/min la coloană Macro-Prep Methyl HIC (5 cm în diametru și 9 cm înălțimea patului produsă de Biorad, număr de catalog 156-0080) care fusese echilibrată înainte cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,2) care conține 1,5 M sulfat de amoniu. După încărcarea probei, s-a realizat eluția cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,2) conținând 1,25 M sulfat de amoniu pentru obținerea fracțiunii trecute prin F1 (2384 ml; concentrația proteinei 0,864 mg/ml; proteină totală 2061 mg; și activitatea relativă 6000).

în continuare, soluția de eluție s-a schimbat la citrat de soldiu 20 mM, pH=5,8, pentru a colecta fracțiunea F2 (1092 ml; concentrația proteinei 0,776 mg/ml; proteină totală 847 mg; și activitate relativă 150000).

Fracțiunea F2 obținută coloană Macro-Prep Methyl HIC (1081 ml) s-a aplicat la o rată de curgere de 10 ml/min la coloană SP Sepharose Fast Flow (3 cm în diametru și 10 cm înălțimea patului) produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0729-01) care a fost echilibrată înainte cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,8). După încărcarea probei s-a realizat eluția cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,6) care conține 110 mM NaCI pentru obținerea fracțiunii F1 (2262 ml; concentrația proteinei 0,270 mg/ml; proteină totală 610 mg și activitate relativă 30000). în continuare, s-a schimbat soluția de eluție la tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,4) conținând 400 mM NaCI pentru colectarea fracțiunii F2 (856 ml);

RO 118299 Β1 concentrația proteinei 0,189 mg/ml; proteină totală 162 mg și activitate relativă 300000). în continuare, s-a schimbat soluția de eluție la tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,2) conținând 1000 mM NaCI pentru colectarea fracțiunii eluate F3 (370 ml, concentrația proteinei 0,034 mg/ml; proteină totală 12,6 mg și activitate relativă 150000).

Principala fracțiune F2 TPO activă (845 ml) de la etapa de coloană SP Sepharose Fast Flow s-a amestecat cu circa 10% în concentrație finală 1-propanol și s-a aplicat la o rată de curgere de 3 ml/min la coloană LA-WGA (2 cm în diametru, și 14 cm înălțimea patului, produsă de Honen, număr de catalog WG-007) care a fost echilibrată înainte cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,4) conținând 400 mM NaCI. După încărcarea probei, eluția s-a realizat folosind un amestec de tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,4) conținând 400 mM NaCI cu 1-propanol (9:1) pentru a obține fracțiunea F1 (64,4 ml; concentrația proteinei 0,0178 mg/ml; proteină totală 1,15 mg și activitate relativă 17220). în continuare, s-a schimbat soluția de eluare la tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=6,1) conținând 0,4 M GIcNac și 10% 1-propanol pentru a colecta fracțiunea eluată F2 (45 ml; concentrația proteinei 0,0104 mg/ml; proteină totală 0,470 mg și activitate relativă 675000).

Principala fracțiune activă TPO F2 (340 ml) a operării coloanei LA-WGA s-a amestecat cu circa 0,005% în concentrație finală TFA și s-a supus la cromatografie în coloană YMC-Pack CN-AP (6 mm în diametru și 250 mm, fabricată de YMC, număr de catalog AP-513). Astfel, folosind 0,1% TFA ca solvent A pentru developare, și 1-propanol conținând 0,05% TFA ca solvent de developare B, proba s-a aplicat la o rată de curgere de 0,6 ml/min la o coloană YMC-Pack CN-AP care a fost echilibrată înainte cu 15% B. După încărcarea probei, concentrația propanolului s-a crescut de la 15 la 25% B și s-a realizat eluția cu un gradient linear de la 25 până la 50% B, timp de 65 min în același timp colectând eluatele în porțiuni de 1,5 ml (2,5 min) în eprubete de polipropilenă.

O porțiune de 0,5 μ\ (1/3000 fracțiune) de eluat din fiecare eprubetă s-a amestecat cu HSA și s-a concentrat prin ultrafiltrare pentru a obține 0,25 ml de soluție de cultură test IMDM conținând 0,05% HSA pentru utilizare în identificarea fracțiunilor active TPO prin testare. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO puternică (activitate relativă de circa 630000 la 4800000) în eprubetele cu numerele 24 - 30 (în domeniul de 35,0 până la 42,0% concentrația de propanol) care s-au strâns ca fracțiune TPO activă FA (13,5 ml).

Fracțiunea FA obținută în etapa coloanei YMC-Pack CN-AP s-a supus la Capcell Pack CI 300A (4,6 mm în diametru și 150 mm înălțimea patului, produsă de Shiseido, număr de catalog CI ΤΥΡΕ: SG 300 A) folosind 0,1 % TFA ca solvent de developare A și 1 -propanol conținând 0,05% TFA ca solvent de developare B. O porțiune (8,9 ml) din fracțiunea FA obținută prin operarea coloanei YMC-Pack CN-AP s-a amestecat cu 0,3 ml glicerol, s-a concentrat prin centrifugare-evaporare și apoi, s-a amestecat cu circa 2,5 ml de 10% B, și soluția rezultată s-a aplicat în continuare la o rată de curgere de 0,4 ml/min la coloana Capcell Pack CI 300 A care a fost echilibrată înainte cu 20% B. După încărcarea probei s-a realizat soluția mai întâi cu 20% B ,timp de 5 min și apoi, cu un gradient linear de 20 până la 40% B, timp de 50 min colectând în același timp eluatele în porțiuni de 1 ml (2,5 min) în eprubete de polipropilenă.

O porțiune de 1 μΙ (1/1000 fracțiune) a eluatului din fiecare eprubetă s-a amestecat cu HSA și s-a concentrat prin ultrafiltrare pentru a obține 0,25 ml de soluție de cultură test IMDM conținând 0,05% HSA pentru utilizare în identificarea prin testare a fracțiunilor active TPO. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO puternică (activitate relativă de circa 3000000 la 22500000) în eprubetele numerele 20 - 23 (în domeniul de 28,5 și 32,5% concentrație de propanol) care s-au colectat ca fracțiune cu activitate ridicată.

3850

3855

3860

3865

3870

3875

3880

3885

3890

RO 118299 Β1 a 6 fragmente DNA dublu împletite, aceste oligonucleotide sintetice s-au combinat după cum urmează, 1 și 2, 3 și 4, 5 și 6, 7 și 8, 9 și 10,11 și 12, și fiecare combinație s-a normalizat într-o soluție compusă din 10 mM Tris/HCI (pH=7,5), 10 mM MgCI₂ și 50 mM NaCI.

în continuare, 3 fragmente DNA dublu împletite ale 1 și 2, 3 și 4, 5 și 6 și alte 3 fragmente DNA dublu împletite 7 și 8, 9 și 10, și respectiv, 11 și 12 s-au tratat cu ligază T4 (produsă de Life Technology) și aceste 2 soluții de reacție s-au tratat din nou în același mod cu ligază T4. Fragmentul DNA obținut prin reacția de ligare s-a digerat cu BamHI (produs de Boehringer - Mannheim) și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru recuperarea unui fragment de circa 390 până la 400 bp care în continuare, s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a subclonat în pUC18 care a fost digerat înainte cu Xbal și BamHI (ca gazdă s-a folosit E.coli DH5a). De la clonele astfel obținute s-a selectat o clonă care are gene artificiale care codifică TPO uman și conține următorii codoni, de preferință, E.coli, selectat prin analiza secvenței nucleotidice și denumită pUC18 (Xb) (1-123). Secvența DNA a catenei codificatoare a este prezentată în lista secvențelor (SECV.ID.Nr.9).

1 20 30 40 5060

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTCACCTTCG ΤΤΤΓΙΤ GGTTGGTCCA TTGTTTATTA CTCGGGCCGA GGCGGTCGAA CACTGGAAGC Xbal 2

80 3 90 100120

TGTTCTGTCT AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC ACAAGACAGATTTGACGAAG CGCTGAGAGT GCAGCACGTG AGAGCAGACA GGGTCATCGGG 4

130 140 150 5 160 170180

GGAAGTTCAC CCGCTGCCGA CCCCGGTTCT GCTTCCGGCT GTCGACTTCT CCCTGGGTGA CCTTCAAGTG GGCGACGGCT GGGGCCAAGA CGAAGGCCGA CAGCTGAAGAGGGACCCACT 6

190 200 210 220 I 230240

ATGGAAAACC CAGATGGAAG AGACCAAGGCTCAGGACATC CTGGGTGCAG TAACTCTGCT TACCTTTTGG GTCTACCTTC TCTGGTTTCG AGTCCTGTAG GACCCACGTC ATTGAGACGA

250 260 270 280 8 290 9300

TCTGGAAGGC GTTATGGCTG CACGTGGCCA GCTTGGCCCG ACCTGCCTGT CTTCCCTGCT AGACCTTCCG CAATACCGAC GTGCACCGGT CGAACCGGGC TGGACGGACA GAAGGGACGA 310 320 330 340 350 10360

TGGCCAGCTG TCTGGCCAGG TTCGTCTGCT GCTCGGCGCT CTGCAGTCTC TGCTTGGAAC ACCGGTCGAC AG ACCGGTCC AAGCAGACGA CGAGCCGCGA GACGTCAGAG ACGAACCGTG

370 380 390 400 410420

CCAGCTGCCG CCACAGGGCC GTACCACTGC TCACAAGGAT CCGAACGCTA TCTTCC GGTCGACGGCGGTGTCCCGGCATGGTGACGAGTGTTCCTAGGCTTGCGATAGAAGGACAGAA

BamHI

S-a sintetizat cADN simplu împletit dintr-un 1 μ$ de ARN poli(A)⁺ derivată din ficat uman normal folosind primer oligodT, și PCR s-a realizat folosind 0,1 voi de soluție de reacție de sinteză cDNA ca matriță. Reacția PCR (incubarea la 96°C, 2 min, repetarea unui total de 30 cicluri de reacție, fiecare ciclu constând din incubări la 95°C, 1 min, la 58°C, 1 min și la 72°C, 1 min și incubare finală la 72°C, 7 min) s-a realizat cu un volum de 100 pi folosind hTPO - C și hTPO - Z (EcoRI) ca primeri. Fragmentul cDNA TPO uman obținut în acest mod s-a digerat cu BamHI și EcoRI și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru recuperarea unui fragment în mărime de circa 600 bp care s-a purificat în continuare, folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a subclonat în pUC18 care a fost digerat

RO 118299 Β1 înainte cu EcoRI și BamHI (ca gazdă s-a folosit E.coli DH5a). S-a selectat o clonă care codifică secvența nucleotidică TPO umană corectă prin analiza secvenței nucleotidice și s-a denumit pUC18(BE) (124-332). Secvențele oligonucleotidice ale primerilor folosiți în reacția PCR sunt după cum urmează:

hTPO-C:5'-GGA GGA GAC CAA GGC ACA GGA - 3'(SECV.ID.Nr.95) (pozițiile 329 la 349 ale clonei pHTF1); și hTPO-Z(EcolRI): 5'-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AGA CAG ATT - 3'(SECV.ID.Nr.96) (s-a preparat prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere EcoRI la un primer antisens corespunzător pozițiilor 1143 la 1163 ale clonei pHTF1).

Clona pUG18 (BE) (124-332) s-a digerat cu BamHI și EcoRI și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru recuperarea fragmentului din partea C-termină cDNA TPO umană în mărime de circa 600 bp care a fost purificat în continuare, folosind kit de purificare ADN Prep-A-Gene și s-a subclonat în pUC18(XB)(1-123) care fusese digerat în avans cu EcoRI și BamHI (E.coli DH5a s-a folosit ca gazdă). O clonă obținută în acest mod s-a numit pUC18(XE)(1-332).

Deoarece, prezența activității TPO umană în fragmentul peptidic TPO uman al resturilor aminoacide poziția 1 până la 163 s-a confirmat printr-un exemplu în care s-au preparat diverse constructe de deleție C-terminală ale cDNA TPO uman și s-au exprimat pentru a măsura in vitro activitatea TPO umană s-a construit un vector de expresie care conține acest fragment peptidic. în acest caz s-a obținut expresia secvenței DNA care codifică GST-TPO (1-174).

Deoarece, o secvență nucleotidică corespunzătoare la pozițiile 681 până la 686 (resturile aminoacide ale pozițiilor 173 și 174) ale clonei pHTF1 se recunoaște printr-o enzimă de restricție Saci, s-au introdus 2 codoni terminali folosind 2 oligonucleotide sintetice utilizând situl de recunoaștere ale acestei enzime de restricție. Astfel, s-au normalizat 2 oligonucleotide sintetice SSE1 și SSE2 într-o soluție compusă din 10 mM Tris-HCI (pH=7,5), 10 mM MgC12 și 50 mM NaCI și folosind kitul de ligare cDNA (produs de Takara Shuzo), fragmentul DNA dublu împletit astfel obținut s-a introdus în pUC18(XE)(1-332) din care fragmentul Cterminal cDNA TPO uman de circa 480 bp fusese îndepărtat, prin digestia sa cu Saci și EcoRI, prin aceasta obținând o clonă pUC18 (XS)(1-174)(E.co//DH5a s-a folosit ca gazdă). Secvențele oligonucleotidelor sintetice sunt cele care urmează: SSE1: CTAATGAG (SECV.ID.Nr.98);

SSE2: AATTCTCATTAGAGCT (SECV.ID.Nr.98);

Saci SSE1 EcoRI

5' - CTAATGAG - 3' (SECV.lD.Nr. 99)

3' - TCGAGATTACTCTTAA - 5' (SECV.ID.Nr.100)

SSE2

Clona pUC18(XS)(1-174) obținută mai sus, s-a digerat cu Xbal și EcoRI și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru recuperarea unui fragment în mărime de circa 600 bp care codifică resturile aminoacide 1 la 174 ale TPO umane, și fragmentul s-a purificat folosind un kit de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a subclonat în pBluescript IISK⁺ (fabricat de Stratagene) care a fost digerat cu Xbal și EcoRI (E.coli DH5a s-a folosit ca gazdă). O clonă obținută în acest mod s-a numit pBL(XS)(1-174). în aceiași manieră, clona pBL(XS) (1-174) s-a digerat cu Xbal și Hindlll pentru recuperarea unui fragment în mărime de circa 550 bp care codifică resturile aminoacide 1 la 174 ale TPO uman, și fragmentul s-a purificat în continuare folosind kit de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a subclonat în pCFM536 (EP-A-136490) care a fost digerat în avans cu Xbal și Hindlll (E.coli DH5a s-a folosit ca gazdă). O clonă obținută în acest mod s-a numit pCFM536/hT(1-174).

4045

4050

4055

4060

4065

4070

4075

4080

4085

RO 118299 Β1

Următorul experiment s-a realizat în scopul efectuării expresiei lui GST-TPO (1-174) apelând la pGEX-2T (produs de Pharmacia) care este un vector de expresie al proteinei fuzionate glutation-S-transferază (GST). Reacția POR (incubare la 96°C, 2 min, repetarea unui total de 22 cicluri de reacție, fiecare ciclu constând din incubări la 95°C, 1 min, la 41 °C, 1 min și la 72°C, 1 min și incubare finală la 72°C, 7 min) s-a realizat folosind pCFM536/hT (1-174) ca matriță și 2 primeri PCR GEZ1 și GEX3. Fragmentul care codifică TPO umană obținut în acest mod s-a digerat cu Nael și EcoRI și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru recuperarea unui fragment în mărime de circa 550 bp, fragmentul s-a purificat în continuare folosind kit de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a donat în pGEX-2T care a fost digerat înainte cu EcoRI și Smal (E.coli DH5 s-a folosit ca gazdă) și apoi o clonă numită pGEX-2T/hT(1-174), care codifică secvența nucleotidică TPO umană corectă s-a selectat prin analiza secvenței nucleotidice pentru prepararea unui transformam pentru utilizare în expresia de GST-TPO (1-174). Secvențele oligonucleotidice ale primerilor folosiți în reacția PCR sunt cele care urmează:

GEX1:5' - ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C - 3' (SECV.ID.Nr.101) (s-a preparat prin adăugarea unei secvențe de recunoaștere Nael la secvența pozițiilor 21-39 din SECV.ID.Nr.10); și

GEX3: 5' - GCC GAA TTC TCA TTA GAG CTC GTT CAG TGT - 3' (SECV.ID.Nr.102) (un primer antisens corespunzător la secvența pozițiilor 523-549 din SECV.ID.Nr.10).

Acest plasmid de expresie conține o secvență DNA care codifică proteina GST urmat de o peptidă de recunoaștere a trombinei și un TPO uman (resturile aminoacide 1 la 174). Secvența DNA care codifică peptidă de recunoaștere a trombinei și TPO uman (resturile aminoacide 1 la 174) sunt arătate în Lista secvențelor (SECV.ID.Nr.10).

Exemplul 40. Expresia GST-TPO(1-174) în E.coli

Transformantul preparat în exemplul 39 s-a cultivat peste noapte la 37°C, într-un agitator folosind 60 ml de mediu LB conținând 50 jug/ml ampicilină, și o porție de 25 ml din bulionul de cultură rezultat s-a adăugat la 1000 ml mediu LB care conține 50 ^g/ml ampicilină și s-a cultivat la 37°C, într-un agitator până când OD la A₆₀₀ a atins 0,7 la 0,8. După aceea, s-a adăugat IPTG la bulionul de cultură până la o concentrație finală de 0,1 mM și agitarea culturii s-a continuat pentru încă 3 h, în scopul inducerii expresiei de GST-TPO (1-174).

Exemplul 41. Purificarea GST-TPO (1-174) exprimată în E.coli și confirmarea activității sale biologice

O porție de 5,9 g de celule înghețate ale tulpinii recombinante care produce GSTTPO (1-174) derivate de la clona pGEX-2T/hT (1-174) care codifică secvența nucleotidică TPO uman, s-au suspendat în 10 ml apă și s-au distrus folosind un dezintegrator de presiune ridicată. S-a recuperat GST-TPO (1-174) prin supunerea suspensiei la centrifugare, din fracțiunea precipitată și s-a îndepărtat majoritatea părților proteinelor contaminante, componente celulare și altele asemenea. în continuare, fracțiunea precipitată astfel recuperată conținând GST-TPO (1-174) s-a suspendat în 5 ml apă la care s-au adăugat, cu agitare, 6 ml de tampon Tris 1M (pH= 8,5), 120 ml uree 10M și 16 ml apă. După 5 min de agitare pentru solubilizarea conținuturilor, soluția rezultată s-a divizat în mod egal în 4 porțiuni pentru realizarea următoarelor etape (1) la (4).

(1) Una dintre probele divizate s-a diluat printr-un factor de 10 cu tampon Tris 20 mM având o valoare de pH=8,5. La aceasta s-au adăugat glutation de tip redus și glutaxtion de tip oxidat până la concentrațiile finale respective de 5 mM și 0,5 mM, urmat de incubare peste noapte la 4°C. Acest amestec preparat s-a supus centrifugării pentru recuperarea GST-TPO (1-174) ca supernatant fluid care s-a diluat în continuare, cu un tampon și anume, citrat de sodiu 20 mM care are un pH de 5,5 și apoi, s-a ajustat la un pH de 5,5 cu acid acetic. GST-TPO (1 -174) în soluție s-a aplicat la coloană schimbătoare de cation SP Sepharose

R0118299 Β1

4140

Fast Flow (produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0729-01) care a fost echilibrată anterior cu tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5. După spălarea coloanei, cu o soluție tampon de citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5, s-a efectuat eluția GST-TPO (1-174) folosind tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5 care conține 500 mM clorură de sodiu. O porțiune de 129 ml de eluat s-a amestecat cu 2,6 ml de tampon Tris 1M, pH=8,5, și amestecul rezultat având o valoare a pH-ului de 8,1 s-a aplicat la coloană Glutathione Sepharose 4B (produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0756-01) pentru a adsorbi GST. TPO(1-174). După spălarea coloanei cu PBS, eluția GST - TPO (1-174) s-a efectuat folosind tampon Tris 20 mM, pH=8,5 care conține 10 mM de glutation de tip redus. Eluatul rezultat s-a amestecat cu 37 unități NTH de trombină, s-a lăsat să stea 4 h la temperatura camerei, s-a diluat cu PBS printr-un factor de 10 și apoi s-a aplicat la coloană Glutathione Sepharose 4B pentru a adsorbi digestul GST și recupera TPO (1-174) în fracțiunea neadsorbită. Fracțiunea neadsorbită astfel recuperată s-a diluat într-un factor de 3 cu tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5 și s-a aplicat la coloană de schimb cationic SP Sepharose Fast Flow, care a fost echilibrată în avans cu același tampon, și compusul de interes s-a eluat cu un gradient linear de densitate de 0 la 500 mM clorură de sodiu dizolvată în același tampon.

(2) Toate operațiile etapei (1) s-au efectuat în prezență de 0,1% polisorbat 80.

(3) Una din probele divizate s-a diluat printr-un factor de 10 cu tampon Tris 20 mM, având o valoare a pH-ului de 8,5. La aceasta s-au adăugat glutation de tip redus și oxidat până la concentrațiile finale de 5 mM și respectiv 0,5 mM, urmat de repaus peste noapte la 4°C. Amestecul astfel preparat s-au supus centrifugării pentru recuperarea GST-TPO(1-174) ca supernatant fluid care în continuare s-a diluat printr-un factor de 2 cu tampon citrat de sodiu 20 mM având o valoare de pH de 5,5 și apoi s-a corectat la pH=5,5 cu acid acetic. GST-TPO (1-174) în soluție s-a aplicat la rășină schmbătoare de cation SP Sepharose Fast Flow echilibrată în avans cu tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5. După spălarea rășinii cu tampon citrat de sodiu 20 mM, pH= 5,5, eluția GST-TPO(1 -174) s-a efectuat folosind tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5 care conține 500 mM clorură de sodiu. Eluatul s-a ajustat la pH=8 cu tampon Tris 1 M, pH=8,5, s-a amestecat cu 320 unități NIH de trombină pentru îndepărtarea secvențelor polipeptidice GST pe calea clivajului unui linker de recunoaștere a trombinei, s-a lăsat să stea 4 h la temperatura camerei, s-a diluat printr-un factor de 5 cu tampon citrat de sodiu 20 mM, pH=5,5 și apoi s-a aplicat la coloană schimbătoare de cation SP Sepharose Fast Flow care s-a echilibrat înainte cu același tampon, și compusul de interes s-a eluat în continuare cu un gradient linear de densitate de 0 până la 500 mM clorură de sodiu dizolvată în același tampon.

(4) Toate operațiile etapei (3) s-au efectuat în prezență de 0,1% polisorbat 80.

Fiecare dintre fracțiunile eluate la densități de circa 200 până la 400 mM prin cromatografia de coloană de schimb cationic SP Sepharose Fast Flow s-au dializat complet contra mediu de cultură IMDM și apoi s-au evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan. Când s-a analizat fracțiunea prin SDS-PAGE în prezența unui agent reducător, s-a detectat o bandă corespunzătoare la o greutate moleculară de 19 kd (puritate, 1 la 20%) ca una dintre benzile proteice principale ale fracțiunii. Când s-a efectuat analiza secvenței N-terminale prin supunerea ei la SDS-PAGE și transfer la membrană PVDF în conformitate cu procedura descrisă în exemplul 1, s-a confirmat că această bandă conține o secvență TPO exprimată de pGEX-2T/hT(1-174) derivat de proteină de fuziune. Secvența aminoacidă dedusă a TPO rezultate a fost (GLY ¹)TPO secvența dată a peptidei linker de recunoaștere a trombinei și activitatea cunoscută a trombinei asupra linkerului.

Exemplul 42. Construcția vectorului pentru utilizare în expresia TPO umane în E.coli (resturile aminoacide 1 la 163 care au substituții în poziția 1 (Ser Ala) și poziția 3 (Ala >Val)

Clona pUC18(XE)(1-332) preparată în exemplul 39 s-a digerat cu Xbal și EcoRl și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru a recupera un fragment în mărime de circa 1000 bp care codifică resturile aminoacide 1 la 332 ale TPO umane, și în continuare, fragmentul s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene și s-a subclonat

4145

4150

4155

4160

4165

4170

4175

4180

4185

4190

RO 118299 Β1 în pBluescript II SK⁺ (produs de Stratagene) care s-a digerat în avans cu Xbal și EcoRI (ca gazdă s-a folosit E.coli DH5a). Clona obținută în acest mod s-a numit pBL(XE)(1-332). în continuare, o regiune a clonei pBL(XE)(1-332) de la secvența sa de recunoaștere BamHI până la poziția aminoacidă 163 (pozițiile 366 la 489) s-au schimbat la codoni dominanți E.coli. S-au preparat oligonucleotidele sintetice 13 la 20 prezentate mai jos, și fiecare pereche de oligonucleotide sintetice 13 și 14,15 și 16 și 17 și 18 s-au fosforilat în aceeași eprubetă care conține o soluție compusă din 0,1 mM ATP, 10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat și 50 mM K-acetat. După adăugare ulterioară a 1/10 voi dintr-o soluție compusă din 100 mM Tris/HCI (pH=7,5), 100 mM MgC12 și 500 mM NaCI, soluția rezultată s-a încălzit într-o baie de apă la fierbere timp de 3 min și apoi s-a lăsat să se răcească până la temperatura camerei pentru a obține un fragment DNA cu împletire dublă. în continuare, cele 3 perechi de fragmente DNA dublu împletite dublă. în continuare, cele 3 perechi de fragmente DNA dublu împletite astfel obținute constând din 13 și 14,15 și 16 și 17 și 18 s-au ligat folosind kit de ligare DNA (produs de Takara Shuzo) și s-au realizat PCR folosind kit de ligare DNA (produs de Takara Shuzo) și s-au realizat PCR folosind produsul astfel ligat ca matriță și oligonucleotidele sintetice 19 și 20 ca primeri. Produsul PCR astfel obținut s-a digerat cu BamHI și Hindlll și s-a supus la electroforeză în gel de agaroză 2% pentru a recupera un fragment în mărime de circa 130 bp folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene. Acesta s-a subclonat în pBL(XE)(1-332) care a fost digerat anterior cu BamHI și Hindlll (s-a folosit ca gazdă E.coli DH5). De la clonele astfel obținute s-a selectat prin analiza secvenței o clonă care are următoarele secvențe nucleotidice și s-a numit pBL(XH)(1-163):

13: S'-GATCCGAACGCTATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGT-S' (SECV. ID.

Nr.103);

14: 5'-TTTGCCACGCAGCAGGTCGTGGAAAGACAGGAAGATAGCGTTCG-3' (SECV.ID. Nr.104);

15: S'-GGCAAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-S· (SECV.ID.

Nr.105);

16: 5'-ACGCACAGGGTAGAACCGCCAACCAHCATCAGGAAACGAAC-3' (SECV.ID.

Nr.106);

17: S'-TGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACCACTGCTGTTCCGTCTTAATGAA-S¹ (SECV.ID. Nr.107);

18: 5'-AGCTTTCATTAAGACGGAACAGCAGTGGTTGGCGGCGCCCGACGA-3' (SECV.ID. Nr.108);

19: 5'-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (SECV.ID.Nr.109); și

20: 5'AGAAGCTTTCATTAAGACGGAACA-3' (SECV.ID.Nr.110).

Exemplul 43. Expresia lui h6T(1-163)în E.coli

Expresia plasmidului de expresie pCFM536 este controlată prin promotorul ĂPL care el însuși este sub controlul genei represoare cl857. Transformantul obținut în exemplul 42 s-a cultivat peste noapte la 30°C, pe un agitator folosind 60 ml de mediu LB care conține 50 Mg/ml ampicilină și 12,5 Mg/ml tetraciclină, și o porțiune de 25 m< din bulonul culturii rezultate s-a adăugat la 1000 ml mediu PB care conține 50 Mg/ml ampicilină și s-a cultivat la 37°C, pe agitator până când OD la A₆₀₀ a atins 1,0 până la 1,2. După aceea, circa 330 ml de mediu LB încălzit la 65°C, s-au adăugat la bulionul culturii pentru ajustarea temperaturii finale a mediului la 42°C, și agitând s-a continuat cultura 3 h la 42°C, pentru inducerea expresiei lui h6T(1 -163).

Exemplul 44. Purificarea lui h6T (1-163) exprimat în E.coli și confirmarea activității lui biologice

O porțiune de 3,6 g de celule înghețate ale tulpinii recombinante producătoare de h6T (1-163) s-a suspendat în 10 ml apă și s-au distrus folosind un dezintegrator de presiune ridicată. Prin supunerea suspensiei la centrifugare, s-a recuperat fracțiunea precipitată și majoritatea părților proteinelor contaminate, componente celulare și altele asemenea s-au

R0118299 Β1

4245 îndepărtat. Fracțiunea precipitată astfel recuperată conținând h6T (1-163) s-a suspendat în 7 ml apă și s-au adăugat la suspensie cu agitare 3 ml de tampon Tris 1M (pH=8,5), urmat de adiție suplimentară de uree (concentrație finală 8M), guanidină clorhidrică (concentrație finală 6M) și sarcozinat N-lauroil de sodiu (concentrație finală 2%). După 5-20 min de agitare la temperatura camerei pentru solubilizarea conținuturilor, soluția rezultată s-a diluat de 10 ori cu tampon Tris 20 mM având o valoare pH de 8,5 și s-a supus la redublare prin incubare peste noapte la 4°C. în acest caz, s-au folosit ca aditivi în adăugare la oxidare la ser glutation și sulfat de cupru. Prin centrifugare, h6T (1-163) s-a recuperat în fluidul supematant. Când fiecare dintre fracțiunile recuperate s-a analizat prin SDS-PAGE în prezența unui agent reducător, s-a detectat o bandă corespunzătoare la o greutate moleculară de 18 kd (puritate, 30-40%) ca principală bandă proteică a fiecărei fracțiuni. Când s-a realizat analiza secvenței N-terminală a acestei benzi prin supunerea ei la SDS-PAGE și transfer la membrană PVDF .conform procedurii descrise în exemplul 1, s-a confirmat că această bandă conține o secvență TPO de exprimat ca pCMF536/h6T(1-163) derivată TPO de tip mutată. Când fiecare fracțiune s-a dializat complet contra mediu de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan, s-a găsit activitate TPO în toate fracțiunile într-un mod dependent de doză.

Exemplul 45. Prepararea anticorpului peptidic anti-TPO și detectarea TPO prin SDSPAGE și analiză Western

Reușita în prepararea anticorpului peptidic anti-TPO va da posibilitatea detectării proteinei TPO prin mijloace imunologice. Ca urmare, de la secvențele aminoacide TPO confirmate s-au selectat 3 regiuni care par a fi relativ utile ca antigen (vezi mai jos), s-a sintetizat o peptidă cu împletire cvadruplă de tip antigen peptidic multiplu (MAP) în conformitate cu procedura lui Tam (Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, 85, 5409-5413,1988) folosind fiecare dintre regiunile selectate și apoi s-au imunizat câte 2 iepuri fiecare de 8 ori cu 100 pg din fiecare dintre peptidele astfel sintetizate pentru a obține probele de antiser respective.

Secvențele aminoacide conținute în peptidele antigen sintetizate (a) TPO(9-28) de șobolan (regiunea peptidică RT1)

PRLLNKLLRTSYLLHRRLSQ (SECV.ID.Nr.116);

(R la poziția 24 este original S în resturile aminoacide determinate de la genă) (b) TPO (46-66) de șobolan (regiunea peptidică RT2)

FSLGEWKTQTEQSKAQDILGA (SECV.ID.Nr.117);

(c) TPO (163-180) de șobolan (regiune peptidică RT4)

SRTSQLLTLNKFPNRLLD (SECV.ID.Nr.118) (LLD la pozițiile 178-180 este original TSG în resturile aminoacide determinate de la genă).

în continuare, dintre aceste probe de antiser, peptidă anti-RTI și anti-RT2 s-au supus inițial la o cromatografie de coloană proteina A (PROSEP-A; produsă de Biocessing LTD; număr de catalog 8427) pentru prepararea fracțiunilor IgG (2344 mg și respectiv, 1920 mg) și porțiuni de 54mg și 32 mg ale fracțiunilor respective s-au biotinilat prin cuplarea lor cu biotină de tip activ (NHS-LC-Biotin II; produsă de PIERCE, număr de catalog 21336). O probă recombinantă conținând TPO s-a supus la SDS-PAGE și apoi la electroblotting pe membrană PVDF sau nitrocelulozică în același mod cum s-a descris în exemplul 1, și s-a efectuat analiza Western în mod uzual folosind acești anticorpi biotinilați ca anticorpi inițiali.

Astfel, membrana după pătare s-a spălat cu o soluție compusă din Tris-HCI 20 mM și 0,5M NaCI (pH=7,5) (TBS) 5 min și de 2 ori cu Tween 20 0,1% conținând TBS (TTBS) câte 5 min fiecare și apoi, s-a tratat cu un agent de blocare (BlockAce; produsă de

Dainippon Pharmaceutical, număr de catalog uk-B25), timp de 60 min. în continuare, membrana s-a tratat 60 min cu soluție TTBS care conține 10 μg/ml de anticorp peptidic anti-TPO biotinilat, 0,05% BSA și 10% BlockAce și apoi s-a spălat de 2 ori cu TTBB câte 5 min

4250

4255

4260

4265

4270

4275

4280

4285

4290

RO 118299 Β1 fiecare. După aceea, membrana s-a tratat 30 min cu o soluție preparată prin diluarea fosfatazei alcaline marcată avidină (produsă de Leinko Technologies, număr de catalog A108) printr-un factor de 5000 cu soluție TTBS câre conține 10% BlockAce și s-a spălat de 2 ori cu TTBS câte 5 min fiecare și cu TBS 5 min, și apoi dezvoltarea culorii s-a efectuat prin folosirea unui substrat fosfatază alcalină (produsă de Bio-Rad, număr de Catalog 170-6432). Analiza Western descrisă mai sus s-a efectuat la temperatura camerei.

Ca urmare, a fost posibil să recunoască nu numai diverse proteine TPO recombinante de șobolan exprimate în celule COS1 ,cât și diverse proteine TPO umane recombinante exprimate în celule COS1 ,cât și diverse proteine TPO umane recombinante exprimate în celule COS1 și celule E.coli (ilustrativ, plasmid pHTP1- sau plasmid pHTF1 derivate TPO uman exprimate în celule COS1 și produsul N-glicozidic de linkaj clivat al acestora, GST-TPO(1-174) exprimat în E.coli și produsul trambin digerat al acestora și h6T(1-163) care este un TPO de tip mutată exprimat în E.coli, toate au fost descrise în exemple).

în plus, rezultatele au dat de asemenea, posibilitatea analizei acestor tipuri variante de TPO uman recombinant.

în plus, la cele de mai sus s-a confirmat posibilitatea preparării de anticorp peptidici anti-TPO uman. Anticorpii obținuți prin aceste tehnici se pot aplica nu numai la analiză Western ci ,de asemenea, la purificarea TPO prin coloane anticorp adesea folosite ca mijloace imunologice bazate pe anticorp.

S-au selectat (tabelul 4) 6 regiuni din secvență aminoacidă TPO uman prezentate în SECV.ID.Nr.7, care au fost de așteptat să aibă antigenicitate relativ corespunzătoare. S-au sintetizat peptidă de tip antigen peptidic multiplu tetramare (MAP), care corespund respectiv regiunilor. Fiecare peptidă s-a imunizat la 2 iepuri de 8 ori într-o cantitate de 100 mg/fiecare imunizare.

Separat de aceasta s-a sintetizat, de asemenea, o peptidă monomeră în care un rest de cisteină a fost legat la capătul C-al terminusul al fiecărei regiuni peptidice prezentată în tabelul 4. Această peptidă s-a folosit apoi ca un test antigen pentru determinarea unui titru de anticorp folosind imunotest enzimatic. Ca rezultat, creșterea titrului de anticorp s-a confirmat pentru serurile preparate mai sus, astfel, încât aceste săruri s-au folosit ca antiseruri.

Anticorpii s-au preparat prin imunizarea fiecărei peptide antigenice la 2 iepuri pentru a produce antiseruri direcționate împotriva peptidei. Cei doi anticorpi peptidici anti-HT1 sunt denumiți în mod distinct ca anticorpi peptidici anti-HT1-1 și anticorpi peptidici anti-HT1-2 în funcție de iepurele individual.

Un exemplu de purificare, a anticorpilor peptidici anti-HT1-1 se va descrie mai jos.

Inițial 30 mg dintr-o peptidă monomeră HT1 la care a fost legat un rest cisteină s-a cuplat la 12 ml gel de cuplare Sulfo-Link (Pierce, număr de catalog 44895). Pe scurt, o soluție de peptidă care conține antigenul s-a cuplat 15 min la gelul echilibrat cu un tampon de cuplare (Tris 50 mM, EDTA-Na 5mM pH=8,5) de 6 volume relativ la volumul gelului. Apoi, după incubare 30 min gelul s-a spălat cu tamponul de cuplare de 3 voi relativ la volumul gelului. S-a adăugat la gel tampon de cuplare conținând 0,05 M L-cisteină -HCI într-o cantitate de 1 m/1 ml gel pentru blocarea radicalilor nereacționați peste 15 min. După incubare 30 min, gelul s-a spălat cu tamponul de cuplare de 8 voi relativ la volumul gelului. Toate reacțiile de cuplare s-au efectuat la temperatura camerei. Astfel, peptidă s-a legat covalent la gel cu o eficiență a cuplării de 28,3%, și apoi s-a preparat o coloană antigen cu 0,8 mg peptidă/1 ml gel.

S-au aplicat 76,7 ml (conținut de proteină 3620 mg) de antiser conținând anticorpul peptidic anti-HT1-1 care a fost obținut din sânge de la unul dintre iepuri într-o cantitate totală de 78,4 ml, la coloana antigen preechilibrare cu tampon fosfat 50 mM (pH=8) care conține

150 mM NaCI și 0,05% azidă de sodiu și apoi s-a spălat cu aceeași cantitate de tampon

R0118299 Β1 pentru a da 105,9 ml de fracțiune trecută prin conținut de proteină (3680 mg). Apoi, fracțiunea adsorbită s-a eluat cu tampon citrat 0,1 M (pH=3,0) și imediat s-a neutralizat cu 21,1 ml de tampon carbonat 0,1M (pH=9,9) urmat de concentrare prin intermediul ultrafiltrării (folosind membrană Amicon YM 30) pentru a da anticorpul peptidic anti-HT1-1 purificat într-o soluție de tampon fosfat 50 mM (pH=8) care conține 150 mM NaCI și 0,05% NaN₃.

în mod similar, s-au preparat următorii anticorpi: anticorp peptidic anti-HT1-2 (60,0 mg); anticorp peptidic anti-HT2-1 (18,8 mg); anticorp peptidic anti-HT2-2 (8,2 mg); și alții asemenea. De asemenea, ar putea fi preparați în mod similar anticorpi peptidici anti-HT3 până la -HT6.

S-au biotinilat prin cuplare la o biotină activată (Pierce, NHS-LC-Biotin II, număr de catalog 21336)) 3 mg de anticorpi peptidici anti-HT1-1 purificat prin afinitate, anticorp peptidic anti-HT 1 -1, anticorp peptidic anti-HT 1 -2, anticorp peptidic anti-HT2-1 sau anticorp peptidic anti-HT2-2.

Toți anticorpii purificați mai sus s-au dovedit a recunoaște și detecta TPO uman prin analiză Western (pe filtru de nitroceluloză sau PVDF) după SDS-PAGE a unui TPO uman recombinat standard parțial purificat din supernatantul culturii celulelor CHO în care a fost introdusă și exprimată o genă care codifică secvența aminoacidă prezentată în tabelul 4.

Tabelul 4

4345

4350

4355

Secvențe aminoacide TRO umane include în antigenul peptidic tetramer sintetic de tip MAP

4360

Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ	SECV.ID.Nr.119
Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
SLGEWKTQMEETKAQD	SECV.ID.Nr.120
Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
LGTQLPPQGRTTAHKDPNA	SECV.ID.Nr.121
Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
NELPNRTSGLLETNFTASA	SECV.ID.Nr.122
Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
SLPPNLQPGYSPSPTHPPTQQYT	SECV.ID.Nr.123
Regiunea peptidică HT1 TPO uman (aminoacizii numerele 8-28):
PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG	SECV.ID.Nr.124

4365

4370

Exemplul 46. Prepararea coloanei anticorp peptidic anti-TPO

Deoarece, anticorpul peptidic anti-TPO de șobolan obținut în exemplul 45 a fost capabil să recunoască molecule TPO de șobolan și umane, s-au legat fracțiuni imunoglobulinice (IgG) ale anticorpului peptidic anti-RT 1 și ale anticorpului peptidic anti-RT2 la un suport de gel activat chimic în următoarea manieră pentru a prepara coloane de anticorp peptidic anti-TPO. Fiecare dintre cei 2 anticorpi folosit ca material s-a preparat din seruri separate a 2 iepuri. Astfel, anticorpul peptidic anti-RT1 s-a preparat de la 2 iepuri și s-a numit respectiv anticorp peptidic anti-RT1-1 și anticorp peptidic anti-RT1-2, și anticorpul peptidic anti-RT2 preparat de la alți 2 iepuri s-a numit respectiv, anticorp peptidic anti-RT2-1 și anticorp peptidic anti-RT2-2. Deoarece, acești anticorpi s-au folosit separat pentru prepararea coloanei de anticorpi s-a obținut un total de 5 coloane și anume 2 coloane de anticorp

4375

4380

4385

RO 118299 Β1 peptidic anti-RT1 (se vor denumi în continuare, “coloană anticorp anti-RT1-1 și “coloană anticorp anti-RT1-2), 2 coloane de anticorp peptidic anti-RT2 (denumite în continuare ca “coloană anticorp anti-RT2-1 și “coloană anticorp anti-RT2-2) și o coloană de anticorp (coloană de anticorp amestec anti-RT 1 -2 + 2-1) care s-a preparat prin amestecarea anticorpului peptidic anti-RT 1 -2 cu anticorp peptidic anti-RT2-1 și cuplarea amestecului cu un gel.

Fiecare anticorp s-a dizolvat într-o soluție de fosfat de sodiu 50 mM și NaCI 0,15 M (pH=8,0) până la o concentrație finală de 5 mg/ml (sau 2,5 mg/ml din fiecare în mod egal amestecat anticorp peptidic anti-RT1-2 și anticorp peptidic anti-RT2-1 în cazul coloanei de anticorp amestec anti-RT1+2), și o porțiune de 2,31 ml din soluția rezultată s-a amestecat cu 1,54 ml în volum dintr-un gel umflat activat formil (Formyl-Cellulofine, produs de Chisso) și s-a supus 2 h la reacție de cuplare la 4°C. La aceasta s-au adăugat 1,1 ml dintr-o soluție 10 mg/ml dintr-un agent de reducere (trimetilaminoboran (TMAB); produs de Seikagaku Kogyo, număr de catalog 680246), urmată 6 h de reacție suplimentară de cuplare și în continuare, centrifugare pentru recuperarea porțiunii de gel. S-a adăugat o porție de 10 ml apă purificată la porția de gel care s-a recuperat din nou prin centrifugare și moleculele de anticorp nereacționat s-au îndepărtat prin repetarea acestei etape de 4 ori. în continuare, gelul rezultat s-a amestecat cu 4,6 ml de soluție de blocare (fosfat de sodiu 0,2M și etanolamină 1M, pH=7,0) și 1,1 ml soluție de agent reducător și s-a tratat la 4°C, pentru cel puțin 2 h pentru realizarea blocării grupărilor active ale gelului nereacționat. După aceea, gelul s-a spălat cu apă purificată și DPBS folosind o centrifugă, s-a introdus într-o eprubetă coloană mică, s-a spălat cu soluție tiocianat de potasiu 3M și o soluție glicină-HCI 0,1M (pH=2,5) s-a echilibrat cu DPBS și apoi s-a depozitat.

în cele 5 geluri anticorp peptidic anti-TPO ale coloanei anticorp anti-RT1-1, coloană anticorp anti-RT1-2, coloană anticorp anti-RT2-1, coloană anticorp anti-RT2-2 și coloană de anticorp amestec anti-RT1-2 + 2-1, eficiența cuplării fracțiuniilor TgG respctive a atins 97,4%, 95,4%, 98,4%, 98,3% și 99,4%. în plus, cantitățile fracțiunilor IgG cuplate pe volumul de gel au fost 5,6 mg/ml gel, 5,8 mg/ml gel, 5,7 mg gel, 5,7 mg/ml gel și respectiv, 2,9 mg/ml gel. Ca urmare, deoarece s-a confirmat că eficiența cuplării și cantitatea cuplată nu variază semnificativ în funcție de originile anticorpului și diferența din antigeni, s-au realizat experiențele prezentate în exemplul următor 47 utilizând aceste coloane de anticorp.

Exemplul 47. Purificarea TPO derivat din supernatantul culturii obținute prin transfecția celulelor CDS1 cu vectorul de expresie pHTP1 folosind coloana anticorp anti-TPO și apoi cromatografia de coloană în fază inversă și confirmarea activității sale biologice

Ca test in vitro pentru evaluarea următoarelor probe de purificare s-a folosit sistemul test M-07e. Probe parțial purificate derivate TPO din supernatantul culturii obținută în exemplul 35 prin transfectarea celulelor COS1 cu vectorul de expresie pHTP1 (fracțiunile altele decât principala fracțiune TPO, și anume, o fracțiune F1 trecută printr-o fracțiune F3 eluată după F2 prin spălare cu citrat de sodiu 20 mM, pH=5,8 a coloanei Macro-Prep Methyl HIC și fracțiunile F1 și F3 ale coloanei SP Sepharose Bast flow) s-au combinat pentru a prepara o fracțiune subdepozit TPO (5463,79 ml; concentrația proteinei 0,490 mg/ml; proteină totală 2676 mg; activitate relativă 12100 și activitate totală 32380000) și s-a concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultraset, greutatea moleculară nominală de separare 8000, produsă de Filtron), solventul fracțiunii concentrate s-a schimbat cu DPBS și apoi, proba de volum mic s-a tratat cu 1 unitate de ultrafiltrare echipată cu membrană YM-10 (produsă de Amicon) pentru a o aduce în final în 120,2 ml de soluție DPBS care conține 0,05% azidă de sodiu. Apoi, toate cele 5 geluri anticorp specific anti-TPO preparate în exemplul 47 s-au amestecat și s-a făcut o coloană anticorp unică (1,6 cm în diametru și 4,8 cm înălțimea patului la care se va face referire precum coloană amestec anticorp anti-RT1+2), și s-a aplicat fracțiunea subdepozit TPO la coloană la o rată de curgere de 0,033 ml/min. După completarea încărcării probei, s-a efectuat eluația cu DPBS pentru colectarea eluatelor până când absorpția UV a devenit suficient de mică, și eluatele astfel colectate s-au concentrat

RO 118299 Β1

4440 folosind unitatea de ultrafiltrare echipată cu membrană YM-10 (produsă de Amicon) pentru a obține o fracțiune F1 trecută prin (82,62 ml; concentrația proteinei 14,3 mg/ml; proteină totală 1184 mg; activitate relativă 67500 și activitate totală 79900000). în continuare, o fracțiune F2 adsorbită la coloană (92,97 ml; concentrația proteinei 0,12 mg/ml; proteina totală 11,1 mg; activitate relativă 257100 și activitate totală 2860000) s-a eluat cu o soluție de eluare acidă (glicină-HCI 0,1 M, pH=2,5). Cu toate că fracțiunea F1 trecută prin sită a conținut încă o activitate TPO, coloana de anticorp adsorbit TPO s-a purificat în continuare, deoarece ea a prezentat o creștere în activitatea relativă de circa 20 ori. Astfel, folosind 0,1% TFA ca solvent pentru developare B s-a realizat o cromatografie de coloană Capcell Pack CI 300A (produsă de Shiseidp, număr de catalog CI ΤΥΡΕ: SG 300A; 4,6 în diametru și 150 mm înălțimea patului, conectată cu o precoloană de 4,6 mm în diametru și 35 mm înălțimea patului) s-a realizat cromatografie de coloană, prin amestecarea fracțiunii F2 obținută din coloana anticorp cu 1/10 voi din solventul de developare B și aplicarea amestecului la o rată de curgere de 0,4 ml/min la coloana Capcell Pack CI 300A care a fost echilibrată anterior cu 20% B. După completarea încărcării probei s-a efectuat eluție 5 min cu 20% B și apoi 50 min cu un gradient linear de densitate de la 20 până la 40%B, și eluatele s-au colectat în eprubete de polipropilenă în porțiuni de 1 ml (2,5 min).

O porțiune de 2 μΙ (1/500 fracțiune) a eluatului din fiecare eprubetă s-a amestecat cu HSA și s-a concentrat prin ultrafiltrare pentru a obține 0,25 ml de soluție de cultură test a IMDM conținând 0,02% HSA pentru utilizare în identificarea fracțiunilor TPO activ prin test. Ca rezultat, s-a găsit activitate TPO puternică în probele din eprubetele cu numerele 20-23 (în domeniul de 28,5 și 32,5% concentrație de propanol). în plus, când aceste probe s-au supus la analiză Western urmând procedura descrisă în exemplul 45 s-a confirmat prezența TPO care a avut o greutate moleculară aparentă de 60000-70000 când s-a măsurat în stare redusă pe baza markerilor de greutate moleculară DPC III, precum și prezența altor molecule care au greutăți moleculare respectiv de 32000-43000 și 20000-300000.

Exemplul 48. Confirmarea activității biologice a TPO derivată din supematantul culturii obținute prin transfecția celulelor COS1 cu vectorul de expresie pHTP1 și purificat până la etapa coloanei Capcell Pack CI 300A

Fracțiunile TPO active purificate în exemplul 36, și anume, eprubetele cu numerele 20-23 (în domeniul de 28,5 și 32,5% concentrație de propanol) ale coloanei Capcell Pack CI 300 A, s-au strâns, s-au amestecat cu 0,21 ml glicerol și apoi, s-au concentrat prin centrifugare evaporare. Aceasta s-a amestecat cu 0,21 ml de soluție clorhidrat de guanidină 6M, s-a diluat până la un volum de 1 ml cu DPBS, s-a schimbat tamponul cu soluție DPBS care conține 0,01% HSA prin coloană Sephadex G25 (NAP-10 produsă de Pharmacia Biotech număr de catalog 17-0854-01) și apoi s-a amestecat cu 1,1 ml de soluție DPBS care conține 0,01% HSA, prin aceasta obținând în final, o fracțiune FA activă TPO (2,6 ml). în scopul examinării activității biologice TPO a acestei probe, s-a efectuat un test in vivo. Astfel, s-a administrat subcutanat fracțiunea activă la șoareci masculi ICR (în vârstă de 8 săptămâni), fiecare grup incluzând 4 animale, zilnic, timp de 5 zile la o doză de 100 μΙ (având o activitate totală de 110000 măsurată prin sistemul de testare M-07e) per animal. Drept control s-au administrat în același mod 100 μΙ de DPBS conținând 0,01% HSA. Chiar înaintea administrării și în ziua următoare administrării finale s-a colectat sânge din fundul de ochi pentru măsurarea numărului de plachete folosind un numărător microcell (F800, produs de Toalyo Denshi). La grupul tratat TPO, numerele plachetelor au crescut printr-un factor în medie de circa 1,42 după terminarea administrării în comparație cu valoarea dinaintea administrării și au fost de 1,23 ori mai ridicate, decât în cazul grupului de control cu o diferență semnificativă (p mai mic de 0,05, test-t Student) între ele. Pe baza acestor rezultate s-a confirmat că TPO uman menționat anterior produs de către celulele mamifere are capacitatea să crească in vivo numărul de plachete.

4445

4450

4455

4460

4465

4470

4475

4480

4485

RO 118299 Β1

Exemplul 49. Confirmarea activității biologice a fracțiunii TPO brute derivată de la

331 de supernatant de cultură obținut prin transfecția celulelor COS1 cu vectorul de expresie pHTP1 și purificat parțial prin coloană de schimb cationic (1) S-a folosit sistemul testM-07e ca și în testul in vitro pentru evaluarea următoarelor probe de purificare în același mod cum s-a descris în exemplul 36 s-a obținut un total de 331 de supernatant de cultură lipsit de aer prin transfectarea celulelor COS1 cu vectorul de expresie pHTP1 și s-a filtrat printr-un filtru de 0,22 μΜ pentru recuperarea supernatantului. Aceasta s-a concentrat printr-un factor de circa 10 cu o unitate de ultrafiltrare (PLGC pellicon Cassette, greutatea moleculară nominală de separare de 10000, produs de Milliph) și s-a amestecat cu circa 1 mM în concentrație finală de inhibitor proteazic p-APMSF pentru a obține o probă de 2018 ml în volum (concentrația proteinei 3,22 mg/ml; proteină totală 6502 mg; activitate relativă 66000, activitate totală 429100000). în continuare, s-a repetat concentrarea folosind o unitate de ultrafiltrare (Omega Ultraset, greutatea moleculară nominală de separare 30000; produsă de Filtron), prin aceasta obținând o fracțiune de 30000 sau mai mare în greutate moleculară (volum, 1190 ml; concentrația proteinei 2,54 mg/ml; proteină totală 3020 mg; activitate relativă 82500, activitate totală 249000000) și o fracțiune de 30000 sau mai puțin în greutate moleculară (volum 2947 ml; concentrația proteinei 0,471 mg/ml) proteină totală 1402 mg; activitate relativă 4500, activitate totală 6310000). Prezența activității TPO în fracțiunea de 30000 sau mai mică în greutate moleculară indică o posibilitate ca supernatantul culturii să conțină TPO a cărui greutate moleculară s-a redus în timpul expresiei sale sau în secretare din celulele animale. Pe de altă parte, fracțiunea de 30000 sau mai mult în greutate moleculară s-a transferat față de tampon cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=6,1) și s-a aplicat la o rată de curgere de 5 ml/min, la coloană SP Sepharose Fast Flow (2,6 cm în diametru și 29 cm înălțimea patului produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0729-01) care s-a echilibrat înainte cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH= 6,1). După definitivarea încercării probei, coloana s-a spălat și s-a eluat cu citrat de sodiu 20 MM ca tampon (pH=6,1). în continuare, folosind tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=6,1) ca solvent pentru developare A și o soluție compusă din solventul pentru developarea A și NaCI1M ca solvent pentru developare B s-a efectuat eluția la o rată de curgere de 3 ml/min cu un gradient linear de la 0 până la 50% B, timp de 215 min și apoi, de la 50 până la 100% B, 20 min și eluatele s-au colectat în eprubete de polipropilenă în porții de 30 ml (10 min). Când o porțiune a fiecăruia dintre aceste eluate s-a verificat prin sistemul test M-07e pentru examinarea distribuției activității, s-a găsit activitate TPO într-un domeniu larg. Prin urmare, fracțiunile s-au eluat cu NaCI de concentrație 50 mM sau mai mică, inclusiv fracțiunea trecută prin sită, s-au strâns ca o fracțiune F1 și principalele fracțiuni TPO s-au eluat cu NaCI 50-1000 mM ca fracțiune F2. Volumul fracțiunii F1 a fost 1951 ml (concentrația proteinei 2,05 mg/ml; proteina totală 3934 mg; activitatea relativă 13500 și activitatea totală 53900000) și cea a lui F2 a fost 649,8 ml (concentrația proteinei 1,11 mg/ml; proteina totală 721 mg; activitatea relativă 268000 și activitatea totală 193000000).

(2) Confirmarea activității biologice a fracțiunii F2 SP Sepharose Fast Flow

O porțiune de 2,5 ml a fracțiunii F2 SP Sepharose Fast Flow separată în etapa (1) de mai sus s-a schimbat față de tampon cu 3,5 ml soluția DPBS care conține 0,01% HSA prin coloană Sephadex G25 (NAP-25, produsă de Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0852-01) și activitatea biologică TPO a acestei probe (concentrația proteinei 1,46 mg/ml) s-a examinat printr-un test in vivo. Astfel, fracțiunea activă s-a administrat subcutanat la șoareci masculi ICR (în vârsta de 8 săptămâni) fiecare grup incluzând 4 animale, zilnic 5 zile consecutive la o doză de 100 μΙ (având o activitate totală de 123000 măsurată prin sistemul de testare M-07e)/animal. Drept control, s-au administrat subcutanat în același mod 100 μΙ

R0118299 Β1

4540

DPBS conținând 0,01% HSA. Chiar înaintea administrării și în ziua următoare administrării finale s-a selectat sânge din fundul de ochi pentru măsurarea numărului de plachete folosind un numărător microcell (F800, produs de'Toa IY1 Denshi). La grupul la care s-a administrat TPO numărul plachetelor a crescut printr-un factor în medie de circa 1,29 după terminarea administrării în comparație cu valoarea înainte de administrare și au fost de 1,12 ori mai mari decât în grupul de control cu o diferență semnificativă (p mai mic decât 0,05, test-t Student) între ele. Aceste rezultate au demonstrat că TPO umană menționată anterior produsă de către celulele mamifere are capacitatea de a crește numărul plachetelor.

Exemplul 50. Construcția vectorului recombinant pDEF202-ghTPO pentru folosire în expresia DNA cromozomul TPO uman în celule CHO

S-a digerat un vector pDEF202 cu enzimele de restricție Kpnl și Spel și apoi s-a supus la electroforeză în gel de agaroză care conține mini gena DHFR de șoarece și semnalul de poliadenilare SV 40, și s-a obținut vectorul de expresie pDEF202-ghTPO prin ligare, folosind ligază DNA T4 (produsă de Takara Shuzo), fragmentului astfel obținut cu un vector DNA care s-a preparat prin îndepărtarea regiunii conținând semnalul de poliadenilare SV 40 de la un plasmid pEFHGTE prin tratamentul său cu enzimele de restricție Kpnl și Spel. Acest plasmid conține originea replicării SV 40, promotorul 1-a al factorului uman de alungire, regiunea de poliadenilare timpurie SV 40 pentru transcripția genei TPO umane, mini gena DHFR de șoarece, originea replicării pUC18 și gena β-lactamazei (Amp^r) și DNA cromozomal TPO uman s-a conectat la un sit în aval al promotorului 1-a al factorului uman de alungire.

Exemplul 51. Expresia DNA-ului cromozomal TPO uman în celule CHO

S-au crescut celule CHO (o tulpină dorefr'; Urlaub și Chasin, Proc.Natl. Acad. Sci. SUA, vol.77, p. 4216, 1980) prin cultivarea lor într-un mediu esențial α-minim (a-MEM(-), suplimentat cu timidină și hipoxantină) conținând 10% ser bovin fetal folosind o placă de 6 cm în diametru (produsă de Faloon), și celulele rezultate s-au supus transfecției prin intermediul metodei fosfat de calciu (CellPhect, produsă de Pharmacia).

Astfel, 10 μg de plasmid pDEF202-ghTPO preparat în exemplul 50, s-a amestecat cu 120 μΙ tampon A și 120 μΙ H₂O, și amestecul rezultat s-a incubat 10 min la temperatura camerei. Această soluție s-a amestecat ulterior cu 120 μΙ tampon B și s-a incubat la temperatura camerei încă 30 min. Soluția DNA astfel preparată s-a pus în placă și s-a cultivat 6 h într-un incubator cu CO₂. După îndepărtarea mediului și spălarea plăcii rezultate de 2 ori cu a-MEM(-), s-a adăugat la placă a-MEM(-) care conține 10% dimetilsulfoxid și s-a tratat 2 min la temperatura camerei. în continuare, s-a adăugat mediu neselectiv (a-MEM(-)) op.cit., suplimentat cu hipoxantină și timidină) conținând 10% dializat de ser fetal bovin și s-a cultivat zile realizându-se apoi selecția folosind un mediu selectiv (a-MEM(-), lipsit de hipoxantină și timidină) conținând 10% dializat de ser fetal bovin. Selecția s-a efectuat prin tratarea celulelor cu tripsină, împărțirea celulelor tratate dintr-o placă de 6 cm în diametru în 5 plăci de 10 cm în diametru sau 20 de plăci de 24 godeuri și continuarea cultivării celulelor în același timp schimbând mediul de selecție la fiecare 2 zile. Prezența activității TPO uman s-a confirmat în supernatantul culturii din plăcile sau godeurile în care s-a observat proliferarea celulelor când s-a măsurat activitatea TPO uman prin testul Ba/F3.

în această situație transfecția celulelor CHO se poate efectua, de asemenea, prin efectuarea cotransfecției celulelor CHO cu pEFHGTE și pMG1.

Exemplul 52. Construcția vectorului pentru expresia proteinei TPO umane în E.coli (resturile aminoacide ale pozițiilor 1-163) (se va denumi în continuare “hMKT (1-163)) în care un rest Lys și un rest Met s-au adăugat respectiv la pozițiile -1, și -2, și confirmarea expresiei sale în scopul efectuării expresiei unei proteine ale cărei resturi aminoacide poziția 1 și sunt aceleași ca și cele ale proteinei TPO umane (resturile aminoacide ale pozițiilor 1-163), s-a construit un vector pCFM536(hMK (1-163) cunoscut, de asemenea, ca (Met^-2, Lys¹) TPO

4545

4550

4555

4560

4565

4570

4575

4580

4585

RO 118299 Β1 (1-163) pentru folosire în expresia lui hMKT(1-163) în E.coli, în același mod cum s-a descris în exemplul 42 folosind următoarele oligonucleotide sintetice 1-13, 2-13, 3-3 și 4-3:

1- 13:5'- CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAATCTCCTGCACCA-3' (SECV.ID.NR.125)

2- 13: 5'- CAGGTGGTGCAGGAGATTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT - 3' (SECV.ID.NR.126)

3- 3: 5' - CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG - 3' (SECV.ID.NR.127)

4- 3: 5' - CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG - 3 (SECV.ID.NR.128)

1-13 20 30 40

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT

TTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTAGAGGA

Xbal 2-13

60 3-3 70 80

GCACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG CGTGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACGT ACGC ±3 (SECV.ID.NR.129)

Acest plasmid de expresia conține o secvență DNA prezentată în lista secvențelor (SECV.ID.NR.12). După aceea, expresia lui hMKT(1-163) s-a indus în același mod cum s-a descris în exemplul 43.

Când proteina de expresie astfel obținută s-a supus la SDS-PAGE, s-a transferat la o membrană PVDF și apoi s-a supus la analiza secvenței aminoacide N-terminale, s-a confirmat că această proteină conține secvența aminoacidă a lui hMKT(1-163) de exprimat.

Exemplul 53. Redublarea TPO uman, h6T(1-163), derivat de la TPO uman exprimat în E.coli, folosind clorhidrat de guanidină și glutation, purificarea și confirmarea activității sale biologice

O porție de 1,2 g celule înghețate h6T(1-163) care produc tulpina recombinantă preparate în exemplul 43 s-au suspendat în 3 ml apă și s-au distrus folosind un dezintegrator de înaltă presiune. Prin supunerea suspensiei la centrifugare, s-a recuperat fracțiunea precipitată și majoritatea părților proteinelor contaminante, componentele celulare și alteia asemenea, s-au îndepărtat. Fracțiunea precipitată astfel recuperată care conține h6T (1-163) s-a suspendat într-un volum final de 4 ml apă. S-a adăugat o porțiune de 1 ml tampon Tris 1M (pH=8,5) la suspensie cu agitare urmată de adăugarea ulterioară a 20 ml clorhidrat de guanidină 8M și continuată de agitare 5 min la temperatura camerei pentru solubilizarea conținuturilor. Soluția rezultată s-a diluat de 10 ori cu tampon Tris 20 mM (pH=8,5), s-au dizolvat 5 mM glutation de tip redus și 0,5 mM glutation de tip oxidat în soluția diluată cu agitare și apoi, soluția astfel preparată s-a incubat peste noapte la 4°C. Prin centrifugare, s-a recuperat din fluidul supernatant h6T(1 -163). O porțiune de 160 ml a fluidului supernatant astfel obținut s-a concentrat folosind membrană de ultrafiltrare YM10 (produsă de Amicon) și s-a supus la schimb de tampon cu DPBS pentru a obține un volum final de 3,4 ml de fracțiune (concentrația proteinei 2,18 mg/ml). Când această fracțiune s-a dializat complet contra mediului de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan s-a găsit activitate TPO puternică (activitate relativă 58000).

Fracțiunea TPO activă preparată mai sus s-a supus unui test in vivo. Astfel, fracțiunea activă s-a administrat subcutanat la șoarecii masculi ICR (în vârstă de 7 săptămâni), fiecare grup incluzând 4 animale zilnic, 5 zile consecutive cu o doză de 170 μΙ (având o activitate totală 22000 măsurate prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan per animal). Drept

RO 118299 Β1 control s-au administrat 170 μΙ de DPBS la fiecare dintre cele 6 animale ale grupului de control în același mod. Chiar înaintea administrării și în ziua următoare definitivării administrării, precum și 3 zile după aceasta s-a colectat sânge din fundul de ochi pentru a măsura numărul plachetelor folosind un numărător microcell (F800, produs de Toa lyo Denchi).

La grupul la care s-a administrat TPO, numărul plachetelor a crescut printr-un factor în medie de circa 2,15 pe ziua următoare definitivării administrării comparativ cu valoarea dinaintea administrării și un astfel de efect s-a păstrat neschimbat chiar după 3 zile de la terminarea administrării prezentând o valoare de 2,13 ori mai ridicată. Numărul plachetelor în ziua imediat după terminarea administrării și la 3 zile după aceasta a fost de 1,73 și respectiv, de 1,80 ori mai ridicat la grupul tratat TPO decât la grupul de control cu o diferență semnificativă (p mai mic de 0,001, test-t Student) între acestea. Aceste rezultate au demonstrat că TPO uman produs de E.coli și preparat prin metoda de mai sus are capacitatea să crească in vivo numărul plachetelor.

Exemplul 54. Redublarea TPO uman, h6T(1-163) exprimată în E.coli folosind sarcozinat N-lauroil de sodiu și sulfat de cupru, purificarea și confirmarea activității sale biologice

O porțiune de 0,6 g de celule înghețate de H6T (1-163) care produc tulpina recombinantă preparată în exemplul 43, s-au suspendat în 3 ml de apă, s-au distrus folosind un dezintegrator de presiune ridicată și apoi, s-a supus la centrifugare pentru recuperarea fracțiuniii precipitate. După suspendarea fracțiunii precipitate în 3,1 ml apă, s-au adăugat la suspensie cu agitare 0,19 ml de tampon Tris 1M (pH=9,2), 11,25 μΙ DTT 1M, 38 μΙ EDTA 0,5 M și 0,38 ml soluție 10% deoxicolat de sodiu și amestecul rezultat s-a agitat la temperatura camerei, timp de 40 min. Acesta, s-a supus apoi la centrifugare pentru recuperarea fracțiunii precipitate și îndepărtarea celei mai mari părți a proteinelor contaminante, componentelor celulare și altora asemenea. Precipitatul rezultat s-a suspendat în 4 ml apă și s-a supus la centrifugare pentru recuperarea fracțiunii precipitate care conține h6T (1-163). Fracțiunea precipitată astfel recuperată s-a suspendat în 3,8 ml apă și la suspensie s-au adăugat cu agitare 0,2 ml tampon Tris 1M (pH=8) și 1 ml de sarcozinat N-lauroil de sodiu 10% urmat de 20 min de agitare la temperatura camerei pentru solidificarea conținuturilor.

Soluția rezultată s-a amestecat cu 5 μΙ de sulfat de cupru 1 % și s-a agitat peste noapte (circa 20 h) la temperatura camerei. Soluția rezultată s-a supus centrifugării pentru recuperarea fracțiunii supematante care conține h6T(1-163), și o porțiune de 5 ml a supernatantului s-a amestecat cu 5 ml apă și 10 ml tampon Tris 20 mM (pH= 7,7) și apoi cu 2,6 g rășină schimbătoare de ioni sub formă de clorură Dowex 1 -x4 de 20-50 mesh, urmată de agitare 90 min. Rășina schimbătoare de ioni s-a îndepărtat folosind un filtru de sticlă pentru recuperarea fracțiunii neadsorbite la rășină care în continuare s-a supus centrifugării pentru recuperarea fluidului supernatant. Fluidul supernatant astfel obținut s-a aplicat la o coloană de schimb cationic SP Sepharose Fast flow care a fost echilibrată înainte cu tampon Tris 20 mM (pH=7,7) și s-a eluat cu același tampon printr-un gradient linear de la 0-500 mM NaCI. Când fiecare dintre fracțiunile eluate ale cromatografiei de coloană de schimb cationic SP Sepharose Fast flow s-a dializat complet contra mediului de cultură IMDM și s-a evaluat prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan, s-a găsit activitate TPO puternică (activitate relativă 19000000) într-o fracțiune eluată cu o centrație NaCI de circa 100 mM). Această fracțiune s-a concentrat de 1,6 ori (2,5 ml concentrația proteinei 25 μg/ml) folosind o unitate de ultrafiltrare (Ultra Free CL, cu greutatea nominală de separare de 5000 produsă de Milliph, număr de catalog UFC4LCC25). Când fracțiunea astfel concentrată s-a analizat prin SDS-PAGE în prezența unui agent reducător s-a detectat o bandă corespunzătoare la TPO ca bandă principală (puritate 70-80%).

Fracțiunea activă TPO preparată prin procedura de mai sus s-a examinat printr-un test in vivo. Astfel, fracțiunea activă s-a administrat subcutanat la șoareci masculi ICR (în vârstă de 8 săptămâni), fiecare grup incluzând 4 animale, zilnic 5 zile consecutive la o doză

4640

4645

4650

4655

4660

4665

4670

4675

4680

4685

RO 118299 Β1 de 100 μΙ (având o activitate totală de 47500 măsurată prin sistemul de testare CFU-MK de șobolan Iper animal. Drept control s-au administrat subcutanat în același mod 100 μΙ de tampon Tris 20 mM (pH=7,7) conținând NaCI'100 mM. Chiar înaintea administrării și în ziua următoare terminării administrării s-au colectat probe de sânge din fund de ochi pentru măsurarea numărului de plachete folosind un numărător microcell (F800, produs de Toa lyo Denshi). La grupul la care s-a administrat TPO numărul plachetelor a crescut printr-un factor în medie cu circa 1,73 după terminarea administrării comparativ cu numărul dinaintea administrării și a fost de 1,59 ori mai ridicat decât în grupul de control cu o diferență semnificativă (p mai mic decât 0,01, test-t Student) între ele. Aceste rezultate au demonstrat că TPO uman produsă de E.coli și preparată prin procedura de mai sus are capacitatea să crească in vivo numărul de plachete.

Exemplul 55. Cultura pe scară mare a celulelor CHO

Cultivarea pe scară largă a liniei celulare CHO care produce TPO uman (celulă CHO 28-30, rezistentă la MTX 25 nM) care a fost obținută prin transfectarea plasmidului de expresie a TPO uman, pDEF202-hTPO-P1 în celule CHO la exemplul 32 s-a realizat după cum urmează. Linia celulară CHD s-a cultivat și a proliferat în mediul de cultură DMEM/F-12 (GIBCO) care conține 25 nM MTX și 10% FCS.După detașarea celulelor cu soluție de tripsină, s-au inoculat 1 x 10⁷ celule în baloane rotative (de exemplu, Falcon, Falcon 3000) care conțin 200 ml din același mediu în care au fost apoi cultivate la 37°C, la o viteză de rotire de 1 rpm, timp de 3 zile. După 3 zile de cultură, supernatantul culturii s-a îndepărtat prin secțiune și celulele CHO aderente s-au spălat apoi cu 100 ml PBS. La sticlă s-au adăugat 200 ml mediu DMEM/F12 (GIBCO) care nu conține nici 20 nMMTX și nici 10% FCS și celulele s-au cultivat la 37°C, la o viteză de rotire de 1 rpm ,7 zile. După 7 zile de cultură, s-a recuperat supernatantul culturii ca materie primă pentru procedura de purificare următoare. Procedurile menționate mai sus s-au efectuat în 500 baloane rotative pentru a obține 1001 supernatant de cultură.

Exemplul 56. Purificarea TPO uman de la linia de celule CHOproducătoare de CHO uman

Circa 1001 de supernatant de cultură lipsit de ser obținuți în exemplul 55, s-au filtrat printr-un filtru de 0,22 μπι pentru a obține filtratul său care apoi s-a concentrat pe o unitate de ultrafiltrare (PLTK Pallicon cassette, greutatea moleculară nominală de separare 30000, produs de Milliph). După înlocuirea solventului concentratului cu apă pură s-au adăugat inhibitori de proteinază pAPMSF (Wako Pure Chemicals) și Efabloc SC (Merck), la soluția apoasă rezultantă la concentrații finale de 1 mM și, respectiv, 0,35 mM pentru a obține 3628 ml de fracțiune de greutate moleculară 30000 sau mai mare (concentrația proteinei 1,60 mg/ml; proteine totală 5805 mg; activitatea relativă 1230000, activitatea totală 7149000000). în continuare, fracțiunea s-a supus la analiză Western blot așa cum s-a descris în exemplul 45. Ca rezultat, s-a constatat prezența proteinei TPO la o greutate moleculară în domeniul dintre 66000 și 100000. La examinarea mai amănunțită s-a constatat că în fracțiunea trecută prin sită sunt conținute tipuri TPO de greutate moleculară mai mică decât TPO de mai sus.

Ultrafiltratul care a conținut TPO cu greutate moleculară nu mai mare de 30000 s-a concentrat separat folosind o unitate de ultrafiltrare (PLGC Pellicon cassette, greutatea moleculară nominală de separare 10000, Milliph), pentru a obține 1901 ml fracțiune TPO de greutate moleculară scăzută (concentrația proteinei 0,36 mg/ml; proteina totală 684 mg; activitate relativă 245500; activitate totală 167900000). Aceasta a arătat că specii de TPO cu greutate moleculară scăzută au fost generate în timpul culturii celulare.

în continuare, la 3614 ml de fracțiunea care conține TPO având o greutate moleculară de 30000 sau mai mare s-au adăugat 764 g de sulfat de amoniu și 144,5 ml tampon citrat de sodiu 0,5 M (pH=5,5) pentru a obține 4089 ml soluție conținând 1,41 M

RO 118299 Β1 (concentrație finală) sulfat de amoniu și 17,7 mM (concentrație finală) de tampon citrat de sodiu. După ce substanțele insolubile s-au îndepărtat din soluție prin centrifugare s-a obținut o soluție limpede.

Această soluție limpede s-a aplicat apoi la coloană Macro-Prep Methyl HIC (Bio-Rad, număr de catalog 156-0080; diametru 5 cm, înălțimea patului 24,5 cm) care a fost echilibrată anterior cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,5) care conține 1,2M sulfat de amoniu la o rată de curgere de 25 ml/min. După completarea acesteia, s-a realizat eluția cu tampon citrat de sodiu (pH=5,5) care conține 1,2 M sulfat de amoniu. Fracțiunea eluată s-a concentrat în continuare pe o unitate de ultrafiltrare (de exemplu, Filtron, Omega Ultrasette, greutatea moleculară nominală de separare 8000) pentru obținerea unei fracțiunea F1 trecută prin (4455 ml; concentrația proteinei 0,400 mg/ml; proteină totală 1780 mg: activitate relativă 1831000).

în continuare, s-a trecut prin coloană citrat de sodiu 20 mM (pH=6,0) ca un tampon de eluție pentru a obține un eluat care apoi s-a concentrat folosind aceeași unitate de ultrafiltrare (adică, Omega Ultrasette, greutatea moleculară nominală de separare 8000) pentru colectarea unei fracțiuni F2 /1457 ml; concentrația proteinei 0,969 mg/ml; proteină totală 1411 mg; activitate relativă 1715000). Prezența unei proteine care are o greutate moleculară de la 66000 la 100000 în F2 s-a confirmat pe SDS-PAGE. Ca rezultat al analizei Western, s-a dovedit că proteina a fost TPO.

în continuare, F2 eluat din coloana Macro-Prep Methyl HIC (1443 ml) s-a aplicat la SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0729-01; diametru 5 cm, înălțimea patului 12 cm) care a fost anterior echilibrată cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=6,0) la o rată de curgere de 15 ml/min. După terminarea acesteia eluția s-a efectuat cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=6,0) care conține 50 mM NaCI. Eluatul s-a colectat și s-a numit fracțiune F1 (3007 ml; concentrația proteinei 0,226 mg/ml; proteină totală 679 mg; activitate relativă 88 B30). După aceasta tamponul de eluție s-a înlocuit cu tampon citrat de sodiu 20 mM (pH=5,4) conținând 750 mM NaCI pentru a colecta fracțiunea eluată F2 (931 ml) concentrația proteinei 0,763 mg/ml; proteină totală 710 ml; activitate relativă 5558000) care apoi s-a concentrat la 202 ml folosind unități de ultrafiltrare (Filtron, Omega Ultrasette, greutatea moleculară nominală de separare 8000; și Amicon, membrană YM3).

în continuare, fracțiunea F2 concentrată care conține activitate TPO (197 ml) s-a aplicat la o coloană de filtrare în gel Sephacryl S-200HR (Pharmacia biotech, număr de catalog 17-0584-05; diametru 7,5 cm, înălțimea patului 100 cm) la o rată de curgere de 3 ml/min.

S-au colectat separat volume de eluție 1200-1785 ml, 1785-2010 ml, 2010-2280 ml și 22803000 ml, pentru a obține fracțiunile F1 (585 ml; concentrația proteinei 1,00 mg/ml; proteină totală 589 mg; activitate relativă 4118000), F2 (225 ml; concentrația proteinei 0,263 mg/ml; proteina totală 59,2 mg; activitate relativă 2509000), F3(270 ml; concentrația proteinei 0,119 mg/ml, proteină totală 32,1 mg, activitate relativă 2535000) și F4 (720 ml; concentrația proteinei 0,0467 mg/ml; proteină totală 33,6 mg; activitate relativă 1155000). Astfel, activitatea TPO fracționată a avut un domeniu larg de greutate moleculară așa cum s-a determinat prin filtrare în gel. După SDS-PAGE al fracțiunilor urmată de analiză Western blot s-a găsit că F1 are un tip de molculă TPO cu o greutate moleculară predominantă de la 66000 la 1000000; F2 o specie de moleculă TPO cu o greutate moleculară de 32000 până la 60000; și F3 o specie TPO cu o greutate moleculară de 32000 până la 42000. Toate moleculele TPO au posedat activitate TPO.

Pe baza rezultatelor secvențării aminoacide N-terminală a moleculei TPO care are o greutate moleculară de 66000 până la 100000 noi am confirmat că molecula TPO are secvența aminoacidă a unei proteine codificate de o genă TPO umană.

4735

4740

4745

4750

4755

4760

4765

4770

4775

4780

RO 118299 Β1 în plus, molecula TPO care are o greutate moleculară 66000-100000, s-a supus la experimente de digestie enzimatică folosind enzimele glicozidazice constând din N-glicanază (enzime, număr de catalog 1472-00), endo-â-N-acetilgalactozaminidază (Seikagaku Kogyo, număr de catalog 100453) și o-glicozidază (Boehdringer-Mannheim Biochimica, număr de catalog 1347101) singura sau în combinație și apoi, la analize SDS-PAGE. Ca rezultat, porțiunea polipeptidică a TPO s-a dovedit a avea o greutate moleculară de circa 36000 așa cum s-a așteptat plecând de la greutatea sa moleculară tehnică și să fie o glicoproteină cu ambele N- și O-legate la catene de zahăr.

Exemplul 57. Purificarea TPO uman de la linia celulară CHO producătoare de TPO uman

La 1 Ide supernatant de cultură fără ser al celulelor CHO obținute în același mod ca în exemplul 55, s-au adăugat 211,4 g sulfat de amoniu, după care amestecul s-a filtrat printr-un filtru de 0,2 μπι (de exemplu, Gelman Science, număr de catalog 12992). Filtratul obținut s-a aplicat la coloană Macro-Prep Methyl HIC (Bio-Rad, număr de catalog 156-0081, diametru 50 mm, înălțimea patului 80 mm) care a fost echilibrat anterior cu tampon acetat de sodiu 20 mM (pH=5,6) care conține 1,2 M sulfat de amoniu la o rată de curgere de 15 ml/min. După terminarea acesteia s-a efectuat eluția cu 450 ml tampon acetat de sodiu 20 mM (pH=5,6) conținând 1,2 M sulfat de amoniu. Fracțiunea eluată s-a aplicat apoi la o coloană fază inversă VydacC4 (The Separations Group, număr de catalog 214BTP54, diametru 4,6 mm, înălțimea patului 250 mm) la o rată de curgere de 0,75 ml/min. După ce coloana s-a spălat, cu tampon Tris 10 mM (pH=6,4) care conține 5% etanol (cunoscut ca “solvent pentru developare A”), timp de 15 min s-a efectuat eluția cu gradient linear de 66 min de la solventul de developare A până la tampon Tris 10 mM (pH=6,4) care conține 94% etanol (cunoscut ca “solvent pentru developare B”). Cromatograma obținută este prezentată în fig.15. Ca rezultat al analizei SDS-PAGE, a apărut ca o bandă unică de geluri SDS-PAGE (fig.16) molecula care are o greutate moleculară 65000-100000 care s-a așteptat să fie TPO și care corespunde fracțiunii timpului de retenție de 68-72 min după adăugarea probei. Analiza Western ulterioară a dovedit că proteina obținută este TPO.

Analiza aminoacidă N-terminală a probei de proteină a arătat că proteina a avut secvența aminoacidă a proteinei codificată de gena TPO umană.

Exemplul 58. Prepararea virusului recombinant pentru expresia TPO umană în celule de insectă

Plasmidul pHTP1 preparat în exemplul 30 s-a digerat cu enzimele de restricție EcoRI și Notl și apoi s-a supus electroforezei în gel de agaroză 1 % pentru a obține o bandă de circa 1200 bp care în continuare s-a purificat folosind kit-ul de purificare DNA Prep-A-Gene. DNA-ul purificat s-a ligat apoi la un vector de transfer pVL1393 (Invitrogen) pretratat cu aceleași enzime de restricție, urmat de transformare în E.coli DHS înalt competente (toyo boseki). Dintre coloniile obținute s-a selectat o clonă PVL1393/hTPO care conține o regiune de codificare de lungime integrală a cDNA TPO uman. Plasmidul DNA s-a preparat apoi de la clonă prin metoda descrisă în Molecular Cloning (Sambrook ș/ colab., Cols Spring Harbor Laboratory Press, 1989) urmat de transfecție în celule de insectă Sf 21 (Invitrogen) folosind kit-ul de transfecție Baculogold™ (Farmingen), și celulele transfectate s-au cultivat în mediul Sf-900 (Lifetechnology) la 27°C, timp de 4 zile pentru recuperarea supernatantului care conține virusul. Supernatantul s-a diluat apoi până la 1:10⁹ 1:10⁵ și circa 7 x1ο⁵ celule Sf21 s-au infectat cu 1 ml supernatant diluat la 27°C, timp de o oră într-o lamelă de 35 mm (în diametru). După îndepărtarea supernatantului, s-a plasat în mediul de cultură Df-900 1% agaroză fierbinte, s-a lăsat cultura să se solidifice, apoi s-a cultivat 6 zile la 27°C, în atmosferă umezită. S-a cules o singură placă formată din care virusul s-a eliberat în 200 μΙ mediu Sf-900. S-au infectat celulele Sf21 cu clona virală obținută într-o placă cu 24 godeuri pentru

R0118299 Β1

4835 proliferarea virusului. O porțiune a lichidului care conține virus din placa unică s-a tratat cu fenol/cloroform urmată de precipitare cu etanol pentru recuperarea ADN-ului viral care s-a folosit apoi ca matriță pentru efectuarea PCR folosind primeri specifici pentru cDNA TPO uman. S-a selectat virusul recombinant care conține cDNA TPO uman pe baza amplificării fragmentului DNA specific. Apoi, celule Sf21 s-au infectat cu supernatantul care conține virusul recombinant purtător de cDNA TPO pentru proliferarea virusului.

Exemplul 59. Expresia TPO uman în celule de insectă Sf21 și identificarea activității TPO

S-au cultivat celule Sf21 într-un balon de cultură de 175 cm² până s-a atins circa 80% confluență, urmat de infectare cu virusul recombinant purtător a cDNA TPO uman preparat în exemplul 58, la 27°C, o oră, după care celulele obținute s-au cultivat în mediul Sf-900 ,la 27°C, 4 zile pentru recuperarea supernatantului culturii. Supernatantul de cultură obținut s-a înlocuit prin mediul de cultură IMDM pe coloană NAP™-5 (Pharmacia). S-a detectat activitate TPO semnificativă în supernatantele rezultate în mod dependent de doză, atât în test CFU-MK șobolan, cât și M-07e. De asemenea, TPO uman recombinant exprimat în celule SF21 s-a identificat prin intermediul analizei Western așa cum s-a descris în exemplul 45.

Exemplul 60. Redublarea TPO uman variat, h6T (1-163) derivat de la dona pCFM 536/h6T(1-163) care poartă o secvență de bază TPO uman pe calea expresiei sale în E.coli prin folosirea sarcozinat N-lauroil de sodiu și sulfatului cupric și purificarea lui h6T (1-163)

Din microorganismul recombinant producător de h6T(1-163) preparat în exemplul 43 s-au suspendat 30 g în 300 ml apă, s-au distrus într-un aparat de presiune ridicată (10000 psi, Rannie High Pressure Laboratory), și apoi s-au centrifugat pentru recuperarea unei fracțiuni sedimentate. Fracțiunea sedimentată s-a suspendat în 90 ml apă la care s-a adăugat apoi cu agitare apă până la cantitatea totală de 150 ml. în continuare, la amestec s-a adăugat 9 ml de tampon Tris 1M (pH=9,2), 540 μΙ DTT1M, 1,8 ml EDTA 0,5 M și 18 ml acid deoxicolic de sodiu 10% cu agitare urmat de agitare 30 min la temperatura camerei. Fracțiunea sedimentată s-a recuperat prin centrifugare și s-au îndepărtat majoritatea proteinelor contaminante și componentele microorganismului. La sediment s-au adăugat 180 ml DTT 5 mM pentru obținerea unei suspensii care apoi s-a centrifugat pentru recuperarea sedimentului fracțiunii care conține h6T (1-163). La sedimentul rezultat s-au adăugat 300 ml apă pentru obținerea unei suspensii la care s-a adăugat apoi apă cu agitare până la cantitatea de lichid de 570 ml.

S-au adăugat 30 ml tampon Tris 1M (pH=8), 150 ml sarcozinat N-lauroil de sodiu 10% amestecului la temperatura camerei cu 20 min agitare în scopul solubilizării h6T(1-163). La aceasta s-au adăugat ulterior 750 μΙ sulfat cupric 1% și amestecul s-a agitat peste noapte (circa 20 h) la temperatura camerei. După ce s-a recuperat prin centrifugare fracțiunea supernatantă care conține h6T (1-163) la 750 ml de supernatant s-au adăugat 750 ml apă și 150 ml tampon Tris 20 mM (pH=7,7) urmat de adăugarea cu agitare a 3 ml de polisorbat 80 (Nikko Chemicals). La soluția obținută s-au adăugat 600 g de rășină schimbătoare de ioni Dowex 1-X4/20-50 mesh, formă de clorură) urmată de agitare 90 min la temperatura camerei. Urmând recuperararea fracțiunii neadsorbite folosind un filtru de sticlă, rășina schimbătoare de ioni s-a spălat cu 750 ml de tampon Tris 20 mM (pH=7,7). Soluția combinată a fracțiunii neadsorbite și a fracțiunii spălate s-a adus la pH=9,2 cu hidroxid de sodiu 2N după care s-a aplicat la coloană schimbătoare de anioni Q Sepharose Fast Flow (ID 5 cm x 10 cm) echilibrată cu tampon Tris 20 mM (pH=9,2) care conține 0,1% polisorbat 80 pentru recuperarea unei fracțiuni neadsorbite. S-a corectat pH-ul fracțiunii neadsorbite obținute la 7,2 cu acid clorhidric, s-a aplicat la coloană de schimb cationic SPSepharose fast Flow (ID 5 cm x10 cm) echilibrată cu tampon Tris 20 M (pH=7,2) care conține 0,1% polisorbat 80, și apoi s-a eluat cu gradient linear de la OM până la 500 mM NaCI în același tampon.

4840

4845

4850

4855

4860

4865

4870

4875

4880

RO 118299 Β1

Fracțiunile eluate s-au supus analizei SDS-PAGE pentru colectarea unei fracțiuni TPO la care s-a adăugat apoi acid trifluoracetic până la o concentrație de 0,1 %. După ce soluția obținută s-a aplicat la coloană Capcell Pack 5 μηι 300A CI (ID 2,1 cm x 5 cm x 2, și Shieido), s-a efectuat HPLC în fază inversă prin metoda eluției în gradient linear crescând concentrația 1-propanol în acid trifluoracetic 0,1%. Eluatul s-a analizat pe SDS-Page în absența agentului reducător. Ca urmare, s-au fracționat 3 fracțiuni pe baza poziției eluției în HPLC fază inversă, dintre care fiecare fracțiune s-a diluat de 3 ori cu acid trifluoracetic 0,1%. Fiecare fracțiune diluată s-a aplicat în același mod la coloana HPLC în fază inversă de mai sus. Cele 3 fracțiuni TPO rezultate care s-a desemnat Fr.S-a, Fr.S-b și Fr.S-c în funcție de ordinea eluției pe HPLC în fază inversă (fig.17) s-au analizat pe SDS-PAGE în absența unui agent reducător. Ca rezultat, s-a detectat o singură bandă la o greutate moleculară de circa 18 kDa (Fr.S-a), circa 19 kDa (Fr.S-b) sau 18 kDa (Fr.S-c) (fig.18). După analizele lor aminoacide, fiecare compoziție aminoacidă determinată a fost aproape consecventă cu valoarea teoretică corespunzătoare estimată din informația secvenței. Suplimentar, rezultatele analizei aminoacide N-terminale au arătat că ele au fost secvențele așteptate. Cantitatea proteinei fiecărei fracțiuni determinate prin analiza aminoacidă a fost 0,64 mg (Fr.S-a), 1,81 mg (Fr.S-b) sau 3,49 mg (Fr.S-c). După dializa totală a fiecărei fracțiuni contra mediu IMDM s-au efectuat teste M-07e. Ca rezultat, activitatea relativă TPO a fiecărei fracțiuni a fost de circa 1620000 (Fr.S-a), 23600000 (Fr.S-b), sau 746000000 (Fr.S-c).

Exemplul 61. Redublarea variantului TPO uman, h6T(1-163) derivat de la clona pCFM536/h6T care poartă o secvență de bază TPO umană pe calea expresiei sale folosind clorhidrat de guanidină și cistein-cistină și purificarea lui h6T(1-163)

Din microorganismul recombinant înghețat care produce h6T (1-163) preparat în exemplul 43 s-au adăugat 50 g la 500 ml apă și s-au suspendat, s-au distrus folosind un aparat de distrugere de înaltă presiune (1000 psi, Rannie High Pressure Laboratory), și apoi s-a centrifugat pentru recuperarea unei fracțiuni sedimentate. Fracțiunea sedimentată s-a suspendat în apă și cantitatea sa de lichid s-a ajustat apoi la 250 ml prin adăugare de apă cu agitare. După aceea, la aceasta s-au adăugat 15 ml tampon Tris 1M (pH=9,2), 900 pl DTT1M, 3 ml EDTA 0,5M și 30 ml acid deoxicolic de sodiu 10% și s-au agitat la temperatura camerei, 30 min. După centrifugare, fracțiunea sedimentată s-a recuperat în același timp îndepărtând majoritatea proteinelor contaminante, componentele microorganismului și altele asemenea. La sediment s-au adăugat 300 ml DTT 5 mM și s-au suspendat, după care fracțiunea sedimentată conținând h6T (1 -163) s-a recuperat prin intermediul centrifugării. Fracțiunea sedimentată recuperată conținând h6T (1163) s-a suspendat în apă într-un volum total de 104 ml. La suspensie s-au adăugat 20 ml tampon Tris 1M (pH=8,5) și apoi 377 ml clorhidrat de guanidină 8M cu agitare și în continuare s-a agitat la temperatura camerei 10 min în scopul solubilizării h6T (1-163). La aceasta s-au adăugat 2500 ml tampon Tris 20 mM (pH=8,5) care conțin 0,1% polisorbat 80 și apoi 2000 ml tampon Tris 20 mM (pH=8,5) conținând clorhidrat de guanidină 1M cu agitare urmată de adăugarea de cisteină 5 mM și cistină 0,5 mM. Soluția astfel obținută s-a incubat peste noapte la 4°C, și apoi s-a centrifugat pentru recuperarea h6T (1-163) din supernatant care apoi s-a concentrat folosind cartuș Prep Scale UF membrană de ultrafiltrare PLDC (Millipoh). S-a înlocuit tamponul concentratului prin tampon Tris 20 mM (pH=9,2) conținând 0,1% polisorbat 80 până la atingerea unui volum final de 1000 ml. Soluția obținută s-a aplicat la coloană de schimb anionic Q Sepharose Fast Flow (ID 5 cm x 10 cm) echilibrată cu tampon Tris 20 mM (pH=9,2) conținând 0,1% polisorbat 80, și apoi s-a eluat cu un gradient linear de la 0 M la 500 mM NaCI în același tampon, prin care fracțiunea (240 ml) eluată la circa 20 mM - circa 150 mM NaCI s-a recuperat. Fracțiunea rezultantă s-a diluat de 4 ori cu tampon Tris 20 mM (pH=7,2) pentru a atinge un volum total de 960 ml, și apoi s-a ajustat pH-ul la 7,2 cu acid acetic, s-a

RO 118299 Β1

4930 aplicat la coloană de schimb cationic SP Sepharose Fast Flow /ID 5 cm x 10 cm) echilibrată cu tampon Tris 20 mM (pH=7,2) conținând polisorbat 80 0,1% și apoi s-a eluat cu un gradient linear de la 0 m la 500 mM NaCI în același tampon. Eluatul s-a analizat pe SDS-PAGE pentru colectarea unei fracțiuni TPO. La fracțiunea TPO s-a adăugat acid trifluoroacetic până la volumul său final de 0,1%. Soluția rezultată s-a aplicat la coloană Capcell Pack 5 μΜ 300A CI (ID 2,1 cm x 5 cm x 2, Shiseido) și în continuare, s-a efectuat HPLC în fază inversă prin metoda eluției gradientului linear crescând concentrația 1-propanolului în acid trifluoracetic 0,1%. Eluatul s-a analizat prin SDS-PAGE în absența unui agent reducător și s-a fracționat în 2 fracțiuni, în funcție de poziția eluată în HPLC în fază inversă. Cele 2 fracțiuni TPO s-au desemnat ca Fr.G-a și Fr.G-d pe baza ordinii în care ele au eluat în HPLC în fază inversă (Fig.17). Fiecare fracțiune s-a analizat apoi pe SDS-PAGE în absența unui agent reducător. Ca rezultat, s-au detectat câte o singură bandă la o greutate moleculară de circa 18 kDa (Fr.G-a) sau circa 32 kDa (Fr.G-d) (Fig.18). Mai mult decât atât, analiza SDS-PAGE a fracțiunilor de mai sus în prezența unui agent reducător a arătat că în ambele fracțiuni s-a detectat o singură bandă la o greutate moleculară de circa 20 kDa. Rezultatul analizei aminoacide a arătat că fiecare dintre compozițiile aminoacide ale acestora a fost aproape în întregime consistentă cu valoarea teoretică corespunzătoare exprimată din informația secvenței. în plus, rezultatele analizei aminoacide N-terminale au arătat că ele au fost secvențele așteptate. Cantitatea proteinei fiecărei fracțiuni determinată din rezultatele analizei aminoacide a fost 2,56 mg (Fr.G-a) sau 1,16 mg (Fr.G-d). Dializa integrală a fiecărei fracțiuni s-a efectuat în continuare, contra mediu IMDM și apoi s-a efectuat testul M-07e. Ca rezultat, fracțiunea a avut activitate TPO relativă de circa 3960000 (Fr.G-a) sau de circa 7760000 (Fr.G-d).

Exemplul 62. Construcția vectoruluirecombinantpDEF202-hTP0163pentru expresia unei TPO umane de lungime parțială (aminoacizii 1-163) (denumită în continuare; hTPO 163“) în celule CHO

Vectorul pDEF202 construit în exemplul 31, s-a tratat cu enzime de restricție EcoRI și Spel urmat de recuperarea unui fragment mai mare de vector folosind electroforeza în gel de agaroză. Fragmentul s-a ligat prin ligază DNA T4 (Takara Shuzo) cu un cDNA hTP0163 care a fost preparat prin tratarea unui plasmid pEF18S-hTPO163 care conține cDNA hTPO 163 care codifică aminoacizii -21 la 163 (SECV.ID.Nr.13) cu enzime de restricție EcoRI și Spel pentru a da un vector de expresie pDEF202-hTPO163. Acest plasmid a conținut o origine a replicării lui SV40, un promotor 1-a al factorului uman de alungire, un sitde poliadenilare timpurie SV40, o mini genă DHFR murină, o origine a replicării lui pUCl8 și o genă β -lactamază (Amp^r), în care cDNA hTPO163 este legat la un sit în aval-ul promotorului 1-a al factorului uman de alungire.

Exemplului 63. Expresia lui hTPO 163 în celule CHO

O linie celulară CHO (tulpină dhfr, Urlaub și Chasin, Proc.Natl.Acad.Sci.SUA, 77, p4216,1980) s-a crescut în mediul esențial α-minim (a-MEM(-) cu timidină și hipoxantină) care conține 10% ser bovin fetal în disc de 6 cm (Falcon) și apoi s-a transformat cu un plasmid pDEF202-hTPO163 prin metoda transfectumului (Seikagaku Kogyo K.K.).

Pe scurt, 10 ^g plasmid pDEF202-hTO163 preparat în exemplul 62, s-a amestecat cu 240 μ\ de NaCI 0,3 M apoi cu un amestec de 20 μ\ transfectum și 220 μ\ H₂O. Această soluție DNA s-a adăugat în picătură la disc urmată de cultură 6 h într-un incubator cu CO₂. S-a îndepărtat mediul de la disc care apoi s-a spălat de 2 ori cu a-MEM(-) urmată de adăugarea a 10% DMSO care conține a-MEM(-) înaintea incubării 2 min la temperatura camerei. După aceasta, la disc s-a adăugat 10% dializat de ser bovin fetal conținând mediu neselectiv (a-MEM(-) cu hipoxantină și timidină) urmat de 2 zile de cultură, apoi selecția în 10% dializat de ser fetal bovin care conține mediul selectiv (a-MEM(-) fără hipoxantină și timidină).

4935

4940

4945

4950

4955

4960

4965

4970

4975

RO 118299 Β1

Selecția s-a dirijat prin tripsinizarea celulelor, împărțirea lor în 5 discuri de 10 cm sau 20 discuri de 24 godeuri pe discul de 6 cm de mai sus, și continuarea culturii în timp ce mediul s-a schimbat cu mediu de selecție proaspăt la ihtervale de 2 zile. Supernatantele de la plăci sau godeuri s-au testat pentru activitate TPO aceasta fiind observată folosind testul Ba/F3. Celulele în care s-a observat activitate TPO în supernatantele culturii s-au transferat apoi la plăci sau godeuri proaspete după ce s-au divizat la o concentrație de celule de 1:15 cu mediu de selecție conținând metotrexat 25 nM, și s-au recultivat în continuare pentru creșterea și donarea celulelor rezistente la metotrexat.

Alternativ, transformarea celulelor CHO se poate efectua prin contrasfecția lui pEF18S-hTPO163 și pMG1 în celulele CHO.

Tulpina CHO (CHO-DUKXB11) transfectată cu plasmidul pDEF202-hTPO163 s-a depozitat pe 31 ianuarie 1995, sub numărul de acces FERM BP-4989, La Național Institute of Bioscience and Human Technology, Agencey of Industrial Science and Technology, Ministry of Internațional trade and Industry, Japonia.

Exemplul 64. Cultura pe scară mare a celulelor CHO

Cultura pe scară mare a liniei celulare CHO care produc hTPO163 (celule CHO 109, obținute prin selecția menționată mai sus în 10% dializat de ser fetal bovin conținând mediu de selecție (α-MEM’ fără hipoxantină și timidină)) care au fost obținute prin transfecția expresiei hTPO163 a plasmidului pDEF202-hTPO în celule CHO în exemplul 63 s-a efectuat după cum urmează. S-au crescut celule CHO 109 în mediu DMEM/F-12 (GIBCO) cu 10% FCS. După recoltarea (sau tripsinizarea) celulelor folosind o soluție de tripsină, s-au inoculat 10 milioane celule într-o sticlă rotativă Falcon(falcon 3000) conținând 200 ml din același mediu și apoi s-au cultivat la o viteză de rotație de 1 rpm, la 37°C, timp de 3 zile. Mediul de cultură s-a îndepărtat prin sucțiune și suprafața culturii celulare s-a spălat cu 100 ml PBS. Apoi, culturii celulare i s-au adăugat 200 ml mediu DMEM/F-12 (GIBCO) fără 10% FCS urmat de 7 zile cultură la 37°C, la 1 rpm. Supernatantul culturii recoltate s-a folosit ca materie primă în etapa următoare de purificare. Proceduri similare s-au dirijat în 300 sticle rotative pentru a da 601 de supernatant de cultură lipsită de ser.

Exemplul 65. Purificarea lui hTPO163 de la linia celulară CHO care produce hTPO163 (1) Din supernatantul de cultură lipsit de ser obținut în exemplul 64,60 I s-au filtrat printr-un filtru de 0,22 μπι pentru a colecta un filtrat care apoi s-a concentrat folosind o unitate de ultrafiltrare (Filtron, treutatea moleculară de separare 10000) pentru a obține o fracțiune concentrată (600 ml, 11,2 mg/ml, proteină totală 6430 mg). S-a dovedit prezența HTPO exprimată la un domeniu de greutate moleculară de la 20000 până la 26000 prin analiza Western a acestei fracțiuni folosind anticorp peptidic anti-HT 1.

Supernatantul de cultură concentrat rezultat (537 ml) s-a tratat pe o coloană Sephadex G-25 fine (Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0032-02; diametru 10 cm și înălțimea patului 30 cm) preechilibrată cu tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH=6,8) pentru a obține o fracțiune proteică F1 (938 ml, concentrația proteinei 4,9 mg/ml, proteină totală 4594 mg) ca o soluție în tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH= 6,8).

Această fracțiune proteică (929 ml) de la coloana Sephadex G-25 Fine s-a aplicat la o rată de curgere de 15ml/min, la o coloană SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech, număr de catalog 17-0729-01; diametru 5 cm și înălțimea patului 12 cm) preechilibrată cu tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH=6,8) urmată de eluție cu tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH=6,8) apoi același tampon conținând 10% etanol. Eluatele s-au combinat ca o fracțiune F1 (1608 ml, concentrația proteinei 2,13 mg/ml, proteina totală 3426 mg). Apoi, s-a efectuat a doua eluție cu tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH=6,8) care conține 750 mM NaCI și 25% etanol pentru a colecta un eluat principal hTPO163 al fracțiunii F2 (651 ml, concentrația proteinei 1,67 mg/ml proteină totală 1087 mg).

R0118299 Β1

5030

La fracțiunea F2 care conține activitate TPO (200 ml) de la coloana SP Sepharose Fast flow s-au adăugat etanol și apă purificată pentru a prepara 300 ml de soluție etanolică 45% (concentrație finală). Materialele insolubile care au rezultat de la adăugarea etanolului s-au îndepărtat prin centrifugare. Supernatantul s-a injectat într-o coloană SOURCE 15RPC (Pharmacia-BIOtech, număr de catalog 17-0727-02; diametru 2 cm și înălțimea patului 20 cm) preechilibrată cu 50% solvent A (tampon acetat de sodiu 10 mM, pH=6,7) plus 50% solvent B (tampon acetat de sodiu 10 mM, pH=6,7, conținând 90% etanol) la o rată de curgere de 2 ml/min. Apoi, coloana s-a spălat cu 55% solvent A plus 45% solvent B până când substanțele neadsorbite au fost aproape complet eluate, după care s-a efectuat eluția la o rată de curgere de 1,5 ml/min,conform următorului profil de eluție: 50% B, 5 min; gradient linear de la 50% B la 100% B peste 140 min; și apoi 100% B 35 min. Fracțiunile s-au colectat la intervale de 5 min (corespunzând la volum de 7,5 ml). Toate fracțiunile s-au supus la SDS-PAGE, apoi la analiză Western pentru examinarea unui domeniu de eluție al hTPO163. Ca rezultat, s-a purificat strict hTPO163 cu o greutate moleculară aparentă de la aproximativ 20000 la 26000 găsindu-se a fi eluată la domeniul de la 66% până la 87% etanol. Dintre aceste proteine hTPO163, hTPO163 având o greutate moleculară mai ridicată s-a eluat devreme din coloana în fază inversă, sugerînd că molecula hTPO163 glicozilată are o hidrofilie crescută.

La 88,8 ml fracțiune de eluție hTPOl63 (adică, fracțiunea ΙΤΓΡΟ163 (90 ml) eluată la domeniul de la 68% la 86,5% etanol) din coloana SOURCE 15RPC s-a adăugat CHAPS, amestecul s-a concentrat și s-a spălat pentru a obține 2,5 ml de concentrat care conține circa 5% etanol și 4 mM CHAPS. Acest concentrat s-a aplicat în continuare la o coloană Superdex 75 pg (Pharmacia-Biotech, număr de catalog 17-1070-01; diametru 2,6 cm și înălțimea patului 60 cm) echilibrată cu tampon fosfat de sodiu 10 mM (pH=6,8) conținând 10% etanol la o rată de curgere de 1,5 ml/min. De la momentul 60 min după aplicare, fracțiunile eluției s-au colectat într-o cantitate de 6 ml fiecare (adică la fiecare 4 min). Ca rezultat, hTPO163 s-a eluat în fracțiunile de la eprubeta cu numărul 16 până la cel puțin eprubeta cu numărul 31 cum s-a determinat prin SDS-PAGE. Această poziție de eluție este corespunzătoare la domeniul unei greutăți moleculare de la aproximativ 44000 până la aproximativ 6000, cum s-a determinat prin filtrare în gel folosind un marker de greutate moleculară standard (amestec de Bio-Rad, Gel Filtration Standard, număr de catalog 151-1901; și Calbiochem, insulină, număr de catalog 407696). Suplimentar, aceste molecule hTPO163 apar a fi eluate în ordinea descreșterii gradului glicozilării. Toate speciile hTPO163 ale domeniului eprubetelor numerele 16 până la 31 (volumul eluției: 180 până la 276 ml) s-au colectat ca fracțiune FA. în plus, la fracțiunea FA, s-au colectat separat din eprubetele numerele 16 la 18 (volum de eluție: 180 la 198 ml), 19 la 24 (volum de eluție: 198 la 234 ml) și 25 la 31 (volum de eluție: 234 la 276 ml) și s-au desemnat ca fracțiune FH, FM și, respectiv, FL. De asemenea, fracțiunea FA s-a preparat prin combinarea porțiunilor fracțiunilor FH, FM și FL. Cele de mai sus sunt prezentate în fig.19.

(2) în continuare, fracțiuniile de eluție hTPO163 FH, FM, FL și FA de la coloana Superdex 75 pg menționate la (1) se vor ilustra mai amănunțit. Secvențele aminoacide N-terminale ale speciilor hTPO163 obținute mai sus s-au determinat prin aceeași metodă ca la exemplul 1, dar majoritatea resturilor Ser N-terminale nu s-au putut identifica. Aceasta sugerează că un zahar O-legat este adăugat la Ser N-terminală. Mai mult decât atât, secvența care urmează Ser N-terminală s-a confirmat a fi o secvență aminoacidă așteptată de la secvența genei hTPO. Concentrațiile proteinelor hTPO163 din FH, FM, FL și Fa au fost

10,2 ng/ml, 6,2 ng/ml, 0,84 ng/ml și 3,2 ng/ml cum s-a determinat prin analiza aminoacidă (AccQ.Tagmethod, Wasters) cu condiția că au fost concentrațiile jumătăților peptidice care nu conțin nici o catenă de zahăr. Aceste fracțiuni (100 ng fiecare) s-au supus la SDS-PAGE

5035

5040

5045

5050

5055

5060

5065

5070

5075

RO 118299 Β1 în condiții nereducătoare folosind un multigel 15/25 (Dai-ichi Kagaku Yakuhin, gel poliacrilamidic 15 la 25% preturnat) sau în condiții reducătoare folosind DTT, urmat de colorare argint (Daiichi Pure Chemicals). Ca rezultat, fiecare dintre aceste fracțiuni s-a găsit a conține hTPO 163 de înaltă puritate. Greutățile moleculare aparente ale hTBO163 în FH, FM, FL și FA așa cum s-au calculat folosind marker de greutate moleculară DPCIII (Daiichi Pure Chemicals) ca standard în condiții reducătoare, au fost 24000 la 21500, 23000 la 21000,23000 la 20500 și .respectiv, 23500 la 20500 (fig.20). Suplimentar, greutățile moleculare aparente ale hTPO din FH, FE, FL și FA așa cum s-au calculat folosind SDS-PAGE marcat biotină standard (Bio-Rad, Biotynylated SDS-PAGE Standards, Broad Range: număr de catalog 161-0319) în condiții reducătoare pe analiză Western au fost 26000 la 22000, 25500 la 22000,26000 la 21000 și, respectiv, 26000 la 21000. Heterogenitatea dintre greutățile moleculare ale FH, FM, FL și FA poate fi datorată heterogenității catenelor de zahăr O- legate. De aceea, fiecare fracțiune a FH, FM, FL și FA s-a digerat cu neuraminidază (Neuraminidase, Nacalai tesque număr de catalog 242-29SP), s-a redus cu DTT și apoi s-a analizat pe SDS-PAGE. Ca rezultat, în toate fracțiunile greutatea moleculară aparentă a fost în jur de 19000 evidențiind că heterogenitatea greutății moleculare a hTPO este datorată, în principal, heterogenității cantității de acid sialic din cafenele de zahăr cuplate cu proteina hTPO163 și că hTPO163 obținută s-a exprimat în celule CHO ca glicoproteină.

(3) Fracțiunile FH, FM, FL și FA obținute în (2) s-au cercetat pentru activitatea lor in vitro prin sistemul de testare M-07e. Ca rezultat activitatea specifică relativă a fost 511000000,775000000,1150000000 și 715000000/mg proteină hTPO163 (greutatea jumătății peptidice care nu conține greutatea nici unui zahăr).

Exemplul 66. Construcția vectorului E.colipentru expresia TPO uman (aminoacizii 1-332) în care este adăugată Lys la poziția -1 și respectiv, Met la poziția -2 (denumită în continuare ca ^ahMKT(1-332)”) și expresia lui hMKT(1-332)

Pentru exprimarea secvenței aminoacide de lungime integrală a TPO uman în E.coli s-a schimbat folosirea codonilor de la aminoacizii 164 la aminoacidul 332 la codonii, de preferință, E.coli, așa cum s-a descris mai jos.

21:5'- CTCCCGAACCGGTACCAGCGCCTGCGTGGAAACCAACTTACCGCGAG-3' (SECV.ID.NR.130)

22:5'- GGTAAAGTTGGTTTCCAGCAGGCCGCTGGTACGGTTCGGGAGCTCGT-3' (SECV.ID.NR.131)

23:5'- CGCGCGTACCACCGGCAGCGGCCGGCGTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGT-3' (SECV.ID.NR.132)

24:5'- AGCCCTGCTGCCATTTCAGCAGGCCGCTGCCGGTGGGTACGCGCGCTCGC-3' (SECV.ID.NR.133)

25:5'- GCAGAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGAT-3' (SECV.ID.NR.134)

26:5'-ATCCAGGCTACGGCTGGTCTGGTTCAGCAGGCCCGGGATTTTCGCACGAA-3' (SECV.ID.NR.135)

27:5'- CCCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTG-3' (SECV.ID.NR.136)

28:5'- GTGCCGTTCAGCAGTTCATGGATACGGTTCAGATAGCCCGGGATCTG-3' (SECV.ID.NR.137)

29:5'- GCCTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAG-3' (SECV.ID.NR.138)

30:5'- ATCCGGCGCCCAGGGGTGCGACGGCTCGGGCCCGGAAACAGGCCACGG-3' (SECV.ID.NR.139)

31:5‘- ATCAGCTCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCGTGCCGCCGAACCTGCAGCC-3' (SECV.ID.NR.140)

R0118299 Β1

32:5'- CAGGTTCGGCGGCAGGCTGCCGGTATCGCTGGTGCCAGAGCTGATATCCG-3' (SECV.ID.NR.141) 33:5'-GGGCTATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTT-3' (SECV.ID.NR.142)

34:5'-GGTATACTGGCCGGTCGGCGGATGGGTCGGGCTCGGGCTATAGCCCGGCTG-3' (SECV.ID.NR.143)

35:5'-TCCGCTGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCTGCATCCGCTGC3' (SECV.ID.NR.144) 36:5'-GGATGCAGCTGAACCACCGGGGTCGGCAGGGTCGGCGGCAGCGGAAACAG-3' (SECV.ID.NR.145) 37:5'-TGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTGAACA-3 (SECV.ID.NR.146) 38:5'-AGCAGCGGGCTGGTCGGGGTCGGGGTCGGCGCGCTGGATCCGGCAGCAGC-3' (SECV.ID.NR.147) 39,5'-CCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGCTAATGAAGCTTGA-3' (SECV.ID.NR.148)

40:5'-CTTCATTAGCCTTCCTGGCTCAGGTTCTGGCTATGGGTATAGCTGGTGTTC-3' (SECV.ID.NR.149) 41:5‘- ACGAGCTCCCGAACCGTACCA-3' (SECV.ID.NR.150) 42:5'- CTGATATCCGGCGCGCCCAGG-3' (SECV.ID.NR.151) 43:5'- CGGATATCAGCTCTGGCACCA-3' (SECV.ID.NR. 152) 44:5'- TCAAGCTTCATTAGCCTTCCT-3' (SECV.ID.NR.153)

Oligonucleotidele sintetice: 21 și 22; 23 și 24; 25 și 26; 27 și 28; 29 și 30; 31 și 32; 33 și 34; 35 și 36; 37 și 38; sau 39 și 40 s-au fosforilat într-o soluție de 0,1 mM ATP, 10 mM Tris-acetat, 10 mM Mg-acetat, 50 mM K-acetat folosind kinază T4 (Pharmacia) în aceeași eprubetă. Apoi, s-a adăugat 1/10 dintr-o soluție de 100 mM Tris/HCI (pH=7,5), 100 mM MgC12,500 mM NaCI la amestecul de reacție, s-a fiert 3 min într-o baie de apă și s-a lăsat să se răcească pentru a forma DNA dublu împletit s-au ligat separat 4 seturi de DNA-uri dublu împletite, adică oligonucleotidele 21 și 22/23 și 24 (combinația A); oligonucleotidele 25 și 26/27 și 28 (combinația B); oligonucleotidele 31 și 32/33 și 24 (combinația C); și oligonucleotidele 35 și 36/37 și 38/39 și 40 (combinația D) cu kit de ligare DNA (Takara Shuzo), și apoi, combinația A s-a ligat împreună cu combinația B și similar combinația C cu combinația D pentru a produce ligarea-1 și, respectiv, ligarea-2. Folosind ligările -1 și -2 ca matrițe, s-au realizat PCR în care s-au folosit ca primeri oligonucleotidele 41 și 42 pentru ligarea -1 și oligonucleotidele 43 și 44 pentru ligarea-2. Produsele de la PCR-ul ligărilor-1 și -2 s-au digerat cu Saci și EcoRV și respectiv EcoRV și Hindlll urmate de electroforeză pe gel de agaroză 2% și apoi, purificarea folosind un kit de purificare DNA Prep-A-Gene pentru a recupera fragmente de circa 240 bp și, respectiv, 250 bp. Cele 2 fragmente astfel obținute au fost subclonate în pBluescriptll KS+ (Stratagene) predigerat cu Saci și Hindi (ca gazdă s-a folosit E.coli DH5). Dintre coloniile rezultate s-a selectat clona care are secvența de bază prezentată în tabelul 6 prin secvențare și s-a numit pBL(SH) (174-332) (SECV.ID.NR.154).

Tabelul 6 CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser 174 180

GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg 190 200

5130

5135

5140

5145

5150

5155

5160

5165

5170

5175

RO 118299 Β1

GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG

Ala Lys lle Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin

210 220

ATC CCG GGC TAT CTG AAC AGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT lle Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lle His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg

230

GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lle

240250

AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCG Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro

260

GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu 270280

TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCG Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro

290300

CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu

310

CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAA

Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

320 330 332

TGA AGC TTG A în continuare, pBL(XH)h6T(1-163) preparat în exemplul 42, ca matriță, s-a supus la PCR în prezența următoarelor oligonucleotide sintetice 45 și 46 ca primeri, și produsul PCR s-a digerat cu BamHI și Saci urmat de electroforeză pe gel de poliacrilamidă 6% pentru a recupera din gel un fragment de circa 160 bp. 45:5'-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3' (SECV.ID.NR.155) 46:5'-GGGAGCTCGTTCAGGGTCAGAACCAGAGAGGTACGAGACGGAACAGCAGTGG TTGG-3' (SECV.ID.NR.156)

De asemenea, pBL(SH)(174-332) s-a digerat cu Saci și Hindlll și digestul s-a purificat apoi folosind kit de purificare DNA Prep-A-Gene pentru a da un fragment de circa 480 bp. Cele 2 fragmente preparate mai sus s-au subclonat în pBluescript II KS+ (Stratagene) predigerat cu BamHI și Hindlll (gazda folosită a fost E.coli DH5).

Dintre clonele rezultate, s-au selectat prin secvențare clona care are secvența de baze prezentată în tabelul 7 și s-a numit pBL (BH) (123-332) (SECV.ID.NR.157).

Tabelul 7 G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT CTG CAG CAC CTG CTG CGT GGC Asp Pro Asn Ala lle Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly 123 130

AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT

Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg

140 150

CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTG

Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu

160

RO 118299 Β1

5230

ACC CTG AAC GAG CTC

Thr Leu Asn Glu Leu

170 174

S-a digerat cu BamHI și Hindlll pBL(XH)h6T(1-163) preparat în exemplul 42 și pBL(BH) (123-332) preparat mai sus s-a digerat în mod similar pentru a produce un fragment de circa 640 bp după care cele 2 fragmente s-au ligat împreună pentru a obține o clonă pBL(XH)h6T(1-334). Ulterior, pCFM536/hMKT(1-163) preparat în exemplul 52 s-a digerat cu Xbal și Sfii pentru a da un fragment de circa 270 bp care în continuare, s-a ligat cu pBL(XH)h6T(1-334) digerat cu aceleași enzime de restricție pentru a produce o clonă pBL(XH)hMKT(1-334). După ce pBL(XH)hMKT(1-33 4) s-a digerat cu Xbal și Hindlll, s-a recuperat un fragment de circa 1040 bp care codifică aminoacizii 1-332 TPO uman de tip mutată, s-a purificat și apoi s-a donat în pCFM536(EP-A-136490) predigerat cu Xbal și Hindlll (gazda folosită a fost E.coli JM109 transformat anterior cu pMW1 (ATCC nr.39933)). Clona rezultantă s-a numit pCFM536/hMKT(1-332 și tulpina E.colicare poartă acest vector de expresie s-a folosit ca transformant pentru expresia proteinei hMKT(1-332) de tip proteină mutată. Plasmidul de expresie pCFM536/hMKT(1-332) conține o secvență DNA prezentată în SECV.ID.NR.14.

Transformantul de mai sus s-a cultivat în 60 ml de mediu LB care conține 50 Mg/ml ampidlină și 12,5 Mg/ml tetraciclină peste noapte la 30°C, și cultura (25 ml) s-a adăugat apoi la 1000 ml de mediu LB care conține 50 Mg/ml ampidlină urmat de agitarea culturii la 36°C, până când OD600 atinge 1,0 până la 1,2. Apoi, după circa 330 ml mediu LB la 65°C, s-au adăugat la cultură, astfel, încât temperatura finală a culturii a devenit 42°C, cultura agitată s-a continuat pentru încă 3 h, la 42°C, în scopul inducerii expresiei variantului TPO uman, proteina hMKT(1-332), cunoscută de asemenea, ca (Met'², Lys’¹) TPO (1-332).

Cultura obținută s-a supus direct la analiză SDS-PAGE. în analiza SDS-PAGE s-a folosit Multigel 15/25 (Dai-ichiChemicalCo). După electrofhză, și colorare cu Coomasie Blue, proteina specifică pentru inducerea expresiei s-a detectat la o greutate moleculară de circa 35 KD pe gelul în legătură cu transformantul care a indus expresia proteinei hMKT(-12332). în plus, urmând SDS-PAGE și electroblottingului (folosind membrană microcelulozică), proteina exprimată mai sus s-a reacționat cu anticorpul peptidic anti-HT1 preparat în exemplul 45. După colorare, s-a detectat o bandă la o greutate moleculară de aproximativ 35 kD aceasta indicând că s-a exprimat hMKT (1-332).

Exemplul 67. Prepararea derivaților substituiți TPO umani, expresia lor în celule COS 7 și identificarea activității lor

Conform următoarelor proceduri s-au studiat câțiva derivați la care aminoacizii TPO uman au fost parțial substituiți cu un alt/alți aminoacid(izi), dacă au activitate TPO.

S-a construit după cum urmează vectorul pSMT201 pentru expresie în celule animale pentru a fi folosit în acest exemplu.

Inițial, plasmidul de expresie pXM-mEPORn care conține un cDNA pentru receptorul eritropoietinei murine (obținut de la Dr.D’andrea de la Dana Farbor Cancer Institute; Cell: 57,277-285 (1989)) s-a tratat cu enzimele de restricție Kpnl și EcoRI, și apoi s-a supus electroforezei pe gel de agaroză pentru a recupera un fragment vector pXM din care s-a îndepărtat cDNA-ul pentru receptorul eritropoietinei murine. în continuare, s-au sintetizat 2 oligonucleotide pentru introducerea a diverse situri de donare restrictivă în vectorul de expresie de mai sus folosind un sintetizator DNA (ABI). Oligonucleotidele sintetizate au următoarele secvențe de bază:

primer -1: 5'-CCTCGAGGAATTCCTGCAGCCCGGGACTAGTATCGGCTACCCTACGACGTCCCC GACTACG CCGGCGTCCATCACCATCACCATCACTGAGCGGCCGCC-3' (SECV.ID.Nr.158)

5235

5240

5245

5250

5255

5260

5265

5270

RO 118299 Β1 primer - 2:

5'-AATTGGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCGCCGGCGTAGTCGGGGA

CGTCGTAGGG GT ΑβΟΟβΑΤΑΟΤΑβΤΟΟΟΟΰΟΟΤΩΟΑΩβΑΑΤΤΟΟΤΟΟΑβΟΘΤΑΟ-β' (SECV.ID. Nr.159)

Cele 2 oligonucleotide s-au amestecat și s-au normalizat pentru a forma o oligonucleotidă dublu împletită care după aceea s-a ligat cu vectorul pXM recuperat mai sus în prezența ligazei DNA T4 (Takara Shuzo) pentru a da un vector de expresie pDMT201. Pentru îndepărtarea cDNA DHFR murin conținut în pDMT201 de la pDMT201, s-au digerat separat vectorii pDMT201 și pEF185 cu Notl și Hpal urmat de electroforeză pentru a recupera un fragment mai mare de la vectorul DNA pDMT201 și un fragment mai mic de la vectorul DNA pEF18S. Apoi, aceste fragmente s-au ligat împreună folosind ligază DNA T4 (Takara Shuzo) pentru a produce un vector de expresie pSMT201. Așa cum s-a prezentat în fig.21, pSMT201 are o origine a replicării lui SV40, un intensificator de secvență, secvența promotoare târzie principală adenovirus, o secvență lider tripatită adenovirus, o secvență semnal de îmbinare cap la cap, o secvență a sitului de poliadenilare timpurie SV40, o secvență a genei VA ARN de adenovirus, o origine de replicare a lui pUC18 și o genă β-lactamază (Amp^r) împreună cu următoarele situri de restricție pentru ligarea unei gene dorite: Bg1 II, Pstl, Kpnl, Xbol, EcoRI, Smal, Spel, și Notl. S-a digerat cu EcoRI și Spel pHtP ilustrat în exemplul 30 care conține cDNA TPO uman de lungime întreagă pentru a da cDNA TPO uman de lungime întreagă, fragment care în continuare s-a subclonat în vectorul pSMT201 predigerat similar pentru a produce un plasmid psMT201-hTPO.

Folosind plasmidul astfel preparat pSMT201-hTPO ca matriță s-a construit inițial plasmidul PGL-TPO/pBlue care s-a folosit ca matriță pentru prepararea derivaților de interes după cum urmează.

S-a încercat adăugarea în pGL-TPO/pBlue a secvenței lider a β-globinei de iepure la situl 5' netranslațional al TPO umane prin metoda Annweiler (Annmeiler și colab., Nucleic Acids Research, 19:3750, 1991). Pentru acest scop, s-au sintetizat chimic următoarele 2 benzi DNA:

5'-AATTCCAAGATCTCACATTGCTTTTGACACAACTGTGTTTACTTGCAATCCCCCAAAA CAGACAGACCC-3¹ (SECV.ID.Nr.160) 5'-GGGTCTGTCTGTTTGGGGGATTGCAAGTTAAACACAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGT GAGAGATCTTGG-3' (SECV.ID.Nr.161) s-au ligat cu un fragment care s-a obținut prin digestia vectorului Bluescript II SK+ (Toyoboseki) cu EcoRI și Smal pentru a produce un vector pGL&pBlue în care s-a inserat secvența lider.

S-a dirijat PCR folosind următoarele secvențe primer: Sma-ATG:5'-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3' (SECV.ID.Nr.162) (adică, secvența 102-122 a SECV.ID.Nr.7 la care s-a ligat secvența Smal); end:5'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3' (SECV.ID.Nr.163) (adică, antisensul secvenței 1140-1160 a SECV.ID.Nr.7, la care s-au ligat secvențele Spel și Hindlll).

S-a realizat PCR folosind 1 ng din plasmidul DNA psMT201-hTPO ca matriță împreună cu 10 μΜ primeri sintetici. Folosind kit de amplificare PCR TaKaRa (Takara Shuzo) și controler termic programabil (MJ Research) s-a dirijat PCR-ul într-un volum de 100 μΙ în următoarele condiții: 3 cicluri de 94°C, 1 min, 55°C, 2 min și 72°C, 2 min/ciclu; apoi, 20 cicluri la 94°C, 45 s, 95°C, 1 min și 72°C, 1 min/ciclu. Produsul PCR s-a extras cu cloroform și apoi s-a precipitat cu etanol de 2 ori urmat de suspensie în 100 μΙ tampon TE.

în continuare, produsul PCR s-a supus la digestie de restricție cu Smal și Hindlll, s-a extras cu fenol/cloroform și s-a precipitat cu etanol. Precipitatul rezultat s-a dizolvat în 10 μΙ tampon TE după care s-a subclonat cu vectorul pGL/pBlue care a fost digerat anterior cu

R0118299 Β1

5325 aceleași enzime de restricție (s-a folosit drept gazdă E.coli JM 109 înalt competentă (Toyoboseki)). Dintre celulele transformante obținute s-au selectat 20 clone de la care s-au preparat plasmizi DNA în esență așa cum s-â descris în Sambrook și colab., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Plasmidul DNA purificat s-a identificat prin secvențare folosind kit-ul de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (applied biosystems, Inc.) și secvența DNA 373A (Applied Biosystems Inc.). Ca rezultat s-a confirmat că plasmidul care codifică pGL-TPO/pBlue are secvența cDNA TPO așteptată fără nici o substituție pe întreaga lungime a acestuia. Apoi, după ce pGL-TPO/pBlue s-a digerat cu Bg1 II și Spel, digestul s-a extras cu fenol/cloroform și apoi ,s-a precipitat cu etanol. Precipitatul obținut s-a dizolvat în 10 μΙ tampon TE și s-a subclonat în vectorul pSMT201 care a fost digerat cu aceleași enzime (gazda folosită a fost E.coli. JM109 înalt competentă (Toyoboseki). S-a preparat plasmidul DNA, conform metodei descrise în Molecular Cloning (Sambrook și colab. de mai sus) de la celulele transformante. Vectorul de expresie rezultat pSMT/pGL-TPO a avut structura ca a secvenței lider a β-globinei și cDNA-ul TPO uman s-a ligat la situl de restricție Bgll l/Spel în aval-ul secvenței semnal de îmbinare cap la cap a vectorului pSMT201 așa cum s-a prezentat în fig.21. Acest vector pSMT/pGL-TPO s-a folosit pentru transfecția sa în celule COS.

Pentru prepararea derivaților de substituție TPO uman s-a aplicat PCR în care s-a folosit metoda Ito (Ito și colab., Gene, 102:67-70,1991). în particular, s-au preparat ilustrativ 2 derivați TPO uman la cane Arg-25 și His-33 ai TPO uman sunt substituiți prin Asn și, respectiv, Thr. Respectiv, acești derivați pot fi cunoscuți ca (Asn²⁵)TPO și (Thr^TPO. în PCR s-au folosit următorii primeri:

T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SECV.ID.Nr.164) (corespunzând regiunii promotoare T7 a lui Bluescript II SK+);

Abg1 II: 5’-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3' (SECV.ID.Nr. 165) (pentru substituirea secvenței de recunoaștere BG1II);

end: S'-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-S' (SECV.ID.Nr. 166) (antisensul 1140-1160 a SECV.ID.Nr.7, la care s-au linkat secvențele Spel și Hindlll);

N3: 5'-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3' (SECV.ID.Nr. 167) (Arg 25 - Asn al SECV.ID.Nr.7 și

09: 5'-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3' (SECV.ID.Nr.168) (His-33 - Thr al SECV.ID.Nr.7).

Prima etapă PCR s-a efectuat folosind 1 ng de plasmid pGL-TPO/pBlue ca matriță împreună cu 10 μg din fiecare primer sintetic. Combinațiile primerilor au fost: (1) Abg1 II și primerii “end”; (2) T7 și N3; și (3) T7 și 09. Folosind kit-ul de amplificare PCR TaKaRa (Takara-Shuzo) și controler termic controlabil (MJ Research), s-a dirijat PCR într-un volum de 100 μΙ în următoarele condiții: 3 cicluri de 94°C, 1 min, 55°C, 2 min și 72°C, 2 min/ciclu; apoi 17 cicluri de 94°C, 45 s, 55°C, 1 min și 72°C, 1 min/ciclu. Fiecare din produsele PCR s-a extras cu cloroform și s-a precipitat de 2 ori cu etanol și precipitatul s-a dizolvat în 100 μΙ de tampon TE. Produsele PCR rezultate (1 μΙ fiecare) s-au supus în continuare la al 2-lea PCR. Combinațiile matrițelor au fost: produse PCR ale (1)/(2) și produse PCR ale lui (1)/(3). Cu privire la primeri, combinația lui T7 și N s-a folosit în 2 cazuri. După incubare la 94°C, 10 min și adăugare de Taq TaKaRa s-a efectuat PCR în următoarele condiții: 3 cicluri de 94°C, 1 min, 55°C, 2 min și 72°C, 2 min/ciclu; apoi 9 cicluri de 94°C, 45 s, 55°C, 1 min și 72°C, 1 min/ciclu. La fiecare dintre produsele PCR rezultate s-au adăugat 1 μΙ de proteinază K (5 mg/ml), 2 μΙ EDTA 0,5 M și 2 μΙ SDA 20%, s-au incubat la 37°C, 30 min pentru inactivarea Taq s-au extras cu fenol/cloroform și s-au precipitat cu etanol. în continuare, precipitatul s-a dizolvat în 20 μΙ apă sterilă, s-a digerat cu Bg1 II și Spel, urmat de extracție fenol/cloroform și precipitare cu etanol. Precipitatul astfel obținut s-a dizolvat în 10 μΙ tampon

5330

5335

5340

5345

5350

5355

5360

5365

5370

RO 118299 Β1

TE și în continuare, s-a subclonat în vectorul de expresie pSMT201 care a fost digerat cu aceleași enzime de restricție și s-a tratat cu fosfatază alcalină din intestin de vițel (Boehringer-Mannheim) (gazda folosită a fost E.coli JM109 înalt competentă). Dintre celulele transformante obținute s-au selectat în fiecare caz 2 clone de la care s-au preparat plasmizi DNA, în principal ,așa cum s-a descris în Molecular Cloning (Sambrook și colab., de mai sus). Plasmizii DNA purificați s-au secvențat folosind secvențer DNA 373A și truse de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (ambele Applied biosystems Inc.).

Plasmidul preparat prin PCR cu utilizare de primer (1) și (3) au conținut un cDNA care codifică un derivat TPO de substituție (09/TPO). S-a confirmat substituția aminoacidă a His 33(CAC) prin Thr (ACC) și extensia terminusului C inițial (Gly 332) prin adăugarea secvenței aminoacide TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH (SECV.ID.Nr.169). Acest derivat s-a definit ca (Thr³³, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp?⁴⁰, Vai³⁴¹, Pro?⁴², Asp?⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³) TPO.

Pe de altă parte, plasmidul preparat prin PCR cu utilizare de primer (1) și (2) a conținut un cDNA care codifică un derivat TPO de substituție (N3/TPO). S-au confirmat substituțiile aminoacide ale Arg 25(AGA) prin ASn(AAC) și Glu231 (GAA) prin Lys(AAA) și extensia terminusului C-inițial (gly332) prin adăugarea secvenței aminoacide TSIGYPYDVPDYAAG VHHHHHH. Acest derivat s-a definit ca (Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴, Ile³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷, His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³)TPO.

Transfecția în celule COS 7 s-a efectuat prin metoda DEAE incluzând tratament clorochină cum s-a descris în exemplul 35. Pe scurt, s-au folosit în transfecție 40 pg din fiecare plasmid DNA, și după 5 zile s-a recuperat supernatantul culturii care s-a concentrat în continuare, până la un volum de 1/20 folosind Centricon-30 (Amicon) în scopul evaluării activității lor TPO prin test M-07e. Ca rezultat, în supernatantele de cultură ale celulelor COS 7 în care s-au transfectat plasmizi conținând cDNA-urile care codifică derivații TPO umani de substituție N3/TPO și, respectiv, 09/TPO, s-a detectat activitate TPO într-un mod dependent de doză (fig.22).

Exemplul 68. Prepararea derivaților de inserție sau deleție ai TPO umane, expresia acestora în celule COS 7 și identificarea activității TPO

Acest exemplu are rolul de a evidenția dacă derivații de inserție sau deleție ai hTPO163 au o activitate TPO.

Derivații preparați au fost un derivat de deleție His33 ((AHis³³)TPO (1-163), dH33); un derivat de deleție Gly116((AGIy¹¹⁶) TPO(1-163), dG116); un derivat de deleție Arg¹¹⁷ ((AArg¹¹⁷) TPO(1-163), T33'), un derivat de inserție Ala ((His³³, gly³³', Pro³⁴, Ser^JTPO (1-163), G33') în care, Thr, Ala și Gly au fost inserați independent între His33 și Pro34; și un derivat de inserție Asn ((Gly¹¹⁶, Asn¹¹⁶',Arg¹¹⁷ITPO(1-163), N¹¹⁶’), un derivat de inserție Ala ((Gly¹¹⁶, Ala¹¹⁶',Arg¹¹⁷)TPO(1-163), A¹¹⁶') și un derivat de inserție Gly ((Gly¹¹⁶, Gly¹¹⁶', Arg¹¹⁷) TPO (1-163), G¹¹⁶') în care Asn, Ala și Gly s-au inserat independent între Gly 116 și Arg 117, toate secvențele fiind bazate pe SECV.ID.Nr.13.

Dintre derivații T33' și N116' se intenționează să se introducă catene de zahăr de tipul mucinei și de tipul legării-Asn.

Derivații menționați mai sus s-au preparat folosind PCR prin metoda descrisă de Ito și colab., (Gene, 102:67-70,1991). Secvențele primer folosite în PCR sunt precum urmează: dH33: 5'-TGTAGGCAAAGGAACTCTTGGGCA-3' (SECV.ID.Nr.172) (pentru prepararea derivatului de deleție His33 bazat pe secvența prezentată în SECV. ID.Nr.7);

T33': 5'-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3‘ (SECV.ID.Nr.173) (pentru prepararea derivatului de inserție Thr cu Thr inserat între His33 și Pro34 din secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

RO 118299 Β1

Α33: 5'-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTQG-3' (SECV.ID.Nr.174) (pentru prepararea derivatului de inserție Ala cu Ala inserat între His33 și Pro 34 din secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

G33': 5-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3' (SECV.ID.Nr.175) (pentru prepararea derivatului de inserție Gly cu Gly inserat între His33 și Pro 34 din secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

dG116: 5'- AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3' (SECV.ID.Nr.176) (pentru prepararea derivatului de deleție Gly116 bazat pe secvența prezentată în SECV. ID.Nr.7);

dR117:5'- GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3' (SECV.ID.Nr.177) (pentru prepararea derivatului de deleție Arg 117 bazat pe secvența prezentată în SECV. ID.Nr.7);

N116':5'- AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3' (SECV.ID.Nr.178) (pentru prepararea derivatului de inserție Asn cu Asn inserat între Gly116 și Arg 117 în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

A116':5‘- AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3' (SECV.ID.Nr.179) (pentru prepararea derivatului de inserție Ala cu Ala inserat între Gly 116 și Arg 117 în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

G116': 5-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3' (SECV.ID.Nr.180) (pentru prepararea derivatului de inserție Gly cu Gly inserat între Gly 116 și Arg 117 în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.7);

dRI:5‘- CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3' (SECV.ID.Nr. 181) (pentru substituirea unei secvențe de recunoaștere a enzimei de restricție EcoRI);

T7:5'- TAATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SECV.ID.Nr.182) (corespunzătoare la regiunea promotor T7 a lui Bluescript IISK+); și endNotl: 5’- GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3' (SECV.ID.Nr. 183) (antisensul secvenței nucleotidice 663-653 a secvenței ID Nr.7 la care s-au adăugat un codon Ide terminare și o secvență de recunoaștere Notl.

O primă etapă PCR s-a efectuat utilizând ca matriță un ng de plasmid ȘGL-TPO/ pBlue DNA preparat în exemplul 67 și folosind 10 μΜ primeri sintetici. Combinația de primeri a fost (1) dRI și endNotl sau (2) T7 și primerii mutați (dH33, A33‘, G33', sT33‘, dG116, dR117, A116' G116' și N116'). în PCR s-au folosit kit de amplificare PCR TaKaRa (Takara Shuzo) și controler termic programabil (MJ Research) și PCR-ul s-a efectuat într-un volum final de 100 μΙ.Ϊη prima reacție PCR a (1), 1 ciclu a fost 94°C, 1 min, 45°C, 2 min și 72°C, 2 min și s-au efectuat 3 cicluri, urmat de 17 cicluri în care 1 ciclu a fost 94°C, 45 s, 45°C, 1 min, și 72°C, 1 min. Pe de altă parte, prima reacție PCR a lui (2) s-a efectuat în condițiile 94°C, 1 min, 55°C, 2 min și 72°C, 2 min pentru 3 cicluri urmat de 94°C, 45 s, 55°C, 1 min și 72°C, 1 min pentru 17 cicluri. Fiecare dintre produsele PCR s-a extras cu cloroform înainte de precipitare de 2 ori cu etanol, și apoi precipitatul rezultat s-a dizolvat în 100 μ\ tampon TE.

în continuare, s-a dirijat o a 2-a etapă a PCR folosind 1 μ\ din fiecare produse PCR ale lui (1) și (2). Primerii folosiți au fost o combinație a lui T7 și endNotl. După incubare la 94°C, 10 min, la fiecare amestec de reacție PCR s-a adăugat Taq TaKaRa. A 2-a PCR s-a efectuat în condiții de 94°C, 1 min, 55°C, 2 min și 72°C, 2 min pentru 3 cicluri urmat de 94°C, 45 s, 55°C, 1 min și 72°C, 1 min pentru 9 cicluri. La fiecare produs PCR astfel obținut s-au adăugat 1 μ\ de proteinază K 5 mg/ml, 2 μΙ SDS 20%, și amestecul s-a ținut la temperatura de 37°C, 30 min pentru inactivarea Taq. Produsul PCR s-a extras cu fenol/cloroform urmat de precipitare cu etanol și precipitatul rezultat s-a dizolvat apoi în 20 μΐ apă sterilă. După digestie cu EcoRI și Notl, soluția s-a extras cu fenol/cloroform și apoi s-a precipitat cu etanol. Precipitatul obținut s-a dizolvat în 10 μΙ tampon TE, și s-a subclonat într-un vector de

5425

5430

5435

5440

5445

5450

5455

5460

5465

5470

RO 118299 Β1 expresie pEF18S care fusese digerat anterior cu aceleași enzime de restricție și s-a tratat cu fosfatază alcalină (din intestin de vițel, Boehringer-Mannheim. Celula gazdă folosită a fost E.coli JM109 înalt competentă (Toyo-boseki). De la transformatorul astfel obținut s-a preparat un plasmid DNA urmând procedura descrisă în Molecular Cloning (Sambrook și colab. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)). în continuare, secvența nucleotidică a plasmidului DNA purificat s-a confirmat folosind kit de secvențare Taq Dye Deoxy™ Terminater Cycle (Applied Biosystems) și folosind un secvențer DNA 373 A Aplied Biosystems) și folosind un secvențer DNA 373 A Aplied Biosystgems 373A. Ca rezultat s-a confirmat că toți plasmizii care codifică dH33, A33‘, T33', dG116, dR117, A116', <311‘ și N116‘ au avut secvența cDNA TPO așteptată fără vreo substituție a secvenței nucleotidice la alte situri, decât cele la care s-a intenționat. Pe lângă aceasta, în G33' s-a observat o substituție de bază (Pro 38(CCT) - Ser (TCT)), alta decât la situl la care s-a intenționat.

Transfecția fiecărei clone obținute în celulele COS 7 s-a dirijat conform metodei din exemplul 11. Pe scurt, transfecția s-a efectuat folosind 10 pg din fiecare plasmid DNA prin metoda DEAE-dextran incluzând tratamentul clorochină și după 4-5 zile supernatantul culturii s-a recuperat, s-a evaluat prin sistemul de testare M-07e. Ca rezultat, în fiecare supernatant al celulelor COS transfectate cu plasmizi care codifică un derivat de inserție sau deleție, s-a detectat activitate TPO într-un mod dependent de doză (fig.23). Din contră, nu s-a găsit activitate TPO în supernatantul culturii celulelor COS 7 în care plasmidul de expresie pEF18S nu conține un cDNA care să codifice un derivat TPO.

>

Exemplul 69. Prepararea și purificarea anticorpilor peptidici anti-TPO umane (1) S-au selectat de la secvența aminoacidă a TPO umane din SECV.ID.nr.191,6 regiuni (prezentate în tabelul 8) care sunt considerate relativ adecvate ca antigeni, de la care s-a sintetizat o peptidă 4-împletită a unei peptide antigen de tip multiplu (MAP) prin metoda Tam (Proc.Natl.Aca.Sci., SUA, 85,5409-5413,1988). S-au imunizat 2 iepuri de 8 ori fiecare cu 100 pg din această peptidă.

Separat de cele de mai sus s-au produs peptide cu împletire unică prin legarea restului de cisteină la C-terminal al fiecăreia dintre regiunile peptidice prezentate prin SECV. ID.nr.119-124 (acestea sunt cunoscute ca o regiune peptidică HT, respectiv regiunile 1 la 6 care sunt peptidele parțial corespunzătoare la 8 la 28, 47 la 62, 108 la 126,172 la 190, 262 la 284 și respectiv, 306 la 332 ale secvenței SECV.ID.nr.191). Folosind acestea ca antigen test, s-au măsurat valorile anticorpului de la acestea în serurile obținute de la iepurii astfel imunizați prin imunotest enzimatic de la care s-a confirmat creșterea valorii anticorpului în toate serurile testate. Astfel, aceste seruri s-au considerat ca antiseruri.

în plus, peptidă sintetică cu împletire simplă menționată mai sus care are returul cisteină legat la C-terminalul său s-a folosit, de asemenea, ca antigen în purificarea de afinitate a antiserurilor în continuare (2).

(2) Doi iepuri s-au imunizat fiecare cu una dintre peptidele antigen menționate mai sus, și anticorpul derivat de la fiecare dintre iepurii astfel imunizați s-a preparat separat. Concret, pentru anticorpi peptidici anti-HT1, s-au obținut anticorp peptidic anti-HT1-1 și anticorp peptidic anti-HT1-2 derivat de la cei 2 iepuri imunizați.

Ca, de exemplu, se ilustrează mai jos purificarea anticorpului peptidic HT-1-1-anti.

Inițial, 30 mg din peptidă cu împletire simplă a HT1 care are restul cisteinic legat la aceasta s-a cuplat 12 ml sulfolinkCouplingGel (produs de Pierce Co., număr de catalog

44895). Mai precis, o soluție de peptidă, care conține antigenul, s-a cuplat pe gelul care a fost echilibrat cu un tampon de cuplare (50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH= 8,5) de 6 ori volumul gelului pe o perioadă de 15 min. Imediat, după ce s-a lăsat să stea ca atare timp de min, gelul s-a spălat cu tamponul de cuplare de 3 ori volumul gelului. în continuare, s-a adăugat la tampon de cuplare care conține-cisteină-HCI 0,05M la gel la o rată de 1 ml/ml gel

RO 118299 Β1

5525 prin care grupările netratate s-au blocat după o perioadă de 15 min. După ce a fost lăsat să stea 30 min, gelul s-a spălat cu tamponul de cuplare de 8 ori față de volumul gelului. Operația de cuplare menționată mai sus s-a efectuat la temperatura camerei. în acest mod, peptida care conține regiunea antigenică s-a cuplat la gel prin legare covalentă la o eficiență de cuplare de 28,3% pentru a prepara un gel peptidă antigenică care are 0,8 mg peptidă cuplată la 1 ml de gel în coloana antigen. După colectarea sângelui total de la fiecare iepure imunizat s-au obținut 78,4 ml de anti-ser (care are un conținut de proteină de 3620 mg) la coloana antigenului care a fost echilibrată anterior cu tampon fosfat 50 mM (pH=8) conținând 150 mM NaCI și 0,05% azidă de sodiu, apoi coloana s-a spălat cu același tampon. Astfel, s-au obținut 105,9 ml dintr-o fracțiune care a trecut (care are un conținut de proteină de 3680 mg). în continuare, fracțiunea adsorbită s-a eluat cu tampon acid citric 0,1 M (pH=3,0), care a fost imediat neutralizat prin adăugare la aceasta a 21,1 ml de tampon carbonat 0,1 M (pH=9,9), s-a concentrat prin ultrafiltrare (folosind membrana YM30 produsă de Amicon Co.) și s-a purificat în tampon fosfat 50 mM (pH=8) care conține 150 mM NaCI și 0,05% azidă de sodiu. Astfel, s-a obținut în tampon 11,2 ml anticorp peptidic purificat anti-HT1-1 (care are un,conținut de proteină de 77,7 mg). în același mod ca mai sus s-au obținut anticorpul peptidic anti-HT1-2 (60,0 mg), anticorpul peptidic asnti-HT2-1 (18,8 mg), anticorpul peptidic antiHT2-2 (8,2 mg), etc.

în același mod ca mai sus s-au obținut anticorpii peptidici anti-HT3 până la anti-HT6. Exemplul 70. Detecția analizei Western TPO (1) Pentru evaluarea anti-serurilor obținute în exemplul 69, acestea s-au testat în maniera menționată în continuare.

O probă standard de TPO uman recombinant care a fost parțial purificată din supernatantul culturii de celule CHO în care a fost introdusă și exprimată o genă care codifică pentru aminoacizii -21 până la 332 ai SECV.ID.Nr.6, s-a supus la electroforeza SDS-poliacrilamidă (SDS-PAGE), conform metodei obișnuite, și apoi, s-a pătat electric pe o membrană PVDF sau miocrocelulozhică. După pătare, membrana s-a spălat cu Tris- HCI 20 mM și NaCI 0,5 M (pH=7,5) (TBS) 5 min, apoi s-a spălat de 2 ori cu Tween 20 0,1% care conține TBS (TTBS) 5 min și s-a tratat cu un agent de blocare (Blopck Ace; produs de Dai-Nippon Pharmaceutical Co., număr de catalog UK-B25) 60 min. Antiserurile, fiecare separat conținând ,unul dintre anticorpul peptidic anti-HT1-1, anticorp peptidic anti-HT2-1, anticorp peptidic anti-HT3-2, anticorp peptidic anti-HT4-1, anticorp peptidic anti-HT5-2 și anticorp peptidic anti-HT6-1, s-au diluat fiecare cu soluție TTBS conținând 0,05% BSA și 10% Block Ace la diluții 1/1000. Anticorpii astfel diluați s-au folosit pentru test Western ca anticorp inițial. Mai precis, proba TPO umană recombinantă prelucrată ca mai sus s-a tratat cu soluție TTBS care conține anticorp peptidic anti-TPO, 0,05% BSA și 10% Block Ace 60 min și apoi s-a spălat cu TTBS 5 min. Imediat aceasta s-a tratat cu soluție TTBS care conține anticorp biotinat de capră anti-iepure (ab’) (produs de Catalog Co., număr de catalog L43015) ca anticorp secundar împreună cu 0,05% BSA și 10% Block Ace 60 min și apoi, s-a spălat de 2 ori cu TTBS 5 min. în continuare, aceasta s-a tratat cu o diluție 1/5000 de fosfatază alcalină marcată avidină (produsă de Leinko Technologies Co., număr de catalog A108) s-a diluat cu 10% Block Ace conținând soluție TTBS 30 min și după aceea s-a spălat de 2 ori fiecare cu TTBS 5 min și apoi cu TBS 5 min. Apoi, aceasta s-a developat folosind un substrat fosfatază alcalină (produsă de Bio-Rad Co., număr de catalog 170-6432). Testul Western menționat mai sus s-a dirijat la temperatura camerei verificându-se că TPO uman a fost recunoscut și s-a detectat prin anti-seruri.

(2) Din anticorpii peptidici care au fost purificați prin cromatografie de afinitate antiHT1-1, anti-HT1-2, anti-HT2-1 și anti-HT2-2, câte 3 mg din fiecare s-au cântărit și biotinat prin cuplarea lor pe o biotină activată (NHS-LC-Biotin II, produsă de Pierce Co., număr de

5530

5535

5540

5545

5550

5555

5560

5565

5570

RO 118299 Β1 catalog 21336). Aceeași probă standard de TPO uman recombinant ca cea folosită anterior în (1) s-a supus la SDS-PAGE, apoi, s-a pătat electric pe o membrană PVDF sau nitrocelulozică și s-a supus la testul Western obișnuit folosind fiecare din acești anticorpi biotinați ca anticorpi primari. Imediat după pătare, membrana s-a spălat cu TBS 5 min și apoi s-a spălat de 2 ori fiecare cu TTBS 5 min și după aceea, aceasta s-a tratat cu un agent de blocare (Block Ace) 60 min. Imediat aceasta s-a tratat cu o soluție TTBS care conține un 1 Mg/ml de anticorp peptidic biotinat anti-TPO, 0,05% BSA și 10% Block Ace 60 min și apoi s-a spălat de 2 ori fiecare cu TTBS 5 min. Apoi, aceasta s-a tratat cu o diluție 1/5000 de fosfatază alcalină marcată avidină (produsă de Leinco Technologies Co., număr de catalog A108), s-a diluat cu 10% Block Ace care conține soluție TTBS 30 min după care s-a spălat de 2 ori fiecare cu TTBS 5 min și apoi cu TBS 5 min. Apoi, aceasta s-a developat folosind un substrat fosfataza alcalină (produs de Bio-Rad Co., număr de catalog 170-6432). Testul Western menționat mai sus s-a efectuat la temperatura camerei și s-a verificat că TPO uman a fost recunoscută și detectată prin anticorpi purificați.

Exemplul 71. Prepararea coloanelor de anticorp peptidic anti-TpO și detectarea TPO uman

Anticorpii peptidici anti-TPO uman obținuți în exemplul 69 s-au verificat ca recunoscând TPO uman. Acești anticorpi s-au cuplat separat pe un purtător cromatografie pentru prepararea coloanelor de anticorp peptidic anti-TPO. Ca un exemplu, în continuare este ilustrată prepararea coloanei de anticorp peptidic anti-HT 1 -2.

(1) S-a preparat o soluție cuprinzând Na fostat 50 mM și 0,15 M NaCI (pH=8,0) și care conține 5 mg/ml de anticorp. Din această soluție 0,8 ml s-au combinat și s-au cuplat cu 1,54 ml gel umflat activat formil (Formyl-Gellulofine produs de Chisso Co.) la 4°C, 2 h. Imediat, s-a adăugat la aceasta 1,1 ml dintr-o soluție care conține 10 mg/l de agent reducător (trimetilaminoboran (TMAB), produs de Seikagaku Kokyo K.K., număr de catalog 680246) și s-a cuplat cu ele pentru încă 4 h. Apoi, s-a recuperat din amestecul de reacție prin centrifugare numai partea de gel. S-au adăugat la aceasta 10 ml apă pură și s-a recuperat din acesta prin centrifugare numai partea de gel. Prin acest proces repetat de 4 ori s-a îndepărtat anticorpul care nu a reacționat. Imediat, gelul astfel recuperat s-a tratat cu 2,1 ml tampon de blocare (fosfat de sodiu 0,2 M, etanolamină 1M, pH=7,0) și s-a adăugat la aceasta la 4°C, 2 h 1,1 ml soluție de agent reducător, prin care grupările active din gelul nereacționat s-au blocat. La sfârșit gelul rezultat s-a spălat cu apă, Tris HCI 20 mM și NaCI 0,15 M (pH=8,0) folosind o centrifugă. Cu acesta s-a umplut o colonană mică care s-a spălat cu soluție tiocianat de sodiu 3M și soluție glicină HCI 0,1 M (pH=2,5) și apoi s-a echilibrat din nou cu Tris HCI 20 mM și NaCI 0,15 M (pH=8,0). Coloana astfel echilibrată s-a depozitat.

Gelul anticorp peptidic anti-TPO în coloana anticorp anti-HT1-2a avut o eficiență de cuplare de până la 94,2% pentru fiecare fracțiune IgG. Cantitatea fracțiunii de IgG cuplată pe gel pe unitatea de volum a gelului a fost 1,9 mg/ml gel. în același mod ca mai sus, s-a preparat un gel pe care a fost cuplat IgG fără activitate TPO ca antigen în cantitate de 21,8 mg/ml gel. Aceasta s-a folosit ca o precoloană (denumită în continuare, coloană preanticorp) pentru scopul îndepărtării moleculelor care nu se leagă specific din coloanele de anticorpi TPO așa cum se menționează în (2).

(2) în continuare, este ilustrat alt exemplu de preparare a unei coloane anticorp antiHT1-2.

O probă standard de TPO uman recombinant care a fost parțial purificată din supernatantul culturii celulelor OHO în care a fost introdusă și exprimată o genă care codifică pentru secvența aminoacidă a oricăreia dintre SECV.ID.Nr.119-124, s-a adăugat la coloana preanticorp (care conține 1 ml gel) preparată la (1), și de 10 ori volumul gelului de Tris-HCI mM (pH=8,0) și NaCI 0,15 M, s-au trecut prin și s-a colectat fracțiunea care trece prin

R0118299 Β1

5620 coloană. Fracțiunea absorbită la coloana pre-anticorp s-a eluat cu de 10 ori volumul gelului un eluent acid (glicină-HCI 0,1 M, pH=2,5). Fracțiunea care a trecut prin coloana pre-anticorp s-a adăugat la coloana anticorp anti-HT1-2 (conținând 2 ml gel) preparată la (1), și coloana s-a spălat cu de 10 ori volumul gelului Tris-HCI 20 mM (pH=8,0) și NaCI 0,15 M, colectând în același timp fracțiunea care trece prin coloana anticorp anti-HT1-2. Fracțiunea adsorbită la coloană anticorp anti-HT1-2 s-a eluat cu de 8 ori volumul gelului eluent acid (glicină-HCI, 0,1 M pH=2,5). Aceste fracțiuni s-au analizat prin SDS-PAGE prin care s-a verificat că TPO nu se adsoarbe la coloana pre-anticorp, dar s-a legat specific la coloana anticorp anti-HT 1 -2 și că cea mai mare parte a TPO din proba adăugată s-a legat la coloana din urmă. Din aceasta, se confirmă că cel puțin 200 până la 300 /zg/ml - gel de TPO s-a legat la gel în ultima coloană.

Exemplul 72. Efectul TPO pentru creșterea numerelor de plachete

S-au împărțit la întâmplare în 4 grupuri 20 șoareci masculi normali ICR, în vârstă de 8 săptămâni, (sângele a fost colectat deja din venele lor orbitale și s-a măsurat numărul de plachete folosind o microcameră de numărătoare F800 produsă de Toa lyo Denshi). Unul dintre cele 4 grupuri (un grup de control iv) s-a injectat pe cale intravenoasă cu 100 μΙ PBS o dată pe zi 5 zile consecutive. Unul din celelalte grupuri (grup TPO-iv) s-a injectat intravenos o dată pe zi 5 zile consecutive cu 100 μΙ dintr-o soluție preparată prin substituirea soluției concentrate a fracțiunii F2 TPO activă a SP Sepharose Fast Flow obținute în exemplul 56 cu PBS folosind o coloană NAP-25 (Pharmacia Biotech; număr de catalog 17-0852-02) urmat de diluare cu PBS, (conține activitate relativă 211900 prin test M-07e). Alt grup (grup control-sc) s-a injectat cu 100 μΙ PBS subcutanat o dată pe zi 5 zile consecutive în același timp grupul care a rămas (grup TPO-sc) injectându-se cu 100 μΙ o dată pe zi 5 zile consecutive în același mod ca grupul TPO-iv. După 6,8,10,13 și 15 zile de la inițierea administrărilor s-a colectat sânge din vena orbitală a fiecăruia dintre șoareci și s-au numărat plachetele folosind o microcameră de numărare (F-800; produsă de Toa lyo Denshi). Schimbările din numărul plachetelor sunt date în fig.24 astfel, la grupul de control iv numărul plachetelor a crescut cu 44% comparativ cu cel de înaintea administrării pe ziua 6 (ziua 0 fiind ziua administrării) când numărul plachetelor a fost cel mai ridicat și, la grupul control s-a remarcat o creștere 47% în ziua 8 când numărul a fost cel mai ridicat. Pe de altă parte, la grupul TPO-iv s-a remarcat o creștere 177% în ziua 6 comparativ cu numărul de înaintea administrării și, la grupul TPO-SC o creștere de 347% s-a remarcat deja în ziua 6, în ziua 8 fiind atinsă cea mai ridicată creștere de 493%.

Din rezultatele de mai sus, s-a confirmat că TPO uman crește numărul plachetelor independent de diferența în timp și, de asemenea, de cele de administrare.

Exemplul 73. Efectul TPO pentru creșterea numărului de plachete

Șaisprezece șoareci masculi normali C3H/HeJ, în vârstă de 11 săptămâni, (s-a recoltat deja sânge din venele lor orbitale și s-au numărat plachete folosind o microcameră de numărătoare de tip F-800 produsă de Toa lyo Denshi) s-au împărțit la întâmplare în 4 grupe. Unul dintre cele 4 grupuri (grup de control) s-a injectat cu 100 μΙ PBS subcutanat o dată pe zi 5 zile consecutive. Alt grup (grupul TPO-1) s-a injectat subcutanat cu 100 μΙ dintr-o soluție (preparată prin substituirea fracțiunii active TPO a Sephacryl S-200HR obținută în exemplul 56 cu PBS folosind NAP-25 urmat de diluare cu PBS; conținând activitate relativă 83000 prin testul M-07e) o dată pe zi 5 zile consecutive. încă un alt grup (grup TPO-2) s-a injectat cu 100 μΙ dintr-o soluție (preparată prin diluarea fracțiunii TPO active folosită la grupul TPO-1 cu PBS pentru a o mări de 2 ori; care conține activitate relativă 41500 prin testul M-07e) subcutanat o dată pe zi 5 zile consecutive. Ultimul grup (grupul TPO-3 s-a injectat cu 100 μΙ dintr-o soluție (preparată prin diluarea fracției TPO active folosită la grupul TPO-2 pentru a o mări de 2 ori; care conține activitate relativă, 20750 prin testul M-07e) subcutanat o dată pe zi 5 zile consecutive.

5625

5630

5635

5640

5645

5650

5655

5660

5665

RO 118299 Β1

S-a colectat sânge din venele orbitale ale șoarecilor pe ziua 6,8,10 și 12 după injectare și s-au numărat plachetele folosind o microcameră de numărătoare (tip F-8000; produsă de Toa lyo Denshi).

Schimbările în numărul plachetelor sunt date în fig.25. Astfel, la grupul de control nu a existat aproape nici o schimbare în numărul plachetelor, în timp ce la grupurile care s-au injectat TPO au existat creșteri în numărul plachetelor la toate grupurile, cele mai ridicate numere s-au înregistrat pe ziua 8 după injectare. în plus, s-au remarcat între grupuri diferențe în doză-răspuns. Astfel, la grupul TPO-1 pe ziua 6 s-a remarcat deja o creștere de circa 200%, crescând până la circa 270% pe ziua 8 și apoi, totuși, s-a remarcat o descreștere în ziua 12 la circa 65%, creșterea care s-a remarcat având o diferență semnificativă față de grupul de control (p mai mic de 0,01, printr-un test de comparație multiplu Dunnet). La grupul TPO-2 s-a găsit aceeași creștere, cu toate că acțiunea de creștere a fost mai mică decât la grupul TPO-1, s-au remarcat creșteri de circa 140% și circa 160% în ziua 6 și respectiv 8. în ziua 12 numerele au descrescut până la aproape același nivel ca la grupul de control. Acțiunea de creștere la grupul TPO-3 a fost mai slabă decât la grupul TPO-2, și pe ziua 8 când numerele au fost cele mai ridicate, s-a remarcat o creștere de circa 110% și din nou, a existat o diferență semnificativă (p mai mic de 0,01) față de grupul de control.

De la rezultatele menționate mai sus, s-a confirmat că TPO uman crește numărul plachetelor independent de tulpina de șoarece și că acțiunea sa are o proprietate-dozărăspuns.

Exemplul 74. Un efect de inhibare al TPO pe trombocitopenie produsă prin administrare de agent anti-canceros

Treizeci șoareci masculi ICR, în vârstă de 8 săptămâni s-au injectat cu 200 mg/kg 5-FU intravenos și s-au împărțit în 2 grupuri, (fiecare grup cuprinzând 15 șoareci), din ziua următoare (ziua 1) unul dintre grupuri (grupul de control) s-a injectat subcutanat cu 100 μΙ PBS o dată pe zi 5 zile consecutiv în același timp celălalt grup (grupul TPO) s-a injectat subcutanat cu 100 μg de fracțiune TPO activă folosită în exemplul 72 (care conține activitate relativă 211900 prin restul M-07e) o dată pe zi 5 zile consecutive. în zilele 4,6 și 8 s-au ales la întâmplare câte 5 șoareci de la fiecare din grupuri, apoi s-a colectat sânge din venele orbitale și s-a determinat numărul de plachete folosind o microcameră de numărare (tip E-2500); produs de Toa lyo Denshi). Schimbările numărului plachetelor sunt date în fig.26. Astfel, la grupul de control numărul de plachete după administrarea de 5-FU a descrescut o dată cu trecerea zilelor și în ziua 6 valoarea a fost cea mai scăzută (circa 28% din valoarea înaintea administrării de 5-FU) cu toate că în ziua a 8-a s-a remarcat o creștere de aproximativ 1,3 ori ca o reacție la descreștere. Chiar în cazul grupului TPO, numărul plachetelor după administrarea de 5-FU a descrescut o dată cu zilele trecute și în ziua 6 valoarea a fost cea mai scăzută (circa 52% din valoarea dinaintea administrării de 5-FU). Cu toate că diferența dintre numărul plachetelor în zilele 4 și 6 a fost foarte mică și în ziua 6 s-a menținut o valoare semnificativ ridicată comparativ cu grupul de control (p mai mic de 0,05; printr-un test de comparație multiplu Dunnet). în ziua 8 a existat o creștere de circa 200% a valorii dinaintea administrării 5-FU.

Din rezultatul menționat mai sus s-a confirmat că TPO uman inhibă descreșterea numărului de plachete așa cum s-au produs printr-un agent anticanceros.

Exemplul 75. Un efect terapeutic al TPO pentru trombocitopenie

S-a injectat intravenos clorhidrat de nimustină (ACNU) (50 mg/kg) la fiecare dintre șoareci masculi ICR de 7 săptămâni, și apoi șoarecii s-au divizat la întâmplare în 2 grupuri (fiecare grup cuprinzând 18 șoareci). Din ziua următoare (ziua 1), unul dintre grupuri (grup de control) s-a injectat cu 200 μΙ de PBS subcutanat de 2 ori pe zi 5 zile consecutive în timp ce alt grup (grupul TPO) s-a injectat cu 200 μΙ de fracțiune TPO activă folosită în

R0118299 Β1 exemplul 73 (fără diluare cu PBS) la care s-au adăugat 0,04% Tween 80 (activitate relativă 380000 prin testul M-07e) subcutanat, de 2 ori pe zi pentru 5 zile consecutive.

După injectare,șoarecii din fiecare grup s-au împărțit la întâmplare în 3 grupuri, de la un grup s-a colectat sânge în zilele 5 și 12; de la alt grup în zilele 8 și 14 și de la grupul rămas, în ziua a 10-a. Sângele s-a colectat din venele orbitale și s-au numărat plachetele printr-o microcameră de numărare (tip F-800; produsă de Toa lyo Denshi). Schimbările în numărul de plachete sunt date în fig.27. Astfel, la grupul de control numărul de plachete după administrarea ACNU a descrescut pe zi ce trece și pe zilele 8-10 valoarea a fost cea mai scăzută (circa 29% din valoarea dinaintea administrării ACNU) și recuperarea a fost de numai circa 49 și circa 74% pe zilele 12 și, respectiv, 14. Pe de altă parte, la grupul TPO s-a remarcat o descreștere până la circa 38% din valoarea dinaintea administrării ACNU pe ziua 5 și apoi situația s-a schimbat la o creștere. Astfel, în ziua 8 valoarea s-a recuperat până la circa 63% din valoarea dinaintea administrării a ACNU și în ziua 10 și după aceea, numărul plachetelor a fost mai mare decât cel dinaintea administrării ACNU. Astfel, în zilele 12 și 14 s-au remarcat creșteri de până la circa 300% și circa 400%.

Așa cum s-a remarcat mai sus, în zilele 8-10 ale căror descreșteri s-au remarcat la grupul de control, o creștere s-a observat deja la grupul TPO și în ziua 10 numărul plachetelor a fost mai mare decât cel dinaintea administrării ACNU. Pentru conformitate, s-a confirmat că TPO uman inițiază recuperarea de la trombocitopenia produsă prin agentul anticanceros.

Luându-se în considerare rezultatele exemplului 74, este de așteptat acum ca TPO uman să inhibe descreșterea numărului de plachete și să promoveze recuperarea de la trombocitopenie independent de tipul agentului anticanceros.

Exemplul 76. Un efect terapeutic al TPO asupra trombocitopeniei după BMI

S-au iradiat 48 șoareci masculi C3H/HeN, în vârstă de 7 săptămâni, cu 10 Gy radiație radioactive asupra întregului corp și imediat după aceea ei s-au injectat intravenos cu 1 x 10⁷ celule de măduvă osoasă de la șoareci de același tip. Șoarecii au fost apoi împărțiți apoi la întâmplare în 2 grupuri și din ziua următoare (ziua 1) unul dintre grupuri (grupul de control) s-a injectat cu PBS în timp ce alt grup (grup TPO) s-a injectat cu fracțiunea activă TPO folosită în exemplul 73 (care conține activitate relativă 4400 prin testul M-07e) cu o doză de 100 μΙ fiecare, subcutanat o dată pe zi 20 zile consecutiv.

După inițierea injectării, s-au ales la întâmplare câte 6 șoareci în zilele 5,10,14 și 21, s-a recoltat sânge din venele lor orbitale și s-a determinat numărul plachetelor printr-o microcameră de numărare (tip E-2500; produsă de Toa lyo Denshi).

Schimbările din numărul plachetelor sunt date în fig.28. Astfel, în toate grupurile, numărul plachetelor a descrescut cu trecerea zilelor după aplicarea BMT și în ziua 10 numerele au fost cele mai scăzute (circa 3% din numerele dinaintea aplicării BMT). După aceasta, s-a remarcat o recuperare graduală și în ziua 4 numărul a fost circa 11% și circa 13% la grupul de control și, respectiv, grupul nTPO. în ziua 21 s-a remarcat o recuperare de numai 37% la grupul de control în timp ce la grupul TPO recuperarea a fost circa 65% pe care s-a observat un efect semnificativ de promovare a recuperării. Din rezultatele menționate mai sus, s-a confirmat că TPO preparat ca în exemplul 56 promovează recuperarea numărului plachetelor după aplicarea de BMT.

Exemplul 77. Un efect terapeutic al TPO pentru trombocitopenie după iradiere cu raze radioactive

S-au iradiat 36 șoareci masculi ICR în vârstă de 8 săptămâni cu raze X de 5 Gy pe întregul corp și s-au împărțit la întâmplare în 2 grupuri. Din ziua următoare (ziua 1) unul din grupuri (grupul de control) s-a injectat cu PBS în timp ce alt grup (grup TPO) s-a injectat cu o fracțiune activă TPO folosită în exemplul 73 (conținând activitate relativă 144000 prin testul

5720

5725

5730

5735

5740

5745

5750

5755

5760

5765

RO 118299 Β1

M-07e) o dată pe zi subcutanat 3 zile consecutive și din ziua următoare s-a injectat subcutanat o dată pe zi 7 zile consecutive o activitate relativă de 360000 prin testul M-07e. După inițierea injectării fiecare dintre grupuri a fost împărțit la întâmplare în 3 grupuri - un grup de la care s-a colectat sânge în zilele 4,11 și 21; alt grup în zilele 7 și 13 și în grupul rămas, în zilele 9 și 15. Colectarea sângelui s-a făcut din venele orbitale și s-au determinat numerele de plachete printr-o microcameră de numărare (tip F-800; produsă de Toa lyo Denshi). Schimbările în numărul de plachete sunt date în fig.29. Astfel, la grupul de control numărul plachetelor a descrescut cu trecerea zilelor după iradiere cu raze X și în ziua 9 numerele au fost cele mai mici (circa 25% din numărul dinaintea iradierii cu raze X). în zilele 11 și 13, s-a recuperat până la circa 38% și, respectiv, 67% și în ziua 15 ei au recuperat până la valorile dinaintea iradierii cu raze X. La grupul TPO, numerele au descrescut până la circa 24% din cele dinaintea iradierii cu raze X în ziua 7. După aceasta s-a notat o creștere pe ziua 9, numerele recuperându-se până la circa 82%. în ziua 11, și după aceea, numerele plachetelor au fost mai mari decât cele dinaintea iradierii cu raze X și până în ziua 21, această tendință s-a menținut. Așa cum s-a menționat mai sus, în ziua 9 în care numerele tind să descrească la grupul de control, numărul plachetelor la grupul TPO s-a schimbat deja la o creștere și în ziua 11, numerele plachetelor au fost mai mari decât cele dinaintea iradierii cu raze X rămânând în același timp ridicat chiar după aceea. Pe de altă parte, la grupul de control a fost nevoie de 15 zile pentru recuperarea numărului de plachete dinainte iradierii cu raze X. De la aceste rezultate, s-a confirmat că TPO umană produsă în exemplul 56 scurtează timpul necesar pentru recuperare din descreșterea în numărul de plachete după iradiere cu raze X și că ele prezintă un efect terapeutic pentru trombocitopenie după iradiere cu raze X.

Exemplul 78. Efectul hTPO163 pentru creșterea numerelor de plachete

S-au împărțit la întâmplare în 4 grupuri un grup de control și grupurile A, B și C, 15 șoareci masculi sănătoși C3H/HeN de la care s-a recoltat deja sânge din venele lor orbitale și s-a determinat numărul de plachete printr-o cameră de numărare (tip F-800; produsă de Toa lyo Denshi). Primul grup (grupul de control) s-a injectat subcutanat cu PBS care conține 0,1% ser de la șoarece o dată pe zi 5 zile consecutiv. Grupurile A, B și C s-au injectat cu fracțiunea TPO activă a SP Sepharose Fast Flow obținută în exemplul 65 urmată de diluție cu PBS conținând 0,1% ser de șoareci la doze de circa 40000000, circa 8000000 și circa 1600000/kg greutate corporală pe zi, respectiv, în termenii activității relative, a hTPO 163 prin testul M-07e, 5 zile consecutive, subcutanat.

în zilele 6, 8,10 și 12 după injectare, s-a colectat sânge din vena orbitală a fiecărui șoarece și s-au numărat plachetele printr-o microcameră de numărătoare (tip F-800; produsă de Toa lyo Denshi). Schimbările din numerele plachetelor sunt date în fig.30.

Astfel, la grupul de control aproape nu au fost schimbări în numărul plachetelor în timp ce la grupurile care au primit TPO s-au remarcat creșteri în numărul de plachete în toate cazurile dând cele mai ridicate valori în ziua 8 după injectare. La fiecare dintre grupurile care au primit TPO s-a remarcat o relație doză-răspuns. Astfel, la grupul A s-au găsit creșteri de circa 88% și circa 100% în zilele 6 și .respectiv, 8 și chiar în ziua 10, s-a menținut o creștere de circa 97%, toate aceste date arătând o diferență semnificativ față de grupul de control (p mai mic de 0,01 printr-un test de comparație multiplu Dunnet). Creșteri similare s-au găsit la grupul B cu toate că gradul de creștere a fost mai scăzut decât cel al grupului A, remarcându-se creșteri de circa 65% și circa 84% în zilele 6 și 8, arătând o diferență semnificativă față de grupul de control (p mai mic decât 0,01 sau 0,05 printr-un test de comparație multiplu Dunnet). Acțiunea de creștere la grupul C a fost mai scăzută decât la grupul B. Ea a prezentat încă o creștere de circa 31% în ziua 8 când s-au găsit cele mai mari numere. Din rezultatele menționate mai sus, s-a confirmat că hTPO 163 produsă în exemplul 65, crește numărul de plachete și că acțiunea sa arată o relație doză-răspuns.

R0118299 Β1

5820

Exemplul 79. Un efect terapeutic al hTPO 163 pentru trombocitopenie

S-au injectat intravenos 100 șoareci masculi C3H/HeN, în vârstă de 8 săptămâni, cu 50 mg/kg clorhidrat de nimustină (ACNU) și apoi, s-au împărțit la întâmplare în 4 grupuri un grup de control și grupurile A, B și C - fiecare cuprinzând 25 șoareci. Din ziua următoare (ziua 1) grupul de control s-a injectat subcutanat cu 5 ml/kg de PBS o dată pe zi pentru zile consecutive, în timp ce grupurile A, B și C s-au injectat subcutanat cu fracțiunea activă TPO a SP Sepharose Fas Flow obținută în exemplul 65, diluat cu PBS la doze de circa 16000000, circa 48000000 și, respectiv, circa 160000000/kg greutate corporală/zi în termenii activității relative a hTPO 163 prin test M-07e o dată pe zi, câteva zile consecutiv.

După inițierea injectării, șoareci din fiecare grup s-au împărțit la întâmplare în 5 grupuri și s-a colectat sânge în zilele 5,8,10,12 și 14. Colectarea sângelui s-a făcut din venele lor orbitale și s-au numărat plachetele printr-o microcameră (tip E-2500; produsă de Toa lyo Denshi). Schimbările în numărul plachetelor sunt date în fig.31. Astfel, la grupul de control numărul de plachete a descrescut cu trecerea zilelor după administrarea ACNU dând cele mai scăzute valori (circa 15-16% din cea dinainte de administrarea ACNU) în zilele 8-10 și mărimea recuperării a fost doar de circa 28% și circa 51% în zilele 12 și, respectiv, 14. Pe de altă parte, la grupul A numărul a descrescut până la circa 25% din cel dinaintea administrării ACNU în ziua 8. După aceea, totuși, ele s-au schimbat spre creștere cu recuperare până la o mărime de circa 34% și circa 89% cum s-a remarcat în zilele 10 și, respectiv, 12. în ziua 14, numărul a fost mai mare decât cel dinaintea administrării ACNU.

Așa cum s-a menționat mai sus, cele mai mici numere de plachete s-au găsit în ziua 8 în toate grupurile cu toate că la grupurile la care s-a dat TPO uman descreșterea a fost mai lentă decât la grupul de control, dând naștere la cele mai mici numere de plachete. La grupul de control, aproape nu a existat nici o recuperare a numărului plachetelor chiar în ziua 10, în timp ce la grupurile care au primit TPO uman, recuperarea numărului de plachete s-a remarcat la toate grupurile cu toate că gradele lor au variat. La un grup la care s-au administrat 50 Mg/kg, s-a remarcat recuperarea în ziua 12, dând numere chiar mai mari decât cele dinainte de administrarea ACNU. Când s-a comparat cu faptul că la grupul de control recuperarea a fost la fel de mică, de circa 51%, comparată cu starea dinaintea administrării ACNU chiar în ziua 14, a devenit clar că hTPO 163 produsă ca în exemplul 65, promovează recuperarea de la scăderea numărului de plachete. Astfel, s-a confirmat că hTPO163 are un efect terapeutic asupra trombocitopeniei produse de agenți anticanceroși.

în continuare sunt date exemple de preparate farmaceutice.

Exemplul 80. Fracțiunea TPO umană obținută în exemplul 56 s-a concentrat, s-a supus la tratament aseptic și s-a înghețat la - 20°C, pentru a da un produs înghețat de folosit cu un preparat injectabil.

Exemplul 81. Fracțiunea TPO umană obținută în exemplul 56, s-a concentrat, 5 ml din ea s-a introdus într-o fiolă de 10 ml, folosind operare aseptică, s-a liofilizat la - 20°C, și fiola s-a închis cu un dop de cauciuc pentru a da o substanță liofilizată pentru a fi folosit ca un preparat injectabil.

Exemplul 82. Fracțiunea TPO umană obținută în exemplul 56 s-a concentrat, s-a supus filtrării aseptice și s-a introdus într-o fiolă de 10 ml pentru a da un produs de folosit ca preparat injectabil.

Exemplul 83. Fracțiunea hTPO163 obținută în exemplul 65, s-a concentrat, s-a supus la tratament aseptic și s-a liofilizat la -20°C, pentru a da un produs înghețat de folosit ca preparat injectabil.

Exemplul 84. Fracțiunea hTPO163 obținută în exemplul 65, s-a concentrat, 5 ml din ea s-a introdus într-o fiolă de 10 ml folosind operare aseptică , s-a liofilizat la -20°C, și fiola s-a sigilat cu un dop de cauciuc pentru a da un produs liofilizat de folosit ca preparat injectabil.

5825

5830

5835

5840

5845

5850

5855

5860

5865

RO 118299 Β1

Exemplul 85. Fracțiunea hTPO163 obținută în exemplul 65, s-a concentrat,s-a supus filtrării aseptice și s-a introdus într-o fiolă de 10 ml pentru a da un produs de folosit ca preparat injectabil.

Exemplul 86. Fracțiunea TPO uman obținută în exemplul 57, s-a concentrat, s-a supus unui tratament aseptic și s-a înghețat la - 20°C, pentru a da un produs înghețat de folosit ca preparat injectabil.

Exemplul 87. Fracțiunea TPO uman obținută în exemplul 57, s-a concentrată, 5 ml din ea s-au introdus într-o fiolă de 10 ml, folosind operarea aseptică, s-a liofilizat la -20°C, și fiola s-a închis cu un dop de cauciuc pentru a da un produs liofilizat de folosit ca preparat injectabil.

Exemplul 88. Fracțiunea TPO uman din exemplul 57, s-a concentrat s-a supus la o filtrare aseptică și s-a introdus într-o fiolă de 10 ml, pentru a obține un produs de folosit ca preparast injectabil.

Exemplul 89. Plasmă canină aplastică

S-a produs plasmă canină aplastică heparinizată (“APK9) sau plasmă canină normală (“NK9) așa cum s-a descris (Mazur, E. și South K. Ex.Hematol. 13:1164-1172 (1985); Arriaga, E., South K., Cohen J.R. și Mazur E.M. B1000 69; 486-492 (1987); Mazur E., Basilico, O., Newton, J.R., Cohen, J.L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A., și Narendran, A.BIood, 76:1771-1782 (1990)) cu excepția că s-au eliberat la recipiente 450 razi de iradiere corporală totală.

Exemplul 90. Testarea megacariocitelor umane

Metode standard .pentru numeroase dintre procedurile descrise în exemplele următoare, sau proceduri alternative potrivite sunt date în manuale de biologie moleculară binecunoscute cum ar fi, de exemplu, Sambrook și colab., (Editor) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1987) și în Ausubel și colab., (editori) Current Protocols in Molecular Biology, Green associates/Wiley Interscience, New York (1990).

S-au analizat APK9 și APK9 fracționat pentru capacitatea de a stimula dezvoltarea megacariocitelor umane de la celule progenitoare CD34⁺. Celule CD34⁺ selectate s-au obținut din celule sanguine periferice așa cum s-a descris (Hokom, M.H.,Choi, E.,Nichol, J.L., Homkohl, A.,Arakawa, T. și Hunt, P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15-31,1994) și s-au incubat în următorul mediu de cultură: mediul lui Iscove modificat Dulbecco (IMDM; GIBCO, Grand Island, NY) suplimentat cu glutamină Pen-strep 1% (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) și heparinizat 10% plasmă umană AB săracă în plachete. Au fost incluse, de asemenea, 2-mercaptoetanol (10⁴M), acid pirivic (110 Mg/ml), colesterol (7,8 Mg/ml), adenozină, guanină, citidină, uridină, timidină, 2-deoxycitozină, 2-deoxiadenozină, 2-deoxiguanozină (10 Mg/ml din fiecare, Sigma); insulina umană recombinantă (10 Mg/ml), transferină umană (300 Mg/ml), lipide de soia (1%, Boehringer - Mannheim, Indianopolis, IN); factor de creștere fibroblastică de bază uman recombinant (2ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA); factor de creștere epidermală uman recombinant (15 ng/ml), factor de creștere derivat plachetar (10 ng/ml, Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA). S-au etalat celule selectate CD³⁴' la 2 x lO^ml mediu de cultură, volum final 15 μΙ în godeurile plăcilor microtitroare de tip Terasaki (Vanguard, Inc., Neptune, NJ). Celulele s-au incubat la 37°C, 8 zile în incinte umezite în aer cu 5% CO₂, s-au fixat direct la godeurile culturii cu glutaraldehidă 1 % și s-au incubat cu un amestec de anticorpi monoclonali (anti-GPIb, anti-GPIIB, (Biodesign) și anti-GPIb (Dako, Carpinteria, CA). Reacția imună s-a developat cu un sistem de detecție streptavidină - beta - galactozidază (HistoMark, Kirgegaard și Perry). Megacariocitele s-au indentificat printr-ο culoare albastră și s-au numărat cu un microscop de fază inversă la mărire 100 X. Rezultatele s-au prezentat ca media numărului de megacariocite per godeu ± eroarea medie standard (SEM). în unele

R0118299 Β1 cazuri, datele s-au prezentat în termenii “unități megacariocdite/ml” când gradul la care o probă dată care a indus dezvoltarea megacariocitelor s-a normalizat la controlul APK9 pozitiv pentru acel experiment. O unitate se'definește ca fiind cantitatea de material ce rezultă la același număr de cariocite ca 1 μΙ de APK9 standard. Activitatea s-a acceptat ca datorată ligandului MPL dacă el a putut fi blocat cu 5-10 μς/ηιΙ MPL-X (receptor solubil Mpl).

S-a dovedit că APK9 conține factori (i) care stimulează dezvoltarea megacariocitelor umane în acest sistem. Celule CD34 selectate s-au incubat NK910% timp de 8 zile au prezentat un număr neglijabil de megacariocite colorate albastru, în timp ce celule CD34 selectate incubate APK9 10% 8 zile prezintă un număr foarte mare de megacariocite colorate albastru.

Fig.32 arată că la creșterea concentrațiilor de Mpl-X adăugate sistemului de cultură de megacariocite umane în creștere blochează dezvoltarea megacariocitelor. La concentrații ale Mpl-X mai mari de 5 μg/ml, inhibiția este completă. în acest experiment, celule CD34 selectate s-au stimulat cu APK9 5%. Aceasta demonstrează că pentru dezvoltarea megacariocitelor umane este necesară o activitate care interacționează cu Mpl-X (presupus ligandul Mpl), și implică ca ligandul MPI să fie prezent în însăși APK9.

Aici, s-a demonstrat ulterior că activitatea ligandului Mpl necesară pentru dezvoltarea megacariocitelor este prezentă în APK9. S-a diluat APK9 (135 ml) de 6 ori în mediul Iscove și s-a aplicat la o coloană de afinitate Mpl-X. Materialul nelegat (curs prin) s-a colectat și s-a concentrat până la volumul inițial dinaintea analiazei. Materialul legat s-a eluat în 10 ml de NaCI 1M, și 20% din depozit s-a diafiltrat și s-a concentrat de 4 ori pentru analiză. Celule CD34 selectate incubate doar în mediu nu s-au dezvoltat în megacariocite. Celulele incubate în APK9 5% (același depozit ca cel aplicat la coclonă) s-au dezvoltat în 48 ± 8 megacariocite per godeu. Celulele incubate în 10% din materialul nelegat nu s-au dezvoltat în megacariocite. Celulele incubate în 10% din depozitul de la eluție s-au dezvoltat în 120 ± 44 megacariocite per godeu. Atât, activitățile încărcăturii coloanei, cât și depozitul eluat s-au inhibat substanțial complet cu 5 μρ/ιτιΙ Mpl-X în analiză.

Exemplul 91. Transfecția receptorului Mpl uman sau murin într-o linie celulară murină

A. Recetor Mpl murin

S-a subclonat cDNA receptor Mpl murin de lungime întreagă într-un vector de expresie care conține un promotor transcripțional derivat de la LTR-ul virusului sarcomului murin Maloney. S-au co-electroporat 5 μο din acest construct și 1 μg din markerul selectabil al plasmidului pWLNEO (Stratagene) într-un IL-3 dependent de linie celulară murină (32 D, domeniul 23; Greenberger și colab., PNAS 80: 29-31 - 2936 (1983). Celulele s-au cultivat 5 zile pentru recuperarea din procedură, și apoi, s-au incubat în mediul de selecție care include 800 μο/ml Geneticin (G418, Sigma) și 1 ng/ml IR-3 murin. Celulele supraviețuitoare s-au împărțit apoi în 2 rezerve a 2 x 10⁵ celule și s-au cultivat până a apărut o populație care a putut fi analizată în continuare. Sau testat 6 populații pentru expresia suprafeței receptorului Mpl prin analiză FACS folosind un ser antipeptidic policlonal de iepure. S-a ales o populație pentru sortare FACS folosind același ser antipeptidic ca înainte. S-au selectat clone de celule singulare ale liniei celulare parentale prin creștere în APK9 10% și Geneticin. După selecție în APK9 timp de 35 zile, celulele s-au menținut în 1 ng/ml IL-3 murin. Una dintre subclone, 1 A6.1, s-a folosit pentru această parte a lucrării.

B. Receptorul Mpl uman

S-a subclonat secvența receptorului Mpl uman de lungime întreagă (Vigon, I., și colab., PNAS 89: 5640-5644(1992)) într-un vector de expresie care conține promotorul transcripțional al virusului sarcoma murin Maloney (același vector ca pentru receptorul

5920

5925

5930

5935

5940

5945

5950

5955

5960

RO 118299 Β1 murin). S-au transfectat 6 μς din acest construct și 6 μ$ dintr-un construct de împachetare amfotrofic retroviral (Landauj, N.R.,Littman, D.R., J.Virology 66:5110-5113 (1992)) în 3 x 10⁶ celule 293 folosind un kit de transfecție mamiferă CaPO4, Stratagene. Aceleași celule s-au retransfectat după 2 zile și din nou după 4 zile. în ziua după ultima transfecție, celulele 293 s-au cultrivat împreună cu IL-3 dependent de linie celulară murină (320, clonă 23) Greenberger și colab., PNAS 80:2931-2936 (1983)). După 24 h, celulele 32 D s-au eliberat și s-au grupat într-un gradient BSA (Path-O-cyte; Mills Inc.). Celulele s-au extins într-un 1 ng/ml IL-3 murin și apoi s-au selectat pentru creștere în APK9 20%. Celulele s-au sortat pentru expresia receptorului celular de suprafață prin FACS folosind un serantipeptidic policlonal de iepure. Aceste celule s-au folosit în continuare în analize.

Exemplul 92. Analiza 1A6.1 pentru ligand Mpl

S-au spălat celule 1 A6.1 lipsite de cultură IL-3 și s-au înlocuit (1000 celule/15 μΙ total col/godeu) în plăcile microtitreare de tip Terasaki în alfa MEM (Gibco) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (FCS), Geneticin (800 μg/ml) și 1% pen/strep (Gibco) în diluții seriale 1:1 ale probelor test. S-a determinat microscopic numărul de celule viabile per godeu după 48 h. O unitate de activitate s-a definit ca acea cantitate de activitate ce rezultă în 200 celule viabile per godeu. Activitatea s-a definit ca datorată ligandului Mpl dacă el a putut fi blocat complet în analiză prin inclusiv 5-10 μο/ιτιΙ Mpl-X. Activitatea ligandului Mpl în APK9 a fost în medie 4400 ± 539 unități/ml de plasmă aplastică, cu excepția unde s-a indicat în alt fel, unitățile de activitate a ligandului Mpl sunt definite în analiza 1A6.1.

Analizele pentru celule transfectate cu gene ale receptorului Mpl uman s-au realizat în esență în același fel ca și în cazul celulelor 1 A6.1.

Exemplul 93. Demonstrație că ligandul Mpl este prezent în plasmă aplastică a serurilor din surse șoarece, câine, porc și om

Ligandul Mpl este prezent în plasma sau serurile aplastice din surse murine, canine, porcine și umane (tabelul 9). S-a colectat plasmă de la șoareci BDF1 preiradiați și la 12 zile postiradiere (500 razi). Plasma s-a testat în analiza 1 A6.1 când ea a demonstrat 2000 unități/ml activitate ceea ce a fost în principal, complet inhibată cu Mpl-X (10 Mg/ml). Plasma de șoarece iradiat a fost, de asemenea, pozitivă în analiza megacariocitelor umane când a prezentat o activitate de 1833 unități/ml. S-a colectat plasmă de la câini preiradiați și 10 zile postiradiere (450 razi). Plasma s-a testat ,atât în analiza 1 A6.1 ,cât și în analize de megacariocite umane. S-a detectat activitate și s-a inhibat complet prin MPI-X (10 μg/ml) în ambele analize. S-a colectat plasmă de la porci preiradiați și 10 zile postiradiere (650 razi). S-a testat plasma, atât în analiza 1 A6.1 cât, și în analize de megacariocite umane. în ambele analize a prezentat activitate de ligand Mpl (poate fi inhibată prin 10 μg/ml Mpl-X) comparabilă celei găsite în plasmă aplastică canină. S-au obținut seruri de la oameni aplastici. Acest material s-a colectat din măduva osoasă transplantată pacienților. S-au analizat seruri de la 6 pacienți în analize 1A6.1 când a prezentat o activitate de 903 unități/ml, din care 88% s-a datorat ligandului Mpl (se poate inhiba cu 10 Mg/ml Mpl-X). De asemenea, s-au testat seruri de la 14 pacienți aplastici în analiza de megacariocit uman. Considerați ca grup, ei au prezentat o activitate substanțială de 941 megaunități/ml, ceea ce s-a putut inhiba complet cu 10 Mg/ml Mpl-X. Sunt incluse datele IL-3 murin pentru demonstrarea specificității analiazei 1A6.1. Deși, această citokină recombinantă induce creșterea liniei celulare, ea nu este blocată prin 10 Mg/ml Mpl-X.

R0118299 Β1

6010

Tabelul 9

Specii	Analiza celule 1AG.1 (unități/ml)	Analiza Meg uman (unități meg/ml)
Medie	+Mpl-X	Medie	+Mpl-X
Șoarece normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Șoarce aplastic	2000	0	1833	nefăcut
Canin normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Canin aplastic	4400+/-539	0+/-0	792+/-128	0+/-0
Porcin normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Porcin aplastic	3866+/-1136	0+/0	1284+/-182	10+/-10
Uman normal	0+/-0	0+/-0	0+/-0	0+/-0
Uman aplastic	903+/-64	114+/-33	941+/-178	0+/-0
Mur IL-3	6000+/-565	6000+/-565	nefăcut	nefăcut

6015

6020

Exemplul 94. Prepararea derivaților TPO umani exprimați în sistemul E.coli într-o încercare de a îmbunătăți activitatea biologică, stabilitatea și solubilitatea, s-au desemnat câțiva derivați TPO și s-au exprimat în E.coli. Derivații generați folosind secvența aminoacidă menționată în SECV.ID.Nr.11, au inclus (Met’²,Lys’¹ .Ala’¹, Val³, Arg¹²⁹) TPO (1-163), în care o arginină înlocuiește o leucină la poziția aminoacidă 129 (de asemenea, cunoscută ca L129R), (Met², Lys¹’, Ala¹, Val³, Arg¹³³, TPO (1-163) în care o arginină înlocuiește o histidină la poziția aminoacidă 133 (cunoscută, de asemenea, ca H133R), (Met ², Lys'¹, Ala¹, VaP, Arg¹⁴³)TPO (1-163) în care o arginină înlocuiește o metionină la poziția aminoacidă 143 (cunoscută, de asemenea, ca M143R), (Met², Lys’¹, Ala¹, Val³, Leu⁸²)TPO (1-163) în care o leucină înlocuiește o glicină la poziția aminoacidă 82 (de asemenea, cunoscută ca G82L), (Met^-2, Lys'¹, Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶) TPO (1-163) în care o leucină înlocuiește o glicină la poziția aminoacidă 146 (de asemenea, cunoscută ca G146L), (Met², Lys’², Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸)TPO(1-163) în care o prolină înlocuiește o serină la poziția aminoacidă 148 (de asemenea, cunoscută ca S148P), (Met'², Lys¹, Ala¹, VaP, Arg⁵⁹) TPO(1-163) în care o arginină înlocuiește o lizină la poziția aminoacidă 59 (de asemenea, cunoscută ca K59R), (Met’², Lys’¹, Ala¹, VaP, Arg¹¹⁵)TPO (1-163) în care o arginină înlocuiește un glutamat la poziția aminoacidă 115 (de asemenea, cunoscut ca Q115R).

Pentru a obține acești derivați TPO s-a folosit ca matriță h6T(1-163) descrisă în exemplul 42, și s-au sintetizat oligonucleotidele care au următoarele secvențe:

L129R: 5*-ATCTTCCGTTCTTTCCAGCACCT -3' pentru prepararea derivatului de substituție Arg cu Leu -129 substituit prin Arg în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.11);

H133R: 5'-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT - 3' (pentru preparatul derivatului de substituție Arg cu His -133 substituit prin Arg în secvența arătată în SECV.ID.Nr.11);

M143R:5'-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC - 3' (pentru prepararea derivatului de substituție

Arg cu Met-143 substituit prin Arg în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.11);

G82L: 5'-GGCCAGCTTCTGCCGACCTGCCT- 3' (pentru prepararea derivatului de substituție Leu cu Gly-82 substituit prin Leu în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.11);

G14L: - ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT - 3' (pentru prepararea derivatului de substituție

Leu cu Gly -146, substituită prin Leu în secvența arătată de SECV.ID.Nr.11);

S148P: 5'-GTGGCGGTCCGACCCCTGTGCG-3' (pentru prepararea derivatului de

6025

6030

6035

6040

6045

6050

RO 118299 Β1 substituție Pro cu Ser-148 substituită prin Pro în secvența prezentată în SECV.ID.Nr.11).

K59R:5'-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATGG-3' (pentru prepararea derivatului de substituție Arg Lys-59 substituită prin Arg în secvența prezentă în SECV.ID.Nr.11); și

Q115R:5'- CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3' (pentru prepararea derivatului de substituție Arg cu Gln-115, substituit prin Arg în secvența arătată în SECV.ID.Nr.11).

S-au construit plasmizi mutanți folosind kit de mutageneză in vitro Sculptor (Amersham). S-a introdus în vectorul fag Bluescript II SK(-) fragmentul Xbal-Hindlll derivat de la pCFM536/h6T(1-163) descris în exemplul 43, după digestie cu Xbal și Hindlll pentru a obține un plasmid pSKTPO, care apoi a fost transformat în E.coli JM109. S-a preparat DNA cu împletire simplă pentru mutageneză de la pSKTPO folosind fagul helper M-12KO7 (Takara Shuzo). Mutațiile s-au introdus în gena TPO, conform instrucțiunilor furnizorului, folosind oligonucleotidele menționate. S-a realizat analiza secvenței cu kit de secvențare DNA (Applied Biosystems, SUA), după instrucțiunile furnizorului și s-au confirmat mutațiile TPO.

Fragmentele Xbal-Hindlll preparate de la pSKTPO mutată s-au introdus în pCFM536 digerat cu Xbal și Hindlll. Plasmizii pCFM536 care conțin genele mutate s-au transformat în E.coli nr.261 în scopul obținerii transformantului care exprimă genele derivatului TPO.

Cultivarea lui E.coli nr.261 transformat cu pCFM536 mutat s-a realizat conform exemplului 43. Peleta de celule a transformantului s-a colectat și s-a depozitat cel puțin o zi în congelator. Peleta de celule înghețate (3 g) s-a suspendat în 30 ml de tampon Tris 20 mM (pH=8,5) care conține 10 mM EDTA, 10 mM DTT și 1mM PMSF. Suspensia s-a păstrat pe gheață și s-a sonicat de 5 ori la intervale de 1 min (cel puțin). Celulele sonicate s-au colectat prin centrifugare la 15000 rpm, timp de 10 min.

Peletul s-a suspendat în 30 ml de tampon Tris 10 mM (pH=8,7) care conține 8 M clorură de guanidinium, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF și redus prin adăugarea a 50 mg DTT. După agitare 1 -1,5 h, pH-ul soluției s-a corectat la 5,0 folosind HCI diluat și apoi s-a răcit la 4°C, înaintea diluării.

Proba de soluție s-a diluat gradat în 1,5 I de tampon CAPS 10 mM (pH=10,5) care conține 30% glicerol, 3M glicerol, 3M uree, 3 mM cistamină și 1 mM L-cisteină peste noapte. După ce s-a lăsat proba la agitare timp de cel puțin 2 zile, precipitatul s-a îndepărtat prin centrifugare la 8000 rpm, 45 min. S-a corectat pH-ul soluției la 6,8 cu acid fosforic 6M și s-a diluat de 2 ori. Soluția s-a filtrat cu 2 straturi de hârtie de filtru nr.2 (diametrul 90 mm, Toyo filter paper, Japonia) și apoi s-a încărcat la coloana (2,6 x 10 cm) de CM-Sepharose Fast Flow (pharmacia). Coloana s-a spălat cu 400 ml tampon fosfat 10 mM (pH=6,8) conținând 15% glicerol și 1M uree și s-a echilibrat cu tampon fosfat 10 mM (pH=7,2) care conține 15% glicerol. Proteina s-a eluat din coloană folosind un sistem de gradient linear de la tampon fosfat 10 mM (pH=7,2) conținând 15% glicerol până la același tampon care conține 0,5 M NaCI la o rată de creștere 1,0 ml/min. Eluția proteinei s-a urmărit prin absorbanți la 280 nM și s-a confirmat fracțiunea care conține derivat TPO prin SDS - PAGR și s-a colectat.

După ce fracțiunea TPO (circa 30 ml) s-a concentrat la 2 ml folosind Centriprep 10 (Amicon), mutantul TPO s-a purificat ulterior prin HLPC în fază inversă (Waters) cu o coloană de micro-Bondasphere C4 (3,9 x 150 mm). Eluția proteinei s-a realizat folosind un gradient linear de la 0,05% TFA în H₂O la 2-propanol conținând 30% CH₃CN și 0,02% TFA cu o rată de curgere de 0,5 ml/min 50 min. în aceste condiții, s-au eluat derivații TPO după circa 30 min.

Pentru analiza biologică proba TPO astfel purificată s-a dializat de 2 ori contra 1 litru de tampon fosfat 10 mM ,timp de 2 zile. După concentrarea cu Centriprep 10 (Amicon) până la aproximativ 0,1 mg/ml s-a evaluat activitatea biologică a derivaților prin sistemul de testare m-07e așa cum s-a descris anterior. S-a găsit că toți mutanții au activitate aproape identică celei a lui h6T (1-163) proba de referință a TPO (vezi fig. 33 și 34).

R0118299 Β1

Lista depozitelor

Escherichia coli (pHT 1 -231/DH5):

FERM BP-4564 și CCTCC-M95001

Escherichia coli (pEF18S-A2a/DH5):

FERM BP-4565 și CCTCC-M85002

Escherichia coli (pHGT1/DH5):

FERM BP-4616 și CCTCC-M95003

Escherichia coli (pHTF1/DH5):

FERM BP-4617 și CCTCC-M95004

Hibridom P55 șoarece-șoarece:

FERM BP-4563 și CCTCC-C95001 CHO28/1/1/3-06:

FERM BP-4988 și CCTCC-C95004

CH0163T-63-79-C1:

FERM BP-4989 și CCTCC-C95005

6100

6105

6110

RO 118299 Β1

LISTAREA SECVENȚEI

( 1 ) INFORMAȚII GENERALE:

(i) Solicitant:

MIYAZAKI, Hiroshi KATO, Takashi OHGAMI, Kinya IWAMATSU, Akihiro AKAHORI, Hiromichi KUROKI, Ryota SHIMIZU, Toshiyuki MUTO, Takanori

(ii) TITLUL INVENȚIEI: PROTEINA AVÂND ACTIVITATE TPO (iii) NUMĂR DE SECVENȚE : 197 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ :

(A) DESTINATAR : Marshall, O’Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) STRADA : 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) ORAȘ : Chicago ( D) STAT: lllinois ( E ) ȚARA: Statele Unite ale Americii ( F ) COD POȘTAL.: 60606 -6402 (v) TIPUL DE CALCULATOR :

(A) MEDIU DE STOCARE: Disc floppy ( B ) CALCULATOR : IBM, PC compatibil ( C ) SISTEM DE OPERARE : PC -DOS / MS - DOS ( D ) SOFTWARE : Patentin Release # 1.0, Versiunea #1.25 (vi) DATA CURENTA A CERERII:

(A ) NUMĂRUL CERERII:

( B ) DATA COMPLETĂRII.

RO 118299 Β1

6165 (C ) CLASIFICAREA :

(vii) DATA CERERII ANTERIOARE (A) NUMĂRUL CERERII: J P 39090 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 14 - feb -1994 ( vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL SOLICITĂRII: J P 79842 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 25 - mar - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: JP 155126 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 01 - iun - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: JP 167328 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 15 - iun -1994 ( vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: JP 227159 /94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 17 - aug - 1994 ( vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

( A ) NUMĂRUL CERERII: JP 304167 /94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 01 - nov - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: JP Necunoscut ( B ) DATA COMPLETĂRII: 28 - dec - 1994 ( vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A ) NUMĂRUL CERERII: JP 193169 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 17 - aug - 1994

6170

6175

6180

6185

6190

6195

6200

6205

RO 118299 Β1 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A ) NUMĂRUL CERERII: JP 298669 / 94 ( C ) DATA COMPLETĂRII : 01 - dec - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: JP 193916 / 94 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 18 - aug - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: S.U.A. 08 / 212.164 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 14 - mar - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE:

(A) NUMĂRUL CERERII: S.U.A. 08 / 221.020 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 01 - apr - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE .

(A) NUMĂRUL CERERII: S.U.A. 08 / 278.083 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 20 - iul -1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE :

(A) NUMĂRUL CERERII: S.U.A. 08 / 320.300 ( B ) DATA COMPLETĂRII : 11 - oct - 1994 (vii) DATA CERERII ANTERIOARE:

(A ) NUMĂRUL CERERII: S.U.A. 08 / 361.811 ( B ) DATA COMPLETĂRII: 22 - dec -1994 (viii) REPREZENTANT / AGENT DE INFORMARE :

(A) NUME : Borun, Michael F.

( B ) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE : 25.447 ( C ) NUMĂR DE REFERINȚĂ / ROL : 01017 / 32425 (ix) INFORMAȚII DE TELECOMUNICAȚIE :

RO 118299 Β1

6255 (A) TELEFON :312/474 - 6300 ( B ) FAX : 312/474-0448 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 1:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIME : 261 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA.: dublă ( D) TOPOLOGIE : lineară (ii) TIP MOLECULAR: ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE:

(A) ORGANISM : Rattus norvegicus ( H ) LINIE CELULARĂ: McA - RH8994 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 1 :

6260

6265

6270

6275

GGTGTACCTG

GCTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC

CACCCCACTC TGTGCAGAGG

TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT

120

CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA

172

ATG

GAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

CTG

GCC

ΑΤΛ

CTT

CTC

CTC

ACC

GCA

220

Met

Glu

Leu

Thr

Aso

Leu

Leu

Lau

Val

Ala

Xle

Leu

Leu

Leu

Thr

Ala

1

5

10

ÎS

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCA

GTT

CCT

CCC

GCC

TGT

GAC

CC

261

Arg

Leu

Thr

Leu

Sar

Ser

Pro

Vai

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

20

25

6280 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 2 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIME : 147 aminoacizi ( B ) TIP : aminoacid ( C ) TOPOLOGIE : lineară

6285

6290 (ii) TIP MOLECULAR : proteină

6295

RO 118299 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 2 :

Mec -21

Clu -20

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu -15

Leu

Val

Ala

lle Leu -10

Leu

Leu Thr

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

?ro

val

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

6300

-5

1

5

10

Leu

Asn

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Tvr

Leu

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

Cin

Cys

Pro

Asp

Val

Asn

Pro

Leu

Ser

lle

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

30

3S

40

6305

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

45

50

55

Ala

Cin

Asp

lle

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

val

Met

όθ

65

70

75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

6310

30

85

90

Cin

Leu

Ser

Glv

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Glv

Ala

Leu

Gin

Gly

Leu

95

100

105

Leu

Gly

Thr

Cin

Val

Ser

Pro

Gin

Thr

Tyr

Arg

Asn

Tyr

Pro

Leu

Thr

110

115

120

Cin Phe Leu

12S /

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 3:

6320 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 580 perechi de baze ( B ) TIP: acid nucleic

6325 (C) CATENA.: dublă ( D) TOPOLOGIE . lineară (ii) TIP MOLECULAR : ADNc până la ARNm

6330 {vi) SURSA DE ORIGINE :

(A) ORGANISM : Homo sapiens ₆₃₃₅ (F) TIP DE ȚESUT: Ficat (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 3 :

R0118299 Β1

CTC CTC GTC ATG CTT CTC CTA ACT CCA Leu Val VaL Met Leu Leu Leu Thr Ala

•	1	5
	CCT	CCT	CCT	GCT	TGT	GAC CTC	CGA	GTC
	Ala.	Pro	Pro	Ala 20	Cys	Asp Leu	Arg	Val 25
	TCC	CAT	GTC	CTT	CAC	AGC AGA	CTG	AGC
	ser	His	Val 35	Leu	His	Ser Arg	Leu 40	Sar
	TTC	CCT	ACA	CCT	GTC	CTG CTC	CCT	GCT
	Leu	Pro SO	Thr	Pro	Val	Leu Leu 55	Pro	Ala
	TCG	AAA	ACC	CAG	ATG	GAG CAG	ACC	AAG
	Tr= 65	Lys	Thr	Gin	Meu	Glu Glu 70	Thr	Lys
	GTG	ACC	CTT	CTG	CTG	GAG GGA	GTG	ATG
	Val	Thr	Leu	Leu	Lae 35	Glu Gly	Val	Meu
	CCC	ACT	TGC	CTC	CA	TCC CTC	CTC	CGCr
	Pro	Thr	Cys	Leu 100	Ser	Sar Leu	Leu	GLv 105
	CTC	CTC	CTT	GCG	CCC	CTG CAG	AGC	CTC
	Leu	Leu	Leu 115	Gly	Ala	Leu Gin	Ser 120	Leu
	NNN	NNN	NNN	NCC	ACA	GCT CAC	AAG	GAT
	Xaa	Xaa 130	Xaa	Xaa	Thr	Ala His 135	Lys	ASp
	TTC	CAA	CAC	CTG	CTC	CGA GGA	AAG	GTG
	Phe 145	Gin	His	Leu	Leu	Arg GLv 150	Lys	Val
	GGG	TCC	ACC	CTC	TGC	GTC AGG	CGG	GCC
	Gly	Ser	Thr	Leu	Cys 165	Vai Arg	Arg	Ala
	AGC	AGA	ACC	TCT	CTA	GTC CTC	ACA	CTG
	Ser	Arg	Thr	Sar iao	Leu	Val Leu	Thr	Leu 135

TCT G Ser

AGG CTA	ACG	CTG	TCC	AGC	CCG	43
Arg Leu	Thr	Leu	Ser	Ser	Pro
10				15			6340
CTC AGT	AAA	CTG	CTT	CGT	GAC	96
Leu Ser	Lys	Leu	Leu	Arg	Asp
		30
CAG TGC	CCA	GAG	GTT	CAC	CCT	144
Gin Cys	Pro	Glu	Val	His	Pro
		45					6345
GTG GAC	τι* * * *	AGC	TTG	GGA	GAA	192
Val Ase	Phe	Sar	Leu	Gly	Glu
	60
GCA CAG	GAC	ATT	CTG	GGA	GCA	240
Aia Gin	Asp	lle	Leu	Gly	Ala
75					30		6350
GCA GCA	CGG	GGA	CAA	CCG	GGA	293
Ala Ala	Arg	Gly	Gir.	Leu	Gly
9G				95
CAG CTT	TCT	GGA	CAG	GTC	CGT	330
Gir. Leu	Ser	Gly	Gir.	Val	Arg
			110				6355
CTT GGA	ACC	CAG	NNN	NUN	NNN	334
Leu Gly	Thr	Gin	Xaa	Xaa	Xaa
		125
CCC AAT	GCC	ATC	TTC	CTG	AGC	432
Pro Asn	Ala 140	ILe	Phe	Leu	Ser		6360
CGT TTC	CTG	ATG	CTT	GTA	GGA	430
Arg Phe	Leu	Mec	Leu	Val	Gly
155					160
CCA CCC	ACC	ACA	GCT	GTC	CCC	523
Pro Pro	Thr	Thr	Ala	val	Pro		6365
170				17 S
AAC GAG	CTC	CCA	AAC	AGG	ACT	S76
Asn Glu	Leu	Pro	Asn	Arg	Thr
			190			S80	6370

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 4 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIME : 253 aminoacizi ( B ) TIP : aminoacid (C ) TOPOLOGIE: lineară

6375

6380

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : proteină ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 4

6385

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Glu

Leu

Leu -15

Leu

Val

Val

Met

Leu -10

Leu

Leu

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

-5

-

3

10

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

6390

15

20

25

Cin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

30

35

40

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

45

SG

55

6395

Ala 60

GLn

Asp

lle

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

GLn

Leu

Gly

Pro

Thr

C7S

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Glv

30

55

90

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

val

Arg

Leu

Leu

Leu

GLy

Ala

Leu

CL.n

Ser

Leu

9S

1GG

6400

Leu

Gly

Thr

GLn

Leu

Pro

Pro

GLn

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

110

115

120

Pro

Asn

Ala

lle

Phe

Leu

Ser

Phe

Gir.

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

12S

130

135

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

6405

140

145

150

155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

val

Leu

Thr

Leu

160

155

L70

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

GLy

Leu

Leu

GLu

Thr

Asn

Phe

Thr

175

130

135

6410

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Tro

GLn

GLn

Gly

190

195

200

Phe

Arg

Ala

Lys

lle

Pro

Glv

Leu

Leu

Asn

GLn

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

205

210

215

Asn

GLn

lle

Pro

Gly

Tvr

Leu

Asn

Arg

lle

His

GLu

Leu

6415

220

225

230

(2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 5:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME : 576 perechi de baze ( B ) TIP: acid nucleic (C ) CATENA.: dublă ( D) TOPOLOGIE : lineară

6425

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE :

(A) ORGANISM : Homo sapiens 6430 ( F) TIP DE ȚESUT: Ficat (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 5 :

AC GGA TTC AGA CCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC ACC Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Cly Leu Leu Asn Cin Thr Ser Arg 15 10 15 ⁴⁷ 6435

TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA

TAC CTC AAC ACC Tyr Leu Asn Arg 25

ATA CAC CAA CTC TTC

9S

Ser Leu

Asp

Gin

Ile Pro Gly 20

Ile

His

Clu

Leu 30

Leu

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA CTC

TTT

CCT GGA CCC

TCA

CCC

ACC

ACC

CTA

CCA

143

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly Leu

Phe

Pro GLv Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

6440

3S

40

45

CCC

CCG

CAC

ATT

TCC TCA

CCA

ACA TCA CAC

ACA

CCC

TCC

CTG

CCA

CCC

191

Ala

Pro

Aso

Ile

Ser Ser

Cly

Thr Ser Asp

Thr

Gly

Ser.

Leu

Pro

Pro

50

Sâ

60

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA TAT

TCT

CCT TCC CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

CCA

239

Asn

Leu

Cin

Pro

Gly Tyr

Ser

Pro Ser Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Cly

6445

S5

70

75

CAC

TAT

ACC

CTC

TTC CCT

CTT

CCA CCC ACC

TTC

CCC

ACC

CCT

CTC

CTC

297

Cir.

Tyr

Thr

Leu

Phe ?ro

Leu

Pra Prc Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

90

35

90

95

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG CTT

CCT

CAC CCT TCT

CCT

CCA

ACC

CCC

ACC

CCT

335

Z /. CA

Cir.

Leu

His

Pro

Leu Leu

Pro

Asa pro Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

6450

100

105

110

ACC

ACC

CCT

CTA AAC

ACA

TCC TAC ACC

CAC

TCC

CAC

AAT

CTG

TCT

333

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu Asn

Thr

Ser Tyr Thr

His

Ser

Cin

Asn

Leu

Ser

115

120

12S

432

CAG GAA GGG TAAGGTTCTC ACACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCATC Cin Clu Gly

130

6455

TACACCTCCC	TTCCCTCCAG	CCCCCCCCTC	CCACACAACT	CCACAAGATT	TCCTACTTTC	492
TCCTCAAACC	CAAACCCCTC	GTAAAACGCA	TACACACCAC	TCAAAACCCA	ATCATTTTTC	SS2
ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AGAA				576

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI: (A ) LUNGIME : 353 aminoacizi ( B ) TIP : aminoacid (C ) TOPOLOGIE : lineară

6460

6465 (ii) TIP MOLECULAR . proteină

RO 118299 Β1 ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 6 :

6470
	Met Glu Leu -21 -20 Arg Leu Thr —5	Thr GLu Leu Leu Ser Ser 1	Leu -15 Pro	Leu Ala	val Pro	Vai Prc	Met Leu Leu Leu Thr	Ala Val
-10 Ala Cys	Aso Leu Arg 10
6475	Leu Ser Lys	Leu Leu Arg	Asp	Ser	His	VaL	Leu His	Ser Arg Leu	Ser
		15			20			25
	Cin Cys Pro	Glu Val His	Pro	Leu	Pro	Thr	Pro Val	Leu Leu Pro	Ala
	30			35				40
	Val Aso Phe	Ser Leu Gly	Glu	Tro	Lys	Thr	Gin Met	GLu Glu Thr	Lys
	45		50				55
6480
	Ala Gin Asp	lle Leu Gly	Ala	Val	Thr	Leu	Leu Leu	GLu Gly Val	Met
	60	03					70		75
	Ala Ala Arg	Glv GLn Leu	Gly	Pro	Thr	Cys	Leu Ser	Ser Leu Leu	Gly
		80				as		90
6485	Gin Leu Ser	Glv GLn VaL	Arg	Leu	Leu	Leu	Gly Ala	Leu GLn Ser	Leu
	9S			100			10S
	Leu Gly Thr	GLn Leu Pro	Pro	GLn	Gly	Arg	Thr Thr	Ala His Lvs	Asp
	110			115				120
	Pro Asn Ala	Xle Phe Leu	Ser	Phe	Gin	His	Leu Leu	Arg Gly Lys	Val
	125		130				13S
6490
	Arg ?he Leu	Met' Leu Val	Gly	Gly	Ser	Thr	Leu Cys	Val Arg Arg	Ala
	140	143					150		1SS
	Pro ?ro Thr	Thr Ala Val	Pro	Ser	Arg	Thr	Ser Leu	VaL Leu Thr	Lau
		150				155		170
	Asn Glu Leu	Pro Asn Arg	Thr	Ser	Glv	Leu	Leu Glu	Thr Asn Phe	T»*· —
6495		175			130			13 =
	Ala Ser Ala	Arg Thr Thr	GLy	Ser	Gly	Lau	Lau Lys	Tro Gir. GLn	Gly
	190			195				200
	Phe Arg Ala	Lys lla Pro	Glv	Leu	Leu	Asn	GLn Thr	Ser Arg Ser	Lau
	20S		210				215
6500	Aso Gin lle	Pro Glv Tzr	Leu	Asn	Arg	lle	His Glu	Lau Leu Asn	Glv
	220	225					230		235
	Thr Arg Gly	Leu Phe Pro	Gly	Pro	Ser	Arg	Arg Thr	Leu CLv Ala	Pro
		Z40				24S		250
	Aso lle Ser	Ser Gly Thr	Ser	Asp	Thr	Gly	Ser Leu	Pro Pro Asn	Leu
6505		2S5			250			255
	GLn Pro Gly	Tyr Ser Pro	Ser	Pro	Thr	His	Pro Pro	Thr Gly GLn	Tyr
	270			275				230
	Thr Leu Phe	Pro Leu Pro	Prc	Thr	Leu	Pro	Thr Pro	VaL Val GLn	Lau
	235		290				295
6510	His Pro Leu	Leu Pro Aso	Pro	Ser	Ala	Pro	Thr Pro	Thr Pro Thr	Ser
	300	30S					210		315
	Pro Leu Leu	Asn Thr Ser	Tyr	Thr	His	Ser	Gin Asn	Leu Ser GLn	Glu
		320				325		3=0

CLv

RO 118299 Β1

(2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 7:	6515
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI . (A) LUNGIME : 1721 perechi de baze (B ) TIP: acid nucleic (C ) CATENA.: dublă (D) TOPOLOGIE : lineară	6520

(ii) TIP MOLECULAR : ADNc până la ARNm

6525 (vi) SURSA DE ORIGINE :

(A) ORGANISM : Homo sapîens ( F) TIP DE ȚESUT: Ficat (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 7 :

GCGGCACGAG GGCGGTGTCT GGCTCGCGTG GCTCCCTGTT TCGGCCCTCT CCCCTGAATC CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCCGCCAC A ATG GAG CTG ACT	50 113	6535
	Hee Glu Leu Thr -21 -20
CAA	TTG CTC	CTC	GTG	GTC	ATG CTT CTC	CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG	151
Clu	Leu Leu	Leu	vai	Val	Mec Leu Leu	Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu
	-15				-10	-s
TCC	AGC CCG	GCT	CCT	CCT	GCT TGT GAC	CTC CCA CTC CTC ACT ΑΆΑ CTC	209	6540
Ser	Ser Pro	Ala	Pro	Pro	Ala Cys Asp	Leu Arg Val Leu Ser Lvs Leu
	1			5		io * 15
CTT	CCT GAC	TCC	CAT	GTC	CTT CAC AGC	ACA CTC ACC CAG TGC CCA GAG	257
Leu	Arg Asp	Ser	His	v*l	Leu His Ser	Arg Leu Ser Gin Cys Prc Glu
			ÎC			25 IC		6545
CTT	CAC CCT	TTC		ACA	CCT CCC CTG	CTG CCT GCT GTG CAC TTT AGC	3CS
Val	His ?rc	iau	?r=	Th *	Prc Vai Leu	Leu Prc Aia V41 Aap Phe Ser
		35			40	45
TTG	GGA GAA	TGG	XAA	ACC	CAG ATC GAG	GAG ACC AAC CCA CAG GAC ATT	35}
Leu	Glv Glu	Tr?	Lys	Thr	Cir. y.ac Glu	Clu Thr cvs Aia Gl.-. Aso île
	50				s 5	50
								6550
CTG	GGA GCA	CTC	ACC	CTT	CTG CTG CAG	GGA G *C ATC GCA GCA CCG GGA	401
Lau	Gly Aia	Val	Thr	Leu	Lau Leu Glu	Gly Val “er Ala Aia Arg Glu
	65				7Q	75
CAA	CTG GGA	CCC	ACT	TGC	CTC CCA TCC	CTC CTC CGC CAG CTT TCT GGA	449
Gin	Leu Gly	Pro	Thr	Cvs	Leu Sar Ser	Leu Leu Gly Gin Leu Sar Glv
80				8$		90 95
								6555
CAG	GTC CC-	CTC	CTC	CTT	GCG CCC CTG	CAG ACC CTC CTT GGA ACC CAC	497
GLn	Va 1 Arg	Leu	Leu	Leu	Gly Ala Leu	Gltx Ser Leu Leu Gly Thr GLn
			100			105 * 1LQ
CTT	cer cca	CAG	CCG	ACG	ACC ACA CCT	CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC	545
Leu	Pro Pro	Gin	Gly	Arg	Thr Thr Aia	His Lys ASp Pro Asr. Ala Ile

115 120 125

6560

RO 118299 Β1

TTC Phe

CTG Leu

ACC Ser 130

TTC Phe

CAA Gin

CAC His

CTG Leu

CTC Leu 135

CGA Arg

GGA Gly

AAC Lys

CTG '/Al

CGT Arg 140

TTC Phe

CTC Leu

ATG Mec

593

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CCG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

641

Leu

Vil

Clv

Gly

ser

Thr

Leu

Cys

val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

14S

1S0

155

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

CAG

CTC

CCA

689

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

150

ies

170

17$

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

737

Asn

Arg

Thr

Ser

GLv

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

ser

Ala

Arg

180

ias

190

aca

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

CTG

AAC

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

785

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Tro

Glft

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

19S

200

20$

ATT

CCT

GCT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

833

lle

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn.

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

lle

Pro

210

215

220

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ΑΤΆ

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

dai

Gly

Tyr

teu

Asn

Arg

lle

ML$

Glu

Leu

Leu

Asn

Cly

Thr

Arg

Gly

Leu

22S

230

235

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

929

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Xle

Ser

Ser

240

24S

250

2SS

GGA

AGA

TCA

GAC

AGA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAC

CCT

GGA

TAT

977

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

ser

Leu

Pro

Pro

han

Lau

Gin

Pro

GLy

Tyr

260

265

270

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

1025

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

?ro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

275

280

28S

CTT

CCA

ccc

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

CTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

1073

Leu

?rc

Pro

Thr

Leu

Pro

—

Pro

val

Val

Gl.-.

Leu

Hkâ

Pro

Lau

Leu

290

295

scc

CCT

GAC

CCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CC7

CTT

CTA

AAC

1121

?Î0

Aso

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

?“O

TS «»

ser

Leu

Leu

Asn

JG5

310

Î1S

ACA

TCG

TAC

ACC

CAC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAC

CAA

wwu

TTC

1170

Thr

Ser

Tyr

Thr

Ser

Gl.-

Asr.

teu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

325

330

GACATCACCA

TACAGCTCCC

AGACACTGCC

TTGTCTCGTG

CGCGCCCCTG

1230

GGAGACAACT

GGACAAGATT tcctactt

TCCTGAAAC caaagccctg

CTAAAAGGGA

1290

TACACACGAC

TGAAAACCGA ‘C

ACTGTACATT

ATAAACCTTC

1350

TAAGCT

ATCACCAATA

CTCATCAGAC

CAGCTAGCTC

1410

AATTTCCAAC

TCACTGATTC

TCTACATGCT

CTTTTTCTGT

GATAACTCTG

CAAACGCCTG

1470

CCCTGGCCTG

GCAGCȚGAAC

AGAGCGAGAG actaaccttc

AGTCAGAAAA

CACAGAAAGG

1530

CTAATTTCCT

TTCCTTCAAA

TTCAAGGCCT

TCCAACGCCG

CCATCCCCTT

TACTATCATT

1590 ctcagtcgca

CTCTCATCCC atattcttaa

CTCTTGAGAA

ATGAATAACC

16S0

TTTCTCTCAC

AAATCCTGTC

CCTATACACT

AGACAAAACT

GAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

1710 ααααααααλα a

172

6610

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 8:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 4506 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA.: dublă (D) TOPOLOGIE : lineară

6615 (ii) TIP MOLECULAR : ADN genomic ( vi) SURSA DE ORIGINE:

6620 (A) ORGANISM: Homo sapiens (G) TIP CELULAR: teucocite periferice ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 8 :

6625

GAATTCAGGG CTTTGCCAGT TCCAGGCTGG TCAGCATCTC

AAGCCCTCCC

CAGCATCTGT

TCACCCTGCC

AGGCAGTCTC TTCCTAGAAA CTTGGTTAAX

TCTTCACTCT

TCTTGCTACT

120

CAAGAGCCTA gagccacgcc

ACCTGAGGQG

TGCAGGGCGC

ATTCCCTGCG atttcctcct

ATTCCTCACC

AGCCAGACAC

CTAGGGCCAT

AGGAACCTGG

TtTCAOGTCT gatctttcaa

CTTCCCCCGC

ATGGCCCCAG

CCCGGCCAGA

ATGGAAACAT

GGGAACCCAT

GGGTCGTGAA

CCTCACGTGT crrrcccccx

CCCTACTCTG

CCCAGAAGTG

180

GAAGGATTCA GGGGAGAGGC

CCCAAACAGG

240

6630

ATQ GAG CTC ACT G CTGAGAACAC Ke« Glu Leu Thr

-21 -20

GACXGAAGGG rcrcccAAAA

TGGGAATTCC

CCTCATCTAA

293

GAGAGAGAAA

XTAAGCGGTC

TGGAATACCA

GGAGACACCC tGAGGGGTGC

CCTGACAATG

G AA TTG CTC CTC Glu Leu Leu Leu

3S3

413

473

S25

6635

CCC CTC ATG CTT CTC CTA ACT OCA ACC CTA ACG CTC TCC ACC CCG GCT Val Val Mec Leu. L«u Ceu Thr Ala Ar; Leu Thr Leu Ser Ser ?ro Ala -10 -Ξ 1

6640

573

RO 118299 Β1 ccr ccr gct tgt gac ctc cga ctc ctc act aaa ctc ctc cgt cac rcc 021 ?ro pro Ala Cys Ass Lau Arg Val Lau Sar Lys Leu Leu Arg Asp Sar □ 10 15

CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTC GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC572

His Val Lau His Ser Arg Leu

2025

CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT732

GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAACGA792 ttattcttca caatacagcc cgcatttaaa AGCTCTCGTC tagagatagt ACTCATGGAGas2

GACTAGCCTC CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCGGCAC912

CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTC CCT ACA901

Ser Gin Cys ?ro Glu Val His ?ro Leu ?ro thr

3035

CCT CTC CTG CTC CCT CCT CTC CAC TTT AGC TTC GGA CAA TGC AAA ACC1009 ?ro Val Leu Leu ?ro Ala Val Aso Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lvs Thr

4550

CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT1065

Gir. Mec

CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA1125

GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT118S

GGCTtGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA124S

AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCTGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG1305

AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATCA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC1365

AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTCA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTCAAACAAC142S

AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG1485

AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC 15 4 S

GAAACCCCGT CTCTAGTAAG AATACAAAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT1305

CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA1565

GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA1725

AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG 17 8 S

GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA 13 4 S

TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATCTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT1905

AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA1965

GAACTCTATT CCCAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT2025

GAAGACATAT CCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA2035

R0118299 Β1

CAATAG

TA

2145

6685

CCAGCCTGAA

CAGAAAGAGA

CTAGAAGCAT

TTCCTTGACG

A CTG AC TCAG

GGAACAAvGw

2205

CTCATACCTA

CCAGGCTGGA

GCGATTCTCC

AGCTAA

AACTCCTGAC

TGAGCCACTG

CAGAAACAGT

CAGCAACGTA

TAGAGGACAC

GAATTCCTGC

TGCTGGCTAC

CTCTCTTCCA gggtcgcttc

GTGCAGTGGC ’gtatttttg

CTCAGGTGAT

CACCCAGCCT

AAATTTGCAG

AGAAAAAAGG

GCGAGTTTTT

CCTGGGTGCG

TCCTAACGCT

TCTCTTTCTC

ÎAGTC :c

TATGACCAT

ACGGAGTCTC

ACTCTATCCC

2255

2325

ATGATCTCAA

TCCCAAGTAG

GTAGAGATGG

CACTAGAACC acctcttctc

CAAGCAGAGG

ACCTTGGTCl

CCCCACCCGC

AG GAG GAG Glu Glu

CTCACTGCAA

CCTCAGCCTC

2385

CTGGGA'

AC

CAGCCTCCCA

TAAAAATCAA

AAGAGGTAAA

ACTGAAACCA

CTGATGACCA

TGTCCAGTTC

TTTAGTGTG

AGGTGCCCAC

CG^.CATGCCC

244S

TG‘ 'GCCCAG

2SQS

AAGTGCTGGC

AGCTGTAACA

AGTGTAAGAC

GCTGTCGGGA

TCAGCCTGTA

CCCTTTGAGG

ATTACAGGCG

GGTTTTCCAG

CGGCAGA'

GACTGTGAAG

ACC AAG GCA CAG GAG ATT CTC GCA

Thr Lys Al* Gir. As? ÎL* Leu Gly 5=

GCA CTG ACC

CTT CTG CTG GAG

GGA Gly

GTG ATG

GCA GCA Al* Al*

COC Arg

GGA GLv

CAA Glft 80

CTG Leu

Al*

V*1

Thr

Leu

Leu Leu Glu ?a

V*1

Mez 75

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

Gly

Pro

Thr

Cvs

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Glv

Cir.

V*1

85

90

9S

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

Arg

Leu

L*U

Leu

Gly

Al*

Leu

Gir.

Ser

Leu

Lau

Gly

Thr

Gin

100

105

110

GTAAGTCCCC

TCTGTAGAAA

CTGACTCAGT

AGTCAAGGGA ctgttctttt

CCCCCTAGAA

2555

2525

2585

2745

2305

2365

2925

2977

302S

3073

3115

317S

GACCTGAGGC

AAGAAGGGCT

CTTCCAGGGA

GCTCAAGGGC

AGAAGAGCTG

ATCTACTAAG

3235

AGTGGTCCCT

GCCAGCCACA

ATGCCTGGGT

ACTGGCATCC

TGTCTTTCCT

ACTTAGACAA

329=

6690

6695

6700

6705

6710

GGGACGCCTG

AGATCTGGCC

CTGGTGTTTG

GCCTCAGGAC

CATCCTCTGC

33S1

CCTCAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

gat

CCC

AAT

GCC

ATC

3399

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Al*

KLs

Lys

As?

Pro

Asn

Ala

Xle

115

120

125

6715

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CCA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

3447

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

Hi*

Leu

L«u

Arg

Gly

Ly*

Val

Arg

Phe

Leu

Mez

130

135

140

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CCG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

3495

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cye

V*1

Arg

Arg

Al*

Pro

Pro

Thr

Thr

145

150

155

6720

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

3543

Al*

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

160

165

170

e *· • * 5

RO 118299 Β1

AAC Aar.

ACG Arg

ACT -*v. .

Ser

GGA Gly 130

• TG Leu

TTG Leu

GAG Glu

ACA —

AAC Aâr. 135

Phe

ACT Thr

GCC Ala

TCA GCC

AGA *

3591

Ser

Ala 13C

ACT

ACT

GGC

TCT

CCG

ctt

CTG

AAC

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

CCC

AAC

3539

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Tro

Gir.

Gir.

Gly

Pha

Arg

Ala

Lys

195

20C

205

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

3637

xle

Pro

GLv

Leu

Leu

Asr.

Gir.

*·κ *

Ser

Arg

Ser

Leu

A3O

Gir.

lle

210

21S

220

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TCC

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

3 735

Gly

Tvr

Lau

Asn

Arg

lle

His

Glu

Leu

Leu

A ar.

GLv

—X —

Arg

CLy

Leu

225

230

23S

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

CTA

GGA

CCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

3733

Phe

?rc

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

lle

Ser

Ser

240

245

2S0

2S5

CGA

ACA

TCA

CAC

ACA

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

3331

Gly

Thr

Ser

Aso

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Cl·/

Tyr

260

265

270

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

3379

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Lau

Phe

?rr

275

280

235

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

CTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

3927

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gir.

Leu

His

Pro

Leu

Leu

290

29S

300

CCT

GAC

CCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

ACC

CCT

CTT

CTA

AAC

3975

Pro

Aso

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

As Λ

305

310

31S

AGA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCÎC

4024

“hr

-Ser

Thr

His

ser

Gir.

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

325

330

AGACACTGCC

GGAGACAACT

TACACAGGAC

TTTTT.AAGCT

AATTTGCAAC

GGCTGGCCTG

CTCAGTGGGA

GACAxCAGCA	TTGTCTCATG	TACAGCTCCC	TTCCCTGCAG	GGCGCCCCTG	4084
GGACAAGATT	TCCTACTTTC	TCCTGAAACC	CAAAGCCCTG	GTAAAAGGGA	4144
TGA-AAAGGCA	ATCATTTTTC	ACTGTACATT	ATAAACCTTC	AGAAGCTATT	4204
ATCAGCAATA	CTCATCAGAG	CAGCTAGCTC	TTTGGTCTAT	TTTCTCCAGA	4264
TCACTGATTC	TCTACATGCT	CTTTTTCTCT	GATAACTCTG	CAAAGCCCTG	4324
GCAGTTGAAC	AGAGGGAGAG	ACTAACCTTG	AGTCAGAAAA	CAGAGAAACG	4384
TTGCTTCAAA	TTCAAGGCCT	TCCAACGCCC	CCATCCCCTT	TACTATCATT	4444
CTCTGATCCC	ATATTCTTAA	CAGATCTTTA	CTCTTGAGAA	ATGAATAAGC	4504

4506

TT

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 9 :

6760 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 416 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic

6765 (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADN sintetic

6770 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 9 :

CTAGAAAAAA

CCAAGGAGG

AATAAATAA ccgccacctt gtgaccttcg τσ

TGTCT

AAACTGC

GCGACTGTCA

CGTGCTGCAC

120

CGAAGTTCAC

CCGCTGCCGÂ

CCCCG<

GCTTCCGGCT

GTCGACTTCT

CCCTGGGTGA

130

6775

ATGGAAAACC

CAGATGGAAG

AGACCAAAGC

TCAGGACATC

CTGCGTGCAG

AACTCTGCT

240

TCTGGAAGGC

GTTACGGCTG

CACGTGGCCA

GCTTGGCCCG

ACCTGCCTG'

CTTCCCTGCT

300

TGGCCAGCTG

TCTGGCCAGG îtcctctoct

GCCCGGCGCT

CTGCAGTCTC

350

CCAGCTGCCG

CCACAGGGC

GTACCACTGC

TCACAAGGAT 'CTTCC

415

6780 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 10 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIMEA: 179 aminoacizî (B) TIP: aminoadd (C) TOPOLOGIE: liniară	6785
(ii) TIP MOLECULAR: proteină	6790

(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr. 10:

ΰβν: -5

Val

Pro

Α-ς

Gly

Ser 1

Pro

Ala

Pra

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

val

6795

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Va.1

Leu

His

Ser

A:5 «3

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Pro

Val.

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

As o 45

Phe

Ser

Leu

Gly

G lu 50

Trp

Lys

Gin

Mec Sâ

GLu

Glu

Thr

Lys

6800

RO 118299 Β1

Ala 60

Gir.

Asp

lle

Leu

Glv 55

Ala

val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Mec 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin ao

Leu

Gly

Pro

Thr

Cvs 35

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Lau

Ser

Glv 95

Gin

Val

Arg

Lau

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Lau

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr LLO

Gir.

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

lle

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Lau

Mat

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

val

Lau

Thr 170

Leu

Asn Glu Leu (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr.11 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 535 perechi de baze ( B ) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA: dublă ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADN sintetic (vi) SURSA DE ORIGINE:

(A) ORGANISM : Homo sapiens (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 11 :

CTAGAAAAAA CCAAGCAGCT AATAAATA ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA S2

Mez Lvs Aii Pro Val ?rr Pro Ala

-2 1 5

TCT Cys

GAT Asp

TTA CCG CTC CTG

Ser

AAA Lys

CTG Leu 15

CTC Lau

CCC Arg

CAC Asp

TCT CAC CTC

CTG Leu

100

Leu

Arg 10

val

Leu

Ser

His 20

val

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC

CAC

TCC

CCG

CAA

CTT

CAC

CCC

CTG

CCC

ACC

CCG

148

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Cin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

—v

Pro

2S

30

35

CTT

CTG

CTT

CCG

CCT

CTC

CAC

TTC

-

CTC

CGT

CAA

TCC

AAA

ACC

CAG

196

Vai

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Ser

Leu

Gly

Clu

Trp

Lys

-Η w

Gin

40

45

50

ATC

CAA

GAG

ACC

AAA

CCT

CAC

CAC

ATC

CTG

GCT

CCA

CTA

ACT

CTG

CTT

244

Mec

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Cin

Asp

lle

Leu

CLv

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

S5

50

65

70

RO 118299 Β1

6850

CTC

CAA

CCC

CTT

ATC CCT

CCA

CCT

CCC

CAG

GGC

CCC

ACC TCC

CTG

292

Leu

CLu

Gly

val

Mez Ala

Ala

Arg

Cly

Cir.

Leu

Cly

Pro

Thr Cys

Leu

75

30

25

TCT

TCC

CTC

CTT

CCC CAC

ctc

TCT

CGC

CAG

GTT

CGT

CTC

CTG CTC

CCC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Cly CL.n

Leu

Ser

CL’z

Cin

Val

Arg

Leu

Leu Leu

Cly

90

95

100

CCT

CTC

CAG

TCT

CTC CTT

CCC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAC

CCC CGT

ACC

3ae

AL*

Leu

Gin

Ser

Leu iau

Cly

Thr

cin

Leu

Pro

Pro

Cin

Cly Arg

Thr

10S

110

L1S

ACT

CCT

CAC

AAG

GAT CCG

AAC

CCT

ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG CAC

CTG

436

Thr

Ala

His

Lys

As? Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Cin His

Leu

120

125

130

CTC

CCT

GGC

AAA

GTT CGT

TTC

CTC

A~G

CTG

GTT

GGC

CGT

TCT ACC

CTC

434

Leu

Arg

Gly

Lys

Val Arg

Phe

Leu

Her.

Leu

v*l

Gly

Gly

Ser Thr

Leu

135

140

145

150

TCC

GTT

CGT

CGG

CCG CCG

CCA

ACC

ACT

CCT

GTT

CCG

TCT

TAACGAAACC

533

Cys

Val

Arg

Arg

Ala Pro

Pro

tk —

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

155 150 rr

535

6855

6860 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr.12 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A ) LUNGIMEA: 535 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: dublă ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADN sintetic

6865

6870 ( vi) SURSA DE ORIGINE:

(A) ORGANISM : Homo sapiens

6875 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 12 .

6880

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATC AAA TCT CCT CCA CCA CCT CCA Maz Lvs Ser Pro Aia Pro Pro Aia -2 1 $

TCT GAT

TTA CGG Leu Arg 10

GTC CTC TCT AAA CTG

CTG leu

CCC Arg

GAC Asp

TCT Ser

CaC gxg

CTC Leu

Cys

As?

Val

Leu

ser

Lys

1 *

His 2C

vai

CAC

TCT

CGT

CTC

TCC

CAC

TCC

CCG

GAA

CTT

CAC

CCG

CTG

CCG

ACC

CCG

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Cin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

2S

30

35

100

148

6885

RO 118299 Β1

GTT Val

CTG Leu 40

CTT Leu

CCG GCT CTC

GAC A« 4S

TTC Phe

TCC Ser

CTG Leu

GGT GAA

TGO AAA

ACC CAG

195

?-O

Ala val

Gly

Glu 5C

Trp

Lys

Thr

CLn

ATG

GAA

GAG

ACC

AAA

GCT

CAG

GAC

ATC

CTG

GGT

GCA

GTA

ACT

CTG

CTT

244

Met

Glu

GLu

T^r

Lys

Ala

Gin

Asp

Zle

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTC

GAA

CCC

GTT

ATG

GCT

CCA

CGT

GGC

CAG

CTT

GGC

CCG

ACC

TGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Mer

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cvs

Leu

75

80

35

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC

CAG

CTG

TCT

GGC

CAG

GTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Sar

Glv

GLn

Val

Ax g

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG

CTT

GGC

ACC

CAG

CTG

CCG

CCA

CAG

GGC

CGT

ACC

388

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gir.

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

10S

110

115

ACT

GCT

CAC

AA0

GAT

CCG

AAC

GCT

ATC

TTC

CTG

TCT

TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

21a

?he

Leu

Ser

Phe

GLn

His

Leu

120

12S

130

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT

CGT

TTC

CTG

ATG

CTG

GTT

GGC

GGT

TCT

ACC

CTG

484

Leu

Άτς

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Mec

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

135

140

14S

1S0

TGC

CTT

CGT

CGG

CCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT

CCG

«tqt

TAATGAAAGC

533

Cys

val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Sar

155

160

S3S (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr.13 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 555 perechi de baze ( B ) TIP: acid nucleic (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADNc până ia ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE:

(A) ORGANISM : Homo sapiens (F) TIP DE ȚESUT: Ficat

..e: Glu Leu

-21 -2G

Glu Leu Leu Leu Val Val Mei Lau

-15 -10

Leu Lau Thr Ala (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 13 :

ATG GAC CTG ACT GAA TTG CTC CTC CTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA

RO 118299 Β1

AGG Arg -5

cta acg ccg rec

AGC CCG GCC

CCT Pro

CCT Pro 5

GCC TGC GAC CTC CGA CCC

96

Lau

Thr

Lau

Sar

Sar 1

Pro

Ala

Ala

Cys

Asp

Lau

Arg 10

Val

CTC

ACT

AAA

CTG

CCC

CGT

GAC

CAC

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

144

Lau

Sar

Lys

Lau

Lau

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Sar

Arg

Leu

Ser

O7JJ

za

25

CAG

TGC

CCA

GAG

GCC

CAC

CCT

T7G

CCT

ACA

CCT

CTC

CTG

CTG

CCT

GCT

192

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Lau

Pro

Pro

Val

Lau

Lau

Pro

Ala

30

35

40

GTG

GAC

TTT

ACC

CTG

GGA

CAA

TGC

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

GAG

ACC

AAG

240

Αα/. λ

val

Asp

Phe

Sar

Lau

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gla

Mec

GLu

Glu

Thr

Lys

45

50

55

GCA

CAG

GAC

ACT

CCG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

CCG

CTG

GAG

GGA

CTG

ATG

286

Ala

Gin

Asp

Ila

Leu

Gly

KLa

Val

Thr

Lau

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Mat

60

65

70

7S

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

CCC

CTC

CCA

TCC

CTC

CTG

GGG

336

Ala

Ala

Arg

G-7

Gin

Lau

Gly

Pro

Thr

Cvs

Lau

Ser

Ser

Lau

Lau

Gly

6945

30

35

90

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CCT

CCC

CTC

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

364

GLn

Lau

Sar

Glv

Gin

val

Arg

Lau

Lau

Lau

Gly

Ala

Leu

GLn

Ser

Leu

55

100

105

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

CCT

CAC

AAG

GAT

432

Leu

Gly

Thr

GLn

Leu

Pro

Pro

GLn

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

6950

110

115

120

CCC

AAT

GCC

ACC

CCC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

460

Pro

Asn

Ala

lle·

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg Gly

Lvs

Val

125

130

13 S

CCT

TTC

CTG

ACG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

528

Arg

Pha

Lau

Mas

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Ala

6955

140

145

150

1SS

CCA

CCC

ACC

ACA

GCC

GTC

CCC

AGC

TGA

555

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Sar

160

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 14 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 1043 perechi de baze (8 ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE liniară (ii) TIP MOLECULAR . ADN sintetic

6960

6965

6970 (vi) SURSA DE ORIGINE :

( A) ORGANISM : Homo sapiens

RO 118299 Β1 ⁶’⁷⁵ ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 14 :

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA ACT CCT GCA CCA CCT CCA 52

Mec Lys Sec P-° ALa Pro Pro Ala

-2 1 5

TGT

GAT

TTA

coo

GTC CTG

TCT

AAA CTG

CTC CGC

GAC TCT

CAC

GTC

CTG

100

6980

Cys

A1O

Leu

Arg

Val Leu

Sar

Lys Leu

Leu Arg

Asp Ser

His

Val

Leu

10

15

2C

CAC

TCT

CGT

CTG

TCC CAG

TG<»

CCG GAA

CTT CAC

CCG CTG

CCG

ACC

CCG

143

His

ser

Arg

Leu

Ser GLn

Cys

Pro Glu

Val His

Pro Leu

Pro

Thr

Pro

25

30

îs

6985

GTT

CTG

CTT

CCG

GCT GTC

GAC

TTC TCC

CTG CGT

CAA TGG

AAA

ACC

CAG

196

Val

Leu

Leu

Pro

Ala val

Asp

Phe Ser

Leu Gly

Glu Tr-3

Lys

«u —

GLn

40

45

50

ATG

CAA

GAG

ACC

AAA GCT

CAG

GAC ATC

CTG GGT

CCA GTA

ACT

C13

CCT

244

Mec

Glu

Glu

Thr

Lys Ala

Gin

Asp île

Leu Gly

Ala Val

Thr

Leu

Leu

55

50

03

70

6990

CTG

GAA

GGC

GTT

ATG CCT

GCA

CGT GGC

CAG CTT

GGC CCG

ACC

CGC

CTG

292

Leu

Glu

Gly

Val

Her Ala

Ala

Arg Gly

Gin Leu

Gly Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

S5

TCT

TCC

CTG

CTT

GGC CAG

CTG

TCT CCC

CAG CTT

CGT CTG

CTG

CTC

CGC

340

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly Gin

Leu

Ser GLv

Cin Val

Arg Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

IOC

6995

GCT

CTG

CAG

TCT

CTG CTT

GCC

ACC CAC

CTC CCG

CCA CAG

GCC

CGC

ACC

388

Ala

Leu

GLn

Sar

Leu Leu

Gly

Thr GLn

Leu Pro

Pro Gir.

Gly

Arg

Thr

105

LLC

115

ACT

GCT

CAC

AAG

GAT CCG

AAC

GCT ATC

TTC CTC

TCT TTC

CAG

CAC

CTG

436

Thr

Ala

His

Lys

Asp Pro

Asn

Ala lle

Phe Leu

Ser Phe

GLn

His

Leu

120

125

130

7000

CTG

CGT

GGC

AAA

GTT CGT

CTG ATC

CTG GTT

GGC GGT

TCT

ACC

CTG

484

Leu

Arg

Gly

Lys

Val Arg

Phe

Leu Mee

Leu Val

Cly Gly

Ser

ς-u —

Leu

135

140

145

150

TGC

GTT

CGT

CGG

CCG CCG

CCA

ACC ACT

CCT CTT

CCG TCT

CGT

ACC

TCT

S32

cys

Val

Arg

Arg·

Ala Pro

Pro

Thr Thr

ALa val

Pro Ser

Arg

Thr

Ser

1S5

150

105

CTG

GTT

CTG

ACC

CTG AAC

GAC

CTC CCG

AAC CCT

ACC ACC

GCC

CTC

CTG

580

7005

Leu

Val

Leu

Thr

Leu Asn

Glu

Leu Pro

Asn Arg

Thr Ser

Glv

Leu

Leu

170

175

180

GAA

ACC

AAC

TTT

ACC GCG

AGC

GCG CGT

ACC ACC

GGC AGC

GGC

CTG

CTG

628

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr Ala

Ser

Ala Arg

Thr Thr

GLv Ser

Gly

Leu

Leu

18 S

190

195

AAA

TGG

CAG

CAG

GGC TTT

CGT

GCG AAA

ATC CCG

GGC CTG

CTG

AAC

CAG

676

7010

Lys

Tro

Gin

Gin

Gly Phe

Arg

Ala Lys

lle Pro

GLv Leu

Leu

Asn

GLn

200

205

210

ACC

AGC

CGT

AGC

CTG GAT

CAC

ATC CCG

GCC TAT

CTG AAC

CGT

ATC

CAT

724

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu Aso

Gin

lle Pro

GLv Tyr

Leu Asn

Arg

lle

His

21S

220

225

230

GAA

CTG

CTG

AAC

GGC ACC

CGT

CGC CTG

TTT CCC

CCC CCG

ACC

CGT

CGC

772

7015

Glu

Leu

Leu

Asn

Glv Thr

Arg

Gly Leu

Phe Pro

Cly Pro

Ser

Arg

Arg

23*5

240

245

ACC

CTG

GGC

GCG

CCG GAT

ATC

AGC TCT

GCC ACC

ACC GAT

ACC

GGC

AGC

820

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro Asp

lle

Ser Ser

Gly Thr

Ser Asp

Thr

Gly

Ser

250

255

260

R0118299 Β1

CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCC GGC TAT ACC CCG AGC CCG ACC CAT CCG

Leu Pro ?ro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro

265 270 275

868

7020

CCG Pro

ACC GGC CAC

TAT Tyr

ACC CTG

Phe

CCG CTG CCG CCG ACC CTG

CCG ACC

915

Thr 230

Gly Gin

Thr

Leu 225

Pro Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

CCG

CTG

GTT

CAG

CTG

CAT

CCG

CTG

CTG

CCG

CAT

CCC

AGC

CCG

CCG

ACC

904

?rs

Vel

v*L

Gir.

leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

As a

Pro

Ser

AL*

Pro

Thr

295

300

305

310

CCG

ACC

CCG

ACC

AGC

CCG

CTG

CTG

AAC

ACC

AGC

TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

»012

Prs

Thr

Pro

Thr

Sar

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr·

Ser

Tyr

Thr

Hi*

Ser

Gin

315

320

325

AAC

CTG

AGC

CAG

CAA

GGC

TAATGAAGCT TGA

1043

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

320

7025

7030 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 15 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 45 perechi de baze (B) TIP: add nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară

7035

7040 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 15 :

AACTGGAAGA ATTCGCGGCC GCAGGAATTT ΓΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTT

7045 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 16.

7050 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 13 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA. unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 16 :

7055

7060

RO 118299 Β1

AA-TCGGCAC GAG (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 17 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 9 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 17:

CÎCGTGCCG (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 18 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

( A) LUNGIMEA: 12 aminoacizi ( B) TIP : aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 18 :

îl· Pro v*l Pro Pro Ala Cys Aaa Pro Arq Leu Leu 15 10 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 19 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 12 aminoacizi (B) TIP : aminoacid (C) CATENA.

( D) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1

7110 (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 19 :

Thr Pro v*l Pro Pro Al* Cys Aso Pro Arg Leu Leu 15 10 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 20 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 12 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 20:

Ser Pro V*1 Pro Pro Al* Cys Asp Pro Arg Leu Leu 15 10 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 21 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 17 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (ix) TRĂSĂTURI:

(A) NUME / COD: bază_ modificată ( B) LOCAȚIE : 12 & 15 (C) ALTE INFORMAȚII: / mod_bază = i (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 21 :

7115

7120

7125

7130

7135

7140

7145

7150

ACGCTGGGGG CNGANGA

RO 118299 Bl

I

7155	(2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 22 :
	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. (A) LUNGIMEA: 17 perechi de baze
7160	(B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară
7165	(ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (ix) TRASATURI: (A) NUME / COD: bază_ modificată
7170	( B ) LOCAȚIE : 12 & 15 ( C) ALTE INFORMAȚII: / mod_bază = i
7175	(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 22 : ACACTAGGAT CXAANAA 17 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 23 :
7180	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. (A) LUNGIMEA: 17 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic
7185	(C) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară
7190	(ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (ix) TRĂSĂTURI: (A) NUME / COD: bază_ modificată
7195	( B ) LOCAȚIE: 12 & 15 (C ) ALTE INFORMAȚII: / mod_bază = i

(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 23 :

7200

RO 118299 Β1

7205

ACCCTGGGTG CUCAilGA î·⁷ (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 24 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 17 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (ix) TRĂSĂTURI:

(A) NUME / COD: bază_ modificată ( B) LOCAȚIE : 12 & 15 (C) ALTE INFORMAȚII: / mod_bază «i (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 24:

ACCCTGGGCG CMGANGA ¹⁷ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 25 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 17 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 25 :

GGGGGGCGGA CGCÎGCG I⁷ ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 26 :

7210

7215

7220

7225

7230

7235

7240 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

7245

RO 118299 Β1 (A) LUNGIMEA ; 17 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 26 :

GGAGCACGAA CACTAGG 17 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 27 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 17 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt add· nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 27 :

CGTGGTCCTA CCCGGGG 17 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 28 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 17 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 28 :

GCCGGCCGCA CGCTGCG

RO 118299 Β1

7295 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 29 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA : unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 29 :

GGATCTTGGT TCATTCTCAA G ^2: (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 30 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 20 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C)CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 30 :

CCTCAGACAG TGGTTCAAAG 20 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 31 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

( A) LUNGIMEA : 21 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA : unică ( D) TOPOLOGIE : liniară

7300

7305

7310

7315

7320

7325

7330

7335

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 31:

CGACGGTCTA CCTGGGTCCT G 2’ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 32 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 32 :

CAGAGTTAGT CTTGCGGTGA G 21 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 33 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA :21 perechi de baze (B) TIP .* acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 33 :

CCTGTCCTGC TGCCTGCTGT G 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 34 :

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze _73g5 (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară

7390 (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 34 :

7395

TGAAGTTGGT CTCCAACAAT C 21 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 35 .

7400 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică 7405 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic

7410 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr.35:

ATGGAGCTGA CTGATTTGCT C

7415 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 36 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: add nudeic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară

7420

7425 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 36 :

7430

TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C

RO 118299 Β1 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 37 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 37 :

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 38 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 38:

TGACGCAGAG GGÎGGACCCT C 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 39 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 39:

AGCAGAACCT CTCTAGTCCT C 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 40:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 21 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică

R0118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 40 : ACACTGAACC ACCTCCCAAA C (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 41 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 41:

aactactgcc TCTCGGCTTC T 21 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 42 :

(I) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 42 :

AGGGATTCAG AGCCAAGATT C ,,

7480

7485

7490

7495

7500

7505

7510

7515 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 43 :

7520

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA : unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 43 :

tagcggccgc ττττττττττ îttttttggg g 31 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 44 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 44 :

TAGCGGCCGC TTTTTTTTCT TTTTTTTAAA A ³¹ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 45 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 31 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 45 :

RO 118299 Β1

7570

TAGCGGCCGC TTTCTTTTTC TTTTTÎTCTÎ T (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 46 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 31 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 46 :

TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT “TTTTTGCC C (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 47 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nudele (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 47 :

tagcggccgc ττττττττττ τ ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 48 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică (D ) TOPOLOGIE : liniară

7575

7580

7585

7590

7595

7600

7605

7610

7615

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 48 :

TTGTCACCTC CGAGTCCTCA G 21 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 49 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 49:

AGGATGGGTT GGGGAAGGAG A 21 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 50 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

( A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA . unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 50 :

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 51 :

RO 118299 Β1

7665 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA .unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 51 :

AGGGAAGAGC CTATACTCTC C 21 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 52 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 52:

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC C 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 63 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 53 :

7670

7675

7680

7685

7690

7695

7700

7705

RO 118299 Β1

ATGGGAGTCA CGAAGCAGTT Τ ₂ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 54 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 54:

TGCGTTTCC GATGCTTGTA G 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 55 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 55 :

AACCTTACCC CTCCTCAGAC A ₂( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 56 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA *. 30 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară

R0118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 56 :

TTîGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 57 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 39 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 57:

TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGCGACAGCT GTGGTGGGT 39 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 58 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 42 perechi de baze (B) TIP: add nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 58 :

TTTGCGGCCG CTCATTACAG TGTGAGGACT AGAGAGGTTC TG 42 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 59 :

7755

7760

7765

7770

7775

7780

7785

7790

7795

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 42 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 59 :

TTTGCGGCCG CTCATTATCT GGCTGAGCCA GTGAAGTTTG TC 42 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 60 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 42 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 60 :

TTTGCGGCCG CTCATTACAG ACCAGGÂATC TTGGCTCTGAA T 42 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 61 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI. SECV ID Nr. 61 :

RO 118299 Β1

TTTGAATTCG GCCAGCCAG A CACCCCGGCC (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 62 :	30	7845
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. (A) LUNGIMEA: 41 perechi de baze		7850
(B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară		7855
(îi) TIP MOLECULAR. alt acid nucleic
( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 62 :		7860
TTTGCGGCCG CTCAT7ACAG GGTGGACCCT CCTACAAGCA T	41
( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 63 :		7865
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.
( A) LUNGIMEA: 40 perechi de baze (B) TIP: acid nudeic ( C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară		7870
(fi ) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic		7875
( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 63 :
TTTGCGGCCG CTCATTAGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA	40	7880
(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 64 .
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.		7885
(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară		7890

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 64 :

TTTGCGGCCG CTCATTACCT GACGCAGAGG GTGGACCC 3 a (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 65 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 65 :

TTTGCGGCCG CTCATTACCG CCTGACGCAG AGGGTGGA 23 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 66 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt add nudeic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 66 ;

TTTGCGGCCG CTCATTAGGC CCGCCTGACG CAGAGGGT 3 a (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 67 :

RO 118299 Β1

7935 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 67 :

TTTGCGGCCG CTCATTATGG GGCCCCCCTG ACGCAGAC 38

2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 68:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 68 :

•jxîgCggccg ctcattaggc tggggcccgc ctgacgca 38 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 69 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic

7940

7945

7950

7955

7960

7965

7970

7975 ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI. SECV ID Nr. 69 :

7980

RO 118299 Β1

TTTGAATTCG GCCAGCCACA CACCCCGCCC (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 70 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 41 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 70:

TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 71 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 39 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 71 : mGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 72 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA. 50 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE: liniară

RO 118299 Β1

8030 (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 72 :

AGÎAAACTGC TTCGTGACTC CCATGTCCTî CACAGCAGAC TGAGCCAGTG SO (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 73 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 73:

CATGGGAGTC ACGAAGCAGT TîACTGGACA GCGTTAGCCT TGCAGTTAG 49 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 74 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nudele (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 74:

TGTCACCTCC GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGTGACTCCC ATGTCCTTC 49

8035

8040

8045

8050

8055

8060

8065 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 75 :

8070

R0118299 Β1

	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. (A) LUNGIMEA: 48 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic
8075	(C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară
8080	(ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 75 : TTTACTGAGG ACTGGGAGGT CAGACGACAC CGTTAGCCTT GCAGTCAG 4β
8085	( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 76 : (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.
8090	(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară
8095	(ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic
8100	(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 76 : GACCTCCGAG “CCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG TCCTTCACA 49 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 77 :
8105	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. (A) LUNGIMEA: 48 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic
8110	(C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară
8115	(ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 77 :

R0118299 Β1

CACTTTACTG AGGACTCGGA GGTCGGACAG CGTTAGCCTT GCAGîTAG 48 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 78 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 78 :

TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 79 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A ) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE:liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi ) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 79 :

CACGTATCCG GGCATTTGGT C 21 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 80 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA : unică

8120

8125

8130

8135

8140

8145

8150

8155

8160

RO 118299 Β1 ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 80 :

TGCGÎTTCCT GATGCTTGTA C (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 81 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 35 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 81 :

GAGAGAGCGG CCGCTTACCC TTCCTGAGAC AGATT (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 82 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 6 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 82 :

GAGAGA (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 83 :

RO 118299 Β1

8210 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 70 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 83 :

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAA~AA- GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCG 60

TGTTCTGTCT 70 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 84 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 72 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA .unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 84:

CAGTTTAGAC AGAACACGAA GGTCACAAGC TGGCGGAGCC GGGCTCATTA TTTATTACCT 60 ccttggtttî ττ 72 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 85 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară

8215

8220

8225

8230

8235

8240

8245

8250

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 85 :

AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC GGAAGTTCAC 60 CCGCTGCCG 69 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 86 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 86 :

CGGGGTCGGC AGCGGGTGAA CTTCCGGGCA CTGGGACAGA CGAGAGTGCA GCACGTGAGA 60 GTCGCGAAG 69 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 87 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze ( B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 87 :

ACCCCGGTTC TGCTTCCGGC TGTCGACTTC TCCCTGGGTG AATGGAAAAC CCAGATGGAA 60

GAGACCAAA

8300

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 88 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 88:

cTGAcerrro gtctcttcca τοτσβοττττ ccattcaccc agggagaact cgacagccgg so

AAGCAGAAC 69 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 89 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 89 :

GCTCAGGACA TCCTGGGTGC AGTAACTCTG CTTCTGGAAG GCGTTATGGC TGCACGTGGC 60

CAGCtTGGC 69 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 90 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 69 perechi de baze

8305

8310

8315

8320

8325

8330

8335

8340

RO 118299 Β1 ( Β ) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 90 :

GGțCGGGCCA AGCTGGCCAC GTGCAGCCAT AACGCCÎTCC AGAAGCAGAG TTACÎGCACC 60 CAGGATGTC 69 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 91 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 69 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 91 :

CCGACCTGCC TGTCTTCCCT GCTTGGCCAG CTGTCTGGCC AGGÎTCGTCT GCTGCTCGGC 60 GCTCTGCAG S9 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 92 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 66 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 92 :

R0118299 Β1

CAGAGACTCC ACAGCGCCGA GCACACGAAC CTGGCCAGAC AGCTGGCCAA GCAGGGAAGA 60

CAGGCA _eW W (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 93 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 70 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 93 :

TCTCTGCTTG GCACCCAGCT GCCGCCACAG GGCCGTACCA CCGCTCACAA CGATCGGAAC 60

GCTATCTTCC ₇₀ ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 94 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 70 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 94 :

AAGACAGGAA GATACCGTTC GGATCCTTGT GAGCAGTGGT ACGGCCCTGT GGCGGCAGCT 60

GGGTGCCAAG ₇₀ ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 95 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 21 perechi de baze

8390

8395

8400

8405

8410

8415

8420

8425

8430

RO 118299 Β1 (Β) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 95 :

GGACGAGACC AACGCACAGG A 21 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 96 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 30 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 96 :

CCGGAATTCT TACCCTTCGT GAGACAGATT 30 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 97 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 8 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 97 :

CTAATGAG

RO 118299 Β1 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 98 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 16 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (îi) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 98:

AATÎCTCATT ACAGCT 15 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 99.

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 8 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 99 :

CTAATGAG 8 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 100 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA; 16 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară

8480

8485

8490

8495

8500

8505

8510

8515

8520 i

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 100 :

AATTCTCATÎ AGAGCT 16 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 101 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 25 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 101 :

ATCGCCGGCT CCGCCAGCTT GTGAC ²³ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 102 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 30 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA. unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 102 :

CCCGAATTCT CATGAGAGCT CGTTCAGTGT 30 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 103 :

R0118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

8570 (A) LUNGIMEA: 42 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară8575 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 103 :

GATCCGAACG CTATCTTCCT GTCTTTCCAG CACCTGCTGC GT42 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 104 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 44 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic8590 (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 104 :

TTTGCCACGC AGCAGCTCCT GGAAAGACAG GAAGATAGCG TTCG 44^θθ ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 105 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 42 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 105 :

RO 118299 Β1

GGCAAAGxTC GTTTCCTGAT GCTGGTTGGC GGÎTCTACCC TG 42 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 106 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 41 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 106 :

ACGCACAGGG TAGAACCGCC AACCAGCATC AGGAAACGAA C ς], (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 107 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 46 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 107 :

TGCGTTCGTC GGGCGCCGCC AACCACTGCT GTTCCCTCT“ AATGAA 40 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 108 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI .

(A) LUNGIMEA : 45 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1

8665 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 108 .

ACCTTTCATT AAGACGGAAC AGCACTGGTr GGCGGCGCCC GACGA 4S (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 109 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 24 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 109:

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG 24 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 110 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 24 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 110 :

AGAAGGÎTTC ATÎAAGACGG AACA 24

8670

8675

8680

8685

8690

8695

8700 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 111 :

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 46 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 111 :

CTACAAAAAA CCAAGCAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT CTACCA (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 112 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 46 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 112 :

CAGGTCGTAC AGGTGCTTTC ΑΓΤΑΤ~ΑΤΤ ACCTCCTTGG (2) INFORMApI DESPRE SECVENȚA ID Nr. 113 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 113 .

R0118299 Β1

8755

CCTGCATGTG ATÎTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG J8 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 114 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 34 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 114 :

CGCACCAGTT 7AC AC ACG AC CCGTAAATCA CATG 34 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA Ό Nr. 115 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A ) LUNGIMEA: 84 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 115 :

CTAGAAAAAA CCAAGGÂGGÎ AAÎAAATAAT GAAACCACCT GTACCACCTG CATGTCAÎTT SO

ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 116 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 20 aminoacizi ( B ) TIP : aminoacid ( C)CATENA:

8760

8765

8770

8775

8780

8785

8790

8795

RO 118299 Β1 (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 116:

Arg Lau Leu A3.-. Lvs Lau Leu Arg A«o Ser Tyr Lau Leu His Arg

S 10 15

Arg Leu Ser Gl.-.

(2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 117 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 21 aminoacizi ( B) TIP : aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 117:

Phe Ser Leu Cly Glu Tru Lvi Thr Cin Thr Glu Cin Ser Lvs Ala Cin

5 10 ÎS

Asu lle Leu GL·/ Ala ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 118.

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 18 aminoacizi ( B) TIP : aminoacid (C) CATENA:

(D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI. SECV ID Nr. 118 :

Ser Arg Thr Ser GLn Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Leu

10 15

Leu Asp

RO 118299 Β1

8845 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 119 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 aminoacizi (B) TIP: aminoadd (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 119:

Asn Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His ÎS 10 15

Ser Arg Leu Ser Gir.

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 120 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

( A) LUNGIMEA: 16 aminoacizi (B) TIP: aminoadd (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 120:

Ser Leu Glv Glu Tm Lvs Thr Gir. Mec Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asn 1 ‘ 5 10 15 ' (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 121 :

8850

8855

8860

8865

8870

8875

8880 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

8885

RO 118299 Β1 (A) LUNGIMEA : 19 aminoacizi ( B) TIP: aminoacid ( C ) CATENA :

( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 121 :

Leu Cly Thr Gin Leu Pro Pro Cin Glv Arg Thr Thr Ala His Lys Aso 1 S * 10 ÎS

Pro Asn Ala (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 122 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 19 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C ) CATENA:

( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 122 :

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr ÎS 10 ÎS

Ala Ser Ala (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 123 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 23 aminoacizi ( B ) TIP : aminoacid (C ) CATENA;

( D ) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1

8940 (ii) TIP MOLECULAR: peptidă ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 123 :

Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pr= Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His 1 S 10 ¹⁵

Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 124 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C )CATENA:

(D ) TOPOLOGIE . liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 124 :

Pro Ser Al* Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser 15 10 15

Tvr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

25 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 125 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 46 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 125 :

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCA 40

8945

8950

8955

8960

8965

8970

8975

8980

RO 118299 Β1 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 126 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 46 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 126 :

CAGGTGGTGC AGGAGATTTC ATTATTTATÎ ACCTCCTTGG ΤΤΤΤΤΓ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 127 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A j LUNGIMEA: 38 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 127 :

CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTCCG (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 128 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 34 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE . liniară

R0118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt add nucleic

9030 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 128 :

CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 129 :9035 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 84 perechi de baze (B) TIP: add nucleic9040 (C ) CATENA . dublă (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 129:

9050

CTAGAAAAAA CCAACCAGC? AATAAATAAT-CAAArCTCCT GOACCACCTG CASGTGATTT 60

ACCCGTCCTG TCTAAACTGC TGCGg (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 130 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 47 perechi de baze (B) TIP : add nucleic9060 ( C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE . liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nudeic9065 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 130 :

CTCCCGAACC GTACCAGCGG CCTGCTGGAA ACCAACTTTA CCGCGAG¢7

9070

RO 118299 Β1 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 131 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 47 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 131 :

GGTAAAGTTG GTTTCCAGC.'. CGCCGCÎGGT ACGGTTCGGG AGCTCGT (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 132 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 132 :

CGCGCGTACC ACCGGCAGCG GCCTGCTGAA ATGGCAGCAG GGCTTTCGT (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 133 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA. 49 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA : unică ( D) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt arid nucleic

9120 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 133 :

AGCCCTGCTG CCATZTCAGC AGGCCGCTGC CGGTGGTACG CGCGCTCGC 49 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 134 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 50 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 134 :

GCGAAAATCC CGGGCCTGCT GAACGAGACC AGCCGTAGCC TGGATCAGAT SG ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 135 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 50 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI. SECV ID Nr. 135 :

ATCCAGGCTA CGGCTGGTCT GGCTCAGCAG GCCCGGGATT TTCGCACGAA 50 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 136 :

9125

9130

9135

9140

9145

9150

9155

RO 118299 Β1

9160

9165

9170

9175

9180

9185 i

/

9190

9195

9200 (ί) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 47 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: unică (O ) TOPOLOGIE . liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 136 :

CCCGGGCTAT CTGAACCGTA TCCAÎGAAC7 GCxGAACGGC ACCCGTG 4?

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 137 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 47 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 137 :

GTGCCGTTCA GCAGTTCAÎG GATACGGTTC AGATAGCCCG GGATCTG 47 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 138 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 138 :

GCCTGTTTCC GGGCCGGAGC CGTCGCACCC TGGGCGCGCC GGATATCAG 49

9205

RO 118299 Β1

9210 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 139 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 49 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 139 :

ATCCGGCGCG CCCAGGGXGC GACGGCTCCG GCCCGGAAAC AGGCCACGG 49 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 140 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 50 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 140 :

AXCAGCTCTG GCACCAGCGA “ACCGGCAGC CXGCCGCCGA ACCTGGAGCC 50 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 141 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚE!.

(A) LUNGIMEA: 50 perechi de baze ( B ) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară

9215

9220

9225

9230

9235

9240

9245

9250

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 141 :

CAGGTTCGGC GGCAGGCTGC CGGTATCGCT GGTGCCAGAG CTGATATCCG 50 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 142 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 51 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 142 :

GGGCTATAGC CCGAGCCCGA CCCATCCGCC GACCGGCCAG TATACCCTGT T SI ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 143 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 51 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 143 :

GCxATACTGG CCCGTCGGCG GA’GGGTCGG GCTCGCGCTA TAGCCCGGCT G 5 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 144 .

RO 118299 Β1

9300 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 50 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 144 :

TCCGCTGCCG CCGACCCTGC CGACCCCGGT GGTTCAGCTG CATCCGCTGC SO ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 145 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 50 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 145 :

GGATGCAGCT GAACCACCGG GGTCGGCAGG GTCGGCGGCA GCGGAAACAG 50 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 146 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 51 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA . unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 146 :

TGCCGGATCC CACCGCGCCG ACCCCGACCC CGACCAGCCC GCTGCTGAAC A si

9305

9310

9315

9320

9325

9330

9335

9340

RO 118299 Β1 ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 147 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 51 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE. liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 147 :

AGCAGCGGGC TGGTCGGGG? CCCGGTCGGC GCGCTCGGAT CCGGCAGCAG C (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 148 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 51 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 148 :

CCAGCTATAC CCATAGCGAG AACCTGAGCC AGGAAGGCTA ATGAAGCTTG A $1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 149 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 51 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ⁹³⁹⁰ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 149 :

CTTGATTAGC CTCCCTGCC': CAGGTTCTGG CTATGGGTAT AGCTCGTGTC C 519395 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 150 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.9400 (A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic

9410 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 150:

ACGAGCTCCC GAACCGTACC A21 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 151 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 151 .

CTGATATCCG GCGCGCCCAG G 219430 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 152 :

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 21 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 152 :

CGCATATCAC CÎCTCGCACC A (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 153 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 153 :

TCAACCTTCA TTACCCTÎCC T (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 154 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 490 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: dublă ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic

RO 118299 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 154 :

9480

CTC CCG

AAC CGT Asn Arg

ACC Thr

AGC Ser

GGC Gly

CTG CTG GAA

ACC Thr

AAC TTT

ACC Thr

GCG Ala ÎS

AGC Ser

48

Leu 1

Pro

Leu

teu

Glu 10

Asn

Phe

GCG

CGT

ACC

ACC

GGC

AGC

GGC

CTG

CTG

AAA

TGG

CAG

CAG

GGC

TTT

CGT

96

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lvs

Trp

Gin

GLn

GLv

Phe

Arg

20

25

30

9485

GCG

AAA

ATC

CCG

GGC

CTG

CTG

AAC

CAG

ACC

AGC

CGT

AGC

CTG

GAT

CAG

144

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Aso

Gin

35

40

45

ATC

CCG

GGC

TAT

CTG

AAC

CGT

ATC

CAT

GAA

CTG

CTG

AAC

GGC

ACC

CGT

192

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

so

SS

60

9490

GGC

CTG

TTT

CCG

GGC

CCG

AGC

CGT

CCC

ACC

CTG

GGC

GCG

CCG

GAT

ATC

240

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

65

70

75

80

AGC

TCT

GGC

ACC

AGC

GAT

ACC

GGC

AGC

CTG

CCG

CCG

AAC

CTG

CAG

CCG

268

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

as

90

95

9495

GGC

TAT

AGC

CCG

AGC

CCG

ACC

CAT

CCG

CCG

ACC

GGC

CAG

TAT

ACC

CTG

336

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

100

10S

110

TTT

CCG

CTG

CCC

CCG

ACC

CTG

CCG

ACC

CCG

GTG

GTT

CAG

CTG

CAT

CCG

384

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

οςΛΛ

115

120

12S

zjUU

CTG

CTG

CCG

GAT

CCG

AGC

GCG

CCG

ACC

CCG

ACC

CCG

ACC

AGC

CCG

CTG

432

Leu

Leu

Pro

As?

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

130

135

140

CTG

AAC

ACC

AGC

TAT

ACC

CAT

AGC

CAG

AAC

CTG

AGC

CAG

GAA

GGC

TAA

480

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

—

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

9505

145

14 S

1S0

TGAAGCTTGA

490

(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 155 :

9510 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 24 perechi de baze

(B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară	9515
(ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic	9520

( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 155 :

AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG

9525

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚI! DESPRE SECVENȚA ID Nr. 156 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 56 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 156 :

GGGAGCTCGT TCAGCGTCAG AACCACAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT GGTTGG 56 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 157 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A ) LUNGIMEA: 157 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: dublă ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 157:

G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAC CAC CTG CTG CGT GGC 46

Asp Pro Asn Ala lle Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly

X 5 10 15

AAA GTT CGT

TTC CTG Phe Lau 20

ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG

TGC GTT

CGT Arg

94

Lys

Val

Arg

Met

Leu

Val Gly Gly 25

Ser

Thr

Leu

Cys

Val 30

CGG

GCG

CCG

CCA

ACC

ACT

GCT

GTT CCG

TCT

CGT

ACC

TCT

CTG

GTT

CTG

142

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Ala

Val Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

35

40

45

ACC CTG AAC GAG CTC Thr Leu Asn Glu Leu

157

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 158 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.9570 ( A) LUNGIMEA: 100 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară9575 (ii) TIP MOLECULAR. alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 158 :

CCTCGAGGAA “CCTGCAGC CCGGGACTAG TATCGGGTAC CCCTACGACG TCCCCGACTA 5G

CGCCGGCGTC CATCACCATC ACCXTCACTG AGCGGCCGCC.

9585 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 159 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

9590 ( A) LUNGIMEA: 108 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară

9595 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 159 : ₉₆θθ

AATTGGCGGC CGCTCAGTGA TGGTGATGGT GATGAGCGCC GCCGTAGTCG GGGACGTCGT 60

AGGGGTAGCC GATACTAGTC CCGGGCTGCA GGAATTCCTC CAGGGTAC 106

9605 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 160 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

RO 118299 Β1 (A) LUNGIMEA : 70 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic ( C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 160 :

AATTCCAAGA 7CTCACACTT GCTTTCGACA CAACTGTGTT TACTTGCAAT CCCCCAAAAC

AGACAGACCC (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 161 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 66 perechi de baze (B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 161 :

GGGTCTGTCT G~~TGGGGG ATTGCAAGTA AACACAGTTG TGTCAAAAGC AAGTGTGAGA

TCTTGG ( 2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 162 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 29 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic ( C) CATENA : unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară

R0118299 Β1

9655 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 162 :

CGCCCCCGAT GGAGCÎGACT CAATTGCTC 29 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 163 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 35 perechi de baze ( B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt add nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 163:

TCAAGCTTAC TAGTCCCCTC CTGAGACAGA TTCTG 35 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 164:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 22 perechi de baze (B ) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: unică (D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 164 :

TAATACGACT CACTATACCG CC 22

9660

9665

9670

9675

9680

9685

9690

9695 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 165 :

RO 118299 Β1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 22 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 165

AATTCCAAGA TCACACACTT CC 22 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 166 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 35 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 166 :

TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG 35 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 167 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 35 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR ; alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 167 :

TGGGCACTGG CTCAGGTTGC T gtgaacgac atgcg

RO 118299 Β1

9750 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 168 :

(j) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 27 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 168:

TCTAGGCAAA CCGGTAACCT CTSGGCA 27 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 169 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 21 aminoacizi (B) TIP : aminoacid ( C)CATENA:

( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 169 :

Thr Ser lle Gly Tyr ?ro Tyr Asp val ?ro Asp Tvr Ala GLv Val His ^{1 3} 10 * 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 170 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 30 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic

9755

9760

9765

9770

9775

9780

9785

9790

RO 118299 Β1 (C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 170 :

TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC J0 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 171 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 41 perechi de baze ( B) TIP: acid nucleic ( C ) CATENA: unică ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 171 :

TXTGCGGCCG CTCATTAXXC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 172 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 24 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 172 :

TGTAGGCAAA GGAACCTCTG GGCA

RO 118299 Β1

9840 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 173 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 173:

TGTAGGCAAA GGAGTGTGAA CCTCTGG 27 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 174 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI. SECV ID Nr. 174 :

TGTAGGCAAA GGAGCGTGAA CCTCTGG 27 ( 2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 175 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE : liniară

9845

9850

9855

9860

9865

9870

9875

9880

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR ; alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 175 :

TGTAGGCAAA GGTCCGTGAA CCTCTGG 27 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 176 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA : 24 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 176:

AGCTGTGGTC CTCTGTGGAG GAAG 24 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 177 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI .

(A) LUNGIMEA: 24 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA : unică (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 177 :

GTGAGCrGTC GTGCCCTGTG GAGG 24 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 178 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI

R0118299 Β1 (A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze ( B) TIP: acid nucleic ( C) CATENA: unică (D)TOPOLOGIE . liniară

9930

9935 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 178:

AGCTGTGGTC CTCTÎCCCCT GTGGAGG 27 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 179 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: alt addnucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 179 :

AGCTGTGGTC CTACCGCCCT CTGGAGG 27 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 180 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 27 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic (C ) CATENA: unică ( D ) TOPOLOGIE : liniară

9940

9945

9950

9955

9960

9965

9970 (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 180 .

9975

AGCTGTGGTC CTTCCGCCCT

GTGGAGG

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 181 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 26 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 181 :

CGGGCTGCAG GATAÎCCAAG ATCTCA 2 o (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 182 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A j LUNGIMEA: 22 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic ( C) CATENA: unică (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 182 :

TAATACGACT CACTATAGGG CG 22 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 183 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 34 perechi de baze ( B ) TIP : acid nucleic ( C ) CATENA : unică ( D) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR: alt acid nucleic (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 183:

gcgcggccgc TCACCTGGGG ACAGCTGTGG TGGG 34 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 184:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 7 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (ix) TRĂSĂTURI:

(A) NUME / COD: trăsături diverse (D)ALTE INFORMAȚII:

/ notă = . Aminoacidul din poziția 2 este Ala, Ser, Gly, Met sau Gin” (ix) TRĂSĂTURI:

(A) NUME / COD: trăsături diverse (D)ALTE INFORMAȚII:

/ notă =. Aminoacidul din poziția 7 este Glu sau Lys” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 184 :

Ly« Xaa Tyr Tyr Glu Ser Xaa

5 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 185 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 6 aminoacizi

10025

10030

10035

10040

10045

10050

10055

10060

RO 118299 Β1 *

10065	( Β) TIP : aminoacid (C) CATENA: (D) TOPOLOGIE: liniară
10070	(ii) TIP MOLECULAR : peptidă (ix) TRĂSĂTURI: (A) NUME / COD: trăsături diverse
10075	( D) ALTE INFORMAȚII: / notă = H Aminoacidul din poziția 6 este Glu sau Asp
10080	( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 185 : Lys GLx Arg Ala Aia Xaa 1 =
f	(2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 186 :
10085	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI. ( A) LUNGIMEA: 7 aminoacizi (B) TIP : aminoacid
10090	(C ) CATENA: ( D) TOPOLOGIE: liniară
10095	(ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 186
10100	Lys Ala Glv Xaa Cys Sar Gly I 5 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 187 :
10105	(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI . (A) LUNGIMEA: 13 aminoacizi ( B) TIP : aminoacid

R0118299 Β1 (C) CATENA :

(D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (ix) TRASATURI.

(A) NUME / COD: trăsături diverse (D) ALTE INFORMAȚII:

/ notă =. Aminoacidul din poziția 2 este lle, Thr sau Ser” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 187:

Ly« X** Pro VaL pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu

10 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 188 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

( A) LUNGIMEA: 9 aminoacizi ( B) TIP: aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă ( xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 188 :

Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys

5 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 189 .

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 9 aminoacizi (B) TIP: aminoacid ( C) CATENA :

10110

10115

10120

10125

10130

10135

10140

10145

10150

RO 118299 Β1 ( D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (ix) TRĂSĂTURI:

(A) NUME / COD : trăsături diverse ( D) ALTE INFORMAȚII:

/ notă = Aminoacidul din poziția 1 este Lysină sau Arginină” (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 189 :

X*i Thr Leu Pro Thr X** al* va’ ?— — ~ (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 190 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 15 aminoacizi (B) TIP : aminoacid (C) CATENA:

(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 190 :

Lys Asp Ser Phe Leu Aia Aso VaL Lvs Cin Tyr Glu Ser Glu

5 * IO * 15 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 191 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 322 aminoacizi (B) TIP : aminoacid (D) TOPOLOGIE : liniară

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR: proteină (vi) SURSĂ DE ORIGINE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens

10195 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 191 .

Ser 1 Arg

Pro Asp

Ala Pro

Pro Ala S

Cys His.

Asp Leu Arc Val Leu Ser

Lys Leu Leu 15

10200

10

Cys

Ser

His 20

Val

Leu

Ser

Arg Lau 25

Sar

GLn

Pro 30

Glu Val

His

Pro

Leu 3S

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser Leu

Gly

GLu SO

Trp

Lys

XHx

Gir.

Mec ss

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

GLn

Asp

lle Leu

10205

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Lau 70

Leu

Glu

Gly

val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

GLn

Leu

Ser

Glv GLn 95

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

GLn 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

GLn Leu

10210

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg

—hr

Thr

Ala 120

HLs

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

lle Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Lau

Lau 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Mez Lau

10215

Val 145

dy

Gly

Ser

Thx

Leu e · • ZU

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Th~

Thr Aia 150

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 155

Sar

Lau

Val

Leu

Thr L7C

Lau

Asn

GLu

Lau

Pro Asn 175

Arg

Thr

Ser

GLy lao

Lau

Leu

Glu

Thr

Asn ias

Phe

Thr

Ala

Sar

Ala 190

«rg Thr

10220

Thr

GLy

Ser 19 S

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys île

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Sar

Leu

Aso 220

GLn

lle

Pro GLy

10225

225

Lau

Asn

Arg

lle

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Lau Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

lle

Ser

Ser Gly 255

Thr

Ser

Asp

Thr 200

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 255

Asn

Leu

Gin

Pro

Glv 270

Tyr Ser

10230

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro Lau

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

GLn

Leu

His 300

Pra

Leu

Lau Pro

10235

Aso 305

pro

Ser

Ala

Pro

-r>>- » * 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Leu

Asn Thr 320

Ser Tyr Thr His Ser Cin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

325 330

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 192 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 1086 perechi de baze (B) TIP : acid nucleic ( C) CATENA : dublă ( D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR : ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE :

(A) ORGANISM : Homo sapiens (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 192 :

GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA AtG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG Si

Het Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val

-21 -20 -15

GTC Val

ATG CTT

CTC Leu

CTA ACT

GCA AGG CTA ACG

CTG Lau

TCC AGC

CCG GCT CCT

99

Mec

Leu -10

Leu

Thr

Ala Arg -S

Leu

Thr

Ser

Sar 1

Pro

Ala

Pro

CCT

GCT

TCT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

147

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

5

10

ÎS

20

GTC

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

CTT

CAC

CCT

rrc

CCT

19S

val

Lau

His

Ser

Arg

Lau

Ser

Cir.

Cys

Pro

Glu

val

His

Pro

Leu

Pro

25

30

35

ACA

CCT

GCC

CTG

CTG

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

AAA

243

Thr

Pro

Vel

Leu

Leu

Ala

Val

Aso

Phe

Sar

Leu

Gly

Glu

Tru

Lys

40

45

50

ACC

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

CTG

ACC

291

—K-

Gir.

Mac

Glu

Glu

—κ-

Lys

Ala

Gir.

Asp

lle

Lac

Glv

Ala

Val

55

SC

£5

CTG

CTG

GAG

GGA

ότα

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

339

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Mec

Ala

Ala

Arg

Gly

Gir.

Leu

Gly

Pro

TO

*5

30

TGC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

387

Cys

Leu

Ser

Ser

Lau

Leu

G-7

Gin

Leu

Ser

CLv

Gir.

Vai

Arg

Leu

Leu

35

30

95

LOC

CTT

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

CGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

43S

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Sar

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Cin

Cly

105

110

1' 5

AGC

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

433

Arg

TJ,

Thr

Ala

His

Lys

Aso

Pro

Asn

Aia

lle

Phe

Leu

Ser

Phe

Gir.

120

125

130

R0118299 Β1

CAC HiS

CTG CTC

CGA GGA

AAG GIG

CGT Arg 140

TTC Phe

CTG Leu

ATG Mec

CTT Lau

CTA vai 145

GGA Gly

GGC Gly

TCC Sar

531

10285

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

ACC

CTC

TGC

CTC

AGG

CCG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

CTC

CCC

AGC

AGA

S79

Thr

Leu

Cys

v*l

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

150

135

160

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

țc-

GGA

627

10290

Thr

Ser

Leu

V*1

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

165

170

175

130

TTC

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

CCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

67S

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

“h

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Thr

Gly

Sar

Gly

13S

190

193

CTT

CTG

AAG

TGG

CAC

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Aia

Lys

lle

Pro

Gly

Leu

Lau

10295

200

205

210

AAC

CAA

ACC

TCC

ACC

TCC

CTG

CAC

CAA

ATC

CCC

CCA

TAC

CTG

AAC

AGG

771

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Lau

Asp

Cin

lle

Pro

Gly

Tyr

Lau

As.·.

Arg

215

220

225

ATA

CAC

CAA

CTC

TTC

AAT

CGA.

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

319

Tle

His

Glu

Leu

Leu

Asr.

Glv

Thr

Arg

Gly

Lau

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

10300

230

235

240

CCC

AGG

ACC

CTA

CCA

CCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

867

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

lle

Ser

Sar

Gly

Thr

Ser

Asp

σ',· — • »Ma

243

250

235

250

GCC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

CCA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

915

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gir.

Pro

Glv

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

10305

255

270

275

CAT

CCT

CCT

ACT

CCA

CAC

TAT

ACC

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

963

His

Pro

Pro

Thr

Gly

cm

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Lau

230

235

290

CCC

ACC

CCT

CTG

CTC

CAC

CTC

CAC

/·**<<·

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GGT

1011

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Cir.

Leu

His

Pro

Leu

Lau

Pro

Asn

?ro

Sar

Ala

29S

3C0

305

10310

CCA

ACG

CCC

ACC

GCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

1059

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Ser

Pro

Lau

Lau

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

310

31=

320

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GCG

TAA

1086

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gir.

Glu

Gly

323

330

10315

(2) INFORMAȚII OESPRE SECVENȚA IO Nr. 193:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.	10320
(A) LUNGIMEA : 7 aminoacizi
(B) TIP : aminoacid
(C) CATENA : unică
( D) TOPOLOGIE . liniară	10325

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : peptidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 193 :

Lvs Cin Tyr Tyr Glu Ser Glu

3 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 194:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 1663 perechi de baze (B) TIP: add nucleic (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE : liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE :

(A) ORGANISM : Rattus norvegicus (H) LINIE CELULARĂ: McA - RH8994 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 194 :

GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC

CACCTGTCCC

CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAACCCGTCT

CCATGGCCCC AGGAAAGATT

120

CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA

GA ATG

Mec

175

GAG

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

GTG

GCC

ATA

CTT CTC

CTC

ACC

GCA

AGA

223

Glu

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu

Leu

Vel

Ale

Ile

Leu Leu

Leu

Thr

Ala

Arg

-20

-15

-10

-5

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCA

GTT

CCT

CCC

GCC

TGT GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

271

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser

Pro

Vel

Pro

Pro

Ala

Cys Asp

Pro

Arg

Leu

Leu

Ț_

S

10

AAT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

TAC

CTC

CTT

CAC AGC

CGA

CTG

AGT

CAG

319

Asn

Lvs

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

Tyr

Leu

Leu

His Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

15

20

25

TGT

CCT

GAC

GTC

AAC

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTC CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

367

cys

Pro

Asp

Vel

Asn

Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Val Leu

Leu

Pro

Ala

VaL

30

35

40

CAC

TTT

AGC

CTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACG CAA

CAC

ACC

AAC

GCA

A · S *i·

A3p

Phe

Ser

Leu

Gly

Gir

Trp

Lys

—u «·

Gir.

Thr Glu

Gin

Sar

lys

Ala

<15

5C

5 5

6G

R0118299 Β1

CAG GAC

ATT Z La

CTA GGG GCA GTG

TCC Ser

CTT Le·-

CTA Leu 7G

CTG Leu

GAv* Glu

GGG GTG ATG

GCA AL*

463

10370

Gin

Asp

Leu

Gly AL1 «5

V*i

Gly

V*L

Mer 75

GCA

CGA

GGA

CAG

CTC

GAA

CCC

TCC

TCC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTC

GCA

CAG

511

Al*

Ar;

Gly

Cin

Leu

Glu

?rs

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

80

25

90

CTT

TCT

GOT

CAG

GTT

CCC

CTC

CTC

TTC

GCA

GCC

CTC

CAG

GGC

CTC

CTA

559

Leu

Ser

Gly 95

Gin

V*1

Ar;

Iau

Leu 100

Leu

Gly

AL*

Leu

Gir. 105

Gly

Leu

Leu

10375

GCA

ACC

CAC

GTA

ACT

CCC

CAC

ACC

TAT

ACA

AAC

TAC

CCT

CTT

ACT

CAG

507

Gly

Thr

Gin

V*L

Ser

?rr

Gin

Thr

Tv r

Ar;

Asn

Tvr

?rr

Lau

Thr

Gin

110

115

120

tTC CTC TAAGGACCTG GGAAAACACA AGGCATTCTA GATTCTAGCT GTCTTCACTC Phe Leu

125 ââ3

10380

TATGAAAGCT	GGTCTATACG	GACTGATCCT	TCTCACCCAC	AATACCTGGG	TGCTCCCACT	723
AAATCTTTCC	ACCTTAGTGA	GAAGACCCCT	CATATGTCCG	CCAACTCACT	GGCCTCAGGC	783
CCATCCTCTG	CCTTCAGCTT	CCTCCACACG	CCACCACCAC	ACCTCACAAG	GACCCCAGTG	843
CCCTCTTCTT	GAGCTTGCAA	CAACTGCTTC	GGGGAAAGGT	GCGCTTCCTG	CTGCTGCTAG	903
AAGGTCCCGC	CCTCTGTGTC	AGACGGACCC	TTCCCACCAC	AGCTGTCCCA	ACCAGAACCT	963
CTCAACTCCT	CACACTAAAC	AAGTTCCCAA	ACAGACTTCT	GGATTGTTGC	ACACGAACTT	1023
CAGTGTTGTA	GCCAGAACTG	CTGGCCCTGG	ACTTCTGAAC	AGGCTTCAAG	GATTCAGAGC	1083
CAAGATTATT	CCTGGTCACC	TAAATCAAAC	CTCCGGGTCC	TTAGACCAAA	TCCCTGGATA	1143
CCTGAACGGG	ACACACGAAC	CTGTGAATCG	AACTCAÎCGC	CTCTTTGCTG	CGACCTCACT	1203
AGAGACCCÎG	GAAGCCCCAG	ACGTTGTGCC	AGGAGCTTTC	AACAAACGCT	CCÎTGCCACT	1263
CAACCTCCAG	AGTGGACTTC	CTCCTATCCC	AAGCCTTGCT	GCTGATGGAT	acacactttt	1323
CCCTCCTTCA	CCTACCTTCC	CCACCCCTGG	GTCTCCACCC	CAGCTCCCCC	CCGTTTCCTG	1383
ACCCCTCCAC	CACCATACCT	AACTCTACCA	ACCCTCATCC	AGGACTTGGT	CTCACTAACC	1443
GTCCCGTGCA	CTGGCACGGA	GCSCwATOG _	CTCCAACATC	TCTCACGCCC	AAGCTTCCTC	1503
AGGAACGCTC	TGAGGCAGCT	CACTAGACAT	CCTGCTCTCG	CCTAACGGGC	CCTGGCAAAG	1563
GGATACACAG AATATTCATC	CCCAGGACAC AGACCAAAAA	tgtacaacct ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	TAGG AG CGAT >J^AA.V_VAA	TTTTTTCTTA	ACCTATCAAC	1623 1663

10385

10390

10395

10400 (2 ) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 195 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 861 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C ) CATENA: dublă ( D) TOPOLOGIE : liniară

10405

10410

RO 118299 Β1 (ii) TIP MOLECULAR : ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (F) TIP DE ȚESUT: Ficat (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 195 :

GGCCACCCAC ACACCCCGGC CACA ATC GAG CTC ACT GAA TTC CTC CTC GTG Mez Glu Leu Thr Glu Leu Leu Iau Val -21 -20 -15

CTC Val

ATC M<-

CTT Leu -10

CTC Leu

CTA Lau

ACT -*u —

CCA ACC A» 4L A^Îy -3

CTA Leu

ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT

99

Th—

Lau

Ser

Ser X

Pro

Aia Pro

CCT

CCT

TCT

CAC

CTC

CGA

GTC

CTC

ACT

AAA

CTC

CTT

CGT

CAC

TCC CAT

147

Pro s

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Val

Lau

Ser

Lys

Leu ÎS

Leu

Arg

Asp

Sar His 20

CTC

CTT

CAC

ACC

ACA

CTG

ACC

CAG

TCC

CCA

GAC

CTT

CAC

TTG CCT

195

Val

Lau

His

Ser

Arg 25

Leu

Sar

Cin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu Pro 35

ACA

CCT

CTC

CTC

CTC

CCT

CCT

CTC

CAC

TTT

AGC

TTG

OCA

CAA

TCC AAA

242

Thr

Pro

Val

Lau 40

Lau

Pro

Ala

val

Aao 45

Phe

Ser

Lau

Glv

Clu 50

Trp Lys

ACC

CAG

ATC

CAC

CAC

ACC

AAG

CCA

CAC

CAC

A~

CTG

GCA

GCA

GTG ACC

291

Thr

Cin

Maz 55

Clu

Clu

Lys

Ala 00

Cin

Asp

Ile

Leu

Gly 03

Ala

val Thr

CTT

CTG

CTC

CAC

CCA

CTC

ATG

CCA

CCA

CCG

CCA

CAA

CTG

CCA

CCC ACT

339

Lau

Lau 70

Leu

Clu

Cly

Val

Maz 75

Ala

Ala

Arg

Cly

Gin aa

Leu

Cly

Pro Thr

TCC

CTC

TCA

TCC

CTC

CTC

GCC

CAC

CTT

TCT

CCA

CAG

GTC

CGT

CTC CTC

387

Cys as

Leu

Ser

Ser

Leu

Lau 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Glv 95

Cin

Val

Ar?

Leu Leu 100

CTT

GGC

CCC

CTC

CAC

ACC

CTC

CTT

CCA

ACC

CAC

CTT

CCT

CCA

CAG CCC

435

Lau

Gly

Ala

Leu

Cin 105

Sar

Lau

Leu

CLv

Thr 110

Cin

Lau

Pro

Pro

Cin Cly 115

AGC

ACC

ACA

CCT

CAC

AAC

GAT

CCC

AAT

CCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC CAA

483

Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 12S

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 120

Phe Cin

CAC

CTG

CTC

CCA

CCA

AAC

CTC

CGT

TTC

CTC

ATC

CTT

GTA

GCA

GCG TCC

531

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

val

Arg 140

Phe

Leu

Maz

Leu

Val 145

Gly

Cly Ser

ACC

CTC

TGC

CTC

ACC

CCC

CCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

CTC

CCC

AGC ACA

579

Thr

Leu 1S0

Cys

val

Ar?

Ar?

Ala 155

Pro

Pro

-hr

Thr

Ala 150

Val

Ser Arg

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGC

ACT

TCT GGA

627

Thr 15S

Ser

Leu

v*l

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Ar?

Thr

Sar Gly 130

TTG

TTC

CAC

ACA

AAC

TTC

ACT

CCC

TCA

CCC

ACA

ACT

ACT

GCC

TCT GCC

67S

Leu

Leu

Clu

TU —

Asr. 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Sar Glv 155

RO 118299 Β1

CTT

CTG

AAC

TCC

CAC

CAC CCA

TTC

ACA

CCC

AAC

ATT

CCT

CCT

CTC

CTC

723

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

CLn Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

lle

Pro

Cly

Leu

Leu

200

20S

210

AAC

CAA

ACC

TCC

ACC

-CC CTG

CAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTC

AAC

ACC

771

Asn

Cin

Thr

Sar :

Krg Ser Leu

Asp

CLn

ILe

Pro

Cly

Tyr

Leu

Asn

Arg

215 220 22S

10455

ΑΤΑ CAC CAA CTC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 823

21« His Glu Leu

230

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA găl

10460 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 196 :

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 1267 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE: liniară

10465

10470 (ii) TIP MOLECULAR: ADNc până la ARNm (vi) SURSA DE ORIGINE .

(A) ORGANISM: Homo sapiens (F) TIP DE ȚESUT: Ficat

10475

10480 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 196 :

CCCCACCCAG ACACCCCGGC CACA ATC CAC CTC ACT CAA TTG CTC CTC CTC SI

Me: Clu Leu Thr Clu Leu Leu Leu Val

-21 -20 -15

10485

CTC ATC CTT

CTC CTA ACT CCA

ACG Arg — 5

CTA Leu

ACC CTG TCC

ACC CCC

GCT CCT

99

Val

Nes

Leu -10

Leu

Leu

Thr

Ala

Thr

Leu

Ser

ser 1

Pro

ALa

Pro

CCT

CCT

TCT

GAC

CTC

CCA

GTC

CTC

ACT

AAA

CTG

CTT

CCT

CAC

TCC

CAT

147

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

S

10

LS

20

CTC

CTT

CAC

ACC

-AGA

CTC

ACC

CAG

TCC

CCA

CAC

CTT

CAC

CCT

TTG

CCT

195

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Clu

VaL

His

Pro

Leu

Pro

25

30

35

ACA

CCT

CTG

CTC

CTC

CCT

CCT

CTG

CAC

TTT

ACC

TTC

CGA

GAA

TGG

AAA

243

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

ALa

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

CLu

Trp

Lys

40

45

50

ACC

CAG

ATC

CAC

CAC

ACC

AAC

CCA

CAC

GAC

ATT

CTC

CGA

CCA

CTC

ACC

291

Thr

Cin

Mec

Clu

Clu

Thr

Lys

Ala

CLn

Asp

lle

Leu

CLv

ALa

VaL

Th—

55

so

65

CTT

CTC

CTC

CAG

CGA

CTC

ATC

CCA

CCA

CCC

CCA

CAA

CTC

CGA

CCC

ACT

339

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Meu

ALa

ALa

Arg

Cly

CLn

Leu

CLy

Pro

Thr

70

75

ao

10490

10495

RO 118299 Β1

10500

TCC Cys 85

CTC TCA

TCC CTC

CTG GGG

CAG GLn

CTT Leu

TCT Ser

CGA CAG GTC CGT CTC CTC

387

Leu

Ser

Sar

Leu

Leu 90

Gly

Gly 95

Gin Val

Arg Leu Leu 100

CTT

CGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

CCA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

435

Leu

Gly

Ala

Lau

Gin

Ser

Leu

Lau

Gly

Thr

GLn

Lau

Pro

Pro

Gin

Gly

105

110

115

10505

AGC

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

483

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Xle

Phe

Leu

Ser

Phe

GLn

120

125

130

CAC

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

CTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGC

TCC

531

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

val

Arg

Phe

Leu

Mee

Leu

Val

Gly

GLy

Ser

135

14C

143

10510

ACC

CTC

TGC

GTC

ACG

CCG

CCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GTC

CCC

ACC

AGA

579

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Ala

Pro

Pro

-1 w —

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

150

155

150

ACC

TCT

CTA

GTC

ACA

CTG

AAC

GAC

CTC

CCA

AAC

AGC

ACT

TCT

GGA

527

Ser

Leu

Val

Lau

Thr

Lau

A3n

Glu

Lau

Pro

Asr.

Arg

Sar

Glv

155

170

175

130

10515

TTG

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

CCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GCC

GGG

S7S

Leu

Leu

GLu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Gly

Ser

Gly

135

19C

195

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

ACA

CCC

AAC

AL 1

CCT

CGT

CTG

CTG

723

Leu

Leu

Lys

Trp

Gir.

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Xle

Pro

Gly

Leu

Lau

200

20S

210

10520

AAC

CAA

ACC

TCC

ACG

TCC

CTG

CAC

CAA

ATC

CCC

CGA

TAC

CTG

AAC

ACG

771

Asn

GLn

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Xle

Pro

Gly

Tyr

Lau

Asn

Arg

2LS

220

225

ATA

CAC

GAA

CTC

AAT

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

819

Xle

His

GLu

Leu

Lau

Asn

Gly

Th4

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

230

235

240

10525

CGC

AGG

ACC

CTA

CGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

«CA

GAC

ACA

357

Arg

Arg

Thr

Leu

Cly

Ala

Pro

Asp

Xle

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

245

250

2SS

250

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAC

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

91S

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gir.

Pro

Glv

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

—U — e ·*«

255

270

275

10530

CAT

CCT

CCT

ACT

CCA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

963

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gir.

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

230

235

290

CCC

ACC

CCT

GTG

CTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

1011

Pro

Thr

Pro

Val

Val

GLn

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Aso

Pro

Ser

Ala

295

300

305

10535

CCA

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

10S9

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

310

315

320

TCC

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAACGTTCTC AGACACTCCC GACATCACCA

1113

Ser

GLn

Asn

Leu

Ser

GLn

Glu

Glv

325 330

10540

TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT CGACAAGATT

ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA

1257

TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAACGGA

1233

RO 118299 Β1 (2) INFORMAȚII DESPRE SECVENȚA ID Nr. 197 :

10545 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.

(A) LUNGIMEA: 549 perechi de baze ( B) TIP : acid nucleic

10550 (C) CATENA: dublă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIP MOLECULAR: ADN sintetic

10555 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV ID Nr. 197 :

CTC CTT CCC

CGT g

CCA Gly

TCC CCG CCT

CCG Pro

CCA Pro 5

CCT TCT

CAC CTT

CGT Arg 10

GTT Val

4â

10560

Leu Val

Pro

Ser 9

Pro Ala

Ala

Cys

Asp

Leu

CTC

TCT

AAA

CTC

CCC

CAC

TCT

CAC

C7G

CTC

CAC

TCT

CCT

CTG

TCC

95

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

15

20

25

CAC

TCC

CCG

CAA

CTT

CAC

CCC

CTG

CCG

ACC

CCG

CTT

CTC

CTT

CCG

GCT

144

CU

Cys

Pro 30

Clu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

«·

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

10565

CTC

CAC

TTC

TCC

CTC

CCT

CAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ATC

CAA

CAC

ACC

AAA

192

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Cly

Glu

Trp

Lys

Thr

Cin

aer

Glu

Clu

Lys

4S

50

55

GCT

CAC

CAC

ATC

CTG

CCT

CCA

CTA

ACT

CTG

CTT

CTC

CAA

GGC

CTT

ATG

240

Ale 60

Cin

Asp

rie

Leu

Cly 65

Ala

val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Clu

Cly

val

Mec 75

10570

CCT

CCA

CCC

CAC

Vw*·

CCG

ACC

TCC

CTG

TCT

TCC

CTC

CTT

GGC

233

Ala

Ala

Arg

CLy

Gir.

Leu

Cly

Pro

Thr

Cvs

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Cly

ao

ss

90

CAC

CTC

TCT

CCC

CAC

CTT

CGT

CTG

CTG

CTC

GGC

GCT

CTG

CAC

TCT

CTG

335

Gin

Leu

Ser

GLv

Cin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Cly

ALa

Leu

Gir.

Ser

Leu

95

100

105

10575

CTT

CCC

ACC

CAC

CTG

CCC

CCA

CAG

GGC

CCT

ACC

ACT

CCT

CAC

AAC

CAT

364

Leu

Cly

Thr

Cin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

ALa

nis

Lys

Asp

110

115

120

CCC

AAT

CCC

ATC

TTC

CTC

ACC

TTC

CAA

CAC

CTC

CTC

CCA

GGA

AAC

GTG

432

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

125

130

135

10580

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

CTA

CCA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

CTC

AGC

CCG

CCC

4ao

Arțj

Phe

Leu

Het

Leu

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

ALa

140

145

150

L5S

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

CTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

523

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

val

Leu

Leu

AAC CAC CTC TAATGAGAAT TC Asn Glu Leu

150 165 170

10585

549

Claims (32)

1. Revendicări

   1. Polipeptidă trombopoietină, caracterizată prin aceea că prezintă activitate biologică de stimulare specifică sau creștere a producerii plachetelor sanguine și are succesiunea de aminoacizi prezentată în secvența nr.6, de la aminoacidul 1 la 332.
2. 2. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este un derivat cu succesiunea de aminoacizi prezentată în secvența nr.6 de la aminoacidul 1 la 163.
3. 3. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este un derivat cu succesiunea de aminoacizi prezentată în secvența nr.6 de la aminoacidul 1 la 232.
4. 4. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este un derivat cu succesiunea de aminoacizi prezentată în secvența nr.6 de la aminoacidul 1 la 151.
5. 5. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicărilor 1,2 sau 3, caracterizată prin aceea că este un derivat cu de la 1 la 6 aminoacizi deletați de la capătul amino terminal.
6. 6. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că este un derivat selectat din grupul format din: [AHis^JTPO¹¹⁷ (1-163) și [AGIy¹¹⁶]TPO(1-163).
7. 7. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că este un derivat cu secvența de aminoacizi derivată de la secvența nr.6, care are:

   (Asn²⁵, Lys²³¹, Thr³³³, Ser³³⁴,lle³³⁵, Gly³³⁶, Tyr³³⁷, Pro³³⁸, Tyr³³⁹, Asp³⁴⁰, Val³⁴¹, Pro³⁴², Asp³⁴³, Tyr³⁴⁴, Ala³⁴⁵, Gly³⁴⁶, Val³⁴⁷; His³⁴⁸, His³⁴⁹, His³⁵⁰, His³⁵¹, His³⁵², His³⁵³
8. 9. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este un derivat cu secvența de aminoacizi derivată de la secvența nr.6, care are: [Asn²⁵] TPO și [Thr³³]TPO.
9. 10. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că este un derivat cu secvența de aminoacizi derivată de la secvența nr.6, care are:

   [Ala¹, Val³, Arg¹²⁹ TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Arg¹³³]TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Arg¹⁴³] TPO (1-163); [Ala¹, Val³, Leu⁸²]TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Leu¹⁴⁶]TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Pro¹⁴⁸]TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Arg⁵⁹TPO(1-163); [Ala¹, Val³, Arg¹¹⁵]TPO(1-163).
10. 11. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că este un derivat cu secvența de aminoacizi derivată de la secvența nr.6, care are: [Arg¹²⁹]TPO(1-163); [Arg¹³³]TPO(1-163); [Arg¹⁴³]TPO(1-163); [Leu⁸²]TPO(1-163);

    [Leu¹⁴⁶]TPO(1-163); [Pro¹⁴⁸]TPO(1-163); [Arg^TPO (1-163) și [Arg¹¹⁵]TPO(1-163).
11. 12. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este legată covalent la un polimer.
12. 13. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că, polimerul este polietilenglicol.
13. 14. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, mai conține suplimentar Met'²-Lys'¹.
14. 15. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, mai conține suplimentar Met’¹.
15. 16. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, mai conține suplimentar Gly¹.
16. 17. Polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, • 10635 prezintă capacitatea de a fi imunoreactivă specific cu un anticorp.

    R0118299 Β1

    10640
17. 18. Secvență ADN care asigură expresia unei polipeptide trombopoietină având activitate biologică de stimulare specifică sau de creștere a producției plachetelor sanguine, caracterizată prin aceea că este aleasă dintre:

    a) Secvențele ADN care sunt prezentate în secvența nr.194,195 sau 196 sau catene complementare acestora;

    b) Secvențe ADN care hibridizează în condiții de stringență la secvențele ADN de la punctul a) sau fragmentele acestora;

    c) Secvențe ADN care hibridizează la secvențele ADN .definite la a) și b) fără degenerarea codului genetic.

    d) Secvențe ADN care codifică o polipeptidă definită, în oricare dintre revendicările

    1...11,14 și 15.
18. 19. Secvență ADN, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că este o secvență cADN.
19. 20. Secvență ADN, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că este o secvență ADN genomică.
20. 21. Secvență ADN, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că este o secvență ADN prelucrată.
21. 22. Secvență ADN, care codifică polipeptidă trombopoietină, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că, respectiva secvență ADN codifică suplimentar o peptidă de recunoaștere a trombinei 5' la secvențele care codifică polipeptidă TPO și codifică glutationS-transferaza(GST) 5' la peptidă de recunoaștere a trombinei.
22. 23. Secvență ADN, conform revendicării 22, caracterizată prin aceea că, respectiva secvență ADN constă, din secvența ADN care codifică polipeptidă formată din succesiunea de aminoacizi 1...174 ai secvenței nr.6.
23. 24. Procedeu pentru producerea unei polipeptide trombopoietine, caracterizat prin aceea că, cuprinde etapele:

    - introducerea unei secvențe ADN definită în oricare din revendicările 17...22 într-un vector adecvat ales dintre pKC30, pTrc99A sau alții asemenea pentru transformarea celulei E.coli; pSV2-neo, pCAGGS, pCDL-SRa296 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de mamifere; pG-1 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de drojdii; pAC373 sau alții asemenea pentru transformarea celulelor de insecte; și care poate conține o origine de replicare, markeri de selecție, un promotor, un situs de îmbinare ARN, un semnal de poliadenilare;

    - introducerea ADN-ului recombinant în celule receptoare adecvate;

    - donarea ADN-ului recombinant;

    - multiplicarea celulelor care conțin ADN-ul recombinant pentru a produce proteina TPO;

    - izolarea polipeptidei TPO.
24. 25. Procedeu pentru producerea unei polipeptide TPO, conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că, poate folosi ca origine de replicare în vectori o secvență care derivă de la SV40, adenovirus, virusul papiloma bovin, Co1 E1, factorul R, factorul F, ARS1.
25. 26. Procedeu pentru producerea unei polipeptide TPO, conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că, poate folosi ca promotori pentru expresia genei în vectori pe cei derivați de la retrovirus, virusul polioma, adenovirus, virusul poliedrozei nucleare, SV40, bacteriofagul λ (trp, Ipp, lac sau tac), ADH, PHO5, GPD, PGK, MAFa, AOXL.
26. 27. Procedeu pentru producerea unei polipeptide TPO, conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că, poate folosi ca markeri de selecție în vectori o genă de rezistență la neomicină (neo), o genă timidin kinază (TK), o genă dihidrofolat reductază (DHFR), o genă E.colixantin-guanin fosforibozil reductază (DHFR), o genă E.coli xantin-guanin fosforibozil transferază (Ecogpt), o genă de rezistență la kanamicină, o genă de rezistență la ampicilină, o genă de rezistență la tetraciclină, Leu2, Trp1, Ura3 și alte asemenea gene.

    10645

    10650

    10655

    10660

    10665

    10670

    10675

    10680

    10685

    RO 118299 Β1

    10690

    10695

    10700
27. 28. Procedeu pentru producerea unei polipeptide TPO, conform revendicării 22 și 24, caracterizat prin aceea că, Gly¹- polipeptida TPO este [Gly’]TPO(1-174).
28. 29. Procedeu pentru producerea unei polipeptide TPO, conform revendicării 24, caracterizat prin aceea că, Glypolipeptida trombopoietină constând din secvența de aminoacizi 1...174 din secvența nr.6.
29. 30. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, ea conține o cantitate eficientă de polipeptidă trombopoietină, definită în revendicările 1...16 și un purtător acceptabil farmaceutic.
30. 31. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că este utilizată în tratamentul unor disfuncții ale plachetelor sanguine.
31. 32. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că este utilizată în tratamentul trombocitopeniei.
32. 33. Compoziție farmaceutică, conform revendicării 30, caracterizată prin aceea că este utilizată în tratamentul trombocitopeniei induse prin chemoterapie, radioterapie sau transplantare de măduvă osoasă.