ES2201547T3

ES2201547T3 - Icam-4 y usos diagnosticos de las mismas.

Info

Publication number: ES2201547T3
Application number: ES98953249T
Authority: ES
Inventors: Patrick D. Kilgannon; W. Michael Gallatin
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-10-02
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-10-02
Also published as: CN1246923A; EP1338896A3; DE69813181D1; NO992666D0; DE69813181T2; CA2273195A1; EP0956508A1; IL130228A0; EP1338896A2; JP2001508181A; AU735917B2; AU1066999A; NO992666L; EP0956508B1; ATE237140T1; DK0956508T3; RU2208230C2; BR9806294A; CN1132014C

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS PARA LA CUANTIFICACION DE LA CONCENTRACION DE ICAM - 4 CIRCULANTE EN ASOCIACION CON VARIOS TRASTORNOS NEURODEGENERATIVOS.

Description

ICAM-4 y usos diagnósticos de las mismas

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere en general a moléculas de adhesión celular y más particularmente a la clonación y expresión de DNA que codifica un polipéptido desconocido en otro tiempo, designado "ICAM-4" que posee afinidad estructural con las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-R.

Antecedentes de la invención

La investigación durante la última década ha aclarado de forma notable los sucesos moleculares que acompañan las interacciones de célula con célula en el cuerpo, especialmente aquellos eventos que intervienen en el movimiento y la activación de células en el sistema inmunitario y, más recientemente, los que intervienen en el desarrollo y la función fisiológica normal de células en el sistema nervioso. Véase en general Springer Nature 346: 425-434 (1990) relativo a células del sistema inmunitario, y Yoshihara, et al, Neurisci. Res. 10:83-105 (1991) y Sonderegger y Rathjen, J. Cell Biol.. 119:1387-1394 (1992) relativo a células del sistema nervioso. Las proteínas de la superficie celular y especialmente las denominadas Moléculas de Adhesión Molecular ("CAM") han sido por lo tanto objeto de investigación y desarrollo farmacéutico, cuyo objetivo es la intervención en los procesos de extravasación de leucocitos a zonas de inflamación y movimiento de leucocitos hacia tejidos determinados, así como diferenciación neuronal y formación de circuitería neuronal compleja. El aislamiento y la caracterización de las moléculas de adhesión molecular, la clonación y expresión de secuencias de DNA que codifican dichas moléculas y el desarrollo de agentes terapéuticos y de diagnóstico relevantes para el proceso inflamatorio y el desarrollo y función del sistema nervioso han sido también objeto de numerosas solicitudes estadounidenses y extranjeras de patentes de invención (véase Edwards, Current Opinión in Therapeutic Patents, 1(11): 1617-1630 (1991) y particularmente las "referencias a la literatura de patentes" publicadas, allí citadas.

De interés fundamental para los intereses de la presente invención son la identificación y caracterización anteriores de ciertos mediadores de eventos de adhesión celular, las "leucointegrinas", LFA-1, MAC-1 y gp 150.95 (designada en la nomenclatura de la OMS: CD18/CD11a, CD18/CD11b, y CD18/CD11c, respectivamente), que constituye una sub-familia de las proteínas de superficie celular "integrina" heterodiméricas presentes en linfocitos B, linfocitos T, monocitos y granulocitos. Véase por ejemplo, Tabla 1 de Springer, supra, en la página 429. Presentan también interés otras moléculas de adhesión de cadena (CAM), que han intervenido en la activación de leucocito, adhesión, motilidad y similar, que son sucesos que acompañan el proceso inflamatorio. Por ejemplo, se cree en la actualidad que antes que la extravasación de leucocito que caracteriza los procesos inflamatorios, se produce la activación de integrinas expresada constitutivamente en leucocitos y va seguida de una interacción muy fuerte ligando / receptor entre las integrinas (por ejemplo LFA-1) y una o ambas de las dos moléculas de adhesión intercelular distintas (ICAM) designadas como ICAM-1 e ICAM-2, que se expresan en superficies celulares endoteliales de vasos sanguíneos y en otros leucocitos.

Al igual que las otras CAM caracterizadas hasta la fecha [por ejemplo molécula de adhesión vascular (VCAM-1) descrita en PCT WO 90/13300, publicado el 15 de noviembre de 1990; y la molécula de adhesión celular endotelial de plaqueta (PECAM-1) descrita en Newman et al, Science, 247:1219-1222 (1990) y PCT WO 91/10683 publicado el 25 de julio de 1991], ICAM-1 e ICAM-2 son estructuralmente homogéneas a otros miembros de la superfamilia genética de la inmunoglobulina, en que la parte extra celular de cada una comprende una serie de dominios que comparten un motivo terminal carboxi similar. Un dominio "típico", similar a la inmunoglobulina contiene una estructura en bucle generalmente anclada por un enlace disulfuro entre dos cisteínas en el extremo de cada bucle. ICAM-1 incluye 5 dominios como la inmunoglobulina; ICAM-2, que difiere de ICAM-1 en cuanto a la distribución celular, incluye dos de estos dominios; PECAM-1 incluye seis; VCAM incluye seis o siete, según las variaciones de corte y empalme, etc. Además, las CAM suelen incluir una región "transmembrana" hidrófoba que se cree participa en orientaciones de la molécula en la superficie de la célula y una región "citoplásmica" terminal carboxi. Los modelos gráficos de la disposición operativa de las CAM suelen mostrar la molécula anclada a la membrana celular en la región transmembranosa con la "cola" citoplásmica que se extiende hacia el interior del citoplasma celular y uno o más lazos inmunoglobulínicos que se extienden hacia el exterior desde la superficie celular.

Cierto número de células neuronales expresan receptores de superficie con dominios extra celulares lg-icos (lg-like), estructuralmente celulares a la ICAM. Véase por ejemplo Yoshihara, et al., supra. Además de los dominios lg-icos, muchas moléculas de adhesión del sistema nervioso contienen también secuencias fibronectinícas repetidas en tandem en el dominio extra celular. Se ha previsto una variedad de usos terapéuticos para las moléculas de adhesión intercelular, inclusive usos basados en la aptitud de ICAM-1 para fijar el rinovirus humano. La solicitud de Patente Europea 468 257 A publicada el 29 de enero de 1992, por ejemplo, se ocupa del desarrollo de configuraciones y formas multímeras de ICAM-1 (inclusive formas moleculares de longitud total y truncada) propuestas por tener una actividad de fijación de ligando / receptor mejorada, especialmente en la fijación de virus, antígenos asociados a linfocitos y patógenos como Plasmodium falciparum.

De forma similar, se ha previsto una variedad de usos para proteínas inmunológicamente relacionadas con moléculas de adhesión intercelular. El documento WO 91/16928, publicado el 14 de noviembre de 1991, por ejemplo, describe anticuerpos anti-ICAM-1, quiméricos humanizados y su utilización en el tratamiento de inflamación específica y no específica, infección viral y asma. Los anticuerpos anti-ICAM-1 y fragmentos de los mismos se consideran útiles en el tratamiento de choque endotóxico descrito en el documento WO 92/04034, publicado en marzo de 1992. En el documento WO 92/06119, publicado el 16 de abril de 1992, se describe la inhibición de las respuestas inflamatorias ICAM-1 dependientes con anticuerpos anti-idiotipicos anti-ICAM-1 y fragmentos de anticuerpo.

Pese a la comprensión fundamental de los fenómenos de adhesión celular que se ha logrado con la identificación y caracterización de proteínas de adhesión intercelular ICAM-1 e integrinas interactivas linfocitarias como LFA-1, el panorama dista de ser completo. Se cree, en general, que participan otras muchas proteínas en los procesos inflamatorios y en los movimientos linfocitarios apuntados por todo el cuerpo. Por ejemplo, la solicitud PCT WO 93/14776 (publicada el 5 de agosto de 1993) describe la clonación y la expresión de una proteína afín a ICAM, ICAM-R. Las secuencias de DNA y amino ácido de ICAM-R se indican en SEQ ID NO.4 de la misma. Este nuevo ligando se ha visto expresado en linfocitos, monocitos y granulocitos humanos.

Otra molécula superficial similar a ICAM, de particular interés para la presente solicitud, ha sido identificada y tiene una expresión específica hística diferente de cualquier molécula conocida ICAM. Mori, et al., [Proc.Natl.Acad. Sci. (USA) 84:3921-3925 (1987)] informa de la identificación de un antígeno telencefalón-específico en el cerebro de un conejo, especialmente inmunoreactivos con anticuerpo monoclonal 271A6. Este antígeno superficial recibió el nombre de telencefalina. Imamura, et at., [Neurosci.Letts. 119:118-121 (1990)], utilizando un anticuerpo policlonal para evaluar la expresión localizada, afirmó que la expresión telencefalina en el cortex visual de gatos mostraba una variación en las capas del tejido, e informó también que la expresión de telencefalina era variable en función del desarrollo. Oka, et al., [Neuroscience 35:93-103 (1990)] informó ulteriormente del aislamiento de la telencefalina utilizando anticuerpo monoclonal 271A6. La publicación indica un peso molecular para la molécula superficial de aproximadamente 500 kD y que la molécula estaba compuesta por 4 sub-unidades, cada una de las cuales tenía un peso molecular nativo de 130 kD y aproximadamente 100 kD tras el tratamiento con N-glucanasa. Yoshihiro, et al., [Neuroscience, Research Supplement 18, p.S83 (1994)] informó de las secuencias de cDNA y aminoácido para telencefalina de conejo en la 17ª Reunión Anual de la Sociedad de Neurociencia de Japón en Nagoya, Japón, 7-9 de diciembre de 1993, y la 23ª Reunión Anual de la Sociedad de Neurociencia en Washington, D.C., 9 de noviembre de 1993 [Sociedad para Resúmenes de Neurociencia 19 (1-3) p. 646 (1993)]. La secuencia de aminoácido deducida, mencionada, sugería que el telencefalón 130 kD es una proteína de membrana integral con cuatro dominios de inmunoglobulina extracelular (lg) icos. Los 8 distales de estos dominios daban homología con otros dominios ICAM lg-icos. La misma información fue comunicada por Yoshihara, et al., en Neuron 12:543-553 (1994).

La solicitud PCT WO 96/40916 (publicada el 19 de diciembre de 1996) describe polinucleótidos y polipéptidos ICAM-4 así como un método de exploración para neuropatología por medio de la detección y la cuantificación de ICAM-4 en el fluido de un cuerpo.

Sigue siendo necesario por lo tanto, en el estado de la técnica, descubrir proteínas adicionales que participan en interacciones de célula con células humanas y especialmente se necesita información que sirva para identificar específicamente y caracterizar dichas proteínas en términos de su secuencia aminoácido. Además, en la medida en que dichas moléculas pueden constituir la base para el desarrollo de agentes terapéuticos y de diagnóstico, es esencial que se aclare el DNA que los codifica. Esta información seminal contribuiría, entre otras cosas, a la producción a gran escala de las proteínas, permitiría la identificación de células que las producen de forma natural y permitiría la preparación de sustancias anticuerpos u otras proteínas de fijación novedosas que reaccionaran con las mismas y/o que inhibieran las reacciones de fijación de ligando / receptor en las que intervienen.

Breve resumen de la invención

Lo que aquí se describe son polinucleótidos aislados y purificados (por ejemplo, secuencia DNA, transcripciones RNA y oligonucleótidos antisentido de los mismos) que codifican un polipéptido nuevo "ICAM-4", así como variantes de polipéptido (que incluyen fragmentos y análogos de eliminación, sustitución y adición) de los mismos, que presentan una o más actividades biológicas de fijación de ligando / receptor y / o propiedades inmunológicas específicas de ICAM-4. Las actividades biológicas de fijación de ligando / receptor específica de ICAM-4 comprenden interacciones de los dos dominios, extracelular y citoplásmico de ICAM-4 con otras moléculas, (por ejemplo en procesos de adhesión célula-célula y / o transducción de señal). Las secuencias preferidas de DNA incluyen secuencias genómicas y cDNA así como secuencias DNA sintetizadas químicamente, total o parcialmente. En SEQ ID NO: 1 se presenta un polinucleótido preferido actualmente, que codifica ICAM-4 de la especie rata. Se contemplan réplicas biológicas (es decir copias de secuencias de DNA aisladas realizadas in vivo o in vitro) de las secuencias DNA descritas. También se describen construcciones recombinantes de replicación autónoma como vectores DNA virales y de plásmidos que incorporan secuencias ICAM-4 y especialmente vectores en los que el DNA que codifica ICAM-4 o una variante de ICAM-4 está operativamente vinculado con una secuencia DNA de control de expresión endógeno o exógeno.

Según otro aspecto, las células huésped, especialmente las células huésped unicelulares como células procarióticas y eucarióticas se transforman establemente con las secuencias DNA descritas de una forma que permite la expresión en las mismas de los polipéptidos deseados. Las células huésped que expresan dichos productos ICAM-4 y variante de ICAM-4 pueden servir para toda una serie de objetos de utilidad. En la medida en que los productos expresados se "manifiestan" sobre las superficies de células huésped, las células pueden constituir un inmunógeno valioso para el desarrollo de sustancias anticuerpo específicamente inmunoreactivas con ICAM-4 y variantes de ICAM-4. Las células huésped son notablemente útiles en métodos para la producción a gran escala de ICAM-4 y variantes de ICAM-4, donde las células se cultivan en un medio de cultivo adecuado y los productos polipéptidos deseados se aíslan de las células o del medio en el que se cultivan las células.

La ICAM-4 nueva aquí descrita se puede obtener como aislados de fuentes celulares naturales, aunque, junto con productos de variante ICAM-4 se producen de preferencia mediante procedimientos de recombinación, en los que intervienen células huésped. En SEQ ID NO: 2 se presenta una secuencia de aminoácido preferida actualmente para un polipéptido ICAM-4. Los productos se pueden obtener en formas entera o parcialmente glucosiladas, parcial o totalmente de-glucosiladas o no-glucosiladas, según la célula huésped seleccionada para la producción recombinante y/o el procesamiento posterior al aislamiento. Las variantes ICAM-4 pueden comprender fragmentos solubles o insolubles en agua, monómeros, multímeros o cíclicos de ICAM-4, que incluyen la totalidad o parte de una o más de las regiones - dominio especificadas anteriormente y tienen una propiedad biológica o inmunológica de ICAM-4, que incluye por ejemplo la aptitud para fijar un asociado de fijación de ICAM-4 y / o inhibir la fijación de ICAM-4 a un asociado natural de fijación. Las variantes ICAM-4 pueden comprender también análogos polipeptídicos, en los que se elimina o sustituye uno o más de los aminoácidos especificados: (1) sin pérdida, y de preferencia con intensificación de una o más actividades biológicas o características inmunológicas específicas de ICAM-4; o (2) con incapacidad específica de una función de fijación de un ligando / receptor particular. Se contemplan polipéptidos análogos, que incluyen residuos adicionales de aminoácido (por ejemplo lisina o cisteína) que facilita la formación multímera.

También se incluyen sustancias anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos híbridos, anticuerpos injertados CDR y similares) y otras proteínas de fijación (por ejemplo polipéptidos y péptidos), específicos (es decir no reactivos con la ICAM-1, ICAM-2, y moléculas de adhesión intercelular ICAM-R, con las que ICAM-4 está estructuralmente relacionado) de ICAM-4 o variantes de ICAM-4. También se incluyen estirpes celulares hibridomas que segregan específicamente los anticuerpos monoclonales descritos. Los hibridomas actualmente preferidos incluyen los designados como 127A, 127H, 173E, 179I y 179H. Pueden desarrollarse sustancias anticuerpos utilizando ICAM-4 o variantes de ICAM-4 aisladas, naturales o recombinantes o células que expresan dichos productos en sus superficies. Las proteínas de fijación resultan además útiles para caracterizar las estructuras del sitio de fijación (por ejemplo, epitopos y/o sensibilidad de las propiedades de fijación a las modificaciones en la secuencia del aminoácido ICAM-4).

Las proteínas de fijación resultan útiles, a su vez, en composiciones para inmunización así como para la purificación de polipéptidos y la identificación de células que muestran los polipéptidos sobre sus superficies. Resultan también manifiestamente útiles en la modulación (por ejemplo bloqueo, inhibición o estimulación) de las actividades biológicas de fijación de ligando / receptor en las que interviene ICAM-4, especialmente aquellas funciones efectores de ICAM-4, que intervienen en respuestas específicas y no específicas del sistema inmunitario. También se contemplan anticuerpos anti - idiotípicos específicos de sustancias anticuerpos anti - ICAM-4 y los usos de dichas sustancias anticuerpos anti - idiotípicas en la modulación de inmuno-respuestas. La invención describe además unos métodos de detección de neuropatología en una persona, que comprenden las etapas de: a) obtener una muestra de fluido de la persona; b) poner en contacto la muestra con un anticuerpo específicamente inmunoreactivo con ICAM-4; c) determinación cuantitativa del nivel de anticuerpo ICAM-4 fijado en la muestra; y d) comparación del nivel de ICAM-4 anticuerpo fijado en la muestra con el nivel de ICAM-4 / anticuerpo fijado en las personas (controles) que se sabe exentos de la neuropatología. Los análisis para la detección y la cuantificación de ICAM-4 en superficies celulares y en fluidos corporales, como suero o liquido cerebroespinal, pueden incluir por ejemplo una sola sustancia anticuerpo o múltiples sustancias anticuerpos en formato de análisis "sandwich". En la detección de ICAM-4 en un fluido corporal, los anticuerpos resultan también útiles para evaluar la aparición de neuropatologías que se pueden correlacionar con niveles elevados de ICAM-4 en la circulación. Estas neuropatologías incluyen, aunque no se limitan a, isquemia cerebral (por ejemplo ictus) que resulta de diversos trastornos, como por ejemplo trombosis, embolismo, hemorragia cerebral aneurismal, vasoespasmo y similares. La determinación de ICAM-4 en circulación puede distinguir también entre diversas formas de epilepsia y puede permitir también la etapa de progresión del SIDA. Otros trastornos neurodegenerativos en los cuales puede resultar útil medir la ICAM-4 en circulación para el diagnóstico, comprenden diversas formas de la enfermedad de Alzheimer y otras demencias corticales (como la enfermedad de Pick, patología del cuerpo cortical difusa de Lewy y degeneración del lóbulo frontal), demencias subcorticales (inclusive la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y supranuclear progresiva), y un número de trastornos psiquiátricos primarios (como la depresión, la esquizofrenia y la psicosis), así como demencias no genéticas consecuencia de, por ejemplo infecciones, vasculitis, trastornos metabólicos y nutricionales (por ejemplo tiroides, deficiencia de vitamina B12), trastornos vasculares (infarto múltiple, síndrome lagunar, enfermedad de Binswanger) encefalopatías tóxicas (por ejemplo exposición a monóxido de carbono, metales pesados y otros contaminantes industriales) y tumores.

El valor científico de la información aportada por las presentaciones de DNA y secuencias de aminoácidos de ICAM-4 es evidente. A modo de una serie de ejemplos, el conocimiento de la secuencia de un cDNA para ICAM-4 permite el aislamiento por hibridación DNA/DNA de secuencias de DNA genómico de codificación de ICAM-4 y especificación de las secuencias reguladoras del control de expresión de ICAM-4 como promotores, operadores y similares. Los procedimientos de hibridación DNA/DNA realizados con las secuencias DNA descritas, emiten, con toda probabilidad el aislamiento de variantes alelos de ICAM-4 que codifican DNA, u otras proteínas estructuralmente similares que comparten una o más de las propiedades inmunológicas y/o biológicas específicas de ICAM-4, y proteínas homólogas de ICAM-4 de otras especies. Los DNA resultan útiles en los análisis de hibridación DNA/RNA para detectar la capacidad de las células de sintetizar ICAM-4. Esta descripción también presenta polinucleótidos antisentido relevantes para regular la expresión de ICAM-4 mediante aquellas células que normalmente las expresan. En otra serie de ejemplos, el conocimiento de DNA y las secuencias de aminoácido de ICAM-4 hace posible la generación por medio recombinantes de variantes de ICAM-4 como proteínas de fusión híbridas (designadas a veces como "inmunoadhesiones") caracterizadas por la presencia de secuencias de proteína ICAM-4 y regiones constantes y/o regiones bisagra de cadena pesada de inmunoglobulina. Véase Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989);Ashkenazi et, al., P.N.A.S. (EE.UU.), 88: 10535-10539 (1991) y PCT WO 80/02922, publicado el 6 el abril de 1989. Las proteínas de fusión variante ICAM-4 pueden incluir también por ejemplo dominios extracelulares elegidos de ICAM-4 y partes de otras moléculas de adhesión celular.

El DNA aquí descrito también permite la identificación de secuencias de DNA no traducida que promueven específicamente la expresión de polinucleótidos operativamente vinculados a las regiones promotoras. La identificación y el uso de estas secuencias promotoras resultan particularmente deseables en casos, por ejemplo transferencia génica, que pueden requerir especialmente expresión génica heteróloga en entorno neuronal limitado. También se incluyen vectores que comprenden los promotores descritos, así como constructos génicos híbridos en los que el promotor está operativamente vinculado con una secuencia polinucleótida heteróloga y una señal de terminación de transcripción.

La información sobre secuencia de DNA y aminoácido proporcionada por la presente descripción también permite el análisis sistemático de la estructura y la función de ICAM-4 y la definición de aquellas moléculas con las cuales interactuará a niveles extracelulares e intracelulares. Los idiotipos de anticuerpos monoclonales anti-ICAM-4 son representativos de dichas moléculas y pueden ser proteínas de fijación natural mímica (péptidos y polipéptidos) mediante las cuales se modulan las actividades intercelulares e intracelulares de ICAM-4 o por medio de los cuales ICAM-4 modula eventos intercelulares e intracelulares. Pueden representar, alternativamente, nuevas clases de moduladores de actividades de ICAM-4. Los anticuerpos anti-idiotípicos, a su vez, pueden representar nuevas clases de equivalentes de ICAM-4 biológicamente activos. Los análisis in vitro para identificar anticuerpos u otros compuestos que modula actividad de ICAM-4 pueden suponer, por ejemplo, la inmovilización de ICAM-4 o un ligando natural al que se fija ICAM-4, la marcación detectable del elemento asociado de fijación no inmovilizado, la incubación de los elementos asociados de fijación y la determinación del efecto de un compuesto de prueba sobre la cantidad de marcador fijado, donde una reducción en el marcador fijado en presencia del compuesto de prueba comparado con la cantidad de marcador fijado en ausencia del compuesto de prueba indica que el agente de la prueba es un inhibidor de la fijación de ICAM-4.

La información de la secuencia de DNA aquí descrita también permite el desarrollo, por recombinación homóloga o estrategias "knockout" (véase por ejemplo, Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)], de roedores que no expresan una proteína funcional ICAM-4 o que expresan una proteína variante de ICAM-4. Estos roedores resultan útiles como modelos para estudiar las actividades de ICAM-4 y moduladores ICAM-4 in vivo.

Según la presente invención, se presenta un método para distinguir entre diversas formas de epilepsia que comprende las siguientes etapas: a) poner en contacto una muestra de fluido obtenida de una primera persona con un anticuerpo específicamente inmunoreactivo con ICAM-4; b) determinar cuantitativamente el nivel de ICAM-4/anticuerpo fijado en la muestra; y c) comparar el nivel de ICAM-4/anticuerpo fijado en la muestra con el nivel de ICAM-4/anticuerpo fijado en una segunda persona que tiene una forma conocida de epilepsia, elegida entre: crisis convulsivas de Grand Mal, Síncope, o epilepsia del lóbulo temporal (TLE).

Descripción detallada de la invención

Resultan relevantes para la descripción de la presente solicitud el diseño y la construcción de sondas de oligonucleótidos para amplificación PCR DNA relacionados con ICAM; la utilización de las sondas para la amplificación de un fragmento genómico humano homólogo aunque distinto de DNA que codifican ICAM-1 e ICAM-2; la detección de bancos de cDNA con el fragmento genómico para aislar secuencias de codificación adicionales de ICAM-R; la detección de bancos de cDNA para aislar una secuencia de cDNA humana de longitud completa que codifica ICAM-cDNA, la caracterización de la información de la secuencia de DNA y aminoácido para ICAM-R, especialmente en su relación con ICAM-1 e ICAM-2; desarrollo de células huéspedes de mamífero que expresa ICAM-R; la evaluación de indicaciones de participación de ICAM-R en sucesos de adhesión que suponen vías dependientes de CD18 e independientes de CD 18; inhibición de la adhesión celular a ICAM-R por péptidos derivados de ICAM-R; expresión de variantes de ICAM-R; preparación y caracterización de anticuerpos anti-ICAM-R y fragmentos de los mismos; mapping de epitopos de ICAM-R reconocidos por anticuerpos monoclonales anti-ICAM-R; evaluación de la distribución y caracterización bioquímica de ICAM-R y el RNA que lo codifica; evaluación de ICAM-R en adhesión célula-célula homotípica y activación/proliferación celular inmunitaria; caracterización de anticuerpos monoclonales ICAM-R; y evaluación de fosforilación diferencial y asociaciones citoesqueletales del dominio citoplásmico de ICAM-R. También se describió la identificación de un ICAM-codificador de DNA de roedor que, parece ser a la vez el homólogo en rata de ICAM-R humano, y la utilización de este DNA para construir y expresar DNAs que codifican proteínas de fusión glutatione-S-transferasa. La descripción detallada de cómo se identificó este DNA de roedor se reproduce aquí como Ejemplo 1. Como se identificó más de la secuencia de codificación ICAM del roedor, se vio claramente que el ICAM DNA del roedor no codificaba una especie de rata homóloga al ICAM-R humano, sino que de hecho codificaba un nuevo polipéptido ICAM, denominado aquí ICAM-4. Con el objeto de apreciar los sucesos que condujeron a la identificación de ICAM-4, se facilita una cronología, que va seguida de una descripción detallada de la invención.

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Se identificó una primera secuencia ICAM-4 genómica de roedor que codificaba una región homóloga al dominio 2 (aquí SEQ ID NO: 3) de ICAM-R humano (aquí SEQ ID NO: 4). También se identificó un segundo DNA genómico solapado (aquí SEQ ID NO: 5) que codificaba el dominio 2 región de SEQ ID NO: 3 y secuencias para ICAM-1.

Utilizando SEQ ID NO: 3 como sonda se identificó un cDNA del bazo de un roedor (aquí SEQ ID NO: 6) que codificaba los dominios 2 a 5 así como un quinto dominio no previamente observado como dominio ICAM. En ese momento, estos DNAs de roedor recientemente identificados parecían codificar un roedor homólogo de ICAM-R humano, aunque resultó difícil la alineación de tres regiones de estos DNAs con otros ICAMs.

El aislamiento subsiguiente de un cDNA 1 kb clon de una base de bazo de rata y la amplificación de un fragmento RT-PCR indicó que no se había secuenciado una parte del cDNA y los clones genómicos. Otro producto de amplificación RT-PCR (SEQ ID NO:7) confirmó esta omisión. Se determinó que un fragmento de 177 bp se escindió de los clones genómicos y cDNA por digestión EcoRI de los clones para aislar estas secuencias de \lambda fago para estudios de secuencia de DNA. El nuevo análisis de SEQ ID NOs: 5 y 6, a la luz de estas otras secuencias permitió identificar secuencias más precisas y completas para los clones genómicos y cDNA inicialmente aislados, presentados en forma correcta aquí como SEQ ID NOs 8 y 9.

Con el objeto de identificar una secuencia de codificación completa para ICAM- 4, se aisló un cDNA de cerebro de rata (SEQ ID NO:10), y se determinó secuencia final 5' mediante amplificación rápida 5' de extremos cDNA (5' RACE), el producto de amplificación expuesto en SEQ ID NO: 11. La combinación de la información del clon RT-PCR (SEQ ID NO: 7) el cDNA del cerebro (SEQ ID NO: 10) y el producto de amplificación RACE (SEQ ID NO: 11) permitió identificar la secuencia de codificación completa para ICAM-4 (SEQ ID NO: 1).

La presente invención se ilustra por lo tanto con los siguientes ejemplos. Más particularmente, el Ejemplo 1 se ocupa de la clonación de un ICAM-4 DNA de roedor parcial. El Ejemplo 2 describe el análisis del método de Northern de transcripción de ICAM-4 de roedor. El Ejemplo 4 describe el aislamiento de un ICAM-4 cDNA de roedor de longitud total. El Ejemplo 4 se refiere a la hibridación in situ de ICAM-4 en tejido cerebral de roedor. El Ejemplo 5 se refiere a la generación de proteínas de fusión ICAM-4 en procariotas. El Ejemplo 6 describe la producción de anticuerpos monoclonales específicos de proteínas de fusión ICAM-4/GST de rata. El Ejemplo 7 describe la expresión de proteínas ICAM-4 solubles de rata en un sistema de expresión baculovirus. El Ejemplo 8 se centra en la producción de anticuerpos monoclonales específicos de ICAM-4 de rata expresado en un sistema baculovirus. El Ejemplo 9 describe el análisis inmunocitoquímico de la expresión ICAM-4 de rata. El Ejemplo 10 se refiere a la clonación de un DNA codificador de ICAM-4-genómico humano. El Ejemplo 11 se ocupa de la clonación de un cDNA de codificación de ICAM-4 humano. El Ejemplo 12 describe el análisis de Northern de expresión ICAM-4 humana. El Ejemplo 13 describe la generación de proteínas de fusión ICAM-4/GST humanas. El Ejemplo 14 presenta la producción de anticuerpos monoclonales inmunoespecíficos para ICAM-4 humano. El Ejemplo 15 describe el desarrollo de un análisis de captura para determinar la concentración de ICAM-4 soluble en un fluido particular. El Ejemplo 16 se aplica al método de análisis de captura para evaluar la concentración de ICAM-4 en el suero de pacientes de ictus. El Ejemplo 17 se refiere a la evaluación de la transcripción ICAM-4 en un modelo de epilepsia de rata. El Ejemplo 18 describe la medida de la concentración de ICAM-4 en circulación como evaluación de varios trastornos neurodegenerativos. El Ejemplo 19 se refiere a la clonación de una región promotor para ICAM-4 humano.

Ejemplo 1 Clonación de DNA afín a (relacionado con) ICAM de rata A. Aislamiento de DNA dominio 2 relacionado con ICAM genómico de rata

Se examinó una base genómica de rata construida en \lambda EMBL3 con una sonda marcada [^{32}P] generada por PCR de codificación DNA ICAM-3 humano dominio 2. La secuencia de la sonda se expone en SEQ ID NO: 12. Se transfirieron placas de la base a membranas de nylon Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, IL). El examen de todas las bases genómica y cDNA se realizó según los protocolos standard. La pre-hibridación y las hibridaciones se realizaron en una solución de 40-50% de formamida, 5X Denhardt'2, 5X SSPE y 1,0% SDS a 42°C. Se añadieron sondas (con marcador [^{32}P]) con una concentración de 10^{5}-10^{6} cpm/ml de solución de hibridación. A las 16-18 horas de la hibridación, se lavaron bien las membranas de nylon a temperatura ambiente en 2X SSPE con 0,1% SDS y se expusieron ulteriormente a una película de rayos X a -80°C durante la noche. Las placas positivas se sometieron a una o más pasadas de hibridación para obtener fago clonal. El DNA preparado a partir de lisato de clones positivos se sub-clonó en pBS+ y se secuenció.

Se identificó un primer clon genómico que codifica un dominio 2 relacionado con ICAM de rata que se según se determinó era homólogo a regiones de dominio 2 en otros miembros de la familia ICAM, aunque era distinto de las secuencias de nucleótidos mencionadas anteriormente para ICAM-1 de rata [Kita, et al, Biochem Biophys.-Acta 1131:108-110 (1992)] o de ratón ICAM-2 [Xu, et al., J.Immunol. 149:2560-2565 (1992)]. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácido deducido para este clon se revelaron como supuestas formas variantes de ICAM-R de rata y se exponen en SEQ ID NOs: 3 y 13 siguientes, respectivamente.

También se identificó un segundo clon superpuesto con las mismas sondas y se determinó que contenía la secuencia dominio 2 ICAM de SEQ ID NO: 3 y 5' DNA que codifica por lo menos parte de ICAM-1 de rata. La secuencia de ácido nucleico para este clon se expone aquí como SEQ ID NO: 5. Este segundo clon indicó que el fragmento de gen relacionado con ICAM del primer clon y el ICAM de rata codificador de gen están situados en el mismo cromosoma de la rata dentro de 5 kb el uno respecto del otro.

B. Aislamiento de cDNA relacionado con ICAM de rata

Para identificar una secuencia de codificación de proteína más completa para el polipéptido relacionado con ICAM, se utilizó DNA marcado [^{32}P] codificador de la secuencia dominio 2 del clon genómico de rata identificado en la sección A (SEQ ID NO:3), supra, para examinar un número de bases de cDNA de diversos tipos de célula de rata y ratón, inclusive macrofago de rata (Clontech, Palo Alto, CA), linfocito de la sangre periférica (PBL) (Clontech), célula T (construida con equipo propio), y bazo (Clontech) y PBL de ratón (Clontech), célula T (construida con equipo propio) y célula B (construida con equipo propio).

Se identificó un solo clon en una base cDNA de bazo de rata (Clontech) que contenía cinco dominios lg-icos, cuatro de ellos eran homólogos a los dominios 2 a 5 tanto en ICAM-1 como ICAM-R. Además, este clon incluía 3' DNA codificador de un aparente quinto dominio lg-ico que no había sido identificado previamente en ningún otro polipéptido ICAM. Además, el clon contenía una secuencia 3' no habitual, que, según se determinó ulteriormente, era un intrón parcial (que se trata más abajo) situado entre los dominios 4 y 5, lo cual sugería que el clon era el producto de una transcripción inmadura o aberrantemente cortada y empalmada. La presencia del único dominio y la determinación de que la región 3' no se alinea adecuadamente con otros ICAMs conocidos sugerían que el DNA relacionado con el ICAM codificaba potencialmente un nuevo polipéptido ICAM de rata. La secuencia del ácido nucleico para este clon cDNA de bazo se expone en SEQ ID NO: 6.

C. Nuevo análisis de cDNA de rata y DNAs genómicos

Ulteriormente, se determinó que al clon parcial cDNA de bazo de rata (SEQ ID NO: 6 aquí) y al clon genómico de hígado de rata (SEQ ID NO: 5 aquí) les faltaba un fragmento interno 177 bp EcoRI que era parte de cada uno de estos clones aunque se perdió en una etapa de subclonación cuando se quitaron los insertos de la base (biblioteca) del vector \lambda con digestión EcoRI y se ligaron en un vector secuenciador. La observación de que a los clones cDNA y genómico les pudiera faltar un fragmento codificador se puso de manifiesto al alinear las secuencias cDNA y genómica de la rata con diversos productos de amplificación RT-PCR inclusive SEQ ID NO: 7, que reveló un hueco en la secuencia de la rata.

El aislamiento subsiguiente y la alineación de secuencia de un cDNA de una biblioteca de bazos utilizando el clon cDNA del bazo (SEQ ID NO: 6) como sonda proporcionó una primera indicación de que no se había secuenciado una parte de los clones genómicos y cDNA del bazo. Una ulterior confirmación de esta idea se puso de manifiesto al amplificar un fragmento RT-PCR, que abarcaba los dominios 3 a 5, utilizando un cebador 5' (RRD3 5' Xho que contiene un lugar de restricción 5' XhoI para facilitar la clonación) que se puede ver en SEQ ID NO: 14, y un cebador 3' (RRSD5 3' Hind, que contiene un lugar Hindi para facilitar la clonación) que se puede ver en SEQ ID NO: 15.

GAACTCGAGGCCATGCCTCCACTTTCC (SEQ ID NO: 14)

CCATAAGCTTATTCCACCGTGACAGCCAC (SEQ ID NO: 15)

La alineación de estos dos DNAs mostró claramente que los clones genómicos y cDNA había perdido un fragmento antes de la secuenciación; esta idea se vio reforzada tras la secuenciación del RT-PCR-DNA tratado más abajo. Se extrajo la conclusión de que la digestión de restricción con EcoRI para quitar los fragmentos genómicos y cDNA antes de la secuenciación tuvo como resultado la excisión de un fragmento 177 bp que no fue detectado visualmente en la separación de gel agarosa de los clones de las secuencias \lambda fago. El análisis ulterior de la secuencia confirmó la ubicación de dos sitios EcoRI que flanqueaban un fragmento 177 bp en ambos clones originales. El fragmento 177 bp EcoRI está situado entre los nucleótidos 719 y 896 en el clon cDNA parcial de rata según se puede ver en SEQ ID NO: 9 y entre nucleótidos 2812 y 2989 en el clon genómico parcial que se puede ver en SEQ ID NO: 8.

D. DNA aislado por clon RT-PCR

Se utilizó RT-PCR para generar una información más completa de la secuencia del gen relacionado con ICAM de rata. La información de la secuencia del clon genómico (SEQ ID NO: 3) se utilizó para diseñar cebadores de sentido complementarios a una región 5' de la región que codifica la proteína, tal como lo determina el clon cDNA, y unos cebadores antisentido diseñados complementariamente a las secuencias de codificación y regiones 3' a la secuencia de codificación en el clon cDNA (SEQ ID NO: 6).

Se preparó de la siguiente forma molde cDNA para reacciones PCR. Se desnaturalizaron aproximadamente 2 \mug de poli A^{+}RNA aislado de células de bazo de rata calentando a 65ºC en un volumen de 10 \mul. Tras la desnaturalización, se añadió 0,1 \mul RNasin (Invitroge, San Diego, CA), 5 \mul 5X RTampón (BRL, Bethesda, MD), 2 \mul de hexámero aleatorio (pd(N)6 a 100 \mug) (Pharmacia, Piscataway JN), 6 \mul dNTPs (2 mM cada uno) y 2 \mul AMV RTase (BRL) y se incubó la reacción a 42ºC durante 60-90 minutos. Se guardaron las reacciones a -20ºC hasta que se necesitaron.

\newpage

Se realizó una serie inicial de experimentos para identificar los pares de cebadores de oligonucleótidos que producían un producto de amplificación en reacciones PCR utilizando como molde cDNA de bazo de rata. Se emparejaron cebadores de sentido 5' en PCR con un cebador 3' diseñado para ser complementario de una secuencia de codificación interna: el cebador 3' fue designado RRD2 3-1 y se puede ver en SEQ ID NO:16.

AACGTGCGGAGCTGTCTG (SEQ ID NO:16)

(en el producto RT-PCR aislado por último, SEQ ID NO: 7, infra, el cebador RRD2 3-1 correspondía a los nucleótidos 719 a 736). De forma similar, se emparejaron varios cebadores antisentido 3' con un cebador 5' diseñado complementario de otra secuencia de codificación interna; el cebador 5' en estas reacciones fue designado RGen3900S y se puede ver en SEQ ID NO: 17.

ACGGAATTCGAAGCCATCAACGCCAGG (SEQ ID NO: 17).

(En SEQ ID NO: 7, infra, el cebador RGen3900S correspondía a los nucleótidos 1719 a 1736). Basándose en el tamaño de los productos de amplificación y la capacidad de estos productos de hibridar con el clon parcial cDNA, se determinó que un par de cebadores era el más eficiente y se utilizó en amplificaciones PCR subsiguientes. El cebador 5' fue designado RGen780S (SEQ ID NO: 18) y el cebador 3' fue designado RGen4550AS ((SEQ ID NO: 19).

CATGAATTCCGAATCTTGAGTGGGATG (SEQ ID NO: 18)

ATAGAATTCCTCGGGACACCTGTAGCC (SEQ ID NO: 19)

(En SEQ ID NO:7, infra, el cebador RGen780s correspondía a los nucleótidos 1 a 18, y el cebador RGen4550AS correspondía a los nucleótidos 2197 a 2214).

Este par de cebadores se utilizó en PCR en una variedad de condiciones para optimizar la amplificación. Se utilizaron un total de 15 tampones PCR diferentes que diferían en cuanto a concentración Mg^{++} y el pH a dos temperaturas de recocido diferentes y se separó una muestra del producto de cada reacción sobre un gel agarosa 1%. Debido a que no se pudo detectar ningún producto de amplificación por inspección visual del gel de color de bromuro de etidio de ninguna de las condiciones de reacción, se utilizó una hibridación Southern más sensible para detectar los productos PCR.

Se separaron por electrofóresis partes del DNA amplificado, se transfirieron a membrana de nylon Hybond N+ utilizando técnicas de mechas (método de Southern) convencionales y se hibridaron con el cDNA total de la rata que se marcó [^{32}P]. Las condiciones de hibridación fueron prácticamente las descritas para el procedimiento de examen de la base (biblioteca) en la sección A anterior. La auto-radiografía indicó que se había generado una pequeña cantidad de DNA, de aproximadamente 2,2 kb en dos de las reacciones, y el resto del producto de amplificación de las dos reacciones se separó sobre un gel agarosa. La región 2,2 kb se eluyó del gel aunque no se apreciaba ninguna cinta (BAND) en la inspección visual, y se utilizó como molde en otra reacción PCR utilizando los mismos cebadores (SEQ ID NOs: 18 y 19), tampón Tris-HCl pH 8.0 contenía un mM Mg^{++}, y 55ºC de temperatura de recocido. El producto de amplificación del PCR secundario se podía ver en gel y se eluyó y clonó en un plasmido pBS^{+} (Stratagene, La Jolla, CA) para análisis de secuencia.

El clon RT-PCR resultante resultó contener 2214 bp tal como se indica en SEQ ID NO: 7. El clon codificaba los dominios 2 a 6 encontrados en el clon cDNA del bazo de rata, un dominio 1 adicional amino-terminal, un dominio 7 adicional carboxi-terminal, y 164 bp de lo que parecía ser otro dominio 8 carboxi-terminal. Inmediatamente 5' a dominio 1 había una secuencia adicional 144 bp que se suponía derivada de un intrón entre el líder y el primer dominio. Este clon no contenía una secuencia líder 5' o regiones transmembrana y citoplásmicas 3'. Además del dominio 6 previamente identificado en el clon cDNA de bazo, el séptimo y octavos dominios en el clon RT-PCR apoyaban la hipótesis de que este clon era un nuevo ICAM de roedor.

Ejemplo 2 Análisis según método de Northern

Con el objeto de seguir investigando la posibilidad de que los clones relacionados con ICAM identificados en el Ejemplo 1 codificara un nuevo polipéptido de ICAM tal como se sugirió por los únicos dominio lg-Icos, se examinó la expresión específica del tejido utilizando el análisis de Northern para permitir una comparación con los modelos de expresión de ICAM humanos previamente comunicados [ICAM-1, Dustin, et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986); ICAM-2, Staunton, et al., Nature 339:6164- (1989); ICAM-R, de Fourgerolles and Springer, J.Exp. Med. 175:185-190)1992)]

Se preparó el RNA celular total de pulmón de rata, cerebro, médula espinal, hígado, tubo digestivo, timo, nodos linfáticos y bazo utilizando reactivos de aislamiento de RNA STAT60 (Tel-test "B", Inc, Friendswood, Texas) según el protocolo sugerido por el fabricante. Se purificó RNA poli A^{+} a partir de RNA total utilizando columnas oligo dT celulosa. Aproximadamente 5 \mug de RNA derivado de cada tejido se separó sobre un gel agarosa formaldehído 1%, y se transfirió a membranas de nitrocelulosa Hybond-C (Amersham).

Un fragmento del cDNA del bazo de la rata del Ejemplo 1 correspondiente a los dominios 2 a 4 (nucleótidos 1 a 724 en SEQ ID NO: 6) se subclonó en pBluescript SK^{+} (Stratagene) y se generó una ribosonda antisentido por transcripción in vitro utilizando UTP marcado ^{32}P y aproximadamente 500 ng de molde linealizado según el protocolo sugerido por el fabricante (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). El RNA ligado a la membrana fue pre-hibridado en una solución que contenía 50% de formamida, 5X SSC, IX PE (50 mM Tris-HCl, pH 7.0, 0,1% de pirofosfato sódico, 0,2% polivinilpirrolidona, 0,2% de ficoll, 5 mM EDTA, 1% SDS) y 150 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. La sonda radiomarcada se desnaturalizó hirviendo y se añadió a la solución de pre-hibridación a una concentración final de 1 x 10^{6} cpm/ml. Se permitió que la hibridación prosiguiera durante 16-18 horas a 65º C. Las membranas se lavaron entonces a 65ºC en 2X SSC que contenía 0,1% SDS y se expusieron después a una película de rayos X durante 3-16 horas.

El análisis Northern, indicó que el cDNA relacionado con ICAM identificado en el Ejemplo 1 se expresara únicamente en el cerebro de la rata, una especificidad del tejido no previamente señalada para ningún otro polipéptido ICAM. Este modelo de expresión, en combinación con los dominios únicos lg-icos cuya existencia no se conoce en otros polipéptidos ICAM indicó que el clon relacionado con ICAM era un nuevo miembro de al familia ICAM de proteínas, y recibió el nombre de ICAM-4.

El hecho de que los clones cDNA identificados inicialmente se detectaron en una biblioteca de bazo de rata sugirió que un subconjunto de células en el bazo podía expresar ICAM-4 a niveles bajos. Sin embargo no se pudo detectar un clon debidamente cortado y empalmado en numerosas bibliotecas hemopoyéticas lo cual llevó a dudar de que la proteína ICAM-4 se expresara realmente en un tejido que no fuera el cerebro. Una explicación de la detección de cDNA ICAM-4 en el bazo es que la sensibilidad de PCR puede haber amplificado una cantidad-traza de transcripción aunque estos tejidos no expresan la proteína codificada.

Ejemplo 3 Aislamiento de cDNA ICAM-4 de rata, con longitud completa A. Identificación de un clon cDNA de cerebro de rata

A la vista de la expresión específica tisular de ICAM-4, se utilizó mRNA de tejido de cerebro en un intento de aislar un cDNA codificador de ICAM-4 de longitud plena. Dos sondas, una complementaria a los dominios 1 a 2 y una segunda complementaria a los dominios 3 a 5 del clon cDNA del bazo identificado en el Ejemplo 1 (SEQ ID NO:7) se radiomarcaron y utilizaron para examinar una biblioteca cDNA de cerebro de rata en \lambdagt10 que se había construido previamente con equipo propio. Las condiciones de hibridación fueron las descritas en el Ejemplo 1, y las placas positivas se sometieron a una o más pasadas de detección para obtener fago clonal.

Se identificaron nueve clones positivos, dos de los cuales hibridados a ambas sondas. El más largo de los dos clonos, designado clono 7, contenía 2550 bp que codificaban a 4 de los 5 dominios lg-icos, encontrados en la sonda cDNA. Además, el clon 7 codificaba otros cuatro dominios lg-icos no encontrados en la sonda. Se identificaron dominios putativos transmembrana y citoplásmicos, seguidos de un codón de terminación, una señal de poli-adenilazión, y una cola de poli (A). Al clon 7 le faltaba por los menos un dominio 5' lg-ico según se determinó comparando con el clon RT-PCR (SEQ ID NO: 7), y también faltaba una secuencia líder; el nuevo examen de la biblioteca no dio como resultado ningún clon más largo que contuviera estas secuencias. La secuencia del ácido nucleico para el clon 7 se indica en SEQ ID NO: 10.

B. Determinación del extremo 5'

Para aislar el dominio 1 y otras secuencias 5', se utilizó una técnica PCR designada 5' Amplificación Rápida de Extremos cDNA (RACE) [Protocolos PCR: Una Guía para Métodos y Aplicaciones, Innis, et al., (eds) Academic Press; Nueva York (1990) página: 28-38] utilizando un kit 5' RACE (Clontech). Esta técnica utiliza un cebador interno emparejado con un segundo cebador complementario de una secuencia adaptador ligada al extremo 5' de las moléculas de la biblioteca cDNA. PCR con este par de cebadores amplificará por lo tanto y facilitará la identificación de las secuencias que intervienen. Se puede utilizar entonces la información de la secuencia superpuesta para generar una secuencia completa del gen.

Se utilizó cDNA listo para RACE de cerebro de rata (suministrado con un kit) en un PCR con el oligonucleótido de kit y un cebador antisentido basado en una secuencia interna ICAM-4 El cebador antisentido 3' designado Spot714AS, se diseñó según una secuencia ICAM-4 dominio 4 y se presenta en SEQ ID NO: 20.

CARGGTGACAAGGGCTCG (SEQ ID NO: 20)

El producto de amplificación resultante de este par de cebadores se sometió a continuación a un PCR secundario utilizando el mismo cebador de kit 5' emparejado con un cebador 3' complementario de una región en ICAM-4 dominio 1. El segundo cebador 3' fue denominado RRACE2 y se puede ver en SEQ ID NO: 21.

TATGAATTCAGTTGAGCCACAGCGAGC (SEQ ID NO: 21)

Cada cebador utilizado en el PCR secundario contenía un sitio EcoRI para facilitar la clonación de los productos de amplificación resultantes en pBS^{+} (Stratagene). El DNA plásmido resultante que contenía el extremo 5' del gen se identificó por hibridación con una sonda ICAM-4 de rata dominios 1 y 2, correspondiente a nucleótidos 1 736 en SEQ ID NO: 7. La información de secuencia parcial para el dominio y el líder hidrofóbico se determinó a partir del producto de amplificación resultante.

El producto del método 5' RACE fue un fragmento DNA, de 222 bp de longitud que contenía 60 bp aguas arriba del residuo de metionina iniciador, una secuencia líder de 82 bp, y una secuencia de 80 bp del dominio 1. El producto de amplificación es el SEQ ID NO: 11.

C. Secuencia de ICAM-4 de rata de longitud completa

Se construyó un clon compuesto de ICAM-4 de longitud completa a partir de la información de secuencia derivada del método 5' RACE (SEQ ID NO: 11), el clon RT-PCR (SEQ ID NO: 7) y el clon 7 de cDNA de rata (SEQ ID NO: 10). El gen de longitud completa para ICAM-4 de rata se determinó que contenía 2985 bp con un solo marco de lectura abierta que codificaba una proteína de aminoácido deducida 917. Una secuencia putativa Kozak se sitúa aguas arriba del residuo de metionina en la secuencia líder. Una secuencia líder hidrofóbica de aminoácido 27 va seguida de nueve dominios lg-icos, una región transmembrana y una cola y una cola citoplásmica de aminoácido 58. El cDNA compuesto ICAM-4 es el de SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácido deducido es el de SEQ ID NO: 2.

Al igual que otros polipéptidos ICAM, ICAM-4, contiene dominios extracelulares, transmembrana y citoplásmicos. En el dominio extracelular, el término amino de ICAM-4 es una secuencia líder que comprende aminoácidos 1 a 27, que va seguida de nuevo dominios de inmunoglobulina (lg)-icos, una característica única de ICAM-4 ya que ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-R contienen cinco, dos y cinco dominios extracelulares lg-ico, respectivamente. En ICAM-4, el dominio 1 comprende aminoácidos 28 a 118; el dominio 2 comprende aminoácidos 119 a 224; el dominio 3 comprende aminoácidos 225 a 321; el dominio 4 comprende aminoácidos 322 a 405; el dominio 5 comprende aminoácidos 406 a 488; el dominio 6 comprende aminoácidos 489 a 569; el dominio 7 comprende aminoácidos 570 a 662; el dominio 8 comprende aminoácidos 663 a 742; y el dominio 9 comprende aminoácidos 743 a 830. Dentro de cada dominio, se forma una estructura característica de "lazo" (lopp) por medio de un enlace disulfuro entre residuos de cisteína ubicados generalmente en extremos opuestos de la secuencia aminoácida del dominio. Otras características estructurales de ICAM-4 incluyen la región transmembrana que comprende aminoácidos 831 a 859 y la región citoplásmica que comprende aminoácidos 860 a 917.

La comparación de la homología de la secuencia de aminoácidos de cada dominio en ICAM-4 de rata con los demás miembros de la familia ICAM se limitó a las secuencias correspondientes de ICAM-1 humano, ICAM-2 e ICAM-R ya que la información de secuencia para los tres homólogos de roedor no habían sido facilitados previamente. En el primer dominio, el ICAM-4 de roedor muestra 21, 30 y 28% de identidad con ICAM-1 humano, ICAM-4 e ICAM-R, respectivamente. El segundo dominio está más conservado, siendo las identidades de porcentaje de aminoácido de 60, 42 y 62 con ICAM-1, -2 y -3, respectivamente. Los dominios 3-5 muestran identidades porcentuales de 48, 49 y 40 con ICAM-1 y 60, 59 y 29 respectivamente para ICAM-R. Una característica interesante es que los dominios ICAM-4 de rata, 6 a 8 son los más homólogos al dominio 5 (con identidades de 29-42%) posiblemente debido a un evento de duplicación de segmento de gen. El noveno y último dominio extracelular se alinea difícilmente con otros dominios ICAM aunque tiene 22% de identidad con el tercer y el sexto dominio de VCAM-1 humano, otro miembro de la familia Ig de proteína que participa en la adhesión celular. La cola citoplásmica tiene una longitud de 58 aminoácidos. Es más larga que los demás miembros de la familia ICAM, donde ICAM-1, -2 y -3 humano contienen 28, 26 y 37 aminoácidos respectivamente. Al igual que ocurre con el noveno dominio, la cola citoplásmica ICAM-4 de rata es la más homóloga a la cola citoplásmica de VCAM-1 humano que contiene solamente 19 aminoácidos. La membrana proximal a 19 aminoácidos de ICAM-4 de rata comparte 7 residuos de aminoácidos con VCAM-1 (37%).

Finalmente, la fijación funcional a LFA-1 (CD11a/CD18) correlaciona con el primer dominio en los ICAMs. Vonderheide et al., [J.Cell. Biol., 125-215-222 (1994)], identificó un motivo de secuencia supuestamente participante en fijación de integrina. Pese a la homología relativamente reducida entre ICAM-4 de rata y otros ICAMs en el dominio 1, este motivo de secuencia de fijación se conserva, lo cual sugiere que ICAM-4 de rata puede ser un ligando para LFA-1 y quizás otras integrinas.

Ejemplo 4 Hibridación in situ en tejido de cerebro

Con el fin de localizar el tejido cerebral específico que expresaba ICAM-4, se empleo la hibridación in situ con ICAM-4 dominio 1 e ICAM-4 dominios 3 a 4, ribosondas antisentido. Las sondas se marcaron por transcripción in vitro utilizando UTP marcado ^{35}S.

Se fijaron secciones de tejido congelado de cerebro normal de rata en 4% de paraformaldehido durante 20 minutos, se enjuagaron y se deshidrataron y se desnaturalizó el RNA fijado durante 2 minutos en 2X SSC, 70% formamida 70ºC antes de la hibridación. Se hibridaron secciones de tejido durante la noche a 50ºC en una solución que contenía 50% de formamida, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 mM EDTA, 10% de sulfato de dextrano, IX Denhardt, 0,5 mg/ml RNA de levadura, 100 mM DTT y una concentración de sonda de 50.000 cmp/\mul. Se lavaron cortes una vez en 4X SSC, 10 mM DTT a temperatura ambiente durante 60 minutos, una vez en 50% de formamida, 2X SSC, 10 mM DTT a 60ºC durante 40 minutos, y una vez en cada una de: 2X SSC y IX SCC durante 30 minutos cada uno, a temperatura ambiente. La especificidad de la hibridación se determinó en experimentos paralelos realizados con el mismo protocolo aunque incluyendo también un lavado más riguroso en 50% de formamida, IX SSC, 10 mM DTT a 60ºC durante 40 minutos. Después de lavar, los cortes se sumergieron en emulsión NTB2 (Kodak, Rochester, NY) y se expusieron durante 2 a 21 días antes de revelarse y contra-teñirse. Los controles negativos incluyeron sondas de sentido generadas desde ribosondas de sentido ICAM-4 dominio 1 e ICAM-4 dominio 3 a 4, además de una ribosonda de virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1).

La señal detectada en el tejido del cerebro se localizó principalmente en la materia gris y la señal más fuerte en el corte cerebral y el hipocampo. El perfil de hibridación era consistente con la expresión ICAM-4 principalmente en neuronas cerebrales.

Ejemplo 5 Generación de proteínas de fusión ICAM-4

Se generaron proteínas de fusión ICAM-4 de rata/glutatione S-transferosa (GST) utilizando el vector de expresión procariótico pGEX (Pharmacia, Alameda, CA) con el fin de generar anticuerpos monoclonales contra fragmentos de polipéptido específicos de ICAM-4.

Se utilizaron cebadores PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' del dominio 1 y a los extremos 5' y 3' del dominio 2 para amplificar los fragmentos de DNA que codifican los dominios individuales. Los fragmentos resultantes se clonaron por separado en un sitio EcoRI de pGEX-2T; el análisis de la secuencia DNA confirmó la orientación correcta y el marco de lectura. Se examinó posteriormente la capacidad de los transformante para producir proteína de fusión del peso molecular adecuado.

Proteínas de fusión de ICAM-4 dominio 1/GST e ICAM-4 dominio 2/GST permanecieron en la fracción insoluble después de lisar las bacterias por sonificación en PBS que contenía 1% SDS. La fracción de proteína insoluble de 100 ml de cultivos se hizo hervir en colorante de carga SDS y se separaron sobre un 10% de gel poliacrilamida-SDS preparativo. El gel se tiñó en 0,4 M KCI enfriado con hielo y las bandas de proteína de fusión se sometieron a excisión. Las proteínas de fusión fueron electroeluidas de los trozos de gel en tubería de diálisis en tampón que contenía 25 mM Tris-HCI y 192 mM glicina. Se determinó la concentración aproximada de proteína con OD_{280} y la pureza de la preparación en SDS-PAGE teñido con azul Coomassie.

Ejemplo 6 Producción de anticuerpos monoclonales contra proteína de fusión ICAM-4/GST de rata

Se inmunizaron ratones Balb/c por inyección subcutánea con 40-50 µg de proteína de fusión ICAM-4 dominio 21GST (descrita en el Ejemplo 5) emulsionada en adyuvante completo de Freund (FCA). Dos semanas después, los ratones se volvieron a inmunizar por inyección subcutánea con la misma proteína, emulsionada sin embargo en adyuvante incompleto de Freund. Dos inmunizaciones intraperitoneales finales dadas dos semanas después de la segunda inmunización incluían antígeno soluble sin adyuvante a intervalo de dos semanas. Se analizó con ELISA el suero procedente de cada ratón inmunizado para comprobar su aptitud para reaccionar específicamente con ICAM-4 de rata, producido por el sistema de expresión baculovirus descrito más adelante.

El bazo del ratón # 1654 se quitó, de forma estéril y se colocó en 10 ml de RPMI 1640 sin suero. Se formó una suspensión de una sola célula pulverizando el tejido de bazo entre extremos escarchados de dos cortes de cristal de microscopios sumergidos en RPMI 1640 sin suero (Gibco, Burlington, Ottawa, Canadá) añadiéndose 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina. La suspensión celular se filtró a través de un filtro celular Nitex estéril de 70 mallas (Becton, Dickinson, Parsippany, NJ) y se lavó dos veces con RPMI seguido de centrifugación a 200 x g durante 5 minutos. El comprimido resultante del lavado final se volvió a suspender en 200 ml de RPMI sin suero. Se prepararon de forma idéntica los timocitos tomados de tres ratones Balb/c no sometidos previamente a experimentación.

Antes de la fusión, se mantuvieron células mieloma NS-1 en crecimiento fase log en RPMI con 11% de suero Fetalclone (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UTA) durante tres días. Una vez recogidas, las células se centrifugaron a 200 x g durante 5 minutos y el comprimido se lavó dos veces según se describe en el párrafo anterior. Después de lavar, la suspensión celular se llevó a un volumen final de 10 ml en RPMI sin suero. Se quitó una parte 20 µl y se diluyó 1:50 con RPMI exento de suero, y se quitó una parte de 20 \mul de esta dilución, se mezcló con 20 \mul 0,4% de azul de trípano en salino 0,85% (Gibco), se cargó en un hemacitómetro (Baxter Healthcare, Deerfield, IL) y se contaron las células. Se combinaron aproximadamente 2,425 x 10^{8} células de bazo con 4,85 x 10^{7} células NS-1, se centrifugó la mezcla y se separó el sobrenadante. El comprimido resultante se desalojó vaciando el tubo y se añadió 2 ml de PEG 1500 al 50% en 75 mM Hepes, pH 8.0 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) agitando durante un minuto. Ulteriormente, se añadió durante un período de 7 minutos 14 ml más de RPMI exento de suero. La suspensión celular se centrifugó a 200 x g durante 10 minutos y se separó el sobrenadante. Se volvió a suspender el comprimido en 200 ml de RPMI que contenía 15% de FBS, 100 \muM de hipoxantina de sodio, 0,4 \muM aminopterina, 16 \muM timidina (HAT) (Gibco)m, 25 unidades/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ml. La suspensión se colocó primero en un frasco de 225 cm^{2} (Corning, Essex, Reino Unido) a 37°C durante 4 horas antes de dispensarse en 10 placas de cultivo de tejido de base plana de 96 pocillos (Corning a 200 \mul/pocillo. Las células en las placas se nutrieron los días 3, 4, 5 y 6 después de la fusión aspirando aproximadamente 100 \mul de cada célula con una aguja 20 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul/pocillo de un medio de plateado descrito anteriormente con la salvedad de que contiene 10 unidades/ml IL-6 y carece de timocitos.

Las placas de fusión se examinaron inicialmente por captura de antígeno ELISA de la forma siguiente. Se recubrieron 4 placas Immulon (Dynatech, Cambridge, MA) durante la noche a 4°C con 100 ng/pocillo de proteína de fusión domino 1-GST o dominio 2-GST en 50 mM de tampón de carbonato. Las placas se bloquearon con 100 \mul/pocillo 0,5% de gelatina de piel de pescado (Sigma, St. Louis, MO) en PBS durante 30 minutos a 37°C. Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía 0,05% Tween 20 (PBST) y se añadió 50 \mul/pocillo de hibridoma sobrenadante de cada fusión. Tras la incubación a 37°C durante 30 minutos, las placas se lavaron en la forma descrita anteriormente, y se añadió 50 \mul de una dilución 1:3500 de peroxidasa - conjugada rábano picante anti-ratón lgG (Fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania). Se volvieron a incubar las placas durante 30 minutos y se lavaron cuatro veces con PBST. Se añadió substrato, 100 \mul/pocillo, constituido por un 1 mg/ml de o-fenilen diamina (Sigma) y 0,1 \mul/ml 30% H_{2}O_{2} en 100 mM de citrato, pH 4.5. Se dejó realizar la reacción de color durante 10 minutos y se apagó con la adición de 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} al 15%. Se determinó entonces la absorbancia 490 nm sobre un vector de placa automático (Dynatech).

Los pocillos positivos para a proteína dominio 2-GST pero no para la proteína dominio 1-GST se examinaron entonces con ELISA con un baculovirus sobrenadante, (descrito a continuación). Se procedió a ELISA en la forma descrita anteriormente con la diferencia de que las placas Immulon 4 se revistieron inicialmente durante la noche con baculovirus sobrenadante diluido 1:4 en 50 mM de tampón de carbonato. Se clonaron de dos a tres veces 3 pocillos (103A, 103B y 103F), sucesivamente por dilución duplicante en RPMI, 15% FBS, 10 \muM hipoxantina sódico, 10 \muM timidina y 10 unidades/ml IL-6. Se calificaron visualmente pocillos de placas de clones a los cuatro días y se registró el número de colonias en los pocillos menos densos. Los pocillos seleccionados de cada clonación se volvieron a analizar con ELISA a los 7 - 10 días para detectar proteína dominio 1-GST y proteína dominio 2-GST o baculovirus sobrenadante.

Los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas fueron isotipados por ELISA. Las placas Immulon 4 (Dynatech) se revistieron 4°C con 50 \muI/pocillo de goat antiratón IgA, IgG, o IgM (Organon, Teknika, Durham, NC) diluido 1:5000 en 50 Mm de tampón de carbonato, pH 9.6. Los pocillos se bloquearon durante 30 minutos a 37°C con 1% BSA en PBS, se lavaron tres veces con PBST. Se añadió una dilución 1:10 de cultivo de hibridona supernadante (50 \mul) a cada placa, se incubó y se lavó en la forma indicada anteriormente. Después de quitar el último lavado, se añadieron 50 \mul de rábano picante en peroxidasa - conjugado conejo antiratón IgG_{1}, G_{2a}, G_{2b} G_{3} (Zymed, San Francisco, CA) (diluido 1:1000 en PBST con 1% de suero normal de cabra). Se incubaron las placas indicadas anteriormente, se lavaron cuatro veces con PBST y añadieron 100 µl de substrato. La reacción de color se apagó a los tres minutos añadiendo 50 \mul H_{2}SO_{4} al 15% y se determinó la absorbancia a 490 nm sobre un vector de placa (Dynatech).

Los resultados indicaron que los anticuerpos 103A, 103B y 103F eran todos ellos isotipos IgG_{1}. Estos anticuerpos se utilizaron ulteriormente en análisis inmunocitoquímicos, método de Western, y para la purificación de proteína expresada en baculovirus.

Ejemplo 7 Expresión baculovirus de ICAM-4 de rata

Se utilizó un sistema de expresión baculovirus (Invitrogen) para generar una proteína soluble correspondiente a los dominios 1 a 6 de ICAM-4. Debido a que no se conocía la secuencia líder de ICAM-4 en ese momento, el constructo de expresión se realizó conteniendo la secuencia de codificación para ICAM-4 condensada (fused) 3' a la secuencia líder ICAM-4 en marco de lectura adecuado. Los detalles específicos relativos a la construcción de la expresión plasmido e ICAM-1/ICAM-4 es la siguiente.

Se amplificó el DNA ICAM-1 de rata que codifica los 4 dominios lg-icos utilizando PCR cebadores que incorporaran diversas características para facilitar la construcción del plasmido de fusión. El cebador 5' oligonucleótido incluía sitios HindIII y Bgl/II, además de una secuencia consensus Kozak aguas arriba de la primera metionina en la secuencia líder. El cebador 3' oligonucleótido incluía una secuencia de codificación para 6 histidinas seguido de un codón de codificación y un lugar de clonación HindIII. El producto de amplificación PCR se clonó en un vector HindIII digerido pBS^{+} y el análisis de la secuencia confirmó la construcción adecuada. Se digirió un lugar interno SmaI en la secuencia líder ICAM-1 y otro sitio SmaI en la región de clonación múltiple del vector (3' a ICAM-1 lg-ico dominio 5) que quitó la mayoría de la secuencia de codificación de ICAM-1. Tras estas manipulaciones, el vector linealizado, de extremo romo contenía una parte de la región de clonación múltiple aguas arriba (aquellos lugares de restricción 5' del lugar original HindIII en la región de clonación múltiple), la secuencia Kozak y la mayoría de la secuencia líder ICAM-.

La secuencia de codificación de ICAM-4 dominios 1 a 6 de rata se amplificó con PCR utilizando cebadores diseñados para permitir la clonación de esta secuencia en el vector linealizado descrito anteriormente. El cebador 5' oligonucleótido incluía un lugar EcoRI y los codones necesarios para completar la secuencia líder ICAM-1. El cebador 3' oligonucleótido incluía codones para 6 residuos de histidina, un codón de terminación y lugares de restricción HindIII y EcoRI. El producto de amplificación de este PCR fue digerido con EcoRI para producir una secuencia de extremo romo que se ligó entonces en el vector linealizado de extremo romo Smal digerido pBS^{+}. Se quitó entonces la secuencia entera que contenía la secuencia líder ICAM-1 5' a los dominios 1 a 6 ICAM-4, del constructo con digestión BglII y HindIII y la secuencia de fusión ICAM-1/ICAM-4 purificada se clonó directamente en un vector BglII y HindIII - digerido pBluesac III (Invitrogen).

La producción de proteína por el virus recombinante se analizó con ELISA, utilizando inicialmente sueros inmunes de ratones inmunizados con proteína de fusión de rata ICAM-4 dominio 2/GST descrita en el Ejemplo 5. En un ulterior se utilizaron anticuerpos monoclonales generados a partir de estos ratones para purificar proteína ICAM-4 producida por el recombinante baculovirus en células SF9.

Ejemplo 8 Producción de anticuerpos monoclonales contra baculovirus - expresado ICAM-4 de rata

Se expresaron dominios 1-6 de ICAM-4 de rata en el sistema de expresión baculovirus descrito en el ejemplo 7. La proteína recombinante se purificó utilizando anticuerpo monoclonal 103A (como se describe en el Ejemplo 6). En resumen, se acoplaron 30 mg de monoclonal purificado 103A (en 100 mM de borato sódico, 500 mM de cloruro sódico) a 3 g de Sefarosa Bromuro Cianógeno Activado 4B (Pharmacia, Piscataway, NJ). El baculovirus sobrenadante que contenía ICAM-4 de rata recombinante (dominios 1-6) se cargó en la columna Sepharose durante la noche a 4°C. La columna se lavó en salino con tampón de fosfato libre - magnesio - calcio (CMF - PBS) y el material ligado se eluyó en 50 mM de ácido cítrico, 500 mM NaCl pH 4.0. la muestra se neutralizó con 1710 volumen Tris pH 10 y se almacenó a -20°C. La proteína purificada separada en SDS-PAGE resultó ser superior al 90% puro y migró a aproximadamente 80 kD.

Se inmunizaron ratones con la proteína purificada de rata ICAM-4 dominios 1-6 recombinante de forma similar a la descrita en el Ejemplo 6. El bazo del ratón # 1945 se utilizó para la fusión # 127. El protocolo de fusión era el descrito en el Ejemplo 6. Los pocillos de fusión se examinaron con ELISA en la proteína ICAM-4 recombinante. El análisis secundario incluyó inmunocitoquímica en las secciones del cerebro de la rata (como se describe más adelante en el Ejemplo 9). A partir de esta fusión se clonaron 4 anticuerpos adicionales específicos de ICAM-4 de rata: 127A, 127B 127F y 127H. El modelo de coloración inmunocitoquímica de cada anticuerpo sobre las secciones de cerebro de rata fue el mismo que el observado con anticuerpo monoclonal 103A (véase Ejemplo 9). Se comprobó la capacidad de los anticuerpos monoclonales para ligar las proteínas de fusión de D1/GST y D2/GST (descritas en el Ejemplo 5). El anticuerpo monoclonal 127A reconoció la proteína de fusión D1/GST y el 127H reconoció la proteína de fusión D2/GST. Estas dos especificidades de fijación distintas junto con las demás que no fijan la proteína GST sugieren que por lo menos tres epítopes diferentes han sido reconocidos por el panel de anticuerpos. Los hibridomas 127A y 127H se depositaron el 31 de mayo de 1995 y el 1 de junio de 1995, respectivamente, en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 y se les concedió los Números de Acceso HB11905 y HB11911, respectivamente.

Ejemplo 9 Inmunocitoquímica de expresión ICAM-4 de rata

Se realizó la inmunocitoquímica con anticuerpo monoclonal 103A para localizar la producción de proteína dentro del cerebro de la rata.

Se recogió un cerebro de una rata Lewis adulta hembra, normal, seccionado sagitalmente y se lavó en 1X PBS exento de RNase sobre hielo durante 30 minutos. Las secciones del cerebro se colocaron entonces en criomoldes Tissue Tek II (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) con una pequeña cantidad de compuesto O.C.T. (Miles, Inc., Elkhart, IN). Los cerebros se centraron en el criomolde, el criomolde se rellenó con compuesto OCT y luego se colocó en un contenedor con 2-metilbutano (Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) y el contenedor se colocó en nitrógeno líquido. Una vez congelados el tejido y el compuesto OCT en el criomolde, se almacenaron los moldes a -80°C hasta el seccionado.

El tejido se seccionó a 60 \mum de espesor, se adhirió a cortes revestidos de Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) y se permitió que se secara con aire con temperatura ambiente durante la noche hasta su utilización. Las secciones se fijaron en etil éter (Malinckrodt, Paris, KY) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez que se quitaron los cortes del éter, se dejó que se evaporase el reactivo. Se bloqueó cada sección de tejido con 150 \mul de suero de rata normal 50% (Sigma) y 2% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma) en 1X PBS (realizado con fosfato sódico solamente) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después del bloqueo, la solución se transfirió con cuidado desde las secciones y el anticuerpo sobrenadante purificado 103A (1,65 mg/ml) se diluyó 1:10 en la solución de bloqueo y se aplico 150 \mul a cada sección de tejido. Los cortes se coloraron en una cámara de humedad y se incubaron a 4°C durante la noche.

Al día siguiente, la solución anticuerpo se transfirió con cuidado desde la sección y los cortes se lavaron tres veces en 1X PBS durante 4 minutos en cada lavado. El PBS excedente se aspiró del corte y se aplicaron 100 \mul del anticuerpo secundario, antiratón, biotin conjugado de rata (Jackson InmunoResearch Laboratories), diluido 1:100 en una solución de suero de rata normal 10% y 2% BSA en 1X PBS, se aplicó a los tejidos. Se dejó que se produjera la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron dos veces en 1X PBS durante 4 minutos en cada lavado, y luego se aplicaron a cada sección 100 \mul de reactivo ABC de un kit Elite Rat IgG Vectastain ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) preparado según la inserción del producto. Se dejó que se realizara la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los cortes se lavaron dos veces en 1X PBS (4 minutos cada lavado) y se aplicaron a cada sección, durante aproximadamente 10 minutos, 150 \mul de Solución Substrato Peroxidasa Vector VIP (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Después de revelar el color, las secciones se enjuagaron bajo agua corriente durante 5 minutos, se tiñeron de contraste con hematoxilina Mayer (Sigma), durante 20 segundos y se enjuagaron nuevamente en agua corriente, con cuidado, durante 5 minutos. Los cortes se deshidrataron a lo largo de una serie graduada de etanoles, se hicieron pasar a través de xileno y se montaron con Accumount 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

La inmunocitoquímica de las secciones de cerebro de rata teñidas con mAb 103A indicaron que el ICAM-4 de rata está expresado en las células neuronales del hipocampo. El modelo de tinción sugirió que la proteína bien pudiera limitarse a los procesos neuronales (dendritas). Las secciones de cerebro coloreadas de forma similar con un anticuerpo irrelevante o un segundo reactivo de etapa solo no muestran el modelo de expresión claro que se ve con MAb 103A.

Ejemplo 10 Clonación de un DNA genómico humano ICAM-4

Durante la clonación de ICAM-4 de rata a partir de DNA genómico, se descubrió que ICAM-4 e ICAM-1 estaban separados a menos de 5 kb entre sí y esta información se utilizó en un intento de clonar el homólogo humano de ICAM-4.

Genome Systems Inc. (St. Louis, MO) amplificó fragmentos en una biblioteca humana P1 mediante PCR utilizando cebadores humanos ICAM-1 dominio 3, cebador de sentido diseñado complementario al ICAM-1 humano dominio 3 (H-1/D3 S) y un cebador antisentido diseñado complementario a ICAM-1 dominio 3, (H-1/D3 AS). Estos cebadores se muestran en SEQ ID NOs: 22 y 23, respectivamente.

CCGGGTCCTAGAGGTGGACACGCA (SEQ ID NO: 22)

TGCAGTGTCTCCTGGCTCTGGTTC (SEQ ID NO: 23)

Se identificaron y sometieron a un análisis ulterior dos clones, designados 1566 y 1567. Ambos clones P1 contenían aproximadamente 75-95 kb de insertos de DNA genómico. Los clones fueron digeridos con BamH1, se separaron con electrofóresis de gel de agarosa y se transfirieron a membranas de nylon. Se realizó la hibridación por métodos Southern con restricción baja (30% formamida) o restricción alta (60% formamida) a 42°C con sondas radiomarcadas de ICAM-1 humano, ICAM-3 o ICAM-4 de rata; otros constituyentes de la solución de hibridación fueron los descritos en Ejemplo 1. La serie de hibridación de baja restricción se lavó a temperatura ambiente en 2X SSPE que contenía 0,1% SDS. La hibridación de restricción elevada se lavó a 65°C en 0,2X SSPE que contenía 0,1% SDS. Las membranas lavadas se expusieron a película de rayos X durante 3,5 horas.

La hibridación diferencial indicó que el ICAM-1 humano estaba contenido en un fragmento 5.5 kb BamH1 mientras que el ICAM-3 humano estaba situado sobre un fragmento 4.0 kb y 1.5 kb BamH1. Los fragmentos de ICAM-1 humano e ICAM-R se subclonaron en pBS^{+} y su identidad se confirmó con el análisis de secuencia limitado.

Se subclonó un fragmento 7.0 kb BamH1 que se híbrido con ICAM-4 de rata bajo condiciones de restricción elevada y se siguió fragmentando con digestión de restricción Rsal. Se identificaron tres fragmentos Rsal que se hibridaron con ICAM-4 de rata y se determinaron sus secuencias. Sobre la base de la homología con ICAM-4 de rata, pareció que estos fragmentos contenían dominios 2, 3, 4 y 5 y parte del dominio 6.

Ejemplo 11 Clonación de cDNA de ICAM-4 humano

Los fragmentos de DNA genómico correspondientes a los dominios 2-5 de ICAM-4 humano (descritos en el Ejemplo 10) se utilizaron como sondas para examinar una biblioteca cDNA hipocampo humano \lambdagt10 (Clontech, Palo Alto, CA). El protocolo de examen de la biblioteca fue prácticamente como el descrito en el Ejemplo 1.

El clon de ICAM-4 humano más largo (# 18) que se encontró en dicha biblioteca, tenía únicamente 992 bp (SEQ ID NO: 24) y correspondían aproximadamente a la mitad del gen 3 kb previsto. El inserto DNA 992 bp del clon 18 (SEQ ID NO: 24) se utilizó como sonda para examinar una biblioteca cDNA hipocampo humano \lambdaZAPII (Stratagene, La Jolla, CA). Esta biblioteca produjo cierto número de clones positivos. El clon más largo, #34, era de 2775 bp (SEQ ID NO: 25). Basado en alineaciones con el ICAM-4 de la rata, de longitud plena, se predijo que a este clon le faltaba la secuencia líder y aproximadamente 30 bp en el extremo 5' del dominio 1. Faltaba la cola de poli A^{+} en el extremo 3', pero estaba presente el codón terminal de traducción.

Se utilizó un fragmento de DNA correspondiente a los primeros dominios (nucleótidos 1 a 840 en clon #34) como sonda para examinar una biblioteca cDNA \lambdagt10 derivada del cortex cerebral humano (Clontech, Palo Alto, CA). Se identificó que un clon 16-1 (SEQ ID NO: 26) tenía 1557 bp e incluía 39 bp de DNA 5' no traducido, una secuencia líder y una información de secuencia por el quinto dominio. Se utilizaron clones de solapamiento #34 (SEQ ID NO: 25) Y 16-1 SEQ ID NO: 26) para generar un compuesto de la secuencia de ICAM-4 humano de longitud plena (SEQ ID NO: 27).

El gen de longitud plena tiene una longitud de 2927 bp y codifica una proteína de aminoácido 924. La secuencia de nucleótido ICAM-4 se expone en SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácido se expone en SEQ ID NO: 28. La alineación de secuencia con el gen ICAM-4 de rata, de longitud total (SEQ ID NO: 11) reveló una identidad de secuencia DNA global de 82%, y una identidad de 85% a nivel del aminoácido. La estructura aparente del dominio extracelular similar a 9 lg de la proteína se conserva entre la rata y los humanos. La secuencia líder se extiende del aminoácido 1 al 22; el dominio 1 del aminoácido 29 a 117; el dominio 2 del aminoácido 118 al 224; el dominio 3 del aminoácido 225 a 320; el dominio 4 del aminoácido 321 a 405; el dominio 5 del aminoácido 406 a 488; el dominio 6 del aminoácido 489 a 570; el dominio 7 del aminoácido 571 a 663; el dominio 8 del aminoácido 664 a 743; el dominio 9 del aminoácido 744 a 837; la región transmembrana del aminoácido 838 a 857 y la cola citoplásmica del aminoácido 858 al 924.

La ICAM-4 humana (HuICAM-4), además de estar genéticamente encolada con ICAM-1 e ICAM-R también mostraba ciertas características estructurales comunes que permiten agruparlas con una familia de moléculas. Un dominio por alineación de dominio de HuICAM-4 con los demás miembros de la familia ICAM muestra grados variables de homología. La secuencia de aminoácido del dominio 1 de HuICAM-4 es 21, 30 y 26% idéntica al dominio 1 de ICAMs 1, 2 y 3 respectivamente. El dominio 2 de HuICAM-4 es 61, 39 y 62% idéntico a los ICAMs 1, 2 y 3 respectivamente, el dominio 3 de HuICAM-4 es 50 y 65% idéntico a ICAMs 1 y 3 respectivamente. El dominio 4 de HuICAM-4 es 54 y 64% idéntico al ICAMs 1 y 3 respectivamente. Los dominios 5-8 de HuICAM-4 son los más homólogos a los quintos dominios de ICAM-1 y 2, con identidades porcentuales que oscilan entre 33-47 para ICAM-1 dominio 5 y 21-31 de ICAM-R dominio 5. El noveno dominio de HuICAM-4 se alinea difícilmente con los demás miembros de la familia ICAM aunque es homólogo a los dominios 3 (24% idéntico) y 6 (23% idéntico) de HuICAM-1.

Ejemplo 12 Análisis Northern de la expresión de ICAM-4 humano

Compraron a Clontech (Palo Alto, CA) dos transferencias Northern (MTN) de tejido múltiple humano. Estas contenían por lo menos 2 \mug de RNA de poli A^{+} de 16 tejidos humanos diferentes (según se muestra en la tabla 1) sobre un formaldehído 1,2% agarosa gel desnaturalizante y se transfirió a una membrana de nylon. Las transferencias (blots) se pre-hibridaron durante 3 horas a 42°C en 10 ml de una solución que contenía 5X SSPE, solución 10X Denhardts, 50% formamida, 2% SDS y 100 \mug/ml DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Las transferencias (blots) se hibridaron en la solución anterior con una sonda ICAM-4 humana radiomarcada (clon # 18, SEQ ID NO: 24) durante 16 horas a 42°C. Al día siguiente, las transferencias se lavaron en una solución de 0,1X SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente seguido de un lavado a 50°C. Los blots se expusieron a una película de rayos X a -80% durante 24 horas. Los resultados del análisis se muestran más adelante en la tabla 1.

Unicamente en la zona que contenía RNA del cerebro híbrido a la sonda ICAM-4, dando una sola banda a aproximadamente 3 kb. Una exposición más larga (5 días) confirmó que únicamente el cerebro tenía una nivel detectable de mensaje. Con el objeto de determinar si todas zonas contenían cantidades comparables de RNA de calidad comparable, se híbrido el mismo blot con una sonda (3-actin de control. Los blots fueron separados de la sonda ICAM-4 tratándolos con una solución hirviendo de 0,1/ SDS durante 15 minutos, y posteriormente se sondaron de forma similar con una sonda \beta-actin facilitada por el fabricante. Salvo alguna variación sin importancia en las cantidades, se vio que todas las zonas tenían RNA de buena calidad.

TABLA 1 Análisis de tejido Northern de expresión de ICAM-4 humano

	SONDA
Tejido	ICAM-4	\beta-Actin
Corazón	-	+++
Cerebro	+	++
Placenta	-	+++
Pulmón	-	+++
Hígado	-	+++

TABLA 1 (continuación)

	SONDA
Tejido	ICAM-4	\beta-Actin
Musculatura esquelética	-	++++
Riñón	-	+++
Páncreas	-	++
Bazo	-	+++
Timo	-	+++
Próstata	-	+++
Testículo	-	+++
Ovario	-	+++
Intestino delgado	-	+++
Colon	-	+++
Leucocito de sangre periférica	-	+++

Se compraron dos métodos adicionales Northern de Clontech que contenían RNA de poli A^{+} de 16 subregiones diferentes de cerebro humano (como se muestra en la Tabla 2). Los métodos se sondaron de forma similar a la utilizada párale análisis de tejido y los resultados se muestran en la Tabla 2. Se comprobó la cantidad y calidad de RNA cargado sondando los blots con una sonda \beta-actin.

Todas las regiones que mostraron expresión de ICAM-4 forman parte del telencéfalo, con excepción del tálamo que se considera parte del diencéfalo. El hipocampo y el cortex cerebral parecían tener el nivel de expresión más alto. El tamaño de transcripción en todos los casos era el mismo, 3 kb. La distribución de tejido exquisita de la expresión de ICAM-4 sugiere que la región promotora puede contener elementos que confieren la expresión espacial y de desarrollo observada, del producto génico. La utilidad de dicha información puede arrojar luz para comprender el control de la expresión génica neural en general.

TABLA 2 Análisis Northern tipo célula de cerebro de expresión de ICAM-4 humano

	SONDA
Región del cerebro	ICAM-4	\beta-Actin
Amígdala	++	+++
Núcleo caudado	++	+++
Cuerpo calloso	+	+++
Hipocampo	++	+++
Hipotálamo	-	+++
Sustancia negra	-	+++
Núcleo subtalámico	+	+++
Tálamo	+	+++
Cerebelo	-	+++
Corteza cerebral	+++	+++
Médula	-	+++
Médula espinal	-	+++
Polo occipital	++	+++
Lóbulo frontal	++	+++
Lóbulo temporal	++	+++
Putamen	++	+++

Ejemplo 13 Generación de proteínas de fusión ICAM-4 humano/lgG

Se construyeron plásmidos de expresión de proteína de expresión ICAM-4 humano /IgG1 para generar anticuerpos monoclonales y para utilizar en análisis de adhesión para identificar potenciales ligandos ICAM-4. Se realizaron dos constructos; el primero incluía DNA codificador de dominios 1-3 de HuICAM-4 y el segundo los dominios 4-8. Ambos estaban vinculados con la región Fc de IgG1 humano en vector humano pDCS1 que utiliza el promotor citomegalovirus (CMV) para activar expresión y la secuencia de señal de IgG4 para facilitar la secreción de las moléculas.

Se diseñaron cebadores PCR (mostrados más adelante en SEQ ID NOs: 29-32) para generar los fragmentos DNA necesarios para la subclonación. El cebador "sentido" para el final 5' del dominio 1 (HI4-D1(s), SEQ ID NO: 29), se diseñó para completar 30 pares base de dominio 1 que faltaban en el clon #34. Se utilizaron los cebadores H14-D1(S) SEQ ID NO: 29) y HI4-D3(AS) (SEQ ID NO: 30) para generar un fragmento DNA codificador dominios 1-3 de ICAM-4 humano, correspondiente a una región en SEQ ID NO: 1 de nucleótido 130 a nucleótido 996. Se utilizaron los cebadores HI4-D3(S) (SEQ ID NO: 31) y HI4-D8(AS) (SEQ ID NO: 32) para generar un fragmento de DNA codificador dominios 4-8 de ICAM-4 humano, correspondiente a una región en SEQ ID NO: 30 desde nucleótido 997 hasta nucleótido 2268. Cada cebador 5' codificaba un lugar restricción BamH1 (GGATCC, indicado en mayúsculas más abajo) para facilitar la subclonación 5' al gen IgG1. Todos los oligonucleótidos contienen nucleótidos espaciadores (subrayado más abajo) en el extremo 5' para permitir digestión de restricción.

HI4-D1(S)

\hskip3cm

(SEQ ID NO: 29)

GTACTTACAGGATCCGCGGTCTCGCAG-

GAGCCCTTCTGGGCGCGGACCTACAGCCTGCGTGGCGTTC

HI4-D3(S)

\hskip3cm

(SEQ ID NO: 30)

ATTTCTCTCGAGGATGGTCACGTTCTCCCGG

HI4-D4(S)

\hskip3cm

(SEQ ID NO: 31)

ATTTCTGGATCCTACAGCTTCCCGGCACCACTC

HI4-D4(S)

\hskip3cm

(SEQ ID NO: 32)

ATTTCTCTCGAGTTCCACGCCCACAGTGACGG

Las reacciones PCR se realizaron en un volumen de 50 \mul utilizando tampones suministrados por Perkin Elmer con la enzima AmpliTaq. Se añadieron cebadores con una concentración final de 10 \mug/ml y los 4 dNTPs se incluyeron a 2 mM. Las reacciones continuaron a través de 30 ciclos de desnaturalización (94°C durante cuatro minutos), recocido (50°C durante dos minutos) y extensión (72°C durante un minuto). Los productos PCR se visualizaron sobre geles agarosa y una parte de cada reacción se utilizó para subclonar los productos PCR en el vector pCRII (Invitrogen, San Diego, CA). Se realizó análisis de secuencia para detectar posibles errores resultantes del proceso de amplificación y confirmar la orientación adecuada. Se digirieron clones adecuados con BamHI y XhoI y fragmentos separados con electrofóresis gel agarosa. Los fragmentos purificados se ligaron en un vector pDCS1 previamente digerido con BamHI y XhoI y los plasmidos resultantes se secuenciaron para confirmar la orientación adecuada y el marco de lectura.

Se obtuvieron proteínas de fusión ICAM-4 humano dominios 1-3 y 4-8/IgG1 tras la transfección transitoria de los plasmidos de expresión en células COS7 y el aislamiento de la proteína secretada del medio de cultivo. La transfección se realizó del siguiente modo. Se lavaron con CMF-PBS células adherentes COS7 a aproximadamente 50-60% de confluencia y ulteriormente se pusieron en contacto con 10-15 \mug de plasmido DNA en 7,5 ml de medio DMEM exento de suero (Gibco, Gaithersburg, MD) que contenía 6 \mul de 0,25 M cloroquina (Sigma, St. Louis, MO). Se añadió 7,5 ml más de medio exento de suero que contenía 150 \mul de DEAE dextrano (50 mg/ml) (Sigma, St. Louis, MO) y las placas se incubaron durante 2-3 horas antes de quitar el medio y sustituirlo por 10% DMSO (Mallinckrodt, McGaw, Illinois) en PBS. Tras un minuto de incubación, se quitó la solución DMSO y se sustituyó por medio fresco que contenía 5% FBS. Cada transfección incluía múltiples placas, y se agruparon medios de células que expresan la misma proteína para el aislamiento de la proteína.

Los medios se recogieron cada tres días a lo largo de 3-4 cosechas. Las proteínas se purificaron utilizando una columna Procep A, 0,4 - 0,4 ml (Bioprocessing Ltd, Inglaterra) se pre-equilibraron con 35 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5. El medio de cultivo se cargó sobre la columna dos veces a un caudal de menos de 60 volúmenes de columna por hora. La columna se lavó una vez con cada uno de los 20 volúmenes de columna de tampón Tris/NaCl, 20 volúmenes de columna de 0,55 M dietanolamina, pH 8.5, y 20 volúmenes de columna de 50 mM de ácido cítrico, pH 5.0. Las proteínas de fusión se eluyeron en fracciones de 1 ml utilizando 50 mM de ácido cítrico pH 3.0 y cada fracción se neutralizó con 1/10 volúmenes 1 M Tris, pH 9.5. La concentración de proteínas se determinó por OD_{280} y la pureza se determinó utilizando SDA-PAGE.

Se observó una notable contaminación de IgG bovino (presente en el FBS). Aunque se predijo que la proteína de fusión dominios 1-3 sería más pequeña que la proteína de fusión de los dominios 4-8, ambos migraron a aproximadamente 90 kD. Una explicación de la observación es que la proteína de fusión de los dominios más pequeños 1-3 estar más fuertemente glucosidada que la proteína de fusión mayor de los dominios 4-8.

\newpage

Además de utilizar las proteínas purificadas para la producción de anticuerpo monoclonal, descrita a continuación, las proteínas se utilizarán también en análisis de adhesión para identificar ligandos ICAM-4

Ejemplo 14 Producción de anticuerpo monoclonal

La proteína purificada descrita en el Ejemplo 13 se utilizó para generar anticuerpos monoclonales que utilizaban un protocolo de inmunización como el descrito en el Ejemplo 6.

El bazo de ratón #2250 (inmunizado con HuICAM-4 D1-3/IgG1) se utilizó para fusión 172 y el bazo de ratón #2272 (inmunizado con HuICAM-4 D4-8/IgG1) se utilizó para fusión 173. El protocolo de fusión utilizado era como el descrito en el Ejemplo 6. Las placas de fusión se examinaron con ELISA (prácticamente como la descripción del Ejemplo 6) utilizando cada proteína de fusión HuICAM-4/IgG1. Los sobrenadantes de pocillo de fusión que reconocieron la proteína inmunógena y no otra, fueron considerados para la clonación. Se utilizó como examen secundario la inmunocitoquímica en secciones de hipocampo humano.

Un clon primario de cada fusión era positivo en inmunocitoquímica y se clonó. Uno de los dos clones dejó de crecer al clonarse, dejando únicamente que siguiera un candidato, el clon 173E que se derivó del ratón inmunizado HuICAM-4 D4-8/IgG1. El hibridona 173E se depositó el 1 de junio de 1995 en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se le asignó el Número de Acceso HB11912.

De otra fusión derivada de un ratón inmunizado con un fragmento soluble ICAM-4 correspondiente a los dominios 1-3, se encontró que seis clones (179A, 179B, 179D, 179H, 1791 y 179K) eran específicos de HuICAM-4 dominios 1 a 3 (D1-3). Los seis anticuerpos en la serie 179 enlazaron con los procesos dendríticos en el gyrus dentado, así como las capas celulares polimórficas y piramidales. El anticuerpo monoclonal 179A coloreó los cuerpos celulares neuronales de estas áreas además del los procesos dendríticos. Las líneas celulares hibridoma que producen anticuerpos 179I y 179H se depositaron el 10 de junio de 1996 en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y se les asignó los Números de Acceso HB 12123 y HB 12124, respectivamente.

Se realizan fusiones adicionales similares para generar otros anticuerpos específicamente inmunoreactivos con regiones particulares ICAM-4.

Ejemplo 15 Revelado del análisis de captura

Se sometieron a prueba los seis anticuerpos monoclonales de la fusión 179 en diversas combinaciones para comprobar su capacidad para capturar y detectar ICAM-4 soluble en solución. El análisis, descrito a continuación, se estableció con el fin de evaluar los niveles de ICAM-4 solubles en fluidos humanos en relación con las condiciones normales y patológicas.

El anticuerpo 1791 se revistió sobre 96 placas de pocillos Immulon 4 (Dynatech) a 3 \mug/ml, 125 \mug/pocillo durante dos horas a 37°C. Se quitó la solución de anticuerpo por aspiración y se bloquearon los pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente con 300 \mul de solución de bloqueo que contenía 5% de gelatina Teleostean en PBS, exento de calcio, exento de magnesio (CMF-PBS). La solución de bloqueo se quitó por aspiración, se añadió a cada pocillo 100 \mul de un fluido de muestra diluido en Diluyente Omni (CMF-PBS), 1% gelatina y 0,05% Tween 20), y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos. Las placas se lavaron tres veces con PBST (CMF-PBS, 0,05% Tween 20). El anticuerpo 179H se biotiniló a 1,5 mg/ml utilizando NHS-LC-Biotin (Pierce) según el protocolo sugerido por el fabricante, se diluyó 1:2000 y se añadió a los pocillos (100 \mul/pocillo). La mezcla resultante se incubó durante 30 minutos a 37°C y las placas se lavaron tres veces con PBST. Se añadió Streptavidin-HRP (Pierce) (100 \mul 0,25 \mug/ml) a cada pocillo y esta mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST antes de añadir 100 µl de tetrametilbenzidina ( Sigma) (10 mg/ml concentrado (Sotck) en DMSO) diluida en 1:100 en substrato tampón ( 13,6 g/L trihidrato acetato sódico, pH 5.5 con 1 M de ácido cítrico, añadiendo 150 \mul/L peróxido de hidrógeno 30% justo antes del revelado). Se dejó revelar la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad tras lo cual se detuvo la reacción añadiendo 50 \mul/pocillo H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en 450 nm.

Los resultados indicaron que análisis podía detectar proteína recombinante soluble HuICAM-4 D1-3 a una concentración tan baja como 5-10 ng/ml con la parte lineal de la curva en el sector 10 - 100 ng/ml. No se observó ninguna interreactividad con HuICAM-4 D4-8 cuando se probó esta región de la proteína a 1 y 10 \mug/ml.

Ejemplo 16 Evaluación de ICAM-4 soluble en suero procedente de pacientes de ictus

Con el objeto de evaluar el papel de ICAM-4 en enfermedades y estados neurológicos, se analizó en la forma descrita anteriormente para comprobar las diferencias en concentración de suero de ICAM-4 soluble, suero procedente de 28 pacientes que padecían ictus agudo y 20 jóvenes voluntarios sanos (no emparejados por edad).

Los resultados indicaron que el suero procedente de los voluntarios sanos no tenía nivel detectable de ICAM-4. Sin embargo 20 de los 28 pacientes de ictus agudo tenían niveles detectables de ICAM-4 soluble. La señal de los pacientes de ictus positivos correspondió a una gama de 5-38 ng/ml del standard (proteína recombinante ICAM-4 D1-3 soluble).

Ejemplo 17 Niveles de ICAM-4 mRNA en hipocampo en un modelo epilepsia de rata

Los niveles de ICAM-4 mRNA de rata expresados se evaluaron en el hipocampo de ratas tratadas de forma que se creara un modelo animal de epiloptegénesis de activación propagada [Lothman, et al., Brain Res. 360: 83-91 (1985)]. En el modelo, el hipocampo de rata se estimula con una serie de descargas eléctricas sub-convulsivas por medio de un electrodo implantado en la región del cerebro que producen gradualmente crisis convulsivas graves de conducta. El proceso de activación propagada supone doce estímulos diarios administrados un día si u otro no durante ocho días. Una vez activada plenamente la propagación, un solo estímulo puede producir crisis convulsivas de conducta y cambios histológicos similares a la epilepsia humana. Las ratas plenamente activadas recibieron dos estímulos al día durante un período de dos semanas y los animales se sacrificaron 24 horas después del último estímulo. Se quitó el hipocampo y se disecó para la preparación RNA.

Se preparó RNA total de cada muestra utilizando el procedimiento de extracción de guanidinio/fenol/cloroformo [Chomezynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)]. Se separó RNA sobre geles formaldehído agarosa desnaturalizantes, se transfirió a membranas de nylon y se híbrido con sondas DNA específicas de rata, radiomarcadas, ICAM-4 y gliceraldehido -3-fosfato-dehidrogenasa (GAPDH). GAPDH es un gen expresado basalmente que se suele utilizar como control para detectar variación de una zona a otra en la cantidad de RNA cargado en un gel. Las fluctuaciones en la proporción de ICAM-4/GAPDH se interpretan como cambios en el nivel de la expresión ICAM-4. Se cuantificaron bandas hibridantes para ICAM-4 y GAPDH con fósforo-diagnóstico por la imagen y se determinó una proporción de ICAM-4/GAPDH.

La proporción de ICAM-4/GAPDH era notablemente superior en los animales de control no sometidos a activación propagada (n=5) comparado con el grupo de prueba con activación propagada (n=5), lo cual sugería que se había producido una regulación por reducción de ICAM-4 como consecuencia del proceso de activación propagada. Hay que señal sin embargo que el grupo de control no se sometió a ningún tratamiento simulacro por lo que existe la posibilidad de que los niveles de mRNA de ICAM-4 estuvieran modulados en respuesta al tratamiento quirúrgico asociado con la activación propagada.

Ejemplo 18 Concentración de suero ICAM-4 como marcador de trastornos neurodegenerativos

Se evaluaron las concentraciones de suero de ICAM-4 en circulación como posible indicador de diversos trastornos de neurodegenerativos. Se analizaron muestras de suero y/o de plasma de donantes anónimos según se describe en el Ejemplo 16 y se compararon con muestras extraídas de donantes de control con ningún historial previo de trastornos neurológicos.

Donantes de control

Con el objeto de establecer una media de referencia para el ICAM-4 circulante en personas normales sanas, se examinaron muestras de suero de 100 donantes. Los resultados mostraron que doce personas (12%) tenían niveles de circulación de ICAM-4 superiores a 10 ng/ml. De estos doce, la concentración de ICAM-4 en cuatro muestras dieron como media 10-20 ng/ml, tres muestras mostraron una concentración media de ICAM-4 de 20-100 ng/ml, dos muestras mostraron niveles de ICAM-4 entre 100 y 500 ng/ml y dos muestras contenían ICAM-4 con una concentración superior a 500 ng/ml.

Se tomaron muestras al mismo tiempo de dos donantes con niveles muy elevados en momentos diferentes durante un período de ocho meses para evaluar la estabilidad de las observaciones con el tiempo. Se observó que a lo largo de los meses, las lecturas fluctuaban. No se disponía de información médica sobre estos donantes por lo que no era posible realizar correlaciones con los niveles ICAM-4 y el bienestar físico de los donantes. Cuando se prepararon las muestras de suero y plasma de la misma persona, no se observó ninguna diferencia en el nivel de ICAM-4 presente.

Esta observación indicaba que un análisis de ICAM-4 soluble sería polivalente en su utilización de suero o de plasma. Además, los resultados indicaron que ICAM-4 es muy estable en la sangre, lo cual sugiere que un elevado nivel de ICAM-4 como resultado de algún estado patológico probablemente no sería transitorio. Finalmente, debido a la aparente estabilidad de ICAM-4 en un entorno de sangre, los análisis de ICAM-4 soluble pueden utilizar muestras de banco de sangre y reducir por lo tanto la necesidad de sangre fresca en cada análisis.

Con el objeto de determinar si los métodos de recogida y/o almacenamiento afectaban las observaciones, se evaluó la estabilidad de ICAM-4 tratando muestras de una persona con el máximo nivel de ICAM-4 circulante en una variedad de formas seguido de las medidas de los niveles de ICAM-4. Ni la incubación a 37°C durante 24 horas ni los uno a tres ciclos de congelación/descongelación alteraron el nivel de ICAM-4 detectable en el suero.

Donantes con epilepsia

La concentración en suero de ICAM-4 en muestras de 20 pacientes con Epilepsia del Lóbulo Temporal (TLE) se midió y comparó con muestras de sueros procedentes de pacientes del grupo de control que habían tenido crisis convulsivas de Grand Mal (38 pacientes diferentes), síncope (8 pacientes) o eran donantes sanos, normales (20 personas). El método de análisis descrito en el Ejemplo 15 se empleó nuevamente y los resultados se expresaron como ng/ml respecto del standard interno utilizado para el análisis, proteína recombinante HuICAM-4 D1-3 soluble (descrita en el Ejemplo 13).

El suero procedente de los 20 pacientes con TLE tenían niveles medibles de ICAM-4 con una media de aproximadamente 140 ng/ml. En las muestras de suero procedentes de los tres grupos de control, inclusive el grupo con Crisis Convulsiva de Grand Mal, la concentración de ICAM-4 era por término medio inferior a 10 ng/ml. Estas observaciones sugieren que un nivel de suero de ICAM-4 en la persona puede representar un marcador bioquímico que distingue entre crisis convulsivas primordiales como las experimentadas en TLE, y Crisis Convulsivas de Grand Mal, más generalizadas.

Donantes con SIDA

También se examinó la concentración de suero de ICAM-4 en los sueros de un número limitado de pacientes de SIDA. Los pacientes se agruparon según recuentos CD4 y la presencia de algún signo de demencia. Se realizó una prueba en un primer grupo que comprendía 60 pacientes asintomáticos, en etapa inicial, con recuentos CD4 superiores a 500. Un segundo grupo comprendía 7 pacientes, en estado avanzado, con recuentos CD4 inferiores a 300, no se determinaron síntomas de demencia para este grupo. El último grupo comprendía nueve pacientes de SIDA, etapa terminal, que mostraban todos ellos signos de demencia.

Los resultados mostraron que las muestras de suero de 4 de los 16 pacientes asintomáticos, iniciales (25%) tenían niveles detectables de ICAM-4 soluble; tres de las cuatro muestras tenían una concentración de ICAM-4 superior a 500 ng/ml. Cuatro de las siete (57%) muestras de pacientes en estado avanzado también fueron positivas en lo que respecta a ICAM-4, y dos de las cuatro tenían concentraciones de ICAM-4 superiores a 500 ng/ml. Las muestras de los pacientes de fase avanzada que mostraban síntomas de demencia no tenían niveles detectables de ICAM-4. Los resultados de este estudios preliminar sugieren que ICAM-4 puede ser un marcador temprano de la neurodegeneración asociada con la demencia del SIDA.

Donantes con otras enfermedades neurodegenerativas

Los resultados del estudio del suero de donantes con epilepsia y SIDA sugieren que los niveles de ICAM-4 en la sangre pueden reflejar daños en las neuronas que normalmente lo expresan. Existe cierto número de otras enfermedades neurológicas que pudieron mostrar también, como parte de su etiología, daños en las neuronas de expresión específicas de ICAM-4, cuyo resultado pueden ser cambios en la concentración de suero de ICAM-4 en la periferia.

Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer está asociada a un daño neuronal amplio en las regiones del telencéfalo en el que se expresa ICAM-4. La evaluación de los niveles de ICAM-4 en el suero de pacientes con las formas familiares de inicio precoz de la enfermedad, así como pacientes con la forma esporádica de la enfermedad, pueden proporcionar un marcador para las diversas etapas de la enfermedad permitiendo la evaluación de posibles intervenciones terapéuticas.

Como ejemplo adicional, debido a que otras demencias corticales como la enfermedad de Pick, la patología del cuerpo cortical difuso de Lewy y la degeneración del lóbulo frontal se confunden algunas veces con la enfermedad de Alzheimer, aunque se pueden distinguir la una de la otra así como la enfermedad de Alzheimer mediante análisis de ICAM-4 en el suero. Un ejemplo adicional junto a la concentración de ICAM-4 en el suero de pacientes que padecen demencia subcortical, inclusive enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y supranuclear progresiva, puede ser elevada como resultado de indicaciones patológicas comunes de esta clase de trastorno.

Como ejemplo adicional, se puede decir que cierto número de trastornos psiquiátricos primarios, como la depresión, la esquizofrenia y la psicosis, se caracterizan en parte por grados de neurodegeneración que pueden ir asociados con niveles detectables de ICAM-4 en la sangre.

Otro ejemplo más: los niveles elevados de ICAM-4 se pueden asociar con cierto número de demencias no genéticas derivadas de infecciones, vasculitis, trastornos nutricionales y metabólicos (por ejemplo tiroides, deficiencia de vitamina B12), trastornos vasculares (infarto múltiple, estado lagunal, enfermedad de Binswanger) encefalopatías tóxicas (por ejemplo exposición al monóxido de carbono, metales pesados u otros contaminantes industriales) y tumores.

Ejemplo 19 Clonación y análisis de DNA regulador aguas arriba de ICAM-4 humano

La expresión génica de ICAM-4 se regula espacial y temporalmente, limitándose la expresión a la región más anterior o ventral del cerebro, el telencéfalo. En un intento de identificar las secuencias de generes responsables de la regulación transcripcional restringida de ICAM-4, se examinó las secuencias de codificación de ICAM-4 nucleótido región 5' a humano.

Se secuenció un fragmento 2607 base par BamHI/PstI derivado de un fragmento genómico BamHI de 7,0 kb (descrito en el Ejemplo 10) y se vio que contenía 1684 nucleótidos aguas arriba del codón de inicio ATG. La secuencia completa de esta región aguas arriba se expone en SEQ ID NO: 33. Con respecto a la posición de la región de codificación de ICAM-4, el "A" en el codón de inicio ATG (numerado en SEQ ID NO: 33 como nucleótidos 1685- 1687) se designa como nucleótido + 1 y el nucleótido inmediatamente 5' al nucleótido A^{+1} se designa -1. Por consiguiente se ve que toda la secuencia se extiende desde el nucleótido -1684 al nucleótido +3, correspondiente a la numeración en la Relación de Secuencia nucleótido 1 a nucleótido 1687.

Con base en la secuencia genómica HuICAM-4, se sintetizaron oligonucleótidos y se utilizaron en PCR para generar moléculas DNA de diversas longitudes dentro de la región reguladora aguas arriba. Cada oligonucleótido mostrado en la Tabla 3 contenía una región espaciadora (mostrada en cursiva) aproximadamente 6-10 bp para permitir la digestión enzimática del producto PCR y un lugar de restricción NheI o HindIII (mostrado en mayúsculas) y una secuencia de cebador de hibridación específico (subrayado). Los nombres de los nucleótidos contienen números que designan su posición dentro de la región reguladora aguas arriba. En las amplificaciones PCR, los oligonucleótidos se emparejaron según se muestra en la Tabla 4 para generar fragmentos DNA que contenía regiones específicas de la región reguladora aguas arriba.

Los lugares de restricción y región espaciadora generados dentro de cada oligonucleótido permitieron la digestión enzimática y la posterior clonación direccional de productos individuales PCR en el vector básico pGL3 (Promega, Madison, WI) que contiene un gen indicador luciferasa inmediatamente aguas arriba del lugar de clonación múltiple (MCS). La actividad de promotor clonada en la región MCS del vector activa la expresión del gen indicador de luciferasa en las líneas celulares transfectadas y la producción de luz de la luciferasa expresada puede medirse como indicador de la actividad de promotor. El Vector Básico pGL3 no tiene ningún promotor y por consiguiente sirvió de control negativo, mientras que un vector pGL3 que contenía un promotor SV 40 sirvió de control positivo. La secuencia de cada constructo de expresión se verificó por análisis de restricción y secuenciación DNA.

TABLA 3 Cebadores PCR utilizados para amplificar las regiones aguas arriba HuICAM-4

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 HI4-19(AS) \+
 CAGAACT AAGCTT ACAGGAGGCGAGGAGAGCGCGAG \cr  \+ (SEQ ID
NO: 34)\cr  HI4-114 \+
 CAACAAT GCTAGC CAAGCGCAACTCTGTCTC \cr  \+ (SEQ ID NO:
35)\cr  HI4-149 \+
 CAACAAT GCTAGC CTTGGAAACCAAGTTACC \cr  \+ (SEQ ID NO:
36)\cr  HI4-206 \+
 CAACAA TGCTAGC AGGAGCTIAGCGCACGCTCG \cr  \+ (SEQ ID NO:
37)\cr  HI4-270 \+
 CAACAAT GCTAGC CATGCCGGCCTCCACGTAG \cr  \+ (SEQ ID NO:
38)\cr  HI4-408 \+
 CAACAAT GCTAGC GTCCAGCITATTATCATG \cr  \+ (SEQ ID NO:
39)\cr  HI4-480 \+
 CAACAAT GCTAGC CTTAGTCCCCAAATGTATC \cr  \+ (SEQ ID NO:
40)\cr  HI4-560 \+
 CAACAAT GCTAGC GGAGAAGGATCAGTGAG \cr  \+ (SEQ ID NO:
41)\cr  HI4-817 \+
 CAACAAT GCTAGC CTCCACCCACCGAGCAGAAG \cr  \+ (SEQ ID NO:
42)\cr}

Se procedió a la transfección de plasmidos que contenían cada uno de ellos las secuencias amplificadas descritas en la Tabla 4 en células de mamífero utilizando un kit de Transfección de Mamífero MBS (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Cada plasmido se introdujo en dos líneas de células diferentes, células precursoras COS 7 y NT2 (Ntera2/D1 de Stratagene). Las células COS 7 son una línea de célula similar a fibroblasto de simio habitualmente utilizada transformada con SV40 que las hace perfectamente adecuadas para activar la expresión de un gen bajo el control del promotor SV40 en células transfectadas con el Vector Promotor pGL3 de control positivo. Las células precursoras NT2 son una línea celular precursora neuronal "commited", y aunque no expresan ICAM-4 pueden ser más representativas de un tipo de células que expresan ICAM-4.

TABLA 4 Cebadores emparejados y regiones amplificadas

Pares de oligonucleótidos	Región reguladora correspondiente aguas arriba
HI4-19 (AS) con HI4-114	-19 \rightarrow 114
HI4-19 (AS) con HI4-149	-19 \rightarrow 149
HI4-19 (AS) con HI4-206	-19 \rightarrow 206
HI4-19 (AS) con HI4-270	-19 \rightarrow 270
HI4-19 (AS) con HI4-408	-19 \rightarrow 480
HI4-19 (AS) con HI4-480	-19 \rightarrow 480
HI4-19 (AS) con HI4-560	-19 \rightarrow 560
HI4-19 (AS) con HI4-817	-19 \rightarrow 817

Cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de base plana de seis pocillos (Falcon) se sembró con 2,5x10^{5} células. Se realizaron transfecciones de COS 7 y NT2 por duplicado, "side by side " utilizando 5 \mug de plasmido DNA para cada pocillo. Las células se cultivaron a 37°C durante 48 horas, se lisaron y se analizó la actividad de luciferasa con un Sistema de Análisis de Luciferasa (Promega).

Los resultados del experimento, recogidos en la Tabla 5, indican un elevado nivel de actividad promotora contenida dentro de las regiones -408 a -19 y -480 a -19 de la región reguladora aguas arriba de ICAM-4 en células NT2. Debido a que las células NT2 son de origen neuronal, pueden expresar ciertos factores de transcripción que reconocen el promotor ICAM-4 que no se encuentran en otros tipos de células. Se obtuvo el máximo nivel de actividad promotora en transfectantes de célula COS con el plasmido que contenía nucleótidos -560 a -19. Mientras el Vector Promotor pGL3 de control positivo trabajaba bien en la célula COS mostró una actividad promotora muy baja en las células NT2, ilustrando de este modo una preferencia específica de tipo celular por ciertas secuencias promotoras.

TABLA 5 Actividad Promotora de regiones 5' ICAM-4

Región aguas arriba	Luminiscencia
	COS	NT2
-114 a -19	0,003	0,376
-149 a -19	0,008	0,628
-206 a -19	0,443	0,622
-270 a -19	0,056	1.140
-408 a -19	0,401	7,970
-480 a -19	0,274	4,630
-560 a -19	3,227	1.232
-817 a -19	0,035	4,453
Vector Promotor pGL3	29,070	0,063
Vector Básico pGL3	0,008	0,014

Debido a que ni las células COS ni las células NT2 expresan normalmente ICAM-4, se repetirá el mismo experimento utilizando neuronas de hipocampo de rata en cultivo primario que si que expresan ICAM-4 y expresan necesariamente la maquinaria transcripcional requerida para actividad promotora ICAM-4 Transfectando los constructos promotores individuales descritos aquí, así como otros, en el entorno más natural, puede ser posible identificar de forma más precisa cuáles son los nucleótidos, en la región reguladora, aguas arriba, responsable de regulación estricta del gen ICAM-4 en el cerebro.

Los anteriores ejemplos ilustrativos se refieren a las realizaciones actualmente preferidas de la invención aunque se espera que a las personas versadas en el arte se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones con respecto a la misma. Por consiguiente sólo se sitúan dentro del ámbito de la presente invención aquellas limitaciones que aparecen en las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: GALLATIN, W. MICHAEL

\hskip3,3cm

Kilgannon, Patrick D.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Materiales y Métodos ICAM-4

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 42

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DOMICILIO POSTAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Chicago

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: Illinois

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 60606-6402

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Patentln Release #1.0 Versión #1.25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/827.689

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 27 de enero de 1992

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/889.724

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 26 de mayo de 1992

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/894.061

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 5 de junio de 1992

vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/009.266

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 22 de enero de 1993

vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/102.852

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 5 de agosto de 1993

vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/245.295

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 18 de mayo de 1994

vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/485.604

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE DEPÓSITO: 7 de junio de 1995

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN APODERADO/REPRESENTANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: WILLIAMS, JR. JOSEPH A.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 38.659

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA: 27866/33321

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): DATOS TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 312-474-6300

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FAX: 312-474-0448

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TELEX: 25-3856

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2988 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 61..2814

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

1

2

3

4

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

: (A) LONGITUD: 917 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

: (B) TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

: (D) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

50

6

7

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 315 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): DATOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LUGAR: 1..315

80

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO. 4

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1781 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): DATOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LUGAR: 16..1659

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 4

9

10

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SECUENCIA PARA SEQ ID NO: 5

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4900 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

110

12

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SECUENCIA ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1295 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2214 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

15

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5077 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(i): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

160

17

18

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1472 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(i): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

190

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2550 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

200

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 222 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única.

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

210

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 292 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 12:

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 13:

220

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 14:

221

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 15:

230

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 16:

231

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 17:

232

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 18:

233

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 19:

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 20:

240

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 21:

241

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 22:

242

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 23:

243

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 992 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 24:

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2775 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 25:

250

26

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1557 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 26:

270

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2927 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): DATOS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LUGAR: 40..2814

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 27:

280

29

30

31

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 924 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 28:

320

33

34

35

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 29:

350

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 30:

351

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 31:

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 32:

360

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1687 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: 33:

361

37

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 34

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 34

\vskip0.333000\baselineskip

CAGAACTAAG CTTACAGGAG GCGAGGAGAG CGCGAS

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCCAAGCGC AACTCTGTCT C

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 36

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCCTTGGAA ACCAAGTTAC C

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.333000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.333000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCAGGAGCT TAGCGCACGC TGC

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCCATGCCG GCCTCCACGT AG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 39

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCGTCCAGC TTATTATTCAT G

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 40

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCCTTAGTC CCCAAATGTA TC

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCGGAGAAG GATCAGTGAG

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Acido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: Unica

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 42

\vskip0.333000\baselineskip

CAACAATGCT AGCCTCCACC CACCGAGCA AAG

\hfill

Claims

1. Método para distinguir entre varias formas de epilepsia, elegidas entre: crisis convulsivas de Grand Mal, síncope o epilepsia del lóbulo temporal (TLE), que comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto una muestra de fluido obtenida de una primera persona con un anticuerpo específicamente inmunoreactivo con ICAM-4;

b): cuantificar el nivel de fijación de ICAM-4 / anticuerpo en la muestra; y

c): comparar el nivel de fijación de ICAM-4 / anticuerpo en la muestra con el nivel de fijación de ICAM-4 / anticuerpo en una segunda persona que tiene una forma conocida de epilepsia elegida entre: crisis convulsivas de Grand Mal, síncope o epilepsia del lóbulo temporal (TLE).

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de fluido es suero.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de fluido es plasma.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de fluido es fluido cerebroespinal

5. El método de la reivindicación 1, en el que la fijación ICAM-4 / anticuerpo se cuantifica por radioinmunoanálisis (RIA)

6. El método de la reivindicación 1, en el que la fijación ICAM-4 / anticuerpo se cuantifica por análisis inmunoabsorbente vinculado a enzima (ELISA).