JP2003149246A

JP2003149246A - 物質の検出法

Info

Publication number: JP2003149246A
Application number: JP2002237477A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Kato; 滋雄加藤; Yoichi Kumada; 陽一熊田
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 2001-08-27
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2003-05-21

Abstract

(57)【要約】【課題】リポソームを破壊することなく高感度でクリ
アーなシグナルを得られる検出方法および該方法に用い
るキットを提供する。【解決手段】リポソームを用いる被検物質を検出する
方法において、リポソームが該被検物質を特異的に認識
する物質を表面に有しかつ標識物質を内包したリポソー
ムであり、リポソームを破壊する工程を有することなく
該被検物質を検出することを特徴とする検出法、並び
に、被検物質を固定化するための担体、被検物質を認識
する抗体（一次抗体）、被検物質を認識する抗体（一次
抗体）を認識することのできる抗体（二次抗体）を表面
に有しかつ標識物質を内包したリポソーム、および該リ
ポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と反応して
検出が可能になり得る物質を含む、被検物質を検出する
ためのキット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リポソームを用い
る、被検物質の高感度検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体間の特定且つ強い免疫学的な
相互作用は、多くの生物学的素材の分析評価方法におい
て、広く使用されている。近年、プロテオミクス（たん
ぱく質機能分析）、臨床の分析評価およびバイオインダ
ストリーにおいて、タンパク質の検出、性質決定、およ
び選別のために測定を必要とするサンプルの数は顕著に
増加していることより、多数のサンプルを迅速かつ自動
的に測定できる方法が要求されている。

【０００３】酵素結合免疫吸着検定法(EIA)は、免疫学
的相互作用に基づく多くの方法の中で、最も一般的な免
疫測定法であるが、結合および遊離している抗体および
抗原の分離のために、インキュベーションおよび洗浄工
程を多数繰り返す必要がある。従って、測定に多くの時
間を要し、多数のサンプルの処理には適していない。ま
た、EIAでは、検出時の発色が、空気に触れる事で徐々
に退色してしまう欠点がある。

【０００４】免疫ブロット測定法やコロニー検出免疫測
定法のような、膜ブロッティング測定法は、自動化され
たマイクロアレイ法等に適用可能であるが、測定感度
は、ラベル試薬の量とシグナル強度により制限される。
例えば、免疫ブロット測定法において検出に用いる抗体
１分子には、２〜３の酵素分子しか結合することしかで
きない。感度増加および測定値のシグナル増幅のため
に、多くの改良法が提案されている。

【０００５】その代表的なものとして、リポソーム(lip
osome)を用いた免疫測定法（LIA）が知られている。１
つのリポソームは多数の抗体（もしくは抗原）分子とそ
の表面で結合可能であり、ラベルされた抗体よりも非常
に多くのマーカーを含むことができるため、ラベルされ
た抗体に代えて、マーカーを閉じ込めている免疫リポソ
ームは上記目的に使用することができる〔ロンゲン(Ron
gen)ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ
(J. Immunol. Methods)、２０４巻、１０５頁（１９９
７）、シング(Singh)ら、 "Liposome in Immunodiagnos
tics, Handbookof Nonmedical Applications of Liposo
mes. D. D. Lasic and Y. Barenholz ed. ２０９〜２２
８頁、CRC Press, Boca Raton, USA" （１９９６）〕。

【０００６】EIAと比較し、LIAでは多点で抗原と抗体の
相互作用が働くため、結合親和性（結合活性）を増加さ
せることができる〔熊田(Kumada)ら、ジャーナル・オブ
・ケミカル・エンジニアリング・ジャパン（J. Chem. E
ng. Japan）、７巻、９４３頁（２００１）〕。しか
し、LIAでは、マイクロタイタープレートなどのウェル
内で反応させることが、実用的な測定のために必要とさ
れており、更に、シグナル発生時に界面活性剤あるいは
補体を用いてリポソームを破壊する必要があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】リポソームを用いたこ
れまでの検出法では、シグナル発生時にリポソームを破
壊することが必須要件とされており、該破壊工程によ
り、液層へ発色生成物の拡散が起こるため、感度が低下
し、クリアーなシグナルを得ることはできなかった。本
発明の目的は、リポソームを破壊することなく高感度で
クリアーなシグナルを得られる検出方法および該方法に
用いるキットを提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（１）
〜（２６）に関する。（１）リポソームを用いる被検物質を検出する方法に
おいて、リポソームが該被検物質を特異的に認識する物
質を表面に有しかつ標識物質を内包したリポソームであ
り、リポソームを破壊する工程を有することなく該被検
物質を検出することを特徴とする検出法。

【０００９】（２）リポソームに被検物質を認識させ
た後、リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と
反応して検出が可能になり得る物質を添加することを特
徴とする（１）記載の検出法。（３）リポソームを用いる被検物質を検出する方法に
おいて、該被検物質を特異的に認識する物質を表面に有
しかつ標識物質を内包したリポソームに被検物質を認識
させた後、該リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識
物質と反応して検出が可能になり得る物質を添加するこ
とを特徴とする検出法。

【００１０】（４）被検物質が、担体に固定化された
被検物質である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載
の検出法。（５）被検物質と、リポソームの表面に存在する該被
検物質を特異的に認識する物質との関係が、免疫学的な
関係にあることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか
１項に記載の検出法。

【００１１】（６）免疫学的な関係が抗原と抗体の関
係であることを特徴とする（５）記載の検出法。（７）被検物質と、リポソームの表面に存在する該被
検物質を特異的に認識する物質が、酵素と基質、酵素と
阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、DNAとRN
A、DNAとDNA、血清アルブミンと色素ブルー、酵素と補
酵素、およびタンパク質とコンビナトリアルリガンドペ
プチドの群より成る組み合わせから選ばれる組み合わせ
の関係を有することを特徴とする、（１）〜（３）のい
ずれか１項に記載の検出法。

【００１２】（８）酵素と補酵素の組み合わせが、酸
化還元酵素と補酵素NADHの組み合わせである、（７）記
載の検出法。（９）リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質
と反応して検出が可能になり得る物質が、さらに該標識
物質との反応によりリポソームの脂質膜に不透過となり
得るものであることを特徴とする（２）または（３）記
載の検出法。

【００１３】（１０）リポソームを用いる被検物質を
検出する方法が、ドットブロッティング法、ウェスタン
ブロッティング法、サザンブロッティング法およびノー
ザンブロッティング法から選ばれる方法である（１）〜
（３）のいずれか１項に記載の検出法。

【００１４】（１１）被検物質が抗原であり、該被検
物質を特異的に認識する物質が抗体であるか、または被
検物質が抗体であり、該被検物質を特異的に認識する物
質が抗原であることを特徴とする（１）〜（３）のいず
れか１項に記載の検出法。（１２）被検物質が抗原であり、リポソームの表面に
存在する該被検物質を特異的に認識する物質が、前記被
検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することので
きる抗体（二次抗体）であり、該被検物質に一次抗体を
認識させた後に、該リポソームを添加することを特徴と
する（１）〜（３）のいずれか１項に記載の検出法。（１３）標識物質が酵素であることを特徴とする
（１）〜（３）のいずれか１項に記載の検出法。

【００１５】（１４）酵素が西洋わさびペルオキシダ
ーゼであることを特徴とする（１３）記載の検出法。（１５）リポソームの脂質膜を透過可能でかつ前記標
識物質と反応して検出が可能になり得る物質が、４−ク
ロロ−１−ナフトールであることを特徴とする（２）ま
たは（３）記載の検出法。

【００１６】（１６）前記リポソームの脂質膜を透過
可能でかつ前記標識物質と反応して検出が可能になり得
る物質が、ルミノールおよび過酸化水素から構成される
ことを特徴とする（２）または（３）記載の検出法。（１７）検出時にエンハンサーを用いることを特徴と
する（１６）記載の検出法。

【００１７】（１８）エンハンサーがp-ヨードフェノ
ールである、（１７）記載の検出法。（１９）担体が、膜状、チップ状、アレイ状およびビ
ーズ状のいずれかの状態である、（４）記載の検出法。

【００１８】（２０）担体が、ポリビニリデンフルオ
リド、ニトロセルロース、またはナイロンであることを
特徴とする（１９）記載の検出法。（２１）担体が細胞である、（４）記載の検出法。（２２）担体の孔径が、前記リポソームの粒子径より
も大きいことを特徴とする（４）記載の検出法。

【００１９】（２３）被検物質を特異的に認識する物
質を表面に有しかつ標識物質を内包したリポソーム、お
よび該リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と
反応して検出が可能になり得る物質を含む、被検物質を
検出するためのキット。（２４）被検物質を固定化するための担体、被検物質
を特異的に認識する物質を表面に有しかつ標識物質を内
包したリポソーム、および該リポソームの脂質膜を透過
可能でかつ標識物質と反応して検出が可能になり得る物
質を含む、被検物質を検出するためのキット。

【００２０】（２５）被検物質を認識する抗体（一次
抗体）、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識す
ることのできる抗体（二次抗体）を表面に有しかつ標識
物質を内包したリポソーム、および該リポソームの脂質
膜を透過可能でかつ標識物質と反応して検出が可能にな
り得る物質を含む、被検物質を検出するためのキット。

【００２１】（２６）被検物質を固定化するための担
体、被検物質を認識する抗体（一次抗体）、被検物質を
認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体
（二次抗体）を表面に有しかつ標識物質を内包したリポ
ソーム、および該リポソームの脂質膜を透過可能でかつ
標識物質と反応して検出が可能になり得る物質を含む、
被検物質を検出するためのキット。

【００２２】本発明の方法は、リポソームを用いた被検
物質を検出する方法において、リポソームを破壊するこ
となく該被検物質を検出することを特徴とする高感度検
出法である。リポソームを破壊することがないため、高
感度かつクリアーなシグナルを得ることができる。

【００２３】また、リポソームの脂質膜を透過可能でか
つ標識物質と反応して検出が可能になる物質（例えば、
発色基質、発光基質、蛍光基質）を用いることによっ
て、リポソーム内に該物質が拡散、反応でき、検出シグ
ナルを向上させることができる。更に、該物質として標
識物質と反応後、溶解度が減少し析出するものを利用す
ることにより、一旦リポソーム内で生じた検出可能物質
を、再びリポソーム外に拡散させることなく、内部に蓄
積させることができるため、更に検出シグナルを向上さ
せることができる。また、該物質として発光時間の短い
ものを利用することにより、リポソーム外への拡散を防
ぐことができ、検出シグナルを向上させることもでき
る。

【００２４】本発明の方法によれば、被検物質に結合し
たリポソームの位置でのみ検出シグナルを発生（例えば
発色、発光等）させることができ、小さなスポットでの
高感度、迅速な検出を可能とすることができる。従っ
て、本発明の方法は、被検物質を膜に負荷、吸着させて
分析を行うイムノブロットアッセイ等にも応用できる。

【００２５】上記理由より、本発明の方法は、ＥＩＡと
比較して高感度であり、任意のブロッティングサイズで
分析を行うことができ、コロニーリフトやマイクロアレ
イアッセイ等へ応用することが可能である。本発明の検
出法では、高感度化以外に、ウェルから膜を用いること
によって迅速性、自動化、マイクロ化の可能性も改善さ
れているため、様々なバイオアフィニティーを及ぼし合
う物質のライブラリーからのスクリーニングに利用する
ことができ、プロテオーム解析のための重要な手法とな
り得る。

【００２６】更に、ＥＩＡに用いられる酵素標識抗体に
比べて、リポソームは様々な物質を包含することができ
ることから、用途に応じて様々なマーカーを選択するこ
とが可能となる。また膜の流動性を制御することでリポ
ソーム内での酵素−基質反応、それに続くシグナルの蓄
積もそれぞれのマーカーに対して可能である。また、本
発明はＥＩＡと同じ発色方法で検出でき、リポソーム内
に発色反応生成物を蓄積させることにより、空気に触れ
る事で徐々に退色してしまうＥＩＡとは異なり、発色後
の膜上のシグナルの退色を防ぐことが可能である。

【００２７】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の検出法における、被検物質は、該被検物
質を特異的に認識する物質が存在する物質であれば、特
に限定されることはない。

【００２８】被検物質と、該被検物質を特異的に認識す
る物質の関係の一例としては、免疫学的な関係にある物
質が挙げられる。具体的には、抗原と抗体の関係が挙げ
られる。抗原と抗体の関係において、被検物質が抗原で
ある場合、該抗原を特異的に認識する物質は抗体であ
り、被検物質が抗体である場合、該抗体を特異的に認識
する物質は抗原である。

【００２９】また、被検物質を特異的に認識する物質
は、被検物質を間接的に認識できる物質であってもよ
い。即ち、被検物質を特異的に認識する物質を認識する
ことのできる物質であってもよい。具体的には、被検物
質を認識する抗体（一次抗体）を認識することのできる
抗体（二次抗体）が挙げられる。

【００３０】二次抗体として、被検物質を認識できる一
次抗体作製に用いた動物種に特異的な抗体を認識するこ
とのできる抗体を用いることにより、該動物種で一次抗
体を作製可能な様々な被検物質に対して共通してこの同
じ二次抗体を使用することが可能となる。本発明の検出
法を利用したキットを作製する上で、この二次抗体を表
面に有するリポソームは有用である。

【００３１】上記抗体を作製するために用いる動物とし
ては、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等が
挙げられる。抗体としては、動物に免疫することによっ
て得られるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法
から得られるモノクローナル抗体でもよい。ポリクロー
ナル抗体を用いる場合には、動物として取り扱いやすい
ウサギ抗体が好ましい。

【００３２】抗原としての被検物質として、例えば血液
中などに微量に存在するタンパク質ホルモン、活性ペプ
チド、オータコイド、腫瘍マーカー、免疫グロブリン等
の生体成分や薬剤等が挙げられるが、これらに限定され
ることはなく、被検物質に対する抗体を作製できるもの
等であれば特に制限はない。

【００３３】その他、本発明の検出法における、被検物
質と、該被検物質を特異的に認識する物質として、酵素
と基質、酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと
糖鎖、ＤＮＡとＲＮＡ、ＤＮＡとＤＮＡ、血清アルブミ
ンと色素ブルー、酵素と補酵素、タンパク質とコンビナ
トリアルリガンドペプチド等の、様々な組み合わせのも
のを挙げることができる。酵素と補酵素の組み合わせの
例としては、酸化還元酵素と補酵素ＮＡＤＨの組み合わ
せ等を挙げることができる。

【００３４】本発明の検出法においては、EIA測定用に
調製された被検物質をそのまま使用することができる。
また、被検物質を担体に固定化して用いてもよい。被検
物質を固定化する担体としては、被検物質を固定化可能
な担体であれば、特に限定されることはない。

【００３５】上記担体の形状としては、膜状、チップ
状、アレイ状、ビーズ状のもの等が挙げられる。上記担
体の素材例としては、被検物質を固定化可能な素材であ
れば特に限定されないが、ポリビニリデンフルオリド、
ニトロセルロース、ナイロン等が挙げられる。

【００３６】担体の孔径は、後述のリポソームの粒子径
に合わせて適宜選定すればよい。リポソームの粒子径よ
りも大きい孔径の担体を用いることにより、検出感度を
向上させることができる。また、担体として、細胞を用
いることもできる。即ち、被検物質を細胞表層に発現し
ている細胞を担体として挙げることができ、該細胞は遺
伝子組換えにより被検物質を発現するように改変された
ものであってもよい。

【００３７】本発明の検出法は、ドットブロッティング
法、ウエスタンブロッティング法、サザンブロッティン
グ法、ノザンブロッティング法等の様々な測定法に適用
することができる。本発明の検出法において用いる、リ
ポソームは、被検物質を特異的に認識する物質を表面に
有しかつ標識物質を内包できるリポソームであれば特に
制限はない。

【００３８】該リポソームに内包される標識物質として
は、リポソームの脂質膜を透過可能な物質と反応して該
物質を検出可能にさせるものであれば、特に限定され
ず、例えば、EIAで用いられる酵素等を挙げることがで
き、具体的には、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−D
−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素等が挙げられる。

【００３９】本発明の検出法において用いられるリポソ
ームの粒子径は、後述の方法で作製可能なリポソームの
有する粒子径であればいずれでもよい。作製したリポソ
ームの粒子径に応じて適宜好ましい孔径を有する担体を
選定すればよい。また、逆に、担体の孔径に応じて適宜
好ましい粒子径を有するリポソームを選定してもよい。

【００４０】前述のように、担体の孔径よりも粒子径が
小さいリポソームを選定することにより感度を向上させ
ることができる。次いで、本発明の検出法において用い
るリポソームの作製法について説明する。本発明の方法
で用いるリポソームを作製する際に使用できる脂質とし
ては、リン脂質、糖脂質、コレステロールなどが挙げら
れ、リン脂質としては、動物や微生物などの細胞膜に広
く存在するリン脂質、例えばホスファチジルエタノール
アミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセ
リン類、スフィンゴミエリン類などの各種リン脂質が挙
げられる。天然の卵黄、牛脳や大豆などから得られるホ
スファチジルコリンも使用できる。

【００４１】このようなリン脂質中の脂肪酸の種類には
各種の飽和または不飽和脂肪酸が含まれる。例えばホス
ファチジルコリンの場合、ジヘプタノイル−、ジカプロ
イル−、ジデカノイル−、ジラウロイル−、ジヘプタデ
カノイル−、ジベヘノイル−、ジミリストイル−、ジパ
ルミトイル−ホスファチジルコリン等が挙げられ、前述
のその他のリン脂質も同様に各種飽和および不飽和脂肪
酸が含まれる。

【００４２】標識物質を封入したリポソームの作製法と
しては、公知のリポソーム作製法に準じた作製法が挙げ
られる。例えば、以下の方法等を挙げることできる。（１）有機溶媒に溶解したリン脂質を容器に入れ、減圧
下にエバポレータまたは窒素ガスの吹き付けにより溶媒
を除去して薄い脂質膜を形成させ、次いで、あらかじめ
封入したい標識物質を含む適当な塩類溶液やあらかじめ
標識物質を溶解した水溶液を加え振盪する方法〔エー・
ディー・バンガム（A. D. Bangham）ら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Bio
l.）、１３巻、２３８頁（１９６５）およびディー・パ
パジョポウラス（D. Papahadjopoulos）ら、バイオキミ
カ・エテ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim. Biophys.
Acta)、１３５巻、６３９頁（１９６７）〕やボルテッ
クスミキサーで振盪攪拌する方法〔ケー・イノウエ（K.
Ionue）、バイオキミカ・エテ・バイオフィジカ・アク
タ(Biochim. Biophys. Acta)、３３９巻、３９０頁（１
９７４）およびエス・シー・キンスキー（S. C. Kinsk
y）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、８巻、
４１４９頁（１９６９）〕。

【００４３】（２）前記（１）の方法で得られた多重膜
リポソーム(MLVs)をさらに超音波発振装置で超音波処理
し小さな一枚膜リポソーム(SUVs)を作製する方法〔ディ
ー・パパジョポウラスら、バイオキミカ・エテ・バイオ
フィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Acta)、３１１
巻、３１０頁（１９７３）〕。

【００４４】（３）有機溶媒に溶解したリン脂質を急激
に標識物質を含む塩類溶液と混和する方法〔エス・バツ
ィーリ（S. Batzri）ら、バイオキミカ・エテ・バイオ
フィジカ・アクタ(Biochim. Biophys. Acta)、２９８
巻、１０１５頁（１９７３）〕。（４）エーテルに溶解したリン脂質をエーテルの沸点よ
り高くした、あらかじめ標識物質を溶解した水溶液にゆ
っくりと吹き出させる方法〔ディー・ダブリュー・ディ
ーマー（D. W. Deamar）、アニュアル・ニューヨーク・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ann. N. Y. Acad. Sc
i）、３０８巻、２５９頁（１９７８）〕。

【００４５】（５）ホスファチジルセリン単独あるいは
等量のホスファチジルセリンとコレステロールからなる
リポソームを超音波発振装置で超音波処理してSUVsを作
成し、カルシウム処理の後、標識物質を含む塩類溶液と
ＥＤＴＡを加え大きな一枚膜リポソーム(LUVs)を作成す
る方法〔ディー・パパジョポウラス、アニュアル・ニュ
ーヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス、３０８巻、
２５９頁（１９７８）〕。

【００４６】（６）脂質を含む有機溶媒に標識物質を溶
解した水溶液を加え超音波発振装置で超音波処理した
後、ロータリーエバポレータで有機溶媒を除去し逆相リ
ポソームとする方法〔エフ・ズォカ・ジュニア（F. Szo
ka. Jr.）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・イン・ユー・エス・エ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７５巻、４１４９
頁（１９７８）〕。

【００４７】（７）脂質やジアルキルリン酸、ジアルキ
ルアンモニウム塩などにアクリル基、メタクリル基、ジ
アセチレン基、ジエン基などの重合可能な官能基を導入
し、この重合性の脂質などを含んだリポソームを前記
（１）〜（６）のいずれかの方法で作製し、その後に紫
外線を照射したり重合開始剤を加えるなどの方法によ
り、リポソーム膜中で重合を起こさせリポソームを安定
化する方法〔例えば、エイチ・オオノ（H. Ohno）ら、
マクロモレキュールズ（Macromolecules）、２０巻、９
２９頁（１９８７）、およびイー・ツチダ（E. Tsuchid
a）ら、マクロモレキュラー・ヘミー（Makromol. Che
m.）、１８７巻、１３５１頁（１９８６）〕。

【００４８】リポソームの重合を行うと、膜の物理的強
度が増大し、リポソーム内に封入する標識物質の保持能
が改善され、またリポソームどうしの融合を防止できる
ため、長期間安定に保存可能であり、また測定の高感度
化を図ることができるため好ましい。また重合性化合物
と非重合性の脂質等からなる混合リポソームの場合、そ
れらの組合せにより、相溶性のものおよび相溶性がなく
リポソーム膜内で相分離を起こすものを選択することが
でき、これらはまた重合性化合物と非重合性の脂質等の
組成の割合を変えることによって、膜の物理的強度、安
定性を制御することもできる。

【００４９】上記の手法等により調製されたリポソーム
の表面に、被検物質と特異的に結合する物質を結合する
方法についても、公知の方法、例えば（１）ホスファチ
ジルエタノールアミンと抗体をグルタルアルデヒドで架
橋する方法〔ブィ・ピー・トールチリン(V. P. Torchil
in)ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Com
m.）、８５巻、９８３頁（１９７８）〕、（２）ホスフ
ァチジルエタノールアミンにＳＨ基と反応する試薬を共
有結合したものをリポソームに組込み、これにＳＨ基を
導入した抗体を結合する方法〔エル・ディー・レーザー
マン（L. D. Leserman）ら、ネイチャー（Nature）、２
８８巻、６０２頁（１９８０）およびワイ・ハシモト
（Y. Hashimoto）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソッズ、６２巻、１５５頁（１９８３）〕、およ
び（３）リポソーム内に糖脂質を組込んでおき、過ヨウ
素酸処理で生じたアルデヒド基と抗体を反応させる方法
〔ティー・ディー・ヒース（T.D. Heath）ら、バイオキ
ミカ・エテ・バイオフィジカ・アクタ(Biochim. Biophy
s. Acta)、６４０巻、６６頁（１９８１）〕などが利用
できる。

【００５０】リポソームの表面に結合させる、被検物質
を特異的に認識する物質の数は、リポソームの粒子径に
依存して増加させることができる。リポソームの粒子径
を大きくすることによりリポソーム１個当たり200以上
の該物質を結合させることができる。5〜200結合させる
のが一般的であるが、50以上結合させてもシグナル感度
は余り向上しないため、10〜50の結合でも充分な感度が
得られる。

【００５１】被検物質の担体への固定化および被検物質
とリポソームとの反応は、従来のEIAあるいはLIAで用い
られている、常法に従って行うことができる。被検物質
とリポソームとの反応として、例えば、該リポソームを
スキムミルク−PBS溶液として、担体と共に、室温で適
当な時間インキュベートする等の方法が挙げられる。

【００５２】担体に固定化した被検物質と該リポソーム
とを直接的または間接的に結合させた後に適用する物質
としては、リポソームの脂質膜を破壊することなく前記
標識物質と反応して検出が可能になり得るものであれ
ば、特に限定されない。このような物質として、リポソ
ームの脂質膜を透過可能でかつ前記標識物質と反応して
検出が可能になる物質（例えば、発色基質）を挙げるこ
とができる。

【００５３】前記標識物質としてEIAで用いられるよう
な酵素を用いた場合には、上記物質として、リポソーム
の脂質膜を透過可能でかつ前記標識物質と反応して検出
が可能な該酵素の基質が挙げられる。通常EIAで用いら
れる酵素の基質はリポソームの脂質膜を透過できないた
め、リポソームの脂質膜を透過可能な基質を選択するあ
るいは透過可能な基質に改変する必要がある。基質の疎
水性を増加させることによりリポソームの脂質膜を透過
可能な基質に改変することが可能である。

【００５４】例えば、標識物質として西洋わさびペルオ
キシダーゼを用いた場合には、上記条件を満たす基質と
して４−クロロ−１−ナフトール（4-CN）等を挙げるこ
とができる。また、西洋わさびペルオキシダーゼの基質
として過酸化水素を用いることもできる。この場合、酵
素反応により発生する酸素ラジカルを、ルミノールのよ
うな化学発光基質による発光により検出することができ
る。

【００５５】4-CNを用いた場合には、西洋わさびペルオ
キシダーゼと反応後生成した発色物質は、溶解度が低
く、リポソーム内で析出、蓄積するため、該発色物質の
リポソーム外への拡散がなく、特に検出シグナルを向上
させることができる。即ち、リポソームの脂質膜を透過
可能であり、かつ酵素と反応後生成する発色物質が溶解
度の低い、リポソーム内で析出、蓄積するような物質を
用いることにより、更に検出シグナルを向上させること
ができる。

【００５６】過酸化水素を用いた場合には、ルミノール
等の化学発光基質による発光時間を短く調整することに
より、リポソーム外への拡散を防ぐことができ、検出シ
グナルを向上させることができる。このとき、p-ヨード
フェノール等のエンハンサーを用いることにより更に検
出シグナルを向上させることができる。このエンハンサ
ーは予めリポソーム内に封入しておいても、基質と共に
添加してもよい。

【００５７】即ち、基質として膜透過性化学発光物質を
用い、標識物質との反応後の発光時間を調整することに
より高感度の検出シグナルを得ることができる。このと
きにエンハンサーを利用することにより更に感度を向上
させることが可能となる。前記標識物質と反応して検出
が可能となる検出シグナルとしては、特に限定されない
が、例えば酵素反応等による色素の生成等が挙げられ
る。

【００５８】生成した色素、発光、蛍光等の検出シグナ
ルは、従来のEIA法、LIA法と同様に、肉眼や、分光光度
計、発光光度計、蛍光光度計、ＣＣＤカメラ等により検
出することができる。実際の測定に際しては、あらかじ
め既知の濃度の被検物質を用いて検量線を作製してお
き、これをもとにして同じ条件下で測定を行うことによ
り、被検試料中の未知の濃度の被検物質量を測定するこ
とができる。

【００５９】本発明の方法は、上記のように、多検体を
少量で迅速且つ高感度で測定可能な方法であるため、該
方法に基づいたキットを作製することにより、簡便に自
動化を図ることができる。本発明のキットの特徴は、被
検物質を特異的に認識する物質を表面に有しかつ標識物
質を内包したリポソームおよび該リポソームの脂質膜を
透過可能でかつ標識物質と反応して検出が可能になり得
る物質を含むことである。

【００６０】従来のEIAで測定可能な被検物質あるいはE
IA測定用に調製された被検物質は、上記を含む本発明の
キットを用いることにより高感度で測定できる。本発明
のキットに、被検物質を固定化するための担体が含まれ
ていてもよい。被検物質を認識する抗体（一次抗体）、
被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識することの
できる抗体（二次抗体）を表面に有しかつ標識物質を内
包したリポソーム、および該リポソームの脂質膜を透過
可能でかつ標識物質と反応して検出が可能になり得る物
質を含むキットも本発明のキットである。二次抗体とし
て、被検物質を認識できる一次抗体作製に用いた動物種
に特異的な抗体を認識することのできる抗体を用いるこ
とにより、該動物種で一次抗体を作製可能な様々な被検
物質に対して共通してこの同じ二次抗体を使用すること
が可能となり、キット化には適している。該キットに被
検物質を固定化するための担体が含まれていてもよい。

【００６１】本発明のキットで用いる、担体、リポソー
ム、被検物質を特異的に認識する物質および該リポソー
ムの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と反応して検出が
可能になり得る物質については、それぞれ前記本発明の
検出法に使用したものを用いることができる。

【００６２】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００６３】実施例１．抗体結合リポソームの作製ジパルミトイルホスファチジルコリン（Dipalmitoylpho
sphatidylcholine：DPPC, ナカライテスク社(nacalai t
esque)）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（dipalmitoylphosphatidylethanolamine：DPPE, S
igma Aldrich）、コレステロール（cholesterol：Chol,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、ジセチル
ホスフェート（dicetylphosphate：DCP, Sigma Aldric
h）およびＮ−サクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチレート（N-succinimidyl-4-(p-maleim
idophenyl)-butyrate ：SMPB, Pierce）をリポソームを
作製するために使用した。

【００６４】リポソームに封入する標識物質として、西
洋わさびペルオキシダーゼ(HRP, 100U/mg, III級, TOYO
BO)を使用し、基質として、４−クロロ−１−ナフトー
ルを使用した。Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート〔N-succinimidyl -3-(2-p
yridyl-dithio)propionate, SPDP〕はAmersham Pharmac
ia Biotechより、ジチオスレイトール（dithiothreito
l, DTT）はナカライテスク社(nacalai tesque)より、抗
ウサギIgG抗体（ヤギ）および抗ウサギIgG抗体（ヤギ）
-HRPはカッペル社(Cappel Products Co.)より、ヒトIgM
はケミコン社(Chemicon Int)より購入した。

【００６５】抗α−キモトリプシノーゲンＡ抗体および
抗ヒトIgM抗体は、加藤(Katoh)らの方法〔アプライド・
マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー(A
ppl.Microbiol. Biotechnol.)、４２巻、３６頁(1994))
で作製した。抗ウサギIgG抗体（ヤギ）をリポソームと
結合させた。

【００６６】なお、SPDP、DTTは、抗体にチオール基を
導入し、リポソーム膜へ固定化するのに用いた。抗ウサ
ギIgG抗体（ヤギ）および抗ウサギIgG抗体（ヤギ）-HRP
は、イムノリポソーム作製、および免疫測定に用いた。
他の使用したすべての化学薬品は試薬グレードのもので
あった。

【００６７】この研究で使用した緩衝液は以下のように
調製した：PBS (NaCl 9.0 g/l, KCl 0.2 g/l, Na₂HPO₄
・12H₂0 2.9 g/l, KH₂PO ₄ 0.2g/l,pH=7.4) および MES
(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid 4.27 g/l, N
aCl8.77 g/l, pH=5.5)。

【００６８】ブロッキング溶液（pH 7.2, ナカライテス
ク社）および 1.0 %および0.1 % のスキムミルクを含む
PBS溶液（スキムミルクPBS溶液）をブロッキングおよび
洗浄に用いた。孔径450nm〔イモビロンＰ(Immobilin
P)、ミリポア(Millipore)〕および２００ nm〔イムノブ
ロット(Immuneblot)、Bio-Rad Laboratories〕のPVDF膜
をブロッティングに使用した。

【００６９】なお、比較用のHRPに対する発色基質とし
て、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-ス
ルホン酸)ジアンモニウム塩（2,2'-azino-bis(3-ethylb
enzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，AB
TS)を用いた。

【００７０】既報〔キシムラ(Kishimura)ら、ジャーナ
ル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエン
ジニアリング(J. Ferment. Bioeng.)、６８巻、３９５
頁(１９８９)〕に準じて、SMBPを用いて、DPPEをN-[4-
(p-tnaleimidophenyl) butyryl] dipalmitoylphosphati
dylethanolamine (MPB-DPPE) に活性化した。

【００７１】クロロホルム中にDPPC (20 mmol)、 Chol
(20 mmol)、 DCP (2 mmol) およびMPB-DPPE (1 mmol)を
含む脂質混合液を、ロータリーエバポレーターを使用
し、ナスフラスコの内壁面に脂質薄膜が形成されるま
で、４２℃または減圧下で乾燥させた。エバポレーショ
ンを繰り返した後、デシケータ中、減圧下で脂質膜を乾
燥させた。

【００７２】次に、PBS中に5 mg/ml溶解させたHRPを、
マーカーとして封入するために、6 ml該フラスコに添加
し、５０℃近辺で、約１０分間ボルテックスミキサーで
振とうし、脂質膜を剥がし、多重膜リポソーム(MLVs)を
形成させた。小さな一枚膜リポソーム(SUVs)を取得する
ために、MLVsの懸濁液を触針型超音波発生器(UD 201,TO
MY) を用い、氷冷下４０Ｗで２０〜３０分間超音波処理
した。大きな一枚膜リポソーム(LUVs)は、メイヤー(May
er)らの方法〔バイオキミカ・エテ・バイオフィジカ・
アクタ(Biochim. Biophys. Acta) 、８５８巻、１６１
頁(１９８６)〕に準じて、MLVsよりエクストルダー(The
rmobarrel Extruder, Lipex Biomembrane Inc.) を使用
して作製した。このようにして作製したリポソームを、
PBSで平衡化したBio-Gel A-15m充填カラム(Bio-Rad Lab
oratories) を用い、ゲルクロマトグラフィーにより、
リポソームに封入されていないHRPと分離した。

【００７３】活性化したリポソーム分子と共有結合によ
り蛋白質を結合させるために、異種２価架橋剤であるSP
DPを用いた。既報〔キシムラ(Kishimura)ら、ジャーナ
ル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエン
ジニアリング(J. Ferment. Bioeng.)、６８巻、３９５
頁(１９８９)〕に準じて、抗ウサギIgG抗体をSPDPによ
り修飾した。修飾された抗体溶液と活性化したリポソー
ム懸濁液を混合し、室温で一晩穏やかに撹拌した。結合
していない抗体をPBSで平衡化したBio-Gel A-15m充填カ
ラムで除去した。取得された抗体結合リポソームは４℃
で保存した。

【００７４】抗体結合リポソームの平均粒子径は動的光
散乱法(DLS 7000, Photal Otsuka Electronics)により
測定した。SUVsの粒子径は60nmであり、孔径100nm、200
nmおよび400nmの膜を使用して調製したLUVsの粒子径
は、それぞれ130nm、200nmおよび350nmであった。

【００７５】DPPCと蛋白質の濃度は、各サンプル100μl
に10％デオキシコール酸ナトリウム塩を10μl添加した
後に測定した。HRPは90℃で10分間加熱することにより
不活化した。リポソーム懸濁液中のDPPC濃度は、リン脂
質Ｃテストワコー(Wako Pure Chemical Ind. Ltd.)を用
い、コリンオキシダーゼ法により測定した。リポソーム
上に結合した蛋白質の濃度は、DC-protein assay (Bio-
Rad Laboratories)により測定した。

【００７６】実施例２．本発明のリポソーム免疫ブロッ
ト測定法（LIA）本発明のLIAおよび従来の免疫ブロット測定法（EIA）測
定法を比較したものを図式的に図1に示した。抗原１
として0〜10μg/mlの異なる濃度のIgMを含むサンプル20
μlを、孔径200nmもしくは450nmのPVDF 膜２上に固定
化した。PBSで洗浄後、非特異的吸着を避けるために、
ブロッキング溶液（ナカライテスク社）で膜２をブロ
ックした。該膜２を１％スキムミルクPBS溶液で洗浄
し、１％スキムミルクPBS溶液に１次抗体として３μg/m
lの抗ヒトIgM抗体（ウサギ）を溶解した溶液にインキュ
ベートした。

【００７７】LIAにおいて、該膜２を1％スキムミルク
PBS溶液で洗浄し、実施例１で作製した抗ウサギIgG抗体
（ヤギ）結合リポソーム４を1μg/mlの抗体濃度に1％
スキムミルクPBS溶液で希釈し、１時間インキュベート
した。PBSで洗浄した後、基質５として0.5 mg/mlの４
−クロロ−１−ナフトール(4-CN)、0.015 % H₂0₂ およ
び17 % メタノールを含むPBS溶液で３０分間発色させ
た。

【００７８】図１に示したように、標識酵素６である
HRPによる４−クロロ−１−ナフトール由来の発色生成
物７はリポソーム４中に沈殿し、蓄積した。従っ
て、全ての発色生成物７はリポソーム４外に拡散す
ることはなく、元の位置で検出することができた。

【００７９】従来のEIAにおいては、該膜２を１％ス
キムミルクPBS溶液で洗浄し、PBS-Tween 20 で2,000倍
に希釈した、標識酵素結合抗体８である抗ウサギIgG
抗体（ヤギ）-HRP(0.05vol% Tween20-PBSで抗体濃度を
２μg/mlに希釈) と、１時間インキュベートした。PBS
で洗浄した後、LIAと同じ手順で発色させた。この場
合、発色生成物７の一部が膜上に吸着され、検出され
る。

【００８０】実施例３．リポソーム膜を通る発色生成物
の透過効果 HRPの２種類の基質、４−クロロ−１−ナフトール(4-C
N)および2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-
6-スルホン酸)ジアンモニウム塩（ABTS）を発色させ抗
体結合リポソームを検出するために使用した。両基質と
もリポソーム透過性であるが、前者の発色生成物は沈殿
を形成し、リポソームのリン脂質膜をもはや通過できな
くなる。両基質をHRP含有リポソームまたは抗ウサギIgG
抗体（ヤギ）-HRPと混合で１５分間発色させた。4-CN且
つ抗ウサギIgG抗体（ヤギ）を用いた場合には、4-CN由
来の発色生成物の凝集物が、9,200×ｇの遠心分離によ
り沈殿化しているが、リポソーム中に封入された発色生
成物はこの遠心分離条件では沈殿化しなかった。ABTSを
用いた時には沈殿は観察されなかった。

【００８１】何れの基質を用いた場合にも、発色を確認
することができ、リポソームを破壊することなく抗体結
合リポソームを検出可能であることがわかった。4-CN且
つリポソームを用いた場合、600,000×gの遠心分離条件
で、リポソームは沈殿し、透明な上清が得られた。この
ことは、この場合発色生成物はリポソーム内に保持され
ていることを示している。それに対し、ABTS且つリポソ
ームを用いた場合には、発色生成物は上清に拡散した。

【００８２】以上、基質としてABTSを使用した場合に
は、発色生成物が拡散してしまうため、発色時間を測定
可能な時間内のなるべく短時間に設定し、発色生成物の
リポソーム外への拡散を防ぐことが好ましかった。一
方、基質として4-CNを使用した場合には、発色生成物が
沈殿として形成され、リポソーム内部に蓄積されるた
め、安定した測定が可能であった。

【００８３】実施例４．本発明のリポソーム免疫ブロッ
ト測定法（LIA）と従来の免疫ブロット測定法（EIA）と
の感度比較 0.0001〜10μg/ml（0.0001、0.001、0.01、0. 1、1、10
μg/ml）のヒトIgMを、本発明のLIAおよびEIAの２種類
の免疫ブロット測定法で測定し、感度比較を行った。サ
ンプル緩衝液で１：３に希釈したサンプル溶液を20μl
をSDS-PAGEにアプライし、電気泳動後、ヒトIgMを孔径4
50nmのPVDF膜に従来法で固定化した。

【００８４】一次抗体反応はEIA、LIAとも同じく、PVDF
膜に１次抗体として、3μg/mlの抗ヒトIgM抗体（ウサ
ギ）を添加した。標識抗体反応は、LIAではHRP包含イム
ノリポソーム溶液(抗体濃度は1μg/ml、粒子径350nm、
0.1%スキムミルク-PBS)を、EIAではHRP標識抗体溶液(0.
05vol% Tween20-PBSで抗体濃度を3μg/mlに希釈)を加え
て室温で1 時間インキュベートした。洗浄は、1%スキム
ミルク-PBS(10分×3回)で行った。発色は、リン脂質膜
透過性の基質4-CNを含む溶液(O.5mg/mlの4-CN、0.015%
のH₂0₂ および17% メタノールを含有するPBS溶液)を添
加し、30分後の発色状況を観察した。

【００８５】HRPを含有する抗体結合リポソームを使用
した本発明のLIAでは、0.02 ng のIgM（0.02 fmol）と
非常に低量のIgMまで検出されるが、抗体-HRP融合体を
用いた、従来のEIAでは2 ng のIgMと100倍の量のIgMが
存在しないと検出できなかった。

【００８６】即ち、本発明のLIAにより、従来のEIAと比
較しおよそ100倍感度が向上し、アルカリホスファター
ゼを用いたウエスタンブロット法の最大感度よりも高い
感度が得られた。

【００８７】更に、従来のEIAにおける発色は、1日後に
色あせたが、本発明のLIAでは、発色は安定していた。
以上、本発明のLIAによれば、高感度かつ安定した膜マ
イクロアレイ測定法を提供することができる。

【００８８】実施例５．ウェスタンブロッテイングへの
応用 0.01 μg/ml〜10 μg/mlの数種のα−キモトリプシノー
ゲンサンプル(サンプル緩衝液で１：３に希釈)15 μlを
SDS-PAGEにアプライし、電気泳動後、α−キモトリプシ
ノーゲンを孔径450nmのPVDF膜に従来法で固定化した。

【００８９】固定化後、該膜をブロッキング溶液でブロ
ックし、１％スキムミルクPBS溶液で洗浄した後、該膜
を、１％スキムミルクPBS溶液に5 μg/ml の濃度で抗α
−キモトリプシノーゲン抗体（ウサギ）を溶解した溶液
と、１時間インキュベートした。１％スキムミルクPBS
溶液で充分洗浄した後、実施例４と同様の方法で、HRP
を含有する抗ウサギIgG抗体結合リポソームまたは抗ウ
サギIgG抗体（ヤギ）-HRPを用いて発色させた。

【００９０】本発明のLIAにおける感度は、従来のEIAよ
りおよそ100倍高い感度を与えた。当然ながら、ウェス
タンブロッティングの感度は、一次抗体の結合親和性に
強く依存するが、本発明のLIAにより、ウェスタンブロ
ッティングにおいて、簡便で高感度の検出法を提供する
ことができた。

【００９１】実施例６．サンプルの添加容量と感度の関
係 PVDF膜（孔径200nm、イムノブロット、Bio-Rad）に、各
濃度が10、1、0.1、0.01、0.001、0μg/mlのα−キモト
リプシノーゲンサンプルを、添加容量をlμlから500μl
（1、5、10、50、100、500μl）まで変化させて固定化
した。

【００９２】固定化後、該膜を用いて、実施例５と同様
の方法でα−キモトリプシノーゲンの検出を行った。そ
の結果、サンプルの添加容量を増加させるに伴い、HRP
含有抗体結合リポソームによる検出感度が増加した。PV
DF膜は吸着量が150〜300μg/cm²であり、希薄なサンプ
ルでも添加容量を増やすことで高感度な分析が可能であ
ることがわかった。

【００９３】実施例７．PVDF膜におけるリポソーム粒子
径と発色感度の関係 PVDF膜（孔径200nm、イムノブロット、Bio-Rad）に各濃
度10、1、0.1、0.01、0.001、0μg/mlのヒトIgM溶液を
５０μｌずつドットブロットした。該ドットブロット済
みのPVDF膜に１次抗体として、３μg/mlの抗ヒトIgM抗
体（ウサギIgG）を添加した。

【００９４】添加後、該膜に、各粒子径が350、200、13
0、60nmのHRP含有抗ウサギIgG抗体（ヤギ）結合リポソ
ーム（抗体濃度 1μg/ml）を作用させ、前記と同様に、
4-CNを含む溶液を添加し、発色状況を観察した。マイク
ロタイタープレートを用いた免疫測定ではリポソームの
粒子径の増加に伴い、高い感度が得られたが、孔径200n
mのPVDF膜を用いた免疫測定では粒子径200nmのLUVs が
最も高い感度を示した。

【００９５】実施例８．孔径200、450nmの二種類のPVDF
膜を用いたEIAの検討孔径200 nm（イムノブロット、Bio-Rad）、450nm（イモ
ビロンＰ、ミリポア）の二種類のPVDF膜に、ヒトIgMを2
00、20、2、0.2、0ngずつドットブロットした。該ドッ
トブロット済みのPVDF膜に１次抗体として、3μg/mlの
抗ヒトIgM抗体（ウサギIgG）を添加した。

【００９６】添加後、該膜に、1μg/ml HRP標識−抗ウ
サギIgG抗体（ヤギ）を添加し、前記と同様に、4-CNを
含む溶液を加え、発色状況を観察した。その結果、EIA
の場合、酵素標識抗体は微小なことから、膜の孔径に対
する発色感度の影響は見られなかった。さらに吸着容量
が多いために、添加した抗体ほぼ完全に膜に吸着してお
り、二種類の膜におけるタンパク固定化量に差はないこ
とが分かった。

【００９７】実施例９．PVDF膜の孔径とリポソームの粒
子径の検出感度における相関孔径200および450nmの二種類の膜、および粒子径200、3
50nmのLUVsを用い、本発明のLIAにおける発色感度を比
較検討した。孔径200 nm（イムノブロット、Bio-Ra
d）、450nm（イモビロンＰ、ミリポア）の二種類のPVDF
膜に、ヒトIgMを200、20、2、0.2、0.02、0.002、0ngず
つドットブロットした。該ドットブロット済みのPVDF膜
に１次抗体として、3μg/mlの抗ヒトIgM抗体（ウサギIg
G）を添加した。

【００９８】添加後、該膜に、各粒子径が350、200の1
μg/ml HRP含有抗ウサギIgG抗体（ヤギ）結合リポソー
ム（抗体濃度 1μg/ml）を作用させ、前記と同様に、4-
CNを含む溶液を加え、発色状況を観察した。その結果、
膜の孔径より粒子径の小さなLUVs、孔径とほぼ同じ粒子
径のLUVs、孔径よりも粒子径の大きなLUVsの順に感度が
下がっていた。このことから、ブロッティング膜細孔径
に応じて適当なリポソーム粒子径が存在することがわか
った。

【００９９】実施例１０．化学発光反応を検出に用いた
本発明のリポソーム免疫ブロット測定法（LIA）２枚のPVDF膜（孔径450nm、イモビロンＰ、ミリポア）
を100％メタノールに30秒間浸し、PBS中で15分間振とう
した。水分をよく切り、パラフィルム上に静置した。膜
が乾かないうちに膜上に各濃度（0、0.0001、0.001、0.
01、0.1、1 ng/μl）のヒトIgMを20μlずつ滴下して膜
内に浸透させ、固定化した。固定化されたIgMの量はそ
れぞれ、0、0.002、0.02、0.2、2、20ngである。膜をPB
S中で10分間振とうして洗浄した後、ブロッキング溶液
（ナカライテスク社、pH7.2）に膜を浸して室温で１時
間インキュベートし、残りの吸着サイトをブロッキング
した。１％スキムミルクPBS溶液で10分間振とうするこ
とを３回繰り返すことにより膜を洗浄した。１次抗体と
して３μg/mlの抗ヒトIgM抗体（ウサギ）を含む１％ス
キムミルクPBS溶液に膜を浸し、室温で１時間インキュ
ベートすることにより、膜上のIgMと反応させた。この
膜を１枚ずつ以下のLIAおよび従来のEIAに用いた。

【０１００】LIAにおいては、１％スキムミルクPBS溶液
で10分間振とうすることを３回繰り返すことにより膜を
洗浄した後、実施例１で作製したHRPを包含した抗ウサ
ギIgG抗体（ヤギ）結合リポソーム（粒子径350nm）を0.
1μg/mlの抗体濃度で含む１％スキムミルクPBS溶液に膜
を浸し、室温で１時間インキュベートすることにより、
膜上の１次抗体と反応させた。膜をPBSで10分間振とう
することを３回繰り返すことにより洗浄した後、化学発
光基質溶液〔10μg/mlルミノール、75μg/ml p-ヨード
フェノール、0.063％H₂O₂を含むTBS（2.4g/l Tris、0.8
g/l NaCl、0.2g/l KCl、pH8.0）〕に一定時間（30秒〜
１分間）膜を浸し、冷却CCDカメラ（東洋紡績株式会
社、FAS-1000）を用いて撮影することにより、シグナル
を検出した。従来のEIAにおいては、１％スキムミルクP
BS溶液で10分間振とうすることを３回繰り返すことによ
り膜を洗浄した後、0.05％ Tween20を含むPBSで64,000
倍に希釈した、標識酵素結合抗体である抗ウサギIgG抗
体（ヤギ）-HRP（抗体濃度として約74ng/ml)に膜を浸
し、室温で１時間インキュベートすることにより、膜上
の１次抗体と反応させた。膜をPBSで10分間振とうする
ことを３回繰り返すことにより洗浄した後、LIAと同じ
手順で化学発光によるシグナルの検出を行なった。

【０１０１】その結果、EIAでは0.2ngのIgMまでしか検
出できなかったのに対し、LIAでは0.02ngのIgMまで検出
できた。したがって、リポソームの脂質膜を透過可能
な、HRPの基質であるH₂O₂、化学発光基質のルミノー
ル、およびエンハンサーとなるp-ヨードフェノールを用
いることにより、本発明のLIAにおいて、化学発光によ
っても非常に高感度でシグナルの検出を行なうことが可
能であった。

【０１０２】

【発明の効果】本発明により、ドットブロッティング法
やウエスタンブロッティング法などの膜を用いたアッセ
イにおいても、拡散等による感度低下や輪郭がぼやける
ことなく、EIAよりも高い感度で被検物質を検出可能
な、方法および該方法に基づくキットを提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のリポソーム免疫ブロット測定法と従来
の免疫ブロット測定法の概略図である。

【符号の説明】

１抗原２膜３一次抗体４リポソーム５基質６標識酵素７発色物質８標識酵素結合抗体

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リポソームを用いる被検物質を検出する
方法において、リポソームが該被検物質を特異的に認識
する物質を表面に有しかつ標識物質を内包したリポソー
ムであり、リポソームを破壊する工程を有することなく
該被検物質を検出することを特徴とする検出法。
【請求項２】リポソームに被検物質を認識させた後、
リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と反応し
て検出が可能になり得る物質を添加することを特徴とす
る請求項１記載の検出法。
【請求項３】リポソームを用いる被検物質を検出する
方法において、該被検物質を特異的に認識する物質を表
面に有しかつ標識物質を内包したリポソームに被検物質
を認識させた後、該リポソームの脂質膜を透過可能でか
つ標識物質と反応して検出が可能になり得る物質を添加
することを特徴とする検出法。
【請求項４】被検物質が、担体に固定化された被検物
質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出
法。
【請求項５】被検物質と、リポソームの表面に存在す
る該被検物質を特異的に認識する物質との関係が、免疫
学的な関係にあることを特徴とする請求項１〜３のいず
れか１項に記載の検出法。
【請求項６】免疫学的な関係が抗原と抗体の関係であ
ることを特徴とする請求項５記載の検出法。
【請求項７】被検物質と、リポソームの表面に存在す
る該被検物質を特異的に認識する物質が、酵素と基質、
酵素と阻害剤、ホルモンと受容体、レクチンと糖鎖、DN
AとRNA、DNAとDNA、血清アルブミンと色素ブルー、酵素
と補酵素、およびタンパク質とコンビナトリアルリガン
ドペプチドの群より成る組み合わせから選ばれる組み合
わせの関係を有することを特徴とする、請求項１〜３の
いずれか１項に記載の検出法。
【請求項８】酵素と補酵素の組み合わせが、酸化還元
酵素と補酵素NADHの組み合わせである、請求項７記載の
検出法。
【請求項９】リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標
識物質と反応して検出が可能になり得る物質が、さらに
該標識物質との反応によりリポソームの脂質膜に不透過
となり得るものであることを特徴とする請求項２または
３記載の検出法。
【請求項１０】リポソームを用いる被検物質を検出す
る方法が、ドットブロッティング法、ウェスタンブロッ
ティング法、サザンブロッティング法およびノーザンブ
ロッティング法から選ばれる方法である請求項１〜３の
いずれか１項に記載の検出法。
【請求項１１】被検物質が抗原であり、該被検物質を
特異的に認識する物質が抗体であるか、または被検物質
が抗体であり、該被検物質を特異的に認識する物質が抗
原であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項
に記載の検出法。
【請求項１２】被検物質が抗原であり、リポソームの
表面に存在する該被検物質を特異的に認識する物質が、
前記被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識するこ
とのできる抗体（二次抗体）であり、該被検物質に一次
抗体を認識させた後に、該リポソームを添加することを
特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出
法。
【請求項１３】標識物質が酵素であることを特徴とす
る請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出法。
【請求項１４】酵素が西洋わさびペルオキシダーゼで
あることを特徴とする請求項１３記載の検出法。
【請求項１５】リポソームの脂質膜を透過可能でかつ
前記標識物質と反応して検出が可能になり得る物質が、
４−クロロ−１−ナフトールであることを特徴とする請
求項２または３記載の検出法。
【請求項１６】前記リポソームの脂質膜を透過可能で
かつ前記標識物質と反応して検出が可能になり得る物質
が、ルミノールおよび過酸化水素から構成されることを
特徴とする請求項２または３記載の検出法。
【請求項１７】検出時にエンハンサーを用いることを
特徴とする請求項１６記載の検出法。
【請求項１８】エンハンサーがp-ヨードフェノールで
ある、請求項１７記載の検出法。
【請求項１９】担体が、膜状、チップ状、アレイ状お
よびビーズ状のいずれかの状態である、請求項４記載の
検出法。
【請求項２０】担体が、ポリビニリデンフルオリド、
ニトロセルロース、またはナイロンであることを特徴と
する請求項１９記載の検出法。
【請求項２１】担体が細胞である、請求項４記載の検
出法。
【請求項２２】担体の孔径が、前記リポソームの粒子
径よりも大きいことを特徴とする請求項４記載の検出
法。
【請求項２３】被検物質を特異的に認識する物質を表
面に有しかつ標識物質を内包したリポソーム、および該
リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識物質と反応し
て検出が可能になり得る物質を含む、被検物質を検出す
るためのキット。
【請求項２４】被検物質を固定化するための担体、被
検物質を特異的に認識する物質を表面に有しかつ標識物
質を内包したリポソーム、および該リポソームの脂質膜
を透過可能でかつ標識物質と反応して検出が可能になり
得る物質を含む、被検物質を検出するためのキット。
【請求項２５】被検物質を認識する抗体（一次抗
体）、被検物質を認識する抗体（一次抗体）を認識する
ことのできる抗体（二次抗体）を表面に有しかつ標識物
質を内包したリポソーム、および該リポソームの脂質膜
を透過可能でかつ標識物質と反応して検出が可能になり
得る物質を含む、被検物質を検出するためのキット。
【請求項２６】被検物質を固定化するための担体、被
検物質を認識する抗体（一次抗体）、被検物質を認識す
る抗体（一次抗体）を認識することのできる抗体（二次
抗体）を表面に有しかつ標識物質を内包したリポソー
ム、および該リポソームの脂質膜を透過可能でかつ標識
物質と反応して検出が可能になり得る物質を含む、被検
物質を検出するためのキット。