CN104977277A - 一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，所述囊泡内部包裹有能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金，同时囊泡表面修饰有异硫氰酸荧光素标记的抗变异p53蛋白抗体。本发明的优点在于：(1)纳米囊泡高特异性识别不同类型肿瘤抑制蛋白p53，提高了检测的特异性和灵敏度。(2)采用等离子体共振成像以及荧光成像技术，待囊泡进入细胞后，利用显微镜对细胞进行原位成像，实现了单细胞层面上野生型和变异p53蛋白的同时检测。(3)本发明设计的纳米囊泡可以对药物作用下细胞内p53蛋白表达的变化进行原位监测，为研究其参与的细胞内生理过程提了供新方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞活体成像分析技术、暗场显微技术和纳米材料制备领域，具体地说，涉及一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡及其应用。
背景技术
近年来，等离子体纳米粒子引起了广泛关注，这些纳米粒子具有特殊的光学和物理性质，能有效吸收并散射可见光，引起金属表面等离子共振。得益于暗场显微镜和等离子体共振瑞利散射光谱的发展，等离子体纳米粒子已经被成功用于生物传感、单颗粒分析、药物运输等多个研究领域。研究表明，等离子体纳米探针已经成为研究生命体尤其是细胞的有力工具，可用于细胞成像、细胞表面识别、穿膜运输等。
肿瘤抑制蛋白p53可通过对细胞周期进行调控引发细胞凋亡，抑制肿瘤的发生和发展。在大部分肿瘤细胞中，p53蛋白的结构发生突变，活性受到抑制。因此对不同类型的p53进行细胞内原位分析和检测，对肿瘤的诊断、治疗和实时监测具有重要的意义。
目前，多种检测p53蛋白的方法已被提出。其中传统检测方法是通过免疫组织化学法(IHC)或者酶联免疫反应(ELISA)检测血清中肿瘤抑制蛋白的含量。免疫组织化学法应用比较广泛，但其主要缺陷是不同批次之间染色差异较大，重复性差。酶联免疫反应方法利用抗原抗体夹心反应检测目标蛋白，具有较好的稳定性，但该方法操作步骤繁琐，灵敏度不高。电化学纳米传感方法灵敏度高，重复性好，但该方法通常采用血清或者细胞提取物作为分析对象，因此无法实现p53蛋白的原位分析和检测，无法得到单细胞层面上p53蛋白的具体位置和分布情况。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡。
本发明的第二个目的在于提供一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，其特征在于，所述囊泡内部包裹有能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金，同时囊泡表面修饰有异硫氰酸荧光素标记的抗变异p53蛋白抗体。
作为一个优选方案，所述能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金通过含有野生型p53蛋白识别位点的双链DNA溶液与55-65nm的纳米金溶液混合搅拌获得。纳米金的粒径优选为60nm。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：的纳米囊泡在活细胞内p53蛋白的成像检测中的应用，以及，纳米囊泡在制备活细胞内p53蛋白的成像检测试剂中的应用。
该囊泡进入细胞后，释放出内部的纳米金，纳米金与细胞内野生型p53蛋白的结合会引发纳米金的聚集，不同浓度的野生型p53蛋白引起的纳米金的聚集程度不同，其散射光的波长不同，暗场散射光谱也是有变化的。因此，可通过暗场显微镜来观察纳米金散射光颜色的变化并采集其散射光谱，从而对纳米金的聚集程度进行表征，进而得到细胞内野生型p53蛋白的分布信息。
同时，囊泡表面修饰的FITC(异硫氰酸荧光素)标记抗变异p53蛋白抗体可以识别细胞内的变异p53蛋白，其荧光信号强度与细胞内变异p53蛋白的浓度成正比。因此，可通过荧光显微镜得到细胞荧光图像，从而对细胞内变异p53蛋白的分布进行观察和表征。
本发明的优点在于：(1)针对传统方法操作复杂、特异性与重复性不高的问题，本方法提供了一种高特异性识别不同类型肿瘤抑制蛋白p53的纳米囊泡，提高了检测的特异性和灵敏度。(2)针对p53蛋白单细胞层面分析手段缺乏的问题，本发明采用等离子体共振成像以及荧光成像技术，待囊泡进入细胞后，利用显微镜对细胞进行原位成像，实现了单细胞层面上野生型和变异p53蛋白的同时检测。(3)本发明设计的纳米囊泡可以对药物作用下细胞内p53蛋白表达的变化进行原位监测，为研究其参与的细胞内生理过程提了供新方法。
附图说明
图1为同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡的制备及其工作原理图。
图2为不同浓度nutlin-3(A1-5:0,B1-5:62.5μg mL-1,C1-5:125μgmL-1,D1-5:250μg mL-1)处理过的HeLa细胞与纳米囊泡及DAPI温育2小时后的显微图像(1:暗场图像,2:明场图像,3:DAPI染细胞核,4:FITC标记抗变异p53蛋白抗体的荧光图像,5:暗场图像的细节放大)，i1-i12:细胞内对应的纳米金的暗场散射光谱。
图1中的标号分别为：
1、纳米囊泡； 2、纳米金； 3、十一醛；
4、FITC标记抗变异p53蛋白抗体； 5、细胞膜。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.合成可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡
(1)根据已有文献，合成13nm金胶作为种子。将50mL HAuCl4(0.01％)溶液加入圆底烧瓶中加热至沸腾，然后快速加入5mL柠檬酸钠溶液(38.8mM)并且持续搅拌30分钟，直到溶液变成红色，得到的13nm金种被用来制备粒径在60nm左右的纳米金。
(2)利用金种合成60nm的纳米金。将1mL金种溶液与100μLNH2OH·HCl(0.2M)混合后用纯水稀释至25mL，之后将3.0mLHAuCl4(0.01％)缓慢逐滴加入上述混合溶液中，持续搅拌30分钟直到溶液变成暗红色。将得到的纳米金溶液离心，用纯水洗涤，于4℃条件下保存。
(3)用60nm的纳米金合成能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金。将10μL含有野生型p53蛋白识别位点的双链DNA溶液(100μM)与1mL纳米金溶液混合，在室温下搅拌过夜，然后将0.1mL PBS缓冲液(含2M NaCl)逐滴加入上述溶液中得到稳定的DNA修饰的纳米金。将上述溶液离心并用PBS洗涤两次，最后重新分散在1mLPBS中得到DNA功能化的能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金。
(4)制备可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡。将(3)中制备的DNA修饰的纳米金溶液(20μL)与20μL无血清培养基混合；另外将1.0μL Lipo-2000脂质体与20μL无血清培养基混合。在室温下静置10分钟后，将上述两种溶液混合然后室温孵育20分钟，得到包裹有纳米金的脂质体。然后将1.0μL十一醛加入上述溶液，室温下反应10分钟，接着加入1mg FITC标记抗变异p53蛋白抗体，于4℃下静置过夜。将上述溶液离心并用PBS洗涤，然后分散在60μL无血清培养基中，得到纳米囊泡。
实施例2.利用纳米囊泡，对细胞内p53蛋白的分布进行原位成像和检测
利用HeLa宫颈癌细胞系作为模型，首先将HeLa细胞(1.0mL,1×106mL-1)种在共聚焦培养皿中，培养24小时。然后将60μL纳米囊泡加入培养皿，在37℃下温育2小时。用PBS洗涤培养皿并且将细胞浸没，然后在暗场显微镜以及荧光显微镜下观察。细胞成像参见图2。发现在肿瘤细胞HeLa中，暗场图像中纳米金的颜色为绿色，没有明显聚集，说明野生型p53的含量较低；而FITC的荧光信号较强，说明变异p53的含量较高。用nutlin-3药物溶液(250μgmL-1)对细胞(1.0mL,1×106mL-1)进行预处理，将细胞与药物共培养48h，然后加入60μL纳米囊泡，37℃下温育2小时后用显微镜观察，发现药物处理过的细胞中，纳米金的颜色明显偏橙红色，而FITC荧光信号明显降低，说明细胞内野生型p53的活性增高而变异p53的活性受到抑制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，其特征在于，所述囊泡内部包裹有能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金，同时囊泡表面修饰有异硫氰酸荧光素标记的抗变异p53蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，其特征在于，所述能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金通过含有野生型p53蛋白识别位点的双链DNA溶液与55-65nm的纳米金溶液混合搅拌获得。
3.根据权利要求2所述的一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，其特征在于，所述纳米金的粒径为60nm。
4.权利要求1所述的纳米囊泡在活细胞内p53蛋白的成像检测中的应用。
5.权利要求1所述的纳米囊泡在制备活细胞内p53蛋白的成像检测试剂中的应用。
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