JP2002241307A - 光増感剤を含有する超音波治療用活性酸素発生剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 身体の深部においてもフラーレンなどの光増
感剤に活性酸素を発生させることができるため、光照射
が不可能な身体深部のがん、ウィルス感染症、細胞内寄
生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、
及び血管狭窄病変の治療にも用いることができる超音波
治療用活性酸素発生剤を提供する。 【解決手段】 光増感剤を含有する超音波治療用活性酸
素発生剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超音波を照射する
ことによってフラーレン及びポルフィリン誘導体などの
光増感剤に活性酸素を発生させる、光増感剤を含有する
超音波治療用活性酸素発生剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】一重項酸素などの活性酸素は、反応性に
富み、細胞のＤＮＡを切断し、細胞増殖を抑制し、タン
パク質分解酵素の活性を阻害するなどの細胞毒性を示す
ことから、がん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染
症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管
狭窄病変などの各種疾患における効果が期待されてい
る。このような活性酸素は、各種光増感剤に可視光を照
射することにより発生することが知られており、このよ
うな光増感剤としては、フラーレン、ポルフィリン誘導
体などがある。しかしこれらの光増感剤に活性酸素を発
生させるには、光照射が必須であるため、上記のような
疾患においても、光照射が可能な部位における疾患（例
えば、皮膚がん、気管がん、食道上皮がんのような体及
び粘膜表面のがん）にその適用が限られていた。例えば
上述の他の疾病に対しても、その病巣が臓器組織の内部
に位置していることから光照射が有効ではなかった。そ
のため、光照射が不可能な身体深部の疾患においても光
増感剤に活性酸素を発生させることができる光増感剤含
有活性酸素発生剤の開発が求められていた。

【０００３】また光増感剤の一つであるフラーレンに関
しては、Ｃ_n（炭素）クラスターの総称であり、ｎの数
に応じてＣ₆₀、Ｃ₇₀などの純炭素物質、又は金属（もし
くは金属酸化物）を内包した炭素クラスターなどの化合
物があることが知られている（化学、50(6), 1995を参
照）。フラーレン自体は、水不溶性であるため、生体内
への投与が困難である。一方、がん組織には、正常組織
と比べてその組織構造の違いから、高分子物質が移行し
やすく、またがん組織に長く滞留する傾向がある。この
ため生体内への投与を可能とするように水溶性を付与す
るとともに、がん組織に特異的に移行し、滞留する特性
を付与することによって、正常組織が活性酸素の細胞毒
性を被ることによる副作用を軽減するために、各種水溶
性高分子をフラーレンと結合させることが検討されてい
る。このような水溶性高分子としては、ポリエチレング
リコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、プル
ラン、デンプン誘導体、及びこれらの高分子の誘導体を
用いることが提案されている（BIO INDUSTRY, Vol. 14,
No. 7, pages 30-37, 1997、特開平９−２３５２３５
号を参照）。

【０００４】一方、超音波照射に関しては、液体に超音
波を照射すると、液体内部に泡が生成（cavitation）
し、この生成した泡が壊れる際に、局所的に熱、圧力な
どが発生する。これによりラジカル（・ＯＨなど）が発
生し、このラジカルが、励起状態から基底状態に遷移し
たり、再結合する際に、主として３００〜６００nmの波
長範囲を有する光が出る（この現象は、ソノルミネッセ
ンスと称される）ことが知られている（"Sonochemistr
y", K.S. Suslick, Science, Vol. 247, pages 1439-14
45, 1990を参照）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、光照
射が不可能な身体深部の疾患においてもフラーレンなど
の各種光増感剤に活性酸素を発生させることができる光
増感剤含有活性酸素発生剤のシステムの開発が求められ
ていた。本発明者らは、このようなシステムを開発する
ために鋭意研究を行った結果、生体に光増感剤を投与
後、生体に超音波照射を行なうと、ソノルミネッセンス
により生じた主として３００〜６００nmの波長範囲を有
する光によって光増感剤が活性酸素を発生することを発
見し、本発明を完成させるに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、水溶性高分子
と複合化したフラーレンなどの光増感剤を含有する、超
音波治療用活性酸素発生剤に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】上述したように、本発明の超音波
治療用活性酸素発生剤は、超音波を照射した際に生じる
ソノルミネッセンス（光生成現象）を利用して、生体内
において光増感剤に活性酸素を発生させ、それによって
がん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維
症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変な
どの病巣の細胞を破壊させるというものである。

【０００８】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含
有される光増感剤としては、ソノルミネッセンスにより
活性酸素を発生することができる光増感剤であればいか
なる光増感剤をも使用することができ、具体的には、水
溶性高分子と複合化したフラーレン及び各種ポルフィリ
ン誘導体のほか、従来光増感剤として使用されている、
アクリジン、ローズベンガル、アクリジンオレンジ、硫
酸ベルベリン、フルオレセイン、テトラサイクリン、エ
オシンＹ、ＮＴＳ、プソラレン、ボネリン、フェオフォ
ルミド、クロリンｅ６、メソテトラ（ヒドロキシフェニ
ル）クロリン、フタロシアニン、プルプリン、５−アミ
ノラエブリン酸（ＡＬＡ）、ＨＡＴ−ＤＯ１（マグネシ
ウム 塩素−塩素二量体）など各種の光増感剤を挙げる
ことができる。ポルフィリン誘導体としては、ポルフィ
マーナトリウム（フォトフリン（登録商標））、ヘマト
ポルフィリン、メタロポルフィリン、硫酸テトラフェニ
ルポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリ
ン、コプロポルフィリン、ジヘマトポルフィリンエーテ
ル（ＤＨＥ）、ベンゾポルフィリン（ＢＰＳ）、ＡＴＸ
−７０（ガリウム−プロフィリン錯体）、ＡＴＸ−Ｓ１
０（four-formyloximethylidene-3-hydroxy-2-vinyl-de
uterio porphynyl(IX)-6-7-bisaspartic acid）などを
挙げることができる。各種ポルフィリン誘導体のなかで
も、特にポルフィマーナトリウムを好ましく使用するこ
とができる。

【０００９】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含
有される光増感剤の一つである水溶性高分子と複合化し
たフラーレンとは、本来水に不溶性であるフラーレン
を、水溶性高分子と化学結合、又は分子間力による物理
的結合により複合化したものであり、水溶性高分子と複
合化させることによって水溶性を付与されている。この
フラーレンとしては、その種類で特に限定されるもので
はなく、活性酸素を発生するものであればいかなる種類
のものも使用しうるが、ｎ＝６０の純炭素物質Ｃ ₆₀フラ
ーレン、Ｃ₇₀フラーレン、やはり純炭素物質であるナノ
チューブフラーレン、そして各種高次フラーレンなどを
用いることができる。なかでも供給及び取り扱いの容易
さの点から、ナノチューブ及びＣ₆₀フラーレンを用いる
のが好ましい。特に、従来の炭素線維よりも細く、ほぼ
完全にグラファイト化し（グラファイトの各層が入れ子
構造的に積層している）、先端部は五員環が入ることに
より閉じており、それぞれの層は、螺旋構造を有してい
るナノチューブ（フラーレンの化学と物理、篠原他著、
名古屋大学出版界）を好ましく使用することができる。
これらの各種フラーレンは、市販されており、例えば本
荘ケミカル、三菱商事、東京化成工業などから入手可能
である（商品名：Ｃ₆₀フラーレン、Ｃ₇₀フラーレン、マ
ルチウオールナノチューブ、シングルウオールナノチュ
ーブなど）。

【００１０】また、上記のフラーレンに水溶性を付与す
るためにフラーレンと複合化している水溶性高分子とし
ては特に限定されるものではなく、市販されている各種
水溶性高分子を使用することができる。なかでも、ポリ
エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドンのような非イ
オン性水溶性合成高分子；デキストラン；プルラン；デ
ンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びヒドロキシプロ
ピルデンプンのようなデンプン誘導体を含む非イオン性
水溶性高分子；アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；
キチン誘導体；並びにこれらの高分子のアニオン性又は
カチオン性誘導体、及びこれらの高分子の２成分又は３
成分の共重合体を用いることができる。なかでもフラー
レンと共通溶媒を持ち、フラーレンとの複合化反応に関
与する官能基が分子末端のみにあり、化学結合様式が単
純であるなどの理由から、ポリエチレングリコールを好
ましく用いることができる。

【００１１】これらの水溶性高分子の分子量は、特に限
定されるものではないが、１，０００〜１，０００，０
００のもの、好ましくは５，０００〜５０，０００のも
のを用いることができる。

【００１２】水溶性高分子としては、分子量１，０００
〜１，０００，０００、特に５，０００〜１５，０００
のポリエチレングリコールを用いるのが特に好ましい。

【００１３】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤にお
いてフラーレンと複合化させるために使用しうる水溶性
高分子は、フラーレンと複合化させるための官能基を有
しており、水溶性高分子は、官能基を介してフラーレン
と複合化している。このような官能基としては、フラー
レンとの複合化を可能とするようないかなる官能基も用
いることができ、アミノ基、水酸基、シアノ基、カルボ
キシル基などの求核置換反応性を有する官能基を挙げる
ことができる。なかでもアミノ基を好ましく使用するこ
とができる。例えばアミノ基を用いてフラーレンを化学
結合により水溶性高分子と結合させる場合は、フラーレ
ンの二重結合へのアミノ基の付加反応により、フラーレ
ンが水溶性高分子と結合する。このような官能基は、フ
ラーレンとの複合化に適した箇所であれば水溶性高分子
の分子内のいかなる箇所に存在してもよいが、複合化の
しやすさを考慮して、水溶性高分子の末端に位置するの
が好ましい。このような官能基を有しない水溶性高分子
を用いる場合には、フラーレンとの複合化の前にまず官
能基を導入しておくことが必要である。また、フラーレ
ンと複合化させるために使用しうる水溶性高分子は、ア
ミノ基などの官能基に加えて、フラーレンと反応しない
官能基、なかでもメトキシのようなＣ_1-6アルコキシ基
を更に有しているのが望ましい。水溶性高分子の片端に
アミノ基のような官能基がある場合、もう一方の末端に
もフラーレンと結合する官能基が存在すると、水溶性高
分子の両端がフラーレンと複合化することにより、フラ
ーレンと水溶性高分子の集合体が生成してしまうが、こ
のような集合体は、分子量が大きくなるために十分な水
溶性を有しなくなる。したがって、フラーレンと複合化
させるために使用しうる水溶性高分子は、アミノ基など
の官能基に加えて、メトキシのようなフラーレンと反応
しない官能基を更に有しているのが望ましい。ただし、
両端にアミノ基などの官能基を有するポリエチレングリ
コールであっても、生成されるフラーレンと水溶性高分
子の集合体が、十分な水溶性を有する場合であれば、使
用することができる。

【００１４】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含
まれる増感剤の一つである水溶性高分子と結合したフラ
ーレンの構造の一例を図１に示す。例示したのは、Ｃ₆₀
フラーレンに、片端にアミノ基を有し、もう一方の端に
メトキシ基を有するポリエチレングリコールを結合させ
たものである。

【００１５】上述したように本発明の超音波治療用活性
酸素発生剤に増感剤として含まれる水溶性高分子と複合
化したフラーレンは、生体への投与が可能な程度の水溶
性を有していればよい。水溶性が低い場合、水溶性高分
子と複合化したフラーレンは、凝集塊を形成するが、そ
の塊の粒径は、がんなどの組織への移行と集積のし易さ
を考慮すると、４００nm以下である必要があるため、こ
れ以上の凝集塊を形成しない程度の水溶性を有する必要
がある。このような溶解度を達成するために必要なフラ
ーレン：水溶性高分子の配合モル比は、用いる水溶性高
分子の種類、水溶性高分子中のアミノ基などの官能基の
含有率によっても異なる。例えば１分子当たり１個のア
ミノ基を有する分子量５，０００〜１５，０００のポリ
エチレングリコールを用いる場合には１：０．１〜１：
１５０の範囲であるのが好ましい。なかでも良好な水溶
性を得るためには、１：５０〜１：１５０のモル比が特
に好ましい。

【００１６】光増感剤として水溶性高分子と化学的に結
合したフラーレンを含有する本発明の超音波治療用活性
酸素発生剤を製造するには、遮光条件下にて、所望の溶
解度を達成するのに必要なモル比のフラーレン及び官能
基を有する水溶性高分子を、有機溶媒に溶解し、撹拌
し、フラーレンと水溶性高分子を官能基を介して結合さ
せることによって得ることができる。有機溶媒として
は、ベンゼン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフ
ラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなど、なかでもベ
ンゼンを好ましく用いることができる。反応温度は、約
４〜４０℃、好ましくは約２５℃であり、反応時間は、
約６〜４８時間、好ましくは約２４時間である。得られ
た反応生成物は、疎水性又はアフィニティクロマトグラ
フィーなどによる精製後、凍結乾燥することにより回収
することができる。また水溶性高分子と分子間力により
物理的に結合したフラーレンを含有する超音波治療用活
性酸素発生剤を製造するには、所望の溶解度を達成する
のに必要なモル比のフラーレン及び官能基を有する水溶
性高分子を混合すればよい。この場合も混合することに
より得られた凝集塊は、組織への移行のし易さなどの点
から、４００nm以下の粒径を有しているのが望ましい。

【００１７】なお上述したように、光増感剤として水溶
性高分子と複合化したフラーレンを含有する本発明の超
音波治療用活性酸素発生剤を製造するために使用する水
溶性高分子は、フラーレンとの複合化を可能とするよう
に、アミノ基などの官能基を有している必要がある。官
能基を有しない水溶性高分子を用いる場合には、フラー
レンとの複合化の前にまず官能基を導入することが必要
である。例えば水酸基のみを有する水溶性高分子にアミ
ノ基を導入するには、過ヨウ素酸酸化法、塩化シアヌル
法、臭化シアン法、又はエピクロロヒドリン法などによ
り水溶性高分子の水酸基と、アルキルジアミン、リシ
ン、リシンのエステル化合物のような一分子中にアミノ
基を２個以上有するアミノ化合物との間に化学結合を形
成させ、高分子側鎖にアミノ基を導入する。またカルボ
キシル基を有する水溶性高分子においては、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド・カルボジイミド、カルボジイミ
ド、クロロ炭酸エチルなどを用いたカルボキシル基とア
ミノ化合物との間の結合反応によりアミノ基を高分子側
鎖に導入する。例えばポリエチレングリコールにアミノ
基を導入するには、両末端ＣＯＯＨを有するポリエチレ
ングリコールをpH５．０のリン酸緩衝液（１０重量％）
に溶解させ、そこへ水溶性カルボジイミドをＣＯＯＨに
対して３倍モル量投入し、室温で１時間撹拌することに
より、カルボキシル基を活性化する。その後、エチレン
ジアミンをＣＯＯＨに対して１０倍モル量加え、更に室
温で６時間反応させる。得られた反応液を水に対して透
析することにより両末端にアミノ基が導入されたポリエ
チレングリコールを得ることができる。また、片端にア
ミノ基が、もう一方の片端にメトキシ基が導入されたポ
リエチレングリコールは、日本油脂株式会社から入手可
能である。

【００１８】上記のようにして得られた光増感剤として
水溶性高分子と複合化したフラーレンを含有する本発明
の超音波治療用活性酸素発生剤は、フラーレンが水溶性
高分子と複合化しているため、生体に投与するのに十分
な水溶性を有すると共に、がん組織や炎症組織への高い
移行性、滞留性を有する。

【００１９】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含
まれる光増感剤は、生体への投与を可能とする程度の水
溶性を有しているが、水溶性高分子と複合化したフラー
レン以外の光増感剤も、必要に応じて水溶性高分子と結
合させることによって、がん組織や炎症組織への移行
性、滞留性を高めることができる。この場合は、フラー
レンと複合化させた水溶性高分子について例示したのと
同じ各種水溶性高分子を使用することができる。これら
の光増感剤は、有機化学の分野において従来使用されて
いる方法で水溶性高分子と結合させることができる。

【００２０】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に含
まれるフラーレンなどの光増感剤は、超音波照射により
惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光によ
り水性媒体中で一重項酸素などの活性酸素を発生させる
ことにより細胞毒性を示すため、がんを含む各種疾患の
治療に使用することができる。照射する超音波は、周波
数約１００KHz〜２０MHz、特に約１〜３MHzのものを好
ましく使用することができる。照射は、約０．１〜５Wa
tt/cm²、なかでも約２Watt/cm²の出力で行うのが好まし
い。Duty cycleは、約１〜１００％、好ましくは約１０
％である。照射時間は、用いる周波数、照射出力によっ
ても異なるが、約５〜３００秒、好ましくは約３０〜１
２０秒である。

【００２１】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、
活性酸素が細胞毒性を示すあらゆる種類のがん、ウイル
ス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢
性腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの治療に有効
である。例えばがんとしては、肺がん、肝がん、膵が
ん、胃腸がん、膀胱がん、腎がん、脳腫瘍のような臓器
の表層及びその内部に発生するあらゆる固形がんを挙げ
ることができる。なかでも光照射が不可能であり従来は
光線力学的治療が不可能であった身体深部のがんの治療
に有効に用いることができる。その他の疾病について
は、その病巣又は感染細胞（罹患細胞）が臓器内部に位
置しているので、光増感剤をその部位に適当な方法によ
って集積させた後、そこに外部より超音波照射すること
によって治療を行うことができる。

【００２２】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤は、
注射剤（静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内など）、
分散剤、流動性剤、固形粉末剤などのあらゆる剤型とす
ることができる。例えば注射剤とする場合には、本発明
の超音波治療用活性酸素発生剤を、注射剤に一般に用い
られる緩衝剤、生理食塩水、保存剤、注射用蒸留水など
の各種添加剤を配合して注射剤とすることができる。本
発明の超音波治療用活性酸素発生剤の投与量は、投与経
路、患者の年齢、性別、疾患の種類及び状態によっても
異なるが、成人１日当たり約１〜１０mg/kgを１〜数回
に分けて投与することができる。

【００２３】上述したように、がん組織や炎症組織に
は、正常組織と比較して高分子物質が移行しやすく、か
つ蓄積しやすい。したがって、水溶性高分子と複合化又
は結合した光増感剤を含有する本発明の超音波治療用活
性酸素発生剤は、生体に投与されると、正常組織に比べ
てがん組織や炎症組織に集積され、正常組織におけるよ
りも高濃度で長くがん組織や炎症組織に滞留する。一
方、正常組織においてはがん組織や炎症組織におけるよ
りも速やかに本超音波治療用活性酸素発生剤が排泄され
るため、本超音波治療用活性酸素発生剤を生体に投与
後、ある程度の時間をおけば、がん組織や炎症組織にお
ける本超音波治療用活性酸素発生剤の濃度は、正常組織
における濃度よりも有意に高いものとなり、本超音波治
療用活性酸素発生剤ががん組織や炎症組織に特異的に高
濃度で分布することになる。したがって、本超音波治療
用活性酸素発生剤を生体に投与後、ある程度の時間をお
いた後に生体に超音波を照射すれば、超音波照射により
惹起されたソノルミネッセンスによって発生する光によ
り光増感剤が一重項酸素などの活性酸素を発生させるこ
とによりがん組織や炎症組織において特異的に抗がん活
性や抗炎症活性が示される。一方、正常組織において
は、本超音波治療用活性酸素発生剤の濃度は低くなって
いるため、正常組織に対する細胞毒性はがん組織や炎症
組織におけるほどは高くなく、正常組織における副作用
が軽減されることが期待される。

【００２４】ヒトにおいて本発明の超音波治療用活性酸
素発生剤の投与後、がん組織や炎症組織での光増感剤の
濃度が正常組織での濃度よりも有意に高くなり、超音波
照射が可能になるまでの時間は、個々の患者の治療部位
における代謝の状態、光増感剤の分布の時間変化などに
よって異なるが、一般的には投与の約０．１〜４８時間
後、特に約２４時間後に超音波照射を行うのが好まし
い。ヒトに照射するには、前述したような周波数の超音
波を、前述したような出力、時間で照射する。したがっ
て、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤を用いて治療
を行なうには、本発明の超音波治療用活性酸素発生剤
を、例えば注射剤の剤型で患者に投与し、約０．１〜４
８時間後に、超音波発生装置を用いて超音波照射を行な
う。投与量、及び投与／照射の頻度、回数などは、患者
の年齢、体重、性別、疾患の種類及び状態などに応じて
決定することができる。

【００２５】また、水溶性高分子と複合化又は結合して
いない光増感剤を含有する本発明の超音波治療用活性酸
素発生剤は、がん組織や炎症組織に特異的に移行、蓄積
されるわけではないが、目標とする組織や細胞へ本発明
の超音波治療用活性酸素発生剤を送達する任意の方法、
例えばドラッグデリバリーシステムにより特異的に送達
する方法を用いることにより、目標とする組織や細胞で
その細胞毒性作用を示させることが可能である。このよ
うな方法としては、目標とする組織や細胞に本発明の超
音波治療用活性酸素発生剤を直接注入する方法（例えば
内視鏡を用いることで体内のほとんどの部位への送達が
可能である）、目標とする組織や細胞に対する抗体、レ
クチン、細胞接着因子、糖鎖などの細胞認識因子を光増
感剤に結合させた本発明の超音波治療用活性酸素発生剤
を投与する方法などを挙げることができる。また、本発
明の超音波治療用活性酸素発生剤を生体に投与後、光増
感剤に活性酸素を発生させたい箇所のみに超音波照射を
することにより、所望の箇所でのみ活性酸素を発生させ
て細胞毒性を示させることもできる。また、超音波をフ
ォーカシングすることによって、細胞毒性発現部位の選
択性を向上させることも可能である。

【００２６】

【実施例】以下に本発明の超音波治療用活性酸素発生剤
の製造方法、及びその抗がん活性について具体的に説明
するが、これによって本発明の超音波治療用活性酸素発
生剤が限定されるものではなく、これらの説明は、記載
した光増感剤以外の光増感剤や、記載した疾患以外の疾
患についても同様に適用される。製造例１：本発明の超音波治療用活性酸素発生剤の製造 水溶性高分子として、一端にアミノ基、他端にメトキシ
基を有するポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ−Ｎ
Ｈ₂と記載する）（分子量約５，０００、日本油脂製）
及びＣ₆₀フラーレン（東京化成工業製）を用いた。０．
５４mMＣ₆₀フラーレンのベンゼン溶液１０mlに、０〜１
０８mMのＰＥＧ−ＮＨ₂を含むベンゼン溶液１０mlを加
え、遮光条件下、２５℃で２４時間撹拌することによっ
てフラーレンをＰＥＧ−ＮＨ₂と結合させて、フラーレ
ン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体を得た。反応終了後、反応溶
液を凍結乾燥し、フラーレン濃度が０．２７mMとなるよ
うにフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体をベンゼンに溶
解し、等量の蒸留水と混合し、２５℃で４８時間放置す
ることにより、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体を水
で抽出し、水への移行を調べた。水への移行は、抽出前
後のベンゼン溶液の５００nmにおけるフラーレンの吸光
度の変化を測定することにより評価した。その結果、フ
ラーレンに対するＰＥＧ−ＮＨ₂の比率が大きいほど、
フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の水への移行が大き
くなることが認められた。このことより、本来水に不溶
性であったフラーレンが、ＰＥＧ−ＮＨ₂と結合するこ
とにより、水への溶解度が増大し、フラーレンが水可溶
性となることが示された。フラーレンに対するＰＥＧ−
ＮＨ₂の添加モル比が５０以上の場合では、ほぼ１００
％のフラーレンが水相に移行しており、フラーレンの完
全に近い水可溶化が達成されていた。

【００２７】試験例１：in vitro抗がん活性 がん細胞としてＲＬ♂１細胞（京都パスツール研究所よ
り供与）を用い、この細胞を１００mmディッシュにてＲ
ＰＭＩ１６４０培地（コスモ・バイオ社製、305-02-0
1、血清１０％含有）中、５％ＣＯ2、９５％大気、３７
℃の培養条件下で、コンフルエントになるまで培養し
た。製造例１と同様の方法で製造したフラーレン−ＰＥ
Ｇ−ＮＨ₂結合体を遮光下で、がん細胞の培養に用いた
のと同じ組成の培地に溶解し、１０μg/mlの濃度に調整
後、滅菌濾過した。６ウエルプレートの各ウエルに調整
後のフラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体含有培地を１ml
づつ分注した。コントロールのウエルには、結合体を含
まない培地のみを分注した。上記のコンフルエントにな
った細胞を２×１０⁵細胞/mlに調整して細胞懸濁液を
得、上記の各ウエルに細胞懸濁液１mlづつを分注した
（この時点で各ウエルには、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ
₂結合体が１０μg、ＲＬ♂細胞２×１０⁵個、培地が２m
l含まれている）。ウエル中の細胞をピペットで軽く撹
拌した後、伝導ジェルを介して６ウエルプレートの底部
より超音波照射装置（Williams Healthcare Systems: M
ODEL #6100）を用いて超音波を照射した（周波数：１MH
z、出力：２Watt/cm²、照射時間６０秒、Duty cycle：
１０％）。超音波照射後、プレートをアルミホイルで遮
光し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で３
日間培養した。その後細胞係数装置（Cell Counting Ki
t：同仁化学、345-06463）を用いて生存細胞数を測定
し、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体を添加せず、超
音波照射もしなかったコントロールに対する生存細胞数
の割合を％で算出した。その結果、図５に示すように、
フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体１０μg/ウエルの存
在下では、生存細胞数はコントロールに比べて２０％以
下であった。更にウエルに加えるフラーレン−ＰＥＧ−
ＮＨ ₂結合体の量を１．２５、２．５、５又は１０μg/m
l、超音波の周波数を１又は３MHz、照射時間を０〜１２
０秒で変化させて、生存細胞数を計数した。出力及びDu
ty cycleは変化させなかった。結果を図２〜５に示す。

【００２８】図２は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合
体をウエルに添加しない場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存
率を示す（周波数１又は３MHz、照射時間は、白いバー
で３０秒、黒いバーで６０秒）。１MHz、６０秒の照射
で、細胞生存数は、変化していなかった。図３は、フラ
ーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体５μg/ウエルを添加した
場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す（周波数１又は
３MHz、照射時間は、白いバーで３０秒、黒いバーで６
０秒）。１MHz、６０秒の照射で、細胞生存数は、有意
に低下した（３０秒に対してｐ＜０．０５）のが認めら
れる。図４は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体５μg
/ウエルを添加し、１MHzの超音波照射時間を０〜１２０
秒の間で変化させた場合の細胞生存率を示す。照射時間
を長くするにつれて細胞生存率が低下するのが認められ
た。また照射１５分から有意に細胞生存率が低下した。
図５は、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の添加量を
０〜１０μg/ウエルで変化させた場合の細胞生存率を示
す（周波数１MHz、照射時間６０秒）。フラーレン−Ｐ
ＥＧ−ＮＨ₂結合体の添加量が増大するにつれて細胞生
存率が低下したのが認められる。ラーレン−ＰＥＧ−Ｎ
Ｈ₂結合体の濃度１．２５μg/ウエルから有意差が認め
られた。

【００２９】試験例２：in vivo抗がん活性 担がんマウスを作成するために、マウスリンパ腫細胞
（ＲＬ♂１）５×１０⁶個をＲＰＭＩ−１６４０培地１
００μlに懸濁し、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに尾静脈から
投与した。このマウスリンパ腫細胞は、投与後約１０日
でマウスの肝臓に腫瘤を形成し、マウスをがん死させる
モデル系である。製造例１に記載の方法でフラーレン−
ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体を製造し、リンパ腫細胞の投与の
２４時間(日)後に、フラーレン含有量４００μgの結合
体を含む水溶液をマウスの尾静脈から投与した。投与の
２４時間後、皮膚に照射プローベをあてて肝臓部位に体
外から６０秒間超音波を照射し（周波数：１MHz、出
力：２Watt/cm²、duty cycle：１０％）、照射後にマウ
スの死亡日を記録して生存率を求めた。その結果、超音
波の照射によりマウスの生存率の増加が認められた。フ
ラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の投与後超音波照射を
行わなかったマウス群、フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結
合体を投与せずに超音波照射のみを行ったマウス群、及
び投与も照射も行わなかったマウス群では、リンパ腫細
胞の投与約１４日ですべてのマウスが死亡した。フラー
レン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の投与後、超音波照射を行
ったマウス群では、リンパ腫細胞の投与１４日後でも、
照射時間に関係なくいずれの群においてもマウスは生存
しており、超音波照射時間が長くなるにつれてその効果
は大きくなっていると考えられた。

【００３０】試験例３：活性酸素発生試験 チトクローム法により、活性酸素（スーパーオキシドア
ニオン，Ｏ₂ ^-）発生量を測定した。チトクロームＣ３０
μMを含有するハンクス液（ＨＢＳＳ、pH＝７．４、Lif
e Technologies Oriental, Inc., 東京）８００μlを、
製造例１で得たＣ₆₀フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体
のＨＢＳＳ溶液２００μlと混合して、結合体の最終濃
度を２．５μg/mlとした。この溶液に６０秒間超音波照
射した（出力：２W/cm²、周波数：１MHz、duty cycle：
１０％）。２５℃で５分間放置した後、溶液の吸光度を
５５０nmで測定した。各操作は、暗所で行ない、各群毎
に３回実験を行なった。Ｃ₆₀フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ
₂結合体の存在下及び非存在下で超音波照射を行なった
後のＯ₂ ^-発生量を、以下の表に示す。Ｃ₆₀フラーレン−
ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体と超音波照射を行なった場合の
み、有意なＯ₂ ^-発生が観察された。Ｃ₆₀フラーレン−Ｐ
ＥＧ−ＮＨ₂結合体のみで超音波照射を行なわなかった
場合、及びＣ₆₀フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の非
存在下で超音波照射を行なった場合はいずれも、Ｏ₂ ^-は
ほとんど発生しなかった。

【００３１】

【表１】

【００３２】ａ）照射時間：６０秒、出力：２W/cm²、
周波数：１MHz、duty cycle：１０％ ｂ）ＮＤ：検出されず ｃ）平均±ＳＥ ＊、ｐ＜０．０５：超音波照射しない場合のＣ₆₀フラー
レン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体存在下におけるＯ₂ ^-発生量
に対して有意差あり。

【００３３】試験例４：腫瘍に対するＣ₆₀フラーレン−
ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の音波動力学的効果 ＲＬ♂１細胞をin vivo条件に慣らすために、細胞を、
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雌性マウス（Japan SLC、静
岡）に、５×１０⁶細胞／０．２ml培地／マウスの濃度
で静脈内接種した。２週間後にマウスの肝臓を採取し、
肝臓に形成された節から腫瘍細胞を単離した。単離した
細胞を再び同様に接種した。次に得られたＲＬ♂１細胞
を、マウスに、０．２mlの量（５×１０⁶細胞／マウ
ス）を静脈内接種して、肝腫瘍を有するマウスを得た。
腫瘍の接種の１日後、製造例１で得たＣ₆₀フラーレン−
ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体を含有するＰＢＳを、４００μg/
０．２ml/マウスの量で、腫瘍を有するマウスに静脈内
投与した。３０分後、肝臓に超音波を１又は５分間照射
した（出力：２W/cm²、周波数：１MHz、duty cycle：２
０％、）。超音波トランスデューサーチップを腹部の皮
膚に取り付けて、超音波伝導ゲルを介して経皮的肝臓超
音波照射を行なった。マウスは毎日観察して、その生存
期間を記録した。対照群には、Ｃ ₆₀フラーレンを含有し
ないポリエチレングリコールを静脈内注射した後、超音
波を照射し、又は照射しなかった。また、Ｃ₆₀フラーレ
ン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体のみを投与し、超音波照射し
ない実験と、まったく注射せずに超音波照射のみを行な
った実験も行なった。各実験群は、６匹のマウスからな
り、すべてのマウスは、通常の飼料と水を自由に摂取さ
せたが、実験の間は暗所で飼育した。この結果を図６に
示す。図６には、腫瘍を有するマウスに対するＣ₆₀フラ
ーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体の投与とその後の超音波
照射による治療効果を示す。Ｃ₆₀フラーレン−ＰＥＧ−
ＮＨ₂結合体のみを投与した場合と、超音波照射のみを
おこなった場合とでは、マウスの生存期間は延長されな
かった。反対に、Ｃ₆₀フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合
体を投与し、超音波照射を行なった場合では、超音波照
射を肝臓に対して１分間行なった場合で、マウスの生存
期間は有意に延長された。

【００３４】

【発明の効果】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤
は、生体に投与された後、超音波照射されることにより
一重項酸素などの活性酸素を発生するため、肺がん、肝
がん、膵がん、胃腸がん、膀胱がん、腎がん、脳腫瘍な
どの、光照射が不可能な身体深部のがん並びにウィルス
感染症、細胞内寄生性感染症、肺繊維症、肝硬変、慢性
腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変などの治療に有効に
用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の超音波治療用活性酸素発生剤に増感剤
として含まれる水溶性高分子と結合したフラーレンの構
造の一例を示す。

【図２】フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体をウエルに
添加しない場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。

【図３】フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体５μg/ウエ
ルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。

【図４】フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体５μg/ウエ
ルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を示す。

【図５】フラーレン−ＰＥＧ−ＮＨ₂結合体０〜１０μg
/ウエルを添加した場合のＲＬ♂１細胞の細胞生存率を
示す。

【図６】腫瘍を有するマウスに対するフラーレン−ＰＥ
Ｇ−ＮＨ₂結合体の投与とその後の超音波照射の治療効
果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 9/14 9/14 11/00 11/00 13/12 13/12 31/00 31/00 31/12 31/12 35/00 35/00 43/00 １２５ 43/00 １２５ Ｆターム(参考） 4C076 AA12 CC11 CC15 CC16 CC17 CC27 CC35 CC37 DD21 DD51 EE06 EE23 EE36 EE37 EE38 FF15 4C084 AA02 AA17 AA18 BA31 BA32 MA02 MA05 MA70 NA02 NA14 ZA361 ZA362 ZA451 ZA452 ZA751 ZA752 ZA811 ZA812 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 ZB351 ZB352 ZC711 ZC712 4C086 AA01 AA02 BC99 GA07 HA06 HA30 MA01 MA02 MA05 NA02 NA14 ZA44 ZA45 ZA59 ZA75 ZA81 ZB26 ZB33 ZB35 ZC71

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光増感剤を含有する超音波治療用活性酸
   素発生剤。
2. 【請求項２】 光増感剤が、水溶性高分子と複合化した
   フラーレンである、請求項１記載の超音波治療用活性酸
   素発生剤。
3. 【請求項３】 フラーレンが、Ｃ₆₀フラーレン又はナノ
   チューブフラーレンである、請求項２記載の超音波治療
   用活性酸素発生剤。
4. 【請求項４】 水溶性高分子が、ポリエチレングリコー
   ル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコー
   ル、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合
   成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロ
   キシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンの
   ようなデンプン誘導体を含む非イオン性水溶性高分子；
   アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体；
   並びにこれらの高分子のアニオン性又はカチオン性誘導
   体及びこれらの高分子の２成分又は３成分の共重合体か
   ら選択される、請求項２又は３記載の超音波治療用活性
   酸素発生剤。
5. 【請求項５】 水溶性高分子が、官能基を介してフラー
   レンと複合化している、請求項２〜４のいずれか１項記
   載の超音波治療用活性酸素発生剤。
6. 【請求項６】 官能基が、アミノ基である、請求項５記
   載の超音波治療用活性酸素発生剤。
7. 【請求項７】 光増感剤が、ポルフィリン誘導体であ
   る、請求項１記載の超音波治療用活性酸素発生剤。
8. 【請求項８】 ポルフィリン誘導体が、水溶性高分子と
   結合している、請求項７記載の超音波治療用活性酸素発
   生剤。
9. 【請求項９】 水溶性高分子が、ポリエチレングリコー
   ル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコー
   ル、ポリビニルピロリドンのような非イオン性水溶性合
   成高分子；デキストラン；プルラン；デンプン、ヒドロ
   キシエチルデンプン及びヒドロキシプロピルデンプンの
   ようなデンプン誘導体を含む非イオン性水溶性高分子；
   アルギン酸；ヒアルロン酸；キトサン；キチン誘導体；
   並びにこれらの高分子のアニオン性又はカチオン性誘導
   体及びこれらの高分子の２成分又は３成分の共重合体か
   ら選択される、請求項８記載の超音波治療用活性酸素発
   生剤。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項記載の超
    音波治療用活性酸素発生剤を含有する、がん、ウイルス
    感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性
    腎炎、動脈硬化、及び血管狭窄病変の治療剤。
11. 【請求項１１】 請求項１〜９のいずれか１項記載の超
    音波治療用活性酸素発生剤及び薬学的に許容しうる担体
    を含有する医薬組成物。