CN102898542B

CN102898542B - 一种水溶性富勒烯及其应用

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Publication number: CN102898542B
Application number: CN201210406707.3A
Authority: CN
Inventors: 张红岭; 史进进; 张振中; 刘艳; 叶凡; 高君; 刘瑞瑗; 马柔柔; 余晓媛; 张静; 王蕾; 侯琳
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2032-10-23
Also published as: CN102898542A

Abstract

本发明涉及水溶性富勒烯及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题，其解决的技术方案是，在原始的富勒烯经过纯化处理的基础上，与氨化试剂反应，将富勒烯表面连接上反应活性较强的氨基后，再与透明质酸反应，生成富勒烯-透明质酸聚合物，其中，透明质酸和富勒烯的质量含量比为0.18-0.25:1，本发明物理以及化学稳定性良好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低，副作用小，是肿瘤治疗药物载体上的创新。

Description

一种水溶性富勒烯及其应用

技术领域

本发明涉及化工领域，特别是一种水溶性富勒烯及其应用。

背景技术

作为碳元素的第三种同素异形体富勒烯家庭的发现，是上世纪自然科学发展史最重要的突破之一。Kroto等三人也因为他们在富勒烯研究中开创性的工作而荣获1996年诺贝尔化学奖。富勒烯以其独特的结构和性质倍受人们重视，近十年来，几乎全世界所有著名大学和研究所的科学家都进行了与富勒烯有关的研究。它已成为当今物理、化学、材料及生命科学研究者共同关心的课题。富勒烯分子的重要科学意义，被美国《Science》杂志评为1991年的“明星分子”。在纳米材料中，包括富勒烯、碳纳米管在内的碳纳米材料一直是近年来国际科学的前沿领域之一。富勒烯是由60个碳原子组成的球形分子，包含12个五元环和20个六元环，直径为0.71nm。近年来,富勒烯在生物医药领域的研究相当引人瞩目,研究发现富勒烯具有多种特殊的生物学效应：(1)可抑制多种酶的活性，包括 HIV 蛋白酶以及逆转录酶；(2)对肿瘤细胞显示出细胞毒性；(3)具有神经保护剂的作用；(4)还具有在可见光照射下产生氧自由基、切割 DNA的作用。

富勒烯作为一种优良的光敏剂表现在其在可见光照射的情况下可以产生活性氧，活性氧包括单线态氧、超氧负离子等。富勒烯光照下产生活性氧为高度反应性的，并且可以表现出明显的细胞毒性，比如裂解细胞中的DNA，抑制细胞的有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，富勒烯可以用于肿瘤的治疗。为此利用富勒烯作为光敏剂开展光动力疗法，即使其在肿瘤组织中蓄积，利用光照产生活性氧来选择性的破坏肿瘤组织。

透明质酸（HA），又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖，它是一种水溶性高分子聚合物，具有良好的生物可吸收性、生物兼容性、黏稠性及保水性。在细胞膜的表面有4类透明质酸的特定受体—CD44(CD分化群)、RHAMM(HA中介的游动性受体)、IVd4及LEC(肝内皮细胞受体)，其中CD44在肿瘤细胞中的含量较高，而且不同的肿瘤细胞所含有的CD44的结构也不同。受体介导的肿瘤靶向性透明质酸纳米药物载体的研究。有报道证明，CD44可以抑制细胞的凋亡，其与单克隆抗体类(mAbs)或HA结合，不仅能抑NT淋巴细胞的凋亡，还能提高B淋巴细胞的存活率。它具有很好的靶向作用，无毒，并且能够抑制癌细胞扩张。

目前将富勒烯表面接枝一种具有靶向肿瘤细胞作用的高分子水溶性聚合物透明质酸，得到一种新的水溶性富勒烯，及其作为光敏剂和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用尚未见报道，因此，本发明的研制成功具有统计学上的意义和实际的临床意义。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种水溶性富勒烯及其应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大、不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。

其解决的技术方案是：一种富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯，它是在原始的富勒烯经过纯化处理的基础上，与氨化试剂反应，将富勒烯表面连接上反应活性较强的氨基后，再与透明质酸反应，生成富勒烯-透明质酸聚合物，其中，透明质酸和富勒烯的质量含量比为0.18-0.25:1。

水溶性富勒烯的制备方法，包括以下步骤：

1）将氨化试剂20ml和氢氧化钠1g混合，再加入水和无水乙醇的重量比为1：5的混合溶剂60ml，搅拌均匀后，逐滴加入含有富勒烯的有机溶液50ml，在30-50℃、200r/min下搅拌反应1-7天，除去上层的有机溶剂，蒸除水和无水乙醇的混合溶剂，再用无水乙醇或甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20-60℃下，真空干燥24-72h，得氨基富勒烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；所述的含有富勒烯的有机溶液由富勒烯和有机溶剂组成，每1ml的有机溶液中含富勒烯1mg；所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；

2）称取上述得到的氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl) 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）120mg在20ml甲酰胺或N，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40-60℃、200r/min下搅拌反应24h，再用无水乙醇或丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在20-60℃下，真空干燥24-72h，得富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯。

富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂在肿瘤治疗中的应用分为体外和体内两部分：

1）将制得的富勒烯-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液，加入到癌细胞A中进行培养，给药后3h后用光源B光照，光照30-120min，继续培养24小时，测定癌细胞A的存活率；

2）将制得的富勒烯-透明质酸聚合物溶于水中制成溶液，静脉注射到荷瘤小鼠C体内，给药后3h后用光源D光照，光照时间为30-120min，测量荷瘤小鼠C的肿瘤体积大小。

上述步骤1中的癌细胞A为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤1中的光源B为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

上述步骤2中的荷瘤小鼠C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的光源D为：400-800nm波长的宽波长光源或者激光中的一种。优选532nm激光。

本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂来进行光动力治疗体内深度肿瘤时，这些光源不能够穿透照射时，可以通过适用与所述部位的方法来改善外部光源照射的穿透力进行肿瘤的治疗。

本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为光敏剂可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射、透皮给药、体内植入方式等。

富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用，分为以下几个步骤：

1）将制得的富勒烯-透明质酸聚合物和抗肿瘤药物A通过方式B进行结合；

2）将装载药物的富勒烯-透明质酸聚合物进行抗肿瘤细胞C和体内的抗肿瘤D的评价。

上述步骤1中的抗肿瘤药物A为：难溶性抗肿瘤药物、水溶性药物和核酸药物，比如：多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、顺铂、卡铂、柔红霉素、寡义反核苷酸、小干扰RNA和酶类药物中的一种或几种。

上述步骤1中的方式B为：超声、搅拌、探超和旋转蒸发中的一种或几种。

上述步骤2中的肿瘤细胞C为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

上述步骤2中的肿瘤D为：器官表面或者内部出现的各种实体瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宫颈癌，喉癌，甲状腺癌，舌癌，脑瘤(颅内肿瘤)，小肠肿瘤，胆囊癌，胆管癌，肾癌，前列腺癌，阴茎癌，睾丸肿瘤，子宫内膜癌，绒毛膜癌，阴道恶性肿瘤，外阴恶性肿瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮肤癌，恶性黑色素瘤中的一种。

本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以更多的分布在肿瘤组织中，与正常组织相比，它可以长期的高浓度的保留在肿瘤组织中，这样当采用适当的手段使用光源进行照射时能够在肿瘤组织中产生更多的活性氧，并且可以使其装载的药物在肿瘤部位浓度提高。但也会分布在正常的组织器官中，为了避免产生的活性氧对正常组织产生损伤，可以通过一些手段来加以改善，比如：可以在富勒烯-透明质酸聚合物上装载一些具有靶向性质的靶头，也可以使用抗体等手段介导，可以使用临床手段比如说内窥镜的方式来直接输送载药系统到达靶组织，聚焦光照面积等方式。

本发明的富勒烯-透明质酸聚合物作为药物转运载体可以制成任意的药物制剂剂型，比如：注射剂、注射用无菌粉针、分散剂、贴剂、凝胶剂、植入剂等。本发明的富勒烯-透明质酸聚合物可以加入各种制剂的添加剂，比如：生理盐水、葡萄糖、缓冲溶液和防腐剂等以便于制备成需要的剂型。给药方式可以为：静脉注射、肌肉注射、瘤内注射和皮下注射等。

本发明物理以及化学稳定性良好，制备条件容易满足，原料来源丰富，成本低，副作用小，是肿瘤治疗药物载体上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

1）将乙二胺20ml和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/ml的富勒烯的甲苯溶液50ml，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的甲苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用无水乙醇500ml抽滤洗涤15次，在40℃下，真空干燥48h，得氨基富勒烯；

2）称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺 120mg在20ml甲酰胺中混合均匀，在40℃、200r/min下搅拌反应24h，再用无水乙醇500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40℃下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯35mg。

实施例2

1）将1,3-丙二胺20ml和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/ml的富勒烯的苯溶液50ml，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在20℃下，真空干燥72h，得氨基富勒烯；

2）称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺 120mg在20mlN，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40℃、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40℃下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯32mg。

实施例3

1）将1,6-己二胺20ml和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60ml中，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/ml的富勒烯的四氢呋喃溶液50ml，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的四氢呋喃，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500ml抽滤洗涤15次，在60℃下，真空干燥24h，得氨基富勒烯；

2）称取上述氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺 120mg在20mlN，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40℃、200r/min下搅拌反应24h，再用丙酮500ml抽滤洗涤20次，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在40℃下，真空干燥48h，得水溶性富勒烯30mg。

相关试验资料如下：

一、使用光照射本发明水溶性富勒烯对肿瘤细胞生长的抑制活性的测定

通过光照射水溶性富勒烯在体外抗肿瘤活性：将PC3前列腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO₂，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（12.5、25、50、100μg/ml）的水溶性富勒烯透明质酸，设置复孔为4～6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。存活率的计算公式：存活率=实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

结果表明，当用光照射60min，水溶性富勒烯透明质酸的加入直接影响了PC3细胞的增殖。

二、光照射时，水溶性富勒烯的体内抗肿瘤活性测定

取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm³昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水；(2)生理盐水激光组；(3)水溶性富勒烯透明质酸组；(4)水溶性富勒烯透明质酸激光组。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2天给药一次，每次注射生理盐水或者2mg/ml的水溶性富勒烯透明质酸100μl，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。

结果表明，当给药水溶性富勒烯透明质酸合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制。

三、水溶性富勒烯作为药物转运载体在肿瘤治疗中的应用

取水溶性富勒烯10mg和多西紫杉醇（由北京怡和生物科技有限公司提供）20mg，加入超纯水2mL，混合均匀后，探头超声（工作3s，间隔6s，工作12次，功率为400W），将探超完成的样品进行离心（4000rpm，15min）除去大颗粒。得到了以水溶性富勒烯为载体的抗肿瘤药物多西紫杉醇给药系统。通过40倍（体积比）乙醇提取出给药系统中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度计测定水溶性富勒烯为载体包封的多西紫杉醇的含量，载药量为2.1 mg/mL。

结果表明，水溶性富勒烯可以吸附抗肿瘤药物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作为抗肿瘤药物的载体使用。

四、水溶性富勒烯多西紫杉醇给药系统的粒子大小和表面带电量的确定

使用Nano-ZS90型激光粒度分析仪进行测定，折射率设置为1.590，吸收系数设置为0.010，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动，以Z平均统计值作为测定结果。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。介电常数设置为79，黏度系数设置为0.8872，温度设置为25 ℃，测量模式设置为自动。每一水平缩合体均配制3份，每份测量一次，取三次测量值的平均值作为测量结果。测得的结果是粒径为30-300nm，电位是-30mV。

五、水溶性富勒烯多西紫杉醇给药系统的体外抗肿瘤活性

将PC3前列腺癌细胞（由上海细胞库提供）用作待考察的癌细胞。将PC3细胞培养在含胎牛血清(FBS)10%，青链霉素混合液1%的RPMI1640培养基中，培养箱条件为37℃、5% CO₂，每2～3天传代一次。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板每孔加入200 μl，铺板使待测细胞调密度至6×10³个/孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。置于5% CO₂，37 ℃孵育24 h，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度（0、0.5、1、2、4、6、8μg/ml）的水溶性富勒烯多西紫杉醇，不加入水溶性富勒烯透明质酸多西紫杉醇为对照组，设置复孔为4～6个。光照组放置在400W可见光中60min，保持光照过程中温度在37 ℃，光照结束后用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，对于不光照组而言，则直接用铝箔包裹细胞板置于CO₂培养箱中孵育24 h，终止培养，吸出含药培养基，每孔用150 μl PBS洗2遍，加入预冷的10% TCA 200 μl，4 ℃放置1 h。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100 μl的SRB溶液，静置放置10 min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150 μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱溶解。在515 nm处测定每孔的OD值。抑制率的计算公式：抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值，其中实验组和对照组均为扣除空白对照组后的值。

结果表明，水溶性富勒烯作为药物载体时能装载药物进入肿瘤细胞内部，更好的发挥出抗肿瘤药物的疗效，而且结合光照后，能够更明显的抑制肿瘤细胞的增殖。

六、水溶性富勒烯多西紫杉醇给药系统的体内抗肿瘤活性

取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7天后，取其中24只肿瘤体积≥100 mm³昆明小鼠，随机分为4组，每组6只。具体分组如下：(1)对照组(NS组)：生理盐水； (2)多西紫杉醇注射液组；(3)水溶性富勒烯透明质酸多西紫杉醇；(4) 水溶性富勒烯透明质酸多西紫杉醇光照组。多西紫杉醇注射液组、水溶性富勒烯透明质酸多西紫杉醇和水溶性富勒烯透明质酸多西紫杉醇光照组的多西紫杉醇给药剂量相等，都为25.125mg/kg。4组均采用静脉给药的方式，其中光照组使用的光源为532nm绿相光源，功率为300mW，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为10min。每2天给药一次，共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2天称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V= 计算肿瘤体积。

结果表明，当给药水溶性富勒烯多西紫杉醇时，小鼠的肿瘤体积的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明显的抑制，合并激光照射时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了更加明显的抑制。

在做上述实验的同时，还采用其他光源以及抗肿瘤药物做了类似的实验，均取得了相同和相类似的结果，本发明分组科学，方法稳定可靠，其他实验结果不再一一列举。

本发明水溶性富勒烯不会对富勒烯本身的特性进行破坏，测试结果表明，本发明水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。

本发明水溶性富勒烯可以作为抗肿瘤光动力治疗的一种良好的光敏剂，测试表明，无论是体外还是体内在光照的情况下都可以很好的抑制肿瘤细胞以及组织的发生和发展，而在不光照的情况下本发明提供的新的水溶性富勒烯对正常细胞以及组织毒副作用很小。

本发明水溶性富勒烯可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，本身有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高等优点。测试结果表明，本发明提供的水溶性富勒烯作为抗肿瘤药物的载体时，粒径均匀，能够提高水不溶性抗肿瘤药物的水溶性，能够起到一定的缓释作用，而且还能够更多的到达肿瘤组织中起到靶向给药的作用，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。

预期可以用于治疗肿瘤的一种良好的光敏剂，还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，是药物制备上的一大创新。

本发明与现有技术相比具有以下突出的有益技术效果：

1）本发明水溶性富勒烯不会对富勒烯本身的特性进行破坏，水分散性强，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低；

2）本发明水溶性富勒烯可以作为抗肿瘤光动力治疗的一种良好的光敏剂，光照时能够发挥抗肿瘤的活性，而不光照时则副作用很小，可以根据光的聚焦等手段来选择性的杀伤肿瘤组织和细胞；

3）本发明水溶性富勒烯可以作为一种良好的抗肿瘤药物的载体，有着极小的毒性，较强的水溶性，生物相容性好，比表面积大，化学惰性高，具有缓释性和靶向性，结合光照还可以发挥出更为优秀的抗肿瘤活性。

Claims

1.一种水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于，该水溶性富勒烯是在富勒烯分子上通过化学键连接透明质酸制成，透明质酸和富勒烯的质量比为0.18-0.25:1，所述的富勒烯为C₆₀富勒烯，其中，包括以下步骤：

1）将氨化试剂20mL和氢氧化钠1g混合，再加入水和无水乙醇的重量比为1:5的混合溶剂60mL，搅拌均匀后，逐滴加入含有富勒烯的有机溶液50mL，在30-50℃、200r/min下搅拌反应1-7天，除去上层的有机溶剂，蒸除水和无水乙醇的混合溶剂，再用无水乙醇或甲醇500mL抽滤洗涤15次，在20-60℃下，真空干燥24-72h，得氨基富勒烯；所述的氨化试剂为乙二胺、1,3-丙二胺、1,6-己二胺中的一种；所述的含有富勒烯的有机溶液由富勒烯和有机溶剂组成，每1mL的有机溶液中含富勒烯1mg；所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物；

2）称取上述得到的氨基富勒烯50mg与透明质酸80mg、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 160mg、N-羟基琥珀酰亚胺 120mg在20mL甲酰胺或N，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，在40-60℃、200r/min下搅拌反应24h，再用无水乙醇或丙酮500mL抽滤洗涤20次，除去未反应的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和透明质酸，在20-60℃下，真空干燥24-72h，得富勒烯-透明质酸聚合物，即水溶性富勒烯。

2.根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于， 1）将乙二胺20mL和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60mL，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/mL的富勒烯的甲苯溶液50mL，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的甲苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用无水乙醇500mL抽滤洗涤15次，在40℃下，真空干燥48h，得氨基富勒烯；

3. 根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于， 1）将1,3-丙二胺20mL和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60mL，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/mL的富勒烯的苯溶液50mL，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的苯，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500mL抽滤洗涤15次，在20℃下，真空干燥72h，得氨基富勒烯；

4.根据权利要求1所述的水溶性富勒烯的制备方法，其特征在于， 1）将1,6-己二胺20mL和氢氧化钠1g加入水和无水乙醇重量比为1:5的混合溶液60mL中，搅拌均匀后，逐滴加入1mg/mL的富勒烯的四氢呋喃溶液50mL，在30℃、200r/min下搅拌反应7天，除去上层的四氢呋喃，蒸除水和无水乙醇的混合溶液，再用甲醇500mL抽滤洗涤15次，在60℃下，真空干燥24h，得氨基富勒烯；

5. 根据权利要求1或2-4任何一项所述的水溶性富勒烯，其特征在于，所述的水溶液富勒烯的粒径为30-300nm。