JP2015214524A - 増感剤、抗がん剤、および超音波を用いたがん治療 - Google Patents

Abstract

【課題】抗がん剤などの薬剤の細胞内への導入が改善され、薬剤の細胞外への排出が抑制され、しかも薬剤を深部に到達させることができるＤＤＳを開発する。【解決手段】癌を治療するために超音波と併用される抗がん剤および増感剤の組み合わせ医薬、ならびに増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置を組み合わせたがん治療キット。【選択図】なし

Description

本発明は、癌を治療するために超音波と併用される増感剤および抗がん剤の組み合わせ医薬に関する。さらに本発明は、増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置を組み合わせたがん治療キットにも関する。

化学療法の治療効果の改善するために、様々なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の研究が行われている。しかしながら、薬剤が細胞内に取り込まれると、リソソームによる分解やＡＢＣトランスポーターによる排出による薬効の消失が問題となっている。このような問題点の改善策の１つとして、薬剤の細胞内への導入を改善したり、薬剤の細胞外への排出を抑制したりする光化学内包化（Photochemical Internalization; PCI）という方法が研究されている（非特許文献１〜５参照）。ＰＣＩは、細胞膜に集積する増感剤とレーザー光を用いた方法で、通常の方法に比べて５〜１００倍程度の薬剤を標的部位に輸送できるＤＤＳである。しかしながら、現在研究が行われているＰＣＩは、レーザー光を用いるため、光の組織透過性が問題となり、深部腫瘍に対する応用が課題となっている。最近になって、超音波と酸化チタン複合体を利用した生体内へのドラッグデリバリーシステムが提案されているが（特許文献１）、インビボにおける抗癌効果は示されていない。

特開２０１２−１１６８２６

Ole-Jacob Norum et al. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 96 (2009) 83-92 Kristian Berg et al. Clin. Cancer Res. 2005; 11(23) December 1, 2005 Kristian Berg et al. Photochem. Photobiol. Sci., 2011, 10, 1637 Pal Kristian Selbo et al. Photochemistry and Photobiology, 2001, 74(2): 303-310 Harm C. Arentsen et al. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations (2013) 1-6

抗がん剤などの薬剤の細胞内への導入が改善され、薬剤の細胞外への排出が抑制され、しかも薬剤を深部に到達させることができるＤＤＳを開発することが、本発明の解決課題であった。

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、抗がん剤などの薬剤を、光感受性物質などの増感剤とともに患者に投与し、患部に超音波照射を行うと、薬剤の投与効果が著しく増強されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。したがって、本発明は以下のものを提供する。

（１）癌を治療するために超音波と併用される増感剤および抗がん剤の組み合わせ医薬。
（２）超音波照射の前に投与される（１）記載の組み合わせ医薬。
（３）超音波の周波数が０．５ＭＨｚ〜７ＭＨｚである（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（４）超音波の周波数が０．７ＭＨｚ〜５ＭＨｚである（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（５）超音波の周波数が１ＭＨｚ〜３ＭＨｚである（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（６）増感剤が光感受性物質である（１）〜（５）のいずれかに記載の組み合わせ医薬。 （７）増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネート、５−アミノレブリン酸、ジスルフォナティッドテトラフェニルクローリンから選択される１種またはそれ以上である（６）記載の組み合わせ医薬。
（８）増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である（６）記載の組み合わせ医薬。
（９）抗がん剤がブレオマイシン、ぺプロマイシン、アクチノマイシンＤから選択される１種またはそれ以上である（１）〜（８）のいずれかに記載の組み合わせ医薬。
（１０）抗がん剤がブレオマイシンである（９）記載の組み合わせ医薬。
（１１）超音波の周波数が０．５ＭＨｚ〜７ＭＨｚであり、超音波の出力が０．３Ｗ／ｃｍ^２〜１０Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（１２）超音波の周波数が０．７ＭＨｚ〜５ＭＨｚであり、超音波の出力が０．５Ｗ／ｃｍ^２〜５Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（１３）超音波の周波数が１ＭＨｚ〜３ＭＨｚであり、超音波の出力が１Ｗ／ｃｍ^２〜３Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、（１）または（２）記載の組み合わせ医薬。
（１４）抗がん剤がブレオマイシンである（１３）記載の組み合わせ医薬。
（１５）増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置を組み合わせたがん治療キット。

本発明によれば、抗がん剤の治療効果を飛躍的に高めることができ、その手法も簡単である。基本的には本発明は非侵襲的な癌治療を実現することができる。本発明を用いれば、従来のレーザー光を併用したがん治療よりも深部のがんを効果的に治療することができる。

インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす増感剤添加量の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波照射時間の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビトロ実験におけるがん細胞生存率に及ぼす超音波出力の影響を調べた結果を示すグラフである。 インビボにおける抗がん剤、増感剤および超音波照射の組み合わせの腫瘍体積減少効果を示すグラフである。 インビボにおける抗がん剤、増感剤および超音波照射の組み合わせ（超音波照射１２日後）の腫瘍の様子を示す写真である。 インビボにおける抗がん剤、増感剤および超音波照射の組み合わせ（超音波照射１２時間後）の腫瘍の組織ＨＥ染色像である。スケールバーは５０μｍである。

本発明は、１の態様において、癌を治療するために超音波と併用される増感剤および抗がん剤の組み合わせ医薬に関するものである。

超音波はキャビテーションによるソノルミネッセンス（発光現象）を引き起こし、光感受性物質を励起することができる。そして、超音波はレーザー光に比べて、より深部まで届く。本発明者らは、このような超音波の性質を利用して、増感剤、抗がん剤、および超音波を組み合わせて用いることで、より深部の癌を効果的に治療する技術を確立した。

本発明に用いられる増感剤としては、超音波のキャビテーションにより生じる光によって励起される物質であればいずれの物質であってもよく、典型的には光感受性物質である。本発明に用いられる好ましい増感剤は、腫瘍に集積する性質を有するものである。本発明において増感剤として用いることのできる光感受性物質としては、アルミニウムフタロシアニンジスルホネート（本明細書において「ＡｌＰｃＳ２ａ」と略称することがある）、５−アミノレブリン酸（本明細書において「５−ＡＬＡ」と略称することがある）、テトラ４−スルフォナトフェニルポルフィリン（本明細書において「ＴＰＰＳ４」と略称することがある）、テトラフィルポルフィリンジスルフォネート（本明細書において「ＴＰＰＳ２ａ」と略称することがある）、ジスルフォナティッドテトラフェニルクローリン（本明細書において「ＴＰＣＳ２ａ」と略称することがある）、ヒペリシンなどが例示されるが、これらに限定されない。本発明において特に好ましい増感剤としては、ＡｌＰｃＳ２ａ、５−ＡＬＡ、ＴＰＣＳ２ａなどが例示される。本発明において、１種類の増感剤を用いてもよく、２種類以上の増感剤を用いてもよい。

本発明の抗がん剤は、合成化合物、天然化合物、蛋白、ペプチドなど、いずれの種類のものであってもよい。抗がん剤は、癌の種類、部位、サイズ、患者の状態などに応じて、医師が適宜選択して用いることができる。抗がん剤の例として、ブレオマイシン（本明細書において「ＢＬＭ」と略称することがある）、ぺプロマイシン、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イリノテカン、クラドリビン、シタラビン、ゲムシタビン、アザチオプリン、ヒドロキシウレア、フルオロウラシル、アムホテリシンＢ、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、アクチノマイシンDなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いられる好ましい抗癌剤としては、ブレオマイシンが例示されるが、これらに限定されない。さらに、本発明に使用可能な抗がん剤としてｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどの核酸を用いてもよい。本発明に用いる抗がん剤は上記のものに限定されない。本発明において１種類の抗がん剤を用いてもよく、２種類以上の抗がん剤を用いてもよい。

増感剤および抗がん剤の組み合わせ医薬を患者に投与するに際し、増感剤および抗がん剤を同時に投与してもよく、別々に投与してもよい。増感剤および抗がん剤を別々に患者に投与する場合は、増感剤を投与した後で抗がん剤を投与してもよく、あるいは抗がん剤を投与した後で増感剤を投与してもよい。増感剤を投与した後で抗がん剤を投与することが好ましい。

増感剤および抗がん剤の投与経路および投与量は、所望の癌治療効果が得られるように医師が選択、決定することができる。増感剤および抗がん剤の投与経路はいずれの経路であってもよく、患者の状態、癌の種類、部位、サイズ、抗がん剤および増感剤の種類、投与量などによって、適宜選択、変更することができる。抗がん剤および増感剤の投与経路としては、経口投与、腹腔内投与、静脈投与、皮下投与、局所投与などが例示されるが、これらに限定されるものではない。また、増感剤の投与経路と、抗がん剤の投与経路は同じであってもよく、異なっていてもよい。

増感剤の投与量および抗がん剤の投与量は、公知であるか、あるいは医師が容易に決定し、変更することができる。増感剤の投与量は、例えば、ＡｌＰｃＳ２ａ、５−ＡＬＡを静脈内投与する場合は１回あたりそれぞれ１．５ｍｇ/ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇであってもよいが、このような量に限定されない。抗がん剤の投与量は、例えばブレオマイシンを静脈内投与する場合は１回あたり２ｍｇ／ｋｇであってもよいが、このような量に限定されない。

超音波の照射は、増感剤または抗がん剤の投与と同時に行ってもよく、あるいはそれらの投与の後に行ってもよい。増感剤および抗がん剤が患部に存在する下で超音波照射を行うことが好ましい。増感剤を添加してから抗がん剤を添加し、その後超音波照射を行うことがさらに好ましい。

超音波を癌に向けて照射する場合、通常は、超音波透過性のゲルを患者の皮膚に塗布し、超音波振動子をゲルに密着させて超音波を照射する。超音波透過性のゲルは当業者に公知であり、市販もされている。超音波の照射部位はがんに近い部位が好ましい。通常は、超音波の照射は体外から行う。癌が深部に存在する場合は、組織を切開して、あるいは組織を除去して超音波を照射してもよい。超音波の照射時間は、超音波の周波数、出力、超音波発生装置の性能、および癌の種類、サイズ、部位、深度、患者の状態などに応じて、医師等が適宜決定あるいは変更することができる。

超音波の周波数が低いほど深部に到達するが、低い周波数の超音波を発生させるには大型の装置が必要となる。超音波の周波数が高くなると体内で散乱が起こりやすくなり、患部に到達しにくくなる。本発明における超音波の周波数は、超音波発生装置の出力、デューティー・サイクルおよび照射時間にもよるが、通常は０．５ＭＨｚ〜１０ＭＨｚ、好ましくは０．５ＭＨｚ〜７ＭＨｚ、より好ましくは０．６ＭＨｚ〜６ＭＨｚ、さらに好ましくは０．７ＭＨｚ〜５ＭＨｚ、例えば、１ＭＨｚ〜３ＭＨｚである。しかしながら、これらの周波数範囲に限定されず、医師等が適宜決定あるいは変更することができる。

本発明における超音波の出力は、超音波の周波数、デューティー・サイクルおよび照射時間にもよるが、通常は０．３Ｗ／ｃｍ^２〜１０Ｗ／ｃｍ^２、好ましくは０．５Ｗ／ｃｍ^２〜５Ｗ／ｃｍ^２、例えば１Ｗ／ｃｍ^２〜３Ｗ／ｃｍ^２である。しかしながら、これらの出力に限定されず、医師等が適宜決定あるいは変更することができる。

本発明における超音波照射のデューティー・サイクル（duty cycle）は、超音波の周波数、出力および照射時間にもよるが、通常は１０％〜５０％である。しかしながら、これらのデューティー・サイクルに限定されず、医師等が適宜決定あるいは変更することができる。

本発明における超音波照射時間は、超音波の周波数、出力およびデューティー・サイクルにもよるが、通常は数１０秒〜数分、好ましくは１分〜５分である。しかしながら、これらの照射時間に限定されず、医師等が適宜決定あるいは変更することができる。超音波の照射は１回であってもよく、複数回に分けて行ってもよい。

本明細書において、超音波の照射条件（周波数、出力、照射時間、デューティー・サイクル）を示す数値は、その値の±約２０％の偏差を許容するものとする。なお、添付図面において超音波を「ＵＳ」と略称することがある。

本発明は、別の態様において、増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置の組み合わせを含むがん治療システムを提供する。

本発明は、さらなる態様において、増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置の組み合わせを含むがん治療キットを提供する。

本発明は、さらなる態様において、増感剤および超音波照射装置の組み合わせを含む、抗がん剤のデリバリーシステムを提供する。

本発明は、さらに別の態様において、癌患者に増感剤および抗がん剤を投与すること、および患部に超音波を照射することを特徴とする癌の治療方法を提供する。

本発明の抗がん剤、がん治療キット、ならびに癌の治療方法等を用いて治療可能ながんの種類は特に限定されないが、固形がんが好ましい。固形がんとしては乳がん、前立腺がん、皮膚がん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、大腸がん、甲状腺がん、子宮がん、卵巣がん、骨肉腫などが例示されるが、これらに限定されない。

本発明の抗がん剤、がん治療キット、ならびに癌の治療方法等を用いて治療可能な患者は高等動物であれば特に種類は限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、ヒトあるいはヒト以外の動物、例えば霊長類、イヌやネコなどのペット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの家畜が例示される。

本明細書において、がんの「治療」とは、がんを消滅させることだけでなく、がんを小さくすること、がんの転移を抑制することを包含する。

本明細書において用いられる用語は、特に説明しない限り、医学分野、薬学分野、生物学分野、化学分野、および物理学分野において認識されている通常の意味に解するものとする。

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

以下に述べる方法にてインビトロでの実験を行った。
マウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ−２６）あるいはマウス肺扁平上皮癌細胞（ＫＬＮ２０５）を、３５ｍｍペトリディッシュ（Nunc, Ltd., Roskilde, Denmark）中の１０％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０（２２４００−０８９、ギブコ）（組成：Ｌ−グルタミン；３００ｍｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ_３；２０００ｍｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ；５９５８ｍｇ／Ｌ培地）に５ｘ１０^４個播種して２４時間培養した後、増感剤（アルミニウムフタロシアニンジスルホネート（ＡｌＰｃＳ２ａ）または５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ））を添加した。増感剤を添加して１８時間後に、抗がん剤（ブレオマイシン（ＢＬＭ））を添加し、４時間後に培地交換した。培地交換後、超音波を照射した。

特に断らない限り、以下の実験条件を用いた。ＡｌＰｃＳ２ａの添加量は、１ＭＨｚの超音波を照射する場合は５μｇ／ｍｌ、３ＭＨｚの超音波を照射する場合は１０μｇ／ｍｌとした。５−ＡＬＡの添加量は１ｍＭとした。ＢＬＭの添加量は５μｇ／ｍｌとした。超音波発生装置は伊藤超短波のＵＳＴ−７７０を用いた。周波数は１ＭＨｚまたは３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは１０％または２０％、出力は１Ｗ／ｃｍ^２、２Ｗ／ｃｍ^２または３Ｗ／ｃｍ^２として、１分間照射した。超音波の照射は、ペトリディッシュと超音波端子間に超音波用ゲルを充填し（厚さ約１ｍｍ）、密着させて実施した。超音波照射後７２時間目に細胞数を測定した。細胞数測定にはMuse^TM Count & Viability Kitを用いた。

（１）増感剤添加量の影響
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭを用い、がん細胞生存率に及ぼすＡｌＰｃＳ２ａの添加量（０〜１０μｇ／ｍｌ）の影響について調べた。超音波の出力は３Ｗ／ｃｍ^２、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図１に示す。ＡｌＰｃＳ２ａの添加量が増加するにつれてがん細胞生存率が低下した。超音波の周波数は３ＭＨｚよりも１ＭＨｚのほうが、がん細胞生存率が低下した。ＡｌＰｃＳ２ａを１０μｇ／ｍｌ添加して（ＢＬＭは５μｇ／ｍｌ）１ＭＨｚの超音波を照射した場合に、がん細胞生存率は０％であった。

（２）超音波照射時間の影響
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波照射時間（０〜６０秒）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、出力は３Ｗ／ｃｍ^２、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図２に示す。超音波の照射時間が長いほど、がん細胞生存率が低下した。

（３）超音波出力の影響（１ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は１ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図３に示す。超音波出力は１Ｗ／ｃｍ^２以上で十分ながん細胞生存率の低下（生存率ほぼ０％）が見られた。

（４）超音波出力の影響（３ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図４に示す。超音波出力が増加するほどがん細胞生存率が低下した。出力３Ｗ／ｃｍ^２の場合にがん細胞生存率は５％未満となった。

（５）超音波出力の影響（１ＭＨｚ、デューティー・サイクル １０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は１ＭＨｚ、デューティー・サイクルは１０％であった。結果を図５に示す。デューティー・サイクルが２０％のとき（図３）と比べてがん細胞生存率は高かった。

（６）超音波出力の影響（３ＭＨｚ、デューティー・サイクル １０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは１０％であった。結果を図６に示す。デューティー・サイクルが２０％のとき（図４）と比べてがん細胞生存率は高かったが、出力依存的にがん細胞の生存率が低下した。

（７）超音波出力の影響（１ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ５−ＡＬＡ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤として５−ＡＬＡを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は１ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図７に示す。超音波出力は２Ｗ／ｃｍ^２以上で十分ながん細胞生存率の低下が見られ、生存率は１％未満であった。増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用いた場合（図３）と同様の低い生存率であった。

（８）超音波出力の影響（３ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ５−ＡＬＡ、がん細胞 Ｃｏｌｏｎ−２６）
がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤として５−ＡＬＡを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図８に示す。超音波出力が増加するほどがん細胞生存率が低下した。出力３Ｗ／ｃｍ^２の場合にがん細胞生存率は１０％未満となった。

（９）超音波出力の影響（１ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 ＫＬＮ２０５）
がん細胞としてＫＬＮ２０５、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は１ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図９に示す。超音波出力は１Ｗ／ｃｍ^２以上で十分ながん細胞生存率の低下が見られ、生存率は３％未満であった。がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６を用いた場合（図３）と同様の低い生存率であった。

（１０）超音波出力の影響（３ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ＡｌＰｃＳ２ａ、がん細胞 ＫＬＮ２０５）
がん細胞としてＫＬＮ２０５、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤としてＡｌＰｃＳ２ａを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図１０に示す。超音波出力が増加するほどがん細胞生存率が低下した。出力３Ｗ／ｃｍ^２の場合にがん細胞生存率はほぼ０％となった。

（１１）超音波出力の影響（１ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ５−ＡＬＡ、がん細胞 ＫＬＮ２０５）
がん細胞としてＫＬＮ２０５、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤として５−ＡＬＡを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は１ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図１１に示す。

（１２）超音波出力の影響（３ＭＨｚ、デューティー・サイクル ２０％、増感剤 ５−ＡＬＡ、がん細胞 ＫＬＮ２０５）
がん細胞としてＫＬＮ２０５、抗がん剤としてＢＬＭ、増感剤として５−ＡＬＡを用い、がん細胞生存率に及ぼす超音波出力（１〜３Ｗ／ｃｍ^２）の影響について調べた。超音波の周波数は３ＭＨｚ、デューティー・サイクルは２０％であった。結果を図１２に示す。超音波出力が増加するほどがん細胞生存率が低下した。出力３Ｗ／ｃｍ^２の場合にがん細胞生存率は１０％未満となった。これらの結果は、がん細胞としてＣｏｌｏｎ−２６を用いた場合（図８）と同様であった。

（１３）核染色
上記各実験系において、超音波照射後５時間目にAnnexin VおよびDead Cell Kitを用いて核染色を実施した。核染色は１ｍＭ ビスベンゾイミダゾール（Hoechst dye 33342）を添加して蛍光顕微鏡で観察した。がん細胞生存率の低下はアポトーシスによるものではないことが確認された（データ示さず）。

以下に述べる方法にてインビボでの実験を行った。
マウス結腸癌細胞（Ｃｏｌｏｎ−２６）をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に１ｘ１０^６個接種して腫瘍を発生させた。増感剤（ＡｌＰｃＳ２ａ）をマウス腹腔内投与して１８時間後に、抗がん剤（ＢＬＭ）を腹腔内投与した。抗がん剤を投与してから３０分後に超音波を照射した。腫瘍と超音波端子間に超音波用ゲル（厚さ約１ｍｍ）を充填して照射した。

特に断らないかぎり、以下の実験条件を用いた。
ＡｌＰｃＳ２ａ投与量は１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇとした。ＢＬＭ投与量は２５ｍｇ／ｋｇとした。超音波発生装置は伊藤超短波のＵＳＴ−７７０であり、周波数３ＭＨｚ、デューティー・サイクル ５０％、出力３Ｗ／ｃｍ^２として３分または５分照射した。腫瘍体積変化を２日おきに測定した。

（１）腫瘍体積の経時変化
いくつかの条件の組み合わせを用いて、インビボにおける抗がん剤、増感剤および超音波照射の組み合わせの効果について調べた。結果を図１３に示す。図１３からわかるように、増感剤を２０ｍｇ／ｍｌ、ブレオマイシン２５ｍｇ／ｋｇを投与し、超音波（３ＭＨｚ、デューティーサイクル５０％）を３分間照射した場合は、超音波照射後１２日目においても腫瘍体積はほとんど増加しなかった。

（２）肉眼所見（超音波照射後１２時間目）
コントロール（無処置）、抗がん剤投与のみ、増感剤投与のみ、超音波照射のみ、抗がん剤と超音波併用、増感剤と超音波併用、ならびに増感剤、抗がん剤および超音波併用の場合について、マウス腫瘍を肉眼観察した。増感剤（ＡｌＰｃＳ２ ２０ｍｇ／ｋｇ）、抗がん剤（ブレオマイシン２５ｍｇ／ｋｇ）および超音波（３ＭＨｚ、デューティーサイクル５０％、３分間照射）併用の場合に、超音波照射から１２時間目に腫瘍の色が暗紫色に変化し（試験前はピンク色）、腫瘍の血流が低下したことが示された。

（３）肉眼所見（超音波照射後１２日目）
コントロール（無処置）、抗がん剤投与のみ、増感剤投与のみ、超音波照射のみ、抗がん剤と超音波併用、増感剤と超音波併用、ならびに増感剤、抗がん剤および超音波併用の場合について、マウス腫瘍を肉眼観察した。結果を図１４に示す。増感剤、抗がん剤および超音波を併用した場合において、超音波照射１２時間後に腫瘍がほとんど消失したことが確認された。

（４）組織学的所見
照射１２時間後に腫瘍組織を採材し、腫瘍をＨＥ（Hematoxylin and Eosin）染色して組織学的に評価した。結果を図１５に示す。増感剤、抗がん剤および超音波を併用した動物の組織において強い染色が見られ、腫瘍組織の結果が破綻していることが確認された。

本発明は、医薬品、医用機器、医学、薬学の研究分野などにおいて利用可能である。

Claims (15)

1. 癌を治療するために超音波と併用される抗がん剤および増感剤の組み合わせ医薬。
2. 超音波照射の前に投与される請求項１記載の組み合わせ医薬。
3. 超音波の周波数が０．５ＭＨｚ〜７ＭＨｚである請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
4. 超音波の周波数が０．７ＭＨｚ〜５ＭＨｚである請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
5. 超音波の周波数が１ＭＨｚ〜３ＭＨｚである請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
6. 増感剤が光感受性物質である請求項１〜５のいずれか１項記載の組み合わせ医薬。
7. 増感剤がＡｌＰｃＳ２ａ、５−ＡＬＡ、ＴＰＣＳ２ａから選択される１種またはそれ以上である請求項６記載の組み合わせ医薬。
8. 増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である請求項６記載の組み合わせ医薬。
9. 抗がん剤がブレオマイシン、ぺプロマイシン、アクチノマイシンＤから選択される１種またはそれ以上である請求項１〜８のいずれか１項記載の組み合わせ医薬。
10. 抗がん剤がブレオマイシンである請求項９記載の組み合わせ医薬。
11. 超音波の周波数が０．５ＭＨｚ〜７ＭＨｚであり、超音波の出力が０．３Ｗ／ｃｍ^２〜１０Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
12. 超音波の周波数が０．７ＭＨｚ〜５ＭＨｚであり、超音波の出力が０．５Ｗ／ｃｍ^２〜５Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
13. 超音波の周波数が１ＭＨｚ〜３ＭＨｚであり、超音波の出力が１Ｗ／ｃｍ^２〜３Ｗ／ｃｍ^２であり、増感剤がアルミニウムフタロシアニンジスルホネートまたは５−アミノレブリン酸である、請求項１または２記載の組み合わせ医薬。
14. 抗がん剤がブレオマイシンである請求項１３記載の組み合わせ医薬。
15. 増感剤、抗がん剤、および超音波照射装置を組み合わせたがん治療キット。