JP2001520046A

JP2001520046A - 洗剤で使用される改変された正味の特性を有する複数置換プロテアーゼ変異体

Info

Publication number: JP2001520046A
Application number: JP2000517091A
Authority: JP
Inventors: ジェイポーロス，アイルーカーラン; シェレンバーガー，ヴォルカー; ティージュニアケリス，ジェイムズ; ピーチ，クリスチャン; ナデルニー，ジョアンヌ; ピーネイキ，ドナルド; エムコールドウェル，ロバート; ディーコリアー，キャセリン
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1997-10-23
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2001-10-30
Also published as: US6312936B1; TR200001113T2; CN1191347C; EP1025239A2; CZ302287B6; ATE417099T1; ATE511540T1; WO1999020723A8; KR100612981B1; AU1276299A; DK1025241T3; TR200002057T2; TW585912B; CA2306894A1; MA24811A1; CA2306894C; EP1571199A2; WO1999020723A3; NO327607B1; EP1025241B2

Abstract

(57)【要約】天然に生じるまたは組換え非ヒトプロテアーゼのＤＮＡ配列に由来する新規プロテアーゼ変異体を開示する。変異体プロテアーゼは、一般には、天然に生じるまたは組換えプロテアーゼをコードする前駆体ＤＮＡ配列をイン・ビトロ修飾して、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列中に複数のアミノ酸残基の置換を生じさせることによって得られる。置換がその位置の電荷を前駆体プロテアーゼと比較してより陰性またはより正ではなくし、かくして、プロテアーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも低い洗剤濃度系でより効果的であるように、１以上の残基位置におけるアミノ酸置換を有するプロテアーゼ変異体を提供する。また、置換がその位置の電荷を前駆体プロテアーゼと比較してより正にまたはより負ではなくし、かくして、プロテアーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも高い洗剤濃度系でより効果的であるように、１以上の残基位置におけるアミノ酸置換を有するプロテアーゼ変異体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本出願は、ここに引用して本明細書に一体化させる１９９８年１０月２３日に
出願された米国特許出願第０８／９５６，３２３号、１９９８年１０月２３日に
出願された米国特許出願第０８／９５６，５６４号、および１９９８年１０月２
３日に出願された米国特許出願第０８／９５６，３２４号の一部継続出願である
。

【０００２】（発明の背景）セリンプロテアーゼ類はカルボニルヒドロラーゼの亜群である。それらは広い
範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含む。Ｓｔｒｏ
ｕｄ．Ｒ．Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．，１３１：７４−８８。その機能的多様性にも
拘わらず、セリンプロテアーゼの触媒装置は、少なくとも２つの酵素の遺伝的に
区別されるファミリー；１）スブチリシンおよび２）哺乳動物キモトリプシン−
関連および相同細菌セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびＳ．ｇｒｅｓｉｕｓトリプシン）によってアプローチされてきた。セリンプロテアーゼのこれらの２つのファミリーは、触媒の顕著に似たメカニズムを示す。Ｋｒａｕ
ｔ，Ｊ．（１９７７），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４６：３
３１−３５８。さらに、一次構造は関連しないが、これらの２つの酵素ファミリーの三次構造は、セリン、ヒスチジンおよびアスパルテートよりなるアミノ酸
の保存された触媒トリアドを一緒にする。

【０００３】スブチリシンは、かなり種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種および他の微生物から大量
に分泌されるセリンプロテアーゼ（ほぼＭＷ２７，５００）である。スブチリシ
ンの蛋白質配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓの少なくとも９つの異なる種から決定され
てきた。Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｆ．Ｓ．ら（１９８３），Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌ
ｅｒ’ｓＺ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６４：１５３７−１５４０。Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，ＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ．ｌｅｎｔｕｓのいくつかの天然変異体からのスブチリシンの三次元結晶学構造が報告されている。これらの研究は、スブ
チリシンは哺乳動物セリンプロテアーゼと遺伝的には無関係であるが、それは同
様の活性部位構造を有する。スブチリシンを含有する共有結合したペプチド阻害
剤（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９７２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：２４３９−２４４９）または生産された複合体（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ，Ｊ．Ｄ．ら，（１９７６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１：１０９７−１１０３）のＸ−線結晶構造は、スブチリシンの活性部位および推定基
質結合裂け目に関する情報を提供してきた。加えて、非常に多数の速度論および
化学的修飾研究がスブチリシンにつき報告されており；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ，Ｂ．（１９７６），ＣａｒｉｓｂｅｒａＲｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４１：２３７−２９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｆ．Ｓ．、前掲）、ならびに、スブチリシンの残基２２２におけるメチオニンの側鎖が過酸化水素によってメチオニンス
ルホキシドに変換され（Ｓｔａｕｆｆｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（１９６５），Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４：５３３３−５３３８）、広範な部位−特異的突
然変異誘発が行われた（ＷｅｌｌｓおよびＥｓｔｅｌｌ（１９８８）ＴＩＢＳ
１３：２９１−２９７）という少なくとも１つの報告がある。

【０００４】洗剤組成物で使用されるプロテアーゼ変異体の開発における通常の論点は、プ
ロテアーゼ変異体が使用される種々の洗剤組成物を含めた洗剤条件である。例え
ば、異なる領域で使用される洗剤処方は、洗浄水に存在するそれらの関連成分の
異なる濃度を有する。例えば、欧州洗剤システムは、典型的には、洗浄水におけ
る約４５００−５０００ｐｐｍの洗剤成分を有し、他方、日本洗剤システムは、
典型的には、洗浄水中にほぼ６６７ｐｐｍの洗剤成分を有する。北米においては
、特に米国においては、洗剤システムは、典型的には、洗浄水中に存在する約９
７５ｐｐｍの洗剤成分を有する。驚くべきことに、低い洗剤濃度系、高い洗剤濃
度系、および／または中程度の洗剤濃度系で使用されるならびに全ての３つのタ
イプの洗剤濃度で使用されるプロテアーゼ変異体を合理的にデザインする方法が
開発された。

【０００５】（発明の概要）１以上の残基位置のアミノ酸の置換が前駆体プロテアーゼと比較して、その位
置における電荷がより負にまたはより正でないように改変し、かくして、プロテ
アーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも低い洗剤濃度系でより効果的であるよ
うに、該置換を含有するプロテアーゼ変異体を提供するのが本発明の目的である
。低い洗剤濃度系は、洗浄水中に存在する約８００ｐｐｍ未満の洗浄成分を有す
る洗浄系である。

【０００６】１以上の残基位置のアミノ酸の置換が前駆体プロテアーゼと比較して、その位
置における電荷がより正にまたはより負でないように改変し、かくして、プロテ
アーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも高い洗剤濃度系でより効果的であるよ
うに、該置換を含有するプロテアーゼ変異体を提供するのが本発明のもう１つの
目的である。高い洗剤濃度系は、洗浄水中に存在する約２０００ｐｐｍより大の
洗浄成分を有する洗浄系である。

【０００７】１以上の残基位置のアミノ酸の置換が前駆体プロテアーゼと比較して、その位
置における電荷がより正にまたはより負でないように改変し、かくして、プロテ
アーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも中程度の洗剤濃度系でより効果的であ
るように、該置換を含有するプロテアーゼ変異体を提供するのが本発明のもう１
つの目的である。中程度の洗剤濃度系は、洗浄水中に存在する約８００ｐｐｍお
よび約２０００ｐｐｍの間の洗浄成分を有する系である。

【０００８】１以上の残基位置のアミノ酸の置換が前駆体プロテアーゼと比較して、その位
置における電荷がより負にまたはより正でないように改変し、かくして、プロテ
アーゼ変異体が前駆体プロテアーゼよりも中程度の洗剤濃度系でより効果的であ
るように、該置換を含有するプロテアーゼ変異体を提供するのが本発明のもう１
つの目的である。中程度の洗剤濃度系は、洗浄水中に存在する約８００ｐｐｍお
よび約２０００ｐｐｍの間の洗浄成分を有する系である。

【０００９】かかるプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列、ならびにかかるＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターを提供するのがさらなる目的である。

【００１０】かかるベクターで形質転換した宿主細胞、ならびにかかるＤＮＡを発現して、
プロテアーゼ変異体を細胞内または細胞外で生産することができる宿主細胞を提
供するのがなおさらなるもう１つの目的である。

【００１１】さらに、本発明のプロテアーゼ変異体を含む洗浄組成物が提供される。

【００１２】加えて、本発明のプロテアーゼ変異体を含む動物飼料が提供される。

【００１３】また、本発明のプロテアーゼ変異体を含むテキスタイルの処理用の組成物が提
供される。

【００１４】さらに、ａ）１以上の残基位置でアミノ酸を置換し、ここで、該置換は、その
位置における電荷を、前駆体プロテアーゼと比較して、より正にまたはより負で
ないように改変し；ｂ）１以上の残基位置でアミノ酸を置換し、ここで、該置換は、その位置にお
ける電荷を、前駆体プロテアーゼと比較して、より負にまたはより正でないよう
に改変し；ｃ）該変異体をテストして、前駆体プロテアーゼと比較して、高い、中程度お
よび低い洗剤濃度系でのその有効性を測定し；次いで、ｄ）前駆体プロテアーゼよりも低い、中程度および高い洗剤濃度系でより効果
的なプロテアーゼ変異体を生じさせるのに必要なだけ工程ａ）−ｃ）を反復する
各工程を含み、ここに、工程ａ）およびｂ）はいずれの順序で行うこともできる
ことを特徴とする、前駆体プロテアーゼよりも低い、中程度および高い洗剤濃度
でより効果的なプロテアーゼ変異体を生産する方法が提供される。

【００１５】（図面の説明）図１−４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチ
リシンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地
図を示す。

【００１６】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＢＰＮ）
およびＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ（野生型）からのスブチリシンの間での保存されたアミノ酸残基を示す。

【００１７】図６および７は、４つのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。頂部の線はＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン（時々はスブ
チリシンＢＰＮともいう）からのスブチリシンのアミノ酸配列を表す。第２の線
はＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。第３の線はＢ．ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。第４の線はＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓからのスブチリシン（ＰＣＴＷＯ８９／０６２７６ではスブチリシン３０９ともいう）のアミノ酸配
列を示す。記号＊はスブチリシンＢＰＮと比較した特異的アミノ酸残基の不存在
を示す。

【００１８】（発明の詳細な説明）前記したごとく、ある種の地理はある種の洗浄条件を有し、それ自体、異なる
タイプの洗剤を使用する。例えば、日本は低い洗剤濃度系を使用し、他方、欧州
は高い洗剤濃度系を使用する。前記したごとく、米国は中程度の洗剤濃度系を使
用する。我々は、異なるプロテアーゼ変異体がこれらの異なる洗剤処方で最適に
実行することを見いだした。しかしながら、これらの観察の結果、全ての３つの
タイプの洗剤でよく働くであろうプロテアーゼを見いだすのは不可能であると予
測されるであろう。驚くべきことに、これは成立しない。低い洗剤濃度系または
高い洗剤濃度系または中程度の洗剤濃度でさえ使用されるプロテアーゼ変異体な
らびに全ての３つの洗剤濃度系で働くプロテアーゼ変異体を合理的にデザインす
る方法が開発された。

【００１９】我々は、低い洗剤濃度系でより効果的なプロテアーゼ変異体を生産するには、
正に荷電した残基を負に荷電した残渣または中性残基でおよび／または中性残渣
を負に荷電した残基で置き換える必要があることを見いだした。対照的に、我々
は、高い洗剤濃度系でより効果的なプロテアーゼ変異体を生産するには、負に荷
電した残基を正に荷電したまたは中性の残基でおよび／または中性残基を正に荷
電した残基で置き換える必要があることを見いだした。さらに、我々は、低い洗
剤濃度系および／または高い洗剤濃度系で有用なプロテアーゼ変異体の多くが中
程度の洗剤濃度系で効果的であることを見いだした。これらの効果をバランスす
ることによって、低い洗剤濃度系、低いおよび中程度の洗剤濃度系、中程度のお
よび高い洗剤濃度系、高い洗剤濃度系、または全ての３つの洗剤濃度系でよく働
くプロテアーゼ変異体を生産することが可能である。

【００２０】酸性または塩基性機能を持ついずれかのイオン化可能アミノ酸側鎖の静電的荷
電が水溶液中で採るのは、ｐＨの関数である。平衡プロセスにおいて酸性残基Ｇ
ｌｕおよびＡｓｐは、ｐＨ３および６の間の解離によってプロトンを失い、それ
により、負の電荷を獲得する。同様に、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇは、各々、
ｐＨ５および８、ｐＨ８．５および１１．５、およびｐＨ１１および１４の間で
、徐々に脱プロトンし、それにより、正の電荷を失う。ＴｙｒＯＨのプロトン
は、ｐＨ８．５および１１．５の間で解離が増大し、それにより、Ｔｙｒは負の
電荷を獲得する。カルボキシ末端での解離の範囲はｐＨ１ないし４であり、負の
電荷を生じ、アミノ末端ではそれはｐＨ８ないし１１であり、正の電荷の喪失を
伴う。ここに所与のアミノ酸側鎖についての解離範囲は、多くの蛋白質について
の平均値であるが、それらはいくつかの蛋白質における通常ではない構造立体配
置によって影響されることが知られている。

【００２１】全ての電荷の累積効果は、蛋白質が所与のｐＨで正味の正のまたは負の電荷を
有するか否かを決定する。正および負の電荷が等しく効果的であり、静電気的に
中性の状態を蛋白質に運ぶｐＨは等電点（ｐＩ）と呼ばれる。蛋白質は、ｐＨが
シフトする場合、またはイオン化可能側鎖残基を持つアミノ酸が付加されるまた
は除去される場合、電荷を喪失するかまたは獲得するであろう。正味の正の電荷
の増加は、所与のｐＨで負に荷電した残基を非荷電または正に荷電した残基で置
き換えることによって達成することができ、それは、各々、＋１および＋２の形
式的電気の変化に至る。非荷電側鎖残基を所与のｐＨでプロトン化された残基で
置き換えることによって、形式的電荷は＋１となろう。同様に、正味の負の電荷
は、正に荷電したまたは非荷電側鎖を観察のｐＨにおいて負に荷電した側鎖で置
き換えることによって増加させることができ、各々、−１および−２だけ負の電
荷の形式的増加を獲得する。

【００２２】低い洗剤濃度系は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤を
含む。日本の洗剤は、典型的には、低い洗剤濃度系であると考えられる。という
のは、それらは洗浄水中の存在するほぼ６６７ｐｐｍの洗剤成分を有するからで
ある。

【００２３】中程度の洗剤濃度は、約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間の洗剤成分
が洗浄水に存在する洗剤を含む。北米洗剤は、一般に、中程度の洗剤濃度である
と考えられる。というのは、それらは、洗浄水中に存在するほぼ９７５ｐｐｍの
洗剤成分を有するからである。ブラジルは、典型的には、洗浄水に存在するほぼ
１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。

【００２４】高い洗剤濃度系は、約２０００ｐｐｍより大の洗剤成分が洗浄水に存在する洗
剤を含む。欧州の洗剤は、一般に、高い洗剤濃度系であると考えられる。という
のは、それらは、洗浄水中にほぼ４５００−５０００ｐｐｍの洗剤成分を有する
からである。

【００２５】ラテンアメリカの洗剤は、一般に、高いセッケン泡のホスフェートビルダー洗
剤であり、ラテンアメリカで使用される洗剤の範囲は、中程度および高い洗剤濃
度双方に入る得る。というのは、それらは、洗浄水中に１５００ｐｐｍないし６
０００ｐｐｍの洗剤成分の範囲だからである。前記したごとく、ブラジルは、典
型的には、洗浄水中に存在するほぼ１５００ｐｐｍの洗剤成分を有する。しかし
ながら、他のラテンアメリカ国に限定されず、他の高いセッケン泡ホスフェート
ビルダー洗剤地理は、洗浄水中に存在する約６０００ｐｐｍまでの洗剤成分の高
い洗剤濃度系を有し得る。

【００２６】前記に徴すれば、世界中の典型的な洗浄溶液中の洗剤の濃度は、約８００ｐｐ
ｍ未満（「低い洗剤濃度の地理」）、例えば、日本における約６６７ｐｐｍから
、約８００ｐｐｍおよび約２０００ｐｐｍの間（「中程度の洗剤濃度地理」）、
例えば、米国における約９７５ｐｐｍおよびブラジルにおける約１５００ｐｐｍ
まで、約２０００ｐｐｍより大（「高い洗剤濃度地理」）、例えば、欧州におけ
る約４５００ないし約５０００ｐｐｍおよび高いセッケン泡ホスフェートビルダ
ー地理における約６０００ｐｐｍの範囲であることは明らかである。

【００２７】典型的な洗浄溶液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国においては、典
型的な洗浄マシーンは、約６４．４Ｌ容量の洗浄容量を保持する。従って、洗浄
溶液内で約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るためには、約６２．７９ｇの洗剤組
成物が６４．４Ｌの洗浄溶液に添加されなければならない。この量は、洗浄を入
れた測定カップを用いて消費者によって洗浄水に測定される典型的量である。

【００２８】プロテアーゼは、一般的には、蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断す
るように作用するカルボニルヒドロラーゼである。本明細書で用いるごとく、「
プロテアーゼ」は、天然に生じるプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼを意味
する。天然に生じるプロテアーゼはα−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペ
プチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシ
ペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カル
ボキシプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼを含む。セリン、メタロ、チ
オールおよび酸性プロテアーゼ、ならびにエンドおよびエキソ−プロテアーゼが
含まれる。

【００２９】本発明は、変異体のアミノ酸配列がそれに由来する前駆体カルボニルヒドロラ
ーゼと比較して、異なる蛋白質分解活性、安定性、基質特異性、ｐＨプロフィー
ルおよび／または効率特徴を有する天然に生じるカルボニルヒドロラーゼ（プロ
テアーゼ変異体）であるプロテアーゼ酵素を含む。具体的には、かかるプロテア
ーゼ変異体は、前駆体プロテアーゼの複数のアミノ酸残基の異なるアミノ酸での
置換によつて由来する、天然では見いだされないアミノ酸配列を有する。前駆体
プロテアーゼは天然に生じるプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼであり得る
。

【００３０】ここに有用なプロテアーゼ変異体は、指名されたアミノ酸残基位置における１
９の天然に生じるＬ−アミノ酸のいずれかの置換を含む。かかる置換はいずれか
の前駆体スブチリシン（原核生物、真核生物、哺乳動物等）でなすことができる
。本出願を通じて、共通の１文字−および３文字暗号によって種々のアミノ酸を
引用する。かかる暗号はＤａｌｅ，Ｍ．Ｗ．（１９８９），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＢａｃｔｅｒｉａ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＡｐｐｅｎｄｉｘＢで確認される。

【００３１】ここに有用なプロテアーゼ変異体は、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎに由来する。より好ましくは、プロテアーゼ変異体はＢａｃｉｌ
ｌｕｓｌｅｎｔｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎおよび／またはｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ３０９に由来する。

【００３２】スブチリシンは、一般的には、蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断す
るように作用する細菌または菌類プロテアーゼである。本明細書で用いるごとく
、「スブチリシン」は天然に生じるスブチリシンまたは組換えスブチリシンを意
味する。一連の天然に生じるスブチリシンは種々の微生物種によって生産され、
しばしば分泌されることが知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配
列は全く相同というのではない。しかしながら、このシリーズのスブチリシンは
、同一または類似のタイプの蛋白質分解活性を呈する。このクラスのセリンプロ
テアーゼは、それらをキモトリプシン関連クラスのセリンプロテアーゼから区別
する触媒トリアドを規定する共通のアミノ酸配列を保有する。スブチリシンおよ
びキモトリプシン関連セリンプロテアーゼは、共に、アスパルテート、ヒトチジ
ンおよびセリンを含む触媒トリアドを共に有する。スブチリシン関連プロテアー
ゼにおいて、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて読んだこれらのアミノ酸の
相対的順序は、アスパルテート−ヒトチジン−セリンである。キモトリプシン関
連プロテアーゼにおいて、しかしながら、相対的順序はヒトチジン−アスパルテ
ート−セリンである。かくして、ここにスブチリシンは、スブチリシン関連プロ
テアーゼの触媒トリアドを有するセリンプロテアーゼをいう。その例は限定され
るものではないが図６および７で確認されるスブチリシンを含む。一般的には、
かつ本発明の目的では、プロテアーゼにおけるアミノ酸のナンバリングは、図１
−４に提示された成熟Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
スブチリシン配列に帰属される番号に対応する。

【００３３】「組換えスブチリシン」または「組換えプロテアーゼ」とは、スブチリシンま
たはプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が修飾されて、天然に生じるアミノ酸
配列における１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入をコードする変異体（ま
たは突然変異体）ＤＮＡ配列を生じるスブチリシンまたはプロテアーゼをいう。
かかる修飾を生じる、本明細書に開示されているものと組み合わせることができ
る適当な方法は米国特許ＲＥ３４，６０６号、米国特許第５，２０４，０１５号
および米国特許第５，１８５，２５８号、米国特許第５，７００，６７６号、米
国特許第５，８０１，０３８号および米国特許第５，７６３，２５７号に開示さ
れているものを含む。

【００３４】「非ヒトスブチリシン」およびそれらをコードするＤＮＡは、多くの原核生物
および真核生物から得ることができる。原核生物の適当な例は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのごときグラム陰性生物およびＭｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓのごときグラム陽性細菌を含む。スブチリシンお
よびそれらの遺伝子がそれから得ることができる真核生物の例はＳａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのごとき酵母、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓ
ｐ．のごとき菌類を含む。

【００３５】「プロテアーゼ変異体」は、「前駆体プロテアーゼ」のアミノ酸配列に由来す
るアミノ酸配列を有する。前駆体プロテアーゼは天然に生じるプロテアーゼおよ
び組換えプロテアーゼを含む。プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列は、前駆体ア
ミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって前駆体プロテア
ーゼアミノ酸配列に「由来」する。かかる修飾は、前駆体プロテアーゼ酵素それ
自体の操作よりもむしろ前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列をコードする「前駆
体ＤＮＡ配列」のものである。前駆体ＤＮＡ配列のかかる操作についての適当な
方法は、ここに開示される方法、ならびに当業者に知られた方法（例えば、ＥＰ
０３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９および既に引用された米国特許およ
び出願参照）。

【００３６】これらのアミノ酸位置番号は、図１−４に呈された成熟Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン配列に帰属されるものをいう。しかしながら、本発明は、この特定のスブチリシンの突然変異に限定されず、
Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンにおける
特定の同定される残基と「同等である」位置におけるアミノ酸残基を含有する前
駆体プロテアーゼに拡大される。本発明の好ましい具体例において、前駆体プロ
テアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓスブチリシンであり、前記リストのものに対応するＢ．Ｌｅｎｔｕｓにおける同等のアミノ酸残基位置で置換がなされる。

【００３７】前駆体プロテアーゼの残基（アミノ酸）位置は、もし、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンに存在する特別の残基または部分と相同（すなわち、いずれかの一次または三次構造における位置に対応する
）または類似する（すなわち、化学的に組み合わせる、反応するまたは相互作用
する同一または同様の機能的能力を有する）ならば、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの残基と同等である。

【００３８】一次構造に対する相同性を確立するには、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列
をＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン一次配
列、特に配列が知られているスブチリシンにおける変異体であることが知られて
いる残基の組と直接的に比較する。例えば、ここに図５は、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンおよびＢ．ｌｅｎｔｕｓスブチリシンの
間で保存された残基を示す。保存された残基を整列させ、整列を維持するのに必
要な挿入および欠失を可能とした後（すなわち、任意の欠失および挿入を通じて
保存された残基の排除を回避し）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの一次配列における特定のアミノ酸と同等の残基が規定される。保存された残基の整列は、好ましくは、かかる残基の１００％を保
存すべきである。しかしながら、保存された残基の７５％より大または５０％と
少ない整列もまた同等の残基を規定するのに適当である。触媒トリアドＡｓｐ３
２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されるべきである。Ｓｉｅｚｅｎら
（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．４（７）：７１９−７３７は、非常に多数のセリンプロテアーゼの整列を示す。Ｓｉｅｚｅｎらはスブチラーゼまたは
スブチラーゼ−様セリンプロテアーゼとしてのグループ分けに言及する。

【００３９】例えば、図６および７において、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃ
ｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ｃａｒｉｓｂｅｒｇｅｎｉｓ）およびＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓからのスブチリシンのアミノ酸配列を整列させて、アミノ酸配列の間の相同性の最大量を提供する。これらの配列の組合せは、各配列に含有さ
れる保存された多数の残基があることを示す。これらの保存された残基（ＢＰＮ
’およびＢ．ｌｅｎｔｕｓの間）は図５に確認される。

【００４０】これらの保存された配列は、かくして、好ましいＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓスブチリシンと高度に相同である、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓからのスブチリシンのごとき他のスブチリシンにおけるＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（１９８９年７月１３日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０６２７９）、ここに好ましいプロテアーゼ前駆体酵素、またはＰ
Ｂ９２というスブチリシン（ＥＰ０３２８２９９）の対応する同等のアミ
ノ酸残基を規定するのに用いることができる。これらのスブチリシンのあるもの
のアミノ酸配列は、保存された残基の最大相同性を生じるＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの配列と共に図６および７で整列される。分かるように、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンと比較してＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓの配列には多数
の欠失がある。かくして、例えば、他のスブチリシンにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンでのＶａｌ１６５について
の同等のアミノ酸はＢ．ｌｅｎｔｕｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
についてのイソロイシンである。

【００４１】「同等の残基」は、その三次構造がＸ−線結晶解析によって決定されている前
駆体プロテアーゼについての三次構造のレベルでの相同性を決定することによっ
ても定義される。同等の残渣は、前駆体プロテアーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの特定のアミノ酸残基の主要鎖原子の２以上の原子座標（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣおよびＯ上の
Ｏ）が０．１３ｎｍ以内にあり、好ましくは、整列後に０．１ｎｍであるものと
定義される。整列は、最良のモデルが、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンに対して問題のプロテアーゼの非水素蛋白質原子の原子座標の最大重複を与えるように配位させ位置付けされた後に達成される
。最良のモデルは、最高の利用可能な分解における実験的解析データについての
最低のＲ因子を与える結晶モデルである。

【００４２】Ｒ因子＝Σｈ｜Ｆｏ（ｈ）｜−｜Ｆｃ（ｈ）｜ Σｈ｜Ｆｏ（ｈ）｜Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの特異
的残基に類似して機能的な同等の残基は、それらが、定義されたおよびＢａｃｉ
ｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの特異的残基に帰
属される方法で、蛋白質構造、基質結合または触媒作用を改変し、修飾しまたは
それに寄与するような立体配座を採り得る前駆体プロテアーゼのアミノ酸と定義
される。さらに、それらは、所与の残基の主要鎖原子は相同位置を占めることを
基礎とした同等の基準を満足できないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原
子座標はＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシン
の対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内にある程度まで類似の位置を占める（そ
れにつき三次構造がＸ−線結晶解析によって得られている）前駆体プロテアーゼ
の残基である。Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチ
リシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開番号０２５１４４６（米国特許第５
，１８２，２０４号に対応、引用によりその開示を本明細書に一体化させる）に
記載されており、前記で概説したように使用して、三次構造のレベルにつき同等
の残基を決定することができる。

【００４３】置換につき同定される残基のいくつかは保存された残基であり、他方、他のも
のはそうではない。保存されない残基の場合は、１以上のアミノ酸の置換は、天
然で見いだされないものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生じる置換
に限定される。保存された残基の場合には、かかる置換の結果、天然に生じる配
列はもたらされないはずである。本発明のプロテアーゼ変異体は、プロテアーゼ
変異体の成熟形ならびにかかるプロテアーゼ変異体のプロ−およびプレプロ−形
態を含む。プレプロ−形態は好ましい構築である。というのは、これは、プロテ
アーゼ変異体の発現、分泌および成熟を容易とするからである。

【００４４】「プロ配列」とは、除去される結果、プロテアーゼの「成熟」形態が出現する
プロテアーゼの成熟形態のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列をいう。多く
の蛋白質分解酵素は、翻訳プレ酵素産物として天然で見いだされ、翻訳後プロセ
ッシングの不存在下では、このようにして発現される。プロテアーゼ変異体を生
産するための好ましいプロ配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンの水性プロ配列であるが、他のプロテアーゼプロ配列も使用することができる。

【００４５】「シグナル配列」または「プレ配列」は、プロテアーゼのＮ−末端部分にまた
はプロテアーゼの成熟またはプロ形態の分泌に参画できるプロプロテアーゼのＮ
−末端部分に結合したアミノ酸のいずれの配列もいう。シグナル配列のこの定義
は機能的なものであり、天然条件下でプロテアーゼの分泌の実行に参画するプロ
テアーゼ遺伝子のＮ−末端部分によってコードされた全てのアミノ酸配列を含む
ことを意味する。本発明は、ここに定義されたプロテアーゼ変異体の分泌を実行
するためにかかる配列を利用する。１つの可能なシグナル配列は、Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓｌｅｎｔｕｓ（ＡＴＣＣ２１５３６）からのスブチリシンのシグナル配
列の残りに融合したＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓスブチリシンからのシグナル配列の最初の７つのアミノ酸残基を含む。

【００４６】プロテアーゼ変異体の「プレプロ」形態は、プロテアーゼのアミノ末端に作動
可能に連結されたプロ配列およびプロ配列のアミノ末端に作動可能に連結された
「プレ」または「シグナル」配列を有するプロテアーゼの成熟形態よりなる。

【００４７】「発現ベクター」とは、適当な宿主中の当該ＤＮＡの発現が可能な適当な制御
配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築体をいう。かかる
制御配列は、転写を行うためのプロモーター、かかる転写を制御するための所望
のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列およ
び転写および翻訳の終止を制御する配列を含む。ベクターはプラスミド、ファー
ジ粒子、または単純に可能なゲノムインサートでよい。一旦適当な宿主に形質転
換されたならば、ベクターは宿主ゲノムとは独立して複製、機能でき、あるいは
ある場合には、ゲノム自体に組み込まれ得る。本明細書では、「プラスミド」お
よび「ベクター」は、時々、相互交換可能に使用される。というのは、プラスミ
ドは現在ではベクターの最も通常に使用される形態だからである。しかしながら
、本発明は、同等の機能を供し、当該分野で知られているまたは知られるように
なった発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。

【００４８】本発明で使用される「宿主細胞」は、一般に、好ましくは米国特許ＲＥ３４，
６０６号に開示されている方法によって操作されて、それらを酵素的に活性なエ
ンドペプチダーゼを分泌できないようにしている原核生物または真核生物宿主で
ある。プロテアーゼを発現するための好ましい宿主細胞は、酵素的に活性な中性
プロテアーゼおよびアルカリ性プロテアーゼ（スブチリシン）において欠乏して
いるＢａｃｉｌｌｕｓ株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の構築は米国特許第５，２６４，３５６号に詳細に記載されている。プロテアーゼを発現するた
めの他の宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１１６８（引用して、その開示を本明細書に一体化させる米国特許ＲＥ３４，６０６号および米国
特許第５，２６４，３６６号にも開示されている）ならびにＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ等のごときいずれかの適当なＢａｃｉｌｌ
ｕｓ株を含む。

【００４９】宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターで形質転換または
トランスフェクトする。かかる形質転換宿主細胞は、プロテアーゼ変異体をコー
ドするまたは所望のプロテアーゼ変異体を発現するベクターを複製できる。発現
されると、プロテアーゼ変異体のプレ−またはプレプロ−形態をコードするベク
ターの場合、かかる変異体は、典型的には、宿主細胞から宿主細胞培地に分泌さ
れる。

【００５０】２つのＤＮＡ領域の間の関係を記載する場合に「作動可能に連結した」とは、
単に、相互に機能的に関連することを意味する。例えば、プレ配列は、もし当該
シグナル配列の切断に最も恐らくは関与する蛋白質の成熟形態の分泌に関与する
シグナル配列としてそれが機能すれば、ペプチドに作動可能に連結している。プ
ロモーターは、もしそれが配列の転写を制御すれば、コーディング配列に作動可
能に連結している；リボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を可能とするように
位置していれば、コーディング配列に作動可能に連結している。

【００５１】天然に生じる前駆体プロテアーゼをコードする遺伝子は、当業者に知られてい
る一般的方法に従って得ることができる。該方法は、一般的には、注目するプロ
テアーゼの領域をコードする推定配列を有する標的プローブを合成し、該プロテ
アーゼを発現する生物からゲノムライブラリーを調製し、次いで、プローブにハ
イブリダイズさせることによって、注目する遺伝子につきライブラリーをスクリ
ーニングすることを含む。次いで、陽性的にハイブリダイズするクローンをマッ
プし、配列決定する。

【００５２】次いで、クローン化プロテアーゼを用いて、宿主細胞を形質転換してプロテア
ーゼを発現させる。次いで、プロテアーゼ遺伝子を高コピー数プラスミドに連結
する。このプラスミドは、それがプラスミド複製に必要なよく知られたエレメン
ト：（もしそれが宿主によって認識されれば、すなわち転写されれば、遺伝子自
身の相同プロモーターとして供給することができる）問題の遺伝子に作動可能に
連結されたプロモーター、転写終止および外因性であって、プロモーター遺伝子
、望ましくは、抗生物質含有培地での増殖によってプラスミド−感染宿主細胞の
連続的培養維持を可能とする抗生物質耐性遺伝子のごとき選択遺伝子の内因性タ
ーミネーター領域によって供給される（ある種の真核生物宿主細胞におけるプロ
テアーゼ遺伝子からの宿主によって転写されるｍＲＮＡの安定性に必要な）ポリ
アデニル化シグナルを含有する意味で宿主中で複製する。また、高コピー数プラ
スミドは、宿主用の複製起点を含有し、それにより、染色体制限なくして非常に
多数のプラスミドが細胞質中で生成することを可能とする。しかしながら、複数
コピーのプロテアーゼ遺伝子を宿主ゲノムに取り込むのは本明細書の範囲内のも
のである。これは、相同組換えに特に感受性の原核生物および真核生物によって
容易とされる。

【００５３】該遺伝子は天然Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ遺伝子であり得る。別法として、天然に生じるまたは突然変異体前駆体プロテアーゼをコードする合成遺伝子を生産するこ
とができる。かかるアプローチにおいて、前駆体プロテアーゼのＤＮＡおよび／
またはアミノ酸配列が決定される。複数の重複する合成一本鎖ＤＮＡ断片がしか
る後に合成され、ハイブリダイゼーションおよび連結に際して、それは前駆体プ
ロテアーゼをコードする合成ＤＮＡを生じる。合成遺伝子構築の例は、出典明示
して本明細書に一体化させる米国特許第５，２０４，０１５号の実施例３に記載
されている。

【００５４】一旦、天然に生じるまたは合成前駆体プロテアーゼ遺伝子がクローン化されれ
ば、多数の修飾を行って、天然に生じる前駆体プロテアーゼの合成を超えて遺伝
子の使用を増強させる。かかる修飾は、米国特許ＲＥ３４，６０６号およびＥＰ
Ｏ公開番号第０２５１４４６号に開示されている組換えプロテアーゼの生産
およびここに記載されたプロテアーゼ変異体の生産を含む。

【００５５】以下のカセット突然変異誘発方法を用いて、本発明のプロテアーゼ変異体の構
築を容易とすることができるが、他の方法を用いることもできる。まず、該プロ
テアーゼをコードする天然に生じる遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定
される。次いで、該配列を、コードされた酵素における１以上のアミノ酸の突然
変異（欠失、挿入または置換）を作成するのが望ましい点につきスキャンする。
この点にフランキングする配列を、遺伝子の短いセグメントを、発現された場合
に種々の突然変異体をコードするオリゴヌクレオチドプールで置き換えるための
制限部位の存在につき評価する。かかる制限部位は、好ましくは、遺伝子セグメ
ントの置き換えを容易とするようにプロテアーゼ遺伝子内のユニークな部位であ
る。しかしながら、プロテアーゼ遺伝子において総じて豊富ではないいずれの便
宜な制限部位も用いることができる。但し、制限消化によって生じた遺伝子断片
は適当な配列において再度組み立てることができるものとする。もし制限部位が
選択された点（１０ないし１５ヌクレオチド）から便宜な距離内の位置に存在し
ないならば、かかる部位は、リーディングフレームまたはコードされたアミノ酸
も最終構築中で変化しないように、遺伝子中のヌクレオチドを置換することによ
って生成させる。所望の配列に適合させるようにその配列を変化させるための遺
伝子の突然変異は、一般的に知られている方法によりＭ１３プライマー伸長によ
って達成される。適当なフランキング領域を位置決定し、２つの便宜な制限部位
配列に到達するのに必要な変化を評価する仕事は、遺伝暗号の縮重、遺伝子の制
限酵素地図および非常に多数の異なる制限酵素によってルーチン的になされる。
もし便宜なフランキング制限部位が利用できるならば、前記方法は、部位を含有
しないフランキング配列に関してのみ使用する必要がある。

【００５６】一旦天然に生じるＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローン化されたならば、突然変
異させるべき位置にフランキングする制限部位を、同族制限酵素で消化し、複数
の末端相補性オリゴヌクレオチドカセットを遺伝子に連結する。突然変異誘発は
この方法によって単純化される。何故ならば、オリゴヌクレオチドの全ては同一
制限部位を有するように合成でき、制限部位を生じさせるために合成リンカーは
必要ではないからである。

【００５７】本明細書中で用いるごとく、蛋白質分解活性は、活性な酵素１ミリグラム当た
りのペプチド結合の加水分解の速度と定義される。蛋白質分解活性を測定するた
めの多くのよく知られた手法が存在する（Ｋ．Ｍ．Ｋａｌｉｓｚ，「ＭｉｃｒｏｂｉｂａｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ．
Ｆｉｅｃｈｔｅｒら，１９８８）。修飾された蛋白質分解活性に加えて、また
はその代替法として、本発明の変異体酵素はＫ_ｍ、Ｋ_ｃａｔ、Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍ比
のごとき他の修飾された特性および／または修飾された基質特異性および／また
は修飾されたｐＨ活性プロティールを有し得る。これらの酵素は、例えば、ペプ
チドの合成において、またはランドリー用途のごとき加水分解プロセスのために
存在することが予測される特別の基質のために仕立てることができる。

【００５８】本発明の１つの態様において、当該目的は、前駆体プロテアーゼと比較して、
改変された蛋白質分解活性を有する変異体プロテアーゼを確保することである。
というのは、かかる活性を増大させることは（数字的に大）、酵素が標的基質に
より効果的に作用するように使用することを可能とするからである。また、興味
あることは、前駆体と比較して、改変された熱安定性および／または改変された
基質特異性を有する変異体酵素である。ある場合には、低い蛋白質分解活性が望
ましく、例えば、蛋白質分解活性の減少が、（ペプチドを合成するに関して）プ
ロテアーゼの活性が所望される場合に有用であろう。かかる合成の産物を破壊で
きるこの蛋白質分解活性を減少させるのが望まれるかも知れない。逆に、ある場
合には、変異体酵素−対−その前駆体の蛋白質分解活性を増加させるのが望まし
いであろう。加えて、アルカリ性安定性もしくは熱安定性を問わず、変異体の安
定性の増加または減少（改変）が望ましいであろう。Ｋ_ｃａｔ、Ｋ_ｍ、Ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍの増加または減少は、これらの速度論パラメーターを決定するのに使用さ
れる基質に特異的である。

【００５９】本発明のもう１つの態様において、当該置換がその位置において荷電を変化さ
せて、前駆体プロテアーゼと比較して荷電をより負にまたはより正でないように
するように、１以上の残基位置においてアミノ酸の置換を含有するプロテアーゼ
変異体が前駆体プロテアーゼよりも低い洗剤濃度でより効果的であることが判明
した。

【００６０】本発明のさらなる態様において、当該置換がその位置において荷電を変化させ
て、前駆体プロテアーゼと比較して荷電をより正にまたはより負でないようにす
るように、１以上の残基位置においてアミノ酸の置換を含有するプロテアーゼ変
異体が前駆体プロテアーゼよりも高い洗剤濃度でより効果的であることが判明し
た。

【００６１】さらに、本発明者らは、低い洗剤濃度系および／または高い洗剤濃度系で有用
なプロテアーゼ変異体の多くもまた中程度の洗剤濃度系で効果的であることを見
いだした。

【００６２】これらの置換は、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ（組換え体または天然タイプ）でなされるが、置換はＢａｃｉｌｌｕｓプロテアーゼ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓスブチリシンでなすことができる。

【００６３】変異体プロテアーゼで得られたスクリーニング結果に基づき、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシンにおける認識される突然
変異は蛋白質分解活性、これらの酵素の効率および／または安定性およびかかる
変異体酵素の清浄または洗浄効率にとって重要である。

【００６４】本発明のプロテアーゼ変異体の多くは種々の洗剤組成物またはシャンプーもし
くはローションのごとき個人のケア処方を処方するのに有用である。多数の公知
化合物が、本発明のプロテアーゼ突然変異体を含む組成物で有用な適当な界面活
性剤である。これらは、ＢａｒｒｙＪ．Ａｎｄｅｒｓｏｎに対する米国特許第
４，４０４，１２８号およびＪｉｒｉＦｌｏｒａらに対する米国特許第４，２６１，８６８号に開示されているごときノニオン、アニオン、カチオンまたは両
性洗剤を含む。適当な洗剤処方は、（先に出典明示して本明細書に一体化させる
）米国特許第５，２０４，０１５号の実施例７に記載されているものである。該
技術は、清浄組成物として使用することができる異なる処方に馴染み深い。典型
的な清浄組成物に加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は天然または野生型プロ
テアーゼが使用されるいずれかの目的で使用することができる。かくして、これ
らの変異体は、例えば、棒もしくは液体セッケン適用、ディッシュケア処方、コ
ンタクトレンズ清浄溶液もしくは製品、ペプチド加水分解、廃物処理、テキスタ
イル適用において、蛋白質生産における融合−切断酵素として使用することがで
きる。本発明の変異体は、（前駆体と比較して）洗剤組成物における増強された
性能を含むことができる。本明細書で用いるごとく、洗剤における増強された性
能は、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価によって測定して、ガラスまたは血
液のごときある種の酵素感受性汚染の清浄の増大と定義される。

【００６５】本発明のプロテアーゼは、約０．０１ないし５重量％（好ましくは０．１％な
いし０．５重量）のレベルで６．５および１２．０の間のｐＨを有する公知の粉
末化よび液体洗剤に処方することができる。これらの洗剤清浄組成物は、公知の
プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼ
のごとき他の酵素、ならびにビルダーおよび安定化剤を含むこともできる。

【００６６】本発明のプロテアーゼの通常の清浄組成物への添加は、いずれの特別な使用制
限も生じない。換言すれば、洗剤に適したいずれの温度およびｐＨも、該ｐＨが
前記範囲内であって、該温度が記載されたプロテアーゼの変性温度未満である限
り本発明の組成物で適当である。加えて、本発明のプロテアーゼは、再度、単独
またはビルダーおよび安定化剤と組み合わせて、洗剤なくして清浄組成物で使用
することができる。

【００６７】また、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体を含有する清浄組成物に関する
。該清浄組成物は、さらに、清浄組成物で通常使用されるある種の添加剤を含有
することができる。これらは、限定されるものではないが、ブリーチ、界面活性
剤、ビルダー、酵素およびブリーチ触媒から選択することができる。いずれの添
加剤が組成物に含有されるのに適するかは当業者に容易に明らかであろう。本明
細書で供するリストは、断じて、それに尽きるものではなく、適当に添加剤の例
としてのみ採用することができる。また、組成物中の酵素および他の成分、例え
ば、界面活性剤に適合する添加剤を使用するに過ぎないことは当業者に容易に明
らかであろう。

【００６８】存在する場合、清浄組成物に存在する添加剤の量は約０．０１ないし９９．９
％、好ましくは約１％ないし９５％、より好ましくは約１％ないし約８０％であ
る。

【００６９】本発明の変異体プロテアーゼは、例えば、米国特許第５，６１２，０５５号；
米国特許第５，３１４，６９２号および第５，１４７，６４２号に記載された動
物飼料添加物の一部のごとき動物飼料に含めることができる。

【００７０】本発明の１つの態様は、本発明の変異体プロテアーゼを含むテキスタイルの処
理用の組成物である。該組成物は、例えば、ＲＤ２１６，９３４号；ＥＰ１３
４，２８７；ＵＳ４，５３３，３５９；およびＥＰ３４４，２５９のごとき刊行
物に記載されている絹または羊毛を処理するのに使用することができる。

【００７１】以下のものは例として提示され、請求の範囲の範囲の限定として解釈されるべ
きではない。

【００７２】

【実施例】

（実施例１）当該分野でよく知られた方法を用い、非常に多数のプロテアーゼ変異体を生産
し、精製した。全ての突然変異はＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓＧＧ３６スブチリシンでなした。

【００７３】「Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｏｆａｓｓａｙｉｎｇｆｏｒａｐｒｅｆｅｒｒｅｄｅｎｚｙｍｅａｎｄ／ｏｒｐｒｅｆｅｒｒｅｄｄｅｔｅ
ｒｇｅｎｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」、米国特許第８０／０６６，７９６号に記載されているミクロスウォッチアッセイを用い、生産されたプロテアーゼ変異
体を、２つのタイプの洗剤および洗浄条件における性能につきテストした。

【００７４】表１−１３はアッセイした変異体プロテアーゼおよび２つの異なる性能におけ
るテスト結果をリストする。全ての値は表に目下最初のプロテアーゼに対する比
較として与える（すなわち、１．３２の値は、表中の最初の変異体の１００％に
対して、当該株の１３２％を放出する能力を示す）。

【００７５】Ａ欄は変異体の電荷の差異を示す。Ｂ欄については、洗剤は、ガロン当たり３
グレインの混合されたＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋硬度を含有する溶液中の０．６７ｇ／
ｌの濾過されたＡｒｉｅｌＵｌｔｒａ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ，Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，オハイオ州，米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を２５
℃の各ウェルで用いた（低濃度洗剤系）。Ｃ欄については、洗剤は、ガロン当た
り１５グレインの混合されたＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋硬度を含有する溶液中の３．３
８ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌＵｌｔｒａ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌ
ｅ，Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，オハイオ州，米国）であり、０．３ｐｐｍの酵素を４０℃の各ウェルで用いた（高濃度洗剤系）。

【００７６】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】（実施例２）実施例１に記載したごとく、以下のプロテアーゼ変異体を作成し、テストした
。

【００７７】表１４における変異体は、両タイプの置換；Ｂ．ｌｅｎｔｕｓＧＧ３６と比較して、電荷をより負にまたはより正ではなくする位置における電荷を変化さ
せる置換および電荷をより正にまたはより負ではないようにする位置における電
荷を変化させる置換、ならびに所与の残基位置における電荷に影響しない中性置
換を有するプロテアーゼ変異体である。これは、低い洗剤濃度系（Ａ欄；０．６
７ｇ／ｌの濾過されたＡｒｉｅｌＵｌｔｒａ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌ
ｅ，Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，オハイオ州，米国）、ガロン当たり３グレインの混合されたＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋硬度を含有する溶液中、０．３ｐｐｍの酵素を２
５℃の各ウェルで用いた）および低い洗剤濃度系（Ｂ欄；３．３８ｇ／ｌの濾過
されたＡｒｉｅｌＦｕｔｕｒ（Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ，Ｃｉｎｃｉｃａｔｉ，オハイオ州，米国）、ガロン当たり１５グレインの混合されたＣ
ａ^２＋／Ｍｇ^２＋硬度を含有する溶液中、０．３ｐｐｍの酵素を４０℃の各ウェ
ルで用いた）の双方における標準よりも良好な性能のプロテアーゼ変異体を生じ
させる。

【００７８】

【表１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシ
ンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地図を
示す。

【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓスブチリシ
ンについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列ならびにこの遺伝子の部分的制限地図を
示す。

【図３】図３は図２の続きである。

【図４】図４は図３の続きである。

【図５】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＢＰＮ）
およびＢａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ（野生型）からのスブチリシンの間での保存されたアミノ酸残基を示す。

【図６】図６は、４つのスブチリシンのアミノ酸配列を示す。

【図７】図７は図６の続きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/54 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:07） 9/54 (Ｃ１２Ｎ 9/54 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/54 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｒ 1:07） (31)優先権主張番号０８／９５６，５６４ (32)優先日平成９年10月23日(1997．10．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シェレンバーガー，ヴォルカーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94010 バーリンガムセクォイアアヴェニュー 1747 (72)発明者ケリス，ジェイムズティージュニアアメリカ合衆国カリフォルニア州 94028 ポートラヴァリータンオークドライヴ 111 (72)発明者ピーチ，クリスチャンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94303 パロアルトモレノアヴェニュー 914 (72)発明者ナデルニー，ジョアンヌアメリカ合衆国カリフォルニア州 94118 サンフランシスコアルゲロナンバー６ 681 (72)発明者ネイキ，ドナルドピーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94118 サンフランシスコトウェンティーフィフスストリート 4815 (72)発明者コールドウェル，ロバートエムアメリカ合衆国カリフォルニア州 94062 レッドウッドシティーウィルミントンウェイ 915 (72)発明者コリアー，キャセリンディーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94062 レッドウッドシティーウィルミントンウェイ 915

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１以上の残基位置においてアミノ酸の置換を含むプロテアー
ゼ変異体であって、該置換が、その位置における電荷を、前駆体プロテアーゼと
比較して、より負にまたはより正でないように改変し、かつ当該プロテアーゼ変
異体は前駆体プロテアーゼより低い洗剤濃度系でより効果的であることを特徴と
するプロテアーゼ変異体。
【請求項２】前記プロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請
求項１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項３】バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スブチリシンに由来すること
を特徴とする請求項１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項４】バチラス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）スブチリシンに由来する請求項３記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項５】請求項１記載のプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項６】請求項５記載のＤＮＡをコードする発現ベクター。
【請求項７】請求項６記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項８】請求項１記載のプロテアーゼ変異体を含む清浄組成物。
【請求項９】請求項１記載のプロテアーゼ変異体を含む動物飼料。
【請求項１０】請求項１記載のプロテアーゼ変異体を含むテキスタイルを
処理するための組成物。
【請求項１１】１以上の残基位置でアミノ酸残基の置換を含むプロテアー
ゼ変異体であって、該置換が、その位置における電荷を、前駆体プロテアーゼと
比較して、より正にまたはより負でないように改変し、かつ当該プロテアーゼ変
異体は前駆体プロテアーゼよりも高い洗剤濃度系でより効果的であることを特徴
とするプロテアーゼ変異体。
【請求項１２】前記プロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする
請求項１１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項１３】バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）スブチリシンに由来するこ
とを特徴とする請求項１１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項１４】バチラス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）スブチリシンに由来する請求項１３記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項１５】請求項１１記載のプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ
。
【請求項１６】請求項１５記載のＤＮＡをコードする発現ベクター。
【請求項１７】請求項１６記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１８】請求項１１記載のプロテアーゼ変異体を含む清浄組成物。
【請求項１９】請求項１１記載のプロテアーゼ変異体を含む動物飼料。
【請求項２０】請求項１１記載のプロテアーゼ変異体を含むテキスタイル
を処理するための組成物。
【請求項２１】高い洗浄濃度が洗浄水中で２０００ｐｐｍより高いことを
特徴とする請求項１記載のプロテアーゼ変異体。
【請求項２２】前駆体プロテアーゼよりも低い、中程度および高い洗剤濃
度でより効果的なプロテアーゼ変異体を生産する方法であって、ａ）１以上の残
基位置でアミノ酸を置換し、ここで、該置換は、その位置における電荷を、前駆
体プロテアーゼと比較して、より正にまたはより負でないように改変し；ｂ）１以上の残基位置でアミノ酸を置換し、ここで、該置換は、その位置にお
ける電荷を、前駆体プロテアーゼと比較して、より負にまたはより正でないよう
に改変し；ｃ）該変異体をテストして、前駆体プロテアーゼと比較して、高い、中程度お
よび低い洗剤濃度系でのその有効性を測定し；ｄ）前駆体プロテアーゼよりも低い、中程度および高い洗剤濃度系でより効果
的なプロテアーゼ変異体を生じさせるのに必要なだけ工程ａ）−ｃ）を反復する
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】１以上の残基位置においてアミノ酸の置換を含むプロテア
ーゼ変異体であって、該置換が、その位置における電荷を、前駆体プロテアーゼ
と比較して、より正にまたはより負でないように改変し、かつ当該プロテアーゼ
変異体は前駆体プロテアーゼよりも中程度の洗剤濃度系でより効果的であること
を特徴とするプロテアーゼ変異体。
【請求項２４】１以上の残基位置においてアミノ酸の置換を含むプロテア
ーゼ変異体であって、該置換が、その位置における電荷を、前駆体プロテアーゼ
と比較して、より負にまたはより正でないように改変し、かつ当該プロテアーゼ
変異体は前駆体プロテアーゼよりも中程度の洗剤濃度系でより効果的であること
を特徴とするプロテアーゼ変異体。