ES2905361T3

ES2905361T3 - Construcciones de anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas para BCMA y CD3

Info

Publication number: ES2905361T3
Application number: ES17703376T
Authority: ES
Inventors: Tobias Raum; Markus Muenz; Johannes Brozy; Peter Kufer; Patrick Hoffmann; Matthias Friedrich; Benno Rattel; Pamela Bogner; Andreas Wolf; Cornelius Pompe
Original assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH; Amgen Inc
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2017-02-02
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2037-02-02
Also published as: AU2017216230A1; US20200048357A1; EP3411402B1; HRP20220081T1; CL2018002057A1; LT3411402T; MA43955B1; DK3411402T3; SG11201805770UA; JOP20170027B1; PT3411402T; AU2023237216A1; PH12018501536A1; IL260958B1; SI3411402T1; AR107521A1; CA3010704A1; AU2017216230B2; US20170218077A1; UA126657C2

Abstract

Una construcción de anticuerpo monocatenaria que comprende: - un primer dominio que se une a BCMA, - un segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3ε humana y/o de Macaca; y - un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, comprendiendo cada uno una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en la que dichos dos monómeros polipeptídicos se fusionan entre sí mediante un conector peptídico.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas para BCMA y CD3

Antecedentes

Las moléculas derivadas de anticuerpo biespecíficas tales como construcciones de anticuerpo BiTE® (de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas) son construcciones de proteínas recombinantes hechas a partir de dos dominios de unión derivados de anticuerpo ligados flexiblemente. Un dominio de unión de construcciones de anticuerpo BiTE® es específico para un antígeno de superficie asociado a tumor seleccionado en células diana; el segundo dominio de unión es específico para CD3, una subunidad del complejo del receptor de linfocitos T en linfocitos T. Mediante su diseño particular, las construcciones de anticuerpo BiTE® se adecuan de forma única a linfocitos T de conexión transitoria con células diana y, al mismo tiempo, activan potentemente el potencial citolítico inherente de linfocitos T contra células diana. Otro desarrollo importante de la primera generación de construcciones de anticuerpo BiTE® (véanse los documentos WO 99/54440 y WO 2005/040220) desarrolladas en clínica como AMG 103 y AMG 110 fue proporcionar construcciones de anticuerpo biespecíficas que se unen a un epítopo independiente de contexto en el extremo N de la cadena CD3s (documento WO 2008/119567). Las construcciones de anticuerpo BiTE® que se unen a este epítopo elegido no solamente muestran especificidad de especie cruzada por la cadena CD3s humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus, sino también, debido al reconocimiento de este epítopo específico (en lugar de epítopos descritos previamente de proteínas de unión a CD3 en moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas), no activan inespecíficamente los linfocitos T al mismo grado que se observa para la generación previa de anticuerpos de acoplamiento a linfocitos T. Esta reducción en la activación de linfocitos T se correlacionó con redistribución de linfocitos T menor o reducida en los pacientes, identificándose la última como un riesgo de efectos secundarios.

Las construcciones de anticuerpo como se describe en el documento WO 2008/119567 probablemente experimentan rápida eliminación del organismo; por tanto, aunque pueden alcanzar la mayoría de las partes del organismo rápidamente, y son rápidas de producir y fáciles de manipular, sus aplicaciones in vivo pueden limitarse por su breve persistencia in vivo. Se usó administración prolongada mediante infusión intravenosa continua para conseguir efectos terapéuticos a causa de la corta semivida in vivo de esta pequeña molécula monocatenaria. Sin embargo, dichas infusiones intravenosas continuas se clasifican como inconvenientes para los pacientes y, por tanto, en caso de estrategias de tratamiento alternativas más convenientes, impedir la elección del compuesto demostró ser más eficaz en el tratamiento de la enfermedad respectiva. Por tanto, hay una necesidad en la técnica de productos terapéuticos biespecíficos que retengan eficacia terapéutica similar, que tengan un formato que sea sencillo de producir, y que tengan propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida más larga.

Una semivida aumenta en general es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y muy especialmente fragmentos de anticuerpo de pequeño tamaño. Las estrategias descritas en la técnica para conseguir dicho efecto comprenden la fusión de la pequeña construcción de anticuerpo biespecífica a proteínas más grandes, que preferiblemente no interfieren con el efecto terapéutico del BiTE®. Ejemplos de dichos otros desarrollos de acopladores de linfocitos T biespecíficos comprenden moléculas de Fc biespecíficas, por ejemplo, descritas en los documentos US 2014/0302037, US 2014/0308285, WO 2014/144722, WO 2014/151910 y WO 2015/048272. Una estrategia alternativa es el uso de HSA fusionado a la molécula biespecífica o la mera fusión de péptidos de unión a albúmina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO2013/128027, WO2014/140358).

BCMA (antígeno de maduración de linfocitos B, TNFRSF17, CD269) es una proteína transmembranaria que pertenece a la superfamilia del receptor de TNF. Esta establecido como un marcador de linfocitos B que es esencial para el desarrollo de linfocitos B y la homeostasis (Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111-2114) debido a su interacción supuestamente esencial con sus ligandos BAFF (factor activador de linfocitos B, también denominado TALL-1 o TNFSF13B) y APRIL (ligando inductor de proliferación).

La expresión de BCMA está restringida al linaje de linfocitos B y presente principalmente en plasmocitos y plasmoblastos y en algún grado en linfocitos B de memoria, pero casi ausente en linfocitos B periféricos y vírgenes. BCMA también se expresa en células de mieloma múltiple (MM) y está implicado en leucemia y linfomas. Junto con sus miembros de la familia TACI (interactuador activador transmembranario y ligando de ciclofilina) y BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, también conocido como miembro 13C de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral), BCMA regula diferentes aspectos de la inmunidad humoral, el desarrollo de linfocitos B y la homeostasis. La expresión de BCMA parece bastante tardía en la diferenciación de linfocitos B y contribuye a la supervivencia a largo plazo de los plasmoblastos y plasmocitos en la medula ósea. La eliminación dirigida del gen de BCMA en ratones provoca números significativamente reducidos de plasmocitos de vida larga en la médula ósea, lo que indica la importancia de BCMA para su supervivencia.

En línea con este hallazgo, BCMA también da soporte al crecimiento y supervivencia de células de mieloma múltiple (MM). Novak et al. descubrieron que líneas celulares MM y células m M recién aisladas expresan BCMA y la proteína TACI en sus superficies celulares y tienen expresión variable de la proteína BAFF-R en su superficie celular (Novak et al, (2004) Blood 103(2):689-694).

El mieloma múltiple (MM) es la segunda neoplasia hemática más común y constituye un 2 % de todas las muertes por cáncer. MM es una enfermedad heterogénea y está provocada principalmente por traslocaciones cromosómicas, entre otras t(11; 14), t(4; 14), t(8;14), del(13) y del(17). Los pacientes afectados por MM pueden experimentar una diversidad de síntomas relacionados con enfermedad debidos a infiltración de la médula ósea, destrucción de hueso, insuficiencia renal, inmunodeficiencia y la carga psicosocial de un diagnóstico de cáncer.

El mieloma es una enfermedad incurable que típicamente sigue una evolución recidivante, requiriendo muchos pacientes (pts) múltiples líneas de tratamiento. Los desenlaces clínicos en RRMM siguen siendo malos, particularmente después de fracaso de tratamiento basado en inhibidor del proteasoma (PI) y/o fármaco inmunomodulador (IMiD).

MM aún es una enfermedad difícil de tratar y sigue siendo incurable. Típicamente sigue una evolución recidivante, requiriendo muchos pacientes múltiples líneas de tratamiento. Tratamientos tales como quimioterapia y estrategias de trasplante de células madre están llegando a estar disponibles y tienen tasas de supervivencia mejoradas, pero a menudo ocasionan efectos secundarios indeseados. Hasta la fecha, las dos opciones de tratamiento más frecuentemente usadas para pacientes con mieloma múltiple son combinaciones de esteroides, talidomida, lenalidomida, bortezomib o diversos agentes citotóxicos, y para pacientes más jóvenes conceptos de quimioterapia de alta dosis con trasplante de células madre autólogas.

La mayoría de trasplantes son del tipo autólogo, es decir, usando las propias células del paciente. Dichos trasplantes, aunque no son curativos, han demostrado prolongar la vida en pacientes seleccionados. Pueden realizarse como tratamiento inicial en pacientes recién diagnosticados o en el momento de recidiva. A veces, en pacientes seleccionados, puede recomendarse más de un trasplante para control adecuadamente la enfermedad. El trasplante de células madre puede no ser una opción para muchos pacientes a causa de edad avanzada, presencia de otra enfermedad grave u otras limitaciones físicas. La quimioterapia solamente controla parcialmente mieloma múltiple, infrecuentemente da lugar a remisión completa. Los desenlaces clínicos en MM resistente recidivante siguen siendo malos, particularmente después de fracaso de tratamiento basado en inhibidor del proteasoma (PI) y/o fármaco inmunomodulador. Por tanto, hay una necesidad urgente de nuevos tratamientos innovadores.

Bellucci etal. (Blood. 15 de mayo de 2005; 105(10)) identificaron anticuerpos específicos de BCMA en pacientes con mieloma múltiple después de que hubieran recibido infusiones de linfocitos donadores. El suero de estos pacientes podría mediar la lisis celular específica de BCMA por ADCC y CDC y se detectaba únicamente en pacientes con respuestas antitumorales (4/9), pero no es pacientes que no respondían (0/6). Los autores especulan que la inducción de anticuerpos específicos de BCMA contribuye a la eliminación de células de mieloma y remisión a largo plazo de los pacientes. Ryan et al. (Mol Cancer Ther. noviembre de 2007; 6(11): 3009-18) informaron de la generación de un anticuerpo específico de BCMA antagonista que evita la activación de NF- ^k B que está asociada con una potente ruta de señalización a favor de la supervivencia en linfocitos B normales y malignos. El documento WO 2013/072406 divulga moléculas de unión que son al menos biespecíficas, que comprenden un primer y un segundo dominio de unión, en las que el primer dominio de unión puede unirse al grupo epitópico 3 de BCMA, y el segundo dominio de unión puede unirse al complejo receptor de CD3 de linfocitos T. El documento WO 2014/122143 se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a BCMA. El documento también muestra que un anticuerpo puede ser biespecífico con o sin un Fc, y puede unirse a BCMA y CD3.

A pesar del hecho de que BCMA; BAFF-R y TACI, es decir, los receptores de linfocitos B que pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF, y sus ligandos BAFF y APRIL se someten a tratamientos en el combate contra el cáncer y/o trastornos autoinmunitarios, aún hay una necesidad de tener disponibles otras opciones para el tratamiento de dichas afecciones médicas. Una de estas estrategias es un acoplador de linfocitos T derivado de anticuerpo biespecífico.

Compendio

Todos los formatos de prolongación de la semivida (formatos HLE) de las moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas descritos en la técnica, que incluían el formato hetero Fc (también denominado Fc heterodimérico, hetFc o hFc) y la fusión de seroalbúmina humana (también denominada HSA o hALB), tenían desventajas individuales tales como activación inespecífica de linfocitos T, activación del complemento, inestabilidad o un perfil farmacocinético que no cumple la prolongación deseada de la semivida de las moléculas. Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar un formato de prolongación de la semivida de moléculas de acoplamiento a linfocitos T biespecíficas de BCMAxCD3, que supere al menos uno y, por supuesto, preferiblemente más de uno de estos defectos individuales observados para las moléculas del estado de la técnica. Por consiguiente, la presente invención proporciona construcciones de anticuerpo de una modalidad de Fc específica caracterizada por comprender un primer dominio que se une a BCMA, un segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3s humana y/o de Macaca, y un tercer dominio, que es la modalidad de Fc específica como se define en las reivindicaciones. Además, la invención proporciona un polinucleótido que codifica la construcción de anticuerpo, un vector que comprende este polinucleótido, células hospedadoras que expresan la construcción y una composición farmacéutica que comprende las mismas como se define en las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

Figura 1: La figura 1a muestra un diagrama de una realización de una construcción de anticuerpo de la invención. La figura 1b muestra una construcción de anticuerpo Fc heterodimérica y la figura 1c muestra una construcción de anticuerpo cruzado "X-body" descrita en la técnica. Los pares cargados indicados se introducen para forzar la heterodimerización. La figura 1d muestra la fusión de una construcción de anticuerpo con una seroalbúmina humana (HSA/hALB).

Figura 2: Evaluación de la activación de linfocitos T independiente de diana por construcciones de anticuerpo BiTE® HLE de diana A. 2(a) Construcción de anticuerpo de la invención en un ensayo de activación de 48 h con PBMC humanos (3x); diluciones seriadas de BiTE® HLE (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); sin o con bloqueo de FcR [10 mg/ml de hulgG (Kiovog, Baxter)]; medición por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] sobre linfocitos T CD4+, CD8+. 2(b) Construcción de anticuerpo hetero-Fc en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanos y PBMC reducidos de células CD14+/CD33+ (3x); diluciones seriadas de BiTE® HLE (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medición por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] sobre linfocitos T CD4+, CD8+.

Figura 3: Evaluación de la activación de linfocitos T independiente de diana por construcciones de anticuerpo BiTE® HLE. 3(a) Construcción de anticuerpo de diana B de la invención en un ensayo de activación de 48 h con PBMC humanos (3x); diluciones seriadas de BiTE® HLE (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); sin o con bloqueo de FcR [10 mg/ml de hulgG (Kiovog, Baxter)]; medición por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] sobre linfocitos T CD4+, CD8+. 3(b) Construcción de anticuerpo hetero-Fc de diana B en ensayo de activación de 48 h con PBMC humanos y PBMC reducidos de células CD14+/CD33+ (3x); diluciones seriadas de BiTE® HLE (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medición por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] sobre linfocitos T CD4+, CD8+. 3(c) Construcción X-body de diana B en un ensayo de activación de 48 h con PBMC humanos y PBMC reducidos de células CD14+/CD33+ (3x); diluciones seriadas de BiTE® HLE (inicio 20 nM; 1:5, 7x+blanco); medición por FACS de la expresión de CD69 y CD25 [no mostrada] sobre linfocitos T CD4+, CD8+. 3(d) - 3(f) Se cultivaron ^pB^mC aislados de tres donadores humanos sanos diferentes con concentraciones crecientes de construcciones de anticuerpo biespecíficas HLE específicas para diana B durante 48 h. La expresión del marcador de activación CD69 en linfocitos T CD4+ y CD8+ se determinó por análisis citométrico de flujo usando un mAb conjugado con PE-Cy7 específico para CD69.

Figura 4: Unión a C1q del complemento de construcciones de anticuerpo BiTE® de fusión a Fc. Construcciones de anticuerpo BiTE® de fusión a Fc (BiTE® Fc monocatenario (triángulos), BiTE® hetero Fc (cuadrados), BiTE® canónico (círculos)) se recubrieron en una placa Maxisorp (en serie de dilución), antes de incubación con suero humano combinado e incubación con anticuerpo policlonal murino anti-CC1q humano, se visualizaron mediante conjugado de cabra anti-Fc de ratón-AP.

Figura 5: Perfiles PK medios de dos construcciones de anticuerpo BiTE® diferentes de unión a BCMA después de administración de una sola dosis en macacos cangrejeros. Por razones de compatibilidad, las concentraciones de suero se normalizaron a la dosis de 15 pg/kg y se indicaron en nmol.

Figura 6: Perfiles PK medios de nueve construcciones de anticuerpo BiTE® diferentes, cada una fusionada a un resto de prolongación de la semivida scFc. Por razones de compatibilidad, las concentraciones de suero se normalizaron a la dosis de 15 pg/kg y se indicaron en nmol.

Figura 7: Variantes de scFc biespecíficas D9F (SEQ ID NO: 105), T2G (SEQ ID NO: 106), D3L (SEQ ID NO: 107), T7I (SEQ ID NO: 108) y K6C (SEQ ID NO: 109). Un tercer dominio preferido de una construcción de anticuerpo de la presente invención es el tercer dominio abarcado por SEQ ID NO: 105.

Figura 8: Determinación basada en resonancia de plasmones superficiales (SPR) de la unión a FcRn humano. Las construcciones D9F, T2G, D3L, T7I y K6C se ensayaron cada una por su capacidad de unión contra FcRn humano en experimentos de SPR (Biacore). La unión máxima durante la fase de inyección se midió para todas las construcciones como las unidades de respuesta respectivas (UR), equivalentes al aumento de masa molecular en el chip CM5 recubierto de FcRn debido a la construcción unida. Todas las construcciones se midieron por duplicado. Se representan los valores promedio de las determinaciones duplicadas en la figura 8A y 8B.

Figura 9: Las construcciones D9F, T2G, D3L, T7I y K6C y un anticuerpo IgG1-kappa humano MT201 se ensayaron cada uno por su capacidad de unión contra FcRn humano en experimentos de SPR (Biacore). La unión máxima durante la fase de inyección se midió para todas las construcciones como las unidades de respuesta respectivas (UR), equivalentes al aumento de masa molecular en el chip CM5 recubierto de FcRn debido a la construcción unida. Todas las construcciones se midieron por duplicado. Se representan los valores promedio de las determinaciones duplicadas, incluyendo las barras de error la desviación típica.

Descripción detallada

Además de la semivida significativamente prolongada de las construcciones de anticuerpo biespecíficas de la invención, la fusión de la modalidad de Fc específica también es responsable de un impacto significativo sorprendente sobre el primero y segundo dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención. Por tanto, aunque otras modalidades de prolongación de la semivida de construcciones de anticuerpo de acoplamiento a linfocitos T muestran rasgos característicos preferidos individuales, la elección de la presente modalidad de Fc específica permite proporciona moléculas biespecíficas que típicamente muestran un amplio espectro de características preferidas de un formato molecular robusto y, por tanto, permite el desarrollo de composiciones farmacéuticas prometedoras.

Por tanto, la presente invención proporciona una construcción de anticuerpo monocatenario, que comprende: un primer dominio que se une a BCMA,

un segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3s humana y/o de Macaca; y un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, comprendiendo cada uno una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en la que dichos dos monómeros polipeptídicos se fusionan entre sí mediante un conector peptídico.

La expresión "construcción de anticuerpo" se refiere a una molécula en que la estructura y/o función se basan en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o entera y/o se extraen de los dominios de la cadena pesada variable (VH) y/o cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo o fragmento del mismo. Una construcción de anticuerpo, por tanto, puede unirse a su diana o antígeno específico. Además, el dominio de unión de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención comprende los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo que permiten la unión a la diana. Este requisito mínimo puede definirse, por ejemplo, por la presencia de al menos las tres CDR de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región ^vL) y/o las tres CDR de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH), preferiblemente las seis CDR. Una estrategia alternativa para definir los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo es la definición del epítopo del anticuerpo dentro de la estructura de la diana específica, respectivamente, el dominio proteínico de la proteína diana que comprende la región epitópica (grupo epitópico) o por referencia a un anticuerpo específico que compite con el epítopo del anticuerpo definido. Los anticuerpos en los que se basan las construcciones de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, recombinantes, quiméricos, desinmunizados, humanizados y humanos.

El dominio de unión de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención puede comprender, por ejemplo, los grupos mencionados anteriormente de CDR. Preferiblemente, esas CDR están comprendidas en la región flanqueante de una región variable de la cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de la cadena pesada de anticuerpo (VH); son embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo retienen alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno intacto. Ejemplos adicionales para el formato de fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo o dominios de unión incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544 546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada y (7) un Fv monocatenario (scFv), siendo preferido el último (por ejemplo, derivado de una colección de scFv). Ejemplos de realizaciones de construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención se describen, por ejemplo, en los documentos WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO 2014/144722, WO 2014/151910 y WO 2015/048272. También dentro de la definición de "dominio de unión" o "dominio que se une" están los fragmentos de anticuerpos de longitud completa, tales como VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 o "r IgG" ("semianticuerpo"). Las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención también pueden comprender fragmentos modificados de anticuerpos, también denominados variantes de anticuerpo, tales como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFab, diacuerpos monocatenarios, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem y anticuerpos de un solo dominio, tales como nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden simplemente un dominio variable, que podría ser VHH, VH o VL, que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "Fv monocatenario", "anticuerpos monocatenarios" o "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpo de una sola cadena polipeptídica que comprenden las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la ligera, pero carecen de las regiones constantes. En general, un anticuerpo monocatenario comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL, que posibilita que forme la estructura deseada que permitiría la unión al antígeno. Los anticuerpos monocatenarios se analizan en detalle por Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pág. 269-315 (1994). Se conocen diversos métodos de generación de anticuerpos monocatenarios, incluyendo los descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 4.694.778 y 5.260.203; la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 88/01649; Bird (1988) Science 242: 423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334: 54454; Skerra et al. (1988) Science 242: 1038-1041. En realizaciones específicas, los anticuerpos monocatenarios también pueden ser biespecíficos, multiespecíficos, humanos, y/o humanizados y/o sintéticos.

Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y, por tanto, construcciones biespecíficas, específicamente que se unen a solamente dos estructuras antigénicas, así como construcciones poliespecíficas/multiespecíficas, que se unen específicamente a más de dos estructuras antigénicas, por ejemplo, tres, cuatro o más, a través de distintos dominios de unión. Además, la definición de la expresión "construcción de anticuerpo" incluye moléculas que consisten en solamente una cadena polipeptídica, así como moléculas que consisten en más de una cadena polipeptídica, que son cadenas que pueden ser idénticas (homodímeros, homotrímeros u homooligómeros) o diferentes (heterodímero, heterotrímero o heterooligómero). Ejemplos para los anticuerpos identificados anteriormente y variantes o derivados de los mismos se describen inter alia en Harlow y Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) y Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann y Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2.a ed.

2010 y Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

El término "biespecífica", como se usa en la presente memoria, se refiere a una construcción de anticuerpo que es "al menos biespecífica", es decir, comprende al menos un primer dominio de unión y un segundo dominio de unión, en la que el primer dominio de unión se une a un antígeno o diana (aquí: BCMA) y el segundo dominio de unión se une a otro antígeno o diana (aquí: CD3). Por consiguiente, las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención comprenden especificidades por al menos dos antígenos o dianas diferentes. Por ejemplo, el primer dominio preferiblemente no se une a un epítopo extracelular de CD3s de una o más de las especies como se describen en la presente memoria. La expresión "antígeno de superficie celular diana" se refiere a una estructura antigénica expresada por una célula y que está presente en la superficie celular, de modo que está accesible para una construcción de anticuerpo como se describe en la presente memoria. Puede ser una proteína, preferiblemente la parte extracelular de una proteína, o una estructura carbohidratada, preferiblemente una estructura carbohidratada de una proteína, tal como una glucoproteína. Es preferiblemente un antígeno tumoral. La expresión "construcción de anticuerpo biespecífica" de la invención también abarca construcciones de anticuerpo multiespecíficas tales como construcciones de anticuerpo triespecíficas, incluyendo las últimas tres dominios de unión, o construcciones que tienen más de tres (por ejemplo, cuatro, cinco...) especificidades.

Dado que las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención son (al menos) biespecíficas, no se producen de forma natural y son notablemente diferentes de los productos de origen natural. Una construcción de anticuerpo o inmunoglobulina "biespecífica", por tanto, es un anticuerpo o inmunoglobulina híbrida artificial que tiene al menos dos lados de unión distintos con diferentes especificidades. Las construcciones de anticuerpo biespecíficas pueden producirse mediante una diversidad de métodos, incluyendo fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990).

Los al menos dos dominios de unión y los dominios variables (VH/VL) de la construcción de anticuerpo de la presente invención pueden comprender o no conectores peptídicos (péptidos espaciadores). La expresión "conector peptídico" comprende, de acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos por la que las secuencias de aminoácidos de un dominio (variable y/o de unión) y otro dominio (variable y/o de unión) de la construcción de anticuerpo de la invención se unen entre sí. Los conectores peptídicos también pueden usarse para fusionar el tercer dominio a los otros dominios de la construcción de anticuerpo de la invención. Un rasgo característico técnico esencial de dicho conector peptídico es que no comprende ninguna actividad de polimerización. Entre los conectores peptídicos adecuados están los descritos en las patentes de Estados Unidos 4.751.180 y 4.935.233 o el documento WO 88/09344. Los conectores peptídicos también pueden usarse para fijar otros dominios o módulos o regiones (tales como dominios de prolongación de la semivida) a la construcción de anticuerpo de la invención.

Las construcciones de anticuerpo de la presente invención son preferiblemente "construcciones de anticuerpo generadas in vitro". Esta expresión se refiere a una construcción de anticuerpo de acuerdo con la definición anterior donde toda o parte de la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) se genera en una selección de células no inmunitarias, por ejemplo, una presentación de fagos in vitro, chip de proteínas o cualquier otro método en que puedan ensayarse las secuencias candidatas por su capacidad de unirse a un antígeno. Esta expresión, por tanto, excluye preferiblemente secuencias generadas únicamente a partir de reordenamiento genómico en un inmunocito en un animal. Un "anticuerpo recombinante" es un anticuerpo hecho a través del uso de tecnología de ADN recombinante o genomanipulación.

La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) o construcción de anticuerpo monoclonal como se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural y/o modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un solo lado antigénico o determinante en el antígeno, en contraste con preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (o epítopos). Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hidridoma, por tanto, no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivo continuo de líneas celulares. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar pueden prepararse por el método de hibridoma descrito por primera vez por Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.816.567). Ejemplos de técnicas adicionales para producir anticuerpos monoclonales humanos incluyen la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

Entonces los hibridomas pueden cribarse usando métodos convencionales, tales como enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y análisis por resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Puede usarse cualquier forma del antígeno pertinente como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, cualquier variante o fragmento del mismo, así como un péptido antigénico del mismo. Puede usarse resonancia de plasmones superficiales como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de los anticuerpos fágicos que se unen a un epítopo de un antígeno de superficie celular diana (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Otro método ejemplar de preparar anticuerpos monoclonales incluye cribar colecciones de expresión de proteínas, por ejemplo, colecciones de presentación en fagos o de presentación en ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., patente de Estados Unidos n.° 5.223.409; Smith (1985) Science 228: 1315 1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Además del uso de colecciones de presentación, el antígeno pertinente puede usarse para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un roedor (tal como un ratón, hámster, conejo o rata). En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible manipular cepas de ratón deficientes de producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los locus de Ig (inmunoglobulina) humana. Usando la tecnología de hibridoma, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, documentos US 2003-0070185, WO 96/34096 y WO 96/33735.

Un anticuerpo monoclonal también puede obtenerse de un animal no humano, y después modificarse, por ejemplo, humanizarse, desinmunizarse, hacerse quimérico etc., usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Ejemplos de construcciones de anticuerpo modificadas incluyen variantes humanizadas de anticuerpos no humanos, anticuerpos de "afinidad madurada" (véase, por ejemplo, Hawkins et al. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) y mutantes de anticuerpo con una o más funciones efectoras alteradas (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.648.260, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.).

En inmunología, la maduración de la afinidad es el proceso por el que los linfocitos B producen anticuerpos con afinidad aumentada por el antígeno durante el transcurso de una respuesta inmunitaria. Con exposiciones repetidas al mismo antígeno, un hospedador producirá anticuerpos de afinidades sucesivamente mayores. Como el prototipo natural, la maduración de la afinidad in vitro se basa en los principios de mutación y selección. La maduración de la afinidad in vitro se ha usado satisfactoriamente para optimizar anticuerpos, construcciones de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo. Se introducen mutaciones aleatorias dentro de las CDR usando radiación, mutágenos químicos o PCR propensa a errores. Además, la diversidad genética puede aumentarse por entremezclado de cadenas. Dos o tres rondas de mutación y selección usando métodos de presentación como presentación en fagos habitualmente provoca fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo nanomolar bajo.

Un tipo preferido de una variación por sustitución aminoacídica de las construcciones de anticuerpo implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la una o más variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo original a partir del que se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica maduración de la afinidad usando presentación en fagos. En resumen, varios lados de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 lados) se mutan para generar todas las posibles sustituciones aminoacídicas en cada lado. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo se presentan de una manera monovalente a partir de partículas fágicas filamentosas como fusiones con el producto del gen III de M13 compactadas dentro de cada partícula. Las variantes presentadas en fagos entonces se criban por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en la presente memoria. Para identificar lados candidatos de la región hipervariable para modificación, puede realizarse mutagénesis por barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígenoanticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el dominio de unión y, por ejemplo, BCMA humano. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez generadas dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en la presente memoria y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes pueden seleccionarse para desarrollo adicional.

Los anticuerpos monoclonales y construcciones de anticuerpo de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siembre que muestren la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno del dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, simios inferiores del Viejo Mundo, simios superiores etc.) y secuencias de la región constante humana. Se ha descrito una diversidad de estrategias para preparar anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314: 452, 1985, Cabilly et al., patente de Estados Unidos n.° 4.816.567; Boss et al., patente de Estados Unidos n.° 4.816.397; Tanaguchi et al., documentos EP 0171496; EP 0173494; y GB 2177096.

Un anticuerpo, construcción de anticuerpo, fragmento de anticuerpo o variante de anticuerpo también puede modificarse por eliminación específica de epítopos de linfocitos T humanos (un método llamado "desinmunización") por los métodos divulgados, por ejemplo, en el documento WO 98/52976 o WO 00/34317. En resumen, los dominios variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo pueden analizarse para péptidos que se unan a MHC de clase II; estos péptidos representan posibles epítopos de linfocitos T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopos de linfocitos T, puede aplicarse una estrategia de modelado informático denominada "hilado peptídico", y además puede hacerse búsqueda en una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humano para motivos presentes en las secuencias de VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos DR principales de MHC de clase II y, por tanto, constituyen posibles epítopos de linfocitos T. Los posibles epítopos de linfocitos T detectados pueden eliminarse sustituyendo pequeños números de residuos aminoacídicos en los dominios variables, o preferiblemente, por sustituciones de un solo aminoácido. Típicamente, se hacen sustituciones conservativas. A menudo, pero no exclusivamente, puede usarse un aminoácido común para una posición en secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. Se divulgan secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; y Tomlinson et al. (1995) Em BO J. 14: 14: 4628-4638. El listado V BASE proporciona un listado exhaustivo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas secuencias pueden usarse como una fuente de secuencia humana, por ejemplo, para regiones flanqueantes y CDR. También pueden usarse regiones flanqueantes humanas consenso, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.300.064.

Los anticuerpos "humanizados", construcciones de anticuerpo, variantes o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) son anticuerpos o inmunoglobulinas de secuencias en su mayor parte humanas, que contienen (a) una o más secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo destinatario) en que los residuos de una región hipervariable (también CDR) del destinatario se remplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (por ejemplo, roedor) (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, hámster o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región flanqueante Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se remplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los "anticuerpos humanizados" como se usa en la presente memoria también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo destinatario ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más y optimizar el funcionamiento del anticuerpo. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

Pueden generarse anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos remplazando secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicados en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables Fv humanos. Se proporcionan métodos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos por Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; y por los documentos US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; y US 6.407.213. Esos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se describe anteriormente, así como de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado entonces puede clonarse en un vector de expresión apropiado.

Los anticuerpos humanizados también pueden producirse usando animales transgénicos tales como ratones que expresan genes de la cadena pesada y ligera humana, pero no pueden expresar los genes endógenos de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de ratón. Winter describe un método ejemplar de injerto de CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria (patente de Estados Unidos n.° 5.225.539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden remplazarse con al menos una parte de una CDR no humana, o únicamente algunas de las CDR pueden remplazarse con CDR no humanas. Es necesario remplazar únicamente el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Un anticuerpo humanizado puede optimizarse mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencia consenso, sustituciones de la línea germinal y/o retromutaciones. Dichas moléculas de inmunoglobulina alteradas pueden prepararse por cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica, (por ejemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, y documento EP 239400).

Las expresiones "anticuerpo humano", "construcción de anticuerpo human" y "domino de unión humano" incluyen anticuerpos, construcciones de anticuerpo y dominios de unión que tienen regiones de anticuerpo tales como regiones o dominios variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas en la técnica incluyendo, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Los anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpo o dominios de unión de la invención pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de lado in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, en CDR3. Los anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpo o dominios de unión pueden tener al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones remplazadas con un residuo aminoacídico que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal. La definición de anticuerpos humanos, construcciones de anticuerpo y dominios de unión, como se usa en la presente memoria, sin embargo, también contempla "anticuerpos completamente humanos", que incluyen solamente secuencias humanas no alteradas artificial y/o genéticamente de anticuerpos, ya que estos pueden obtenerse usando tecnologías o sistemas tales como Xenomouse. Preferiblemente, un "anticuerpo completamente humano" no incluye residuos aminoacídicos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana.

En algunas realizaciones, las construcciones de anticuerpo de la invención son construcciones de anticuerpo "aisladas" o "sustancialmente puras". "Aislada" o "sustancialmente pura", cuando se usa para describir las construcciones de anticuerpo divulgadas en la presente memoria, significa una construcción de anticuerpo que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción. Preferiblemente, la construcción de anticuerpo está libre o sustancialmente libre de asociación con todos los demás componentes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tales como los resultantes de células transfectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas u otros solutos proteínicos o no proteínicos. Las construcciones de anticuerpo pueden constituir, por ejemplo, al menos aproximadamente un 5 %, o al menos aproximadamente un 50 % en peso de la proteína total en una muestra dada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir de un 5 % a un 99,9 % en peso del contenido de proteína total, dependiendo de las circunstancias. El polipéptido puede prepararse a una concentración significativamente mayor a través del uso de un promotor inducible o promotor de alta expresión, de modo que se preparar a niveles de concentración aumentados. La definición incluye la producción de una construcción de anticuerpo en una amplia diversidad de organismos y/o células hospedadoras que son conocidas en la técnica. En realizaciones preferidas, la construcción de anticuerpo se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de cubeta giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. Normalmente, sin embargo, una construcción de anticuerpo aislada se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión "dominio de unión" caracteriza, en relación con la presente invención, un dominio que se une a/interactúa con/reconoce (específicamente) un epítopo diana dado o un lado diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: BCMA y CD3, respectivamente. La estructura y función del primer dominio de unión (que reconoce BCMA), y preferiblemente también la estructura y/o función del segundo dominio de unión (que reconoce CD3), se basan en la estructura y/o función de un anticuerpo, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o total y/o se extraen de los dominios de la cadena pesada variable (VH) y/o cadena ligera variable (VL) de un anticuerpo o fragmento del mismo. Preferiblemente, el primer dominio de unión se caracteriza por la presencia de tres CDR de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). El segundo dominio de unión preferiblemente comprende también los requisitos estructurales mínimos de un anticuerpo, que permiten la unión a la diana. Más preferiblemente, el segundo dominio de unión comprende al menos tres CDR de la cadena ligera (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL) y/o tres CDR de la cadena pesada (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH). Se prevé que el primer y/o segundo dominio de unión se produzca o se pueda obtener por métodos de presentación en fagos o de cribado colecciones en lugar de injertar secuencias de CDR de un anticuerpo preexistente (monoclonal) en un armazón.

De acuerdo con la presente invención, los dominios de unión están en forma de un polipéptido. Dichos polipéptidos pueden incluir partes proteínicas y partes no proteínicas (por ejemplo, conectores químicos o agentes reticulantes químicos tales como glutaraldehído). Las proteínas (incluyendo fragmentos de las mismas, preferiblemente fragmentos biológicamente activos, y péptidos, que tienen habitualmente menos de 30 aminoácidos) comprenden dos o más aminoácidos acoplados entre sí mediante un enlace peptídico covalente (que produce una cadena de aminoácidos).

El término "polipéptido" como se usa en la presente memoria describe un grupo de moléculas, que habitualmente consiste en más de 30 aminoácidos. Los polipéptidos pueden formar además multímeros tales como dímeros, trímetros y oligómeros superiores, es decir, que consisten en más de una molécula polipeptídica. Las moléculas polipeptídicas que forman dichos dímeros, trímeros etc. pueden ser idénticos o no idénticos. Las estructuras de orden superior correspondientes de dichos multímeros se denominan, en consecuencia, homo- o heterodímeros, homo- o heterotrímeros etc. Un ejemplo de un hereteromultímero es una molécula de anticuerpo que, en si forma de origen natural, consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas. Las expresiones "péptido", "polipéptido" y "proteína" también se refieren a péptidos/polipéptidos/proteínas modificadas de forma natural, en las que la modificación se logra, por ejemplo, por modificaciones postraduccionales como glucosilación, acetilación, fosforilación y similares. Un "péptido", "polipéptido" o "proteína", cuando se menciona en la presente memoria también puede modificarse químicamente, tal como pegilarse. Dichas modificaciones son bien conocidas en la técnica y se describen en la presente memoria a continuación.

Preferiblemente, el dominio de unión que se une a BCMA y/o el dominio de unión que se une a CD3s son dominios de unión humanos. Los anticuerpos y construcciones de anticuerpo que comprenden al menos un dominio de unión humano evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos o construcciones de anticuerpo que poseen regiones variables y/o constantes no humanas tales como de roedor (por ejemplo, murinas, de rata, de hámster o de conejo). La presencia de dichas proteínas derivadas de roedor puede dar lugar a la rápida eliminación de los anticuerpos o construcciones de anticuerpo o puede dar lugar a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo o construcción de anticuerpo por parte de un paciente. Para evitar el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpo derivadas de roedor, pueden generarse anticuerpos/construcciones de anticuerpo humanas o completamente humanas a través de la introducción de función de anticuerpo humano en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos.

La capacidad de clonar y reconstruir locus humanos de tamaño de megabases en YAC y de introducirlos en la línea germinal de ratón proporciona una estrategia poderosa de dilucidar los componentes funcionales de locus muy grandes o toscamente calcografiados, así como de generar modelos útiles de enfermedad humana. Además, el uso de dicha tecnología para la sustitución de locus de ratón con sus equivalentes humanos podría proporcionar ideas únicas de la expresión y regulación de productos génicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su implicación en la inducción y progresión de enfermedad.

Una aplicación práctica importante de dicha estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de locus de inmunoglobulina (Ig) humana en ratones en que los genes de Ig endógenos se han inactivado ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos subyacentes a la expresión programada y ensamblaje de los anticuerpos, así como su función en el desarrollo de linfocitos B. Además, dicha estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales (mAb) completamente humanos, un hito importante hacia el cumplimiento de la promesa de tratamiento de anticuerpos en enfermedad humana. Se espera que los anticuerpos o construcciones de anticuerpo completamente humanas minimicen las respuesta inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAb de ratón o derivados de ratón y, por tanto, aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos/construcciones de anticuerpo administradas. Puede esperarse que el uso de anticuerpos o construcciones de anticuerpo completamente humanas proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad y cáncer, que requieren administraciones repetidas de compuesto.

Una estrategia hacia este objetivo fue diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los locus de Ig humana de manera anticipada, de modo que los ratones produjeran un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Grandes fragmentos de Ig humana conservarían la gran diversidad de genes variables, así como la apropiada regulación de la producción y expresión de anticuerpos. Explotando la maquinaria de ratón para la diversificación y selección de anticuerpos y la ausencia de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio de anticuerpos humanos reproducido en estas cepas de ratón de producir anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridoma, podrían producirse y seleccionarse fácilmente mAb humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada. Esta estrategia general se demostró en relación a la generación de las primeras cepas de ratón XenoMouse (véase Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994)). Las cepas XenoMouse se diseñaron con cromosomas artificiales de levadura (YAC) que contenían fragmentos de configuración de la línea germinal de 245 kb y 190 kb de tamaño del locus de la cadena pesada human y el locus de la cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias centrales de región variable y constante. Los YAC que contenían la Ig humana demostraron ser compatibles con el sistema de ratón tanto para el reordenamiento como la expresión de anticuerpos y pudieron sustituir los genes de Ig de ratón inactivados. Esto se demostró por su capacidad de inducir el desarrollo de linfocitos B, de producir un repertorio humano similar al adulto de anticuerpos completamente humanos y de generar mAb humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugirieron que la introducción de partes más grandes de los locus de Ig humana que contienen mayores números de genes V, elementos reguladores adicionales y regiones constantes de Ig humana pueden recapitular el repertorio sustancialmente completo que es característico de la respuesta humoral humana a infección e inmunización. El trabajo de Green et al. se amplió recientemente para la introducción de más de aproximadamente un 80 % del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de YAC de configuración de la línea germinar de megabases de tamaño de los locus de la cadena pesada humana y locus de la cadena ligera kappa, respectivamente. Véase Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997).

La producción de los ratones XenoMouse se analiza adicionalmente y se esboza en las patentes de Estados Unidos n.° 6.673.986; 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181 y 5.939.598, así como las solicitudes de patente de Estados Unidos subyacentes, y las patentes japonesas n.° 3 068 180 B2, 3068 506 B2 y 3068 507 B2. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), documentos EP 0463151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 y WO 03/47336.

En una estrategia alternativa, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado una estrategia de "minilocus". En la estrategia de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en una construcción para su inserción en un animal. Esta estrategia se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.545.807 de Surani et al. y las patentes de Estados Unidos n.° 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; y 6.255.458 cada una de Lonberg y Kay, las patentes de Estados Unidos n.° 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, las patentes de Estados Unidos n.° 5.612.205; 5.721.367; y 5.789.215 de Berns et al., y la patente de Estados Unidos n.° 5.643.763 de Choi y Dunn. Esta estrategia se describe además en las patentes de Estados Unidos de GenPharm International n.° 5.569.825; 5.789.650; 5.545.806; 5.661.016; 5.814.318; y 5.364.079, así como las solicitudes de patente de Estados Unidos subyacentes. Véanse también los documentos EP 0546073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente de Estados Unidos n.° 5.981.175. Véase además Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994) y Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en que, a través de fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas o cromosomas enteros. Véanse las publicaciones de solicitud de patente europea n.° EP 773288 y EP 843961. Xenerex Biosciences está desarrollando una tecnología para la posible generación de anticuerpos humanos. En esta tecnología, se reconstituyen ratones SCID con células linfáticas humanas, por ejemplo, linfocitos B y/o T. Entonces los ratones se inmunizan con un antígeno y puede generar una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Véanse las patentes de Estados Unidos n.° 5.476.996; 5.698.767 y 5.958.765.

Las respuestas de anticuerpo humano antirratón (HAMA) han dado lugar a que la industria prepare anticuerpos quiméricos o humanizados de otro modo. Sin embargo, se espera que se observen determinadas respuestas de anticuerpo humano antiquimérico (HACA), particularmente en utilizaciones crónicas o multidosis del anticuerpo. Por tanto, sería deseable proporcionar construcciones de anticuerpo que comprendan un dominio de unión humano contra BCMA y un dominio de unión humano contra CD3s para minar los problemas y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA.

Las expresiones "se une (específicamente) a", "reconoce (específicamente)", "está dirigido (específicamente) a" y "reacciona (específicamente) con" significan, de acuerdo con esta invención, que un dominio de unión interactúa o interactúa específicamente con un epítopo dado o un lado de diana dado en las moléculas diana (antígenos), aquí: BCMA y CD3s, respectivamente.

El término "epítopo" se refiere a un lado en un antígeno al que un dominio de unión, tal como un anticuerpo o inmunoglobulina, o un derivado, fragmento o variante de un anticuerpo o una inmunoglobulina, se une específicamente. Un "epítopo" es antigénico y, por tanto, el término epítopo también se denomina a veces en la presente memoria "estructura antigénica" o "determinante antigénico". Por tanto, el dominio de unión es un "lado de interacción con antígeno". Se entiende que dicha unión/interacción también define un "reconocimiento específico". Los "epítopos" pueden formarse mediante aminoácidos contiguos o mediante aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Un "epítopo lineal" es un epítopo donde una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye al menos 3 o al menos 4, y más habitualmente, al menos 5 o al menos 6 o al menos 7, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos en una secuencia única.

Un "epítopo conformacional", en contraste con un epítopo lineal, es un epítopo en el que la secuencia primaria de los aminoácidos que componen el epítopo no es el único componente determinante del epítopo reconocido (por ejemplo, un epítopo en el que la secuencia primaria de aminoácidos no se reconoce necesariamente por el dominio de unión). Típicamente un epítopo conformacional comprende un número aumentado de aminoácidos con respecto a un epítopo lineal. Con respecto al reconocimiento de epítopos conformacionales, el dominio de unión reconoce una estructura tridimensional del antígeno, preferiblemente un péptido o proteína o fragmento de la misma (en el contexto de la presente invención, la estructura antigénica para uno de los dominios de unión está comprendida dentro de la proteína antigénica de superficie celular diana). Por ejemplo, cuando una molécula proteínica se pliega para formar una estructura tridimensional, determinados aminoácidos y/o la cadena principal polipeptídica que forma el epítopo conformacional quedan yuxtapuestos, lo que posibilita que el anticuerpo reconozca el epítopo. Los métodos para determinar la conformación de epítopos incluyen, aunque sin limitación, cristalografía de rayos X, espectroscopia por resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-RMN) y marcaje de espín dirigido al sitio y espectroscopia por resonancia paramagnética electrónica (RPE).

En lo siguiente se describe un método para cartografiado de epítopos: Cuando una región (un tramo de aminoácidos contiguos) en la proteína BCMA humana se intercambia/remplaza con su correspondiente región de un BCMA no humano y no de primate (por ejemplo, BCMA ratón, pero también pueden ser concebibles otros como de pollo, rata, hámster, conejo etc.), se espera que se produzca una disminución en la unión del dominio de unión, salvo que el dominio de unión tenga reactividad cruzada con el BCMA no humano no de primate usado. Dicha disminución es preferiblemente al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %; más preferiblemente al menos un 60 %, 70 % o 80 %, y mucho más preferiblemente un 90 %, 95 % o incluso un 100 % en comparación con la unión a la región respectiva en la proteína BCMA humana, por lo que la unión a la región respectiva en la proteína BCMA humana se establece en un 100 %. Se prevé que las quimeras mencionadas anteriormente de BCMA humano/BCMA no humano se expresen en células CHO. También se prevé que las quimeras de BCMA humano/BCMA no humano se fusionen con un dominio transmembranario y/o dominio citoplásmico de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM.

En un método alternativo o adicional para el cartografiado de epítopos, pueden generarse varias versiones truncadas del dominio extracelular de BCMA humano para determinar una región específica que se reconoce por un dominio de unión. En estas versiones truncadas, los diferentes dominios/subdominios o regiones extracelulares de BCMA se eliminan por etapas, partiendo del extremo N. Se prevé que las versiones de BCMA truncadas puedan expresarse en células CHO. También se prevé que las versiones de BCMA truncadas puedan fusionarse con un dominio transmembranario y/o dominio citoplásmico de una proteína unida a la membrana diferente tal como EpCAM. También se prevé que las versiones de BCMA truncadas pueden abarcar un dominio de péptido señal en su extremo N, por ejemplo, un péptido señal derivado del péptido señal de la cadena pesada de IgG de ratón. Se prevé además que las versiones de BCMA truncadas puedan abarcar un dominio v5 en su extremo N (después del péptido señal) que permite verificar su correcta expresión en la superficie celular. Se espera que se produzca una disminución o una pérdida de unión con esas versiones de BCMA truncadas que no abarcan ninguna región más de BCMA que se reconoce por el dominio de unión. La disminución de unión es preferiblemente al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %; más preferiblemente al menos un 60 %, 70 %, 80 %, y mucho más preferiblemente un 90 %, 95 % o incluso un 100 %, por lo que la unión a la proteína BCMA humana completa (o su región o dominio extracelular) se establece en 100.

Un método adicional para determinar la contribución de un residuo específico de BCMA al reconocimiento por una construcción de anticuerpo o dominio de unión es barrido de alanina (véase, por ejemplo, Morrison KL y Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. junio de 2001; 5(3): 302-7), donde cada residuo a analizar se remplaza por alanina, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se usa alanina a causa de su grupo funcional metilo no voluminoso, químicamente inerte que, no obstante, imita las referencias de estructura secundaria que poseen muchos de los demás aminoácidos. A veces pueden usarse aminoácidos voluminosos tales como valina o leucina en casos donde se deseable conservación del tamaño de los residuos mutados. El barrido de alanina es una tecnología desarrollada que se ha usado durante un largo periodo de tiempo.

La interacción entre el dominio de unión y el epítopo o la región que comprende el epítopo implica que un dominio de unión muestra afinidad apreciable por el epítopo/la región que comprende el epítopo en una proteína o antígeno particular (aquí: BCMA y CD3, respectivamente) y, en general, no muestra reactividad significativa con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3. "Afinidad apreciable" incluye unión con una afinidad de aproximadamente 10-6 M (KD) o más fuerte. Preferiblemente, la unión se considera específica cuando la afinidad de unión es de aproximadamente 10-12 a 10-8 M, de 10-12 a 10-9 M, de 10-12 a 10-10 M, de 10-11 a 10-8 M, preferiblemente de aproximadamente 10-11 a 10-9 M. Que un dominio de unión reacciones específicamente con o se una a una diana puede ensayarse fácilmente, entre otras cosas, comparando la reacción de dicho dominio de unión con una proteína o antígeno diana con la reacción de dicho dominio de unión con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3. Preferiblemente, un dominio de unión de la invención no se une esencial o sustancialmente a proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3 (es decir, el primer dominio de unión no puede unirse a proteínas distintas de BCMA y el segundo dominio de unión no puede unirse a proteínas distintas de CD3). Una característica prevista de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es tener características de afinidad superiores en comparación con otros formatos HLE. Dicha afinidad superior, en consecuencia, sugiere una semivida prolongada in vivo. La semivida más larga de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede reducir la duración y frecuencia de administración que típicamente, lo contribuye a un cumplimiento mejorado por parte del paciente. Esto es de particular importancia ya que las construcciones de anticuerpo de la presente invención son particularmente beneficiosas para pacientes con cáncer muy debilitados o incluso con múltiples enfermedades.

La expresión "no se une esencial/sustancialmente" o "no puede unirse" significa que un dominio de unión de la presente invención no se une a una proteína o antígeno distinto de BCMA o CD3, es decir, no muestra reactividad de más de un 30 %, preferiblemente no más de un 20 %, más preferiblemente no más de un 10 %, particularmente preferiblemente no más de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 % con proteínas o antígenos distintos de BCMA o CD3, por lo que la unión a BCMA o CD3, respectivamente, se establece a un 100 %.

Se cree que la unión específica se logra mediante motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del dominio de unión y el antígeno. Por tanto, la unión se consigue como resultado de su estructura primaria, secundaria y/o terciaria, así como el resultado de modificaciones secundarias de dichas estructuras. La interacción específica del lado de interacción con antígeno con su antígeno específico puede provocar una unión simple de dicho lado al antígeno. Además, la interacción específica del lado de interacción con antígeno con su antígeno específico puede provocar, como alternativa o adicionalmente, el inicio de una señal, por ejemplo, debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc.

El término "variable" se refiere a las partes del anticuerpo o dominios de inmunoglobulina que muestran variabilidad en su secuencia y que están implicadas en la determinación de la especificidad y afinidad de unión de un anticuerpo particular (es decir, el "dominio o dominios variables"). El emparejamiento de una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) juntas forma un solo sitio de unión a antígeno.

La variabilidad no está distribuida de forma uniforme por todos los dominios variables de los anticuerpos; se concentra en subdominios de cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. Estos subdominios se denominan "regiones hipervariables" o "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR). Las partes más conservadas (es decir, no hipervariables) de los dominios variables se denominan regiones "flanqueantes" (FRM o FR) y proporcionan un armazón para las seis CDR en el espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de origen natural comprenden cada uno cuatro regiones FRM (FR1, FR2, FR3 y FR4), que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad por la FRM y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del lado de unión a antígeno (véase Kabat et al., loc. cit.).

El término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad, de la que tres componen el carácter de unión de una región variable de la cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) y tres componen el carácter de unión de una región variable de la cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno y, por tanto, contribuyen a la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: son los determinantes principales de especificidad antigénica.

Los límites exactos definidores y longitudes de las CDR están sujetos a diferentes sistemas de clasificación y numeración. Las CDR, por lo tanto, pueden denominarse según Kabat, Chotia, de contacto o cualquier otra definición de límites, incluyendo el sistema de numeración descrito en la presente memoria. A pesar de los diferentes límites, cada uno de estos sistemas tiene algún grado de solapamiento en lo que constituyen las denominadas "regiones hipervariables" dentro de las secuencias variables. Las definiciones de CDR de acuerdo con estos sistemas, por lo tanto, pueden diferir en la longitud y las áreas de límite con respecto a la región flanqueante adyacente. Véase, por ejemplo, Kabat (una estrategia basada en variabilidad de secuencia de especies cruzadas), Chotia (una estrategia basada en estudios cristalográficos de complejos de antígeno-anticuerpo) y/o MacCallum (Kabat et al., loc. cit.; Chotia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; y MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Otra norma más para caracterizar el lado de unión a antígeno es la definición de AbM usada por el programa informático de modelador de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). En la medida en que dos técnicas de identificación de residuos definen regiones de regiones solapantes, pero no idénticas, pueden combinarse para definir una CDR híbrida. Sin embargo, se prefiere la numeración de acuerdo con el denominado sistema de Kabat.

Típicamente, las CDR forman una estructura de bucle que puede clasificarse como una estructura canónica. La expresión "estructura canónica" se refiere a la conformación de cadena principal que adoptan los bucles de unión a antígeno (CDR). A partir de estudios estructurales comparativos, se ha descubierto que cinco de los seis bucles de unión a antígeno tienen solamente un repertorio limitado de conformaciones disponibles. Cada estructura canónica puede caracterizarse por los ángulos de torsión de la cadena principal polipeptídica. Los bucles correspondientes entre anticuerpos, por lo tanto, pueden tener estructuras tridimensionales similares, a pesar de la alta variabilidad de secuencia de aminoácidos en la mayoría de las partes de los bucles (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chotia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin y Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Además, hay una relación entre la estructura de bucle adoptada y las secuencias de aminoácidos que la rodean. La conformación de una clase canónica particular se determina por la longitud del bucle y los residuos aminoacídicos que residen en posiciones clave dentro del bucle, así como dentro de la región flanqueante conservada (es decir, fuera del bucle). La asignación a una clase canónica particular, por lo tanto, puede hacerse basándose en la presencia de estos residuos aminoacídicos clave.

La expresión "estructura canónica" también puede incluir consideraciones en cuanto a la secuencia lineal del anticuerpo, por ejemplo, como se cataloga por Kabat (Kabat et al., loc. cit.). El esquema (sistema) de numeración Kabat es una normal ampliamente adoptada para numerar los residuos aminoacídicos de un dominio variable de anticuerpo de una manera coherente y es el esquema preferido aplicado en la presente invención como también se menciona en otra parte en la presente memoria. También pueden usarse consideraciones estructurales adicionales para determinar la estructura canónica de un anticuerpo. Por ejemplo, esas diferencias no reflejadas completamente por la numeración de Kabat pueden describirse por el sistema de numeración de Chotia et al. y/o revelarse por otras técnicas, por ejemplo, cristalografía y modelador informático bi- o tridimensional. Por consiguiente, una secuencia de anticuerpo dada puede colocarse en una clase canónica que permite, entre otras cosas, identificar secuencias estructurales apropiadas (por ejemplo, basadas en un deseo de que incluyan una diversidad de estructuras canónicas en una colección). La numeración de Kabat de secuencias de aminoácidos de anticuerpo y consideraciones estructurales como se describe por Chotia et al., loc. cit. y sus implicaciones para interpretar aspectos canónicos de estructura de anticuerpo, se describen en la bibliografía. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas en la técnica. Para una revisión de la estructura de anticuerpo, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

La CDR3 de la cadena ligera y, particularmente, la CDR3 de la cadena pesada pueden constituir los determinantes más importantes en la unión al antígeno dentro de las regiones variables de la cadena ligera y pesada. En algunas construcciones de anticuerpo, la CDR3 de la cadena pesada parece constituir el área principal de contacto entre el antígeno y el anticuerpo. Pueden usarse esquemas de selección in vitro en que se varia la CDR3 en solitario para variar las propiedades de unión de un anticuerpo o determinar los residuos que contribuyen a la unión de un antígeno. Por tanto, la CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del lado de unión del anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corta como dos residuos aminoacídicos o de más de 26 aminoácidos.

En un anticuerpo o inmunoglobulina clásica de longitud completa cada cadena ligera (L) está unida a una cadena pesada (H) mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. El dominio CH más próximo a VH habitualmente se denomina CH1. Los dominios constantes ("C") no están directamente implicados en la unión al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y activación del complemento. La región Fc de un anticuerpo está comprendida dentro de los dominios constantes de la cadena pesada y puede, por ejemplo, interactúa con los receptores de Fc ubicados en la superficie celular.

La secuencia de los genes de anticuerpo después del ensamblaje y mutación somática es muy variada, y se estima que estos genes variados codifican 1010 diferentes moléculas de anticuerpo (Immunoglobulin Genes, 2.a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Por consiguiente, el sistema inmunitario proporciona un repertorio de inmunoglobulinas. El término "repertorio" se refiere a al menos una secuencia de nucleótidos derivada completa o parcialmente de al menos una secuencia que codifica al menos una inmunoglobulina. La una o más secuencias pueden generarse por reordenamiento in vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Como alternativa, la una o más secuencias pueden generarse a partir de una célula en respuesta a lo que produce reordenamiento, por ejemplo, estimulación in vitro. Como alternativa, parte o la totalidad de la secuencia o secuencias puede obtenerse por empalme de ADN, síntesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.565.332. Un repertorio puede incluir únicamente una secuencia o puede incluir una pluralidad de secuencias, incluyendo las de una colección genéticamente diversa.

La expresión "parte Fc" o "monómero Fc" significa, en relación a esta invención, un polipéptido que comprende al menos un dominio que tiene la función de un dominio CH2 y al menos un dominio que tiene la función de un dominio CH3 de una molécula de inmunoglobulina. Como es evidente por la expresión "monómero Fc", el polipéptido que comprende esos dominios CH es un "monómero polipeptídico". Un monómero Fc puede ser un polipéptido que comprende al menos un fragmento de la región constante de una inmunoglobulina, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante de la cadena pesada (CH1), pero manteniendo al menos una parte funcional de un dominio CH2 y una parte funcional de un dominio CH3, en el que el dominio CH2 es aminoterminal al dominio CH3. En un aspecto preferido de esta definición, un monómero Fc puede ser una región constante polipeptídica que comprende una parte de la región de bisagra de Ig-Fc, una región CH2 y una región CH3, en el que la región de bisagra es aminoterminal al dominio CH2. Se prevé que la región de bisagra de la presente invención promueva la dimerización. Dichas moléculas polipeptídicas de Fc pueden obtenerse por digestión con papaína de una región de inmunoglobulina (produciendo, por supuesto, un dímero de dos polipéptidos Fc), por ejemplo, y sin limitación. En otro aspecto de esta definición, un monómero Fc puede ser una región polipeptídica que comprende una parte de una región CH2 y una región CH3. Dichas moléculas polipeptídicas de Fc pueden obtenerse por digestión con pepsina de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, y sin limitación. En una realización, la secuencia polipeptídica de un monómero Fc es sustancialmente similar a una secuencia polipeptídica de Fc de: una región Fc de IgG1, una región Fc de IgG2, una región Fc de IgG3, una región Fc de IgG4, una región Fc de IgM, una región Fc de IgA, una región Fc de IgD y una región Fc de IgE. (Véase, por ejemplo, Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Como hay algo de variación entre las inmunoglobulinas, y únicamente por claridad, monómero Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de la cadena pesada de IgA, IgD e IgG, y los tres últimos dominios de inmunoglobulina de la región constante de la cadena pesada de IgE e IgM. Como se menciona, el monómero Fc también puede incluir la bisagra flexible N terminal a estos dominios. Para IgA e IgM, el monómero Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, la parte Fc comprende los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 y la bisagra entre los dos primeros dominios y CH2. Aunque los límites de la parte de Fc pueden variar, puede definirse que un ejemplo para una parte Fc de la cadena pesada de IgG humana que comprende una bisagra funcional, dominio CH2 y CH3, por ejemplo, comprende los residuos D231 (del dominio de bisagra, correspondiente a D234 en la tabla 1 a continuación) a P476, respectivamente L476 (para IgG4) del extremo carboxílico del dominio CH3, en el que la numeración es de acuerdo con Kabat. Las dos partes Fc o monómeros Fc, que se fusionan entre sí mediante un conector peptídico, definen el tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención, que también puede definirse como dominio scFc.

En una realización de la invención, se prevé que un dominio scFc como se divulga en la presente memoria, respectivamente los monómeros Fc fusionados entre sí, estén comprendidos en el tercer dominio de la construcción de anticuerpo.

En línea con la presente invención, una región de bisagra de IgG puede identificarse por analogía usando la numeración de Kabat como se expone en la tabla 1. En línea con lo anterior, se prevé que un dominio/región de bisagra de la presente invención comprenda los residuos aminoacídicos correspondientes al tramo de secuencia de IgG1 de D234 a P243 de acuerdo con la numeración de Kabat. Asimismo, se prevé que un dominio/región de bisagra de la presente invención comprenda o consista en la secuencia de bisagra de IgG1 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 99) (correspondiente al tramo de D234 a P243 como se muestra en la tabla 1 a continuación, también se prevén variaciones de dicha secuencia siempre que la región de bisagra aún promueva la dimerización). En una realización preferida de la invención, el sitio de glucosilación en la posición de Kabat 314 de los dominios CH2 en el tercer dominio de la construcción de anticuerpo se retira mediante una sustitución N314X, en la que X es cualquier aminoácido excluyendo Q. Dicha sustitución es preferiblemente una sustitución N314G. En una realización más preferida, dicho dominio CH2 comprende adicionalmente las siguientes sustituciones (posición de acuerdo con Kabat): V321C y R309C (estas sustituciones introducen el puente disulfuro de cisteína dentro del dominio en las posiciones de Kabat 309 y 321).

También se prevé que el tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención comprenda o consista, en orden amínico a carboxílico: DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 99) (es decir bisagra) -CH2-CH3-conector- DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 99) (es decir bisagra) -CH2-CH3. El conector peptídico de la construcción de anticuerpo mencionada anteriormente en una realización preferida se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros del mismo, es decir, (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 5 o mayor (por ejemplo, 5, 6, 7, 8 etc. o mayor), siendo preferido 6 ((Gly4Ser)6). Dicha construcción puede comprender además las sustituciones mencionadas anteriormente N314X, preferiblemente N314G, y/o las sustituciones adicionales V321C y R309C. En una realización preferida de las construcciones de anticuerpo de la invención como se define en la presente memoria anteriormente, se prevé que el segundo dominio se una a un epítopo extracelular de la cadena CD3s humana y/o de Macaca.

Tabla 1: numeración de Kabat de los residuos aminoacldicos de la región de bisagra

Numeración IMGT Traducción de Numeración de

para la bisagra aminoácido de IgG. Kabat

En otras realizaciones de la presente invención, el dominio/región de bisagra comprende o consiste en la secuencia de bisagra del subtipo IgG2 ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 100), la secuencia de bisagra del subtipo IgG3 ELKTPLDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 101) o ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 103), y/o la secuencia de bisagra del subtipo IgG4 ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 102). La secuencia de bisagra del subtipo IgG1 puede ser la siguiente: E^pK^sCDKTHTCPPCP (como se muestra en la tabla 1 y SEQ ID NO: 104). Estas regiones de bisagra centrales, por tanto, también se prevén en el contexto de la presente invención.

La ubicación y secuencia del dominio CH2 de IgG y CD3 de IgG pueden identificarse por analogía usando la numeración de Kabat como se expone en la tabla 2:

"abla 2. nun-eración de <abal de los ■‘esiduos aminoacld eos de la región CH2 y CP3 de IgG

Subtipo Traducción de Numeración de Traducción de Numeración de de IgG aa de CH2 Kabat de CH2 aa de CH3 Kabat de CH3

IgGi APE... ...KAK 244 , GQP... ^{. P Q} K 361 ., .. 476 IgGj APP . ...K7K 244.. ...360 GQP... PGK 361... ...478 igGj AP£... ...KTK 244... ...360 GQP... PGK 361... ...476 igG* APE... KAK 244 . . 360 GQP- ...Í.GK 361 . . 476

En una realización de la invención los residuos aminoacídicos resaltados en negrita en el dominio CH3 del primero o ambos monómeros Fc están eliminados.

El conector peptídico, por el que los monómeros polipeptídicos ("parte Fc" o "monómero Fc") del tercer dominio se fusionan entre sí, preferiblemente comprende al menos 25 residuos aminoacídicos (25, 26, 27, 28, 29, 30 etc.). Más preferiblemente, este conector peptídico comprende al menos 30 residuos aminoacídicos (30, 31, 32, 33, 34, 35 etc.). También se prefiere que el conector comprenda hasta 40 residuos aminoacídicos, más preferiblemente hasta 35 residuos aminoacídicos, mucho más preferiblemente exactamente 30 residuos aminoacídicos. Una realización preferida de dicho conector peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros del mismo, es decir (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 5 o mayor (por ejemplo, 6, 7 u 8). Preferiblemente, el número entero es 6 o 7, más preferiblemente el número entero es 6.

En el caso de que se une un conector para fusionar el primer dominio al segundo dominio, o el primer o segundo dominio al tercer dominio, este conector se preferiblemente de una longitud y secuencia suficientes para garantizar que cada uno del primer y segundo dominio puedan retener, independientemente entre sí, sus especificidades de unión diferenciales. Para conectores peptídicos que conectan los al menos dos dominios de unión (o dos dominios variables) en la construcción de anticuerpo de la invención, se prefiere que esos conectores peptídicos comprendan únicamente un número limitado de residuos aminoacídicos, por ejemplo, 12 residuos aminoacídicos o menos. Por tanto, se prefieren conectores peptídicos de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 residuos aminoacídicos. Un conector peptídico previsto con menos de 5 aminoácidos comprende 4, 3, 2 o un aminoácido, en el que se prefieren conectores ricos en Gly. Una realización preferida del conector peptídico para una fusión del primer y el segundo dominio se representa en SEQ ID NO: 1. Una realización de conector preferido del conector peptídico para fusionar el segundo y tercer dominio es un conector (Gly)4, también denominado conector G4.

Un aminoácido "único" particularmente preferido en el contexto de uno de los "conectores peptídicos" descritos anteriormente es Gly. Por consiguiente, dicho conector peptídico puede consistir en el aminoácido único Gly. En una realización preferida de la invención, un conector peptídico se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros del mismo, es decir (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 1 o mayor (por ejemplo, 2 o 3). Se representan conectores preferidos en SEQ ID NO: 1 a 12. Las características de dicho conector peptídico, que comprenden la ausencia de promoción de estructuras secundarias, son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) y Raag y Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Se prefieren conectores peptídicos que además no promueven ninguna estructura secundaria. La unión de dichos dominios entre sí puede proporcionarse, por ejemplo, por genomanipulación, como se describe en los ejemplos. Los métodos para preparar construcciones monocatenarias biespecíficas fusionadas y unidas de forma funcional y expresarlas en células de mamífero o bacterias son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, documento WO 99/54440 o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001).

En una realización preferida de la construcción de anticuerpo o la presente invención, el primer y segundo dominio forman una construcción de anticuerpo en un formato seleccionado del grupo que consiste en (scFv)2, mAb de un solo dominio-scFv, y oligómeros de cualquiera de esos formatos.

De acuerdo con una realización particularmente preferida, y como se documenta en los ejemplos adjuntos, el primer y el segundo dominio de la construcción de anticuerpo de la invención es una "construcción de anticuerpo monocatenaria biespecífica", más preferiblemente un "Fv monocatenario" (scFv) biespecífico. Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un conector sintético, como se describe anteriormente en la presente memoria, lo que posibilita prepararlos como una sola cadena proteínica en el par de regiones VL y VH forma una molécula monovalente; véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se evalúan por su función de la misma manera que para los anticuerpos de longitud completa. Un fragmento variable monocatenario (scFv), por tanto, es una proteína de fusión de la región variable de la cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) de inmunoglobulinas, habitualmente conectadas con un corto péptido conector de aproximadamente diez a aproximadamente 25 aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 15 a 20 aminoácidos. El conector habitualmente es rico en glicina para la flexibilidad, así como serina o treonina para la solubilidad, y puede conectar el extremo N de la VH con el extremo C de la VL, o viceversa. Esta proteína retiene la especificidad de la inmunoglobulina original, a pesar de la eliminación de las regiones constantes y la introducción del *conector.

Las construcciones de anticuerpo monocatenarias biespecíficas son conocidas en la técnica y se describen en el documento WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, inter alia, la patente de Estados Unidos 4.946.778, Kontermann y Dübel (2010), loc. cit. y Little (2009), loc. cit.) pueden adaptarse para producir construcciones de anticuerpo monocatenarias que reconocen específicamente (una) diana(s) elegidas.

Los fragmentos variables monocatenarios bivalentes (también denominados divalentes) o biespecíficos (bi-scFv o discFv que tienen el formato (scFv)2 pueden manipularse uniendo dos moléculas scFv (por ejemplo, con conectores como se describe anteriormente en la presente memoria). Si estados dos moléculas scFv tienen la misma especificidad de unión, la molécula (scFv)2 resultante preferiblemente se denominará bivalente (es decir, tiene dos valencias para el mismo epítopo diana). Si las dos moléculas scFv tienen diferentes especificidades de unión, la molécula (scFv)2 resultante preferiblemente se denominará biespecífica. La unión puede hacerse produciendo una sola cadena peptídica con dos regiones VH y dos regiones VL, produciendo scFv en tándem (véase, por ejemplo, Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5): 238-244). Otra posibilidad es la creación de moléculas scFv con péptidos conectores que son demasiados cortos para que las dos regiones variables se plieguen juntas (por ejemplo, aproximadamente cinco aminoácidos), forzando que los scFv dimericen. Este tipo se conoce como diacuerpos (véase, por ejemplo, Hollinger, Philipp et al., (julio 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).

En línea con esta invención, el primero, el segundo o el primer y el segundo dominio pueden comprender un anticuerpo de un solo dominio, respectivamente el dominio variable o al menos las CDR de un anticuerpo de un solo dominio. Los anticuerpos de un solo dominio comprenden simplemente un dominio variable de anticuerpo (monomérico) que puede unirse selectivamente a un antígeno específico, independientemente de otras regiones o dominios V. Los primeros anticuerpos de un solo dominio se diseñaron a partir de anticuerpos de cadena pesada encontrados en camélidos, y estos se denominan fragmentos V^hH. Los peces cartilaginosos también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR) de los que pueden obtenerse anticuerpos de un solo dominio denominados V^nar. Una estrategia alternativa es dividir los dominios variables diméricos de inmunoglobulinas comunes, por ejemplo, de seres humanos o roedores en monómeros, obteniendo, por tanto, VH o VL como un Ab de un solo dominio. Aunque la mayor parte de la investigación sobre anticuerpos de un solo dominio se basa actualmente sobre dominios variables de la cadena pesada, los nanocuerpos derivados de cadenas ligeras también han demostrado unirse específicamente a epítopos diana. Ejemplos de anticuerpos de un solo dominio se denominan sdAb, nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable.

Un (mAb de un solo dominio)2, por tanto, es una construcción de anticuerpo monoclonal compuesta de (al menos) dos anticuerpos monoclonales de un solo dominio, que se seleccionan individualmente del grupo que comprende VH, V^l, V^hH y V^nar. El conector preferiblemente está en forma de un conector peptídico. Asimismo, un "mAb de un solo dominio-scFv" es una construcción de anticuerpo monoclonal compuesta de al menos un anticuerpo de un solo dominio como se describe anteriormente y una molécula scFv como se describe anteriormente. De nuevo, el conector preferiblemente está en forma de un conector peptídico.

Que una construcción de anticuerpo compita o no por la unión con otra construcción de anticuerpo dada puede medirse en un ensayo de competición tal como un ELISA competitivo o un ensayo de competición celular. También pueden usarse micropartículas (microesferas) acopladas a avidina. Similar a una placa de ELISA recubierta con avidina, cuando se hacen reaccionar con una proteína biotinilada, cada una de estas microesferas puede usarse como sustrato sobre el que puede realizarse un ensayo. El antígeno se recubre sobre una microesfera y después se prerrecubren con el primer anticuerpo. El segundo anticuerpo se añade y se determina cualquier unión adicional. Un posible medio para la lectura incluye citometría de flujo.

Las células T o linfocitos T son un tipo de linfocito (en sí mismo un tipo de glóbulo blanco) que desempeña una función central en la inmunidad celular. Hay varios subconjuntos de linfocitos T, cada uno con una función distinta. Los linfocitos T pueden distinguirse de otros linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos NK, por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular. El TCR es responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y está compuesto de dos cadenas proteínicas diferentes. En un 95 % de los linfocitos T, el TCR consiste en una cadena alfa (a) y beta (p). Cuando el TCR se acopla con el péptido antigénico y el MHC (complejo de péptido/MHC), el linfocito T se activa a través de una serie de acontecimientos bioquímicos mediados por enzimas asociadas, correceptores, moléculas adaptadoras especializadas y factores de transcripción activados o liberados.

El complejo del receptor de CD3 es un complejo proteínico y está compuesto de cuatro cadenas. En mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y (gamma), una cadena CD35 (delta) y dos cadenas CD3s (épsilon). Estas cadenas se asocian con el receptor de linfocitos T (TCR) y la denominada cadena Z (zeta) para formar el complejo del CD3 del receptor de linfocitos T y para generar una señal de activación en linfocitos T. Las cadenas CD3y (gamma), CD35 (delta) y CD3s (épsilon) son proteínas de superficie celular muy relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulina que contienen un solo dominio de inmunoglobulina extracelular. Las colas intracelulares de las moléculas CD3 contienen un solo motivo conservado conocido como motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora o ITAM por acortar, que es esencial para la capacidad de señalización del TCR. La molécula CD3 épsilon es un polipéptido que, en seres humanos, está codificado por el gen CD3E que reside en el cromosoma 11. El epítopo más preferido de CD3 épsilon está comprendido dentro de los residuos aminoacídicos 1-27 del dominio extracelular de CD3 épsilon humana. Se prevé que construcciones de anticuerpo de acuerdo con la presente invención muestren típica y ventajosamente menos activación de linfocitos T inespecífica, lo que no se desea en inmunoterapia específica. Esto se traduce en un riesgo reducido de efectos secundarios.

La lisis redirigida de células diana mediante el reclutamiento de linfocitos T por una construcción de anticuerpo multiespecífica, al menos biespecífica, implica formación de sinapsis citolíticas y suministro de perforina y granzimas. Los linfocitos T acoplados tienen capacidad de lisis celular diana en serie, y no se ven afectados por mecanismos de evasión inmunitaria que interfieran con el procesamiento o presentación de antígenos peptídicos, o diferenciación de linfocitos T clonales; véase, por ejemplo, el documento WO 2007/042261.

La citotoxicidad mediada por construcciones de anticuerpo de la invención puede medirse de diversas maneras. Las células efectoras, por ejemplo, pueden ser linfocitos T CD8 positivos enriquecidos estimulados (humanos) o leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) no estimulados (humanos). Si las células diana son de origen de macaco o expresan o se transfectan con BCMA de macaco que se une por el primer dominio, las células efectoras también deben ser de origen de macaco tal como una línea de linfocitos T de macaco, por ejemplo, 4119LnPx. Las células diana deben expresar (al menos el dominio extracelular de) BCMA, por ejemplo, BCMA humano o de macaco. Las células diana pueden ser una línea celular (tal como CHO) que se transfecta de forma estable o transitoria con BCMA, por ejemplo, BCMA humano o de macaco. Como alternativa, las células diana pueden ser una línea celular de expresión natural de BCMA positiva tal como la línea celular de mieloma múltiple humano L363 o NCI-H929. Habitualmente se espera que los valores de CE50 sean menores con líneas celulares diana que expresan niveles mayores de BCMA en la superficie celular. La relación de células efectoras a diana (E:T) habitualmente es de aproximadamente 10:1, pero también puede variar. La actividad citotóxica de construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 puede medirse un ensayo de liberación de 51Cr (tiempo de incubación de aproximadamente 18 horas) o en un ensayo de citotoxicidad basado en FACS (tiempo de incubación de aproximadamente 48 horas). También son posibles modificaciones del tiempo de incubación del ensayo (reacción citotóxica). Otros métodos de medición de la citotoxicidad son bien conocidos por los expertos en la materia y comprenden ensayos MTT o MTS, ensayos basados en ATP incluyendo ensayos bioluminiscentes, el ensayo de sulforrodamina B (SRB), ensayo WST, ensayo clonogénico y la tecnología ECIS.

La actividad citotóxica mediada por construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la presente invención se mide preferiblemente en un ensayo de citotoxicidad celular. También puede medirse en un ensayo de liberación de 51Cr. Se representa por el valor de CE50, que corresponde a la concentración eficaz para la mitad del máximo (concentración de la construcción de anticuerpo que induce una respuesta citotóxica a medio camino entre el valor basal y el máximo). Preferiblemente, el valor de CE50 de las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 es <5000 pM o <4000 pM, más preferiblemente <3000 pM o <2000 pM, incluso más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <400 pM o <300 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <20 pM o <10 pM, y mucho más preferiblemente <5 pM.

Los valores de CE50 dados anteriormente pueden medirse en diferentes ensayos. El experto en la materia será consciente de que puede que un valor de CE50 sea menor cuando se usen linfocitos T CD8+ estimulados/enriquecidos como células efectoras, en comparación con PBMC no estimulados. Además, puede esperarse que los alores de CE50 sean menores cuando las células diana expresen un alto número de BCMA en comparación con una rata de baja expresión de la diana. Por ejemplo, cuando se usan linfocitos T CD8+ humanos estimulados/enriquecidos como células efectoras (y se usan células transfectadas con BCMA tales como células CHO o líneas celulares humanas BCMA positivas como células), el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífica BCMAxCD3 es preferiblemente <1000 pM, más preferiblemente <500 pM, incluso más preferiblemente <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM, incluso más preferiblemente <50 pM, incluso más preferiblemente <10 pM y mucho más preferiblemente <5 pM. Cuando se usan PBMC humanos como células efectoras, el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífica BCMAxCD3 es preferiblemente <5000 pM o <4000 pM (en particular cuando las células diana son líneas celulares humanas BCMA positivas), más preferiblemente <2000 pM (en particular cuando las células diana son células transfectadas con BCMA tales como células CHO), más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <200 pM, incluso más preferiblemente <150 pM, incluso más preferiblemente <100 pM y mucho más preferiblemente <50 pM, o menor. Cuando se usa una línea de linfocitos T de macaco tal como LnPx4119 como células efectoras, y se usa una línea celular transfectada con BCMA de macaco tal como células CHO como línea celular diana, el valor de CE50 de la construcción de anticuerpo biespecífica BCMAxCD3 es preferiblemente <2000 pM o <1500 pM, más preferiblemente <1000 pM o <500 pM, incluso más preferiblemente <300 pM o <250 pM, incluso más preferiblemente <100 pM y mucho más preferiblemente <50 pM.

Preferiblemente, las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la presente invención no inducen/median la lisis o no inducen/median esencialmente la lisis de células BCMA negativas tales como células CHO, o células HL60, MES-SA o SNU-16. La expresión "no induce lisis", "no induce esencialmente lisis", "no media la lisis" o "no media esencialmente la lisis" significa que una construcción de anticuerpo de la presente invención no induce o media la lisis de más de un 30 %, preferiblemente no más de un 20 %, más preferiblemente no más de un 10 %, particularmente preferiblemente no más de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 % o 5 % de células BCMA negativas, por lo que la lisis de una línea celular humana BCMA positiva se establece a un 100 %. Esto se aplica habitualmente para concentraciones de la construcción de anticuerpo de hasta 500 nM. Los expertos en la materia conocen la manera de medir la lisis celular sin más preámbulos. Además, la presente memoria descriptiva muestra instrucciones específicas sobre la manera de medir la lisis celular.

La diferencia en la actividad citotóxica entre la isoforma monomérica y la dimérica de construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 individuales se denomina "brecha de potencia". Esta brecha de potencia puede calcularse, por ejemplo, como la relación entre los valores de CE50 de la forma monomérica y dimérica de la molécula. Las brechas de potencia de las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la presente invención son preferiblemente <5, más preferiblemente <4, incluso más preferiblemente <3, incluso más preferiblemente <2 y mucho más preferiblemente <1.

El primer y/o el segundo (o cualquier adicional) dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención son preferiblemente específicos de especie cruzada para miembros del orden de mamíferos de primates. Los dominios de unión a CD3 específicos de especie cruzada se describen, por ejemplo, en el documento WO 2008/119567. De acuerdo con una realización, el primer y/o segundo dominio de unión, además de unión a BCMA humano y CD3 humano, respectivamente, también se unirán a BCMA/CD3 de primates incluyendo (aunque sin limitación) primates del Nuevo Mundo (tales como Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimirí sciureus), primates del Viejo Mundo (tales como babuinos y macacos), gibones y homínidos no humanos.

En una realización de la construcción de anticuerpo de la invención, el primer dominio se une a BCMA humano y se une además a BCMA de macaco, tal como BCMA de Macaca fascicularis, y más preferiblemente, a BCMA de macaco expresado en la superficie de células de macaco. La afinidad del primer dominio por BCMA, preferiblemente por BCMA humano, es preferiblemente <100 nM o <50 nM, más preferiblemente <25 nM o <20 nM, más preferiblemente <15 nM o <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <2,5 nM o <2 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <06 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM y mucho más preferiblemente <0,4 nM. La afinidad puede medirse, por ejemplo, en un ensayo BIAcore o en un ensayo de Scatchard. Otros métodos de determinación de la afinidad también son bien conocidos por los expertos en la materia. La afinidad del primer dominio por BCMA de macaco es preferiblemente <15 nM, más preferiblemente <10 nM, incluso más preferiblemente <5 nM, incluso más preferiblemente <1 nM, incluso más preferiblemente <0,5 nM, incluso más preferiblemente <0,1 nM y mucho más preferiblemente <0,05 nM o incluso <0,01 nM.

Preferiblemente la brecha de afinidad de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención para la unión a BCMA de macaco frente a BCMA humano [ma BCMA:hu BCMA] (determinada, por ejemplo, por BiaCore o por análisis de Scatchard) es <100, preferiblemente <20, más preferiblemente <15, adicionalmente preferiblemente <10, incluso más preferiblemente<8, más preferiblemente <6 y mucho más preferiblemente <2. Intervalos preferidos para la brecha de afinidad de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención para la unión a BCMA de macaco frente a BCMA humano son entre 0,1 y 20, más preferiblemente entre 0,2 y 10, incluso más preferiblemente entre 0,3 y 6, incluso más preferiblemente entre 0,5 y 3 o entre 0,5 y 2,5, y mucho más preferiblemente entre 0,5 y 2 o entre 0,6 y 2.

El segundo dominio de la construcción de anticuerpo de la invención se une a CD3 épsilon humano y/o a CD3 épsilon de Macaca. En una realización preferida, el segundo dominio se une además a CD3 épsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus o Saimiri sciureus. Callithrix jacchus y Saguinus oedipus son ambos primates del Nuevo Mundo que pertenecen a la familia de Callitrichidae, mientras que Saimiri sciureus es un primate del Nuevo Mundo que pertenece a la familia de Cebidae.

Se prefiere para la construcción de anticuerpo de la presente invención que el segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3 épsilon humana y/o de Macaca comprenda una región VL que comprenda CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 27 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 28 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 29 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 117 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 118 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 119 del documento WO 2008/119567; y

(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 153 del documento WO 2008/119567, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 154 del documento WO 2008/119567 y CDR-L3 como se representa en SEQ ID NO: 155 del documento WO 2008/119567.

En una realización preferida adicional de la construcción de anticuerpo de la presente invención, el segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3 épsilon humana y/o de Macaca comprenda una región VH que comprende ^cD^r-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 12 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 13 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 14 del documento WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 30 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 31 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 32 del documento WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 48 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 49 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 50 del documento WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 66 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 67 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 68 del documento WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 84 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 85 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 86 del documento WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 102 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 103 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 104 del documento WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 120 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 121 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 122 del documento WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 138 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 139 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 140 del documento WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 156 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 157 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 158 del documento WO 2008/119567; y

(j) CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 174 del documento WO 2008/119567, CDR-H2 como se representa en SEQ ID NO: 175 del documento WO 2008/119567 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 176 del documento WO 2008/119567.

En una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la invención, los tres grupos descritos anteriormente de CDR de VL se combinan con los diez grupos descritos anteriormente de CDR de VH dentro del segundo dominio de unión para formar (30) grupos, comprendiendo cada uno CDR-L 1 -3 y CDR-H 1 -3.

Se prefiere para la construcción de anticuerpo de la presente invención que el segundo dominio que se une a CD3 comprenda una región VL seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 17, 21, 35, 39, 53, 57, 71, 75, 89, 93, 107, 111, 125, 129, 143, 147, 161, 165, 179 o 183 del documento WO 2008/119567 o como se representa en SEQ ID NO: 13.

También se prefiere que el segundo dominio que se une a CD3 comprenda una región VH seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181 del documento WO 2008/119567 o como se representa en SEQ ID ⁿO: 14.

Más preferiblemente, la construcción de anticuerpo de la presente invención se caracteriza por un segundo dominio que se une a CD3, que comprende una región VL y una región VH seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 17 o 21 del documento WO 2008/119567 y una región VH como se representa en SEQ ID NO: 15 o 19 del documento WO 2008/119567;

(b) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 35 o 39 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ iD NO: 33 o 37 del documento WO 2008/119567;

(c) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 53 o 57 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ iD NO: 51 o 55 del documento WO 2008/119567;

(d) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 71 o 75 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ iD NO: 69 o 73 del documento WO 2008/119567;

(e) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 89 o 93 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ iD NO: 87 o 91 del documento WO 2008/119567;

(f) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 107 o 111 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ ID NO: 105 o 109 del documento WO 2008/119567;

(g) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 125 o 129 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ ID NO: 123 o 127 del documento WO 2008/119567;

(h) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 143 o 147 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ ID NO: 141 o 145 del documento WO 2008/119567;

(i) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 161 o 165 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ ID NO: 159 o 163 del documento WO 2008/119567; y

(j) una región VL como se representa en SEQ ID NO: 179 o 183 del documento WO 2008/119567 y una región VH

como se representa en SEQ ID NO: 177 o 181 del documento WO 2008/119567.

También se prefiere, en relación a la construcción de anticuerpo de la presente invención, un segundo dominio que

se une a CD3, que comprende una región VL como se representa en SEQ ID NO: 13 y una región VH como se representa en s Eq ID nO: 14.

De acuerdo con una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención, el primero y/o el segundo dominio tienen el siguiente formato: Los pares de regiones VH y regiones VL están en el formato de un anticuerpo de una sola cadena (scFv). Las regiones VH y VL se disponen en el orden VH-VL o VL-VH. Se prefiere

que la región VH se ubique de forma N terminal de una secuencia conectora, y la región VL se ubique de forma C terminal de la secuencia conectora.

Una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la presente invención descrita anteriormente se caracteriza por el segundo dominio que se une a CD3, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada

del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 25, 41,43, 59, 61,77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169,

185 o 187 del documento WO 2008/119567 o como se representa en SEQ ID NO: 15.

También se prevé que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprenda una

región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, y una región VH que comprenda CDR-H1, CDR-H2 y CDR-3 seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 48, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 49, CDR-L3 como

se representa en SEQ ID NO: 50, CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 45, CDR-H2 como se representa en

SEQ ID NO: 46 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 47;

(b) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 66, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 67, CDR-L3 como

se representa en SEQ ID NO: 68, CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 63, CDR-H2 como se representa en

SEQ ID NO: 64 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 65; y

(c) CDR-L1 como se representa en SEQ ID NO: 84, CDR-L2 como se representa en SEQ ID NO: 85, CDR-L3 como

se representa en SEQ ID NO: 86, CDR-H1 como se representa en SEQ ID NO: 81, CDR-H2 como se representa en

SEQ ID NO: 82 y CDR-H3 como se representa en SEQ ID NO: 83.

Se prevé además que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprenda una

región VH y una región VL seleccionada del grupo que consiste en:

(a) una región VH como se

representa en SEQ ID NO: 51 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 52; (b) una región VH como se

representa en SEQ ID NO: 57 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 58; (c) una región VH como se representa en SEQ ID NO: 69 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 70; (d) una región VH como se representa en SEQ ID NO: 75 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 76; (e) una región VH como se representa en SEQ ID NO: 87 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 88; y (f) una región VH como se representa en SEQ ID NO: 93 y una región VL como se representa en SEQ ID NO: 94. Se prevé además que el primer dominio de unión de la construcción de anticuerpo de la invención comprenda una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las representadas en SEQ ID NO: 53, 59, 71, 77, 89 o 95.

También se incluyen modificaciones covalentes de las construcciones de anticuerpo dentro del alcance de esta invención, y en general se hacen, pero no siempre, de forma postraduccional. Por ejemplo, se introducen varios tipos de modificaciones covalentes de la construcción de anticuerpo en la molécula haciendo reaccionar residuos aminoacídicos específicos de la construcción de anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N o C terminales.

Los residuos de cisteinilo muy normalmente se hacen reaccionar con a-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se derivatizan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridil disulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0. Los residuos de lisinilo y aminoterminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para la derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas a causa del alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como el gripo épsilon-amino de arginina.

La modificación específica de residuos de tirosilo puede hacerse, con interés particular en introducir marcadores espectrales en residuos de tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Muy habitualmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N--R'), donde R y R' son opcionalmente grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular las construcciones de anticuerpo de la presente invención con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en una diversidad de métodos. Los agentes de reticulación habitualmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(pazidofenil)ditio]propioimidato producen intermedios fotoactivables que pueden formar reticulaciones en presencia de luz. Como alternativa, se emplean matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 para la inmovilización de proteínas.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente en los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Como alternativa, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquier forma de estos residuos está dentro del alcance de esta invención.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pág. 79-86), acetilación de la amina N terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal.

Otro tipo de modificación covalente de las construcciones de anticuerpo incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glucosilación de la proteína. Como se sabe en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos aminoacídicos de glucosilación particulares, analizados a continuación), o la célula hospedadora u organismo en que se produce la proteína. Se analizan a continuación sistemas de expresión particulares.

La glucosilación de polipéptidos está típicamente ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la fijación del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glucosilación. La glucosilación ligada a O se refiere a la fijación de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, muy habitualmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación a la construcción de anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación ligada a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia de partida (para sitios de glucosilación ligada a O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos de una construcción de anticuerpo se altera preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas, de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otro medio de aumentar el número de restos de carbohidrato en la construcción de anticuerpo es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula hospedadora que tenga capacidades de glucosilación para glucosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el uno o más glúcidos pueden fijarse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, 1981, C_1-C Crit. Rev. Biochem., pág. 259-306.

La eliminación de restos de carbohidrato presentes en la construcción de anticuerpo de partida puede conseguirse química o enzimáticamente. La desglucosilación química requiere exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento provoca la escisión de la mayoría o de todos los glúcidos excepto el glúcido de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras deja el polipéptido intacto. La desglucosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una diversidad de endo- y exoglucosidasas como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glucosilación en posibles sitios de glucosilación puede evitarse mediante el uso del compuesto tunicamicina como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces de proteína-N-glucósido.

En la presente memoria también se contemplan otras modificaciones de la construcción de anticuerpo. Por ejemplo, otro tipo de modificación covalente de la construcción de anticuerpo comprende ligar la construcción de anticuerpo a diversos polímeros no proteínicos incluyendo, aunque sin limitación, diversos polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, de la manera expuesta en las patentes de Estados Unidos n.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se sabe en la técnica, pueden hacerse sustituciones aminoacídicas en diversas posiciones dentro de la construcción de anticuerpo, por ejemplo, para facilitar la adición de polímeros tales como PEG.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de las construcciones de anticuerpo de la invención comprende la adición de uno o más marcadores. El grupo marcador puede acoplarse a la construcción de anticuerpo mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar proteínas y pueden usarse en la realización de la presente invención. La expresión "marcador" o "grupo marcador" se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores pertenecen a una diversidad de clases, dependiendo del ensayo en que tienen que detectarse, los siguientes ejemplos incluyen, aunque sin limitación:

a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)

b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas)

c) restos activos en oxidorreducción

d) tintes ópticos (incluyendo, aunque sin limitación, cromóforos, fosforescentes y fluoróforos) tales como grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánidos fosforescentes), grupos quimioluminiscentes y fluoróforos que pueden ser fluorescentes "micromoleculares" o fluorescentes proteínicos

e) grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) f) grupos biotinilados

g) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, lados de unión de anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas epitópicas, etc.)

Por "marcador fluorescente" se entiende cualquier molécula que puede detectarse mediante sus propiedades fluorescentes inherentes. Marcadores fluorescentes adecuados incluyen, aunque sin limitación, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAE^dAⁿS, EDANS, BODIPY FL, ^lC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon Green, los tintes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamina y Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Se describen tintes ópticos adecuados, incluyendo fluoróforos, en Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland.

Los marcadores fluorescentes proteínicos adecuados también incluyen, aunque sin limitación, proteína fluorescente verde, incluyendo una especie de Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., número de acceso de Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8.a planta, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), p galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, patentes de Estados Unidos n.° 5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).

La construcción de anticuerpo de la invención también puede comprender dominios adicionales, que son de ayuda, por ejemplo, en el aislamiento de la molécula o están relacionados con un perfil farmacocinético adaptado de la molécula. Los dominios de ayuda para el aislamiento de una construcción de anticuerpo pueden seleccionarse de motivos peptídicos o restos introducidos de forma secundaria, que pueden capturarse en un método de aislamiento, por ejemplo, una columna de aislamiento. Realizaciones no limitantes de dichos dominios adicionales comprenden motivos peptídicos conocidos como marca Myc, marca HAT, marca HA, marca TAP, marca GST, dominio de unión a quitina (marca CBD), proteína de unión a maltosa (marca MBP), marca Flag, marca de estreptomicina y variantes de los mismos (por ejemplo, marca de estreptomicina ll) y marca de His. Todas las construcciones de anticuerpo divulgadas en la presente memoria comprenden un dominio de marca de His, que se conoce en general como una repetición de residuos de His consecutivos en la secuencia de aminoácidos de una molécula, preferiblemente de cinco, y más preferiblemente de seis residuos de His (hexahistidina). La marca de His puede localizarse, por ejemplo, en el extremo N o C de la construcción de anticuerpo, preferiblemente se localiza en el extremo C. Más preferiblemente, se une una marca de hexahistidina (HHHHHH) (SEQ ID NO: 16) mediante enlace peptídico al extremo C de la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención. Además, puede combinarse un sistema de conjugado de PLGA-PEG-PLGA con una marca de polihistidina para aplicación de liberación mantenida y perfil farmacocinético mejorado.

También se contemplan modificaciones de la secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpo descritas en la presente memoria. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de la construcción de anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácidos de las construcciones de anticuerpo se preparan introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en el ácido nucleico de las construcciones de anticuerpo, o por síntesis peptídica. Todas las modificaciones de secuencia de aminoácidos descritas a continuación deben producir una construcción de anticuerpo que aún retenga la actividad biológica deseada (unión a BCMA y a CD3) de la molécula original no modificada.

La expresión "aminoácido" o "residuo aminoacídico" típicamente se refiere a un aminoácido que tiene su definición reconocida en la técnica tal como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina (Ala o A); arginina (Arg o R); asparagina (Asn o N); ácido aspártico (Asp o D); cisteína (Cys o C); glutamina (Gln o Q); ácido glutámico (Glu o E); glicina (Gly o G); histidina (His o H); isoleucina (He o I): leucina (Leu o l); lisina (Lys o K); metionina (Met o M); fenilalanina (Phe o F); prolina (Pro o P); serina (Ser o S); treonina (Thr o T); triptófano (Trp o W); tirosina (Tyr o Y); y valina (Val o V), aunque pueden usarse aminoácidos modificados, sintéticos o infrecuentes según se desee. En general, los aminoácidos pueden agruparse por tener una cadena lateral apolar (por ejemplo, Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, Asp, Glu); una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, Arg, His, Lys); o una cadena lateral polar no cargada (por ejemplo, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, y Tyr).

Las modificaciones aminoacídicas incluyen, por ejemplo, eliminaciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las construcciones de anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos postraduccionales de las construcciones de anticuerpo, tal como cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación.

Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos pueden insertarse, sustituirse o eliminarse en cada una de las CDR (por supuesto, dependiendo de su longitud), mientras que 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos pueden insertarse, sustituirse o eliminarse en cada una de las FR. Preferiblemente, las inserciones de secuencia de aminoácidos en la construcción de anticuerpo incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de uno solo o múltiples residuos aminoacídicos. También pueden realizarse modificaciones correspondientes dentro del tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención. Una variante de inserción de la construcción de anticuerpo de la invención incluye la fusión al extremo N o al extremo C de la construcción de anticuerpo de una enzima o la fusión a un polipéptido.

Los sitios de mayor interés para mutagénesis sustitutiva incluyen (aunque sin limitación) las CDR de la cadena pesada y/o ligera, en particular las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR en la cadena pesada y/o ligera. Las sustituciones son preferiblemente sustituciones conservativas como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, pueden sustituirse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos en una CDR, mientras que pueden sustituirse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 25 aminoácidos en las regiones flanqueantes (FR), dependiendo de la longitud de la CDR o FR. Por ejemplo, si una secuencia de CDR abarca 6 aminoácidos, se prevé que se sustituya uno, dos o tres de estos aminoácidos. Asimismo, si una secuencia de CDR abarca 15 aminoácidos, se prevé que se sustituya uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de estos aminoácidos. un método útil para la identificación de determinados residuos o regiones de las construcciones de anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells en Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana dentro de la construcción de anticuerpo se identifica (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se remplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el epítopo.

Esas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo variantes adicionales u otras en, o por, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio o región para introducir una secuencia de aminoácidos está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no tiene que predeterminarse. Por ejemplo, para analizar u optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, puede realizarse mutagénesis por barrido de alanina o aleatoria en un codón o región diana, y las variantes de construcción de anticuerpo expresadas se criban por la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones sustitutivas en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis con cebador M13 y mutagénesis por PCR. El cribado de los mutantes se hace usando ensayos de actividades de unión a antígeno, tal como unión a BCMA o CD3.

En general, si se sustituyen aminoácidos en una o más o todas las CDR de la cadena pesada y/o ligera, se prefiere que la secuencia "sustituida" entonces obtenida sea al menos un 60 % o 65 %, más preferiblemente un 70 % o 75 %, incluso más preferiblemente un 80 % u 85 %, y particularmente preferiblemente un 90 % o 95 % idéntica a la secuencia de CDR "original". Esto significa que depende de la longitud de la CDR el grado al que sea idéntica a la secuencia "sustituida". Por ejemplo, una CDR que tiene 5 aminoácidos es preferiblemente un 80 % idéntica a su secuencia sustituida para que tenga al menos un aminoácido sustituido. Por consiguiente, las CDR de la construcción de anticuerpo pueden tener diferentes grados de identidad con sus secuencias sustituidas, por ejemplo, CDRL1 puede tener un 80 %, mientras que CDRL3 puede tener un 90 %.

Las sustituciones (o remplazos) preferidas son sustituciones conservativas. Sin embargo, se prevé cualquier sustitución (incluyendo sustitución no conservativa o una o más de las "sustituciones ejemplares" enumeradas en la tabla 3, a continuación) siempre que la construcción de anticuerpo retenga su capacidad de unirse a BCMA mediante el primer dominio y a CD3 épsilon mediante el segundo dominio y/o sus CDR tengan una identidad con la secuencia entonces sustituida (al menos un 60 % o 65 %, más preferiblemente un 70 % o 75 %, incluso más preferiblemente un 80 % u 85 %, y particularmente preferiblemente un 90 % o 95 % idénticas a la secuencia de CDR "original").

Se muestran sustituciones conservativas en la tabla 3 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones provocan un cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 3, o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, y los productos pueden cribarse por una característica deseada.

Tabla 3: Sustituciones de aminoácidos

Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas de la construcción de anticuerpo de la presente invención seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoide, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. los residuos de origen natural se dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr, asn, gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada de la construcción de anticuerpo puede sustituirse, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación aberrante. A la inversa, puede añadirse uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Para secuencias de aminoácidos, la identidad y/o similitud de secuencia se determina usando técnicas convencionales conocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, el algoritmo de identidad de secuencia local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, el algoritmo de alineación de identidades de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, ^fA^sTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencias Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387-395, preferiblemente usando los ajustes por defecto, o por inspección. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB basado en los siguientes parámetros: penalización por emparejamiento incorrecto de 1; penalización por hueco de 1; penalización por tamaño de hueco de 0,33; y penalización por unión de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pág. 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones por pares progresivas. También puede trazar un árbol que muestra las relaciones de agrupamientos usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Los parámetros útiles de PILEUP incluyen una carga por hueco por defecto de 3,00, una carga por longitud de hueco por defecto de 0,10 y huecos finales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se obtuvo de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266: 460-480. WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de ellos establecidos a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: tramo de solapamiento=1, fracción de solapamiento=0,125, umbral de palabra (T)=II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos particular frente a la que se está haciendo la búsqueda de la secuencia de interés; sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.

Un algoritmo útil adicional es gapped BLAST como se presenta por Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25: 3389 3402. Gapped BLAST usa las puntuaciones de sustitución BLOSUM-62; el parámetro T umbral se establece a 9; el método de dos aciertos para activar las extensiones sin huevos, carga longitudes de hueco de k de un coste de 10+k; Xu se establece a 16, y Xg se establece a 40 para la fase de búsqueda de base de datos y a 67 para la fase de producción de los algoritmos. Las alineaciones con huecos se activan mediante una puntuación correspondiente a aproximadamente 22 bits.

En general, la homología, similitud o identidad de aminoácidos entre CDR variantes individuales o secuencias VH/VL son de al menos un 60 % con las secuencias representadas en la presente memoria, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos un 65 % o 70 %, más preferiblemente al menos un 75 % u 80 %, incluso más preferiblemente al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y casi un 100 %. De una manera similar, "el porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos nucleotídicos en la secuencia codificante de la construcción de anticuerpo. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido a los parámetros por defecto, con tramo de solapamiento y fracción de solapamiento establecidos a 1 y 0,125, respectivamente.

En general, la homología, similitud o identidad de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican CDR variantes individuales o secuencias VH/VL y las secuencias de nucleótidos representadas en la presente memoria son de al menos un 60 %, y más típicamente con homologías o identidades preferiblemente crecientes de al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, y casi un 100 %. Por tanto, una "CDR variante" o una "región VH/VL variante" es una con la homología, similitud o identidad especificada para la CDR/VH/VL original de la invención, y comparte función biológica incluyendo, aunque sin limitación, al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la especificidad y/o actividad de la CDR o VH/^vL original.

En una realización, el porcentaje de identidad con la línea germinal humana de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención es >70 % o >75 %, más preferiblemente >80 % o >85 %, incluso más preferiblemente >90 % y mucho más preferiblemente >91 %, >92 %, >93 %, >94 %, >95 % o incluso >96 %. La identidad con productos génicos de la línea germinal de anticuerpo humano se cree que es un rasgo característico importante para reducir el riesgo de que proteínas terapéuticas provoquen una respuesta inmunitaria contra el fármaco en el paciente durante el tratamiento. Hwang y Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demuestran que la reducción de las partes no humanas de las construcciones de anticuerpo como fármaco da lugar a una disminución del riesgo de inducir anticuerpos antifármaco en los pacientes durante el tratamiento. Comparando un número amplio de fármacos de anticuerpo evaluados clínicamente y los respectos datos de inmunogenia, se muestra la tendencia de que la humanización de las regiones V de los anticuerpos hace que la proteína sea menos inmunógena (promedio de un 5,1 % de pacientes) que los anticuerpos que portan regiones V no humanas inalteradas (promedio de un 23,59 % de pacientes). Por tanto, es deseable un mayor grado de identidad con las secuencias humanas para productos terapéuticos proteínicos basados en la región V en forma de construcciones de anticuerpo. Para este propósito de determinación de la identidad con la línea germinal, las regiones V de VL pueden alinearse con las secuencias de aminoácidos de segmentos V y segmentos J de la línea germinal humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) usando el programa informático Vector NTI y la secuencia de aminoácidos se calcula dividiendo los residuos aminoacídicos idénticos por el número total de residuos aminoacídicos de la VL en porcentaje. Puede hacerse lo mismo para los segmentos VH (http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/) con la excepción de que la CDR3 de VH puede excluirse debido a su alta diversidad y a la ausencia de compañeros de alineación existentes de CDR3 de VH de la línea germinal humana. Entonces pueden usarse técnicas recombinantes para aumentar la identidad de secuencia con genes de la línea germinal de anticuerpos humanos.

Además, se prevé que las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la presente invención no se unan (esencialmente) a o no reaccionen de forma cruzada con BAFF-R human y/o TACI humano. Además, se prevé que las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la presente invención no se unan (esencialmente) a o no reaccionen de forma cruzada con BAFF-R de macaco y/o TACI de macaco.

En una realización adicional, las construcciones de anticuerpo biespecíficas de la presente invención muestran altos rendimientos de monómero en condiciones convencionales a escala de investigación, por ejemplo, en un proceso de purificación convencional de dos etapas. Preferiblemente el rendimiento de monómero de las construcciones de anticuerpo de acuerdo con la invención es >0,25 mg/l de sobrenadante, más preferiblemente >0,5 mg/l, incluso más preferiblemente >1 mg/l, y mucho más preferiblemente >3 mg/l de sobrenadante.

Asimismo, puede determinarse el rendimiento de las isoformas diméricas de la construcción de anticuerpo y, por tanto, el porcentaje de monómero (es decir, monómero:(monómero+dímero)) de las construcciones de anticuerpo. La productividad de construcciones de anticuerpo monoméricas y diméricas y el porcentaje calculado de monómeros puede obtenerse, por ejemplo, en la etapa de purificación por SEC del sobrenadante de cultivo a partir de producción normalizada a escala de investigación en frascos rodantes. En una realización, el porcentaje de monómeros de las construcciones de anticuerpo es >80 %, más preferiblemente >85 %, incluso más preferiblemente >90 % y mucho más preferiblemente >95 %.

En una realización, las construcciones de anticuerpo tienen una estabilidad en plasma preferida (relación de CE50 con plasma a CE50 sin plasma) de <5 o <4, más preferiblemente <3,5 o <3, incluso más preferiblemente <2,5 o <2 y mucho más preferiblemente <1,5 o <1. La estabilidad en plasma de una construcción de anticuerpo puede ensayarse por incubación de la construcción en plasma humano a 37 °C durante 24 horas, seguido de la determinación de la CE50 en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51cromo. Las células efectoras en el ensayo de citotoxicidad pueden ser linfocitos T CD8 positivos humanos enriquecidos estimulados. Las células diana pueden ser, por ejemplo, células CHO transfectadas con BCMA humano. La relación de células efectoras a diana (E:T) puede elegirse como 10:1. La combinación de plasma humano usada para este propósito se obtiene de sangre de donadores sanos recogida mediante jeringas recubiertas con EDTA. Los componentes celulares se retiran por centrifugación y la fase de plasma superior se recoge y posteriormente se combina. Como control, las construcciones de anticuerpo se diluyen inmediatamente antes del ensayo de citotoxicidad en medio RPMI-1640. La estabilidad en plasma se calcula como la relación de CE50 (después de incubación en plasma) a CE50 (control).

Además, se prefiere que la conversión de monómero en dímero de las construcciones de anticuerpo de la invención sea baja. La conversión puede medirse en diferentes condiciones y analizarse por cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento. Por ejemplo, la incubación de las isoformas monoméricas de las construcciones de anticuerpo puede realizarse durante 7 días a 37 °C y a concentraciones de, por ejemplo, 100 pg/ml o 250 pg/ml en una estufa de incubación. En estas condiciones, se prefiere que las construcciones de anticuerpo de la invención muestran un porcentaje de dímeros que es <5 %, más preferiblemente <4 %, incluso más preferiblemente <3 %, incluso más preferiblemente <2,5 %, incluso más preferiblemente <2 %, incluso más preferiblemente <1,5 % y mucho más preferiblemente <1 % o <0,5 % o incluso 0 %.

También se prefiere que las construcciones de anticuerpo biespecíficas de la presente invención presenten una conversión dimérica muy baja después de varios ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el monómero de construcción de anticuerpo se ajusta a una concentración de 250 pg/ml, por ejemplo, en tampón genérico de formulación y se somete a tres ciclos de congelación/descongelación (congelación a -80 °C durante 30 min seguido de descongelación durante 30 min a temperatura ambiente), seguido de SEC de alto rendimiento para determinar el porcentaje de construcción de anticuerpo inicialmente monomérica que se había convertido en construcción de anticuerpo dimérica. Preferiblemente, los porcentajes de dímeros de las construcciones de anticuerpo biespecíficas son <5 %, más preferiblemente <4 %, incluso más preferiblemente <3 %, incluso más preferiblemente <2,5 %, incluso más preferiblemente <2 %, incluso más preferiblemente <1,5 % y mucho más preferiblemente <1 % o incluso <0,5 %, por ejemplo, después de tres ciclos de congelación/descongelación.

Las construcciones de anticuerpo biespecíficas de la presente invención preferiblemente muestran una termoestabilidad favorable con temperaturas de agregación >45 °C o >50 °C, más preferiblemente >52 °C o >54 °C, incluso más preferiblemente >56 °C o >57 °C y mucho más preferiblemente >58 °C o >59 °C. El parámetro de termoestabilidad puede determinarse en términos de temperatura de agregación de anticuerpos como sigue: Se transfiere solución de anticuerpos a una concentración de 250 pg/ml en una cubeta de un solo uso y se coloca en un dispositivo de dispersión de luz dinámica (DLS). La muestra se calienta de 40 °C a 70 °C a una tasa de calentamiento de 0,5 °C/min con adquisición constante del radio medido. El aumento del radio que indica fusión de la proteína y agregación se usa para calcular la temperatura de agregación del anticuerpo.

Como alternativa, pueden determinarse curvas de temperatura-fusión por calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar las estabilidades biofísicas intrínsecas de la proteína de las construcciones de anticuerpo. Estos experimentos se realizan usando un dispositivo de VP-DSC de MicroCal LLC (Northampton, MA, EE. UU.). La captación de energía de una muestra que contiene una construcción de anticuerpo se registra de 20 °C a 90 °C en comparación con una muestra que contiene solamente tampón de formulación. Las construcciones de anticuerpo se ajustan a una concentración final de 250 pg/ml, por ejemplo, en tampón de migración de SEC. Para registrar la respectiva curva de fusión, se aumenta la temperatura global de la muestra por etapas. A cada temperatura T se registra la captación de energía de la muestra y la referencia de tampón de formulación. La diferencia en la captación de energía Cp (kcal/mol/°C) de la muestra menos la referencia se representa frente a la temperatura respectiva. La temperatura de fusión se define como la temperatura en el primer máximo de captación de energía. También se prevé que las construcciones de anticuerpo biespecíficas BCMAxCD3 de la invención tengan una turbidez (medida por DO340 después de concentración de la construcción de anticuerpo monomérica purificada a 2,5 mg/ml e incubación durante una noche) de <0,2, preferiblemente de <0,15, más preferiblemente de <0,12, incluso más preferiblemente de <0,1 y mucho más preferiblemente de <0,08.

En una realización adicional, la construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención es estable a pH fisiológico o ligeramente menor, es decir, aproximadamente pH 7,4 a 6,0. Cuanto más tolerante se comporte la construcción de anticuerpo a pH no fisiológico, tal como aproximadamente pH 6,0, mayor será la recuperación de la construcción de anticuerpo eluido de una columna de intercambio iónico con respecto a la cantidad total de proteína cargada. La recuperación de la construcción de anticuerpo de una columna de intercambio iónico (por ejemplo, catiónico) a aproximadamente pH 6,0 es preferiblemente >30 %, más preferiblemente >40 %, más preferiblemente >50 %, incluso más preferiblemente >60 %, incluso más preferiblemente >70 %, incluso más preferiblemente >80 %, incluso más preferiblemente >90 %, incluso más preferiblemente >95 % y mucho más preferiblemente >99 %.

Además, se prevé que las construcciones de anticuerpo biespecíficas de la presente invención muestran eficacia terapéutica o actividad antitumoral. Esto puede evaluarse, por ejemplo, en un estudio como se divulga en el siguiente ejemplo de un modelo de xenoinjerto de tumor humano en fase avanzada:

En el día 1 del estudio, se inyectan por vía subcutánea 5x106 células de una línea celular de cáncer positivo a antígeno de células diana humanas (aquí: BCMA) en el flanco dorsal derecho de ratones NOD/SCID hembra. Cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 100 mm3, se trasplantan linfocitos T CD3 positivos humanos expandidos in vitro en los ratones mediante inyección de aproximadamente 2x107 células en la cavidad peritoneal de los animales. Los ratones del grupo de control con vehículo 1 no reciben células efectoras y se usan como control sin trasplantar para su comparación con el grupo de control con vehículo 2 (que reciben células efectoras) para controlar el impacto de los linfocitos T en solitario sobre el crecimiento tumoral. El tratamiento con anticuerpo empieza cuando el volumen medio del tumor alcanza aproximadamente 200 mm3. El tamaño medio del tumor de cada grupo de tratamiento en el día del inicio del tratamiento no debe ser estadísticamente diferente de cualquier otro grupo (análisis de la varianza). Los ratones se tratan con 0,5 mg/kg/día de una construcción de anticuerpo biespecífica BCMAxCD3 por inyección en embolada intravenosa durante aproximadamente 15 a 20 días. Los tumores se miden mediante un calibre durante el estudio y se evalúa el progreso por comparación entre grupos de los volúmenes de los tumores (TV). La inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] se determina calculando TV como % T/C = 100 x (mediana de TV del grupo analizado) / (mediana de TV del grupo de control 2).

Los expertos en la materia conocen la manera de modificar o adaptar determinados parámetros de este estudio, tal como el número de células tumorales inyectadas, el sitio de inyección, el número de linfocitos T humanos trasplantados, la cantidad de construcciones de anticuerpo biespecíficas a administrar, y los plazos, mientras se llegue aún a un resultado significativo y reproducible. Preferiblemente, la inhibición del crecimiento tumoral T/C [%] es <70 o <60, más preferiblemente <50 o <40, incluso más preferiblemente <30 o <20 y mucho más preferiblemente <10 o <5 o incluso <2,5.

La construcción de anticuerpo de la invención es una construcción de anticuerpo monocatenaria.

En una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la invención dicho tercer dominio comprende, en un orden amínico a carboxílico:

bisagra-CH2-CH3-conector-bisagra-CH2-CH3.

En una realización de la invención, cada uno de dichos monómeros polipeptídicos del tercer dominio tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 17-24. En una realización preferida o la invención cada uno de dichos monómeros polipeptídicos tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 17-24.

También en una realización de la invención el dominio CH2 de uno o preferiblemente cada uno de (ambos) monómeros polipeptídicos del tercer dominio comprende un puente disulfuro de cisteína dentro del dominio. Como se sabe en la técnica, la expresión "puente disulfuro de cisteína" se refiere a un grupo funcional con la estructura general R-S-S-R. La unión también se denomina enlace SS o puente disulfuro y se obtiene mediante el acoplamiento de dos grupos tiol de residuos de cisteína. Es particularmente preferido para la construcción de anticuerpo de la invención que las cisteínas que forman el puente disulfuro de cisteína en la construcción de anticuerpo madura se introduzcan en la secuencia de aminoácidos del dominio CH2 correspondiente a 309 y 321 (numeración de Kabat).

En una realización de la invención se retira un sitio de glucosilación en la posición de Kabat 314 del dominio CH2. Se prefiere que esta retirada del sitio de glucosilación se consiga mediante una sustitución N314X, en la que X es cualquier aminoácido excluyendo Q. Dicha sustitución es preferiblemente una sustitución N314G. En una realización más preferida, dicho dominio CH2 comprende adicionalmente las siguientes sustituciones (posición de acuerdo con Kabat) V321C y R309C (estas sustituciones introducen el puente disulfuro de cisteína dentro del dominio en las posiciones de Kabat 309 y 321).

Se asume que los rasgos característicos preferidos de la construcción de anticuerpo de la invención en comparación, por ejemplo, con la construcción de anticuerpo heteroFc biespecífica conocida en la técnica (figura 1 b) pueden estar relacionados inter alia con la introducción de las modificaciones descritas anteriormente en el dominio CH2. Por tanto, se prefiere para la construcción de la invención que los dominios CH2 en el tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención comprendan el puente disulfuro de cisteína dentro del dominio en las posiciones de Kabat 309 y 321 y/o el sitio de glucosilación en la posición de Kabat 314 se retira mediante una sustitución N314X como se describe anteriormente, preferiblemente mediante una sustitución N314G.

en una realización preferida adicional de la invención los dominios CH2 en el tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención comprendan el puente disulfuro de cisteína dentro del dominio en las posiciones de Kabat 309 y 321 y el sitio de glucosilación en la posición de Kabat 314 se retira mediante una sustitución N314G. Más preferiblemente, el monómero polipeptídico del tercer dominio de la construcción de anticuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17 y 18.

En una realización, la invención proporciona una construcción de anticuerpo, en la que:

(i) el primer dominio comprende dos dominios variables de anticuerpo y el segundo dominio comprende dos dominios variables de anticuerpo;

(ii) el primer dominio comprende un dominio variable de anticuerpo y el segundo dominio comprende dos dominios variables de anticuerpo;

(iii) el primer dominio comprende dos dominios variables de anticuerpo y el segundo dominio comprende un dominio variable de anticuerpo; o

(iv) el primer dominio comprende un dominio variable de anticuerpo y el segundo dominio comprende un dominio variable de anticuerpo.

Por consiguiente, el primer y el segundo dominio pueden ser dominios de unión que comprenden cada uno dos dominios variables de anticuerpo, tal como un dominio VH y un VL. Ejemplos de dichos dominios de unión que comprenden dos dominios variables de anticuerpo se describen en la presente memoria anteriormente y comprenden, por ejemplo, fragmentos Fv, fragmentos scFv o fragmentos Fab descritos en la presente memoria anteriormente. Como alternativa, uno cualquiera de esos dominios de unión o ambos pueden comprender solamente un único dominio variable. Ejemplos de dichos dominios de unión de un solo dominio se describen en la presente memoria anteriormente y comprenden, por ejemplo, nanocuerpos o anticuerpos de un solo dominio variable que comprenden simplemente un dominio variable, que puede ser VHH, VH o VL, que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones V o dominios.

En una realización preferida de la construcción de anticuerpo de la invención, el primer y segundo dominio se fusionan al tercer dominio mediante un conector peptídico. El conector peptídico preferido se ha descrito en la presente memoria anteriormente y se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, es decir, Gly4Ser (SEQ ID NO: 1), o polímeros del mismo, es decir (Gly4Ser)x, donde x es un número entero de 1 o mayor (por ejemplo, 2 o 3). Un conector particularmente preferido para la fusión del primer y segundo dominio al tercer dominio se representa en SEQ ID NO: 1.

En una realización preferida, la construcción de anticuerpo de la invención se caracteriza por comprenden, en un orden amínico a carboxílico:

(a) el primer dominio;

(b) un conector peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-3;

(c) el segundo dominio;

(d) un conector peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1,2, 3, 9, 10, 11 y 12;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio;

(f) un conector peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8; y

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio.

La construcción de anticuerpo de la presente invención comprende un primer dominio que se une a BCMA, preferiblemente al dominio extracelular (ECD) de BCMA. Se entiende que la expresión "unión al dominio extracelular de BCMA", en el contexto de la presente invención, implica que el dominio de unión se une a BCMA expresado en la superficie de una célula diana. El primer dominio de acuerdo con la invención, por tanto, se une preferiblemente a BCMA cuando se expresa por células o líneas celular de expresión natural, y/o por células o líneas celulares transformadas o transfectadas (de forma estable/transitoria) con BCMA. En una realización preferida, el primer dominio de unión también se une a BCMA cuando se usa BCMA como molécula "diana" o "ligando" en un ensayo de unión in vitro tal como BIAcore o Scatchard. La "célula diana" puede ser cualquier célula procariota o eucariota que exprese BCMA en su superficie; preferiblemente la célula diana es una célula que es parte del organismo humano o animal, tal como un cáncer o célula tumoral específica que expresa BCMA.

Preferiblemente, el primer dominio se une a BCMA/ECD de BCMA humano. Una secuencia de BCMA humano preferida se representa en SEQ ID NO: 41, y una secuencia de ECD de BCMA humano preferida se representa en SEQ ID NO: 42. En una realización preferida adicional, se une a BCMA/ECD de BCMA de macaco. Una secuencia de BCMA de macaco preferida se representa en SEQ ID NO: 43, y una secuencia de ECD de BCMA de macaco preferida se representa en SEQ ID NO: 44. De acuerdo con la realización más preferida, el primer dominio se une a BCMA/ECD de BCMA humano y también de macaco. El "dominio extracelular de BCMA" o "ECD de BCMA" se refiere a la región o secuencia de BCMA que está esencialmente libre de dominios transmembranarios y citoplásmicos de BCMA. Los expertos en la materia entenderán que el dominio transmembranario identificado para el polipéptido de BCMA de la presente invención se identifica conforme a criterios empleados de forma rutinaria en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de un dominio transmembranario pueden variar, pero muy probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio mencionado específicamente en la presente memoria. Una secuencia de aminoácidos de BCMA de longitud completa preferida se representa en SEQ ID NO: 41. Un ECD de BCMA preferido se muestra en SEQ ID NO: 42. Se divulgan dominios de unión preferidos que se unen a BCMA en los documentos WO 2013/072406, WO 2013/072415 y WO 2014/140248. Puede usarse cualquier dominio de unión a BCMA descrito en estas solicitudes en el contexto de la presente invención.

En un aspecto de la invención la construcción de anticuerpo comprende en orden amínico a carboxílico:

(a) el primer dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 53, 59, 71,77, 89 o 95;

(c) el segundo dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187 del documento WO 2008/119567, o SEQ ID NO: 15;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio que tiene una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-24;

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio que tiene una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-24.

En línea con esta realización preferida, el primer y segundo dominio que se fusionan mediante un conector peptídico al tercer dominio comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 53, 59, 71,77, 89 o 95. En un aspecto, la construcción de anticuerpo de la invención se caracteriza por tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55, 56, 61,62, 73, 74, 79, 80, 91,92, 97 y 98. La invención proporciona además un polinucleótido/molécula de ácido nucleico que codifica una construcción de anticuerpo de la invención. Un polinucleótido es un biopolímero compuesto de 13 o más monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (tal como ADNc) y el ARN (tal como ARNm) son ejemplos de polinucleótidos con distinta fusión biológica. Los nucleótidos son moléculas orgánicas que sirven como monómeros o subunidades de moléculas de ácido nucleico como ADN o ARN. La molécula de ácido nucleico o polinucleótido puede ser bicatenario y monocatenario, lineal y circular. Está comprendido preferiblemente en un vector que está comprendido preferiblemente en una célula hospedadora. Dicha célula hospedadora puede, por ejemplo, después de transformación o transfección con el vector o el polinucleótido de la invención, expresar la construcción de anticuerpo. Para ese propósito, el polinucleótido o molécula de ácido nucleico se une de forma funcional a secuencias de control.

El código genético es el conjunto de normas por el que la información codificada dentro del material genético (ácidos nucleicos) se traduce en proteínas. La descodificación biológica en células vivas se consigue mediante el ribosoma que une los aminoácidos en un orden especificado por el ARNm, usando moléculas de ARNt para transportar aminoácidos y para leer tres nucleótidos de ARNm cada vez. El código define la manera en que secuencias de estos tripletes nucleotídicos, denominados codones, especifican el aminoácido que se añadirá a continuación durante la síntesis de proteínas. Con algunas excepciones, un codón trinucleotídico en una secuencia de ácido nucleico especifica un solo aminoácido. Como la inmensa mayoría de los genes están codificados con exactamente el mismo código, este código particular a menudo se denomina código genético canónico o convencional. Aunque el código genético determina la secuencia proteínica para una región codificante dada, otras regiones genómicas pueden influir en el momento y el lugar en que se producen estas proteínas.

Además, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido/molécula de ácido nucleico de la invención. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada como vehículo para transferir material genético (exógeno) en una célula. El término "vector" abarca, aunque sin restricción, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. En general, los vectores manipulados comprenden un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y un marcador de selección. El propio vector en genera es una secuencia de nucleótidos, habitualmente una secuencia de ADN que comprende un inserto (transgén) y una secuencia más grande que sirve como "cadena principal" del vector. Los vectores modernos pueden abarcar rasgos característicos adicionales además del inserto transgénico y una cadena principal: promotor, marcador genético, resistencia a antibiótico, gen indicador, secuencia de dirección, marca de purificación de proteína. Los vectores denominados vectores de expresión (construcciones de expresión) son específicamente para la expresión del transgén en la célula diana, y en general tienen secuencias de control.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida de forma funcional en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido de forma funcional" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder de secreción está unido de forma funcional a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido de forma funcional a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido de forma funcional a una secuencia codificante si está colocado para facilitar la traducción. En general, "unida de forma funcional" significa que las secuencias de ADN que se une son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o conectores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

"Transfección" es el proceso de introducción deliberada de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) en células diana. El término se usa principalmente para métodos no víricos en células eucariotas. La transducción a menudo se usa para describir la transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales típicamente implica abrir poros u "orificios" transitorios en la membrana celular, para permitir la captación de material. La transfección puede realizarse usando fosfato de calcio, por electroporación, por constricción celular o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan sus cargas dentro.

El término "transformación" se usa para describir la transferencia no vírica de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) en bacterias, y también en células eucariotas no animales, incluyendo células vegetales. La transformación, por tanto, es la alteración genética de una célula bacteriana o eucariota no animal resultante de la captación directa a través de la una o más membranas celulares desde sus alrededores y la posterior incorporación de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación puede lograrse por medios artificiales. Para que suceda la transformación, las células o bacterias deben estar en un estado de competencia, que podría ocurrir como una respuesta limitada por el tiempo a condiciones ambientales tales como privación y densidad celular.

Además, la invención proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con el polinucleótido/molécula de ácido nucleico o con el vector de la invención. Como se usa en la presente memoria, las expresiones "célula hospedadora" o "célula destinataria" pretenden incluir cualquier célula individual o cultivo celular que puede ser o haya sido destinatario de vectores, moléculas de ácido nucleico exógenas, y polinucleótidos que codifican la construcción de anticuerpo de la presente invención; y/o destinatarios de la propia construcción de anticuerpo. La introducción del material respectivo en la célula se realiza mediante transformación, transfección y similares. La expresión "célula hospedadora" también pretende incluir la descendencia o posible descendencia de una sola célula. Como pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación natural, accidental o deliberada o debido a influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN genómico o total) a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión como se usa en la presente memoria. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas o eucariotas, y también incluyen, aunque sin limitación, bacterias, células de levadura, células fúngicas, células vegetales y células animales tales como células de insecto y células de mamífero, por ejemplo, murinas, de rata, de macaco o humanas.

La construcción de anticuerpo de la invención puede producirse en bacterias. Después de la expresión, la construcción de anticuerpo de la invención se aísla de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse a través de, por ejemplo, cromatografía de afinidad y/o exclusión por tamaño. La purificación final puede realizarse similar al proceso para purificar anticuerpos expresados, por ejemplo, en células CHO.

Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o las levaduras son hospedadores de clonación o expresión adecuados para la construcción de anticuerpo de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de cerveza, es la más habitualmente usada entre los organismos hospedadoras eucariotas inferiores. Sin embargo, están habitualmente disponibles otros varios géneros, especies y cepas y son útiles en la presente memoria, tales como Schizosaccharomyces pombe, hospedadores de Kluyveromyces tales como K. lactis, K. fragilis (A^tCC 12424), K. bulgaricus (A^tC^c16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402 226); Pichia pastoris (documento EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de la construcción de anticuerpo glucosilada de la invención se obtienen de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes a partir de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí. Está disponible al público una diversidad de cepas víricas para transfección, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de NPV de Bombyx mori, y dichos virus pueden usarse como virus en la presente memoria de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También pueden usarse cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, Arabidopsis y tabaco como hospedadores. Los vectores de clonación y expresión útiles en la producción de proteínas en cultivo de células vegetales son conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, y Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

Sin embargo, el interés ha sido máximo en células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (histocultivo) se han convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVI ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervicouterino humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3^a, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2,14138065); tumor mamario de ratón (M^mT 060562, ATCC CCL5 1); células TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

En una realización adicional, la invención proporciona un proceso para la producción de una construcción de anticuerpo de la invención, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones que permitan la expresión de la construcción de anticuerpo de la invención y recuperar la construcción de anticuerpo producida del cultivo.

Como se usa en la presente memoria, el término "cultivar" se refiere al mantenimiento, diferenciación, crecimiento, proliferación y/o propagación in vitro de células en condiciones adecuadas en un medio. El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de una construcción de anticuerpo de la invención incluyendo, aunque sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Cuando se usan técnicas recombinantes, la construcción de anticuerpo puede producirse de forma intracelular, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si la construcción de anticuerpo se produce de forma intracelular, como primera etapa, los desechos en partículas, las células hospedadoras o los fragmentos lisados, se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares pueden retirarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en general se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes fortuitos.

La construcción de anticuerpo de la invención preparada a partir de las células hospedadoras puede recuperarse o purificarse usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. También están disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre SEPHAROSE™ heparina, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico

(tal como una columna de poli(ácido aspártico)), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación en sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo a recuperar. Cuando la construcción de anticuerpo de la invención comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación.

La cromatografía de afinidad es una técnica de purificación preferida. La matriz a la que se fija el ligando de afinidad es muy a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden conseguirse con agarosa.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de la invención o una construcción de anticuerpo producida de acuerdo con el proceso de la invención. Se prefiere para la composición farmacéutica de la invención que la homogeneidad de la construcción de anticuerpo sea >80 %, más preferiblemente >81 %, >82 %, >83 %, >84 % o >85 %, más preferiblemente >86 %, >87 %, >88 aún más preferiblemente, >91 %, >92

% o >95 % y mucho más preferiblemente >96 o >99 %.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una composición que es adecuada para su administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. La composición farmacéutica particularmente preferida de esta invención comprende una o una pluralidad de la construcción o construcciones de anticuerpo de la invención, preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además formulaciones adecuadas de uno o más vehículos (farmacéuticamente eficaces), estabilizantes, excipientes, diluyentes, solubilizantes, tensioactivos, emulsionantes, conservantes y/o adyuvantes. Los constituyentes aceptables de la composición son preferiblemente atóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, aunque sin limitación, composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas.

Las composiciones de la invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. En general, como se usa en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa todas y cada una de las soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles, disolventes, tampones, por ejemplo, soluciones salinas tamponadas con fosfato (PBS), agua, suspensiones, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, liposomas, medios de dispersión y recubrimientos, que son compatibles con la administración farmacéutica, en particular con la administración parenteral. El uso de dichos medios y agentes en composiciones farmacéuticas es bien conocido en la técnica, y las composiciones que comprenden dichos vehículos pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos.

Determinadas realizaciones proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la construcción de anticuerpo de la invención y además uno o más excipientes tales como los descritos de forma ilustrativa en esta sección y en otra parte de la presente memoria. Los excipientes pueden usarse en la invención a este respecto para una amplia diversidad de propósitos, tales como ajustar las propiedades físicas, químicas o biológicas de las formulaciones, tales como el ajuste de la viscosidad, y/o procesos de la invención para mejorar la eficacia y/o para estabilizar dichas formulaciones y procesos contra la degradación y deterioro debidos a, por ejemplo, agresiones que se producen durante la fabricación, transporte, almacenamiento, preparación antes del uso, administración y después de ello.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación con el propósito de modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la tasa de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición (véase, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.a edición, (A.R.

Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). En dichas realizaciones, los materiales de formulación adecuados pueden incluir, aunque sin limitación:

• aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, treonina, prolina, 2-fenilalanina, incluyendo aminoácidos cargados, preferiblemente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato y/o histidina

• agentes antimicrobianos tales como antibacterianos y antifúngicos

• antioxidantes tales como ácido ascórbico, metionina, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio;

• tampones, sistemas tamponantes y agentes tamponantes que se usan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor; ejemplos de tampones son borato, bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos, succinato, fosfato e histidina; por ejemplo, tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5;

disolventes no acuosos tales como propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo;

vehículos acuosos incluyendo agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado;

polímeros biodegradables tales como poliésteres;

agentes espesantes tales como manitol o glicina;

agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA);

agentes isotónicos y retardadores de la absorción;

agentes formadores de complejos tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-betaciclodextrina

rellenos;

monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa o dextrinas); los carbohidratos pueden ser glúcidos no reductores, preferiblemente trehalosa, sacarosa, octasulfato, sorbitol o xilitol;

proteínas (de bajo peso molecular), polipéptidos o vehículos proteínicos tales como seroalbúmina humana o bovina, gelatina o inmunoglobulinas, preferiblemente de origen humano;

agentes colorantes y aromatizantes;

agentes reductores que contienen azufre, tales como glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol y tiosulfato de sodio

agentes diluyentes;

agentes emulsionantes;

polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona)

contraiones formadores de sal tales como sodio;

conservantes tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares; ejemplos son: cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno);

complejos metálicos tales como complejos de Zn-proteína;

disolventes y codisolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol);

glúcidos y alditoles, tales como trehalosa, sacarosa, octasulfato, manitol, sorbitol o xilitol, estaquiosa, manosa, sorbosa, xilosa, ribosa, mioinisitosa, galactosa, lactitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; y alditoles polihídricos;

• agentes de suspensión;

tensioactivos o agentes humectantes tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal; los tensioactivos pueden ser detergentes, preferiblemente con un peso molecular de >1,2 kDa y/o un poliéter, preferiblemente con un peso molecular de >3 kDa; ejemplos no limitantes para detergentes preferidos son Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 y Tween 85; ejemplos no limitantes para poliéteres preferidos son PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 y PEG 5000;

• agentes potenciadores de la estabilidad tales como sacarosa o sorbitol;

• agentes potenciadores de la tonicidad tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol;

• vehículos de administración parenteral incluyendo solución de cloruro de sodio, solución de Ringer con dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites fijos;

• vehículos de administración intravenosa incluyendo reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en solución de Ringer con dextrosa).

Es evidente para los expertos en la materia que los diferentes constituyentes de la composición farmacéutica (por ejemplo, los enumerados anteriormente) pueden tener diferentes efectos, por ejemplo, un aminoácido puede actuar como tampón, estabilizantes y/o antioxidante; el manitol puede actuar como agente espesante y/o agente potenciador de la tonicidad; el cloruro de sodio puede actuar como vehículo de administración y/o agente potenciador de la tonicidad; etc.

Se prevé que la composición de la invención podría comprender, además del polipéptido de la invención definido en la presente memoria, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición. Dichos podrían ser fármacos que actúan en el sistema gastrointestinal, fármacos que actúan como citostáticos, fármacos que previenen la hiperuricemia, fármacos que inhiben las inmunorreacciones (por ejemplo, corticoesteroides), fármacos que modulan la respuesta inflamatoria, fármacos que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como citocinas conocidas en la técnica. También se prevé que la construcción de anticuerpo de la presente invención se aplique en un tratamiento conjunto, es decir, en combinación con otro medicamento antineoplásico.

En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica óptima la determinará un experto en la materia dependiendo de, por ejemplo, la vía pretendida de administración, el formato de suministro y la dosificación deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. En determinadas realizaciones, dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de eliminación in vivo de la construcción de anticuerpo de la invención. En determinadas realizaciones, el vehículo o excipiente principal en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o excipiente adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina son vehículos ejemplares adicionales. En determinadas realizaciones, las composiciones de construcción de anticuerpo de la invención pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) en forma de una torta liofilizada o en una solución acuosa. Además, en determinadas realizaciones, la construcción de anticuerpo de la invención puede formularse como un liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Cuando se contempla administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa apirógena, parenteralmente aceptable que comprende la construcción de anticuerpo deseada de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en que se formula la construcción de anticuerpo de la invención como una solución isotónica estéril, apropiadamente conservada. En determinadas realizaciones, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), microesferas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o mantenida del producto que puede administrarse mediante una inyección de absorción retardada. En determinadas realizaciones, también puede usarse ácido hialurónico, que tiene el efecto de promover una duración mantenida en la circulación. En determinadas realizaciones, pueden usarse dispositivos implantables de administración de fármacos para introducir la construcción de anticuerpo deseada.

Serán evidentes composiciones farmacéuticas adicionales para los expertos en la materia, incluyendo formulaciones que implican la construcción de anticuerpo de la invención en formulaciones de administración/liberación mantenida o controlada. Las técnicas para formular una diversidad de otros medios de administración mantenida o controlada, tales como vehículos de liposomas, micropartículas bioerosionables o microesferas porosas e inyecciones de absorción retardada, también son conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO9315722, que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación mantenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación mantenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 3.773.919 y la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolimers 2: 547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98 105), acetato de etilenvinilo (Langer et al., 1981, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (publicación de solicitud de patente europea n.° EP 133.988). Las composiciones de liberación mantenida también pueden incluir liposomas que pueden prepararse por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692; publicaciones de solicitud de patente europea n.° Ep 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

La construcción de anticuerpo también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Las composiciones farmacéuticas usadas para administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. Puede realizarse esterilización por filtración a través de membranas estériles de filtración. Cuando las composiciones se liofilizan, puede realizarse esterilización usando este método antes o después de liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Las composiciones parenterales en general se colocan en un recipiente que tiene una vía de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Otro aspecto de la invención incluye formulaciones autotamponantes de construcción de anticuerpo de la invención, que pueden usarse como composiciones farmacéuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2. Está disponible una diversidad de exposiciones sobre estabilización de proteínas y materiales de formulación y métodos útiles a este respecto, tales como Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter y Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), y Randolph et al, "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), véanse particularmente las partes pertinentes a los excipientes y procesos de los mismos para formulaciones proteínicas autotamponantes de acuerdo con la presente invención, especialmente en cuanto a productos farmacéuticos proteínicos y procesos para usos veterinarios y/o médicos humanos.

Pueden usarse sales de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición de acuerdo con la invención. Como es bien sabido, los iones pueden estabilizar el estado natural de las proteínas por unión a residuos cargados en la superficie de la proteína y cubriendo grupos cargados y polares de la proteína y reduciendo la fuerza de sus interacciones electrostáticas, interacciones de atracción y de repulsión. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína por unión a, en particular, los enlaces peptídicos desnaturalizados (--CONH) de la proteína. Además, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteína también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, de ese modo, evitar o reducir la agregación e insolubilidad de las proteínas.

Las especies iónicas difieren significativamente en sus efectos sobre las proteínas. Se han desarrollado varias clasificaciones por categorías de los iones y sus efectos sobre las proteínas, que pueden usarse en la formulación de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Un ejemplo es la serie Hofmeister, que clasifica los solutos iónicos y polares no iónicos por su efecto sobre la estabilidad conformacional de las proteínas en solución. Los solutos estabilizantes se denominan "cosmótropos". Los solutos desestabilizantes se denominan "caótropos". Los cosmótropos se usan habitualmente a altas concentraciones (por ejemplo, sulfato de amonio >1 molar) para precipitar las proteínas en la solución ("desestabilización salina"). Los caótropos se usan habitualmente para desnaturalizar y/o solubilizar las proteínas ("disolución salina"). La eficacia relativa de los iones para "disolución salina" y "desestabilización salina" define si posición en la serie Hofmeister.

Los aminoácidos libres pueden usarse en las formulaciones de construcción de anticuerpo de la invención de acuerdo con diversas realizaciones de la invención como agentes espesantes, estabilizantes y antioxidantes, así como otros usos convencionales. Puede usarse lisina, prolina, serina y alanina para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en liofilización para garantizar la correcta estructura de torta y las propiedades. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de proteínas, en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas. La metionina es útil como antioxidante.

Los polioles incluyen glúcidos, por ejemplo, manitol, sacarosa y sorbitol y alcoholes polihídricos tales como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol y, con propósitos de análisis en la presente memoria, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmótropos. Son agentes estabilizantes útiles en formulaciones tanto líquidas como liofilizadas para proteger las proteínas de procesos de degradación físicos y químicos. Los polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones. Entre los polioles útiles en realizaciones seleccionadas de la invención está el manitol, habitualmente usado para garantizar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. Garantiza la estabilidad estructural en la torta. En general se usa con un lioprotector, por ejemplo, sacarosa. El sorbitol y la sacarosa están entre los agentes preferidos para ajustar la tonicidad y como estabilizantes para proteger contra agresiones por congelación-descongelación durante el transporte o la preparación a granel durante el proceso de fabricación. Los glúcidos reductores (que contienen grupos aldehído o cetona libres), tales como glucosa y lactosa, pueden glucar residuos superficiales de lisina y arginina. Por lo tanto, en general no están entre los polioles preferidos para su uso de acuerdo con la invención. Además, los glúcidos que forman dichas especies reactivas, tales como sacarosa, que se hidroliza en fructosa y glucosa en condiciones ácidas, y por consiguiente genera glucación, tampoco están entre los polioles preferidos de la invención a este respecto. El PEG es útil para estabilizar las proteínas y como crioprotector y puede usarse en la invención a este respecto.

Las realizaciones de las formulaciones de construcción de anticuerpo de la invención comprenden además tensioactivos. Las moléculas proteínicas pueden ser susceptibles a adsorción sobre superficies y a desnaturalización y consiguiente agregación en superficies de contacto de aire-líquido, sólido-líquido y líquido-líquido. Estos efectos en general cambian de escala inversamente a la concentración de proteína. Estas interacciones perjudiciales en general cambian de escala inversamente a la concentración de proteína y típicamente se exacerban por agitación física, tal como la generada durante el transporte y la manipulación de un producto. Los tensioactivos se usan de forma rutinaria para evitar, minimizar o reducir la adsorción superficial. Los tensioactivos útiles en la invención a este respecto incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros ésteres de ácido graso de polietoxilatos de sorbitán y poloxámero 188. Los tensioactivos también se usan habitualmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensioactivos a este respecto es específico de proteínas ya que cualquier tensioactivo dado típicamente estabilizará algunas proteínas y desestabilizará otras.

Los polisorbatos son susceptibles a degradación oxidativa y a menudo, según se suministran, contienen cantidades suficientes de peróxidos para provocar la oxidación de las cadenas laterales de la proteína, especialmente metionina. En consecuencia, los polisorbatos deben usarse cuidadosamente y, cuando se usan, deben emplearse a su concentración eficaz más baja. A este respecto, los polisorbatos ejemplifican la norma general de que los excipientes deben usarse en sus concentraciones eficaces más bajas.

Las realizaciones de las formulaciones de construcción de anticuerpo de la invención comprenden además uno o más antioxidantes. En alguna medida puede evitarse la oxidación perjudicial de las proteínas en las formulaciones farmacéuticas manteniendo los niveles apropiados de oxígeno ambiental y temperatura y evitando la exposición a la luz. Pueden usarse excipientes antioxidantes también para prevenir la degradación oxidativa de las proteínas. Entre los antioxidantes útiles a este respecto están los agentes reductores, los aceptadores de oxígeno/radicales libres y los agentes quelantes. Los antioxidantes para su uso en formulaciones de proteína terapéutica de acuerdo con la invención preferiblemente son solubles en agua y mantienen su actividad durante toda la vida útil de un producto. El EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invención a este respecto. Los antioxidantes pueden dañar las proteínas. Por ejemplo, los agentes reductores, tales como glutatión en particular, pueden alterar los enlaces disulfuro intramoleculares. Por tanto, los antioxidantes para su uso en la invención se seleccionan para, entre otras cosas, eliminar o reducir suficientemente la posibilidad de que por sí mismo dañes las proteínas en la formulación.

Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden incluir iones metálicos que son cofactores de las proteínas y que son necesarios para formar complejos de coordinación proteínicos, tal como cinc necesario para formar determinadas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan las proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan los procesos físicos y químicos que degradan las proteínas. Pueden usarse iones de magnesio (10-120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico en ácido isoaspártico. Los iones de Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Mg+2, Mn+2 y Zn+2, sin embargo, pueden desestabilizar la rhDNasa. Asimismo, Ca+2 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, que puede desestabilizarse por Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2, y su agregación puede aumentarse por iones de Al+3.

Las realizaciones de las formulaciones de construcción de anticuerpo de la invención comprenden además uno o más conservantes. Los conservantes son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales multidosis que implican más de una extracción del mismo recipiente. Su función principal es inhibir el crecimiento microbiano y garantizar la esterilidad del producto durante toda la vida útil o periodo de uso del medicamento Los conservantes habitualmente usados incluyen alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservantes tienen un largo historial de uso con compuestos parenterales micromoleculares, el desarrollo de formulaciones proteínicas que incluyen conservantes puede ser problemático. Los conservantes casi siempre tienen un efecto desestabilizante (agregación) sobre las proteínas, y esto se ha convertido en un factor principal en la limitación de su uso en formulaciones proteínicas multidosis. Hasta la fecha, la mayoría de fármacos proteínicos se ha formulado para un solo uso únicamente. Sin embargo, cuando son posibles formulaciones multidosis, tienen la ventaja añadida de posibilitar la comodidad del paciente y la comerciabilidad aumentada. Un buen ejemplo es el de la hormona del crecimiento humana (hGH) donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha dado lugar a la comercialización de presentaciones de pluma de inyección multiusos más convenientes. Actualmente están disponibles en el mercado al menos cuatro de dichos dispositivos de pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ (líquido, Genentech) y Genotropin (cartucho de doble cámara liofilizado, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol mientras que Somatrope (Eli Lilly) se formula con m-cresol. Tienen que considerarse varios aspectos durante la formulación y desarrollo de formas farmacéuticas conservadas. La concentración de conservante eficaz en el medicamento debe optimizarse. Esto requiere ensayar un conservante dado en la forma farmacéutica con intervalos de concentración que confieran eficacia antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteína.

Como puede esperarse, el desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservantes es más problemático que las formulaciones liofilizadas. Los productos secados por congelación pueden liofilizarse sin el conservante y reconstituirse con un diluyente que contenga conservante en el momento de uso. Esto acorta el tiempo durante el que un conservante está en contacto con la proteína, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Con las formulaciones líquidas, la eficacia y estabilidad del conservante deben mantenerse durante la toda la vida útil del producto (aproximadamente de 18 a 24 meses). Un punto a destacar importante es que la eficacia del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes excipientes.

Las construcciones de anticuerpo divulgadas en la presente memoria también pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para administrar un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen la construcción de anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); patentes de Estados Unidos n.° 4.485.045 y 4.544.545; y documento WO 97/38731. Los liposomas con tiempo en circulación potenciado se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de la construcción de anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterápico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

Una vez se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de su administración.

La actividad biológica de la composición farmacéutica definida en la presente memoria puede determinarse, por ejemplo, por ensayos de citotoxicidad, como se describe en los siguientes ejemplos, en el documento WO 99/54440 o por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). La "eficacia" o "eficacia in vivo" como se usa en la presente memoria se refiere a la respuesta al tratamiento por la composición farmacéutica de la invención, usando, por ejemplo, criterios de respuesta NCI normalizados. El éxito o la eficacia in vivo del tratamiento usando una composición farmacéutica de la invención se refiere a la eficacia de la composición para su propósito pretendido, es decir, la capacidad de la composición de provocar su efecto deseado, es decir, reducción de las células patológicas, por ejemplo, células tumorales. La eficacia in vivo puede controlarse por métodos convencionales establecidos para las entidades patológicas respectivas incluyendo, aunque sin limitación, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea. Además, pueden usarse diversos parámetros de química clínica específicos de enfermedad y otros métodos convencionales establecidos. Además, puede usarse tomografía asistida por ordenador, rayos X, tomografía por resonancia magnética nuclear (por ejemplo, para evaluación de respuesta basada en criterios del National Cancer Institute [Cheson BD, Horning Sj , Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harres NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. abril de 1999; 17(4): 1244]), exploración por tomografía de emisión de positrones, recuentos de glóbulos blancos, diferenciales, clasificación celular activada por fluorescencia, aspiración de médula ósea, biopsias/histologías de ganglios linfáticos y diversos parámetros de química clínica específicos de linfoma (por ejemplo, lactato deshidrogenasa) y otros métodos convencionales establecidos.

Otro problema principal en el desarrollo de fármacos tales como la composición farmacéutica de la invención es la modulación predecible de las propiedades farmacocinéticas. Para este fin, puede establecerse un perfil farmacocinético del fármaco candidato, es decir, un perfil de los parámetros farmacocinéticos que afectan a la capacidad de un fármaco particular de tratar una afección dada. Los parámetros farmacocinéticos del fármaco que influyen en la capacidad de un fármaco de tratar una determinada entidad de enfermedad incluyen, aunque sin limitación: semivida, volumen de distribución, metabolismo de primer paso hepático y el grado de unión en suero sanguíneo. La eficacia de un medicamento dado puede verse influida por cada uno de los parámetros mencionados anteriormente. Es una característica prevista de las construcciones de anticuerpo de la presente invención provistas de la modalidad Fc específica que implican, por ejemplo, diferencias en el comportamiento farmacocinético. Una construcción de anticuerpo dirigida de semivida prolongada de acuerdo con la presente invención preferiblemente muestra un tiempo de residencia sorprendentemente aumentado in vivo en comparación con versiones "canónicas" no HLE de dicha construcción de anticuerpo.

"Semivida" significa el tiempo en el que un 50 % de un fármaco administrado se elimina a través de procesos biológicos, por ejemplo, metabolismo, excreción, etc. Por "metabolismo de primer paso hepático" se entiende la propensión de un fármaco de metabolizarse tras el primer contacto con el hígado, es decir, durante su primer paso a través del hígado. "Volumen de distribución" significa el grado de retención de un fármaco por todos los diversos compartimentos del organismo, como, por ejemplo, espacios intracelulares y extracelulares, tejidos y órganos, etc. y la distribución del fármaco dentro de estos compartimentos. "Grado de unión en suero sanguíneo" significa la propensión de un fármaco de interactuar con y unirse a proteínas del suero sanguíneo, tal como albúmina, que da lugar a una reducción o pérdida de la actividad biológica del fármaco.

Los parámetros farmacocinéticos también incluyen biodisponibilidad, periodo de latencia (Tlag), Tmáx, tasas de absorción, más aparición y/o Cmáx para una cantidad dada de fármaco administrado. "Biodisponibilidad" significa la cantidad de un fármaco en el compartimento sanguíneo. "Periodo de latencia" significa el retardo en el tiempo entre la administración del fármaco y su detección y cuantificabilidad en sangre o plasma. "Tmáx" es el tiempo después del que se alcanza la concentración sanguínea máxima del fármaco, y "Cmáx" es la concentración sanguínea obtenida de forma máxima con un fármaco dado. El tiempo hasta alcanzar una concentración sanguínea o en tejido del fármaco que se requiere para su efecto biológico se ve influido por todos los parámetros. Los parámetros farmacocinéticos de construcciones de anticuerpo biespecíficas que muestran especificidad de especie cruzada, que puede determinarse en ensayo preclínico en animales en primates que no sean chimpancés como se resumen anteriormente, también se exponen, por ejemplo, en la publicación de Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

En un aspecto preferido de la invención, la composición farmacéutica es estable durante al menos cuatro semanas a aproximadamente -20 °C. Como es evidente a partir de los ejemplos adjuntos, la calidad de una construcción de anticuerpo de la invención frente a la calidad de las correspondientes construcciones de anticuerpo del estado de la técnica puede ensayarse usando diferentes sistemas. Se entiende que esos ensayos están en línea con la "ICH Harmonised Tripartite Guideline: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C and Specifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B' y, por tanto, se eligen para proporcionar un perfil que indique estabilidad que proporcione certeza de que se detectan cambios en la identidad, pureza y potencia del producto. Está bien aceptado que el término pureza es un término relativo. Debido al efecto de la glucosilación, desamidación u otras heterogeneidades, la pureza absoluta de un producto biotecnológico/biológico debe evaluarse típicamente por más de un método y el valor de pureza derivado es dependiente del método. Con el propósito de ensayo de la estabilidad, los ensayos para la pureza deben centrarse en los métodos para la determinación de productos de degradación.

Para la evaluación de la calidad de una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de la invención puede analizarse, por ejemplo, analizando el contenido de agregados solubles en una solución (HMWS según exclusión por tamaño). Se prefiere que la estabilidad durante al menos cuatro semanas a aproximadamente -20 °C se caracterice por un contenido de menos de un 1,5 % de HMWS, preferiblemente menos de un 1 % de HMWS.

Una formulación preferida para la construcción de anticuerpo como una composición farmacéutica puede comprender, por ejemplo, los componentes de una formulación como se describe a continuación:

• Formulación A:

fosfato de potasio, clorhidrato de L-arginina, dihidrato de trehalosa, polisorbato 80 a pH 6,0

Otros ejemplos para la evaluación de la estabilidad de una construcción de anticuerpo de la invención en forma de una composición farmacéutica se proporcionan en los ejemplos adjuntos 4-12. En esos ejemplos se ensayan realizaciones de construcciones de anticuerpo de la invención con respecto a diferentes condiciones de agresión en diferentes formulaciones farmacéuticas y los resultados se comparan con otros formatos de prolongación de la semivida (HLE) de construcción de anticuerpo de acoplamiento de linfocitos T biespecífica conocidos de la técnica. En general, se prevé que las construcciones de anticuerpo provistas de la modalidad Fc específica de acuerdo con la presente invención sean típicamente más estable sobre un amplio intervalo de condiciones de agresión tales como temperatura y agresión lumínica, ambos en comparación con construcciones de anticuerpo provistas de diferentes formatos HLE y sin ningún formato HLE (es decir construcciones de anticuerpo "canónicas"). Dicha termoestabilidad puede referirse tanto a temperatura disminuida (por debajo de la temperatura ambiente incluyendo congelación) como aumentada (por encima de la temperatura ambiente incluyendo temperaturas de hasta o por encima de la temperatura corporal). Como conocerán los expertos en la materia, dicha estabilidad mejorada con respecto a agresiones, lo que apenas es evitable en la práctica clínica, hacer que la construcción de anticuerpo sea más segura debido a que se producirán menos productos de degradación en la práctica clínica. En consecuencia, dicha estabilidad aumentada significa seguridad aumentada.

Una realización proporciona la construcción de anticuerpo de la invención o la construcción de anticuerpo producida de acuerdo con el proceso de la invención para su uso en la prevención, tratamiento o mejora de un trastorno de linfocitos B que se correlaciona con la expresión de BCMA o sobreexpresión de BCMA, un trastorno de plasmocitos y una enfermedad autoinmunitaria.

Las formulaciones descritas en la presente memoria son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento, mejora y/o prevención de la afección médica patológica como se describe en la presente memoria en un paciente que lo necesita. El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación al organismo, un tejido aislado o célula del paciente que tiene una enfermedad/trastorno, un síntoma de una enfermedad/trastorno, o una predisposición a una enfermedad/trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o influir en la enfermedad, el síntoma de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad.

El término "mejora" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier mejora del estado patológico de un paciente que tiene una enfermedad como se especifica en la presente memoria a continuación, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesite. Dicha mejora también puede observarse como una ralentización o detención de la progresión de la enfermedad del paciente. El término "prevención" como se usa en la presente memoria significa la evitación de la aparición o reaparición en un paciente que tiene un tumor o cáncer o un cáncer metastásico como se especifica en la presente memoria a continuación, mediante la administración de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesite.

El término "enfermedad" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica descrita en la presente memoria. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero a la enfermedad en cuestión.

Una "neoplasia" es un crecimiento anómalo de tejido, formando habitualmente, pero no siempre, una masa. Cuando también forma una masa, se denomina comúnmente "tumor". Las neoplasias o tumores pueden ser benignos, potencialmente malignos (precancerosos) o malignos. Las neoplasias malignas habitualmente se denominan cáncer. Habitualmente invaden y destruyen el tejido circundante y pueden formar metástasis, es decir, se propagan a otras partes, tejidos u órganos del organismo. Por tanto, la expresión "cáncer metastásico" abarca metástasis a otros tejidos u órganos distintos del de tumor original. Los linfomas y leucemias son neoplasias linfoides. Para los propósitos de la presente invención, también se incluyen por los términos "tumor" o "cáncer".

La expresión "enfermedad vírica" describe enfermedades, que son el resultado de una infección vírica de un sujeto. La expresión "trastorno inmunológico" como se usa en la presente memoria describe, en línea con la definición común de esta expresión, trastornos inmunológicos tales como enfermedades autoinmunitarias, hipersensibilidades, inmunodeficiencias.

En trastornos de plasmocitos, un clon de plasmocitos se multiplica incontrolablemente. Como resultado, este clon produce cantidades inmensas de un solo anticuerpo (monoclonal) conocido como proteína M. En algunos casos, tales como con gammapatías monoclonales, el anticuerpo producido está incompleto, que consiste en solamente cadenas ligeras o cadenas pesadas. Estos plasmocitos anómalos y los anticuerpos que producen habitualmente están limitados a un tipo.

Preferiblemente, el trastorno de plasmocitos se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmocitoma, leucemia de plasmocitos, macroglobulinemia, amiloidosis, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extramedular, mieloma osteoesclerótico, enfermedades de la cadena pesada, gammapatía monoclonal de alcance indeterminado y mieloma múltiple asintomático. Los trastornos de linfocitos B también pueden seleccionarse del grupo que consiste en linfoma no hodgkiniano de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica y linfoma de Hodgkin.

La enfermedad autoinmunitaria es, por ejemplo, lupus eritematoso diseminado (SLE) o artritis reumatoide (RA). Las expresiones "sujeto que lo necesita" o aquellos "que necesitan tratamiento" incluyen los que ya tienen un trastorno, así como aquellos en que tiene que prevenirse el trastorno. El sujeto que lo necesita o "paciente" incluye sujetos humanos y otros sujetos mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

La construcción de anticuerpo de la invención en general se diseñará para vías y métodos específicos de administración, para dosificaciones y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con intervalos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Los materiales de la composición se formulan preferiblemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Las formulaciones y composiciones, por tanto, pueden diseñarse de acuerdo con la invención para administración por cualquier vía adecuada de administración. En el contexto de la presente invención, las vías de administración incluyen, aunque sin limitación

• vías tópicas (tales como epicutánea, por inhalación, nasal, oftálmica, auricular/ótica, vaginal, a la mucosa); • vías enterales (tales como oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); y

• vías parenterales (tales como intravenosa, intraarterial, intraósea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular, epidural, intratecal, subcutánea, intraperitoneal, extraamniótica, intraarticular, intracardiaca, intradérmica, intralesional, intrauterina, intravesical, intravítrea, transdérmica, intranasal, transmucosa, intrasinovial, intraluminal).

Las composiciones farmacéuticas y la construcción de anticuerpo de esta invención son particularmente útiles para administración parenteral, por ejemplo, administración subcutánea o intravenosa, por ejemplo, por inyección tal como inyección en embolada, o por infusión tal como infusión continua. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse usando un dispositivo médico. Ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163. En particular, la presente invención proporciona una administración ininterrumpida de la composición adecuada. Como ejemplo no limitante, la administración ininterrumpida o sustancialmente ininterrumpida, es decir, continua puede lograrse mediante un pequeño sistema de bomba que porta el paciente para medir el flujo entrante de agente terapéutico en el organismo del paciente. La composición farmacéutica que comprende la construcción de anticuerpo de la invención puede administrarse usando dichos sistemas de bomba. Dichos sistemas de bomba en general son conocidos en la técnica, y dependen habitualmente del intercambio periódico de cartuchos que contienen el agente terapéutico a infundir. Cuando se intercambia el cartucho en dicho sistema de bomba, puede generarse una interrupción temporal del flujo por lo demás ininterrumpido de agente terapéutico en el organismo del paciente. En dicho caso, la fase de administración antes del remplazo del cartucho y la fase de administración después del remplazo del cartucho aún se considerará dentro del significado del medio farmacéutico y métodos de la invención conjuntamente que componente una "administración ininterrumpida" de dicho agente terapéutico.

La administración continua o ininterrumpida de las construcciones de anticuerpo de la invención puede ser intravenosa o subcutánea mediante un dispositivo de administración de fluidos o pequeño sistema de bomba que incluye un mecanismo impulsor de fluidos para dirigir el fluido fuera del depósito y un mecanismo accionador para accionar el mecanismo impulsor. Los sistemas de bomba para administración subcutánea pueden incluir una aguja o una cánula para penetrar la piel de un paciente y administrar la composición adecuada al organismo del paciente.

Dichos sistemas de bomba pueden fijarse o adherirse directamente a la piel del paciente independientemente de una vena, arteria o vaso sanguíneo, permitiendo de ese modo un contacto directo entre el sistema de bomba y la piel del paciente. El sistema de bomba puede fijarse a la piel del paciente durante 24 horas hasta varios días. El sistema de bomba puede ser de pequeño tamaño con un depósito para pequeños volúmenes. Como ejemplo no limitante, el volumen del depósito para la composición farmacéutica adecuada a administrar puede ser entre 0,1 y 50 ml.

La administración continua también puede ser transdérmica mediante un parche portado sobre la piel y remplazado a intervalos. Un experto en la materia es consciente de los sistemas de parche para administración de fármacos adecuados para este propósito. Cabe destacar que la administración transdérmica es especialmente susceptible a administración ininterrumpida, ya que el intercambio de un primer parche agotado puede conseguirse ventajosamente simultáneamente con la colocación de un segundo parche nuevo, por ejemplo, sobre la superficie de la piel inmediatamente adyacente al primer parche agotado e inmediatamente antes de retirar el primer parche agotado. No surgen problemas de interrupción del flujo o fallo de la pila.

Si la composición farmacéutica se ha liofilizado, el material liofilizado en primer lugar se reconstituye en un líquido apropiado antes de la administración. El material liofilizado puede reconstituirse en, por ejemplo, agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la misma formulación en la que estaba la proteína antes de la liofilización.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada que puede determinarse, por ejemplo, por estudios de cambio de escala de la dosis por administración de dosis crecientes de la construcción de anticuerpo de la invención que muestran especificidad de especie cruzada descrita en la presente memoria a primates que no son chimpancés, por ejemplo, macacos. Como se expone anteriormente, la construcción de anticuerpo de la invención que muestra especificidad de especie cruzada descrita en la presente memoria puede usarse ventajosamente de forma idéntica en ensayo preclínico en primates que no son chimpancés y como fármaco en seres humanos. La pauta posológica estará determinada por el médico a cargo y los factores clínicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se estén administrando simultáneamente.

La expresión "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para conseguir o al menos conseguir parcialmente el efecto deseado. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades o dosis eficaces para este uso dependerán de la afección a tratar (la indicación), la construcción de anticuerpo administrada, el contexto terapéutico y los objetivos, la gravedad de la enfermedad, el tratamiento previo, los antecedentes clínicos del paciente y la respuesta al agente terapéutico, la vía de administración, el tamaño (pero corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o el estado (la edad y salud general) del paciente, y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente. La dosis apropiada puede ajustarse de acuerdo con el criterio del médico a cargo de modo que pueda administrarse al paciente una vez o durante una serie de administraciones, y para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones específicas, la dosificación puede variar de 1,0 pg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, opcionalmente de 10 pg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg o de 100 pg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg.

Una cantidad eficaz terapéutica de una construcción de anticuerpo de la invención preferiblemente provoca una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia o duración de los periodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o discapacidad debida al padecimiento de la enfermedad. Para tratar enfermedades que se correlacionan con la expresión de BCMA como se describe en la presente memoria anteriormente, una cantidad terapéuticamente eficaz de la construcción de anticuerpo de la invención, aquí: una construcción de anticuerpo anti-BCMA/anti-CD3, preferiblemente inhibe el crecimiento celular o crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 % o al menos aproximadamente un 90 % con respecto a pacientes no tratados. La capacidad de un compuesto de inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un modelo animal predictivo de eficacia.

La composición farmacéutica puede administrarse como un solo agente terapéutico o en combinación con tratamientos adicionales tales como tratamientos antineoplásicos según lo necesario, por ejemplo, otros fármacos proteínicos y no proteínicos. Estos fármacos pueden administrarse simultáneamente con la composición que comprende la construcción de anticuerpo de la invención como se define en la presente memoria o por separado antes o después de la administración de dicha construcción de anticuerpo en intervalos y dosis definidas temporalmente.

La expresión "dosis eficaz y atóxica" como se usa en la presente memoria se refiere a una dosis tolerable de una construcción de anticuerpo de la invención que es suficientemente alta para provocar la reducción de células patológicas, la eliminación del tumor, la contracción del tumor o la estabilización de la enfermedad sin o esencialmente sin efectos tóxicos principales. Dichas dosis eficaces y atóxicas pueden determinarse, por ejemplo, por estudios de cambio de escala de dosis descritos en la técnica y deben estar por debajo de la dosis que induce acontecimientos secundarios adversos graves (toxicidad limitante de la dosis, DLT).

El término "toxicidad" como se usa en la presente memoria se refiere a los efectos tóxicos de un fármaco manifestados en acontecimientos adversos o acontecimientos adversos graves. Estos acontecimientos secundarios podrían referirse a la ausencia de tolerabilidad del fármaco en general y/o una ausencia de tolerancia local después de administración. La toxicidad también podría incluir efectos teratógenos o carcinógenos provocados por el fármaco.

La expresión "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" como se usa en la presente memoria define la administración de un fármaco sin inducir acontecimientos adversos graves directamente después de la administración (tolerancia local) y durante un periodo más largo de aplicación del fármaco. La "seguridad", "seguridad in vivo" o "tolerabilidad" puede evaluarse, por ejemplo, a intervalos regulares durante el tratamiento y periodo de seguimiento. Las mediciones incluyen evaluación clínica, por ejemplo, manifestaciones orgánicas y cribado de anomalías analíticas. Puede realizarse evaluación clínica y registrarse/codificarse las desviaciones de los hallazgos normales de acuerdo con las normas NCI-CTC y/o MedDRA. Las manifestaciones orgánicas pueden incluir criterios tales como alergia/inmunología, sangre/médula ósea, arritmia cardiaca, coagulación y similares, como se expone, por ejemplo, en los Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE). Los parámetros analíticos que pueden ensayarse incluyen, por ejemplo, hematología, química clínica, perfil de coagulación y análisis de orina y examen de otros líquidos corporales tales como suero, plasma, líquido linfoide o cefalorraquídeo, líquido amniótico y similares. Por tanto, la seguridad puede evaluarse, por ejemplo, por examen físico, técnicas de imágenes (es decir, ultrasonidos, rayos X, exploraciones CT, imágenes de resonancia magnética (MRI), otras medidas con dispositivos técnicos (es decir, electrocardiograma), signos vitales, midiendo parámetros analíticos y registrando acontecimientos adversos. Por ejemplo, pueden examinarse los acontecimientos adversos en primates que no son chimpancés en los usos y métodos de acuerdo con la invención por métodos histopatológicos y/o histoquímicos.

Los términos anteriores también se mencionan, por ejemplo, en la Preclinical safety evaluation of biotechnologyderived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee congreso de 16 de julio, 1997.

Finalmente, la invención proporciona un kit que comprende una construcción de anticuerpo de la invención o producida de acuerdo con el proceso de la invención, una composición farmacéutica de la invención, un polinucleótido de la invención, un vector de la invención y/o una célula hospedadora de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término "kit" significa dos o más componentes, correspondiendo uno de ellos a la construcción de anticuerpo, la composición farmacéutica, el vector o la célula hospedadora de la invención, envasados conjuntamente en un envase, recipiente o de otro modo. Por tanto, un kit puede describirse como un conjunto de productos y/o utensilios que son suficientes para conseguir un determinado objetivo, que puede comercializarse como una sola unidad.

El kit puede comprender uno o más recipientes (tales como viales, ampollas, envases, jeringas, frascos, bolsas) de cualquier forma, tamaño y material apropiados (preferiblemente resistente al agua, por ejemplo, plástico o vidrio) que contienen la construcción de anticuerpo o la composición farmacéutica de la presente invención en una dosificación apropiada para administración (véase anteriormente). El kit puede contener adicionalmente instrucciones de uso (por ejemplo, en forma de un prospecto o manual de instrucciones), un medio para administrar la construcción de anticuerpo de la presente invención tal como una jeringa, bomba, infusor o similar, un medio para reconstituir la construcción de anticuerpo de la invención y/o un medio para diluir la construcción de anticuerpo de la invención. La invención también proporciona kits para una unidad de administración de una sola dosis. El kit de la invención también puede contener un primer recipiente que comprende una construcción de anticuerpo secada/liofilizada y un segundo recipiente que comprende una formulación acuosa. En determinadas realizaciones de esta invención, se proporcionan kits que contienen jeringas prellenadas de una sola cámara y de múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos y liojeringas).

Debe apreciarse que, como se usa en la presente memoria, las formas singulares "un/o", "una" y "el/la", incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un reactivo" incluye uno o más de dichos diferentes reactivos y una referencia "al método" incluye referencia a etapas y métodos equivalentes conocidos por los expertos en la materia, que podrían modificarse o sustituirse en el lugar de los métodos descritos en la presente memoria.

Salvo que se indique de otro modo, debe entenderse que la expresión "al menos" que precede una serie de elementos, se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de averiguar, usando poco más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria.

El término "y/o" dondequiera que se une en la presente memoria incluye el significado de "y", "o" y "todas y cada una de las otras combinaciones de los elementos conectados por dicho térmico".

El término "aproximadamente" como se usa en la presente memoria significa dentro de un 20 %, preferiblemente dentro de un 10 % y más preferiblemente dentro de un 5 % de un valor o intervalo dado. Incluye, sin embargo, también el número concreto, por ejemplo, aproximadamente 20 incluye 20.

La expresión "menor de" o "mayor de" incluye el número concreto. Por ejemplo, menor de 20 significa menor de o igual a. Así mismo, más de o mayor de significa más de o igual a, o mayor de o igual a, respectivamente.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, salvo que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero o etapa indicada o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Cuando se usa en la presente memoria, la expresión "que comprende" puede sustituirse con la expresión "que contiene" o "que incluye" o a veces cuando se usa en la presente memoria, con la expresión "que tiene".

Cuando se usa en la presente memoria, "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en la presente memoria, "que consiste esencialmente en" no excluye materiales o etapas que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la reivindicación.

En cada caso en la presente memoria, cualquiera de las expresiones "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede remplazarse con cualquiera de las otras dos expresiones.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, material, reactivos y sustancias, etc., particulares descritos en la presente memoria y, por tanto, pueden variar. La terminología usada en la presente memoria es con el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Se obtendrá una mejor comprensión de la presente invención y de sus ventajas a partir de los siguientes ejemplos, ofrecidos con propósitos ilustrativos únicamente. Los ejemplos no están destinados a limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera. Los ejemplos como se describen a continuación pueden realizarse de forma similar, es decir, siguiendo los mismos protocolos, con otras construcciones de anticuerpo biespecíficas de acuerdo con la invención.

Ejemplo 1: Expresión de CD69 inducida por BiTE® sobre linfocitos T en ausencia de células diana

Se cultivaron PBMC aislados de donadores humanos sanos con cada vez más construcciones de anticuerpo biespecíficas de diana B/CD3 o diana A/CD3 HLE durante 48 h. Se determinó la expresión del marcador de activación CD69 en linfocitos T por inmunotinción y citometría de flujo y conjugados específicos de antígeno de mAb. Se observó activación de linfocitos T independiente de diana en términos de regulación por aumento de CD69 para todas las construcciones anti-CDH 19, pero fue más pronunciada para moléculas heteroFc y crossbody. La regulación por aumento de CD69 por antidiana B-scFc se produjo a mayores concentraciones y la amplitud fue en parte inferior en comparación con las otras dos construcciones basadas en Fc.

Para la antidiana A casi no se observó activación de linfocitos T independiente de diana para la molécula que contenía scFc, mientras que la construcción heteroFc indujo una fuerte regulación por aumento de CD69 en la superficie celular de linfocitos T en ausencia de células diana.

Se evaluó la activación de linfocitos T independiente de diana inducida por construcciones BiTE® que contenían una fusión de Fc monocatenario o hetero-Fc en el extremo C para las siguientes construcciones:

Construcciones BiTE® (diluciones en serie: 0,1 pM - 2 pM)

a. Diana A-I2C scFc; 1,14 mg/ml;

b. Diana A Hetero Fc; 1,02 mg/

Células efectoras PBMC humanas (3 donadores; n.° 065, n.° 823, n.° 836 (scFc), n.° 401, n.° 415, n.° 433 (heteroFc); n.2590, n.2595, 598, n.2605 (X-body)).

48 h de tiempo de incubación.

Determinación de la expresión de CD69 en linfocitos T CD4+ y CD8+ con citometría de flujo y conjugados específicos de antígeno de mAb. Véanse los resultados en la figura 2.

Se evaluó la activación de linfocitos T independiente de diana inducida por construcciones de anticuerpo BiTE® que contenían una fusión de Fc monocatenario, hetero-Fc o crossbody en el extremo C para las siguientes construcciones:

Construcciones BiTE® (diluciones en serie: 0,1 pM - 2 pM)

c. Diana B x I2C-scFc; 245,3 pg/ml (

d. Diana B Hetero FC; 1 mg/ml

e. Diana B crossbody; 6,3 mg/ml

Células efectoras PBMC humanas (de 3 a 4 donadores; n.° 386, n.° 392, n.° 401 (scFc) n.° 282, n.° 284, n.° 287 (heteroFc)).

48 h de tiempo de incubación.

Determinación de la expresión de CD69 en linfocitos T CD4+ y CD8+ con citometría de flujo y conjugados específicos de antígeno de mAb. Véanse los resultados en la figura 3.

Se observó activación de linfocitos T independiente de diana en términos de regulación por aumento de CD69 para varias construcciones biespecíficas ensayadas en estos ensayos. La regulación por aumento de CD69 en general fue más pronunciada para las construcciones de anticuerpo BiTE® canónicas, moléculas heteroFc y crossbody en comparación con las construcciones scFc respectivas. La regulación por aumento de CD69 por las construcciones scFc se produjo en general a concentraciones ligeramente mayores, y la amplitud fue en parte inferior en comparación con las otras dos construcciones basadas en Fc.

Para la construcción scFc antidiana B, no se observó activación de linfocitos T independiente de diana, mientras que las construcciones heteroFc y X-Body indujeron una fuerte regulación por aumento de CD69 en la superficie celular de linfocitos T en ausencia de células diana.

Además, no se observó regulación por aumento independiente de diana de CD69 en ensayos usando construcciones antidiana C y antidiana G. Debido a la expresión de la diana en células del linaje mieloide, estas células se habían eliminado antes de la configuración del ensayo. Estos datos indican que una interacción de las regiones Fc de las construcciones biespecíficas con células que expresan F^cyR podría ser responsable de la inducción independiente de diana de CD69 en linfocitos T.

La fuerte regulación por aumento de CD69 en linfocitos T por la construcción antidiana H-scFc en ausencia de células tumorales se debe a la expresión de diana H en linfocitos T.

Materiales y métodos

1. Diana I

Activación de linfocitos T independiente de diana inducida por una molécula BiTE® que contiene un Fc monocatenario para la siguiente construcción:

1. Construcción de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana I-scFc

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

4. Análisis citométrico de flujo de la expresión de CD69 en linfocitos T CD4+ y CD8+ usando un mAb conjugado a PE-Cy7 específico para CD69.

2. Diana D

Se evaluó la activación de linfocitos T independiente de diana inducida por moléculas BiTE® que contenían una fusión de un Fc monocatenario, hetero-Fc o crossbody en el extremo C para las siguientes construcciones:

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana D-hetFc (hetero-Fc)

2. Diana D-scFc

3. Diana D-X-Body (Diana D Crossbody)

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

3. Diana C

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana C-canónico

2. Diana C-scFc

3. Diana C-hetFc

4. Diana C-X-Body

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

4. Diana B

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana B-scFc

2. Diana B-hetFc

3. Diana B-X-Body

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

5. Diana A

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana A-scFc

2. Diana A-hetFc

3. Diana A-X-Body

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

6. Diana F

Se evaluó la activación de linfocitos T independiente de diana inducida por moléculas BiTE® que contenían un Fc monocatenario o un hetero-Fc para las siguientes construcciones:

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana F-canónico

2. Diana F-scFc

3. Diana F-hetFc

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

7. Diana E

1. Construcciones de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana E-canónico

2. Diana E-scFc

3. Diana E-hetFc

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

8. Diana H

Se evaluó la activación de linfocitos T independiente de diana inducida por una molécula BiTE® que contenía un Fc monocatenario para la siguiente construcción:

1. Construcción de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana H-scFc

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores)

3. 48 h de tiempo de incubación

9. Diana G

1. Construcción de anticuerpo BiTE® (diluciones en serie: 1,3 pM - 20 nM)

1. Diana G-scFc

2. Células efectoras PBMC humanas (3 donadores; reducidas de células CD14+/CD33+)

3. 48 h de tiempo de incubación

Ejemplo 2:

Se recubrieron construcciones de anticuerpo BiTE® sobre una placa Maxisorb en concentración decreciente (100 nM, diluciones 1:4). Después de lavado 3x con PBS-T y bloqueo con PBS/BSA al 3 % (p/v) (60 min, 37 °C), se incubó plasma humano combinado durante 60 min, 80 rpm a temperatura ambiente. Después de lavado 3x, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón específico para la subunidad A de C1q humano (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) durante 60 min, 80 rpm, temperatura ambiente, después de las etapas de lavado descritas se incubó un mAb de cabra anti-Fc de ratón-POX (1:5,000) durante 60 min, 80 rpm, temperatura ambiente. Después de lavado adicional, se incubó sustrato TMB y se detuvo después de reacción colorimétrica mediante la adición de H2SO4. La absorción se determinó a 450 nm.

Resultado: Como se muestra en la figura 4, a altas concentraciones, la construcción hetero Fc BiTE® (cuadrados) mostraba mayores señales de unión para CC1q humano en comparación con una construcción de Fc monocatenario BiTE® (triángulo). Como control negativo se usó un BiTE® canónico (círculos), que no mostró unión significativa a CC1q.

Ejemplo 3: Farmacocinética de construcciones de anticuerpo BiTE® fusionadas a modalidades de prolongación de la semivida

Se fusionaron diversas construcciones de anticuerpo BiTE® de unión a diana a cuatro restos diferentes de prolongación de la semivida. Todas las diferentes variantes HLE disponibles para anticuerpo BiTE® se ensayaron en macaco cangrejero en el contexto de estudios farmacocinéticos (PK). Posteriormente se denominaron BiTE®-scFc, BiTE®-hetFc, BiTE®-HALB, BiTE®-Xbody, de acuerdo con la modalidad de prolongación de la semivida fijada a la proteína de unión a diana. La molécula BiTE® no HLE se denomina BiTE® "canónico". La nomenclatura correspondiente de estas moléculas se resume brevemente en la tabla 4 a continuación.

Tabla 4 Nomenclatura de compuestos de moléculas BiTE® de una sola dosis

Las moléculas BiTE® se administraron como un bolo intravenoso (compuestos 1b, 2a-d, 3a/b, 4a/b, 5a-5c, 7-9) e infusión intravenosa (compuestos 1a, 1c, 3c/d, 6a/b, cada uno como una infusión de 30 min). Las moléculas BiTE® se administraron en un intervalo farmacocinéticamente pertinente de dosis lineal de 3 pg/kg a 6 pg/kg, 12 pg/kg y 15 pg/kg, respectivamente. El compuesto 10a se administró como inyección en embolada intravenosa corta, la construcción canónica (compuesto 10b) como una infusión intravenosa continua. Para comparar parámetros farmacocinéticos para ambos compuestos 10a y 10b, se muestra solamente la fase terminal que empieza directamente después del final de la infusión en la figura 5 para el BCMA-BiTE® canónico. Las moléculas BCMA BiTE® se administraron en un intervalo farmacocinético pertinente de dosis lineal de 15 pg/kg. Por razones de comparabilidad, las concentraciones séricas mostradas en la figura 5 están normalizadas a la dosis y normalizadas al peso molecular (descrito en nmol). Para cada uno de los compuestos nombrados anteriormente, se usó un grupo de al menos dos a tres animales. Se recogieron muestras de sangre y se preparó suero para la determinación de las concentraciones séricas. Se midieron los niveles de anticuerpo BiTE® en suero usando un inmunoensayo. Se midieron los niveles de BCMA BiTE® en suero usando un inmunoensayo que usa un par de anticuerpos de idiotipo anti-CD3 para el recubrimiento y la detección de las moléculas BiTE®. Se usaron los perfiles de concentración sérica-tiempo para determinar los parámetros PK. La configuración apropiada del estudio se ajustó a las características de las moléculas BiTE®: una duración de 1 semana o una de 2 semanas. Los puntos temporales de muestreo de sangre podrían variar ligeramente y se enumeran para ambas configuraciones en la tabla 5 a continuación.

Tabla 5 Puntos temporales de muestreo de sangre durante el estudio PK. Los puntos temporales podrían variar entre estudios individuales. Los puntos temporales marcados con un asterisco eran obligatorios y comunes para todos los estudios

La farmacocinética de moléculas BiTE®-HLE se muestra de forma ejemplar en la tabla 6. Cada grupo de compuestos representa la misma proteína BiTE® fusionada a un formato scFc-, hetFc-, HSA- (seroalbúmina humana, HALB) o Crossbody-Fc, o se deja como molécula BiTE® canónica. Para todas las proteínas, los niveles séricos eran cuantificables para todos los puntos temporales en todos los animales después de administración de la molécula BiTE®. Los perfiles PK describen una disminución exponencial bifásica después de cada una de las administraciones de un solo artículo de ensayo.

Los parámetros farmacocinéticos se determinaron usando métodos convencionales de análisis no compartimentado (NCA). Usando análisis no compartimentado, se estimaron los siguientes parámetros PK: ABCinf (área bajo la curva de concentración sérica-tiempo), Vss (volumen de distribución en estado estable), CL (eliminación sistémica) and t1/2 terminal (semivida terminal). Los parámetros PK para cada compuesto ensayado se resumen como la media de n=2 y n=3, respectivamente en la tabla 6 a continuación.

Tabla 6 Parámetros farmacocinéticos de diversas variantes HLE de diferentes proteínas de unión a diana BiTE® en macacos cangrejeros.

Típicamente el perfil PK para las moléculas BCMA-BiTE® canónicas describe un perfil de concentración sérica que disminuye muy rápidamente relacionado con el mecanismo de eliminación de estas proteínas canónicas. El BiTE®-scFc dirigido a BCMA de semivida prolongada muestra una disminución exponencial bifásica después de administraciones de un solo artículo de ensayo en macacos cangrejeros.

globalmente, la molécula BCMA-BiTE® fusionada a una modalidad HLE scFc (compuesto 10a) muestra una ABCinf media de 18772 h*ng/ml, un valor de eliminación sistémica de 0,8 ml/h/kg, así como un volumen correspondiente de distribución de 110 ml/kg. El compuesto 10b, el BiTE® dirigido a BCMA sin prolongación de la semivida canónico muestra una alta eliminación de 62,6 ml/h/kg que da lugar a una baja exposición en suero de 1677 h*ng/ml.

Las diferencias en el comportamiento farmacocinético de las dos diferentes modalidades BCMA BiTE® ensayadas describen completamente la ventaja del BiTE®-scFc dirigido a BCMA de semivida prolongada por encima de la correspondiente versión canónica, especialmente en términos de tiempo de residencia de la sustancia en el organismo.

Globalmente, la ABCinf para las diferentes proteínas de unión a diana BiTE® fusionadas a una modalidad HLE scFc, hetFc, HAS o Crossbody, respectivamente, varió entre 1971 h*ng/ml y 77271 h*ng/ml, dependiendo del contexto de diana de BiTE®. Todas las fusiones HLE analizadas consiguieron valores de eliminación sistemática de 0,4 a 7,6 ml/h/kg. Los volúmenes correspondientes de distribución variaron entre 68 y 540 ml/kg. El compuesto 3d, el compuesto 3 de proteína de unión a diana BiTE® sin prolongación de la semivida canónico se incluye como referencia. Las moléculas BiTE® sin prolongación de la semivida muestras altas eliminaciones, bajas exposiciones a suero y como consecuencia una corta semivida terminal. Se resume una comparación de las semividas terminales por la modalidad en la tabla 7.

Tabla 7 Comparación de semividas terminales por la modalidad investigada en macacos cangrejeros.

Investigando hasta cuatro diferentes modalidades de prolongación de la semivida (HLE) por BiTE® dirigido, queda claro que el resto -scFc muestra un aumento de t1/2 en comparación con otros restos de prolongación de la semivida correspondientes después de administración de una sola dosis baja a 6, 10, 12 y 15 pg/kg (véase la figura 6).

Ejemplo 4:

Se intercambió el tampón de sustancias farmacéuticas preformuladas que contenían diana A-hALB, diana A-hFc y diana A-scFc purificadas respectivamente, mediante ultrafiltración/diafiltración usando membranas con un corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. La formulación final se consiguió añadiendo soluciones madre concentradas. Las formulaciones resultantes para cada construcción se enumeran en la tabla 8. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml. Las construcciones de diana A formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio de tipo I que se taparon con tapones de caucho butílico y se plegaron con precintos de aluminio. Los viales llenados se incubaron a -20, 5, 25 y 37 °C. Un vial de cada versión se sometió a cinco ciclos de congelación y descongelación (F/T). La temperatura de congelación diana fue -29 °C. La temperatura de descongelación diana fue 2 °C. La tasa de rampa fue aproximadamente 0,3 K/min.

Las partículas visuales se evaluaron de acuerdo con el método descrito por Ph Eur 2.9.20 por operarios capacitados. Los recuentos de partículas visuales por vial se representan en la tabla 8. El número de partículas proteínicas visuales (más grandes de 125 pm) fue mayor para diana A-hFc si se compara tanto con diana A-hALB como con diana A-scFc.

Tabla 8: Número de partículas proteínicas visuales por vial para muestras sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) que contienen diferentes construcciones BiTE® antidiana A con semivida prolongada.

Las muestras descritas anteriormente también se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño de rendimiento ultraelevado (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se realizó SE-UPLC en un sistema de UPLC AcquityH-Class (Waters) usando una columna Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm (Waters). La temperatura de la columna se estableció a 25 °C. La separación de las variantes de tamaño se consiguió aplicando un método isocrático con un caudal de 0,4 ml/min. La fase móvil estaba compuesta de fosfato de sodio 100 mM, NaCl 250 mM a pH 6,8. El tiempo de migración suma un total de 6,0 minutos. Las muestras se mantuvieron a 8 °C dentro del tomamuestras automático hasta el análisis. Se inyectó una cantidad total de 3 gg de proteína. Para evitar el arrastre se realizó una inyección intermedia con acetonitrilo al 40 % después de cada muestra. La detección se basó en la emisión de fluorescencia (excitación a 280 nm, emisión a 325 nm). La integración del pico se realizó usando el programa informático Empower®. Se presentó al área relativa bajo la curva de HMWS (tabla 9).

Las construcciones basadas en Fc mostraron menores contenidos de HMWS en la variante de formulación G40MSuT que en K60RTrT independientemente de la condición de agresión. Quedó evidente que diana A-scFc contenía menos HMWS que diana A-hFc en ambas preparaciones G40MSuT y también K60RTrT. Diana A-scFc en su formulación preferida (G40MSuT) era menos propensa a formación de HMWS que diana A-hALB formulada en K60RTrT. En experimentos previos, este tampón mostró potencial estabilizante mejorado para construcciones basadas en hALB.

Tabla 9: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-UPL^c

n.e. = no ensayado

La abundancia de modificaciones químicas tras agresión térmica (incubación a 37 °C) se controló por cartografiado de péptidos. Las muestras de proteína se digirieron enzimáticamente y los péptidos resultantes se separaron usando cromatografía en fase inversa. El eluido de la columna se inyectó directamente en la fuente de ionización de un espectrómetro de masas para la identificación y cuantificación de los péptidos.

Para conseguir cobertura máxima, se realizaron dos digestiones enzimáticas separadas: una vez con tripsina y una vez con quimotripsina. En cada caso, las proteínas se desnaturalizaron con cloruro de guanidinio y después se redujeron con ditiotreitol (DTT). Después de incubación en DTT, se alquilaron los residuos de cisteína libres mediante la adición de ácido yodoacético. Entonces se intercambió el tampón de las muestras a Tris 50 mM pH 7,8 para la digestión. Se añadieron tripsina y quimotripsina para a tubos de reacción separados a una relación de 1:10 (muestra:enzima) cada una. Las muestras se digirieron durante 30 min a 37 °C y la reacción se interrumpió añadiendo ácido trifluoroacético.

Se inyectó por separado una carga de 5 gg de cada digestión en una columna de fase inversa Zorbax SB-C18 (Agilent n.° 859700-902) equilibrada en ácido fórmico (FA) al 0,1 % (V/V). Se usó un gradiente de 156 minutos de hasta un 90 % de acetonitrilo que contenía un 0,1 % de FA para eluir los péptidos directamente en la fuente de ionización por electronebulización de un espectrómetro de masas Q-Exactive Plus (Thermo Scientific). Se recogieron los datos en modo dependiente de datos usando un método de 12 mejores en que una exploración completa (resolución 70.000; intervalo de exploración 200-2000 m/z) estuvo seguida de disociación por colisión de alta energía (HCD) de los 12 iones más abundantes (resolución 17.500).

Los péptidos se identificaron basándose en la masa precisa y el espectro de masas en tándem usando un programa informático propio. Las identificaciones se verificaron manualmente. Las cantidades relativas de los péptidos modificados y no modificados se calcularon basándose en la abundancia de iones usando el programa informático Pinpoint (Thermo Scientific).

Los porcentajes de modificaciones químicas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y de la parte que prolonga la semivida (hALB o Fc) detectadas en preparaciones de diana A-hALB, -hFc y - scFc se dan en la tabla 10. Cuando se comparan condiciones de formulación similares, queda obvio que las modificaciones químicas globales eran menos abundantes en construcciones scFc.

Tabla 10: Visión global de modificaciones químicas en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinadas mediante cartografiado de péptidos

n.a. = no aplicable; n.e. = no ensayado

Ejemplo 5:

Diana A-hALB, -hFc, -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se sometieron a un experimento de salto de pH. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se llenó un volumen de 0,38 ml de cada material de partida en un vial de vidrio. Después de reacondicionar las soluciones a 37 °C, se les añadió solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x que estaba compuesto de fosfato de potasio 0,090 M, fosfato de sodio 0,480 M (ambos dibásicos), cloruro de potasio 0,052 M y NaCl 2,76 M. Las muestras con adicionales se incubaron a 37 °C durante dos semanas. Después de incubación, se analizaron por SE-UPLC usando el método descrito en el ejemplo 4 y se presentó el contenido porcentual de HMWS (tabla 11). Cuando se comparan todas las construcciones formuladas en K60RTrT el contenido de HMWS aumentaba en el siguiente orden: hALB < scFc < hFc. Diana A-scFc también mostró menor contenido de HMWS que diana A-hFc cuando se formulaban en G40MSuT.

Tabla 11: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión (salto de pH 2 sem.

37 °C) de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-UPLC

Ejemplo 6:

Diana A-hALB, -hFc y -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se sometieron a agresión por agitación. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se filtró un volumen de 0,5 ml de cada solución a través de un filtro de 0,22 pm apropiado y llenó en viales de vidrio de 3 cm3. Los viales se colocaron en una caja de plástico que garantiza que los viales no se desplazaran dentro de la caja durante la agitación. La caja se puso en otro agitador orbital. Las muestras se agitaron a 500 rpm durante 65 horas. Las partículas visuales se evaluaron de acuerdo con el método descrito por Ph Eur 2.9.20. El método se realizó por operarios capacitados. Los recuentos de partículas visuales por vial se representan en tabla 12. Solamente se observaron partículas proteínicas visibles en preparaciones de diana A-hFc.

Tabla 12: Número de partículas proteínicas visuales por vial en muestras agitadas

Las muestras anteriores también se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño de rendimiento ultraelevado (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se aplicó el mismo método que el descrito en el ejemplo 4. Los contenidos de HMWS de muestras agitadas se resumen por la tabla 13. La formación of HMWS fue mucho más pronunciada en diana A-hFc en comparación con preparaciones K60RTrT. Las HMWS fueron más abundantes en diana A-hFc que en diana A-scFc.

Tabla 13: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión (salto de pH 2 sem.

37 °C) de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-UPLC

Ejemplo 7:

Diana A-hALB, -hFc y -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se expusieron a luz visible y UVA (fotoagresión). La concentración de proteína sumó un total de 1 mg/ml en todas las preparaciones. Las soluciones de proteína se filtraron a través de un filtro con 0,22 pm de tamaño de poro y se llenaron hasta 0,5 ml en viales de vidrio de tipo I. Diana A-hALB y -scFc se sometieron a diferentes ensayos incluyendo 0,2 MLux de luz visible/25 W*h/m2 de luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/173 W*h/m2 respectivamente. Diana A-hFc se sometió a dos ensayos diferentes incluyendo 0,2 MLux de luz visible sin luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/30 W*h/m2 de luz UVA respectivamente. Las temperaturas de la cámara se ajustaron a 25 °C. Después de la exposición a la luz las muestras se analizaron por inspección visible (tabla 14), SE-UPLC (tabla 15) y mapa peptídico (tabla 16). Los métodos mencionados anteriormente se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el ejemplo 4. Aunque diana A-hALB y -scFc se expusieron a dosis mayores de luz UVA, no se observaron partículas proteínicas visibles mientras que las muestras de diana A-hFc mostraron una partícula proteínica visible por vial para estos dos ensayos independientemente de la formulación.

Tabla 14: Visión global del número de partículas proteínicas visibles per vial en preparaciones de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinados después de exposición a la luz

Las HMWS aumentaron en el siguiente orden diana A-hALB < -scFc < -hFc cuando la proteína se formulaba en K60RTrT. Las HMWS podían reducirse para construcciones basadas en Fc cuando se formulaban en G40MSuT. Sin embardo las HMWS de nuevo fueron menos pronunciadas para diana A-scFc. Diana A-hFc reveló ser especialmente sensible a exposición de luz UVA.

Tabla 15: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinados después de exposición a la luz mediante SE-UPLC.

Los porcentajes de modificaciones químicas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y de la parte que prolonga la semivida (hALB o Fc) detectadas en preparaciones de diana A-hALB, -hFc y - scFc se dan en la tabla 16. Cuando se comparan condiciones de formulación similares, queda obvio que las modificaciones químicas globales eran menos abundantes en construcciones scFc.

Tabla 16: Visión global de modificaciones químicas en preparaciones de diana A-hALB, -hFc y -scFc determinadas tras exposición a la luz mediante cartografiado de péptidos

Ejemplo 8:

Diana A-hALB se formuló en K60RTrT y diana A-scFc se formuló en G40MSuT de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Las concentraciones de proteína sumaron un total de 0,05 mg/ml. Recipientes de ensayo de vidrio (vial de borosilicato, tipo I, 13 mm 3 cm3 de West, Art. n.° 68000375) y polipropileno (2 ml con junta tórica, por ejemplo, de Sarstedt, Art n.° 72.694.005) se llenaron con 500 pl de la solución de ensayo. La solución de ensayo se dejó durante cinco minutos en el primer recipiente de ensayo. Después muestreó una alícuota de 150 pl para el análisis. La solución de ensayo restante (350 pl) se transfirió secuencialmente de un recipiente de ensayo al siguiente (cinco recipientes en total). En cada vial, la solución se dejó durante cinco minutos antes de la siguiente transferencia. Se usó la misma punta de pipeta cada etapa de transferencia. Se realizó el mismo ensayo usando 30 ml de frascos de policarbonato (Nalgene, PCS-000295 con cierre, documento PP/20-415/ZTPE). Para este tipo de recipiente, el primer recipiente se llenó con 5 ml. Después de muestrear una alícuota de 150 pl, el volumen residual se transfirió de un recipiente de ensayo al siguiente (de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente). Las muestras extraídas del recipiente n.° 1 y n.° 5 se analizaron por SE-UPLC (método como se describe en el ejemplo 4). Además, la detección de proteínas se realizó con un detector PDA (280 nm) para determinar las concentraciones de proteína. En la tabla 17 se da el porcentaje de recuperación de proteína de cada recipiente de ensayo. Se demostró que la recuperación de proteína era más pronunciada para diana A-scFc que para diana A-hALB independientemente del tipo de recipiente.

Tabla 17: Recuperación de proteína de diferentes tipos de recipiente para diana A-hALB y -scFc determinada por

SE-UPLC

Ejemplo 9:

Diana A-hALB se formuló en K60RTrT y diana A-scFc se formuló en K60RTrT y G40MSuT de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 4. La concentración de proteína sumó un total de 1,0 mg/ml. A 1950 pl de cada solución de ensayo se le añadió 50 pl de una solución de patrón de silicio de 1000 ppm (Specpure de AlfaAesar, Art. n.° 38717) produciendo una adición de 25 ppm. Una solución de ensayo sin adición sirvió como muestra de control. La solución de ensayo con adición, así como la muestra de control se llenaron en viales de vidrio de tipo I de 3 cm3 y se incubaron a 37 °C durante 24 horas. Todas las muestras se analizaron por SE-UPLC de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 4 para cuantificar la cantidad de HMWS (tabla 18). Cuando se formulaba en K60RTrT, diana A-hALB y -scFc mostraban aumentos similares en HMWS tras la adición de silicio.

Tabla 18: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones de diana A-hALB y -scFc determinados mediante SE-UPLC después de adición de 25 ppm de silicio

Ejemplo 10:

Se intercambió el tampón de sustancias farmacéuticas preformuladas que contenían diana C (cc)-hALB, diana C (cc)-hFc y diana C (cc)-scFc purificadas respectivamente, mediante ultrafiltración/diafiltración usando membranas con un corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa. La formulación final se consiguió añadiendo soluciones madre concentradas. Las formulaciones resultantes para cada construcción se enumeran en la tabla 19. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml. Las construcciones de diana C (cc) formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio de tipo I que se taparon con tapones de caucho butílico y se plegaron con precintos de aluminio. Los viales llenados se incubaron a -20, 5, 25 y 37 °C. Un vial de cada versión se sometió a cinco ciclos de congelación y descongelación (F/T). La temperatura de congelación diana fue -29 °C. La temperatura de descongelación diana fue 2 °C. La tasa de rampa fue aproximadamente 0,3 K/min. Las muestras descritas anteriormente también se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño de rendimiento ultraelevado (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se realizó SE-UPLC de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 4. Cuando se formulaban en K60RTrT, las HMWS aumentaba en el siguiente orden de muestras no sometidas a agresión: scFc < hALB < hFc. El aumento menos pronunciado en HMWS tras agresión con congelación y descongelación se observó para la construcción scFc. La construcción hFc reveló ser más propensa a la formación de HMWS a -20 °C. Los contenidos de HMWS aumentaron después de cuatro semanas de almacenamiento a 5 °C. La formación de HMWS en estas condiciones fue más pronunciada para construcciones basadas en Fc que para construcciones basadas en albúmina. En K60RTrT no se observaron aumentos significativos en HMWS a temperaturas de almacenamiento elevadas (25 y 37 °C). Cuando se formulaban en G40MSuT, todas las construcciones revelaban contenidos de HMWS similares en muestras no sometidas a agresión. el aumento durante la congelación y descongelación fue muy distinto para construcciones basadas en Fc en comparación con la construcción basada en albúmina. En G40MSuT, la construcción hFc fue menos estable durante almacenamiento a -20 °C. Solamente se observaron aumentos considerables en HMWS durante el almacenamiento en líquido para la construcción hALB.

Tabla 19: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana C (cc) hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-UPLC

La abundancia de modificaciones químicas tras agresión térmica (incubación a 37 °C) se controló por cartografiado de péptidos de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 4. Los porcentajes de modificaciones químicas de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) determinadas en preparaciones de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc se dan en la tabla 20. Globalmente, diana C (cc)-scFc mostró la cantidad más baja de modificaciones químicas en las CDR. Quedó evidente que especialmente las desamidaciones de las CDR eran menos pronunciadas para la construcción scFc.

Tabla 20: Visión global de modificaciones químicas en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc determinadas mediante cartografiado de péptidos

Ejemplo 11:

Diana C(cc)-hALB, -hFc y -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se sometieron a un experimento de salto de pH. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se llenó un volumen de 0,38 ml de cada material de partida en un vial de vidrio. Después de preacondicionar las soluciones a 37 °C, se les añadió solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20x que estaba compuesto de fosfato de potasio 0,090 M, fosfato de sodio 0,480 M (ambos dibásicos), cloruro de potasio 0,052 M y NaCl 2,76 M. Las muestras con adicionales se incubaron a 37 °C durante dos semanas. Después de incubación, se analizaron por SE-UPLC usando el método descrito en el ejemplo 4 y se presentó el contenido porcentual de HMWS (tabla 21). Las construcciones diana C (cc)-scFc mostraron el contenido de HMWS más bajo después de salto de pH en comparación con diana C (cc)-hALB y -hFc independientemente de la formulación.

Tabla 21: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión (salto de pH 2 sem.

37 °C) de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-U^pL^c

Ejemplo 12:

Diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se sometieron a agresión por agitación. La concentración de los materiales de partida fue 1,0 mg/ml. Se filtró un volumen de 0,5 ml de cada solución a través de un filtro de 0,22 pm apropiado y llenó en viales de vidrio de tipo I de 3 cm3. Los viales se colocaron en una caja de plástico que garantiza que los viales no se desplazaran dentro de la caja durante la agitación. La caja se puso en otro agitador orbital. Las muestras se agitaron a 500 rpm durante 65 horas. Las muestras se analizaron por SE-UPLC para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se aplicó el mismo método que el descrito en el ejemplo 4. Los contenidos de HMWS de muestras agitadas se resumen por la tabla 22. La formación de HMWS fue menos pronunciada para diana C (cc)-scFc en cualquier formulación.

Tabla 22: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión (salto de pH 2 sem.

37 °C) de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc determinados mediante SE-U^pL^c

Ejemplo 13:

Diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc formuladas como se describe en el ejemplo 4 se expusieron a luz visible y UVA (fotoagresión). La concentración de proteína sumó un total de 1 mg/ml en todas las preparaciones. Las soluciones de proteína se filtraron a través de un filtro con 0,22 pm de tamaño de poro y se llenaron hasta 0,5 ml en viales de vidrio de tipo I. Diana C(cc)-hALB y -scFc se sometieron a diferentes ensayos incluyendo 0,2 MLux de luz visible/25 W*h/m2 de luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/173 W*h/m2 respectivamente. Diana C (cc)-hFc se sometió a dos ensayos diferentes incluyendo 0,2 MLux de luz visible sin luz UVA y 1,2 MLux de luz visible/30 W*h/m2 de luz UVA respectivamente. Las temperaturas de la cámara se ajustaron a 25 °C. Después de la exposición a la luz las muestras se analizaron por SE-UPLC (tabla 23) y mapa peptídico (tabla 24). Los métodos mencionados anteriormente se realizaron de acuerdo con los procedimientos del ejemplo 4. A pesar de la mayor intensidad de luz UVA aplicada a diana C (cc)-scFc, esta construcción era estable contra la formación de HMWS. En contraste, diana C (cc)-hFc y diana C (cc)-hALB mostraron un aumento en HMWS tras ensayar 2 condiciones.

Tabla 23: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc determinados des ués de ex osición a la luz mediante SE-UPLC.

Las modificaciones químicas globales tras exposición a la luz eran menos pronunciadas para diana C (cc)-scFc. Se realizaron especialmente desamidaciones de las CDR a un grado mayor en diana C (cc)-hALB y diana C (cc)-hFc. Cuando se comparaban construcciones basadas en Fc, se reveló que diana C (cc)-scFc era menos propensa a modificaciones químicas de la parte Fc, aunque la construcción scFc se expuso a dosis de luz UVA mayores que la construcción hFc. La tabla 24 también enumera las modificaciones químicas más abundantes de la parte de albúmina en diana C (cc)-hALB, lo que demuestra que la parte de prolongación de la semivida de esta construcción se degradaba químicamente más que las partes Fc de diana C (cc)-hFc y -scFc.

Tabla 24: Visión global de modificaciones químicas en preparaciones de diana C (cc)-hALB, -hFc y -scFc determinadas tras exposición a la luz mediante cartografiado de péptidos

Ejemplo 14

Se examinaron diferentes construcciones de anticuerpo BiTE® diseñadas para abordar diana F incluyendo diana F sin prolongación de semivida (no HLE, canónica), diana F-hALB y diana F-scFc. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml para la versión hALB y scFc y 0,4 mg/ml para la no HLE. Las construcciones de anticuerpo BiTE® formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio de tipo I que se taparon con tapones de caucho butílico y se plegaron con precintos de aluminio. Los viales llenos se incubaron a -20 °C y 37 °C (sin y con 25 ppm de silicio que es conocido por su potencial de inducir agregación de proteínas) durante 4 semanas. Las construcciones anteriores también se expusieron a la luz (1,2 MLux de luz visible/173 W*h/m2 de luz UVA). Para agresión lumínica, la temperatura de la cámara se estableció a 25 °C. Las muestras almacenadas a -70 °C sirvieron como controles (T0).

Las muestras descritas anteriormente se analizaron por duplicado por cromatografía de exclusión por tamaño de rendimiento ultraelevado (SE-UPLC) para cuantificar el contenido porcentual de especies de alto peso molecular (HMWS). Se realizó SE-UPLC en un sistema de UPLC Aquity H-Class (Waters) usando una columna Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm (Waters). La temperatura de la columna se estableció a 25 °C. La separación de las variantes de tamaño se consiguió aplicando un método isocrático con un caudal de 0,4 ml/min. La fase móvil estaba compuesta de fosfato de sodio 100 mM, NaCl 250 mM pH 6,8. El tiempo de migración suma un total de 6,0 minutos. Las muestras se mantuvieron a 8 °C dentro del tomamuestras automático hasta el análisis. Se inyectó una cantidad total de 3 pg de proteína. Para evitar el arrastre se realizó una inyección intermedia con ACN al 40 % después de cada muestra. La detección se basó en la fluorescencia (excitación a 280 nm, emisión a 325 nm). La integración del pico se realizó usando el programa informático Empower®. Se presentó al área relativa bajo la curva de HMWS (tabla 25).

En muestras no sometidas a agresión, las HMWS fueron menos pronunciadas para la construcción scFc. Se observó formación de HMWS exclusivamente durante 4 semanas de almacenamiento a -20 °C. Los contenidos de HMWS en estas condiciones aumentan en el siguiente orden scFc < hALB < no HLE.

Tabla 25: Visión global de los contenidos de HMWS en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana F-no HLE, - hALB y -scFc determinados mediante SE-UpLC.

Además, se evaluaron muestras derivadas de termoagresión en ausencia y presencia de silicio para la abundancia de partículas subvisibles por imágenes de microfluidos (MFI) usando una Flowcam de Fluid Imaging Technologies, Inc. El instrumento estaba equipado con una cubeta de lectura FC80FV. Se aplicó un aumento óptico de diez veces. La idoneidad del sistema se verificó con agua sin partículas. Se aplicó una tasa de autoimagen de 20 fotogramas por segundo. Los umbrales de oscuridad y luz se establecieron a 25 y 20 píxeles respectivamente. el volumen de muestra para una sola medición suma un total de 0,25 ml. Las muestras se midieron por triplicado. Antes de cada triplicado el sistema se lavó abundantemente con 0,5 ml de las soluciones de muestra respectivas. Al inicio y entre cada triplicado se realizó un lavado con 1,0 ml de agua sin partículas. La evaluación de los datos se realizó con el programa informático Visual Spreadsheet. Las muestras se midieron por triplicado. Los resultados se resumen en la tabla 26.

La termoagresión provocó la formación de partículas subvisibles en preparaciones que contienen construcciones no HLE y hALB. En contraste, la construcción scFc permaneció estable. La formación de partículas subvisibles no se promovió mediante la adición de silicio independientemente de la naturaleza de la construcción de anticuerpo BÍTE®-Tabla 26: Evaluación de partículas subvisibles por MFI en preparaciones de diana F-no HLE (canónica), -hALB y -scFc después de termoagresión en ausencia y presencia de silicio.

También se analizaron muestras de termoagresión por cromatografía de intercambio catiónico débil (WCX) para cuantificar el contenido porcentual de variantes de carga usando un UPLC Aquity H class de Waters. Se aplicó una columna Protein-Pak Hi Res CM 7im 4,6 x 100 mm (Waters, cat n.° 186004929). La temperatura de la columna se ajustó a 30 °C. El caudal se estableció a 0,65 ml/min. El gradiente aplicado se diseñó como sigue (tabla 27). La temperatura del tomamuestras automático se mantuvo a 2-8 °C.

Tabla 27: Gradiente aplicado para cromatografía WCX

Se inyectó una cantidad total de 3 gg de proteína. La detección se basó en la fluorescencia (excitación a 280 nm, emisión a 325 nm). La integración del pico se realizó usando el programa informático Empower®. Se presentaron las áreas relativas bajo la curva del pico principal, así como de variantes de carga ácidas y básicas (tabla 28).

La termoagresión provocó un porcentaje de pico principal reducido que tuvo que atribuirse a una formación predominante de variantes de carga ácidas. La pérdida en el porcentaje de pico principal fue menos pronunciada para la construcción scFc (7,5 %). Se formaron variantes de carga básicas en ambas construcciones con semivida prolongada tras exposición a la luz. El aumento en las variantes de carga básicas varió entre un 5 y un 6 % en construcciones hALB y scFc.

Tabla 28: Evaluación de variantes de carga por cromatografía WCX en preparaciones de diana F-no HLE (canónica),

-hALB, y -scFc después de agresión inducida por calor y luz.

Además, se cuantificó la pureza de la muestra en muestras sometidas a agresión térmica y lumínica usando un ensayo de electroforesis capilar de microfluidos con dodecilsulfato de sodio (CE-SDS) basado en el sistema LabChip GXII (Perkin Elmer). La solución desnaturalizante de la muestra estaba compuesta del tampón de muestra de expresión de proteínas HT (proporcionado por Perkin Elmer) complementado con ditiotreitol 34 mM. Cada muestra se diluyó 1:8 con la solución desnaturalizante y se calentó hasta 70 °C durante 10 minutos junto con la escala de expresión de proteínas. Se añadieron 35 gl de agua para inyección (WFI) a 40 gl de la muestra desnaturalizada. Se añadieron 120 gl de WFI a 12 gl de la escala. Las muestras, la escala, el tampón de lavado de expresión de proteínas, el tinte de gel y la solución de destinción se transfieren a los depósitos respectivos. Las muestras se cargan electrocinéticamente desde una placa de microvaloración al chip que integra la separación, tinción, destinción y detección de la proteína y sus variantes de tamaño. Los electroferogramas resultantes se evaluaron y se presentaron los cambios en la pureza. Se da una visión global de la pureza porcentual detectada después de agresión en la tabla 29 y en comparación con muestras no sometidas a agresión (T0).

Se observaron mayores purezas para las construcciones hALB y scFc en comparación con la construcción no HLE en todas las condiciones. Se detectaron ligeras disminuciones en la pureza en comparación con T0 para las construcciones hALB y scFc tras agresión térmica y lumínica. La pérdida de pureza después de 4 semanas de almacenamiento a 37 °C suma un total de un 8,4 % para la construcción hALB y un 6,6 % para las construcciones scFc. Las pérdidas tras exposición a la luz fueron comparables entre hALB y scFc.

Tabla 29: Visión global de la pureza porcentual en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana F-no HLE, -hALB y -scFc determinada mediante LabChip GXII (Caliper)

Ejemplo 15

Se formularon diferentes construcciones de anticuerpo BiTE® diseñadas para abordar diana E, incluyendo diana E-hALB y diana E-scFc, respectivamente. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml para ambas construcciones. Las construcciones de anticuerpo BiTE® formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio de tipo I que se taparon con tapones de caucho butílico y se plegaron con precintos de aluminio. Los viales llenados se incubaron a 37 °C (diana E-hALB) y 40 °C (diana E-scFc) durante 4 semanas. Las muestras almacenadas a -70 °C sirvieron como controles (T0). Las muestras se analizaron por SE-UPLC de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 13. Los resultados se resumen en la tabla 30.

La construcción scFc mostró una pérdida de monómero reducida (2,3 %) tras termoagresión en comparación con la construcción hALB (4,0 %), aunque la temperatura de incubación fue ligeramente mayor.

Tabla 30: Visión global del porcentaje de pico de monómero en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana E-hALB y -scFc determinado mediante SE-UPLC.

Ejemplo 16

Se examinaron diferentes construcciones de anticuerpo BiTE® diseñadas para abordar diana I, incluyendo diana I-Xbody y diana I-scFc. La concentración de proteína diana fue 1,0 mg/ml. Las construcciones de anticuerpo BiTE® formuladas se llenaron hasta 1 ml en viales de vidrio de tipo I que se taparon con tapones de caucho butílico y se plegaron con precintos de aluminio. Los viales llenados se incubaron a -20 °C y 37 °C durante 4 semanas. Además, todas las muestras se expusieron a 1,2 MLux de luz visible y 173 W*h/m2 de luz UVA. La temperatura de la cámara se ajustó a 25 °C. Las muestras almacenadas a -70 °C sirvieron como controles (T0). Las muestras almacenadas a -20 y -37 °C se analizaron por SE-UPLC de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 13. Los resultados se resumen en la tabla 31.

La construcción scFc conservó un mayor contenido de monómero cuando se almacenaba durante cuatro semanas a -20 y 37 °C respectivamente, en comparación con la Xbody.

Tabla 31: Visión global de los contenidos de monómero en preparaciones sometidas a agresión y no sometidas a agresión (T0) de diana I-Xbody y -scFc determinados mediante SE-UPLC.

Además, se evaluaron muestras no sometidas a agresión para la abundancia de partículas subvisibles por imágenes de microfluidos (MFI) usando el método descrito en el ejemplo 13. Los resultados se resumen en la tabla 32. La preparación diana I-scFc mostró cantidades significativamente menores de partículas subvisibles en comparación con la preparación diana I-Xbody. Esto se aplica a todas las fracciones de tamaños incluidos.

Tabla 32: Evaluación de partículas subvisibles por MFI en diana I-Xbody y -scFc no sometidas a agresión

También se analizaron muestras de agresión lumínica por cromatografía de intercambio catiónico débil (WCX) para cuantificar el contenido porcentual de variantes de carga usando un UPLC Aquity H class de Waters de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 13. Se presentaron las áreas relativas bajo la curva del pico principal, así como de variantes de carga ácidas y básicas (tabla 33).

La construcción scFc mostró estabilidad potenciada contra la exposición a la luz en comparación con la Xbody indicada por una pérdida menos pronunciada en el pico principal que sumó un total de un 1,4 % en comparación con un 5,5 % para la construcción Xbody.

Tabla 33: Evaluación de variantes de carga por cromatografía WCX en preparaciones de diana I- Xbody y -scFc después de agresión inducida por calor y luz.

Ejemplo 17: Cromatografía de exclusión por tamaño de variantes scFc biespecíficas

Las construcciones D9F, T2G, D3L, T7I y K6C (véase la figura 7) se ensayaron cada una por su comportamiento de migración por cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con procedimientos convencionales. En detalle, se procesó una cantidad definida de 25 pg de cada construcción (a 750 pl/min) en tampón de citrato-lisina (10 mM y 75 mM, pH 7) en una columna Superdex 200 increase 10/300GL a temperatura ambiente y se registró la DO 280 nm. Posteriormente, las construcciones se han comparado por sus tiempos de retención. Como resultado, la construcción D9F muestra elución significativamente retardada (tabla 34) en comparación con T2G, D3L, T7I y K6C, lo que indica una diferencia en la estructura/disposición de los dominios Fc. Esta diferencia en el tiempo de retención fue más significativa con la construcción T7I que tiene cisteínas no emparejadas en la región de bisagra y la unión de CH2 y CH2CH3 a CH3 (18,98 min frente a 18,62 min, diferencia de 0,36 min). Sin embargo, también la diferencia en el tiempo de retención de 0,16 min entre D9F y T2G es significativa teniendo en consideración el tiempo de retención respectivo del control de BSA. El control de BSA mostró un tiempo de retención de 19,07 min para el monómero y 16,82 min para el dímero, presentando una diferencia de 2,25 min en el tiempo de retención para un peso molecular duplicado. Por tanto, como construcciones que tienen solamente diferencias estructurales en la parte Fc, una diferencia de 0,16 min en el tiempo de retención es significativa. En resumen, la construcción D9F mostró el tiempo de retención más largo, indicando unión más fuerte. Esta conclusión da lugar a la expectativa de que D9F también tenga la semivida más larga in vivo.

Tabla 34

Ejemplo 18: Determinación basada en resonancia de plasmones superficiales de la unión a FcRn humano (FCGRT/B2M).

Las construcciones D9F, T2G, D3L, T7I y K6C (figura 7) se ensayaron cada una por su capacidad de unirse a FcRn humano en experimentos de SPR (Biacore) de acuerdo con procedimientos convencionales. En detalle, se inmovilizador chips sensores CM5 (GE Healthcare) con 450-500 U^rde FCGRT/B2M (ACRO Biosystems) usando tampón de acetato de Na pH 4,5 y un tampón de migración que consiste en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM pH 6,0. Las construcciones entonces se inyectaron en migraciones posteriores en dos concentraciones de 250 nM y 125 nM diluidas en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, pH 6,0 y 36 °C. La asociación se hizo durante 90 segundos con un caudal de 30 pl/min seguido de la fase de disociación durante 90 segundos a un caudal de 30 pl/min en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, pH 6,0 a 36 °C. La regeneración posterior se hizo durante 10 s con 30 pl/min con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, E^dT^a3 mM pH 7,4.

La unión máxima durante la fase de inyección se midió para todas las construcciones como las unidades de respuesta respectivas (UR), equivalentes al aumento de masa molecular en el chip CM5 recubierto de FcRn debido a la construcción unida. Todas las construcciones se midieron por duplicado. Se representan los valores promedio de las determinaciones duplicadas en la figura 8A y 8B, respectivamente.

Como resultado, la construcción D9F muestra un aumento de masa significativamente mayor en el chip CM5 recubierto con FcRn, en comparación con T2G, D3L, T7I y K6C, lo que indica afinidad de unión más fuerte de D9F a FcRn humano. Esta observación se ve para ambas concentraciones de las construcciones respectivas.

La unión a FcRn se media a través de la parte Fc dentro de las construcciones. La unión más fuerte a FcRn humano como se describe en la bibliografía es un indicador de semivida más larga in vivo debido a un mayor rescate intracelular de la proteína respectiva y, por lo tanto, una tasa de degradación reducida. Por esta razón, la unión más fuerte de D9F a FcRn humano en comparación con las otras construcciones hace que esta molécula sea claramente superior como base para moléculas terapéuticas para permitir una exposición más larga del fármaco potencial en el paciente y una menor frecuencia de administración de fármaco.

Ejemplo 19: Determinación basada en resonancia de plasmones superficiales de la unión a FcRn humano (FCGRT/B2M).

Las construcciones D9F, T2G, D3L, T7I y K6C y un anticuerpo IgG1-kappa humano MT201 se ensayaron cada uno por su capacidad de unión contra FcRn humano en experimentos de SPR (Biacore) de acuerdo con procedimientos convencionales. En detalle, se inmovilizador chips sensores CM5 (GE Healthcare) con aproximadamente 350 UR de FCGRT/B2M (ACRO Biosystems) usando tampón de acetato de Na pH 4,5 y un tampón de migración que consiste en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM pH 6,0. Las construcciones y el control de IgG1-kappa humana (MT201) se inyectaron entonces a una concentración de 125 nM diluidas en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, pH 6,0 y 36 °C. La asociación se hizo durante 90 segundos con un caudal de 30 pl/min seguido de la fase de disociación durante 60 segundos a un caudal de 30 pl/min en HEPES 200 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, pH 6,0 a 36 °C. La regeneración posterior se hizo durante 10 s con 30 pl/min con HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, E^dT^a3 mM pH 7,4.

La unión máxima durante la fase de inyección se midió para todas las construcciones como las unidades de respuesta respectivas (UR), equivalentes al aumento de masa molecular en el chip CM5 recubierto de FcRn debido a la construcción unida. Todas las construcciones se midieron por duplicado. Se representan los valores promedio de las determinaciones duplicadas en la figura 9 incluyendo las barras de error la desviación típica.

Como resultado, la construcción D9F muestra un aumento de masa significativamente mayor en el chip CM5 recubierto con FcRn, en comparación con T2G, D3L, T7I y K6C, lo que indica afinidad de unión más fuerte de D9F a FcRn humano. El aumento de masa en el chip CM5 recubierto de FcRn para D9F es muy comparable al aumento de masa del anticuerpo de control de IgG1-kappa humana MT201, lo que indica una unión comparable de la construcción D9F a FcRn humano.

La unión a FcRn se media a través de la parte Fc de IgG1 humana dentro de las construcciones. La unión más fuerte a FcRn humano como se describe en el campo es un indicador de semivida más larga in vivo debido a un mayor rescate intracelular de la proteína respectiva y, por lo tanto, una tasa de degradación reducida. Por esta razón, la unión más fuerte de D9F a FcRn humano en el intervalo de un anticuerpo de IgG1-kappa humana (MT201), en comparación con las otras construcciones hace que esta molécula sea claramente superior como base para moléculas terapéuticas para permitir una exposición más larga del fármaco potencial en el paciente, presumiblemente en el intervalo de un anticuerpo de IgG1 humana completa, y una menor frecuencia de administración de fármaco.

La siguiente tabla describe los péptidos y proteínas que tienen SEQ ID NO: 1-109, así como los que tienen SEQ ID NO: 110-129, correspondientes a secuencias del documento WO 2008/119567.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de anticuerpo monocatenaria que comprende:

• un primer dominio que se une a BCMA,

• un segundo dominio que se une a un epítopo extracelular de la cadena CD3s humana y/o de Macaca; y

• un tercer dominio que comprende dos monómeros polipeptídicos, comprendiendo cada uno una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en la que dichos dos monómeros polipeptídicos se fusionan entre sí mediante un conector peptídico.

2. La construcción de anticuerpo de la reivindicación 1, en la que dicho tercer dominio comprende, en un orden amínico a carboxílico:

bisagra-CH2-CH3-conector-bisagra-CH2-CH3.

3. La construcción de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en la que cada uno de dichos monómeros polipeptídicos tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-24.

4. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que cada uno de dichos monómeros polipeptídicos tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-24.

5. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio CH2 comprende un puente disulfuro de cisteína dentro del dominio.

6. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que

7. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el primer y segundo dominio se fusionan al tercer dominio mediante un conector peptídico.

8. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, en un orden amínico a carboxílico:

(a) el primer dominio;

(c) el segundo dominio;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio;

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio.

9. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, en un orden amínico a carboxílico:

(c) el segundo dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 o 129, o SEQ ID NO: 15;

(e) el primer monómero polipeptídico del tercer dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ^sE^qID NO: 17-24;

(g) el segundo monómero polipeptídico del tercer dominio que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17-24.

10. La construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55, 56, 61,62, 73, 74, 79, 80, 91,92, 97 y 98.

11. Un polinucleótido que codifica una construcción de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Un vector que comprende un polinucleótido como se define en la reivindicación 11.

13. Una célula hospedadora transformada o transfectada con el polinucleótido como se define en la reivindicación 11 o con el vector como se define en la reivindicación 12.

14. Un proceso para la producción de una construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho proceso cultivar una célula hospedadora como se define en la reivindicación 13 en condiciones que permite la expresión de la construcción de anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y recuperar la construcción de anticuerpo producida del cultivo.

15. Una composición farmacéutica que comprende una construcción de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o producida de acuerdo con el proceso de la reivindicación 14.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 15, que es estable durante al menos cuatro semanas a aproximadamente -20 °C.

17. La construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en la prevención o tratamiento de un tumor o una enfermedad autoinmunitaria.

18. La construcción de anticuerpo para el uso de la reivindicación 17, en la que el tumor se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, plasmocitoma, leucemia de plasmocitos, macroglobulinemia de Waldenstrom, plasmocitoma óseo solitario, plasmocitoma extramedular, mieloma osteoesclerótico, mieloma múltiple asintomático, linfoma no hodgkiniano de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica y linfoma de Hodgkin.

19. Un kit que comprende una construcción de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o producida de acuerdo con el proceso de la reivindicación 14, un polinucleótido como se define en la reivindicación 11, un vector como se define en la reivindicación 12 y/o una célula hospedadora como se define en la reivindicación 13.