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KR102688969B1 - Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물 - Google Patents

Bcma 및 cd3 이중특이성 t 세포 맞물림 항체 작제물 Download PDF

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KR102688969B1
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마커스 뮌츠
요하네스 브로지
피터 쿠퍼
패트릭 호프만
마티아스 프리드리히
벤노 뢰틀
파메라 보그너
안드레이스 월프
코르넬리우스 펌프
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암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하
암젠 인크
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Abstract

본 발명은 BCMA에 대한 제1 도메인 결합, 인간 및/또는 마카카 CD3ε쇄의 세포외 에피토프에 대한 제2 도메인 결합, 및 특이적 Fc 양상인 제3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 특이적 Fc 양상의 이중특이성 항체 작제물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 작제물을 발현시키는 숙주 세포 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

Description

BCMA 및 CD3 이중특이성 T 세포 맞물림 항체 작제물
이중특이성 항체 유래 분자, 예컨대 BiTE(등록상표)(이중특이성 T　세포 관여자) 항체 작제물은 2개의 가요성으로 연결된 항체 유래 결합 도메인으로부터 생성된 재조합 단백질이다. BiTE(등록상표) 항체 작제물의 하나의 결합 도메인은 표적 세포 상의 선택된 종양-관련 표면 항원에 특이적이고; 제2 결합 도메인은 CD3, 즉, T 세포 상의 T 세포 수용체 복합체의 서브유닛에 대해 특이적이다. 그들의 특정 설계에 의해, BiTE(등록상표) 항체 작제물은 T 세포를 표적 세포와 일시적으로 연결하는 데 독특하게 적합하고, 동시에, 표적 세포에 대한 T 세포의 고유한 세포용해 가능성을 강력하게 활성화시킨다. AMG　103 및 AMG　110으로서 임상으로 개발된 BiTE(등록상표) 항체 작제물의 1세대의 중요한 추가적인 개발(WO　99/54440 및 WO　2005/040220 참조)은 CD3ε 쇄의 N-말단에서 문맥 독립적 에피토프에 대한 이중특이성 항체 작제물의 제공이었다(WO　2008/119567). 이런 선택된 에피토프에 대한 BiTE(등록상표) 항체 작제물 결합은 인간 및 비단마모셋(Callithrix jacchus), 솜털머리타마린(Saguinus oedipus) 또는 다람쥐 원숭이(Saimiri sciureus) CD3ε쇄에 대한 교차종 특이성을 나타낼 뿐만 아니라, (이중특이성 T 세포 맞물림 분자에서 CD3 결합제의 이전에 기재된 에피토프 대신) 이 특정 에피토프의 인식에 기인하여, T 세포 맞물림 항체의 이전의 생성에 대해 관찰된 것과 동일한 정도로 T 세포를 비특이적으로 활성화시키지 않는다. T 세포 활성화에서 이런 감소는 환자에서의 더 적은 또는 감소된 T 세포 재분포와 관련되고, 상관 관계가 있으며, 후자는 부작용의 위험으로서 식별된다.
WO 2008/119567에 기재된 바와 같은 항체 작제물은 신체로부터의 빠른 클리어런스를 겪을 가능성이 있고; 따라서, 한편으로 그들은 대부분의 신체에 빠르게 도달할 수 있으며, 생성이 더 빠르고 조절하기가 용이하며, 그들의 생체내 적용은 생체내에서 그들의 짧은 지속성에 의해 제한될 수 있다. 지속적 정맥내 주입에 의한 장기간 투여는 이 작은, 단일 쇄 분자의 짧은 생체내 반감기 때문에 치료적 효과를 달성하는 데 사용되었다. 그러나, 이러한 지속적 정맥내 주입은 환자에 대한 불편함으로 분류되고, 따라서, 더 편리한 대안의 치료 접근의 경우에, 각각의 질환의 치료에서 더 효율적인 것으로 입증된 화합물의 선택을 방해한다. 따라서, 유사한 치료 효능을 보유하고, 생성이 간단한 형식을 가지며, 더 긴 반감기를 포함하는 바람직한 약동학적 특성을 갖는 이중특이성 치료에 대한 당업계의 필요가 있다.
증가된 반감기는 일반적으로 면역글로불린, 특히 항체 및 가장 특별하게는 작은 크기의 항체 단편의 생체내 적용에서 유용하다. 이러한 효과를 달성하기 위해 당업계에 기재된 접근은 바람직하게는 BiTE(등록상표)의 치료 효과를 방해하지 않는 더 큰 단백질에 대한 작응 이중특이성 항체 작제물의 융합을 포함한다. 이중특이성 T 세포 관여자의 이러한 추가적인 개발에 대한 예는, 예를 들어, 미국 특허 제2014/0302037호, 미국 특허 제2014/0308285호, WO 2014/144722, WO 2014/151910 및 WO 2015/048272에 기재된 이중 특이성 Fc-분자를 포함한다. 대안의 전략은 이중특이성 분자에 융합된 HSA 또는 단지 인간 알부민 결합 펩타이드의 융합의 사용이다(예를 들어, WO2013/128027, WO2014/140358).
BCMA(B 세포 성숙 항원, TNFRSF17, CD269)은 TNF 수용체 슈퍼 패밀리에 속하는 막관통 단백질이다. 리간드 BAFF(B 세포 활성화 인자, 또한 TALL-1 또는 TNFSF13B로서 표기됨) 및 APRIL(증식기 유도 리간드: A proliferation inducing ligand)과의 추정적으로 필수적인 상호작용에 기인하여 B 세포 발생 및 항상성(Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111-2114)에 필수적인 B 세포 마커가 되는 것으로 확립되었다.
BCMA 발현은 B 세포 계통으로 제한되며, 형질 세포 및 형질아세포 상에서 주로 그리고 기억 B 세포 상에서 어느 정도로 존재하지만, 말초 및 미경험 B 세포 상에는 사실상 없다. 또한 BCMA는 다발성 골수종(MM) 세포 상에서 발현되고, 백혈병 및 림프종에 연루된다. 그의 패밀리 구성원 TACI(막관통 활성체 및 사이클로필린 리간드 상호작용자) 및 BAFF-R(B 세포 활성화 인자 수용체, 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 13C로서 알려짐)과 함께, BCMA는 상이한 양상의 체액성 면역, B 세포 발생 및 항상성을 조절한다. BCMA의 발현은 B 세포 분화에서 다소 늦게 나타내며, 골수에서의 형질아세포 및 형질 세포의 장기간 생존에 기여한다. 마우스에서 BCMA 유전자의 표적화된 결실은 골수에서 장기간 살아있는 형질 세포 수를 상당히 감소시키는데, 이는 그들의 생존을 위한 BCMA의 중요성을 나타낸다.
이 발견과 관련하여, BCMA는 또한 다발성 골수종(MM) 세포의 성장 및 생존을 지지한다. 노박(Novak) 등은 MM 세포주 및 신선하게 단리된 MM 세포가 그들의 세포 표면 상에서 BCMA 및 TACI 단백질을 발현시키고, 그들의 세포 표면 상에서 BAFF-R 단백질의 가변적 발현을 가진다는 것을 발견하였다(Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694).
다발성 골수종(MM)은 2번째로 흔한 혈액 악성종양이며, 모든 암 사망의 2%를 구성한다. MM은 이질적 질환이며, 대부분 염색체 전좌, 특히 t(11; 14), t(4; 14), t(8;14), del(13) 및 del(17)에 의해 야기된다. MM에 걸린 환자는 골수 침윤, 골 파괴, 신부전, 면역결핍, 및 암진단의 심리적 부담에 기인하여 다양한 질환 관련 증상을 경험할 수 있다.
골수종은 전형적으로 재발 과정에 따르는 불치의 질환인데, 다수의 환자(pt)는 다중 계통의 요법이 필요하다. RRMM에서의 결과는, 특히 프로테아좀 저해제(PI)- 및/또는 면역조절 약물(IMiD)-기반 치료의 실패 후에 불량하게 남아있다.
MM은 여전히 치료하기 어려운 질환이며, 불치성으로 남아있다. 이는 전형적으로 재발 과정에 따르는데, 다수의 환자는 다중 계통의 요법이 필요하다. 화학요법 및 줄기 세포 이식 접근과 같은 요법을 이용 가능하게 되고, 이는 개선된 생존율을 갖지만, 종종 원치않는 부작용을 초래한다. 지금까지, 다발성 골수종을 갖는 환자에 대해 2가지의 가장 빈번하게 사용되는 치료 선택 사항은 스테로이드, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 보르테조밉 또는 다양한 세포독성제의 조합물, 그리고 더 젊은 환자에 대해 자가 줄기 세포 이식과 함께 고용량 화학요법 개념이다.
대부분의 이식물은 자가 유형을 가지며, 즉, 환자 자신의 세포를 이용한다. 이러한 이식물은 치유력이 있지 않다고 해도, 선택 환자에서 수명을 연장시키는 것으로 나타났다. 그들은 새로 진단된 환자에서 또는 재발 시 초기 요법으로서 수행될 수 있다. 때때로, 선택 환자에서, 질환을 적절하게 제어하기 위해 1개 초과의 이식물이 권장될 수 있다. 줄기 세포 이식은 노령, 다른 심각한 병의 존재 또는 다른 신체적 제한 때문에 다수의 환자에 대한 선택사항아 아닐 수도 있다. 화학요법은 다발성 골수종을 단지 부분적으로 제어하며, 완전한 관해를 거의 야기하지 않는다. 재발 난치성 MM에서의 결과는, 특히 프로테아좀 저해제(PI)- 및/또는 면역조절 약물-기반 치료의 실패 후에 불량하게 남아있다. 따라서, 새로운, 혁신적 치료에 대한 긴급한 필요가 있다.
벨루시(Bellucci) 등(Blood. 2005 May 15;105(10))은 다발성 골수종 환자가 공여자 림프구 주입을 받은 후에, 다발성 골수종 환자에서 BCMA-특이적 항체를 동정하였다. 이들 환자의 혈청은 ADCC 및 CDC에 의해 BCMA-특이적 세포 용해를 매개할 수 있고, 항-종양 반응을 갖는 환자(4/9)에서만 검출되었지만, 비-반응 환자(0/6)에서는 검출되지 않았다. 저자는 BCMA-특이적 항체의 유도가 골수종 세포의 제거 및 환자의 장기간 관해에 기여한다는 것을 추측한다. 리안(Ryan) 등(Mol Cancer Ther. 2007 Nov; 6(11):3009-18)은 정상 및 악성 B 세포에서 강력한 생존전 신호전달 경로와 관련된 NF-κΒ 활성화를 방지하는 길항적 BCMA 특이적 항체의 생성을 보고하였다.
BCMA; BAFF-R 및 TACI, 즉, TNF 수용체 슈퍼 패밀리에 속하는 B 세포 수용체, 및 그들의 리간드 BAFF 및 APRIL에 암 및/또는 자가면역 장애에 대해 싸우는 요법을 실시한다는 사실에도 불구하고, 이러한 의학적 병태의 치료를 위한 입수 가능한 추가적인 선택사항에 대한 필요가 여전히 있다. 하나의 이러한 접근은 이중특이성 항체 유래 T 세포 관여자이다.
이형 Fc(또한 이형이량체 Fc, hetFc 또는 hFc로서 표기) 형식 및 인간 혈청 알부민의 융합(또한 HSA 또는 hALB로서 표기)을 포함한 당업계에 기재된 이중특이성 T 세포 맞물림 분자의 모든 반감기 연장 형식(half-life extending format: HLE 형식)은 비특이적 T 세포 활성화, 상보체 활성화, 불안정성, 또는 분자의 목적으로 하는 반감기 연장을 충족시키지 않는 약동학적 프로파일과 같은 개개 단점을 가진다. 따라서 본 발명의 목적은 본 기술분양의 분자에 대해 관찰된 이들 개개 결함 중 적어도 하나 그리고, 물론, 바람직하게는 하나 초과를 극복하는 BCMAxCD3 이중특이성 T　세포 맞물림 분자의 반감기 연장 형식을 제공하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 BCMA에 대한 제1 도메인 결합, 인간 및/또는 마카카(Macaca) CD3ε쇄의 세포외 에피토프에 대한 제2 도메인 결합, 및 특이적 Fc 양상인 제3 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 특이적 Fc 양상의 항체 작제물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 작제물을 발현시키는 숙주 세포 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1: 도 1a는 본 발명의 항체 작제물의 일 실시형태의 다이어그램을 도시한 도면. 도 1b는 이형이량체 Fc 항체 작제물을 도시하고, 그리고 도 1c는 당업계에 기재된 X-바디(X-body) 작제물을 도시한 도면. 표시된 전하쌍은 이형이량체화를 시행하기 위해 도입된다. 도 1d는 인간 혈청 알부민과 항체 작제물의 융합(HSA/hALB)을 도시한 도면.
도 2: 표적 A HLE BiTE(등록상표) 항체 작제물에 의한 표적-독립적 T 세포 활성화의 평가. 2(a) 인간 PBMC(3x); HLE BiTE(등록상표) 연속 희석물(20nM 시작; 1:5, 7x+블랭크); FcR 차단이 없거나 또는 있음[10㎎/㎖ huIgG(키오보그(Kiovog), 백스터(Baxter))]; CD4+, CD8+ T 세포 상에서 CD69 및 CD25[미제시] 발현의 FACS 측정에 의한 48시간 활성화 분석에서 본 발명의 항체 작제물.2(b) 인간 PBMC 및 CD14+/CD33+ 세포 고갈 PBMC(3x); HLE BiTE(등록상표) 연속 희석물(20nM 시작; 1:5, 7x+블랭크); CD4+, CD8+ T 세포 상에서 CD69 및 CD25[미제시] 발현의 FACS 측정에 의한 48시간 활성화 분석에서 이형-Fc 항체 작제물.
도 3: HLE BiTE(등록상표) 항체 작제물에 의한 표적-독립적 T 세포 활성화의 평가. 3(a) 인간 PBMC(3x); HLE BiTE(등록상표) 연속 희석물(20nM 시작; 1:5, 7x+블랭크); FcR 차단이 없거나 또는 있음[10㎎/㎖ huIgG(키오보그, 백스터)]; CD4+, CD8+ T 세포 상에서 CD69 및 CD25[미제시] 발현의 FACS 측정에 의한 48시간 활성화 분석에서 본 발명의 표적B 항체 작제물.3(b) 인간 PBMC 및 CD14+/CD33+ 세포 고갈 PBMC(3x); HLE BiTE(등록상표) 연속 희석물(20nM 시작; 1:5, 7x+블랭크); CD4+, CD8+ T 세포 상에서 CD69 및 CD25[미제시] 발현의 FACS 측정에 의한 48시간 활성화 분석에서 표적B 이형-Fc 항체 작제물.3(c) 인간 PBMC 및 CD14+/CD33+ 세포 고갈 PBMC(3x); HLE BiTE(등록상표) 연속 희석물(20nM 시작; 1:5, 7x+블랭크); CD4+, CD8+ T 세포 상에서 CD69 및 CD25[미제시] 발현의 FACS 측정에 의한 48시간 활성화 분석에서 표적B X-바디 작제물.3(d) 내지 3(f)는 3명의 상이한 건강한 인간 공여자로부터의 단리시킨 PBMC를 48시간 동안 표적 B에 특이적인 HLE 이중특이성 항체 작제물의 농도를 증가시키면서 배양시켰다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 CD69 활성화 마커의 발현을 CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합 mAb를 이용하는 유세포분석에 의해 결정하였다.
도 4: BiTE(등록상표) Fc 융합 항체 작제물의 상보체 C1q 결합을 도시한 도면. BiTE(등록상표) Fc 융합 항체 작제물(BiTE(등록상표) 단일쇄 Fc(삼각형), BiTE(등록상표) 이형 Fc(정사각형), 정규 BiTE(등록상표)(원))을 풀링된 인간 혈청과 함께 인큐베이션 및 다클론성 항-인간 CC1q 뮤린 항체와 함께 인큐베이션 전에 막시소프(Maxisorp) 플레이트 상에서(연속 희석물에서) 코팅시키고, 염소 항-마우스 Fc-AP 접합체에 의해 시각화하였다.
도 5: 사이노몰거스 원숭이에서 단일 용량 투여 후 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 표적화하는 두 상이한 BCMA의 평균 PK 프로파일을 도시한 도면. 비교 가능성 때문에, 혈청 농도를 15㎍/㎏으로 용량 정규화시키고, n㏖로 표시하였다.
도 6: 각각 scFc 반감기 연장 모이어티에 융합된 9개의 상이한 BiTE(등록상표) 항체 작제물의 평균 PK 프로파일을 도시한 도면. 비교 가능성 때문에, 혈청 농도를 15㎍/㎏으로 용량 정규화시키고, n㏖로 표시하였다.
도 7: 이중특이성 scFc 변이체 D9F(서열번호　105), T2G(서열번호　106), D3L(서열번호　107), T7I(서열번호　108) 및 K6C(서열번호　109). 본 발명의 항체 작제물의 바람직한 제3 도메인은 서열번호 105에 의해 포함되는 제3 도메인이다.
도 8: 인간 FcRn에 대한 결합의 표면 플라즈몬 공명(SPR)-기반 결정. SPR(비아코어(Biacore)) 실험에서 작제물 D9F, T2G, D3L, T7I 및 K6C를 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 능력에 대해 각각 시험하였다. 결합된 작제물에 기인하는 FcRn 코팅 CM5 상에서의 분자 질량 증가와 동일한 각각의 반응 단위(RU)로서 모든 작제물에 대해 주사 단계 동안의 최대 결합을 측정하였다. 모든 작제물을 2회 중복해서 측정하였다. 2회 결정의 평균 값을 도 8A 및 도 8B에서 도시한다.
도 9: SPR(비아코어) 실험에서 작제물 D9F, T2G, D3L, T7I 및 K6C 및 인간 IgG1-카파 항체 MT201를 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 능력에 대해 각각 시험하였다. 결합된 작제물에 기인하는 FcRn 코팅 CM5 상에서의 분자 질량 증가와 동일한 각각의 반응 단위(RU)로서 모든 작제물에 대해 주사 단계 동안의 최대 결합을 측정하였다. 모든 작제물을 2회 중복해서 측정하였다. 표준 편차 오차 막대를 포함하는 2회 결정의 평균 값을 도시한다.
본 발명의 이중특이성 항체 작제물의 상당히 연장된 반감기에 추가로, 특이적 Fc 양상의 융합은 또한 본 발명의 항체 작제물의 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인에 대해 놀랍게도 상당한 영향을 초래한다. 따라서, T 세포 맞물림 항체 작제물의 다른 반감기 연장 양상은 개개의 바람직한 특징을 나타내지만, 본 발명의 특이적 Fc 양상의 선출은 전형적으로 광범위한 강한 분자 형식의 바람직한 특징을 나타내는 이중특이성 분자의 제공을 허용하고, 따라서, 유망한 약제학적 조성물의 개발을 허용한다.
따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 항체 작제물을 제공한다:
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BCMA에 결합하는 제1 도메인,
인간 및/또는 마카카(Macaca) CD3ε쇄의 세포외 에피토프에 결합하는 제2 도메인; 및
각각 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 제3 도메인으로서, 상기 2개의 폴리펩타이드 단량체는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합된다.
용어 "항체 작제물"은 구조 및/또는 기능이 항체의, 예를 들어, 전장 또는 전체 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능에 기반하고/하거나 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 도메인으로부터 유도되는 분자를 지칭한다. 따라서 항체 작제물은 그의 특정 표적 또는 항원에 결합할 수 있다. 더 나아가, 본 발명에 따른 항체 작제물의 결합 도메인은 표적 결합을 허용하는 항체의 최소 구조적 필요를 포함한다. 이런 최소 필요는, 예를 들어, 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3), 바람직하게는 모두 6개의 CDR의 존재에 의해 정해질 수 있다. 항체의 최소 구조 필요를 정하기 위한 대안의 접근은 특정 표적 구조 내의, 즉, 각각 에피토프 영역을 구성하는 표적 단백질의 단백질 도메인(에피토프 클러스터) 또는 정해진 항체의 에피토프와 경쟁하는 특정 항체에 대한 항체의 에피토프의 정의이다. 본 발명에 따른 작제물에 기반하는 항체는, 예를 들어, 단클론성, 재조합체, 키메라, 탈면역화, 인간화 및 인간 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체 작제물의 결합 도메인은, 예를 들어 CDR의 상기 언급된 그룹을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 해당 CDR은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 프레임워크에 포함되지만; 그러나, 둘 다를 포함하지는 않는다. Fd 단편은, 예를 들어, 2개의 VH 영역을 가지고, 종종 무손상 항원-결합 도메인의 일부 항원-결합 기능을 보유한다. 항체 단편, 항체 변이체 또는 결합 도메인의 형식에 대한 추가적인 예는 (1) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편; (2) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편; (3) 2개의 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (4) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편, (5) VH 도메인을 갖는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546); (6) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (7) 단일쇄 Fv(scFv)를 포함하며, 후자가 바람직하다(예를 들어, scFV-라이브러리로부터 유래). 본 발명에 따른 항체 작제물의 실시형태에 대한 예는, 예를 들어 WO　00/006605, WO　2005/040220, WO　2008/119567, WO　2010/037838, WO　2013/026837, WO　2013/026833, 미국 특허 제2014/0308285호, 미국 특허 제2014/0302037호, WO　2014/144722, WO　2014/151910, 및 WO　2015/048272에 기재되어 있다.
또한 VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 또는 "r　IgG"("절반 항체")와 같은 전장 항체의 단편은 "결합 도메인" 또는 "결합하는 도메인"의 정의 내이다. 본 발명에 따른 항체 작제물은 또한 항체 변이체로도 불리는 항체의 변형된 단편, 예컨대 scFv, 다이-scFv 또는 이중(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-지퍼, scFab, Fab2, Fab3, 다이어바디, 단일쇄 다이어바디, 탠덤(tandem) 다이어바디(Tandab's), 탠덤 다이-scFv, 탠덤 트라이-scFv, "멀티바디", 예컨대 트라이어바디 또는 테트라바디, 및 단일 도메인 항체, 예컨대, 나노바디, 또는 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는, VHH, VH 또는 VL일 수 있는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 단일 가변 도메인 항체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일쇄 Fv", "단일쇄 항체" 또는 "scFv"는 중쇄와 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 없는 단일 폴리펩타이드 쇄 항체 단편을 지칭한다. 일반적으로, 단일쇄 항체는 항원 결합을 허용하는 목적으로 하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. 단일쇄 항체는 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]에 의해 상세하게 논의된다. 미국 특허 제4,694,778호 및 제5,260,203호; 국제 특허 출원 공개 WO 88/01649; 문헌[Bird (1988) Science 242:423-442; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward et al. (1989) Nature 334:54454; Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]에 기재된 것을 포함하는 단일쇄 항체를 생성하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 구체적 실시형태에서, 단일쇄 항체는 또한 이중특이성, 다중특이성, 인간 및/또는 인간화 및/또는 합성일 수 있다.
더 나아가, 용어 "항체 작제물"의 정의는 1가, 2가 및 다가/다중가 작제물 및, 그에 따라, 단지 2개의 항원 구조에 특이적으로 결합하는 이중특이성 작제물뿐만 아니라 별개의 결합 도메인을 통해 2개 초과의 항원 구조, 예를 들어 3, 4개 이상에 특이적으로 결합하는 다특이성/ 다중특이성 작제물을 포함한다. 게다가, 용어 "항체 작제물"의 정의는 단지 하나의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 분자뿐만 아니라 하나 초과의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 분자를 포함하는데, 이 쇄는 동일하거나(동종이량체, 동종삼량체 또는 동종 올리고머) 또는 상이할 수 있다(이형이량체, 이형삼량체 또는 이형올리고머). 상기 동정한 항체 및 이의 변이체 또는 유도체에 대한 예는 특히 문헌[Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann 및 D
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bel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "이중특이성"은 "적어도 이중특이성"인 항체 작제물을 지칭하며, 즉, 이는 적어도 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함하되, 제1 결합 도메인은 하나의 항원 또는 표적(본 명세서에서: BCMA)에 결합하고, 제2 결합 도메인은 다른 항원 또는 표적(본 명세서에서: CD3)에 결합한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 작제물은 적어도 2개의 상이한 항원 또는 표적에 대한 특이성을 포함한다. 예를 들어, 제1 도메인은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 종의 CD3ε의 세포외 에피토프에 결합하지 않는다. 용어 "표적 세포 표면 항원"은 세포에 의해 발현되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 작제물에 접근 가능하도록 세포 표면에 존재하는 항원 구조를 지칭한다. 이는 단백질, 바람직하게는 단백질의 세포외 부분, 또는 탄수화물 구조, 바람직하게는 단백질의 탄수화물 구조, 예컨대 당단백질일 수 있다. 이는 바람직하게는 종양 항원이다. 본 발명의 용어 "이중특이성 항체 작제물"은 또한 다중특이성 항체 작제물, 예컨대 삼중특이성 항체 작제물을 포함하며, 후자는 3개의 결합 도메인을 포함하거나, 또는 작제물은 3개 초과의(예를 들어, 4, 5...) 특이성을 가진다.
본 발명에 따른 항체 작제물이 (적어도) 이중특이성이라는 것을 고려하면, 그들은 자연적으로 생기지 않으며, 그들은 천연 유래 생성물과 현저하게 상이하다. 따라서 "이중특이성" 항체 작제물 또는 면역글로불린은 상이한 특이성을 갖는 적어도 2개의 별개의 결합측을 갖는 인공 혼성 항체 또는 면역글로불린이다. 이중특이성 항체 작제물은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990)] 참조.
본 발명의 항체 작제물의 적어도 2개의 결합 도메인 및 가변 도메인(VH/VL)은 펩타이드 링커(스페이서 펩타이드)를 포함할 수도 있고 또는 포함하지 않을 수도 있다. 용어 "펩타이드 링커"는 본 발명에 따르면 본 발명의 항체 작제물의 하나의(가변 및/또는 결합) 도메인 및 다른(가변 및/또는 결합) 도메인의 아미노산 서열이 서로 연결되는 아미노산 서열을 포함한다. 펩타이드 링커는 또한 본 발명의 항체 작제물의 다른 도메인에 제3 도메인을 융합시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 링커의 필수적인 기술적 특징은 그것이 임의의 중합 활성을 포함하지 않는다는 것이다. 적합한 펩타이드 링커 중에 미국 특허 제4,751,180호 및 제4,935,233호 또는 WO　88/09344에 기재된 것이 있다. 펩타이드 링커는 또한 본 발명의 항체 작제물에 다른 도메인 또는 모듈 또는 영역(예컨대, 반감기 연장 도메인)을 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 작제물은 바람직하게는 "시험관내 생산된 항체 작제물"이다. 이 용어는 상기 정의에 따른 항체 작제물을 지칭하며, 여기서, 가변 영역의 모두 또는 일부(예를 들어, 적어도 하나의 CDR)는 비면역 세포 선택, 예를 들어, 시험관내 파지 디스플레이, 단백질 칩 또는 후보 서열이 항원에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험될 수 있는 다른 방법에서 생성된다. 따라서 이 용어는 바람직하게는 동물에서 면역 세포의 게놈 재배열에 의해서만 생성되는 서열을 제외한다. "재조합 항체"는 재조합 DNA 기법 또는 유전자 조작의 사용을 통해 이루어진 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단클론성 항체"(mAb) 또는 단클론성 항체 작제물은 실질적으로 균질한 항체의 집단을 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역 후 변형(예를 들어, 이성질화, 아마이드화)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 상이한 결정소(또는 에피토프)와 관련된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인(다클론성) 항체 제제와 대조적으로 항원 상에서 단일 항원측 또는 결정소에 대해 고도로 특이적이다. 그들의 특이성에 추가로, 단클론성 항체는 그들이 하이브리도마 배양물에 의해 합성되고, 따라서 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변형어 "단클론성"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
단클론성 항체의 제조를 위해, 지속적 세포주 배양에 의해 생산된 항체를 제공하는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용될 단클론성 항체는 문헌[Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생성될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 추가적인 기법의 예는 트라이오마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) 및 EBV-하이브리도마 기법을 포함한다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985),77-96).
이어서, 하이브리도마는 구체화된 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하나 이상의 하이브리도마를 동정하기 위해 표준 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명(비아코어(상표명)) 분석을 이용하여 선별될 수 있다. 적절한 항원의 임의의 형태는 면역원, 예를 들어, 재조합 항원, 천연 유래 형태, 임의의 변이체 또는 이의 단편뿐만 아니라 이의 항원 펩타이드로서 사용될 수 있다. 비아코어 시스템에서 사용되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명은 표적 세포 표면 항원의 에피토프에 결합하는 파지 항원의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
단클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 선별 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어, 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어, 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 제5,223,409호; 문헌[Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)]에 기재되어 있다.
디스플레이 라이브러리의 사용에 추가로, 비인간 동물, 예를 들어, 설치류(예컨대, 마우스, 햄스터, 토끼 또는 래트)를 면역화하기 위해 적절한 항원이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 인간 Ig(면역글로불린) 좌위의 큰 단편을 이용하는 마우스 항체 생성에서 결핍된 마우스 균주를 조작하는 것이 바람직하다. 하이브리도마 기법을 이용하여, 목적으로 하는 특이성을 갖는 유전자로부터 유래된 항원-특이적 단클론성 항체가 생성되고, 선택될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)(상표명), 문헌[Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21], 미국 특허 제2003-0070185호, WO　96/34096, 및 WO　96/33735.
단클론성 항체는 또한 비인간 동물로부터 얻어질 수 있고, 이어서, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법을 이용하여 변형되며, 예를 들어, 인간화, 탈면역화, 키메라 등이 제공된다. 변형된 항체 작제물의 예는 비인간 항체, "친화도 성숙된" 항체(예를 들어, 문헌[Hawkins et al. J.　Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) 및 Lowman et al., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) 및 변경된 효과기 기능(들)을 갖는 항체 돌연변이체(예를 들어, 미국 특허 제5,648,260호, 문헌[Kontermann and Dubel (2010), 상기 인용 문헌 및 Little (2009), 상기 인용 문헌] 참조)의 인간화된 변이체를 포함한다.
면역학에서, 친화도 성숙은 B 세포가 면역 반응의 과정 동안 항원에 대해 증가된 친화도를 갖는 항체를 생성하는 과정이다. 동일한 항원에 대한 반복된 노출에 의해, 숙주는 성공적으로 더 큰 친화도의 항체를 생성할 것이다. 천연 표현형과 마찬가지로, 시험관내 친화도 성숙은 성숙 및 선택의 원칙에 기반한다. 시험관내 친화도 성숙은 항체, 항체 작제물 및 항체 단편을 최적화하기 위해 성공적으로 사용되었다. CDR 내부의 무작위 돌연변이는 방사선, 화학적 돌연변이원 또는 오류 유발 PCR을 이용하여 도입된다. 추가로, 유전자 다양성은 쇄 셔플링에 의해 증가될 수 있다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법을 이용하는 돌연변이 및 선택의 2 또는 3회 라운드는 보통 낮은 나노몰 범위에서 친화도를 갖는 항체 단편을 초래한다.
항체 작제물의 바람직한 유형의 아미노산 치환 변이는 모 항체(예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가적인 연구를 위해 선택된 얻어진 변이체(들)는 그들이 생성된 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화도 성숙을 수반한다. 간략하게, 몇몇 초가변 영역측(예를 들어, 6 내지 7개측)은 각각의 측에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에서 패키징된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합으로서 섬질 파지 입자로부터 1가 방식으로 나타난다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 선별된다. 변형을 위해 후보 초가변 영역측을 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 수행되어 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 결합 도메인과, 예를 들어, 인간 BCMA 사이의 접점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 데 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 본 명세서에 상세히 기재된 기법에 따르는 치환에 대한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성된다면, 변이체의 패널에 본 명세서에 기재된 바와 한은 선별이 실시되고, 하나 이상의 적절한 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가 연구를 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 단클론성 항체 및 항체 작제물은 구체적으로는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 이에 대해 상동성인 한편, 그들이 목적으로 하는 생물학적 활성을 나타낸다면, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 분류 또는 하위분류에 속하는 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에서의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)을 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855(1984)]). 본 명세서의 관심 대상의 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 긴 꼬리 원숭이, 유인원 등) 및 인간 불변 영역 서열로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근이 기재되었다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851 , 1985; Takeda et　al., Nature 314:452, 1985], 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 보스(Boss) 등의 미국 특허 제4,816,397호; 타나구치(Tanaguchi) 등의 유럽 특허 제0171496호; 유럽 특허 제0173494호; 및 독일 특허 제2177096호 참조.
항체, 항체 작제물, 항체 단편 또는 항체 변이체는 또한, 예를 들어 WO　98/52976 또는 WO　00/34317에 개시된 방법에 의한 인간 T 세포 에피토프의 특정 결실("탈면역화"로 불리는 방법)에 의해 변형될 수 있다. 간략하게, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 MHC 클래스 II에 결합하는 펩타이드에 대해 분석될 수 있고; 이들 펩타이드는 잠재적 T 세포 에피토프를 나타낸다(WO　98/52976 및 WO　00/34317에 나타낸 바와 같음). 잠재적 T 세포 에피토프의 검출을 위해, "펩타이드 스레딩(threading)"으로 지칭되는 컴퓨터 모델링 접근이 적용될 수 있고, 그리고 추가로 인간 MHC 클래스 II 결합 펩타이드의 데이터베이스는 WO　98/52976 및 WO　00/34317에 기재된 바와 같은 VH 및 VL 서열에 존재하는 모티프에 대해 검색될 수 있다. 이들 모티프는 임의의 18개의 주요 MHC 클래스 II DR 알로타입에 결합하고, 따라서 잠재적 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적 T 세포 에피토프는 가변 도메인에서 소수의 아미노산 잔기를 치환함으로써, 또는 바람직하게는, 단일 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있다. 전형적으로, 보존적 치환이 이루어진다. 종종, 배타적으로는 아니지만, 인간 생식계열 항체 서열 내 위치에 공통적인 아미노산이 사용될 수 있다. 인간 생식계열 서열은, 예를 들어, 문헌[Tomlinson, et al. (1992) J. MoI. Biol. 227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; 및 Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14:4628-4638]에 개시되어 있다. V BASE 디렉토리는 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적 디렉토리를 제공한다(문헌[Tomlinson, LA. et　al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK]에 의해 편집됨). 이들 서열은 인간 서열의 공급원으로서, 예를 들어, 프레임워크 영역 및 CDR에 대해 사용될 수 있다. 공통 인간 프레임워크 영역은 또한, 예를 들어 미국 특허 제6,300,064호에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
"인간화된" 항체, 항체 작제물, 변이체 또는 이들의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)은 (a) 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열(들)을 함유하는 대부분의 인간 서열의 항체 또는 면역글로불린이다. 대부분의 경우에, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역(또한 CDR)으로부터의 잔기가 목적으로 하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간(예를 들어, 설치류) 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 더 나아가, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "인간화된 항체"는 또한 수용자 항체에서도 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하고 최적화하기 위해 이루어진다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가적인 상세한 설명을 위해, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,2: 593-596(1992)] 참조.
인간화된 항체 또는 이의 단편은 항원 결합에 직접적으로 수반되지 않는 Fv 가변 도메인의 서열을 인간 Fv 가변 도메인으로부터의 동등한 서열로 대체함으로써 생성될 수 있다. 인간화된 항체 또는 이의 단편을 생성하기 위한 예시적인 방법은 문헌[Morrison (1985) Science 229:1202-1207]에 의해; 문헌[Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214]에 의해; 그리고 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,762호; 미국 특허 제5,859,205호; 및 미국 특허 제6,407,213호에 의해 제공된다. 상기 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터 면역글로불린 Fv 가변 도메인의 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 단리시키는 단계, 조작하는 단계 및 발현시키는 단계를 포함한다. 이러한 핵산은 상기 기재한 바와 같은 사전 결정된 표적에 대해서 뿐만 아니라 다른 공급원으로부터의 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 이어서, 인간화된 항체 분자를 암호화하는 재조합 DNA는 적절한 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
인간화된 항체는 또한 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시키지만, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수 없는 유전자이식 동물, 예컨대 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 윈터(Winter)는 본 명세서에 기재된 인간화된 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 CDR 접합 방법을 기재한다(미국 특허 제5,225,539호). 특정 인간 항체의 모든 CDR은 비-인간 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나, 또는 단지 일부의 CDR은 비-인간 CDR로 대체될 수 있다. 이는 사전 결정된 항원에 대한 인간화된 항체의 결합에 필요한 CDR의 수를 대체하는 데에만 필수적이다.
인간화된 항체는 보존적 치환, 공통 서열 치환, 생식계열 치환 및/또는 복귀 돌연변이의 도입에 의해 최적화될 수 있다. 이러한 변경된 면역글로불린 분자는 당업계에 공지된 임의의 몇몇 기법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16,1982], 및 유럽 특허 제239　400호).
용어 "인간 항체", "인간 항체 작제물" 및 "인간 결합 도메인"은, 예를 들어, 문헌[Kabat et al. (1991)(상기 인용 문헌)]에 의해 기재된 것을 포함하는 당업계에 공지된 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 실질적으로 대응하는 가변 및 불변 영역 또는 도메인과 같은 항체 영역을 갖는 항체, 항체 작제물 및 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 인간 항체, 항체 작제물 또는 결합 도메인은, 예를 들어 CDR에서, 그리고 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체, 항체 작제물 또는 결합 도메인은 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산으로 대체되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 위치를 가질 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 인간 항체, 항체 작제물 및 결합 도메인의 정의는 또한 제노마우스(Xenomouse)와 같은 기법 또는 시스템을 이용함으로써 유도될 수 있는 것으로서 항체의 비인공 및/또는 유전적으로 변경된 인간 서열만을 포함하는 "완전 인간 항체"를 상정한다. 바람직하게는, "완전 인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 작제물은 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 항체 작제물이다. "단리된" 또는 "실질적으로 순수한"은 본 명세서에 개시된 항체 작제물을 기재하기 위해 사용할 때, 그의 생성 환경의 성분으로부터 동정되고/되거나, 분리되고/되거나 회수된 항체 작제물을 의미한다. 바람직하게는, 항체 작제물은 그의 생성 환경으로부터의 모든 다른 성분과의 관련이 없거나 또는 실질적으로 없다. 그의 생성환경의 오염 성분, 예컨대 재조합 형질감염 세포로부터 초래된 것은 폴리펩타이드에 대한 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해하지 않는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 항체 작제물은, 예를 들어 주어진 샘플 중의 총 단백질의 적어도 약 5중량%, 또는 적어도 약 50중량%를 구성할 수 있다. 단리된 단백질은 상황에 따라서 총 단백질 함량의 5중량% 내지 99.9중량%를 구성할 수 있다는 것이 이해된다. 폴리펩타이드는 그것이 증가된 농도 수준에서 생성되도록 유도성 프로모터 또는 고발현 프로모터의 사용을 통해 상당히 더 높은 농도에서 생성될 수 있다. 상기 정의는 당업계에 공지된 매우 다양한 유기체 및/또는 숙주 세포에서 항체 작제물의 생성을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 항체 작제물은 (1) 스피닝 컵 시퀀서의 사용에 의해 N-말단의 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마씨 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균질성에 대해 정제될 것이다. 그러나, 보통 단리된 항체 작제물은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "결합 도메인"은 본 발명과 관련하여 표적 분자(항원), 본 명세서에서 각각 BCMA 및 CD3 상의 주어진 표적 에피토프 또는 주어진 표적측에 (특이적으로) 결합하고/상호작용하며/인식하는 도메인을 특성규명한다. 제1 결합 도메인(BCMA를 인식)의 구조 및 기능, 및 바람직하게는 또한 제2 결합 도메인(CD3을 인식)의 구조 및/또는 기능 항체의, 예를 들어, 전장 또는 전체 면역글로불린 분자의 구조 및/또는 기능에 기반하고/하거나 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 도메인으로부터 유도된다. 바람직하게는, 제1 결합 도메인은 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3)의 존재를 특징으로 한다. 제2 결합 도메인은 바람직하게는 또한 표적 결합을 허용하는 항체의 최소 구조적 필요를 포함한다. 더 바람직하게는, 제2 결합 도메인은 적어도 3개의 경쇄 CDR(즉, VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 3개의 중쇄 CDR(즉, VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인은 이미 존재하는(단클론성) 항체로부터의 CDR 서열을 스캐폴드에 접합시키기보다는 파지-디스플레이 또는 라이브러리 선별 방법에 의해 생성되거나 또는 이에 의해 얻을 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명에 따르면, 결합 도메인은 하나 이상의 폴리펩타이드의 형태이다. 이러한 폴리펩타이드는 단백질성 부분 및 비단백질성 부분(예를 들어, 화학적 링커 또는 화학적 가교제, 예컨대 글루타르알데하이드)을 포함할 수 있다. 단백질(이의 단편, 바람직하게는 생물학적으로 활성인 단편, 및 펩타이드를 포함하고, 보통 30개 미만의 아미노산을 가짐)은 공유 펩타이드 결합(아미노산 쇄를 초래)을 통해 서로 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 보통 30개 초과의 아미노산으로 이루어지는 분자 그룹을 기재한다. 폴리펩타이드는 추가로 다량체, 예컨대 이량체, 삼량체 및 더 고차의 올리고머를 형성할 수 있고, 즉, 하나 초과의 폴리펩타이드 분자로 이루어진다. 이러한 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩타이드 분자는 동일할 수도 있고 또는 동일하지 않을 수도 있다. 이러한 다량체의 대응하는 더 고차의 구조는, 결과적으로 동종- 또는 이형이량체, 동종 또는 이형삼량체 등으로 지칭된다. 이형다량체에 대한 예는 그의 천연 발생 형태에서, 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드로 이루어진 항체 분자이다. 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 지칭하되, 변형은 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 번역후 변형에 의해 달성된다. "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 본 명세서에서 지칭할 때, 또한 화학적으로 변형될 수 있으며, 예컨대 페길화된다(pegylated). 이러한 변형은 당업계에 잘 공지되어 있고, 본 명세서에서 이하에 기재한다.
바람직하게는 BCMA에 결합하는 결합 도메인 및/또는 CD3ε에 결합하는 결합 도메인은 인간 결합 도메인이다. 적어도 하나의 인간 결합 도메인을 포함하는 항체 및 항체 작제물은 비-인간, 예컨대 설치류(예를 들어, 뮤린, 래트, 햄스터 또는 토끼) 가변 및/또는 불변 영역을 갖는 항체 또는 항체 작제물과 관련된 일부 문제를 피한다. 이러한 설치류 유래 단백질의 존재는 항체 또는 항체 작제물의 빠른 클리어런스를 야기할 수 있거나 또는 환자에 의해 항체 또는 항체 작제물에 대한 면역 반응의 생성을 야기할 수 있다. 설치류 유래 항체 또는 항체 작제물의 사용을 회피하기 위해, 인간 또는 완전 인간 항체/항체 작제물은 설치류가 완전 인간 항체를 생성하도록 설치류에 인간 항체 기능의 도입을 통해 생성될 수 있다.
YAC에서 메가베이스-크기 인간을 클로닝하고 재구성하며, 그들을 마우스 생식계열에 도입하는 능력은 매우 큰 또는 조잡하게 맵핑된 좌위의 기능적 성분을 설명하는 것뿐만 아니라 인간 질환의 유용한 모델을 생성하는 것에 대해 강력한 접근을 제공한다. 더 나아가, 마우스 좌위의 그들의 인간 동등물로의 치환을 위한 이러한 기법의 용도는 개발 동안 인간 유전자 산물 발현 및 조절, 다른 시스템과 그들의 통신 및 질환 유도 및 진행에서 그들의 연루에 대한 독특한 통찰을 제공할 수 있었다.
이러한 전략의 중요한 실행적 적용은 마우스 체액성 면역계의 "인간화"이다. 내인성 Ig 유전자가 활성화된 마우스 내로 인간 면역글로불린(Ig)의 도입은 프로그래밍된 발현의 기저를 이루는 메커니즘 및 항체의 조립체뿐만 아니라 B-세포 발생에서 그들의 역할을 연구하는 기회를 제공한다. 더 나아가, 이러한 전략은 완전한 인간 단클론성 항체(mAb)의 생성 - 인간 질환에서 항체 요법의 가능성 충족에 대해 중요한 단계를 위한 이상적인 공급원을 제공할 수 있었다. 완전 인간 항체 또는 항체 작제물은 마우스 또는 마우스 유도체화된 mAb에 대해 고유한 면역원성 그리고 알레르기 반응을 최소화하고, 따라서 투여된 항체/항체 작제물의 효능 및 안전성을 증가시키는 것으로 예상된다. 완전 인간 항체 또는 항체 작제물의 사용은 반복된 화합물 투여가 필요한 만성 및 재발성 인간 질환, 예컨대 염증, 자가면역 및 암의 치료에서 실질적인 이점을 제공하는 것으로 예상될 수 있다.
이 목적에 대한 한 가지 접근은 마우스 항체의 부재 하에 이러한 마우스가 인간 항체의 거대 레퍼토리를 생성하는 적용에서 인간 Ig 좌위의 거대 단편을 이용하는 마우스 항체 생성에 결여된 마우스 균주를 조작하는 것이었다. 거대 인간 Ig 단편은 거대 가변 유전자 다양성뿐만 아니라 항체 생성 및 발현의 적절한 조절을 보존할 것이다. 항체 다양성 및 선택에 대한 마우스 기작 및 인간 단백질에 대한 면역학적 용인의 결여를 연구함으로써, 이들 마우스 균주에서 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함하는 임의의 관심 대상에 대해 고친화도 항체를 수득하여야 한다. 하이브리도마 기법을 이용하여, 목적으로 하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 mAb는 용이하게 생성되고, 선택될 수 있었다. 이런 일반적 전략은 제1 제노마우스 마우스 균주의 생성과 관련하여 입증되었다(문헌[Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)] 참조). 제노마우스 균주는 코어 가변 및 불변 영역 서열을 포함하는, 각각 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 245kb 및 190kb-크기 생식계열 입체배치 단편을 포함하는 효모 인공 염색체(YAC)를 이용하여 조작되었다. YAC를 함유하는 인간 Ig는 항체의 재배열과 발현 둘 다에 대한 마우스 시스템에 적합한 것으로 증명되었고, 비활성화 마우스 Ig 유전자를 치환할 수 있었다. 이는 완전 인간 항체의 성인-유사 인간 레퍼토리를 생성하기 위해, 그리고 항원-특이적 인간 mAb를 생성하기 위해 B 세포 발생을 유도하는 그들의 능력에 의해 입증되었다. 이들 결과는 또한 더 다수의 V 유전자, 추가적인 조절 요소, 및 인간 Ig 불변 영역을 함유하는 인간 Ig 좌위의 더 큰 부분의 도입이 감염 및 면역화에 대한 인간 체액성 반응의 특징인 실질적으로 완전한 레퍼토리를 개괄할 수 있다는 것을 시사한다. 그린(Green) 등의 작업은 최근에 각각 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위의 메가베이스 크기, 생식계열 입체배치 YAC 단편의 도입을 통해 인간 항체 레퍼토리의 대략 80%보다 더 큰 도입으로 확장되었다. 문헌[Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)] 및 미국 특허 출원 일련 번호 제08/759,620호 참조.
제노마우스 마우스의 생성은 미국 특허 출원 일련 번호 제07/466,008호, 일련 번호 제07/610,515호, 일련 번호 제07/919,297호, 일련 번호 제07/922,649호, 일련 번호 제08/031,801호, 일련 번호 제08/112,848호, 일련 번호 제08/234,145호, 일련 번호 제08/376,279호, 일련 번호 제08/430,938호, 일련 번호 제08/464,584호, 일련 번호 제08/464,582호, 일련 번호 제08/463,191호, 일련 번호 제08/462,837호, 일련 번호 제08/486,853호, 일련 번호 제08/486,857호, 일련 번호 제08/486,859호, 일련 번호 제08/462,513호, 일련 번호 제08/724,752호 및 일련 번호 제08/759,620호; 및 미국 특허 제6,162,963호; 제6,150,584호; 제6,114,598호; 제6,075,181호 및 제5,939,598호 및 일본 특허 제3　068　180B2호, 제3　068　506　B2호 및 제3　068　507　B2호에서 추가로 논의되고 상세하게 기술된다. 또한 문헌[Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) 및 Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495(1998)], 유럽 특허 제0　463　151B1호, WO94/02602, WO96/34096, WO98/24893, WO00/76310 및 WO03/47336 참조.
대안의 접근에서, 젠팜 인터네셔날 인코포레이티드(GenPharm International, Inc.)를 포함하는 다른 것들은 "미니좌위(minilocus)" 접근을 이용하였다. 미니좌위 접근에서, 외인성 Ig 좌위는 Ig 좌위로부터의 조각(개개 유전자)의 포함을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 영역 및 제2 불변 영역(바람직하게는 감마 불변 영역)은 동물 내로 삽입을 위한 작제물로 형성된다. 이 접근은 수라니(Surani) 등의 미국 특허 제5,545,807호 및 미국 특허 제5,545,806호; 론버그(Lonberg) 및 카이(Kay)에 대해 각각 제5,625,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 제5,770,429호; 제5,789,650호; 제5,814,318호; 제5,877,397호; 제5,874,299호; 및 제6,255,458호, 크림펜포트(Krimpenfort) 및 번스(Berns)에 대해 미국 특허 제5,591,669호 및 제6,023.010호, 번스 등에 대해 미국 특허 제5,612,205호; 제 5,721,367호; 및 제5,789,215호, 및 최(Choi) 및 던(Dunn)에 대해 미국 특허 제5,643,763호, 및 제네팜 인터네셔날 미국 특허 출원 일련 번호 제07/574,748호, 일련 번호 제07/575,962호, 일련 번호 제07/810,279호, 일련 번호 제07/853,408호, 일련 번호 제07/904,068호, 일련 번호 제07/990,860호, 일련 번호 제08/053,131호, 일련 번호 제08/096,762호, 일련 번호 제08/155,301, 일련 번호 제08/161,739호, 일련 번호 제08/165,699호, 일련 번호 제08/209,741호에 기재되어 있다. 또한 유럽 특허 제0　546　073　B1호, WO　92/03918, WO　92/22645, WO　92/22647, WO　92/22670, WO　93/12227, WO　94/00569, WO　94/25585, WO　96/14436, WO　97/13852, 및 WO　98/24884 및 미국 특허 제5,981,175호 참조. 추가로 문헌[Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), 및 Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996)] 참조.
키린(Kirin)은 또한 마이크로셀 융합을 통해, 거대 조각의 염색체 또는 전체 염색체가 도입된 마우스로부터의 인간 항체의 생성을 입증하였다. 유럽 특허 출원 제773　288호 및 제843　961호 참조. 제네렉스 바이오사이언시즈(Xenerex Biosciences)는 인간 항체의 잠재적 생성을 위한 기법을 개발 중에 있다. 이 기법에서, SCID 마우스는 인간 림프 세포, 예를 들어, B 및/또는 T 세포에 의해 재구성된다. 이어서, 마우스는 항원에 의해 면역화되고, 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 미국 특허 제5,476,996호; 제5,698,767호; 및 제5,958,765호 참조.
인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응은 키메라 또는 다른 인간화된 항체를 준비하기 위한 산업을 야기하였다. 그러나, 특정 인간 항-키메라 항체(HACA) 반응은 특히 항체의 만성 또는 다회 용량 이용에서 관찰될 것으로 예상된다. 따라서, HAMA 또는 HACA 반응의 우려 및/또는 효과를 해치기 위해 BCMA에 대한 인간 결합 도메인 및 CD3ε에 대한 인간 결합 도메인을 포함하는 항체 작제물을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
용어 "에 (특이적으로) 결합하다", (특이적으로) 인식하다", "로 (특이적으로) 향한다", 및 "(특이적으로) 와 반응하다"는 본 발명에 따르면 결합 도메인이 본 명세서의 표적 분자(항원)(각각 BCMA 및 CD3ε) 상의 주어진 에피토프 또는 주어진 표적 측과 상호작용하거나 또는 특이적으로 상호작용한다는 것을 의미한다.
용어 "에피토프"는 결합 도메인, 예컨대 항체 또는 면역글로불린, 또는 항체 또는 면역글로불린의 유도체, 단편 또는 변이체가 특이적으로 결합하는 항원측을 지칭한다. "에피토프"는 항원성이며, 따라서 용어 에피토프는 때대로 또한 본 명세서에서 "항원 구조" 또는 "항원 결정소"로서 지칭된다. 따라서, 결합 도메인은 "항원 상호작용측"이다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정하는 것으로 이해된다.
"에피토프"는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓이는 비인접한 아미노산 둘 다에 의해 형성될 수 있다. "선형 에피토프"는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 전형적으로 독특한 서열에서 적어도 3 또는 적어도 4, 및 더 보통으로는, 적어도 5 또는 적어도 6 또는 적어도 7, 예를 들어, 약 8 내지 약 10개의 아미노산을 포함한다.
선형 에피토프와 대조적으로 "입체배좌 에피토프"는 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이 인식된 에피토프(예를 들어, 아미노산의 1차 서열이 결합 도메인에 의해 반드시 인식되지 않는 에피토프)의 유일한 정의 성분이 아닌 에피토프이다. 전형적으로 입체배좌 에피토프는 선형 에피토프에 비해 증가된 수의 아미노산을 포함한다. 입체배좌 에피토프의 인식에 대해, 결합 도메인은 항원, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질 또는 이들의 단편의 3차원 구조를 인식한다(본 발명과 관련하여, 결합 도메인 중 하나에 대한 항원 구조는 표적 세포 표면 항원 단백질 내에 포함됨). 예를 들어, 단백질 분자가 3차원 구조를 형성하기 위해 폴딩될 때, 입체배좌 에피토프를 형성하는 특정 아미노산 및/또는 폴리펩타이드 골격은 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 하도록 나란히 놓이게 된다. 에피토프의 입체배좌를 결정하는 방법은 x-선 결정학, 2차원 핵자기 공명(2D-NMR) 분광학 및 부위 지정 스핀 표지법 및 전자 상자성 공명(EPR) 분광학을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
에피토프 맵핑을 위한 방법은 다음에 기재되어 있다: 인간 BCMA 단백질 내 영역(인접한 아미노산 신장)이 비-인간 및 비영장류 BCMA(예를 들어, 마우스 BCMA, 그러나 닭, 래트, 햄스터, 토끼 등과 같은 다른 것이 또한 가능함)의 대응하는 영역으로 교환/대체될 때, 결합 도메인이 사용한 비-인간, 비-영장류 BCMA에 대해 교차 반응성이 아니라면, 결합 도메인의 결합 감소가 일어날 것으로 예상된다. 상기 감소는 바람직하게는 인간 BCMA 단백질에서 각각의 영역에 대한 결합에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%; 더 바람직하게는 적어도 60%, 70% 또는 80%, 그리고 가장 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 100%이고, 이에 의해 인간 BCMA 단백질에서 각각의 영역에 대한 결합은 100%가 되는 것으로 설정된다. 앞서 언급한 인간 BCMA/비-인간 BCMA 키메라는 CHO 세포에서 발현되는 것으로 생각된다. 또한 인간 BCMA/비-인간 BCMA 키메라는 상이한 막-결합 단백질, 예컨대 EpCAM의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인과 융합된다는 것이 생각된다.
에피토프 맵핑을 위한 대안의 또는 추가적인 방법에서, 결합 도메인에 의해 인식된 특정 영역을 결정하기 위해 인간 BCMA 세포외 도메인의 몇몇 절단된 형태가 생성될 수 있다. 이들 절단된 형태에서, 상이한 세포외 BCMA 도메인/하위 도메인 또는 영역은 N-말단으로부터 시작해서 단계적으로 결실된다. 절단된 BCMA 형태는 CHO 세포에서 발현될 수 있다는 것이 생각된다. 또한 절단된 BCMA 형태는 상이한 막-결합 단백질, 예컨대 EpCAM의 막관통 도메인 및/또는 세포질 도메인과 융합될 수 있다는 것이 생각된다. 또한 절단된 BCMA 형태는 그들의 N-말단에서 신호 펩타이드 도메인, 예를 들어 마우스 IgG 중쇄 신호 펩타이드로부터 유래된 신호 펩타이드를 포함할 수 있다는 것이 생각된다. 더 나아가 절단된 BCMA 형태는 세포 표면 상에서 그들의 정확한 발현을 입증하는 것을 허용하는 그들의 N-말단에서 (신호 펩타이드 다음) v5 도메인을 포함할 수 있다는 것이 생각된다. 결합의 감소 또는 상실은 결합 도메인에 의해 인식되는 임의의 더 많은 BCMA 영역을 포함하지 않는 해당되는 절단된 BCMA 형태에 의해 일어나는 것으로 예상된다. 결합의 감소는 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; 더 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 그리고 가장 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 100%이며, 이에 의해 전체 인간 BCMA 단백질(또는 그의 세포외 영역 또는 도메인)에 대한 결합은 100가 되도록 설정된다.
항체 작제물 또는 결합 도메인에 의한 인식에 대한 BCMA의 특정 잔기의 기여를 결정하는 추가적인 방법은 알라닌 스캐닝이며(예를 들어, 문헌[Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7] 참조), 여기서, 분석될 각각의 잔기는, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발을 통해 알라닌으로 대체된다. 알라닌은, 그럼에도 불구하고 다수의 다른 아미노산이 갖는 2차 구조 기준을 모방하는, 그의 비-벌키(non-bulky), 화학적 비활성, 메틸 작용기 때문에 사용된다. 때때로, 벌키 아미노산, 예컨대 발린 또는 류신은 돌연변이 잔기의 크기 보존이 요망되는 경우에 사용될 수 있다. 알라닌 스캐닝은 긴 시간 기간 동안 사용된 성숙 기법이다.
결합 도메인과 에피토프 또는 에피토프를 포함하는 영역 사이의 상호작용은 결합 도메인이 특정 단백질 또는 항원(본 명세서에서: 각각 BCMA 및 CD3) 상에서 에피토프/에피토프를 포함하는 영역에 대한 인식 가능한 친화도를 나타내고, 그리고 일반적으로, BCMA 또는 CD3 이외의 단백질 또는 항원과의 상당한 반응성을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다. "인식 가능한 친화도"는 약 10-6M(KD) 또는 더 강한 친화도를 갖는 결합을 포함한다. 바람직하게는, 결합 친화도가 약 10-12 내지 10-8M, 10-12 내지 10-9M, 10-12 내지 10-10M, 10-11 내지 10-8M, 바람직하게는 약 10-11 내지 10-9M일 때, 결합은 특이적인 것으로 고려된다. 결합 도메인이 표적과 특이적으로 상호작용하거나 또는 결합하는지의 여부는, 특히, 상기 결합 도메인과 표적 단백질 또는 항원의 반응을 상기 결합 도메인과 BCMA 또는 CD3 이외의 단백질 또는 항원의 반응과 비교함으로써 용이하게 시험될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 도메인은 BCMA 또는 CD3 이외의 단백질 또는 항원에 본질적으로 또는 실질적으로 결합하지 않는다(즉, 제1 결합 도메인은 BCMA 이외의 단백질에 결합할 수 없고, 제2 결합 도메인은 CD3 이외의 단백질에 결합할 수 없다). 다른 HLE 형식에 비해 우수한 친화도 특징을 갖는 본 발명에 따른 항체 작제물의 특징이 생각된다. 결과에서 이러한 우수한 친화도는 생체내에서 연장된 반감기를 시사한다. 본 발명에 따른 항체 작제물의 더 긴 반감기는 전형적으로 개선된 환자 순응도에 기여하는 투여의 지속기간 및 빈도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 항체 작제물은 고도로 쇠약하거나 또는 심지어 다중질환(multimorbide) 암 환자에 대해 특히 유리하기 때문에 이는 특히 중요하다.
용어 "본질적으로/실질적으로 결합하지 않는" 또는 "결합할 수 없는"은 본 발명의 결합 도메인이 BCMA 또는 CD3 이외의 단백질 또는 항원에 결합하지 않으며, 즉, BCMA 또는 CD3 이외의 단백질 또는 항원과의 30% 초과의 반응성을 나타내지 않고(바람직하게는 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 이하), 이에 의해 BCMA 또는 CD3에 대한 결합은 각각 100%가 되는 것으로 설정된다는 것을 의미한다.
특이적 결합은 결합 도메인 및 항원의 아미노산 서열에서 특이적 모티프에 의해 달성될 것으로 여겨진다. 따라서, 결합은 그들의 1차, 2차 및/또는 3차 구조의 결과로서 뿐만 아니라 상기 구조의 2차 변형의 결과로서 달성된다. 항원-상호작용-측면과 그의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 항원의 상기 측면의 단순한 결합을 초래할 수 있다. 게다가, 항원-상호작용-측면과 그의 특이적 항원의 특이적 상호작용은 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어, 항원의 입체배좌 변화, 즉, 항원의 올리고머화 등의 유도에 기인하여 신호의 개시를 초래할 수 있다.
용어 "가변적"은 그들의 서열에서 가변성을 나타내고 그리고 특정 항체(즉, "가변 도메인(들)")의 특이성 및 결합 친화도를 결정하는 데 수반되는 항체 또는 면역글로불린 도메인의 일부를 지칭한다. 가변 중쇄(VH)와 가변 경쇄(VL)의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다.
가변성은 항체의 가변 도메인 전체적으로 균일하게 분포되지 않으며; 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서브도메인에 집중된다. 이들 서브 도메인은 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불린다. 가변 도메인의 더 보존된(즉, 비-초가변성) 부분은 "프레임워크" 영역(FRM 또는 FR)으로 불리고, 항원-결합 표면을 형성하기 위해 3차원 공간에서 6개의 CDR에 대한 스캐폴드를 제공한다. 천연 유래 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 β시트 구조의 부분을 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 β시트 입체배치를 대부분 채택하는 4개의 FRM 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FR메 의해 근위에 함께 보유되고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항원-결합 측면의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., 상기 인용 문헌] 참조).
용어 "CDR" 및 그의 복수의 "CDR"은 상보성 결정 영역을 지칭하는데, 이중 3개는 경쇄 가변 영역의 결합 특징을 구성하고(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3), 3개는 중쇄 가변 영역의 결합 특징을 구성한다(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3). CDR은 항체와 항원의 특이적 상호작용을 초래하는 대부분의 잔기를 포함하며, 따라서, 항체 분자의 기능적 활성에 기여한다: 그들은 항원 특이성의 주된 결정소이다.
정확한 정의의 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 넘버링 시스템의 대상이다. 따라서 CDR은 카바트(Kabat), 코티아(Chothia), 컨택트(contact) 또는 본 명세서에 기재된 넘버링 시스템을 포함하는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 상이한 경계에도 불구하고, 각각의 이들 시스템은 가변 서열 내에서 소위 "초가변 영역"을 구성하는 것에서 일정한 중복 정도를 가진다. 따라서 이들 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역에 대해 길이 및 경계 면적이 상이할 수 있다. 예를 들어, 카바트(교차종 서열 가변성에 기반한 접근), 코티아(항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기반한 접근) 및/또는 맥칼룸(MacCallum)(Kabat et al., 상기 인용 문헌; Chothia et al., J. MoI. Biol,1987,196: 901-917; 및 MacCallum et al., J. MoI. Biol,1996,262: 732) 참조. 항원 결합 측면을 특성규명하기 위한 또 다른 표준은 옥스포드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody modeling software)에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 예를 들어, 문헌[Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)] 참조. 두 잔기 동정 기법이 중복 영역을 정하지만, 동일한 영역은 아닌 정도로, 그들은 혼성 CDR을 정하도록 조합될 수 있다. 그러나, 소위 카바트 시스템에 따른 넘버링이 바람직하다.
전형적으로, CDR은 정규 구조로서 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "정규 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주요쇄 입체배좌를 지칭한다. 비교를 통한 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개는 이용 가능한 입체배좌의 제한된 레퍼토리만을 갖는 것으로 발견되었다. 각각의 정규 구조는 폴리펩타이드 골격의 비틀림 각도에 의해 특성규명될 수 있다. 따라서, 항체 사이의 대응하는 루프는 대부분의 루프에서 높은 아미노산 서열 가변성에도 불구하고, 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800). 더 나아가, 채택된 루프 구조와 그를 둘러싸는 아미노산 서열 사이에 관계가 있다. 특정 정규 분류의 입체배좌는 루프의 길이 및 루프 내의 중요한 위치에서 뿐만 아니라 보존된 프레임워크 내에(즉, 루프 외부에) 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서 특정 정규 분류에 대한 배치는 이들 중요한 아미노산 잔기의 존재에 기반하여 이루어질 수 있다.
용어 "정규 구조"는 또한, 예를 들어, 카바트에 의해 목록이 만들어진 항체의 선형 서열에 관한 고려사항을 포함할 수 있다(Kabat et al., 상기 인용 문헌). 카바트 넘버링 계획(시스템)은 일관된 방식으로 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위해 널리 채택된 표준이며, 본 명세서의 다른 곳에서 또한 언급되는 본 발명에 적용되는 바람직한 계획이다. 추가적인 구조적 고려사항은 또한 항체의 정규 구조를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카바트 넘버링에 의해 완전히 반영되지 않는 해당되는 차이는 코티아 등의 넘버링 시스템에 의해 기재될 수 있고/있거나 다른 기법, 예를 들어, 결정학 및 2- 또는 3-차원 컴퓨터 모델링에 의해 나타날 수 있다. 따라서, 주어진 항체 서열은, 특히, (예를 들어, 라이브러리에서 다양한 정규 구조를 포함하기 위한 바람에 기반하여) 적절한 섀시(chassis) 서열의 동정을 허용하는 정규 분류에 놓일 수 있다. 항체 구조의 정규 양상을 구성하기 위해 문헌[Chothia et al., 상기 인용 문헌 및 그의 참고문헌)에 의해 기재되는 항체 아미노산 서열 및 구조적 고려사항의 카바트 넘버링은 문헌에 기재되어 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 당업계에 잘 공지되어 있다. 항체 구조의 검토를 위해, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988] 참조.
경쇄의 CDR3 및 특히 중쇄의 CDR3은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내의 항원 결합에서 가장 중요한 결정소를 구성할 수 있다. 일부 항체 작제물에서, 중쇄 CDR3은 항원과 항체 사이의 주요 접촉 면적을 구성하는 것으로 나타났다. CDR3 단독이 변하는 시험관내 선택 계획은 항체의 결합 특성을 달리 하기 위해 또는 잔기가 항원 결합에 기여하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, CDR3은 전형적으로 항체-결합측면 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, H3은 2개 아미노산 잔기만큼 짧거나 또는 26개 초과의 아미노산일 수 있다.
고전적 전장 항체 또는 면역글로불린에서, 각각의 경쇄(L)는 하나의 공유적 이황화결합에 의해 중쇄(H)에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라서 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. VH에 가장 근접한 CH 도메인은 보통 CH1로서 표기된다. 불변("C") 도메인은 항원 결합에 직접적으로 연루되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적, 세포-매개 세포독성 및 상보체 활성화를 나타낸다. 항체의 Fc 영역은 중쇄 불변 도메인 내에 포함되며, 예를 들어, 세포 표면에 위치된 Fc 수용체와 상호작용할 수 있다.
조립체 및 체세포 돌연변이 후에 항체 유전자의 서열은 크게 변화되며, 이들 변화된 유전자는 1010개의 상이한 항체 분자를 암호화하는 것으로 추정된다(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). 따라서, 면역계는 면역글로불린의 레퍼토리를 제공한다. 용어 "레퍼토리"는 적어도 하나의 면역글로불린을 암호화하는 적어도 하나의 서열로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 서열(들)은 중쇄의 V, D 및 J 세그먼트, 및 경쇄의 V 및 J 세그먼트의 생체내 재배열에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 서열(들)은 재배열이, 예를 들어 시험관내 자극에서 생기는 반응 내 세포로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 서열(들)의 부분 또는 모두는 DNA 스플라이싱, 뉴클레오타이드 합성, 돌연변이유발, 및 기타 방법에 의해 얻을 수 있다, 예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호 참조. 레퍼토리는 단지 하나의 서열을 포함할 수 있거나 또는유전적으로 다양한 수집물 중의 하나를 포함하는 복수의 서열을 포함할 수 있다.
용어 "Fc 부분" 또는 "Fc 단량체"는 본 발명과 관련하여 CH2 도메인의 기능을 갖는 적어도 하나의 도메인 및 면역글로불린 분자의 CH3 도메인의 기능을 갖는 적어도 하나의 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 "Fc 단량체"로부터 명확하게, 해당 CH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 "폴리펩타이드 단량체"이다. Fc 단량체는 중쇄(CH1)의 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하지만, 하나의 CH2 도메인의 적어도 기능적 부분 및 하나의 CH3 도메인의 기능적 부분을 유지하는 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 단편을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있되, CH2 도메인은 CH3 도메인에 대해 아미노 말단이다. 본 정의의 바람직한 양상에서, Fc 단량체는 Ig-Fc 힌지 영역의 일부, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 폴리펩타이드 불변 영역일 수 있되, 힌지 영역은 CH2 도메인에 대해 아미노 말단이다. 본 발명의 힌지 영역은 이량체화를 촉진시키는 것으로 생각된다. 이러한 Fc 폴리펩타이드 분자는, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 면역글로불린 영역의 파파인 분해에 의해 얻을 수 있다(물론 2개의 Fc 폴리펩타이드의 이량체를 초래함). 본 정의의 다른 양상에서, Fc 단량체는 CH2 영역 및 CH3 영역의 일부를 포함하는 폴리펩타이드 영역이리 수 있다. 이러한 Fc 폴리펩타이드 분자는, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 면역글로불린 분자의 펩신 분해에 의해 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, Fc 단량체의 폴리펩타이드 서열은 IgG1 Fc 영역, IgG2 Fc 영역, IgG3 Fc 영역, IgG4 Fc 영역, IgM Fc 영역, IgA Fc 영역, IgD Fc 영역 및 IgE Fc 영역의 Fc 폴리펩타이드 서열과 실질적으로 유사하다. (예를 들어, 문헌[Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)] 참조). 면역글로불린 사이에 일부 변이가 있기 때문에, 명확함을 위해, Fc 단량체는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 중쇄 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 중쇄 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 상기 언급한 바와 같이, Fc 단량체는 또한 이들 도메인에 대해 가요성 힌지 N-말단을 포함할 수 있다. IgA 및 IgM에 대해, Fc 단량체는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해, Fc 부분은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3, 및 제1의 2개 도메인과 CH2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 부분의 경계는 변할 수 있지만, 기능성 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG 중쇄 Fc 부분에 대한 예는, 예를 들어, (힌지 도메인의 - 이하의 표 1의 D234에 대응) 잔기 D231 내지 P476, CH3 도메인의 카복실-말단의 L476(IgG4에 대해)을 각각 포함하는 것으로 정의될 수 있되, 넘버링은 카바트에 따른다. 펩타이드 링커를 통해 서로 융합되는 Fc 단량체의 2개 Fc 부분은 또한 scFc 도메인으로서 정의될 수 있는 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인을 정한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 scFc 도메인, 각각 서로 융합된 Fc 단량체는 항체 작제물의 제3 도메인에만 포함된다는 것이 생각된다.
본 발명과 관련하여, IgG 힌지 영역은 표 1에 제시된 바와 같은 카바트 넘버링을 이용하는 유추에 의해 동정될 수 있다. 상기와 관련하여, 본 발명의 힌지 도메인/영역은 카바트 넘버링에 따라 D234 내지 P243의 IgG1 서열 신장에 대응하는 아미노산 장기를 포함한다는 것이 생각된다. 마찬가지로, 본 발명의 힌지 도메인/영역은 IgG1 힌지 서열 DKTHTCPPCP(서열번호 99)를 포함하거나 또는 이것으로 이루어진다는 것이 생각된다(이하의 표 1에 나타낸 바와 같은 신장 D234 내지 P243에 대응- 상기 서열의 변형이 또한 생각되되, 단, 힌지 영역은 이량체화를 여전히 촉진시킴). 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체 작제물의 제3 도메인 내 CH2 도메인의 카바트 위치 314에서 글리코실화 부위는 N314X 치환에 의해 제거되되, X는 Q를 제외한 임의의 아미노산이다. 상기 치환은 바람직하게는 N314G 치환이다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 CH2 도메인은 다음의 치환(카바트에 따른 위치)을 추가로 포함한다: V321C 및 R309C(이들 치환은 카바트 위치 309 및 321에서 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 도입함).
또한 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인은 아미노에서 카복실 순서로 포함하거나 또는 이루어진다는 것이 생각된다: DKTHTCPPCP(서열번호　99)(즉, 힌지) -CH2-CH3-링커-DKTHTCPPCP(서열번호 99)(즉, 힌지)-CH2-CH3. 앞서 언급한 항체 작제물의 펩타이드 링커는 바람직한 실시형태에서 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, 즉, Gly4Ser(서열번호　1), 또는 이의 중합체, 즉, (Gly4Ser)x를 특징으로 하며, x는 5 이상의 정수(예를 들어, 5, 6, 7, 8등 이상)이며, 6이 바람직하다((Gly4Ser)6). 상기 작제물은 추가로 앞서 언급한 치환 N314X, 바람직하게는 N314G, 및/또는 추가로 치환 V321C 및 R309C를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에서, 제2 도메인이 인간 및/또는 마카카 CD3ε쇄의 세포외 에피토프에 결합한다는 것이 생각된다.
본 발명의 추가 실시형태에서, 힌지 도메인/영역은 IgG2 서브타입 힌지 서열 ERKCCVECPPCP(서열번호　100), IgG3 서브타입 힌지 서열 ELKTPLDTTHTCPRCP(서열번호　101) 또는 ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호　103), 및/또는 IgG4 서브타입 힌지 서열 ESKYGPPCPSCP(서열번호　102)를 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. IgG1 서브타입 힌지 서열은 다음의 것일 수 있다: EPKSCDKTHTCPPCP(표 1 및 서열번호　104에 나타낸 바와 같음). 따라서 이들 코어 힌지 영역이 본 발명과 관련하여 생각된다.
IgG CH2 및 IgG CD3 도메인의 위치 및 서열은 표 2에 제시한 바와 같은 카바트 넘버링을 이용하여 유추에 의해 동정될 수 있다:
본 발명의 일 실시형태에서, 제1 또는 Fc 단량체 둘 다의 CH3 도메인에서 강조된 볼드체 아미노산 잔기는 결실된다.
제3 도메인의 폴리펩타이드 단량체("Fc 부분" 또는 "Fc 단량체")가 서로 융합된 펩타이드 링커는 바람직하게는 적어도 25개의 아미노산 잔기(25, 26, 27, 28, 29, 30 등)를 포함한다. 더 바람직하게는, 이 펩타이드 링커는 적어도 30개의 아미노산 잔기(30, 31, 32, 33, 34, 35 등)을 포함한다. 또한 링커는 40개까지의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 35개까지의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 정확히 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 펩타이드 링커의 바람직한 실시형태는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, 즉, Gly4Ser(서열번호　1), 또는 이의 중합체, 즉, (Gly4Ser)x를 특징으로 하며, x는 5 이상(예를 들어, 6, 7 또는 8)의 정수이다. 바람직하게는 정수는 6 또는 7이며, 더 바람직하게는 정수는 6이다.
제2 도메인에 제1 도메인을, 또는 제3 도메인에 제1 도메인 또는 제2 도메인을 융합시키기 위해 링커가 사용된다면, 이 링커는 바람직하게는 각각의 제1 도메인 및 제2 도메인이 서로 독립적으로 그들의 상이한 결합 특이성을 보유할 수 있다는 것을 보장하기에 충분한 길이 및 서열을 가진다. 본 발명의 항체 작제물 내 적어도 2개의 결합 도메인(또는 2개의 가변 도메인)을 연결하는 펩타이드 링커에 대해, 단지 소수의 아미노산 잔기, 예를 들어, 12 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 해당 펩타이드 링커가 바람직하다. 따라서, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 아미노산 잔기의 펩타이드 링커가 바람직하다. 5개 미만의 아미노산(4, 3, 2 또는 1개의 아미노산(들)을 포함)을 갖는 펩타이드 링커가 생각되되, Gly-풍부 링커가 바람직하다. 제1 도메인과 제2 도메인의 융합을 위한 펩타이드 링커의 바람직한 실시형태는 서열번호 1에 도시된다. 제2 도메인과 제3 도메인의 융합을 위한 펩타이드 링커의 바람직한 링커 실시형태는 G4-링커로도 불리는 (Gly) 4-링커이다.
상기 기재한 "펩타이드 링커" 중 하나와 관련하여 특히 바람직한 "단일" 아미노산은 Gly이다. 따라서, 상기 펩타이드 링커는 단일 아미노산 Gly으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 펩타이드 링커는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, 즉, Gly4Ser(서열번호　1), 또는 이의 중합체, 즉, (Gly4Ser)x를 특징으로 하며, x는 1 이상(예를 들어, 2 또는 3)의 정수이다. 바람직한 링커는 서열번호 1 내지 12에 도시된다. 2차 구조 촉진의 부재를 포함하는 상기 펩타이드 링커의 특징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) 및 Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)]에 기재되어 있다. 더 나아가 임의의 2차 구조를 촉진시키지 않는 펩타이드 링커가 바람직하다. 상기 도메인의 서로에 대한 연결은 실시예에 기재하는 바와 같이, 예를 들어 유전자 조작에 의해 제공될 수 있다. 융합된 그리고 조작적으로 연결된 이중특이성 단일쇄 작제물을 제조하고 포유류 세포 또는 박테리아에서 그들을 발현시키기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, WO　99/54440 또는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001]).
항체 작제물 또는 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 제1 도메인 및 제2 도메인은 (scFv)2, scFv-단일 도메인 mAb, 다이어바디 및 임의의 해당 형식의 올리고머로 이루어진 군으로부터 선택된 형식으로 항체 작제물을 형성한다.
특히 바람직한 실시형태에 따르면, 그리고 첨부하는 실시형태에서 기록하는 바와 같이, 본 발명의 항체 작제물의 제1 도메인 및 제2 도메인은 "이중특이성 단일쇄 항체 작제물", 더 바람직하게는 이중특이성 "단일쇄 Fv" (scFv)이다. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 그들은 VL과 VH 영역이 짝지어져서 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 그들이 생성되도록 하는 것을 가능하게 하는 -본 명세서에 앞서 기재한 바와 같은- 합성 링커에 의한 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다; 예를 들어, 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883] 참조. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 이용하여 얻어지며, 단편은 전체 또는 전장 항체와 동일한 방식으로 기능에 대해 평가된다. 따라서 단일쇄 가변 단편(scFv)은 보통 약 10 내지 약 25개의 아미노산, 바람직하게는 약 15 내지 20개의 아미노산의 짧은 펩타이드와 연결된 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 보통 가요성을 위해 글리신뿐만 아니라 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결하거나, 또는 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다.
이중특이성 단일쇄 항체 작제물은 당업계에 공지되어 있으며, WO　99/54440, 문헌[Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92,7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, , Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, , Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293,41-56]에 기재되어 있다. 단일쇄 항체의 생성에 대해 기재한 기법(특히, 미국 특허 제4,946,778호, 문헌[Kontermann and (2010), 상기 인용 문헌 및 Little (2009), 상기 인용 문헌] 참조)은 선택된 표적(들)을 특이적으로 인식하는 단일쇄 항체 작제물에 적합할 수 있다.
2가(또한 이가로 불림) 또는 이중특이성 단일쇄 가변 단편(형식(scFv)2 를 갖는 바이-scFv 또는 다이-scFv)은 2개의 scFv 분자를 (예를 들어 본 명세서에서 앞서 기재한 바와 같은 링커에 의해) 연결함으로써 조작될 수 있다. 이들 2개의 scFv 분자가 동일한 결합 특이성을 가진다면, 얻어진(scFv)2 분자는 바람직하게는 2가로 불릴 것이다(즉, 동일한 표적 에피토프에 대해 2개의 원자가를 가짐). 2개의 scFv 분자가 상이한 결합 특이성을 가진다면, 얻어진 (scFv)2 분자는 바람직하게는 이중특이성으로 불릴 것이다. 2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역을 갖는 단일 펩타이드 쇄를 생성하여, 탠덤 scFv를 수득함으로써 연결이 행해질 수 있다(예를 들어, 문헌[Kufer　P. et al., (2004) Trends in Biotechnology　22(5):238-244] 참조). 다른 가능성은 2개의 가변 영역이 함께 폴딩되기에 너무 짧아서 scFv가 이량체화되게 하는 링커 펩타이드(예를 들어, 약 5개의 아미노산)를 갖는 scFv 분자의 생성이다. 이 유형은 다이어바디로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America　90　(14): 6444-8] 참조).
본 발명과 관련하여, 제1 도메인, 제2 도메인 또는 제1 도메인과 제2 도메인은 단일 도메인 항체, 각각 단일 도메인 항체의 가변 도메인 또는 적어도 CDR을 포함할 수 있다. 단일 도메인 항체는 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 특이적 항체에 선택적으로 결합할 수 있는 단지 하나의(단량체) 항체 가변 도메인을 포함한다. 제1 단일 도메인 항체는 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되고, 이들은 VHH 단편으로 불린다. 연골어류는 또한 VNAR 단편으로 불리는 단일 도메인 항체가 얻어질 수 있는 중쇄 항체(IgNAR)를 가진다. 대안의 접근은 공통 면역글로불린으로부터의, 예를 들어 인간 또는 설치류로부터의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하고, 따라서, 단일 도메인 Ab로서 VH 또는 VL을 얻는다. 단일 도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 도메인에 기반하지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디는 또한 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 단일 도메인 항체의 예는 sdAb, 나노바디 또는 단일 가변 도메인 항체로 불린다.
따라서 (단일 도메인 mAb)2는 VH, VL, VHH 및 VNAR을 포함하는 군으로부터 개개로 선택되는 (적어도) 2개의 단일 도메인 단클론성 항체로 구성된 단클론성 항체 작제물이다. 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커의 형태이다. 유사하게, "scFv-단일 도메인 mAb"는 상기 기재한 바와 같은 적어도 하나의 단일 도메인 항체 및 상기 기재한 바와 같은 하나의 scFv 분자로 구성된 단클론성 항체 작제물이다. 또한, 링커는 바람직하게는 펩타이드 링커의 형태이다.
항체 작제물이 다른 주어진 항체 작제물과의 결합을 위해 경쟁하는지의 여부는 경쟁적 ELISA 또는 세포 기반 경쟁 분석과 같은 경재 분석에서 측정될 수 있다. 아비딘-결합 마이크로입자(비드)가 또한 사용될 수 있다. 아비딘-코팅된 ELISA 플레이트와 유사하게, 바이오틴일화된 단백질과 경쟁할 때, 각각의 이들 비드는 분석이 수행될 수 있는 기질로서 사용될 수 있다. 항원은 비드 상에 코팅되고, 이어서, 제1 항체로 사전 코팅된다. 제2 항체가 첨가되며, 임의의 추가적인 결합이 결정된다. 판독을 위한 가능한 수단은 유세포 분석을 포함한다.
T 세포 또는 T 림프구는 세포 매개 면역에서 중추적 역할을 하는 림프구의 유형이다(그 자체가 백혈구의 유형임). 각각 별개의 기능을 갖는 T 세포의 몇몇 서브세트가 있다. T 세포는 세포 표면 상의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 NK 세포와 구별될 수 있다. TCR은 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합되고 2개의 상이한 단백질 쇄로 구성된 항원 인식을 초래한다. 95%의 T 세포에서, TCR은 알파(α) 및 베타(β) 쇄로 이루어진다. TCR이 항원 펩타이드 및 MHC(펩타이드/MHC 복합체)와 맞물릴 때, T 림프구는 연관된 효소, 공동 수용체, 전문화된 어댑터 분자 및 활성화된 또는 방출된 전사 인자에 의해 매개된 일련의 생화학적 사건을 통해 활성화된다.
CD3 수용체 복합체는 단백질 복합체이고, 4개의 쇄로 구성된다. 포유류에서, 복합체는 CD3γ(감마) 쇄, CD3δ(델타) 쇄 및 2개의 CD3ε(엡실론) 쇄를 포함한다. 이들 쇄는 T　세포 수용체 CD3 복합체를 형성하기 위해 그리고 T 림프구 내 활성화 신호를 생성하기 위해 T 세포 수용체(TCR) 및 소위 ζ(제타) 쇄와 연결된다. CD3γ감마), CD3δ(델타) 및 CD3ε(엡실론) 쇄는 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 분자의 세포내 꼬리는 단축을 위한 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 단일 보존된 모티프를 포함하는데, 이는 TCR의 신호전달 능력에 필수적이다. CD3 엡실론 분자는 염색체 11 상에 존재하는 인간이 CD3E 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드이다. CD3 엡실론의 가장 바람직한 에피토프는 인간 CD3　엡실론 세포외 도메인의 아미노산 잔기 1 내지 27 내에 포함된다. 본 발명에 따른 항체 작제물은 전형적으로 그리고 유리하게는 특정 면역요법에서 요망되지 않는 더 적은 비특이적 T 세포 활성화를 나타낸다는 것이 생각된다. 이는 부작용의 감소된 위험으로 전환된다.
다중특이성, 적어도 이중특이성, 항체 작제물에 의한 T 세포의 동원을 통한 표적 세포의 재지시된 용해는 세포용해 시냅스 형성 및 퍼포린과 그랜자임의 전달을 수반한다. 맞물린 T 세포는 일련의 표적 세포 용해를 가능하게 하고, 펩타이드 항원 가공 및 제시, 또는 클론의 T 세포 분화를 방해하는 면역 탈출에 의해 영향받지 않는다; 예를 들어, WO　2007/042261 참조.
본 발명의 항체 작제물에 의해 매개되는 세포독성은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 효과기 세포는, 예를 들어, 자극된 농축(인간) CD8 양성 T 세포 또는 비자극(인간) 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)일 수 있다. 표적 세포가 마카크 유래이거나 또는 제1 도메인에 의해 결합되는 마카크 BCMA에 의해 발현되거나 또는 형질감염된다면, 효과기 세포는 또한 마카크 유래, 예컨대 마카크 T 세포주, 예를 들어 4119LnPx를 가져야 한다. 표적 세포는 BCMA, 예를 들어, 인간 또는 마카크 BCMA (의 적어도 세포외 도메인)을 발현시켜야 한다. 표적 세포는 BCMA, 예를 들어, 인간 또는 마카크 BCMA로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염되는 세포주(예컨대 CHO)일 수 있다. 대안적으로, 표적 세포는 BCMA 양성 천연 발현자 세포주, 예컨대 인간 다발성 골수종 세포주 L363 또는 NCI-H929일 수 있다. 보통 EC50 값은 세포 표면 상에서 더 고수준의 BCMA를 발현시키는 표적 세포주에 의해 더 낮아지는 것으로 예상된다. 효과기 대 표적 세포(E:T) 비는 보통 10:1이지만, 또한 변할 수 있다. BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 세포독성 활성은 51Cr-방출 분석(약 18시간의 인큐베이션 시간)에서 또는 FACS-기반 세포독성 분석(약 48시간의 인큐베이션 시간)에서 측정될 수 있다. 분석 인큐베이션 시간(세포독성 반응)의 변형이 또한 가능하다. 세포독성을 측정하는 다른 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, MTT 또는 MTS 분석, 생발광 분석을 포함하는 ATP-기반 분석, 설포로다민 B(SRB) 분석, WST 분석, 집락형성 분석법 및 ECIS 기법을 포함한다.
본 발명의 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물에 의해 매개되는 세포독성 활성은 바람직하게는 세포기반 세포독성 분석에서 측정된다. 이는 또한 51Cr-방출 분석에서 측정될 수 있다. 이는 절반 최대 유효 농도(기준과 최대값 사이의 세포독성 반응을 불완전하게 유도하는 항체 작제물의 농도)에 대응하는 EC50 값으로 나타낸다. 바람직하게는, BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 EC50 값은 ≤5000pM 또는 ≤4000pM, 더 바람직하게는 ≤3000pM 또는 ≤2000pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤1000pM 또는 ≤500pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤400pM 또는 ≤300pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤200pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤100pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤50pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤20pM 또는 ≤10pM, 및 가장 바람직하게는 ≤5pM이다.
상기 주어진 EC50 값은 상이한 분석에서 측정될 수 있다. 당업자는 EC50 값은 자극된/농축된 CD8+ T 세포가 비자극 PBMC에 비교하여 효과기 세포로서 사용될 때 더 낮아지는 것으로 예상될 수 있다는 것을 인식한다. 더 나아가 표적 세포가 낮은 표적 발현 래트에 비해 다수의 BCMA를 발현시킬 때 EC50 값은 더 낮은 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 자극/농축된 인간 CD8+ T 세포가 효과기 세포로서 사용될 때(그리고 BCMA 형질감염 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 BCMA 양성 인간 세포주는 표적 세포로서 사용됨), BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 EC50 값은 바람직하게는 ≤1000pM, 더 바람직하게는 ≤500pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤250pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤100pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤50pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤10pM, 및 가장 바람직하게는 ≤5pM이다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용될 때, BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 EC50 값은 바람직하게는 ≤5000pM 또는 ≤4000pM (특히 표적 세포가 BCMA 양성 인간 세포주일 때), 더 바람직하게는 ≤2000　pM(특히 표적 세포가 BCMA 형질감염 세포, 예컨대 CHO 세포일 때), 더 바람직하게는 ≤1000pM 또는 ≤500pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤200pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤150pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤100pM, 및 가장 바람직하게는 ≤50pM 이하이다. 마카크 T 세포주, 예컨대 LnPx4119가 효과기 세포로서 사용되고, 그리고 마카크 BCMA 형질감염 세포주, 예컨대 CHO 세포가 표적 세포주로서 사용될 때, BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 EC50 값은 바람직하게는 ≤2000pM 또는 ≤1500pM, 더 바람직하게는 ≤1000pM 또는 ≤500pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤300pM 또는 ≤250pM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤100pM, 및 가장 바람직하게는 ≤50pM이다.
바람직하게는, 본 발명의 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물은 용해를 유도/매개하지 않거나 또는 BCMA 음성 세포, 예컨대 CHO 세포, 또는 HL60, MES-SA, 또는 SNU-16 세포의 용해를 본질적으로 유도/매개하지 않는다. 용어 "용해를 유도하지 않는다", "용해를 본질적으로 유도하지 않는다", "용해를 매개하지 않는다" 또는 "용해를 본질적으로 매개하지 않는다"는 본 발명의 항체 작제물이 30% 초과의 용해를 유도하거나 또는 매개하지 않음으로써(바람직하게는 20% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 특히 바람직하게는 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 이하의 BCMA 음성 세포), BCMA 양성 인간 세포주의 용해가 100%로 설정된다는 것을 의미한다. 이는 보통 500　nM까지의 항체 작제물 농도에 적용된다. 당업자는 추가적인 고심 없이 세포 용해를 측정하는 방법을 안다. 게다가, 본 명세서는 세포 용해를 측정하는 특정 지침을 교시한다.
개개 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 단량체와 이량체 아이소폼 사이의 세포독성 활성 차이는 "효력 갭(potency gap)"으로서 지칭된다. 이 효력 갭은, 예를 들어, 분자의 단량체와 이량체 형태의 EC50 값 사이의 비로서 계산될 수 있다. 본 발명의 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 효력 갭은 바람직하게는 ≤　5, 더 바람직하게는 ≤　4, 훨씬 더 바람직하게는 ≤　3, 훨씬 더 바람직하게는 ≤　2 및 가장 바람직하게는 ≤　1이다.
본 발명의 항체 작제물의 제1 및/또는 제2 (또는 임의의 추가적인) 결합 도메인(들)은 바람직하게는 영장류 목의 포유류 구성원에 특이적인 교차종이다. 교차종 특이적 CD3 결합 도메인은, 예를 들어, WO　2008/119567에 기재되어 있다. 일 시형태에 따르면, 인간 BCMA 및 인간 CD3에 대한 결합에 추가로 제1 결합 도메인 및/또는 제2 결합 도메인은 각각 또한 신세계 영장류(예컨대, 비단마모셋, 솜털머리타마린 또는 다람쥐 원숭이), 구세계 영장류(개코원숭이 및 마카크), 깁본 및 비-인간 사람아과(homininae)를 포함하는(이들로 제한되지 않음) 영장류의 BCMA/CD3에 결합할 것이다.
본 발명의 항체 작제물의 일 실시형태에서, 제1 도메인은 인간 BCMA에 결합하고, 마카크 BCMA, 예컨대 필리핀원숭이의 BCMA에, 및 더 바람직하게는, 표면 마카크 세포 상에서 발현된 마카크 BCMA에 추가로 결합한다. BCMA에 대한, 바람직하게는 인간 BCMA에 대한 제1 도메인의 친화도는 바람직하게는 ≤100nM 또는 ≤50nM, 더 바람직하게는 ≤25nM 또는 ≤20nM, 더 바람직하게는 ≤15nM 또는 ≤10nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤5nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤2.5nM 또는 ≤2nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤1nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤0.6nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤0.5nM, 및 가장 바람직하게는 ≤0.4　nM이다. 친화도는, 예를 들어 비아코어 분석에서, 또는 스캐차드 분석(Scatchard assay)에서 측정될 수 있다. 친화도를 결정하는 다른 방법은 또한 당업자에게 잘 공지되어 있다. 마카크 BCMA에 대한 제1 도메인의 친화도는 바람직하게는 ≤15nM, 더 바람직하게는 ≤10nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤5nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤1nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤0.5nM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤0.1nM, 및 가장 바람직하게는 ≤0.05nM 또는 심지어 ≤0.01nM이다.
바람직하게는 마카크 BCMA 대 인간 BCMA[ma BCMA　:　hu BCMA]에 결합하기 위한 본 발명에 따른 항체 작제물의 친화도 갭은(예를 들어, 비아코어에 의해 또는 스캐차드 분석에 의해 결정함) <100, 바람직하게는 <20, 더 바람직하게는 <15, 추가로 바람직하게는 <10, 훨씬 더 바람직하게는 <8, 더 바람직하게는 <6 및 가장 바람직하게는 <2이다. 마카크 BCMA 대 인간 BCMA에 결합하기 위한 본 발명에 따른 항체 작제물의 친화도 갭에 대한 바람직한 범위는 0.1 내지 20, 더 바람직하게는 0.2 내지 10, 훨씬 더 바람직하게는 0.3 내지 6, 훨씬 더 바람직하게는 0.5 내지 3 또는 0.5 내지 2.5, 및 가장 바람직하게는 0.5 내지 2 또는 0.6 내지 2이다.
본 발명의 항체 작제물의 제2 도메인은 인간 CD3 엡실론 및/또는 마카카 CD3 엡실론에 결합한다. 바람직한 실시형태에서 제2 도메인은 비단마모셋, 솜털머리타마린 또는 다람쥐 원숭이 CD3 엡실론에 추가로 결합한다. 비단마모셋과 솜털머리타마린은 둘 다 비단원숭이과(Callitrichidae)에 속하는 신세계 영장류인 반면, 다람쥐 원숭이는 꼬리감는원숭이과에 속하는 신세계 영장류이다.
본 발명의 항체 작제물에 대해 인간 및/또는 마카카(Macaca) CD3 엡실론 쇄의 세포외 에토프에 결합하는 제2 도메인은 하기로부터 선택된 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 것이 바람직하다:
(a) WO2008/119567의 서열번호 27에 도시된 바와 같은 CDR-L1, WO　2008/119567의 서열번호 28에 도시된 바와 같은 CDR-L2 및 WO2008/119567의 서열번호 29에 도시된 바와 같은 CDR-L3;
(b) WO2008/119567의 서열번호 117에 도시된 바와 같은 CDR-L1, WO　2008/119567의 서열번호 118에 도시된 바와 같은 CDR-L2 및 WO2008/119567의 서열번호 119에 도시된 바와 같은 CDR-L3; 및
(c) WO2008/119567의 서열번호 153에 도시된 바와 같은 CDR-L1, WO　2008/119567의 서열번호 154에 도시된 바와 같은 CDR-L2 및 WO2008/119567의 서열번호 155에 도시된 바와 같은 CDR-L3.
본 발명의 항체 작제물의 더 바람직한 실시형태에서, 인간 및/또는 마카카 CD3 엡실론 쇄의 세포외 에피토프에 결합하는 제2 도메인은 하기로부터 선택된 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 VH 영역을 포함한다:
(a) WO2008/119567의 서열번호 12에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 13에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 14에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(b) WO2008/119567의 서열번호 30에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 31에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 32에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(c) WO2008/119567의 서열번호 48에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 49에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 50에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(d) WO2008/119567의 서열번호 66에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 67에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 68에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(e) WO2008/119567의 서열번호 84에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 85에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 86에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(f) WO2008/119567의 서열번호 102에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 103에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 104에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(g) WO2008/119567의 서열번호 120에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 121에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 122에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(h) WO2008/119567의 서열번호 138에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 139에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 140에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(i) WO2008/119567의 서열번호 156에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 157에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 158에 도시된 바와 같은 CDR-H3; 및
(j) WO2008/119567의 서열번호 174에 도시된 바와 같은 CDR-H1, WO 2008/119567의 서열번호 175에 도시된 바와 같은 CDR-H2 및 WO2008/119567의 서열번호 176에 도시된 바와 같은 CDR-H3.
본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에서, VL CDR의 상기 기재한 3개의 그룹은 각각 CDR-L 1-3 및 CDR-H 1-3을 포함하는 (30) 그룹을 형성하기 위해 제2 결합 도메인 내의 VH CDR의 상기 기재한 10개 그룹 내에서 조합된다.
CD3에 결합하는 제2 도메인은 WO　2008/119567의 서열번호　17, 21, 35, 39, 53, 57, 71, 75, 89, 93, 107, 111, 125, 129, 143, 147, 161, 165, 179 또는 183에 도시된 것 도는 서열번호 13에 도시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 영역을 포함하는 본 발명의 항체 작제물이 바람직하다.
또한 CD3에 결합하는 제2 도메인은 WO 2008/119567의 서열번호 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 또는 181에 도시된 것 또는 서열번호 14에 도시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
더 바람직하게는, 본 발명의 항체 작제물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL 영역 및 VH 영역을 포함하는 CD3에 결합하는 제2 도메인을 특징으로 한다:
(a) WO　2008/119567의 서열번호 17 또는 21에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 15 또는 19에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(b) WO　2008/119567의 서열번호 35 또는 39에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 33 또는 37에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(c) WO　2008/119567의 서열번호 53 또는 57에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 51 또는 55에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(d) WO　2008/119567의 서열번호 71 또는 75에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 69 또는 73에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(e) WO　2008/119567의 서열번호 89 또는 93에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 87 또는 91에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(f) WO　2008/119567의 서열번호 107 또는 111에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 105 또는 109에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(g) WO　2008/119567의 서열번호 125 또는 129에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 123 또는 127에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(h) WO　2008/119567의 서열번호 143 또는 147에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 141 또는 145에 도시된 바와 같은 VH 영역;
(i) WO　2008/119567의 서열번호 161 또는 165에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 159 또는 163에 도시된 바와 같은 VH 영역; 및
(j) WO　2008/119567의 서열번호 179 또는 183에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 WO　2008/119567의 서열번호 177 또는 181에 도시된 바와 같은 VH 영역.
또한 본 발명의 항체 작제물과 관련하여 서열번호 13에 도시된 바와 같은 VL 영역 및 서열번호 14에 도시된 바와 같은 VH 영역을 포함하는 CD3에 결합하는 제2 도메인이 바람직하다.
본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에 따르면, 제1 도메인 및/또는 제2 도메인은 다음의 형식을 가진다: VH　영역과 VL　영역의 쌍은 단일쇄 항체(scFv)의 형식이다. VH 및 VL 영역은 VH-VL 또는 VL-VH의 순서로 배열된다. VH-영역은 링커 서열의 N-말단에 위치되고, VL-영역은 링커 서열의 C-말단에 위치되는 것이 바람직하다.
상기 기재한 본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태는 WO　2008/119567의 서열번호　23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 또는 187로 이루어진 군으로부터 선택된 또는 서열번호 15에 도시한 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 제2 도메인을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 항체 작제물의 제1 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 및 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 것이 생각된다:
(a) 서열번호　48에 도시된 바와 같은 CDR-L1, 서열번호　49에 도시된 바와 같은 CDR-L2, 서열번호　50에 도시된 바와 같은 CDR-L3, 서열번호　45에 도시된 바와 같은 CDR-H1, 서열번호　46에 도시된 바와 같은 CDR-H2, 및 서열번호　47에 도시된 바와 같은 CDR-H3;
(b) 서열번호　66에 도시된 바와 같은 CDR-L1, 서열번호　67에 도시된 바와 같은 CDR-L2, 서열번호　68에 도시된 바와 같은 CDR-L3, 서열번호　63에 도시된 바와 같은 CDR-H1, 서열번호　64에 도시된 바와 같은 CDR-H2, 및 서열번호　65에 도시된 바와 같은 CDR-H3; 및
(c) 서열번호　84에 도시된 바와 같은 CDR-L1, 서열번호　85에 도시된 바와 같은 CDR-L2, 서열번호　86에 도시된 바와 같은 CDR-L3, 서열번호　81에 도시된 바와 같은 CDR-H1, 서열번호　82에 도시된 바와 같은 CDR-H2, 및 서열번호　83에 도시된 바와 같은 CDR-H3.
더 나아가 본 발명의 항체 작제물의 제1 결합 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 것이 생각된다:
(a) 서열번호 51에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호　52에 도시된 바와 같은 VL 영역;
(b) 서열번호 57에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호　58에 도시된 바와 같은 VL 영역;
(c) 서열번호 69에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 70에 도시된 바와 같은 VL 영역;
(d) 서열번호 75에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 76에 도시된 바와 같은 VL 영역;
(e) 서열번호 87에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 88에 도시된 바와 같은 VL 영역; 및
(f) 서열번호 93에 도시된 바와 같은 VH 영역 및 서열번호 94에 도시된 바와 같은 VL 영역.
더 나아가 본 발명의 항체 작제물의 제1 결합 도메인은 서열번호 53, 59, 71, 77, 89 또는 95에 도시된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다는 것이 생각된다.
항체 작제물의 공유 변형은 또한 본 발명의 범주 내에 포함되고, 일반적으로, 항상은 아니지만, 번역 후에 행해진다. 예를 들어, 항체 작제물의 몇몇 유형의 공유 변형은 항체 작제물의 특정 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응시킬 수 있는 유기 유도체와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다.
시스테인일 잔기는 가장 통상적으로는 α-할로아세테이트(및 대응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아마이드와 반응되어, 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테인일 잔기는 또한 브로모트라이플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-나이트로-2-피리딜 다이설파이드, 메틸 2-피리딜 다이설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-나이트로페놀 또는 클로로-7-나이트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
이 제제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문에 히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 다이에틸파이로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화된다. 파라-브로모펜아실 브로마이드는 또한 유용하며; 반응은 바람직하게는 pH　6.0에서 0.1M 카코딜산나트륨 중에서 수행된다. 라이신일 및 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응된다. 이들 제제에 의한 유도체화는 라이신일 잔기의 전하를 반전시키는 효과를 가진다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스터, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트라이나이트로벤젠설폰산; O-메틸아이소유레아; 2,4-펜탄다이온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매된 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇몇 통상적인 시약, 특히, 페닐글리옥살, 2,3-부탄다이온, 1,2-사이클로헥산다이온 및 닌하이드린과의 반응에 의해 변형된다. 알기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa 때문에 반응이 알칼리성 조건 하에 수행될 것을 요구한다. 더 나아가, 이들 시약은 라이신기뿐만 아니라 알기닌 엡실론-아미노기와 반응할 수 있다.
방향족 다이아조늄 화합물 또는 테트라나이트로메탄과의 반응에 의해 타이로실 잔기에 스펙트럼 표지를 도입하는 데 특정 관심이 있는 타이로실 잔기의 특정 변형이 이루어질 수 있다. 가장 통상적으로는, N-아세틸디이미졸 및 테트라나이트로메탄은 각각 O-아세틸 타이로실 종 및 3-나이트로 유도체를 형성하기 위해 사용된다. 타이로실 잔기는 방사성면역분석, 즉, 적합한 것으로 상기에 기재한 클로라민 T 방법에서 사용하기 위한 표지 단백질을 제조하기 위해 125I 또는 131I를 이용하여 아이오딘화된다.
카복실 측기(아스파틸 또는 글루타밀)은 카보다이이민(R'―N=C=N--R')과의 반응에 의해 선택적으로 변형되며, 여기서 R 및 R'는 선택적으로 알킬기, 예컨대 1-사이클로헥실-3-(2-몰폴린일-4-에틸) 카보다이이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-다이메틸펜틸) 카보다이이미드이다. 더 나아가, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라긴일 및 글루타민일 잔기로 전환된다.
2작용성 제제에 의한 유도체화는 다양한 방법으로 사용하기 위해 수불용성 지지 기질 또는 표면에 본 발명의 항체 작제물을 가교시키는 데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스터, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 갖는 에스터, 다이숙신이미딜 에스터, 예컨대 3,3'-다이티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 포함하는 동종2작용성 이미도에스터, 및 2작용성 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)다이티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛의 존재 하에 가교를 형성할 수 있는 광활성화 가능한 중간체를 수득한다. 대안적으로, 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 4,330,440호에 기재된 바와 같은 반응성 수불용성 기질, 예컨대 사이아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물 및 반응성 기질이 단백질 고정을 위해 사용된다.
글루타민일 및 아스파라긴일 잔기는 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 빈번하게 탈아마이드화된다. 대안적으로, 이들 잔기는 약하게 산성인 조건 하에 탈아마이드화된다. 이들 잔기의 형태 중 하나는 본 발명의 범주 내에 속한다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기 인산화, 라이신, 알기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범주 내에 포함된 항체 작제물의 다른 유형의 공유 변형은 단백질의 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. 당업계에 공지되는 바와 같은, 글리코실화 패턴은 단백질 서열(예를 들어, 이하에 논의하는 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생성되는 숙주 세포 또는 유기체에 따를 수 있다. 특정 발현 시스템을 이하에 논의한다.
폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결 중 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이-펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트라이-펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.
항체 작제물에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 그것이 (N-연결 글리코실화 부위에 대해) 상기 기재한 트라이-펩타이드 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 시작 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 용이함을 위해, 항체 작제물의 아미노산 서열은 DNA 수준의 변화를 통해, 특히 목적으로 하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 사전선택된 염기에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 바람직하게 변경된다.
항체 작제물 상의 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 다른 수단은 단백질에 대한 글리코사이드의 화학적 또는 효소적 결합에 의한다. 이들 절차는 그들이 N- 및 O-연결 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질의 생성을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용되는 결합 방식에 따라서, 당(들)은 (a) 알기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 설프하이드릴기, (d) 유리 하이드록실기, 예컨대 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 하이드록실기, (e) 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판의 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아마이드기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 WO　87/05330에, 그리고 문헌[Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306]에 기재되어 있다.
시작 항체 작제물 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 화합물 트라이플루오로메탄설폰산, 또는 동등한 화합물에 대한 단백질의 노출을 필요로 한다. 이 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단을 초래하는 반면, 폴리펩타이드를 무손상으로 남긴다. 화학적 탈글리코실화는 문헌[Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52]에 의해 그리고 문헌[Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131]에 의해 기재된다. 폴리펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350]에 기재된 바와 같은 다양한 엔도- 또는 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 잠재적 글리코실화 부위에서 글리코실화는 문헌[Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105]에 기재되는 바와 같은 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지될 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코사이드 연결의 형성을 차단시킨다.
본 명세서에서 항체 작제물의 다른 변형이 또한 상정된다. 예를 들어, 항체 작제물의 공유 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 다양한 폴리올, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 비-단백질성 중합체에 항체 작제물을 연결하는 것을 포함한다. 추가로, 당업계에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은, 예를 들어, PEG와 같은 중합체의 첨가를 용이하게 하기 위해 항체 작제물 내의 다양한 위치에서 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 작제물의 공유 변형은 하나 이상의 표지의 첨가를 포함한다. 표지기는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(arm)을 통해 항체 작제물에 결합될 수 있다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명을 수행하는 데 사용될 수 있다. 용어 "표지" 또는 "표지기"는 임의의 검출 가능한 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 그들이 검출될 분석에 따라서 다양한 분류에 속한다- 다음의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
a) 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)과 같은 방사성 또는 중동위원소일 수 있는, 동위원소 표지
b) 자기 표지(예를 들어, 자기 입자)
c) 산화환원 활성 모이어티
d) 광학 염료(발색단, 인광체 및 형광단을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 예컨대 형광기(예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 화학발광기, 및 "소분자" 형광 또는 단백질성 형광 중 하나 일 수 있는 형광단
e) 효소기(예를 들어, 겨자무과산화효소, β갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제)
f) 바이오틴일화된 기
g) 2차 리포터에 의해 인식되는 사전결정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합측, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)
"형광 표지"는 고유 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 표지는 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠머린, 메틸-쿠머린, 파이렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로, 캐스케이드 블루J, 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC 레드 705, 오리건 그린, 알렉사-플루오르(Alexa-Fluor) 염료(알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로 및 R-피코에리트린(PE)(오리건주 유진에 소재한 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes)), FITC, 로다민 및 텍사스 레드(일리노이주 락포드에 소재한 피어스(Pierce)), Cy5, Cy5.5, Cy7(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 아머샴 라이프 사이언스(Amersham Life Science))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 형광단을 포함하는 적합한 광학 염료는 문헌[Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland]에 기재되어 있다.
적합한 단백질성 형광 표지는 또한 레닐라(Renilla), 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 또는 GFP의 에쿼리아 종(Aequorea species)을 포함하는 녹색 형광 단백질(Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP(클론테크 래버러토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.), 젠뱅크 수탁 번호 U55762), 청색 형광 단백질(BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), 루시퍼라제(Ichiki et al., 1993, J. Immunol . 150:5408-5417), β갈락토시다제(Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:2603-2607) 및 레닐라(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, 미국 특허 제5,292,658호; 제5,418,155호; 제5,683,888호; 제5,741,668호; 제5,777,079호; 제5,804,387호; 제5,874,304호; 제5,876,995호; 제5,925,558호)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 작제물은 또한, 예를 들어, 분자의 단리에 도움을 주거나 또는 분자의 적합한 약동학적 프로파일에 관한 추가적인 도메인을 포함할 수 있다. 항체 작제물의 단리에 도움을 주는 도메인은 단리된 방법, 예를 들어, 단리 칼럼에서 포획될 수 있는 펩타이드 모티브 또는 2차적으로 도입된 모이어티로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가적인 도메인의 비제한적 실시형태는 Myc-태그, HAT-태그, HA-태그, TAP-태그, GST-태그, 키틴 결합 도메인(CBD-태그), 말토스 결합 단백질(MBP-태그), 플래그-태그, 스트렙트-태그 및 이의 변이체(예를 들어, 스트렙트II-태그) 및 His-태그로서 알려진 펩타이드 모티브를 포함한다. 모든 본 명세서에 개시된 항체 작제물은 바람직하게는 5, 그리고 더 바람직하게는 6개의 His 잔기(헥사-히스티딘)의 분자 아미노산 서열 내 연속적 His 잔기의 반복부로서 일반적으로 알려진 His-태그 도메인을 포함할 수 있다. His-태그는, 예를 들어, 항체 작제물의 N-말단 또는 C-말단에 위치될 수 있고, 바람직하게는 이는 C-말단에 위치된다. 가장 바람직하게는, 헥사-히스티딘 태그(HHHHHH)(서열번호 16)는 본 발명에 따른 항체 작제물의 C-말단에 대한 펩타이드 결합을 통해 연결된다. 추가적으로, PLGA-PEG-PLGA의 접합체 시스템은 지속적 방출 적용 및 개선된 약동학적 프로파일을 위해 폴리-히스티딘 태그와 조합될 수 있다.
본 명세서에 기재된 항체 작제물의 아미노산 서열 변형이 또한 상정된다. 예를 들어, 항체 작제물의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것은 바람직할 수 있다. 항체 작제물의 아미노산 서열 변이체는 항체 작제물 핵산에 적절한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 모든 이하에 기재되는 아미노산 서열 변형은 비변형 모 분자의 목적으로 하는 생물학적 활성(BCMA에 대한 그리고 CD3에 대한 결합)을 여전히 보유하는 항체 작제물을 초래하여야 한다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는, 원한다면 변형, 합성 또는 희귀 아미노산이 사용될 수 있지만, 전형적으로 그의 당업계의 인식되는 정의를 갖는 아미노산, 예컨대, 알라닌(Ala 또는 A); 알기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(GIn 또는 Q); 글루탐산(GIu 또는 E); 글리신(GIy 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 아이소류신(He 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 라이신 (Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 타이로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(VaI 또는 V)으로부터 선택된 아미노산을 지칭한다. 일반적으로, 아미노산은 비극성 측쇄(예를 들어, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, VaI); 음으로 하전된 측쇄(예를 들어, Asp, GIu); 양으로 하전된 측쇄(예를 들어, Arg, His, Lys); 또는 비하전 극성 측쇄(예를 들어, Asn, Cys, GIn, GIy, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp 및 Tyr)를 갖는 것으로 그룹화될 수 있다.
아미노산 변형은, 예를 들어, 항체 작제물의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하도록 이루어지며, 단, 최종 작제물은 목적으로 하는 특징을 갖는다. 아미노산 변화는 또한 항체 작제물의 번역 후 과정, 예컨대 글리코실 부위의 수 또는 위치의 변화를 변경시킬 수 있다.
예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 각각의 CDR(물론, 그들의 길이에 의존함)에서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 반면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25개의 아미노산이 각각의 FR에서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있다. 바람직하게는, 항체 작제물 내로 아미노산 서열 삽입은 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드에 대해 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잔기의 범위에 있는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 대응하는 변형은 또한 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 작제물의 삽입 변이체는 효소의 항체 작제물의 N-말단 또는 C-말단에 대한 융합 또는 폴리펩타이드에 대한 융합을 포함한다.
치환 돌연변이유발의 가장 큰 관심 대상 부위는 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR, 특히 초가변 영역을 포함하지만(그러나 이들로 제한되지 않음) 중쇄 및/또는 경쇄에서의 FR 변형이 또한 상정된다. 치환은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 보존적 치환이다. 바람직하게는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산은 CDR에서 치환될 수 있는 한편, CDR 또는 FR의 길이에 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25개의 아미노산이 프레임워크 영역(FR)에서 치환될 수 있다. 예를 들어, CDR 서열이 6개의 아미노산을 포함한다면, 이들 아미노산 중 1, 2 또는 3개가 치환된다는 것이 생각된다. 유사하게, CDR 서열이 15개의 아미노산을 포함한다면, 이들 아미노산 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개가 치환된다는 것이 생각된다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 항체 작제물의 특정 잔기 또는 영역의 동정을 위한 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 의해 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 항체 작제물 내의 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 동정되고(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu), 천연 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 에피토프과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다.
이어서, 치환에 대한 작용 민감성을 보여주는 해당 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위 또는 영역이 사전결정되지만, 특히 돌연변이 특성은 사전결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이 성능을 분석하거나 또는 최적화하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고, 발현된 항체 변이체는 목적으로 하는 활성의 최적의 조합물에 대해 선별된다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내 사전결정된 부위에서 치환 돌연변이를 생성하기 위한 기법, 예를 들어, M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발은 잘 공지되어 있다. 돌연변이체의 선별은 항원 결합 활성, 예컨대 BCMA 또는 CD3 결합의 분석을 이용하여 행해진다.
일반적으로, 아미노산이 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 또는 모든 CDR에서 치환된다면, 이어서, 얻어진 "치환된" 서열은 "본래의" CDR 서열에 대해 적어도 60% 또는 65%, 더 바람직하게는 70% 또는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 80% 또는 85%, 및 특히 바람직하게는 90% 또는 95% 동일한 것이 바람직하다. 이는 "치환된" 서열과 동일한 정도로 CDR 길이에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 5개의 아미노산을 갖는 CDR은 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖도록 그의 치환된 서열과 바람직하게는 80% 동일하다. 따라서, 항체 작제물의 CDR은 그들의 치환된 서열에 대해 상이한 정도의 동일성을 가질 수 있고, 예를 들어, CDRL1은 80%를 가질 수 있는 반면, CDRL3은 90%를 가질 수 있다.
바람직한 치환(또는 대체)은 보존적 치환이다. 그러나, 항체 작제물이 제1 도메인을 통해 BCMA에 그리고 제2 도메인을 통해 CD3　엡실론에 결합하는 그의 능력을 보유하고/하거나 그의 CDR이 치환된 서열에 대해 동일성("본래의" CDR 서열에 대해 적어도 60% 또는 65%, 더 바람직하게는 70% 또는 75%, 훨씬 더 바람직하게는 80% 또는 85%, 및 특히 바람직하게는 90% 또는 95% 동일)을 가진다면, 임의의 치환(이하의 표 3에 열거되는 비보존적 치환 또는 "예시적인 치환"으로부터의 하나 이상을 포함)이 생각된다.
보존적 치환은 표제 "바람직한 치환" 하에서 표 3에 나타낸다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 생물학적 활성의 변화를 초래한다면, 표 3에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나 또는 아미노산 분류에 대해 이하에 추가로 기재하는 바와 같은 더 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 목적으로 하는 특징에 대해 선별된다.
아미노산 치환
본래 아미노산 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) val, leu, ile val
Arg (R) lys, gln, asn lys
Asn (N) gln, his, asp, lys, arg gln
Asp (D) glu, asn glu
Cys (C) ser, ala ser
Gln (Q) asn, glu asn
Glu (E) asp, gln asp
Gly (G) Ala ala
His (H) asn, gln, lys, arg arg
Ile (I) leu, val, met, ala, phe leu
Leu (L) 노르류신, ile, val, met, ala ile
Lys (K) arg, gln, asn arg
Met (M) leu, phe, ile leu
Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr tyr
Pro (P) Ala ala
Ser (S) Thr thr
Thr (T) Ser ser
Trp (W) tyr, phe tyr
Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe
Val (V) ile, leu, met, phe, ala leu
본 발명의 항체 작제물의 항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체배좌로서, 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지함에 있어서 그들의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 유래 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 기반하여 그룹들로 나뉘어진다: (1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile; (2) 중성 친수성: cys, ser, thr, asn, gln; (3) 산성: asp, glu; (4) 염기성: his, lys, arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및 (6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 분자의 산화적 안정성을 개선시키기 위해 그리고 비정상 가교를 방지하기 위해 항체 작제물의 적절한 입체배좌를 유지하는 데 수반되지 않는 임의의 잔기는 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 대조적으로, 시스테인 결합(들)은 그의 안정성을 개선시키기 위해 항체에 첨가될 수 있다(특히, 여기서 항체는 항체 단편, 예컨대 Fv 단편임).
아미노산 서열에 대해, 서열 동일성 및/또는 유사성은 문헌[Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재한 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)), 문헌[Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395]에 의해 기재되는 베스트 핏(Best Fit) 서열 프로그램을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 표준 기법을 이용함으로써, 바람직하게는 디폴트 설정을 이용하거나, 또는 검사에 의해 결정된다. 바람직하게는, 동일성 백분율은 다음의 매개변수: 미스매치 페널티 1; 갭 페널티 1; 갭 크기 페널티 0.33; 및 결합 페널티 30, 문헌["Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc]에 기반하여 FastDB에 의해 계산된다.
유용한 알고리즘의 예는 PILEUP이다. PILEUP는 진행성, 쌍별 알고리즘을 이용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한 정렬을 생성하기 위해 사용되는 클러스터링 관계를 나타내는 나무를 플롯팅할 수 있다. PILEUP는 문헌[Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360]의 진행성 정렬 방법의 단순화를 사용하며; 상기 방법은 문헌[Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153]에 의해 기재되는 것과 유사하다. 디폴트 갭 가중치 3.00, 디폴트 갭 길이 가중치 0.10, 및 가중치 부여된 말단 갭을 포함하는 유용한 PILEUP 매개변수.
유용한 알고리즘의 다른 예는 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; 및 Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌[Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480]으로부터 얻은 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 대부분 디폴트 값으로 설정된 몇몇 검색 매개변수를 사용한다. 조절 가능한 매개변수는 다음의 값으로 설정된다: 중복 스팬=1, 중복 분율=0.125, 단어 역치(T)=II. HSP S 및 HSP S2 매개변수는 역학적 값이고, 특정 서열의 조성 및 관심 대상의 서열이 검색된 특정 데이터베이스의 조성에 따라서 프로그램 그 자체에 의해 확립되지만; 그러나, 값은 민감도를 증가시키도록 조정될 수 있다.
추가적인 유용한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 의해 보고되는 갭 BLAST이다. 갭 BLAST는 BLOSUM-62 치환 스코어; 9로 설정된 역치 T 매개변수; 갭이 없는 연장을 촉발시키기 위한 2-히트 방법, k의 갭 길이에 10+k을 부과; 16으로 설정한 Xu, 및 데이터베이스 검색 단계에 대해 40 및 알고리즘의 산출 단계에 대해 67로 설정한 Xg를 이용한다. 갭 정렬은 약 22 비트에 대응하는 스코어에 의해 촉발된다.
일반적으로, 개개 변이체 CDR 또는 VH/VL 서열 사이의 아미노산 상동성, 유사성, 또는 동일성은 본 명세서에 도시된 서열에 대해 적어도 60%이고, 더 전형적으로는 바람직하게는 적어도 65% 또는 70%, 더 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 거의 100%의 상동성 또는 동일성으로 증가한다. 유사한 방식으로, 본 명세서에 동정된 결합 단백질의 핵산 서열에 대해 "핵산 서열 동일성 백분율(%)"은 항체 작제물의 암호 서열에서 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내 뉴클레오타이드 잔기의 백분율로서 정의된다. 특정 방법은 디폴트 매개변수로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 이용하며, 중복 스팬 및 중복 분율은 각각 1 및 0.125로 설정된다.
일반적으로, 개개 변이체 CDR 또는 VH / VL 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 본 명세서에 도시된 뉴클레오타이드 서열 사이의 핵산 서열 상동성, 유사성 또는 동일성은 적어도 60%이고, 더 전형적으로는 바람직하게는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 및 거의 100%의 상동성 또는 동일성을 가진다. 따라서, "변이체 CDR" 또는 "변이체 VH/VL 영역"은 본 발명의 모 CDR/VH　/VL에 대해 구체화된 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 것이며, 모 CDR 또는 VH　/ VL의 특이성 및/또는 활성에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 생물학적 작용을 공유한다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 작제물의 인간 생식계열에 대한 동일성의 백분율은 ≥　70% 또는 ≥　75%, 더 바람직하게는 ≥　80% 또는 ≥　85%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　90%, 그리고 가장 바람직하게는 ≥　91%, ≥　92%, ≥　93%, ≥　94%, ≥　95% 또는 심지어 ≥　96%이다. 인간 항체 생식계열 유전자 산물에 대한 동일성은 치료 동안 환자에서 약물에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 치료 단백질의 위험을 감소시키기 위한 중요한 특징인 것으로 생각된다. 황(Hwang) 및 푸트(Foote)("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10)는 약물 항체 작제물의 비인간 부분의 감소가 치료 동안 환자에서 항-약물 항체를 유도할 위험의 감소를 야기한다는 것을 입증한다. 임상적으로 평가된 항체 약물의 고갈된 수와 각각의 면역원성 데이터를 비교함으로써, 항체의 V-영역의 인간화는 변경되지 않은 비-인간 V 영역(평균 23.59　%의 환자)을 운반하는 항체보다 덜 면역원성(평균 5.1%의 환자)으로 만든다는 경향이 나타난다. 따라서, 항체 작제물 형태로 V-영역 기반 단백질 치료에 대해 인간 서열에 대해 더 높은 정도의 동일성이 바람직하다. 생식계열 동일성을 결정하는 이 목적을 위해, VL의 V-영역은 벡터 NTI(Vector NTI) 소프트웨어 및 동일한 아미노산 잔기를 VL의 아미노산 잔기의 총 수로 나누어서(백분율) 계산되는 아미노산 서열을 이용하여 인간 생식계열 V 세그먼트 및 J 세그먼트의 아미노산 서열에 의해 정렬될 수 있다(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). VH CDR3이 그의 높은 다양성 및 존재하는 인간 생식계열 VH CDR3 정렬 상대의 결여에 기인하여 배제될 수 있다는 것을 제외하고, 이는 VH 세그먼트에 대해 동일할 수 있다(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). 이어서, 인간 항체 생식계열 유전자에 대한 서열 동일성을 증가시키기 위해 재조합 기법이 사용될 수 있다.
더 나아가 본 발명의 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물은 인간 BAFF-R 및/또는 인간 TACI에 (본질적으로) 결합하지 않거나 또는 교차반응하지 않는다는 것이 생각된다. 더 나아가 본 발명의 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물은 마카크/사이아노 BAFF-R 및/또는 마카크/사이아노 TACI에 (본질적으로) 결합하지 않거나 또는 교차반응하지 않는다는 것이 생각된다.
추가 실시형태에서, 본 발명의 이중특이성 항체 작제물은, 예를 들어, 표준 2단계 정제 공정에서 표준 연구 규모 조건 하에 높은 단량체 수율을 나타낸다. 바람직하게는 본 발명에 따른 항체 작제물의 단량체 수율은 ≥　0.25㎎/ℓ 상청액, 더 바람직하게는 ≥　0.5㎎/ℓ, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　1㎎/ℓ, 및 가장 바람직하게는 ≥　3㎎/ℓ 상청액이다.
마찬가지로, 이량체 항체 작제물 아이소폼의 수율 및 그에 따른 항체 작제물의 단량체 백분율(즉, 단량체　:　(단량체+이량체))이 결정될 수 있다. 단량체 및 이량체 항체 작제물의 생산성 및 계산된 단량체 백분율은, 예를 들어, 롤러 보틀에서 표준화된 연구-규모 생산으로부터의 배양 상청액의 SEC 정제 단계에서 얻을 수 있다. 일 실시형태에서, 항체 작제물의 단량체 백분율은 ≥　80%, 더 바람직하게는 ≥　85%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　90%, 및 가장 바람직하게는 ≥　95%이다.
일 실시형태에서, 항체 작제물은 ≤　5 또는 ≤　4, 더 바람직하게는 ≤　3.5 또는 ≤　3, 훨씬 더 바람직하게는 ≤　2.5 또는 ≤　2, 및 가장 바람직하게는 ≤　1.5 또는 ≤　1의 바람직한 혈장 안정성(혈장이 있는 EC50 대 혈장이 없는 EC50의 비)을 가진다. 항체 작제물의 혈장 안정성의 혈장 안정성은 37℃에서 24시간 동안 인간 혈장에서 작제물의 인큐베이션 다음에 51크로뮴 방출 세포독성 분석에서 EC50 결정에 의해 시험할 수 있다. 세포독성 분석에서 효과기 세포는 자극 농축된 인간 CD8 양성 T 세포이리 수 있다. 표적 세포는, 예를 들어, 인간 BCMA로 형질감염된 CHO 세포일 수 있다. 효과기 대 표적 세포(E:T) 비는 10:1로서 선택될 수 있다. 이 목적을 위해 사용되는 인간 혈장 풀은 EDTA 코팅 주사기에 의해 수집되는 건강한 공여자의 혈액으로부터 유래된다. 세포 성분은 원심분리에 의해 제거되고, 상부 혈장상이 수집되며, 후속적으로 풀링된다. 대조군으로서, 항체 작제물은 RPMI-1640 배지에서 세포독성 분석 직전에 희석된다. 혈장 안정성은 EC50(혈장 인큐베이션 후) 대 EC50(대조군)의 비로서 계산한다.
더 나아가 본 발명의 항체 작제물의 단량체에서 이량체 전환이 낮은 것이 바람직하다. 전환은 상이한 조건 하에 측정될 수 있고, 고성능 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 항체 작제물의 단량체 아이소폼의 인큐베이션은 인큐베이터 내에서 37℃에서 7일 동안, 예를 들어, 100㎍/㎖ 또는 250㎍/㎖의 농도로 수행될 수 있다. 이들 조건 하에서, 본 발명의 항체 작제물은 ≤5%, 더 바람직하게는 ≤4%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤3%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤2.5%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤2%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤1.5%, 및 가장 바람직하게는 ≤1% 또는 ≤0.5% 또는 심지어 0%인 이량체 백분율을 나타내는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 이중특이성 항체 작제물은 다수의 냉동/해동 주기 후에 매우 낮은 이량체 전환으로 존재하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체 작제물 단량체는 250㎍/㎖의 농도로, 예를 들어, 일반적 제형 완충제 중에서 조절되고, 3회 냉동/해동 주기(-80℃에서 30분 동안 냉동 다음에 실온에서 30분 동안 해동), 다음에 이량체 항체 작제물로 전환되는 초기 단량체 항체 작제물의 백분율을 결정하기 위해 고성능 SEC를 실시하였다. 바람직하게는 이중특이성 항체 작제물의 이량체 백분율은, 예를 들어, 3회의 냉동/해동 주기 후에 ≤5%, 더 바람직하게는 ≤4%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤3%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤2.5%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤2%, 훨씬 더 바람직하게는 ≤1.5%, 및 가장 바람직하게는 ≤1% 또는 심지어 ≤0.5%이다.
본 발명의 이중특이성 항체 작제물은 바람직하게는 ≥45℃ 또는 ≥50℃, 더 바람직하게는 ≥52℃ 또는 ≥54℃, 훨씬 더 바람직하게는 ≥56℃ 또는 ≥57℃, 및 가장 바람직하게는 ≥58℃ 또는 ≥59℃의 응집 온도로 바람직한 열 안정성을 나타낸다. 열안정성 매개변수는 다은과 같은 항체 응집 온도에 대해 결정될 수 있다: 250㎍/㎖의 농도에서 항체 용액은 일회용 큐벳에 전달되고, 동적 광산란(DLS) 장치에 놓인다. 샘플은 측정된 반경을 일정하게 획득하면서 0.5℃/분의 가열 속도로 40℃로부터 70℃로 가열된다. 단백질의 융점 및 응집을 나타내는 반경의 증가는 항체의 응집 온도를 계산하기 위해 사용된다.
대안적으로, 온도 용융 곡선은 항체 작제물의 본래의 생물리학적 단백질 안정성을 결정하기 위해 시차 주사 열량 측정법(DSC)에 의해 결정될 수 있다. 이들 실험은 마이크로칼 엘엘씨(MicroCal LLC)(미국 매사추세츠주 노샘프턴에 소재) VP-DSC 장치를 이용하여 수행된다. 항체 작제물을 함유하는 샘플의 에너지 흡수는 제형 완충제만을 함유하는 샘플에 비해 20℃로부터 90℃로 기록된다. 항체 작제물은, 예를 들어, SEC 실행 완충제 중에서 250㎍/㎖의 최종 농도로 조절된다. 각각의 용융 곡선의 기록을 위해, 전체 샘플 온도는 단계적으로 증가된다. 각각의 온도에서, 샘플 및 제형 완충제 기준의 T 에너지 흡수가 기록된다. 샘플 - 기준의 에너지 흡수 Cp의 차이(㎉/㏖/℃)는 각각의 온도에 대해 플롯팅된다. 용융 온도는 에너지 흡수의 처음 최대값에서의 온도로서 정의된다.
BCMAxCD3 본 발명의 이중특이성 항체 작제물은 또한 ≤　0.2, 바람직하게는 ≤　0.15, 더 바람직하게는 ≤　0.12, 훨씬 더 바람직하게는 ≤　0.1, 및 가장 바람직하게는 ≤　0.08의 탁도(정제된 단량체 항체 작제물의 농도를 2.5㎎/㎖로 밤새 인큐메이션한 후에 OD340에 의해 측정)로 생각된다.
추가 실시형태에서, 본 발명에 따른 항체 작제물은 생리적 또는 약간 더 낮은 pH, 즉, 약 pH 7.4 내지 6.0에서 안정하다. 더 잘 견디는 항체 작제물은 비생리적 pH, 예컨대 약 pH 6.0에서 거동하며, 부하된 단백질의 총 량에 대해 이온 교환 칼럼으로부터 용리된 항체 작제물의 회수는 더 높다. 약 pH　6.0에서 이온(예를 들어, 양이온) 교환 칼럼으로부터의 항체 작제물의 회수는 바람직하게는 ≥　30%, 더 바람직하게는 ≥　40%, 더 바람직하게는 ≥　50%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　60%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　70%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　80%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　90%, 훨씬 더 바람직하게는 ≥　95%, 및 가장 바람직하게는 ≥　99%이다.
더 나아가 본 발명의 이중특이성 항체 작제물은 치료적 효능 또는 항종양 활성을 나타낸다는 것이 생각된다. 이는, 예를 들어, 진행된 병기의 인간 종양 이종이식 모델의 다음의 예에서 개시하는 바와 같은 연구에서 평가될 수 있다:
연구의 제1일에, 인간 표적 세포 항원(본 명세서에서 BCMA) 양성 암 세포주의 5x106개의 세포는 암컷 NOD/SCID 마우스의 우측 등의 측면에 피하로 주사된다. 평균 종양 용적이 약 100㎣에 도달될 때, 시험관내 확장된 인간 CD3 양성 T 세포는 동물의 복강 내로 약 2x107개 세포의 주사에 의해 마우스에 이식된다. 비히클 대조군 1의 마우스는 효과기 세포를 받지 않으며, 종양 성장에 대한 T 세포의 영향을 모니터링하기 위해 비히클 대조군 2(효과기 세포를 수용)에 비교하여 비이식 대조군으로서 사용하였다. 평균 종양 용적이 약 200㎣에 도달될 때, 항체 처리를 시작한다. 처리 시작일에 각각의 처리군의 평균 종양 크기는 임의의 다른 그룹과 통계적으로 상이하지 않아야 한다(분산 분석). 약 15 내지 20일 동안 정맥내 볼루스 주사에 의해 마우스를 BCMAxCD3 이중특이성 항체 작제물의 0.5㎎/㎏/일로 처리하였다. 연구 동안 캘리퍼에 의해 종양을 측정하고, 종양 용적(TV)의 그룹간 비교에 의해 진행을 평가한다. T/C% = 100 x (분석 그룹의 중앙값 TV)/(대조군 2의 중앙값 TV)로서 TV를 계산함으로써 종양 성장 저해 T/C[%]를 결정한다.
당업자는 이 연구의 특정 매개변수, 예컨대 주사한 종양 세포의 수, 주사 부위, 이식한 인간 T 세포의 수, 투여될 이중특이성 항체 작제물의 양, 및 연대표를 변형하거나 또는 적합화하는 한편, 의미있고 재현 가능한 결과에 도달하는 방법을 안다. 바람직하게는, 종양 성장 저해 T/C[%]는 ≤　70 또는 ≤　60, 더 바람직하게는 ≤　50 또는 ≤　40, 훨씬 더 바람직하게는 ≤　30 또는 ≤　20 및 가장 바람직하게는 ≤　10 또는 ≤　5 또는 심지어 ≤　2.5이다.
본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에서 항체 작제물은 단일쇄 항체 작제물이다.
또한 본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에서, 상기 제3 도메인은 아미노에서 카복실 순서로 포함한다:
힌지-CH2-CH3-링커-힌지-CH2-CH3.
본 발명의 일 실시형태에서 제3 도메인의 각각의 상기 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서 각각의 상기 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 17 내지 24로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
또한 본 발명의 일 실시형태에서, 제3 도메인의 폴리펩타이드 단량체 중 하나 또는 바람직하게는 각각(둘 다)의 CH2 도메인은 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같은 용어 "시스테인 이황화 브릿지"는 일반 구조 R -S-S- R을 갖는 작용기를 지칭한다. 연결은 또한 SS-결합 또는 이황화 브릿지로 불리고, 시스테인 잔기의 2개 티올기를 결합함으로써 유도된다. 본 발명의 항체 작제물에 대해 성숙 항체 작제물에서 시스테인 이황화 브릿지를 형성하는 시스테인은 309 및 321(카바트 넘버링)에 대응하는 CH2 도메인의 아미노산 서열에 도입되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, CH2 도메인의 카바트 위치 314에서 글리코실화 부위가 제거된다. 글리코실화 부위의 이 제거는 N314X 치환에 의해 달성되되, X는 Q를 제외하는 임의의 아미노산인 것이 바람직하다. 상기 치환은 바람직하게는 N314G 치환이다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 CH2 도메인은 다음의 치환(카바트에 따른 위치) V321C 및 R309C을 추가로 포함한다(이들 치환은 카바트 위치 309 및 321에서 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 도입함).
예를 들어, 당업계에 공지된 이중특이성 이형Fc 항체 작제물에 비해 본 발명의 항체 작제물의 바람직한 특징은(도 1b) 특히 CH2 도메인에서 상기 기재한 변형의 도입과 관련될 수 있다는 것이 추정된다. 따라서, 본 발명의 작제물에 대해 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인 내 CH2 도메인은 카바트 위치 309 및 321에서 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 포함하고/하거나 카바트 위치 314에서 글리코실화 부위는 바람직하게는 N314G 치환에 의해 상기 기재한 바와 같이 N314X 치환에 의해 제거되는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인 내 CH2 도메인은 카바트 위치 309 및 321에서 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 포함하고, 카바트 위치 314에서 글리코실화 부위는 N314G 치환에 의해 제거된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체 작제물의 제3 도메인의 폴리펩타이드 단량체는 서열번호 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
일 실시형태에서, 본 발명은 항체 작제물을 제공하되, 여기서:
(i) 제1 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 제2 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하거나;
(ii) 제1 도메인은 1개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 제2 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하거나;
(iii) 제1 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 제2 도메인은 1개의 항체 가변 도메인을 포함하거나; 또는
(iv) 제1 도메인은 1개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 제2 도메인은 1개의 항체 가변 도메인을 포함한다.
따라서, 제1 도메인 및 제2 도메인은 각각 2개의 항체 가변 도메인, 예컨대 VH 및 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인일 수 있다. 본 명세서에 상기 기재된 2개의 항체 가변 도메인을 포함하는 이러한 결합 도메인의 예는, 예를 들어, 본 명세서에 상기 기재한 Fv 단편, scFv 단편 또는 Fab 단편을 포함한다. 대안적으로 해당 결합 도메인 중 하나 또는 둘 다는 단일 가변 도메인만을 포함할 수 있다. 본 명세서에 상기 기재된 이러한 단일 도메인 결합 도메인에 대한 예는, 예를 들어, 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 VHH, VH 또는 VL일 수 있는 하나의 가변 도메인만을 포함하는 나노바디 또는 단일 가변 도메인 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 작제물의 바람직한 실시형태에서, 제1 도메인 및 제2 도메인은 펩타이드 링커를 통해 제3 도메인에 융합된다. 바람직한 펩타이드 링커는 본 명세서에 상기 기재한 바와 같고, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, 즉, Gly4Ser (서열번호　1), 또는 이의 중합체, 즉, (Gly4Ser)x를 특징으로 하며, 여기서 x는 1 이상(예를 들어, 2 또는 3)의 정수이다. 제3 도메인에 대해 제1 도메인 및 제2 도메인의 융합을 위한 특히 바람직한 링커를 서열번호 1에 도시한다.
바람직한 실시형태에서 본 발명의 항체 작제물은 아미노에서 카복실 순서로 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 제1 도메인;
(b) 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커;
(c) 제2 도메인;
(d) 서열번호 1, 2, 3, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커;
(e) 제3 도메인의 제1 폴리펩타이드 단량체;
(f) 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커; 및
(g) 제3 도메인의 제2 폴리펩타이드 단량체.
본 발명의 항체 작제물은 BCMA에, 바람직하게는 BCMA의 세포외 도메인(ECD)에 결합하는 제1 도메인을 포함한다. 본 발명과 관련하여 용어 "BCMA의 세포외 도메인에 대한 결합"은 결합 도메인이 표적 세포의 표면 상에서 발현된 BCMA에 결합한다는 것을 나타내는 것으로 이해된다. 따라서 본 발명에 따른 제1 도메인은 자연적으로 발현하는 세포 또는 세포주에 의해, 그리고/또는 BCMA에 의해 형질전환되거나 또는 (안정하게/일시적으로) 형질감염된 세포 또는 세포주에 의해 발현될 때 BCMA에 바람직하게 결합한다. 바람직한 실시형태에서, 제1 결합 도메인은 또한, BCMA가 비아코어 또는 스캐처드와 같은 시험관내 결합 분석에서 "표적" 또는 "리간드" 분자로서 사용될 때, BCMA에 결합한다. "표적 세포"는 표면 상에서 BCMA를 발현시키는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있고; 바람직하게는 표적 세포는 인간 또는 동물 신체, 예컨대 특정 BCMA 발현 암 또는 종양 세포의 부분인 세포이다.
바람직하게는, 제1 도메인은 인간 BCMA / BCMA ECD에 결합한다. 바람직한 인간 BCMA 서열은 서열번호　41에서 도시되고, 바람직한 인간 BCMA ECD 서열은 서열번호　42에서 도시된다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 이는 마카크 BCMA/BCMA ECD에 결합한다. 바람직한 마카크 BCMA 서열은 서열번호 43에서 도시되고, 바람직한 마카크 BCMA ECD 서열은 서열번호 44에서 도시된다. 가장 바람직한 실시형태에 따르면, 제1 도메인은 인간과 마카크 BCMA / BCMA ECD 둘 다에 결합한다. "BCMA 세포외 도메인" 또는 "BCMA ECD"는 BCMA의 막관동 및 세포질 도메인이 본질적으로 없는 BCMA 영역 또는 서열을 지칭한다. 본 발명의 BCMA 폴리펩타이드에 대해 동정된 막관통 도메인은 소수성 도메인의 해당 유형을 동정하기 위해 당업계에서 일상적으로 사용되는 기준에 의해 동정된다는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 막관통 도메인의 정확한 경계는 본 명세서에 구체적으로 언급된 도메인 말단 중 하나에서 아마도 약 5개 이하의 아미노산만큼 다를 수 있다. 바람직한 전장 BCMA 아미노산 서열은 서열번호　41에서 도시된다. 바람직한 BCMA ECD는 서열번호　42에 나타낸다.
BCMA에 결합하는 바람직한 결합 도메인은 WO　2013/072406, WO　2013/072415 및 WO　2014/140248에 개시되어 있다. 이들 적용에서 기재된 BCMA에 대한 임의의 결합 도메인은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 항체 작제물은 아미노에서 카복실 순서로 포함한다:
(a) 서열번호 53, 59, 71, 77, 89 또는 95로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제1 도메인;
(b) 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커;
(c) WO　2008/119567의 서열번호 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 또는 187, 또는 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 제2 도메인;
(d) 서열번호 1, 2, 3, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커;
(e) 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는 제3 도메인의 제1 폴리펩타이드 단량체;
(f) 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커; 및
(g) 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 갖는 제3 도메인의 제2 폴리펩타이드 단량체.
이 바람직한 실시형태와 관련하여, 펩타이드 링커를 통해 제3 도메인에 융합된 제1 도메인 및 제2 도메인은 서열번호 53, 59, 71, 77, 89 또는 95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 양상에서, 본 발명의 항체 작제물은 서열번호 55, 56, 61, 62, 73, 74, 79, 80, 91, 92, 97 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드/핵산 분자를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 쇄 내에서 공유결합된 13개 이상의 뉴클레오타이드 단량체로 구성된 생체중합체이다. DNA(예컨대 cDNA) 및 RNA(예컨대 mRNA)는 별개의 생물학적 기능을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 예이다. 뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자의 단량체 또는 서브유닛으로서 작용하는 유기 분자이다. 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 및 단일 가닥, 선형 및 원형일 수 있다. 이는 바람직하게는 숙주 세포에 포함된 벡터에 바람직하게 포함된다. 상기 숙주 세포는 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드로, 예를 들어 형질전환 또는 형질감염 후에 항체 작제물을 발현시킬 수 있다. 상기 목적을 위해, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자는 대조군 서열과 조작 가능하게 연결된다.
유전자 암호는 유전자 물질(핵산) 내에 암호화된 정보가 단백질로 번역되는 규칙의 세트이다. 살아있는 세포에서의 생물학적 해독(decoding)은 아미노산을 운반하기 위해 tRNA를 이용하여 그리고 mRNA가 한번에 3개의 뉴클레오타이드를 판독하기 위해 mRNA에 의해 특정된 순서로 아미노산을 연결하는 리보솜에 의해 달성된다. 상기 암호는 아미노산이 단백질 합성 동안 다음에 첨가되는 것을 코돈으로 불리는 이들 뉴클레오타이드 트리플렛의 서열이 구체화하는 방법을 정한다. 일부를 제외하고, 핵산 서열 내 3개의 뉴클레오타이드 코돈은 단일 아미노산을 구체화한다. 대다수의 유전자는 동일한 암호에 의해 정확하게 암호화되기 때문에, 이 특정 암호는 종종 정규 또는 표준 유전자 암호로서 지칭된다. 유전자 암호는 주어진 암호 영역에 대한 단백질 서열을 결정하지만, 다른 게놈 영역은 이들 단백질이 생성되는 시기 및 장소에 영향을 미칠 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드/핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 (외래) 유전자 물질을 세포 내로 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 조작된 벡터는 복제기점, 다중클로닝 부위 및 선택 마커를 포함한다. 벡터 그 자체는 일반적으로 벡터의 "골격"으로서 작용하는 삽입(이식유전자) 그리고 더 큰 서열을 포함하는 통상적으로 DNA 서열인 뉴클레오타이드 서열이다. 현대의 벡터는 이식유전자 삽입 및 골격 이외의 추가적인 특징을 포함할 수 있다: 프로모터, 유전자 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그. 발현 벡터(발현 작제물)로 불리는 벡터는 구체적으로는 표적 세포 내 이식유전자의 발현을 위한 것이며, 일반적으로는 제어 서열을 가진다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합측을 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합측은 번역을 용이하게 하기 위해 위치된다면, 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 그리고 분비 리더의 경우에, 인접하면서 판독기에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해서는 안 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실행에 따라 사용된다.
"형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드(벡터를 포함)를 표적 세포 내로 의도적으로 도입하는 과정이다. 상기 용어는 대부분 진핵 세포에서 비바이러스 방법에 대해 사용된다. 형질도입은 종종 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드의 바이러스-매개 전달을 기재하기 위해 사용된다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 막 내에 개방된 일시적 기공 또는 "구멍"을 수반하여, 물질의 흡수를 허용한다. 형질감염은 인산칼슘을 이용하여, 전기천공법에 의해, 세포 압착에 의해 또는 세포막과 융합하고 내부에 그들의 화물을 싣는 리포좀을 생성하는 물질과 양이온성 지질을 혼합함으로써 수행될 수 있다.
용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드(벡터를 포함)의 박테리아 내로의, 그리고 또한 식물 세포를 포함하는 진핵 세포 내로의 비바이러스 전달을 기재하기 위해 사용된다. 따라서, 형질전환은 주변으로부터 세포막(들)을 통해 직접적 흡수로부터 초래된 박테리아 또는 비동물 진핵 세포의 유전적 변경 및 외인성 유전자 물질(핵산 분자)의 후속적 혼입이다. 형질전환은 인공적 수단에 의해 달성될 수 있다. 일어나는 형질전환에 대해, 세포 또는 박테리아는 기아 및 세포 밀도와 같은 환경 조건에 대해 시간-제한된 반응으로서 일어날 수 있는 능력의 상태에 있어야 한다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드/핵산에 의해 또는 벡터에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 또는 "수용자 세포"는 벡터의 수용자, 외인성 핵산 분자, 및 본 발명의 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 항체 작제물 그 자체의 수용자일 수 있거나 또는 이었던 임의의 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 의도된다. 세포 내로 각각의 물질의 도입은 형질전환, 형질감염 등에 의해 수행된다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 변형이 자연적, 우연적 또는 의도적인 성숙에 기인하여 또는 환경적 영향에 기인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수도 있지만(형태에서 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체에서), 본 명세서에 사용되는 용어의 범주 내에 여전히 포함된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하고, 또한 박테리아, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 동물 세포, 예컨대 곤충 세포 및 포유류 세포, 예를 들어, 뮤린, 래트, 마카크 또는 인간을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 작제물은 박테리아에서 생성될 수 있다. 발현 후에, 본 발명의 항체 작제물은 가용성 분획에서 이콜라이(E.　coli) 세포 페이스트로부터 단리되고, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 및/또는 크기 배제를 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는, 예를 들어, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 공정과 유사하게 수행될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 본 발명의 항체 작제물에 대해 진핵 미생물, 예컨대 섬유상 진균 또는 효모가 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상적인 빵 효모가 더 하위의 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 클루이베로마이세스 락티스(K.　lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K.　fragilis)(ATCC 12424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K.　bulgaricus)(ATCC 16045), 클루이베로마이세스 위케라미(K.　wickeramii)(ATCC 24178), 클루이베로마이세스 왈티(K.　waltii)(ATCC 56500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸(K.　drosophilarum)(ATCC 36906), 클루이베로마이세스 써모톨러란스(K.　thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 막시아누스(K.　marxianus); 야로위아(yarrowia)(유럽 특허 제402 226호); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(유럽 특허 제183 070호); 칸디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(유럽 특허 제244 234호); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상성 진균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실룸(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 아스퍼질러스 니둘란스(A.　nidulans) 및 아스퍼질러스 니거(A.　niger)는 통상적으로 이용 가능하고, 본 명세서에서 유용하다.
본 발명의 글리코실화된 항체 작제물의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 숙주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 이집트 숲모기(모기), 흰줄숲모기(모기), 노랑초파리(과실파리), 및 누에나방으로부터의 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 대응하는 허용적 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 형질감염을 위한 다수의 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라 본 명세서의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토, 애기장대 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포 배양물 내 단백질의 생성에서 유용한 클로닝 및 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, 및 Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986] 참조.
그러나, 척추동물 세포에 가장 큰 관심이 있으며, 배양물(조직 배양물) 내 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배야 신장 계통(상청액 배양물 중에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌[Graham et al. , J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CVI ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2,1413 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC　5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 계통(Hep G2)이다.
추가 실시형태에서 본 발명은 본 발명의 항체 작제물의 생산 방법을 제공하며, 상기 공정은 본 발명의 항체 작제물의 발현을 허용하고 생산된 항체 작제물을 배양물로부터 회수하는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배양시키는"은 배지 내 적합한 조건 하에서 세포의 시험관내 유지, 분화, 성장, 증식 및/또는 전파를 지칭한다. 용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 발명의 항체 작제물의 생성에 연루된 임의의 단계를 포함한다.
재조합 기법을 이용할 때, 항체 작제물은 주변 세포질 공간에서 세포내로 생성될 수 있고, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체 작제물이 제1 단계로서 세포내로 생성된다면, 숙주 세포 또는 용해된 단편 중 하나인 미립자 파편은, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌[Carter　et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)]은 이콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리시키기 위한 절차를 기재한다. 간략하게, 세포 페이스트는 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 입수 가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 펠콘(Pellcon) 한외여과 단위를 이용하여 처음 농축된다. 프로테아제 저해제, 예컨대 PMSF는 단백질 분해를 저해하기 위해 임의의 앞서 언급한 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
숙주 세포로부터 제조된 본 발명의 항체 작제물은, 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 회수되거나 또는 정제될 수 있다. 회수될 항체에 따라서 단백질 정제를 위한 다른 기법, 예컨대 이온 교환 칼럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(Sepharose)(상표명) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전을 또한 이용 가능하다. 본 발명의 항체 작제물이 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 ABX(Bakerbond ABX) 수지(J.T.　Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다.
친화도 크로마토그래피는 바람직한 정제 기법이다. 친화도 리간드가 부착된 기질은 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 기질도 이용 가능하다. 기계적으로 안정한 기질, 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스타이렌다이비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 때보다 더 빠른 속도 및 더 짧은 가공 시간을 허용한다.
게다가, 본 발명은 본 발명의 항체 작제물 또는 본 발명의 방법에 따라 생산된 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 대해 항체 작제물의 동질성은 ≥ 80%, 더 바람직하게는 ≥ 81%, ≥ 82%, ≥ 83%, ≥ 84%, 또는 ≥ 85%, 더 바람직하게는 ≥ 86%, ≥ 87%, ≥ 88%, ≥ 89%, 또는 ≥ 90%, 훨씬 더 바람직하게는, ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, 또는 ≥ 95% 및 가장 바람직하게는 ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98% 또는 ≥ 99%인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에 대한 투여에 적합한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 약제학적 조성물은 바람직하게는 치료적 유효량으로 하나의 또는 복수의 본 발명의 항체 작제물(들)을 포함한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 1종 이상의 (약제학적으로 유효한) 담체, 안정제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면활성제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제의 적합한 제형을 추가로 포함한다. 조성물의 허용 가능한 구성성분은 바람직하게는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 액체, 냉동 및 동결건조된 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 투여에 적합한, 특히 비경구 투여에 적합한 임의의 및 모든 수성 및 비수성 용액, 멸균 용액, 용매, 완충제, 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 물, 현탁액, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 리포좀, 분산물 배지 및 코팅을 의미한다. 약제학적 조성물 중의 이러한 배지 및 제제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있고, 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다.
특정 실시형태는 본 발명의 항체 작제물 및 추가적인 1종 이상의 부형제, 예컨대 본 명세서의 이 부문 및 다른 곳에 예시적으로 기재된 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 부형제는 매우 다양한 목적에 대해 본 발명에서 사용될 수 있으며, 예컨대 제형의 물리적, 화학적 또는 생물학적 특성의 조절, 예컨대 점성도의 조절, 및 또는 유효성을 개선시키고 시키거나 이러한 제형을 안정화시키기 위한 본 발명의 공정 및 제조, 선적, 저장, 사용 전 제제, 투여 동안 그리고 그 이후에 일어나는 스트레스에 기인하여 분해 및 부패에 대한 공정에서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, pH, 삼투압, 점성도, 명확성, 색상, 등장성, 냄새, 멸균, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 조성물의 흡수 또는 침투를 변형시키거나, 유지하거나 또는 보존하는 목적을 위한 제형 물질을 함유할 수 있다(문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company] 참조). 이러한 실시형태에서, 적합한 제형 물질은 하기를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다:
Figure 112018076210054-pct00010
아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 프롤린, 2-페닐알라닌, 하전된 아미노산, 바람직하게는 라이신, 라이신 아세테이트, 알기닌, 글루타메이트 및/또는 히스티딘을 포함함
항미생물제, 예컨대, 항박테리아제 및 항진균제
항산화제, 예컨대 아스코르브산, 메티오닌, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨;
생리적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서 조성물을 유지하기 위해 사용되는 완충제, 완충제 시스템 및 완충 제제; 완충제의 예는 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산, 숙신산염, 인산염 및 히스티딘; 예를 들어 약 pH 7.0 내지 8.5의 트리스 완충제임;
비수성 용매, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브유 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레이트;
물, 알코올을 포함하는 수성 담체/식염수 및 완충 배지를 포함하는 수용액, 에멀션 또는 현탁액;
생분해성 중합체, 예컨대 폴리에스터;
증량제, 예컨대 만니톨 또는 글리신;
킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA);
등장성 및 흡수 지연제;
착화제, 예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린)
충전제;
단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 탄수화물은 비환원 당, 바람직하게는 트레할로스, 수크로스, 옥타설페이트, 솔비톨 또는 자일리톨일 수 있음;
바람직하게는 인간 유래의 (저분자량) 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질성 담체, 예컨대 인간 또는 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, ;
착색제 및 향미제;
황 함유 환원제, 예컨대 글루타티온, 티옥산, 티오글리콜산나트륨, 티오글리세롤, [알파]-모노티오글리세롤 및 티오황산나트륨
희석제;
유화제;
친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈)
염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨;
보존제, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 기체 등; 예는 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 또는 또는 과산화수소임);
금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물;
용매 및 공용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜);
당 및 당 알코올, 예컨대, 트레할로스, 수크로스, 옥타설페이트, 만니톨, 솔비톨 또는 자일리톨 스타키오스, 만노스, 솔보스, 자일로스, 리보스, 마이오이니시토스, 갈락토스, 락티톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤, 사이클리톨(예를 들어, 이노시톨), 폴리에틸렌 글리콜; 및 다가 당 알코올;
현탁제;
계면활성제 또는 습윤제, 예컨대 플루로닉스, PEG, 솔비탄 에스터, 폴리솔베이트, 예컨대 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔; 계면활성제는 바람직하게는 분자량 >1.2　KD인 세정제 및/또는 바람직하게는 분자량 >3　KD인 폴리에터일 수 있고; 바람직한 세정제의 비제한적 예는 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85이며; 바람직한 폴리에터의 비제한적 예는 PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 및 PEG 5000임;
안정성 향상제, 예컨대 수크로스 또는 솔비톨;
등장성 향상제, 예컨대 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 솔비톨;
염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정유를 포함하는 비경구 전달 비히클;
유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제(예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것)를 포함하는 정맥내 전달 비히클.
약제학적 조성물의 상이한 구성성분(예를 들어, 상기 열거한 것)은 상이한 효과를 가질 수 있고, 예를 들어, 아미노산은 완충제, 안정제 및/또는 항산화제로서 작용할 수 있으며; 만니톨은 증량제 및/또는 등장성 향상제로서 작용할 수 있고; 염화나트륨은 전달 비히클 및/또는 등장성 향상제 등으로서 작용할 수 있다는 것은 당업자에게 명확하다.
본 발명의 조성물은, 본 명세서에 정의된 본 발명의 폴리펩타이드에 추가로, 조성물의 의도된 용도에 따라서 추가적인 생물학적으로 활성인 제제를 포함할 수 있다는 것이 생각된다. 이러한 제제는 위장계 상에서 작용하는 약물, 세포정지제로서 작용하는 약물, 고요산혈증을 예방하는 약물, 면역반응을 저해하는 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드), 염증 반응을 조절하는 약물, 순환계 상에서 작용하는 약물 및/또는 당업계에 공지된 사이토카인과 같은 제제일 수 있다. 또한 본 발명의 항체 작제물이 공동 요법에서, 즉, 다른 항암 의약과 조합하여 적용된다는 것이 생각된다.
특정 실시형태에서, 최적의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 목적으로 하는 투약량에 따라서 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 참조]. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 본 발명의 항체 작제물의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 클리어런스에 영향을 미칠 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물 중의 1차 비히클 또는 담체는 천연에서 수성 또는 비수성일 수 있다. 예를 들어, 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물 중에서 통상적인 다른 물질로 보충한 주사용수, 생리 식염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가로 예시적인 비히클이다. 특정 실시형태에서, 본 조성물의 항체 작제물은 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 목적으로 하는 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적 제형화제와 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기 참조). 추가로, 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 작제물은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 이용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
비경구 투여가 상정될 때, 본 발명에서 사용하기 위한 치료 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 비히클 중에 목적으로 하는 본 발명의 항체 작제물을 포함하는 무 발열원, 비경구로 허용 가능한 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 본 발명의 항체 작제물이 적절하게 보존된 멸균, 등장 용액으로서 제형화된 멸균 증류수이다. 특정 실시형태에서, 상기 제제는 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는 제제, 예컨대 주사용 미소구체, 생부식성 입자, 중합체 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포좀에 의한 목적으로 하는 분자의 제형화를 수반할 수 있다. 특정 실시형태에서, 순환에서 지속된 지속기간을 촉진시키는 효과를 갖는 하이알루론산이 또한 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식 가능한 약물 전달 장치는 목적으로 하는 항체 작제물을 도입하기 위해 사용될 수 있다.
지속 또는 제어 전달/방출 제형에서 본 발명의 항체 작제물을 수반하는 제형을 포함하는 추가적인 약제학적 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생부식성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기법이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 마이크로입자의 제어 방출을 기재하는 국제 특허 출원 PCT/US93/00829 참조. 지속 방출 제제는 성형 물품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 반투과성 중합체 기질을 포함할 수 있다. 지속 방출 기질은 폴리에스터, 하이드로겔, 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 출원 공개 제058481호에 개시된 것), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer et al., 1981, 상기 참조) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산(유럽 특허 출원 공개 제133,988호)을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692]; 유럽 특허 출원 간행물 제036,676호; 유럽 특허 제088,046호 및 유럽 특허 제143,949호 참조.
항체 작제물은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합(예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀션에 갇힐 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 제제로서 제공된다. 멸균은 멸균 여과막을 통해 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조될 때, 이 방법을 이용하는 멸균은 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액 중에 저장될 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.
본 발명의 다른 양상은 국제 특허 출원 WO　06138181A2 (PCT/US2006/022599)에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물로서 사용될 수 있는 본 제형의 자기-완충 항체 작제물을 포함한다. 이와 관련하여 유용한 단백질 안정화 및 제형 물질 및 방법에 대해 다양한 논문을 이용 가능하며, 예컨대 문헌[Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), 및 Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)]을 참조하고, 특히 부형제 및 본 발명에 따른 자기-완충 단백질 제형에 대한 공정, 특히 수의학 및/또는 인간 의학 용도를 위한 단백질 약제학적 제품 및 공정에 관한 부분을 참조한다.
예를 들어, 제형의 이온 강도 및/또는 등장성을 조절하기 위해 그리고/또는 본 발명에 따른 조성물의 단백질 또는 다른 성분의 용해도 및/또는 물리적 안정성을 개선시키기 위해 본 발명의 특정 실시형태에 따라 염이 사용될 수 있다. 잘 공지된 바와 같이, 이온은 단백질 표면 상의 하전된 잔기에 결합함으로써 그리고 단백질의 하전된 기 및 극성기를 차폐시키고 그들의 정전기적 상호작용, 인력 및 반발력 상호작용의 강도를 감소시킴으로써 단백질의 천연 상태를 안정화시킬 수 있다. 이온은 또한, 특히, 단백질의 변성 펩타이드 연결(--CONH)에 대한 결합에 의해 단백질의 변성 상태를 안정화시킬 수 있다. 더 나아가, 단백질에서 하전된 기 및 극성기와의 이온 상호작용은 또한 분자간 정전기적 상호작용을 감소시킴으로써, 단백질 응집 및 불용성을 방해하거나 또는 감소시킬 수 있다.
이온 종은 단백질 상에서 그들의 효과가 상당히 상이하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제형화함에 있어서 사용될 수 있는 이온의 다수의 범주적 순위 및 단백질 상에서 그들의 효과가 개발되었다. 일 예는 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈인데, 이는 용액 중의 입체배좌 안정성에 대한 효과에 따라 이온성 및 극성 비이온성 용질의 순위를 매긴다. 용질의 안정화는 "코스모트로픽(kosmotropic)"으로서 지칭된다. 용질의 불안정화는 "카오트로픽(chaotropic)"으로서 지칭된다. 코스모트로프는 통상적으로 용액으로부터 단백질을 침전시키기 위해("염석") 고농도(예를 들어, 1몰 초과의 황산암모늄)에서 사용된다. 카오트로프는 통상적으로 단백질을 변성시키고/시키거나 용해시키기 위해("염용") 사용된다. "염용" 및 "염석"에 대한 이온의 상대적 유효성은 호프마이스터 시리즈에서 그들의 위치를 정한다.
유리 아미노산은 증량제, 안정제 및 항산화제뿐만 아니라 다른 표준 용도로서 본 발명의 다양한 실시형태에 따른 본 제형의 항체 작제물에서 사용될 수 있다. 라이신, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제형에서 단백질을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 글리신은 정확한 케이크 구조 및 특성을 보장하기 위한 동결건조에서 유용하다. 알기닌은 액체와 동결건조된 제형 둘 다에서 단백질 응집을 저해하는 데 유용할 수 있다. 메티오닌은 항산화제로서 유용하다.
폴리올은 당, 예를 들어, 만니톨, 수크로스, 및 솔비톨 및 다가 알코올, 예컨대, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜, 및 본 명세서의 논의의 목적을 위해, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련된 물질을 포함한다. 폴리올은 코스모트로픽이다. 그들은 물리적 그리고 화학적 분해 공정으로부터 단백질을 보호하기 위한 액체 제형과 동결건조된 제형 둘 다에서 유용한 안정제이다. 폴리올은 또한 제형의 등장성을 조절하는 데 유용하다. 본 발명의 선택 실시형태에서 유용한 폴리올은 동결건조 제형에서 케이크의 구조적 안정성을 보장하기 위해 통상적으로 사용되는 만니톨이다. 이는 케이크에 대한 구조적 안정성을 보장한다. 이는 일반적으로 동결보호제, 예를 들어, 수크로스와 함께 사용된다. 등장성을 조절하기 위한 제제 중에 그리고 수송 또는 제조 공정 동안 벌크의 제조 동안 냉동-해동 스트레스에 대해 보호하기 위한 안정제로서 솔비톨 및 수크로스가 바람직하다. 환원제(유리 알데하이드 또는 케톤기를 포함함), 예컨대 글루코스 및 락토스는 표면 라이신 및 알기닌 잔기를 당화시킬 수 있다. 따라서, 그들은 일반적으로 본 발명에 따른 용도를 위한 바람직한 폴리올이 아니다. 추가로, 산성 조건 하에서 프럭토스 및 글루코스로 가수분해되고, 결과적으로 당화를 발생하게 하는 이러한 반응성 종, 예컨대 수크로스를 형성하는 당은 또한 이와 관련하여 본 발명의 바람직한 폴리올이 아니다. PEG는 단백질을 안정화하는데 그리고 동결보호제로서 유용하고, 이와 관련하여 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 제형의 항체 작제물의 실시형태는 계면활성제를 추가로 포함한다. 단백질 분자는 표면 상에서 흡착되고, 공기-액체, 고체-액체 및 액체-액체 계면에서 후속적 응집이 되기 쉬울 수 있다. 이들 효과는 일반적으로 단백질 농도와 반비례하여 규모가 조정된다. 이들 해로운 상호작용은 일반적으로 단백질 농도와 반비례하여 규모가 조정되며, 전형적으로 생성물의 선적 및 조정 동안 생성된 물리적 교반에 의해 악화된다. 계면활성제는 일상적으로 표면 흡착을 방지하거나, 최소화하거나 또는 감소시키기 위해 사용된다. 이와 관련하여 본 발명에서 유용한 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 솔비탄 폴리에톡실레이트의 다른 지방산 에스터 및 폴록사머 188을 포함한다. 계면활성제는 또한 단백질 입체배좌 안정성을 제어하기 위해 통상적으로 사용된다. 이와 관련하여 계면활성제의 사용은 단백질-특이적인데, 임의의 주어진 계면활성제가 일부 단백질을 안정화시키고 다른 것들을 불안정화시키기 때문이다.
폴리솔베이트는 산화 분해되기 쉬우며, 종종, 공급된다면, 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 야기시키기 위해 충분한 양의 퍼옥사이드를 함유한다. 결과적으로, 폴리솔베이트는 주의해서 사용되어야 하며, 사용할 때, 가장 낮은 유효 농도로 사용되어야 한다. 이와 관련하여, 폴리솔베이트는 해당 부형제가 그들의 가장 낮은 유효 농도로 사용되는 일반적 규칙을 예시한다.
본 제형의 항체 작제물의 실시형태는 1종 이상의 항산화제를 추가로 포함한다. 일부 해로운 정도로 단백질의 산화는 적절한 수준의 주위 산소 및 온도를 유지함으로써 그리고 광에 대한 노출을 회피함으로써 약제학적 제형 중에서 방지될 수 있다. 단백질의 산화적 분해를 방지하기 위해 항산화제 부형제가 마찬가지로 사용될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 항산화제는 환원제, 산소/유리-라디칼 스캐빈저 및 킬레이트제이다. 본 발명에 따른 치료 단백질 제형에서 사용하기 위한 항산화제는 바람직하게는 수용성이며, 생성물의 보관수명 내내 그들의 활성을 유지한다. EDTA는 이와 관련하여 본 발명에 따른 바람직한 항산화제이다. 항산화제는 단백질을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 환원제, 예컨대 글루타티온은, 특히, 분자내 이황화 결합을 파괴할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 항산화제는 특히, 제형 중에서 그 자체가 단백질을 손상시킬 가능성을 제거하거나 또는 충분히 감소시키도록 선택된다.
본 발명에 따른 제형은 단백질 보조인자이고, 단백질 배위 착물을 형성하는 데 필수적인 금속 이온, 예컨대 특정 인슐린 현탁액을 형성하는 데 필수적인 아연을 포함할 수 있다. 금속 이온은 또한 단백질을 분해시키는 일부 과정을 저해할 수 있다. 그러나, 금속 이온은 또한 단백질을 분해시키는 물리적 및 화학적 과정을 촉매한다. 마그네슘 이온(10 내지 120mM)은 아스파르트산의 아이소아스파르트산으로의 이성질화를 저해하기 위해 사용될 수 있다. Ca+2 이온(100mM까지)은 인간 데옥시리보뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 그러나, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2는 rhDNase를 불안정화시킬 수 있다. 유사하게, Ca+2 및 Sr+2는 인자 VIII을 안정화시킬 수 있고, Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2에 의해 불안정화될 수 있으며, 그의 응집은 Al+3 이온에 의해 증가시킬 수 있다.
본 제형의 항체 작제물의 실시형태는 1종 이상의 보존제를 추가로 포함한다. 보존은 동일 용기로부터 1회 초과의 추출을 수반하는 다회 용량 비경구 제형을 개발할 때 필요하다. 그들의 1차적 기능은 약물 제품의 보관수명 또는 사용 기간 내내 미생물 성장을 저해하고 제품 멸균을 보장하는 것이다. 통상적으로 사용되는 보존제는 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존은 분자 비경구적 사용의 장기간 역사가 있지만, 보존제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 도전 중일 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대한 탈안정화 효과(응집)를 가지며, 이는 다회 용량 단백질 제형에서 그들의 용도를 제한함에 있어서 대수의 인자를 가진다. 지금까지, 대부분의 단백질 약물은 일회용 단독에 대해 제형화되었다. 그러나, 다회 용량 제형이 가능할 때, 그들은 환자의 편리함 및 증가된 시장성을 가능하게 하는 추가된 이점을 가진다. 양호한 예는 보존된 제형의 개발이 더 편리하고, 다회용의 주사 펜 제공의 상업화를 야기하게 하는 인간 성장 호르몬(hGH)이다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 적어도 4개의 이러한 펜 장치는 현재 시중에서 입수 가능하다. 노르디트로핀(액체, 노보 노르디스크(Nordisk)), 뉴트로핀 AQ(액체, 제넨테크(Genentech)) 및 제노트로핀(동결건조된--이중 챔버 카트리지, 파마시어(Pharmacia) 및 업존(Upjohn))은 페놀을 함유하는 한편, 소마트로프(엘리 릴리(Eli Lilly))는 m-크레졸에 의해 제형화된다. 몇몇 양상은 보존된 투약 형태의 제형 및 개발 동안 고려될 필요가 있다. 약물 제품 중의 유효한 보존적 농도는 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성을 손상시키는 일 없이 항미생물 유효성을 부여하는 농도로 투약 형태로 주어진 보존제를 시험하는 것을 필요로 한다.
예상될 바와 같이, 보존제를 함유하는 액체 재형의 개발은 동결건조 제형보다 더 도전 중에 있다. 냉동-건조된 제품은 보존제 없이 동결건조될 수 있고, 사용 시 희석제를 함유하는 보존제에 의해 재구성된다. 이는 보존제가 단백질과 접촉되는 시간을 단축시키며, 관련된 안정성 위험을 상당히 최소화한다. 액체 제형에 의해, 보존적 유효성 및 안정성은 전체 생성물 보관수명에 걸쳐(약 18 내지 24개월) 유지되어야 한다. 주목할 중요한 점은 활성 약물 및 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 보존제 유효성이 입증되어야 한다는 것이다.
본 명세서에 개시되는 항체 작제물은 또한 면역-리포좀으로서 제형화될 수 있다. "리포좀"은 포유류에 대한 약물의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소수포이다. 리포좀의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 이중층 형성에서 통상적으로 배열된다. 항체 작제물을 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)]; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 W0　97/38731에 기재된 것에 의해 제조된다. 순환 시간이 향상된 리포좀은 미국 특허 제 5,013, 556호에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용하는 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 목적으로 하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하기 위해 정해진 기공 크기의 필터를 통하여 압출된다. 본 발명의 항체 작제물의 Fab' 단편은 이황화물 교환 반응을 통해 문헌[Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같은 리포좀에 접합될 수 있다. 화학치료제는 선택적으로 리포좀 내에 함유된다. 문헌[Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)] 참조.
일단 약제학적 조성물이 제형화된다면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체, 결정으로서 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 멸균 바이알 중에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 바로 사용 가능한 형태로 또는 투여 전에 재구성되는(예를 들어, 동결건조된) 형태로 저장될 수 있다.
본 명세서에 정의된 약제학적 조성물의 생물학적 활성은, 예를 들어, 다음의 예에 기재된 바와 같이 WO　99/54440에서 또는 Schlereth 등(Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12)에 의해 세포독성 분석에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "효능" 또는 "생체내 효능"은, 예를 들어, 표준화된 NCI 반응 기준을 이용하여 본 발명의 약제학적 조성물에 의한 요법에 대한 반응을 지칭한다. 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 요법의 성공 또는 생체내 효능은 의도된 목적을 위한 조성물의 유효성, 즉, 목적으로 하는 효과, 즉, 병리 세포, 예를 들어, 종양 세포의 고갈을 야기하는 조성물의 능력을 지칭한다. 생체내 효능은 백혈구 계수, 차별, 형광 활성화 세포 분류, 골수 흡인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 각각의 질환 독립체에 대해 확립된 표준 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 추가로, 다양한 질환 특이적 임상 화학 매개변수 및 기타 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다. 더 나아가, 컴퓨터 보조 단층촬영, X-선, 핵자기 공명 단층촬영(예를 들어, 국립 암 연구소-기준 기반 반응 평가[Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), 양전자 방출 단층촬영 스캐닝, 백혈구 계수, 차별, 형광 활성화 세포 분류, 골수 흡인, 림프절 생검/조직학 및 다양한 림프종 특이적 임상 화학 매개변수(예를 들어, 락테이트 탈수소효소) 및 다른 확립된 표준 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물과 같은 약물의 개발에서 다른 주된 도전은 약동학적 특성의 예측 가능한 조정이다. 이를 위하여, 약물 후보의 약동학적 프로파일, 즉, 주어진 조건을 치료하기 위한 특정 약물의 능력에 영향을 미치는 약동학적 매개변수의 프로파일이 확립될 수 있다. 특정 질환 독립체를 치료하기 위한 약물의 능력에 영향을 미치는 약물의 약동학적 매개변수는 반감기, 분포 용적, 간 초회 대사 및 혈액 혈청 결합 정도를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 주어진 약물 제제의 효능은 상기 언급한 각각의 매개변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 그들은, 예를 들어, 약동학적 거동의 차이를 수반하는 특이적 Fc 양상을 구비하는 본 발명의 항체 작제물의 구상 중인 특징이다. 본 발명에 따른 항체 작제물을 표적화하는 연장된 반감기는 바람직하게는 상기 항체 작제물의 "정규" 비-HLE 형태에 비해 생체내에서 놀랍게 증가된 체류 시간을 나타낸다.
"반감기"는 투여되는 약물의 50%가 생물학적 과정, 예를 들어, 대사, 배설 등을 통해 제거되는 시간을 의미한다. "간 초회 통과 대사"는 약물이 간과 처음 접촉 시, 즉, 간을 통한 그의 초회 통과 동안 대사되는 경향을 의미한다. "분포 용적"은 신체의 다양한 구획 전체적으로 약물의 체류 정도, 예를 들어, 세포내 및 세포외 공간, 조직 및 기관 등 및 이들 구획 내의 약물의 분포를 의미한다. "혈액 혈청 결합 정도"는 혈액 혈청 단백질, 예컨대 알부민과 상호작용하고 결합하여 약물의 생물학적 활성의 감소 또는 손실을 야기하는 약물의 경향을 의미한다.
약동학적 매개변수는 또한 주어진 양의 투여 약물에 대한 생체이용 가능성, 지체 시간(Tlag), Tmax, 흡수 속도, 더 많은 개시 및/또는 Cmax를 포함한다. "생체이용 가능성"은 혈액 구획 내 약물의 양을 의미한다. "지체 시간"은 약물의 투여와 그의 검출 및 혈액 또는 혈장 중에서의 측정 가능성 사이의 시간 지연을 의미한다. "Tmax"는 약물의 최대 혈액 농도가 도달된 후의 시간이며, 그리고 "Cmax"는 주어진 약물에 의해 최대로 얻어진 혈액 농도이다. 생물학적 효과를 위해 필요한 약물의 혈액 또는 조직 농도에 도달하는 시간은 모든 매개변수에 의해 영향받는다. 상기 약술한 바와 같은 비침팬지 영장류에서의 전임상 동물 시험에서 결정될 수 있는 교차종 특이성을 나타내는 이중특이성 항체 작제물의 약동학적 매개변수는 또한, 예를 들어 Schlereth 등에 의한 간행물에서 제시된다(Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).
본 발명의 바람직한 양상에서, 약제학적 조성물은 약 -20℃에서 적어도 4주 동안 안정하다. 첨부하는 실시예로부터 명확한 바와 같이, 상이한 시스템을 이용하여 본 발명의 항체 작제물의 품질 대 당업계의 항체 작제물의 대응하는 품질이 시험될 수 있다. 해당 시험은 문헌["ICH Harmonised Tripartite Guideline: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C and Specifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B"]과 연결되는 것으로 이해되며, 따라서, 생성물의 동일성, 순도 및 효력의 변화가 검출되는 확실성을 제공하는 안정성-표시 프로파일을 제공하도록 선택된다. 용어 순도는 상대적 용어인 것으로 잘 수용된다. 글리코실화, 탈아마이드화, 또는 다른 이질성의 효과에 기인하여, 생명공학/생물학적 제품의 절대적 순도는 전형적으로 한 가지 초과의 방법에 의해 평가되어야 하며, 유래된 순도값은 방법-의존적이다. 안정성 시험의 목적을 위해, 순도에 대한 시험은 분해 산물의 결정을 위한 방법에 중점을 두어야 한다.
본 발명의 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물의 품질에 대한 평가를 위해, 예를 들어, 예를 들어 용액 중의 가용성 응집물 함량(HMWS/크기 배제)을 분석함으로써 분석될 수 있다. 약 -20℃에서 적어도 4주 동안의 안정성은 1.5% 미만의 HMWS, 바람직하게는 1% 미만 HMWS의 함량을 특징으로 하는 것이 바람직하다.
약제학적 조성물로서 항체 작제물을 위한 바람직한 제형은, 예를 들어, 이하에 기재하는 바와 같은 제형 성분을 포함할 수 있다:
제형 A:
pH　6.0에서 인산칼륨, L-알기닌 하이드로클로라이드, 트레할로스 2수화물, 폴리솔베이트 80
약제학적 조성물의 형태로 본 발명의 항체 작제물의 안정성 평가를 위한 다른 예는 첨부하는 실시예 4 내지 12에서 제공된다. 해당 예에서, 본 발명의 항체 작제물의 실시형태는 당업계에 공지된 항체 작제물과 맞물리는 이중특이성 T 세포의 다른 반감기 연장(HLE) 형식에 비교하여 상이한 약제학적 제형에서의 상이한 스트레스 조건 및 결과에 대해 시험된다. 일반적으로, 본 발명에 따른 특이적 Fc 양상을 구비한 항체 작제물은 전형적으로 상이한 HLE 형식을 구비한 항체 작제물 및 임의의 HLE 형식이 없는 항체 작제물(즉, "정규" 항체 작제물)에 비해 온도와 광 스트레스와 같은 광범위한 스트레스 조건에 걸쳐 더 안정하다는 것이 생각된다. 상기 온도 안정성은 감소된(냉동을 포함하는 실온 미만) 그리고 증가된(체온까지의 또는 체온 초과의 온도를 포함하는 실온 초과) 온도 둘 다에 관한 것일 수 있다. 당업자가 인정하는 바와 같이, 임상 실행에서 거의 회피할 수 없는 스트레스에 관한 이러한 개선된 안정성은 항체 작제물을 더 안전하게 만드는데, 임상 실행에서 더 적은 분해 생성물이 생기기 때문이다. 결과에서, 상기 증가된 안정성은 증가된 안전성을 의미한다.
일 실시형태는 본 발명의 항체 작제물, 또는 BCMA 발현 또는 BCMA 과발현과 상관 관계가 있는 B 세포 장애, 형질 세포 장애 및 자가면역 질환의 예방, 치료 또는 개선에서 사용하기 위한 본 발명의 과정에 따라 생성되는 항체 작제물을 제공한다.
본 명세서에 기재된 제형은 본 명세서에 기재된 병리적 의학 병태의 치료, 개선 및/또는 예방이 필요한 환자에서 약제학적 조성물로서 유용하다. 용어 "치료"는 치료적 치료와 예방적 또는 방지적 측정을 둘 다 지칭한다. 치료는 질환, 질환의 증상, 또는 질환에 대한 소인을 치료하거나, 치유하거나, 경감하거나, 완화시키거나, 변경하거나, 교정하거나, 좋아지게 하거나, 개선시키거나 또는 영향을 미치기 위한 목적으로 질환/장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인을 갖는 환자로부터의 신체, 단리된 조직 또는 세포에 대한 제형의 적용 또는 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개선"은 본 명세서에서 이하에 구체화되는 질환의 개선이 필요한 대상체에서 본 발명에 따른 항체 작제물의 투여에 의한 이들 질환을 갖는 환자의 질환 상태의 임의의 개선을 지칭한다. 이러한 개선은 또한 환자 질환의 진행의 늦춤 또는 중단으로서 알 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 명세서에서 이하에 구체화하는 종양 또는 암 또는 전이성 암을 갖는 환자의 발생 또는 재발의 회피가 필요한 대상체에게 본 발명에 따른 항체 작제물의 투여에 의한 종양 또는 암 또는 전이성 암을 갖는 환자의 발생 또는 재발의 회피를 의미한다.
용어 "질환"은 본 명세서에 기재된 항체 작제물 또는 약제학적 조성물에 의한 치료가 유리한 임의의 병태를 지칭한다. 이는 포유류가 당해 질환에 대한 성향을 갖게 만드는 해당 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다.
"신생물"은 조직의 비정상적 성장이지만, 항상 덩어리를 형성하지는 않는다. 또한 덩어리를 형성할 때, 이는 통상적으로 "종양"으로서 지칭된다. 신생물 또는 종양은 양성, 잠재적으로 악성(전암성) 또는 악성일 수 있다. 악성 신생물은 통상적으로 암으로 불린다. 그들은 보통 주변 조직을 침윤하고, 파괴하며, 전이를 형성하고, 즉, 그들은 신체의 다른 부분, 조직 또는 기관으로 퍼진다. 따라서, 용어 "전이성 암"은 본래 종양 중 하나보다 다른 조직 또는 기관에 대한 전이를 포함한다. 림프종 및 백혈병은 림프 신생물이다. 본 발명의 목적을 위해, 그들은 또한 용어 "종양" 또는 "암"에 의해 포함된다.
용어 "바이러스 질환"은 대상체의 바이러스 감염의 결과인 질환을 기재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역학적 장애"는 이 용어의 통상적인 정의와 관련하여 면역학적 장애, 예컨대 자가면역 질환, 과민증, 면역 결핍증을 기재한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 작제물 또는 본 발명의 방법에 따라 생산된 항체 작제물을 치료 또는 개선이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, BCMA 발현 또는 BCMA 과발현, 형질 세포 장애, 또는 자가면역 질환과 상관관계가 있는 B 세포 장애의 치료 또는 개선을 위한 방법을 제공한다.
형질 세포 장애에서, 형질 세포 중 하나의 클론은 비제어적으로 증식한다. 그 결과, 이 클론은 M-단백질로서 알려진 방대한 양의 단일(단클론성) 항체를 생산한다. 일부 경우에, 예컨대 단클론성 감마글로불린병증에 의해, 생산된 항체는 불완전하며, 경쇄 또는 중쇄만으로 이루어진다. 이들 비정상 형질 세포 및 그들이 생성하는 항체는 보통 하나의 유형으로 제한된다.
바람직하게는, 형질 세포 장애는 다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성골 형질세포종, 수질외 형질세포종, 골경화 골수종, 중쇄 질환, 의미불명의 단클론성 감마글로불린이상증 및 무증상 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. B 세포 장애는 또한 B-세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 및 호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
자가면역 질환은, 예를 들어, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염(RA)이다.
용어 "필요한 대상체" 또는 "치료가 필요한" 대상체는 이미 장애가 있는 대상체뿐만 아니라 장애가 예방될 대상체를 포함한다. ~가 필요한 대상체 또는 "환자"는 예방적 또는 치료적 처리를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다.
본 발명의 항체 작제물은 일반적으로 특정 경로 및 투여 방법에 대해, 특정 투약량 및 투여 빈도에 대해, 특정 질환의 특정 치료에 대해, 특히 생체 이용가능성 및 지속성의 범위로 설계될 것이다. 조성물의 물질은 바람직하게는 투여 부위에 대해 허용 가능한 농도로 제형화된다.
따라서 제형 및 조성물은 임의의 적합한 투여 경로에 의한 전달을 위해 본 발명에 따라 설계될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 투여 경로는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:
국소 경로(예컨대 표피, 흡입, 비강, 안과, 청각/귀, 질, 점막);
장 경로(예컨대, 경로, 위장, 설하, 구순하, 협측, 직장); 및
비경구 경로(예컨대 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 대뇌, 뇌실 내, 경막외, 척추강내, 피하, 복강내, 양막외, 관절내, 심장내, 진피내, 장애내, 자궁내, 방광내, 유리체내, 경피, 비강내, 경점막, 활액내, 관내).
본 발명의 약제학적 조성물 및 항체 작제물은 전형적으로, 예를 들어 주사, 예컨대 볼루스 주사에 의해 또는 주입, 예컨대 연속 주입에 의해 비경구 투여, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 전달에 특히 유용하다. 약제학적 조성물은 의학적 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하기 위한 의학적 장치의 예는 미국 특허 제4,475,196호; 제4,439,196호; 제4,447,224호; 제4,447, 233호; 제4,486,194호; 제4,487,603호; 제4,596,556호; 제4,790,824호; 제4,941,880호; 제5,064,413호; 제5,312,335호; 제5,312,335호; 제5,383,851호; 및 제5,399,163호에 기재되어 있다.
특히, 본 발명은 적합한 조성물의 중단되지 않는 투여를 제공한다. 비제한적 예로서, 중단되지 않는 또는 실질적으로 중단되지 않는, 즉, 연속적 투여는 환자의 신체 내로 치료제의 유입을 측정하기 위해 환자에 의해 착용되는 작은 펌프 시스템에 의해 실현될 수 있다. 본 발명의 항체 작제물을 포함하는 약제학적 조성물은 상기 펌프 시스템을 이용함으로써 투여될 수 있다. 이러한 펌프 시스템은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 통상적으로 주입될 치료제를 함유하는 카트리지의 주기적 교환에 의존한다. 이러한 펌프 시스템에서 카트리지를 교환할 때, 환자의 신체 내로 치료제의 다른 중단되지 않는 유동의 일시적 중단이 이어질 수 있다. 이러한 경우에, 카트리지 대체 전의 투여 단계 및 카트리지 대체 후 투여 단계는 여전히 약제학적 수단의 의미 내에서 고려될 것이며, 본 발명의 방법은 이러한 치료제의 하나의 "중단되지 않은 투여"를 구성한다.
본 발명의 항체 작제물의 연속적 또는 중단되지 않은 투여는 저장소 밖으로 유체를 구동하기 위한 유체 구동 기계 및 구동 기계를 작동시키기 위한 작동 기계를 포함하는 유체 전달 장치 또는 작은 펌프 시스템에 의해 정맥내 또는 피하일 수 있다. 피하 투여를 위한 펌프는 환자의 피부에 참투시키기 위한 그리고 환자의 신체 내로 적합한 조성물을 전달하기 위한 바늘 또는 캐뉼라를 포함할 수 있다. 상기 펌프 시스템은 정맥, 동맥 또는 혈관과 독립적으로 환자의 피부에 직접 고정되거나 또는 부착됨으로써, 펌프 시스템과 환자의 피부 사이의 직접적인 접촉을 허용할 수 있다. 펌프 시스템은 며칠까지 24시간 동안 환자의 피부에 부착될 수 있다. 작은 용적을 위한 저장소를 갖는 펌프 시스템은 작은 크기를 가질 수 있다. 비제한적 예로서, 투여될 적합한 약제학적 조성물에 대한 저장소의 용적은 0.1 내지 50㎖일 수 있다.
연속적 투여는 또한 피부 상에 입혀지는 패치에 의해 경피일 수 있고, 간격을 두고 대체될 수 있다. 당업자는 본 목적에 적합한 약물 전달을 위한 패치 시스템을 인식한다. 처음에 사용한 패치의 교환은 유리하게는, 예를 들어 처음에 사용한 패치에 바로 인접한 피부 표면 상에서 새로운 두 번째 패치의 배치와 동시에 그리고 처음에 사용한 패치의 제거 직전에 수행될 수 있기 때문에 경피 투여는 특히 중단되지 않는 투여를 잘 받아들인다는 것을 주목한다. 유동 중단 또는 파워셀 고장의 문제는 일어나지 않는다.
약제학적 조성물이 동결건조되었다면, 동결건조된 물질은 투여 전에 적절한 액체 중에서 처음 재구성된다. 동결건조된 물질은, 예를 들어, 정균성 주사용수(BWFI), 생리 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS) 중에서, 동결건조 전에 단백질이 있었던 동일 제형으로 재구성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비-침팬지 영장류, 예를 들어, 마카크에 대해 본 명세서에 기재된 교차종 특이성을 나타내는 본 발명의 항체 작제물의 증가된 용량의 투여에 의한, 예를 들어 용량 상승적 연구에 의해 결정될 수 있는 적합한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 제시한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 교차종 특이성을 나타내는 본 발명의 항체 작제물은 비침팬지 영장류에서의 전임상 시험에서 그리고 인간에서의 약물로서 동일한 형태로 유리하게 사용될 수 있다. 투약량 요법은 담당 의사 및 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 공지된 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 투약량은 환자의 크기, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적 건강상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 다수의 인자에 의존한다.
용어 "유효 용량" 또는 "유효 투약량"은 목적으로 하는 효과를 달성하거나 또는 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양으로서 정의된다. 용어 "치료적 유효 용량"은 이미 질환에 걸린 환자에서 질환 및 그의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 정의된다. 이 용도에 유요한 양 또는 용량은 치료될 병태(적응증), 전달되는 항체 작제물, 치료적 상황 및 목적, 질환의 중증도, 사전 요법, 환자의 임상 이력 및 치료제에 대한 반응, 투여 경로, 크기(체중, 신체 표면 또는 기관 크기) 및/또는 환자의 병태(연령 및 일반적 건강상태) 및 환자 자신의 면역계의 일반적 상태에 의존할 것이다. 적절한 용량은 한 번 또는 일련의 투여에 걸쳐 환자에게 투여될 수 있도록, 그리고 최적의 치료 효과를 얻기 위해 담당 의사의 판단에 따라 조절될 수 있다.
전형적인 투약량은 상기 언급한 인자에 따라서 약 0.1㎍/㎏ 내지 약 30㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 구체적 실시형태에서, 투약량은 1.0㎍/㎏ 내지 약 20㎎/㎏, 선택적으로 10㎍/㎏ 내지 약 10㎎/㎏ 또는 100㎍/㎏ 내지 약 5㎎/㎏의 범위일 수 있다.
본 발명의 항체 작제물의 치료적 유효량은 바람직하게는 질환 증상의 중증도 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간의 증가 또는 질환 고통에 기인하는 손상 또는 장애의 예방을 초래한다. 본 명세서에서 상기 기재한 바와 같은 BCMA 발현과 상관 관계가 있는 질환을 치료하기 위해, 본 명세서에서 치료적 유효량의 본 발명의 항체 작제물: 항-BCMA/항-CD3 항체 작제물은, 바람직하게는 비치료 환자에 비해 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%만큼 세포 성장 또는 종양 성장을 저해한다. 종양 성장을 저해하는 화합물의 능력은 효능을 예측하는 동물 모델에서 평가될 수 있다.
약제학적 조성물 치료제 단독으로서 또는 필요하다면 추가적인 치료제, 예컨대 항암 요법, 예를 들어, 다른 단백질성 및 비단백질성 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 이들 약물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 작제물을 포함하는 조성물과 동시에 또는 시기 적절하게 정해진 간격 및 용량으로 상기 항체 작제물의 투여 전에 또는 후에 별개로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효 및 비독성 용량"은 주된 독성 효과 없이 또는 본질적으로 없이 병적 세포의 고갈, 종양 제거, 종양 수축 또는 질환의 안정화를 야기하기에 충분히 높은 본 발명의 항체 작제물의 용인 가능한 용량을 지칭한다. 이러한 유효 및 비독성 용량은, 예를 들어, 당업계에 기재된 용량 상승 연구에 의해 결정될 수 있고, 중증의 유해한 부작용(용량 제한 독성, DLT)을 유도하는 용량 미만이어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "독성"은 부작용 또는 중증의 부작용으로 나타나는 약물의 독성 효과를 지칭한다. 이들 부작용은 일반적으로 약물 내약성의 결여 및/또는 투여 후 국소 내성의 결여를 지칭할 수 있다. 독성은 또한 약물에 의해 야기되는 기형 유발성 또는 발암 효과를 포함할 수 있었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"은 투여 후 그리고 약물의 더 장기간의 적용 동안 직접적으로 중증의 부작용(국소 내성)을 유도하지 않는 약물의 투여를 정의한다. "안전성", "생체내 안전성" 또는 "내약성"은, 예를 들어 치료 및 후속 기간 동안 규칙적 간격으로 평가될 수 있다. 측정은 임상적 평가, 예를 들어, 기관 징후, 및 실험 이상의 선별을 포함한다. 임상 평가가 수행될 수 있으며, 정상 소견에 대한 편차는 NCI-CTC 및/또는 MedDRA 표준에 따라 기록/암호화된다. 기관 징후는 예를 들어, 3등급 이상의 일반적인 부작용 범주(Common Terminology Criteria for adverse events v3.0)(CTCAE)에 제시된 바와 같은 기준, 예컨대 알레르기/면역학, 혈액/골수, 심장 부정맥, 응고 등을 포함할 수 있다. 시험될 수 있는 실험 매개변수는, 예를 들어, 혈액학, 임상 화학, 응고 프로파일 및 소변 분석 및 다른 체액 검사, 예컨대 혈청, 혈장, 림프구 또는 척수액, 리큐어 등을 포함한다. 따라서 안전성은, 예를 들어 신체 검사, 영상화 기법(즉, 초음파, x-선, CT 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), 기술적 장치에 의한 다른 측정(즉, 심전도), 활력징후에 의해, 실험실 매개변수를 측정함으로써 그리고 부작용을 기록함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서 비-침팬지 영장류에서의 부작용은 조직병리학적 및/또는 조직화학적 방법에 의해 시험될 수 있다.
상기 용어는 또한, 예를 들어, 생체기법-유래 약제 S6의 전임상 안전성 평가(Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6); 문헌[ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997]에 언급된다.
최종적으로, 본 발명은 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 따라 생산된 항체 작제물, 본 발명의 약제학적 조성물, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 본 발명의 벡터 및/또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "키트"는 용기, 수용기 또는 기타에 함께 포장된 2 이상의 성분 - 이중 하나는 본 발명의 항체 작제물, 약제학적 조성물, 숙주 세포의 벡터에 대응함 -을 의미한다. 따라서 키트는 단일 단위로서 시판될 수 있는 특정 목표를 달성하기에 충분한 제품 및/또는 기구의 세터로서 기재될 수 있다.
키트는 투여를 위한 적절한 투약량으로 본 발명의 항체 작제물 또는 약제학적 조성물을 함유하는 임의의 형상, 크기 및 물질(바람직하게는 방수, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리) 중 하나 이상의 수용기(예컨대, 바이알, 앰플, 용기, 주사기, 병, 백(bag))를 포함할 수 있다. 키트는 추가적으로 사용을 위한 지침(예를 들어 리플렛 또는 설명서 매뉴얼의 형태로), 본 발명의 항체 작제물을 투여하기 위한 수단, 예컨대, 주사기, 펌프, 주입기 등, 본 발명의 항체 작제물을 재구성하기 위한 수단 및/또는 본 발명의 항체 작제물을 희석시키기 위한 수단을 수용할 수 있다.
본 발명은 또한 일회용 투여 단위를 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 또한 건조/동결건조된 항체 작제물을 포함하는 제1 수용기 및 수성 제형을 포함하는 제2 수용기를 수용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 단일 챔버 및 다중 챔버의 사전 충전된 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결건조주사기)를 수용하는 키트가 제공된다.
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본 명세서에서 사용되는 단수의 형태는 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고, "방법"에 대한 언급은 동등한 단계에 대한 언급 및 본 명세서에 기재된 방법으로 변형되거나 또는 치환될 수 있는 당업계에 공지된 방법을 포함한다.
달리 표시되지 않는 한, 일련의 구성요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 시리즈 내 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태와 동등한 다수의 동등물을 이용하는 것을 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 어디에서나 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 구성요소의 모두 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 그리고 더 바람직하게는 주어진 값 또는 범위의 5% 이내를 의미한다. 그러나, 또한 구체적인 수를 포함하며, 예를 들어, 약 20은 20을 포함한다.
용어 "보다 적은" 또는 "보다 큰"은 구체적인 수를 포함한다. 예를 들어, 20보다 적은은 더 적거나 또는 동일함을 의미한다. 유사하게, 보다 많은 또는 보다 큰은 각각 보다 많거나 동일함 또는 보다 크거나 동일함을 의미한다.
본 명세서 및 다음의 청구범위 전체적으로, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 변형, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 제외를 의미하지는 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 본 명세서에서 용어 "갖는"과 함께 사용될 때 용어 "함유하는" 또는 "포함하는"으로 대체될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "이루어진"은 청구범위 요소에서 구체화되지 않은 임의의 구성요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 명세서에서 사용될 때, "본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본적 그리고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 제외하지 않는다.
본 명세서의 각각의 예에서, 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 물질, 시약 및 물질 등으로 제한되지 않으며, 이들은 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시형태만을 기재하는 목적을 위한 것이며, 청구범위에 의해서만 정해지는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
상기 참조이든 또는 이하 참조이든 본 명세서의 내용 전체적으로 인용된 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학적 간행물, 제조업자의 명세서, 설명서 등을 포함)는 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명 때문에 이러한 개시내용보다 선행한다는 자격이 부여되지 않는다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 참고로 포함되는 물질이 본 명세서와 모순되거나 또는 일치되지 않는 정도로, 본 명세서는 임의의 이러한 물질을 대체할 것이다.
본 발명의 그리고 그의 이점의 더 양호한 이해는 단지 예시적 목적을 위해 제공되는 다음의 실시예로부터 얻을 것이다. 실시예는 임의의 방법에서 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이하에 기재되는 실시예는 본 발명에 따른 다른 이중특이성 항체 작제물과 유사하게, 즉, 동일한 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
실시예 1: 표적 세포의 부재 하에 T 세포 상의 BiTE(등록상표) 유도 CD69 발현
건강한 인간 공여자로부터 단리된 PBMC를 48시간 동안 표적 B/CD3 또는 표적 A/CD3 HLE 이중특이성 항체 작제물을 증가시키면서 배양시켰다. 면역염색법 및 유세포분석 및 항원 특이적 접합체 mAb에 의해 T 세포 상에서 활성화 마커 CD69의 발현을 결정하였다.
CD69 상향조절에 대한 표적-독립적 T 세포 활성화를 모든 항-CDH 19 작제물에 대해 관찰하였지만, 이형Fc 및 크로스바디 분자에 대해 가장 확연하였다. 항-표적 B-scFc에 의한 CD69의 상향조절은 보다 고농도에서 발생하였고, 진폭은 다른 2개의 Fc-기반 작제물에 비해 부분적으로 더 낮았다.
항-표적 A에 대해, scFc-함유 분자에 대해 관찰되는 표적-독립적 T 세포 활성화는 거의 없는 반면, 이형Fc 작제물은 표적 세포의 부재 하에 세포 표면 T 세포 상에서 CD69의 강한 상향조절을 유도하였다.
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 작제물에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
BiTE(등록상표) 작제물(연속 희석: 0.1pM 내지 2μM)
a. 표적 A-I2C scFc; 1.14㎎/㎖;
b. 표적 A 이형 Fc; 1.02㎎/
인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자; #065, #823, #836(scFc) #401, #415, #433(이형Fc); #590, #595, 598, #605(X-바디)).
48시간 인큐베이션 시간
유세포분석기 및 항원-특이적 접합체 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 CD69 발현의 결정. 결과는 도 2를 참조함.
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 또는 크로스바디 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 항체 작제물에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
BiTE(등록상표) 작제물(연속 희석: 0.1pM 내지 2 μM)
c. 표적 B x I2C-scFc; 245.3㎍/㎖(
d. 표적 B　이형 Fc;　1㎎/㎖　
e. 표적 B 크로스바디; 6.3㎎/㎖
인간 PBMC 효과기 세포(3 내지 4명의 공여자; #386, #392, #401(scFc) #282, #284, #287(이형Fc)).
48시간 인큐베이션 시간
유세포분석기 및 항원-특이적 접합체 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서 CD69 발현의 결정. 결과는 도 3을 참조함.
이들 분석에서 시험한 몇몇 이중특이성 작제물에 대해 CD69 상향조절에 대해 표적-독립적 T 세포 활성화를 관찰하였다. CD69 상향조절은 일반적으로 각각의 scFc 작제물에 비교할 때 정규 BiTE(등록상표) 항체 작제물, 이형Fc 및 크로스바디 분자에 대해 더 확연하였다. scFc 작제물에 의한 CD69의 상향조절은 일반적으로 약간 더 높은 농도에서 발생하였고, 진폭은 다른 2개의 Fc-기반 작제물에 비해 부분적으로 더 낮았다.
항-표적 B scFc 작제물에 대해, 표적-독립적 T 세포 활성화는 관찰되지 않은 반면, 이형Fc 및 X-바디 작제물은 표적 세포의 부재 하에 T 세포의 세포 표면 상에서 CD69의 강한 상향조절을 유도하였다.
추가로, 항-표적 C 및 항-표적 G 작제물을 이용하는 분석에서 CD69의 표적 세포-독립적 상향조절은 관찰되지 않았다. 골수성 계통의 세포 상에서 표적의 발현에 기인하여, 이들 세포는 분석 설정 전에 제거되었다. 이들 데이터는 이중특이성 작제물의 Fc 영역의 FcγR-발현 세포와의 상호작용이 T 세포 상에서 CD69의 표적-독립적 유도를 초래할 수 있다는 것을 나타낸다.
종양 세포의 부재 하에서 항-표적　H-scFc 작제물에 의한 T 세포 상에서 CD69의 강한 상향조절은 T 세포 상에서 표적 H의 발현에 기인한다.
물질 및 방법
1. 표적 I
다음의 작제물에 대해 단일쇄-Fc를 포함하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T　세포 활성화:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물 (연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 I-scFc
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
2. 표적 D
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 또는 크로스바디 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 D-hetFc(이형-Fc)
2. 표적 D-scFc
3. 표적 D-X-바디 (표적 D 크로스바디)
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
3. 표적 C
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 또는 크로스바디 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 C-정규
2. 표적 C-scFc
3. 표적 C-hetFc
4. 표적 C-X-바디
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
4. 표적 B
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 또는 크로스바디 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 B-scFc
2. 표적 B-hetFc
3. 표적 B-X-바디
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
5. 표적 A
C-말단에서 단일쇄-Fc 또는 이형-Fc 또는 크로스바디 융합을 함유하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 A-scFc
2. 표적 A-hetFc
3. 표적 A-X-바디
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
6. 표적 F
단일쇄-Fc 또는 이형-Fc를 포함하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도된 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 F-정규
2. 표적 F-scFc
3. 표적 F-hetFc
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
7. 표적 E
단일쇄-Fc 또는 이형-Fc를 포함하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도된 표적-독립적 T 세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물(연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 E-정규
2. 표적 E-scFc
3. 표적 E-hetFc
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
8. 표적 H
단일쇄-Fc를 포함하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T　세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물 (연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 H-scFc
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
9. 표적 G
단일쇄-Fc를 포함하는 BiTE(등록상표) 분자에 의해 유도되는 표적-독립적 T　세포 활성화를 다음의 작제물에 대해 평가하였다:
1. BiTE(등록상표) 항체 작제물 (연속 희석: 1.3pM 내지 20nM)
1. 표적 G-scFc
2. 인간 PBMC 효과기 세포(3명의 공여자; CD14+/CD33+ 세포 고갈됨)
3. 48시간 인큐베이션 시간
4. CD69에 특이적인 PE-Cy7 접합된 mAb를 이용하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 상에서의 CD69 발현의 유세포분석.
실시예 2:
정제된 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 감소된 농도로(100nM, 1:4 희석) 막시소브 플레이트(Maxisorb Plate) 상에서 코팅시켰다. PBS-T로 3x 세척하고 PBS/3%(w/v) BSA(60분, 37℃)로 차단시킨 후에, 풀링한 인간 혈장을 60분 동안, 실온에서 80rpm로 인큐베이션시켰다. 3x회 세척 후에, 인간 C1q 서브유닛 A(CC1q)에 특이적인 마우스 단클론성 항체를 60분 동안, 실온에서 80rpm로 첨가하고(써모(Thermo) MA1-83963, 1:500) 기재한 세척 단계 후에, 염소 항 마우스 Fc-POX mAb(1:5,000)를 60분 동안, 실온에서 80rpm로 인큐베이션시켰다. 추가 세척 후에, TMB 기질을 인큐베이션시키고, H2SO4의 첨가에 의해 표색 반응 후에 중단시켰다. 450㎚에서 흡수를 결정하였다.
결과: 고농도에서 도 4에서 나타내는 바와 같이, BiTE(등록상표) 이형 Fc 작제물(정사각형)은 BiTE(등록상표) 단일쇄 Fc 작제물(삼각형)에 비해 인간 CC1q에 대해 더 높은 결합 신호를 나타내었다. 음성 대조군으로서, 상당한 CC1q 결합을 나타내지 않은 정규 BiTE(등록상표)(원)를 사용하였다.
실시예 3: 반감기 연장 양상에 융합된 BiTE(등록상표) 항체 작제물의 약동학
다양한 표적 결합 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 4개의 상이한 반감기 연장 모이어티에 융합시켰다. BiTE(등록상표) 항체마다 이용 가능한 모든 상이한 HLE-변이체를 약동학적(PK) 연구와 관련하여 사이노몰거스 원숭이에서 시험하였다. 표적 결합제에 부착된 반감기 연장 양상에 따라 그들을 후속적으로 BiTE(등록상표)-scFc, BiTE(등록상표)-hetFc, BiTE(등록상표)-HALB, BiTE(등록상표)-X바디로 명명한다. 비-HLE BiTE(등록상표) 분자를 "정규" BiTE(등록상표)로 명명한다. 이들 분자의 대응하는 명명법을 이하의 표 4에 간략하게 요약한다.
단일 용량 BiTE(등록상표) 분자의 화합물 명명법
화합물 동의어 시험 화합물 명칭
화합물 1a 표적 C -scFc
화합물 1b 표적 C -hetFc
화합물 1c 표적 C-HALB
화합물 2a 표적 A -scFc
화합물 2b 표적 A -hetFc
화합물 2c 표적 A-HALB
화합물 2d 표적 A-X바디
화합물 3a 표적 B-scFc
화합물 3b 표적 B -hetFc
화합물 3c 표적 B-HALB
화합물 3d 표적 B-H6
화합물 4a 표적 D-scFc
화합물 4b 표적 D-hetFc
화합물 5a 표적 E -scFc
화합물 5b 표적 E -hetFc
화합물 5c 표적 E-HALB
화합물 6a 표적 F-scFc
화합물 6b 표적 F-HALB
화합물 7 표적 G-scFc
화합물 8 표적 H-scFc
화합물 9 표적 I cc-scFc
화합물 10a BCMA (cc)-scFc
화합물 10b BCMA (정규 BiTE(등록상표))
BiTE(등록상표) 분자를 정맥내 볼루스(화합물1b, 2a-d, 3a/b, 4a/b, 5a-5c, 7-9) 및 정맥내 주입으로서(화합물 1a, 1c, 3c/d, 6a/b, 각각 30분 주입으로서) 투여하였다. BiTE(등록상표) 분자를 각각 3㎍/㎏ 내지 6㎍/㎏, 12㎍/㎏ 및 15㎍/㎏의 용량-선형의, 약동학적으로 적절한 범위에서 투여하였다. 화합물 10a을 짧은 정맥내 볼루스 주사로서, 정규 작제물(화합물 10b)을 연속적 정맥내 주입으로서 투여하였다. 화합물 10a와 10b 둘 다에 대한 약동학적 매개변수를 비교하기 위해, 주입이 끝난 직후에 시작해서 최종 단계에만 정규 BCMA-BiTE(등록상표)에 대해 도 5에 나타낸다. BCMA BiTE(등록상표) 분자를 용량 선형의, 약동학적으로 적절한 범위의 15㎍/㎏으로 투여하였다. 비교 가능성의 이유를 위해, 도 5에 나타낸 혈청 농도를 용량 정규화시키고, 분자량-정규화시킨다(n㏖로 기재함). 각각의 상기 명명한 화합물에 대해, 3마리의 동물 중 적어도 2마리의 그룹을 사용하였다. 혈액 샘플을 수집하고 나서, 혈청을 혈청 농도의 결정을 위해 제조하였다. 면역분석을 이용하여 혈청 BiTE(등록상표) 항체 수준을 측정하였다. BiTE(등록상표) 분자의 코팅 및 검출을 위해 항-CD3 유전자형 항체 쌍을 사용하는 면역분석을 이용하여 혈청 BCMA BiTE(등록상표) 수준을 측정하였다. 혈청 농도-시간 프로파일을 사용하여 PK 매개변수를 결정하였다. 적절한 연구 설정을 BiTE(등록상표) 분자의 특징에 대해 조정하였다: 1-주- 또는 2-주 지속기간. 혈액 샘플링 시점을 약간 변화시키고, 이하의 표 5에서 설정 둘 다에 대해 열거한다.
PK 연구 동안 혈액 샘플링 시점. 시점은 단일 연구 간에 변할 수 있었다. 별표로 표지한 시점은 의무사항이며, 모든 연구에 대해 공통적이었다
1-주 연구 지속기간 동안의 혈액 샘플링 시점
[h]		 2-주 연구 지속기간 동안의 혈액 샘플링 시점
[h]		 화합물 10a에 대한 혈액 샘플링 시점; 주입의 시작 후[h] 화합물 10b에 대한 혈액 샘플링 시점; 주입의 시작 후 [h]
0.05 / 0.085* 0.05 / 0.085* 0.085
0.25 0.25 0.25
0.5 0.5 0.5
1 1 1
2 2
4* 4* 4
8 8 8
24 16 16
24* 24* 24
48* 48* 48
72* 72* 72
96 96
120 120
144 144
168* 168* 168 168.00
216 169.01
240 240 172.01
264 175.99
336* 336 180.00
BiTE(등록상표)-HLE 분자의 약동학을 표 6에 예시적으로 나타낸다. 각각의 화합물기는 scFc-, hetFc-, HSA-(인간 혈청 알부민, HALB) 또는 크로스바디-Fc-형식에 융합된 또는 정규 BiTE(등록상표) 분자로서 남아있는 동일한 BiTE(등록상표) 단백질을 상징한다. 모든 단백질에 대해, 혈청 수준은 BiTE(등록상표)- 분자 투여 후에 모든 동물에서 모든 시점에 대해 정량화 가능하였다. PK 프로파일은 각각의 단일 시험 항목 투여 후에 2상, 기하급수적 감소를 기재한다.
표준 비구획 분석(NCA) 방법을 이용하여 약동학적 매개변수를 결정하였다. 비-구획 분석을 이용하여, 다음의 PK 매개변수를 추정하였다: AUCinf(혈청 농도-시간 곡선 하 면적), Vss(정상 상태에서의 분포 용적), CL(전신 클리어런스) 및 최종 t1/2(최종 반감기).
각각의 시험 화합물에 대한 PK 매개변수를 이하의 표 6에서 각각 n=2 및 n=3의 평균으로서 요약한다.
사이노몰거스 원숭이에서 상이한 BiTE (등록상표)-표적 결합제로부터의
다양한 HLE 변이체의 약동학적 매개변수.
시험 항목 최종 t 1/2
[h]
15㎍/㎏
에 대해 정규화된 AUC inf
[h*ng/㎖] 		Cl
[㎖/h/㎏] 		Vss
[㎖/㎏]
화합물 1a 167 9981 1.4 256
화합물 1b 95 6159 2.4 235
화합물 1c 47 4498 3.3 161
화합물 2a 213 41173 0.4 89
화합물 2b 116 18745 0.8 78
화합물 2c 77 28928 1.0 65
화합물 2d 77 9825 1.5 112
화합물 3a 61 4109 3.7 129
화합물 3b 59 4561 3.3 78
화합물 3c 51 2769 6.8 299
화합물 3d 3 510 30.0 653
화합물 4a 97 7816 1.9 181
화합물 4b 62 3606 4.2 292
화합물 5a 234 30954 0.5 144
화합물 5b 173 18299 0.8 166
화합물 5c 142 26418 0.6 103
화합물 6a 97 15854 1.0 103
화합물 6b 48 77271 1.0 64
화합물 7 64 1971 7.6 395
화합물 8 122 17093 0.9 119
화합물 9 210 6729 2.2 540
화합물 10a 112 18772 0.8 110
화합물 10b 3 1677 62.6 5268
전형적으로 정규 BCMA-BiTE(등록상표) 분자의 PK 프로파일은 이들 정규 단백질의 클리어런스 메커니즘과 관련된 혈청 농도 프로파일을 매우 가파르게 감소시키는 것을 설명한다. 반감기 연장된 BCMA-표적화 BiTE(등록상표)-scFc는 사이노몰거스 원숭이에서 단일 시험 항목 투여 후에 2상, 기하급수적 감소를 나타낸다.
전반적으로, scFc HLE-양상에 융합된 BCMA-BiTE(등록상표) 분자(화합물 10a)는 18772　h*ng/㎖의 평균 AUCinf, 0.8㎖/h/㎏의 전신 클리어런스 값뿐만 아니라 110㎖/㎏의 대응하는 용적 분포를 나타낸다. 화합물 10b, 정규, 비반감기 연장된 BCMA 표적화 BiTE(등록상표)는 1677 h*ng/㎖의 낮은 혈청 노출을 야기하는 높은 클리어런스 62.6㎖/h/㎏를 나타낸다.
시험한 2개의 상이한 BCMA BiTE(등록상표) 양상의 약동학적 거동의 차이는, 특히 신체 내 물질의 체류 시간에 관해 대응하는 정규 형식 이상으로 반감기 연장된 BCMA 표적화 BiTE(등록상표)-scFc의 이점을 철저히 기재한다.
전반적으로, 각각 -scFc, -hetFc, HAS 또는 크로스바디 HLE 양상 중 하나에 융합된 상이한 BiTE(등록상표) 표적 결합제에 대한 AUCinf는 BiTE(등록상표) 표적 내용에 따라서 1971 h*ng/㎖와 77271 h*ng/㎖ 사이의 범위이다. 모든 분석한 HLE 융합은 0.4 내지 7.6㎖/h/㎏의 전신 클리어런스 값을 달성하였다. 대응하는 분포 용적은 68 내지 540㎖/㎏의 범위이다. 화합물 3d, 정규, 비 반감기 연장된 화합물 3 BiTE(등록상표) 표적 결합제를 기준으로서 포함시킨다. 비-반감기 연장된 BiTE(등록상표) 분자는 높은 청소율, 낮은 혈청 노출 및 그 결과 짧은 최종 반감기를 나타낸다. 양상에 의한 최종 반감기의 비교를 표 7에 요약한다.
사이노몰거스 원숭이에서 연구한 양상에 의한 최종 반감기의 비교
HLE 양상 최종 t 1/2
[h]
정규 BiTE(등록상표) 3
BiTE(등록상표)-scFc 61-234
BiTE(등록상표)-hetFc 48-173
BiTE(등록상표)-HALB 47-142
BiTE(등록상표)-크로스바디 77
표적화 BiTE(등록상표)마다 4개까지의 상이한 반감기-연장(HLE) 모이어티를 조사하여, -scFc 모이어티는 6, 10, 12 및 15㎍/㎏에서 단일 저용량 투여 후 대응하는 다른 반감기 연장 모이어티에 비한 t1/2의 증가를 나타낸다는 것이 분명하게 되었다(도 6 참조).
실시예 4:
정제된 표적 A-hALB, 표적 A-hFc, 및 표적 A-scFc를 각각 함유하는 사전제형화된 약물 물질을 10kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 막을 이용하여 한외여과/정용여과를 통해 완충제 교환하였다. 농축된 저장 용액을 첨가함으로써 최종 제형을 달성하였다. 각각의 작제물에 대해 얻어진 제형을 표 8에 열거한다. 표적 단백질 농도는 1.0㎎/㎖였다. 제형화된 표적 A 작제물을 뷰틸 고무 마개로 중단시키고, 알루미늄 마개로 막은 I형 유리 바이알에서 1㎖까지 충전시켰다. 충전시킨 바이알을 -20, 5, 25 및 37℃에서 인큐베이션시켰다. 각각의 형태의 하나의 바이알에 5회 냉동 및 해동(F/T) 주기를 실시하였다. 표적 냉동 온도는 -29℃였다. 표적 해동 온도는 2℃였다. 램프 속도는 대략 0.3K/분이었다.
훈련된 작업자에 의해 Ph Eur 2.9.20에 의해 기재된 방법에 따라 시각적 입자를 평가하였다. 바이알 당 시각적 입자 계수를 표 8에 도시한다. 시각적(125㎛보다 큼) 단백질성 입자는 표적 A-hALB와 표적 A-scFc 둘 다에 비해 표적 A-hFc에 대해 더 컸다.
또한 고 분자량 종(HMWS)의 백분율화한 함량을 정량화하기 위해 크기 배제 초 고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 상기 기재한 샘플을 분석하였다. 액퀴티(Acquity) UPLC BEH200 SEC 150㎜ 칼럼(워터스(Waters))를 액퀴티H-클레스 UPLC 시스템(AcquityH-Class UPLC system)(Waters) 상에서 이용하여 SE-UPLC를 수행하였다. 칼럼 온도를 25℃로 설정하였다. 유동 속도 0.4㎖/분으로 등용매 방법을 적용함으로써 크기 변이체의 분리를 달성하였다. 이동상은 pH 6.8에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl로 구성되었다. 실행 시간 총 6.0분. 오토샘플러 내에서 분석까지 샘플을 8℃에서 보유하였다. 총 3㎍ 단백질의 양을 주사하였다. 40% 아세토나이트릴과 함께 중간체 주사를 캐리 오버(carry over)하는 것을 피하기 위해 각각의 샘플 후에 수행하였다. 검출은 형광 방출(280㎚에서 여기, 325㎚에서 방출)에 기반하였다. 엠파워(Empower)(등록상표) 소프트웨어를 이용하여 피크 통합을 수행하였다. HMWS의 곡선하 상대적 면적을 기록하였다(표 9).
Fc 기반 작제물은 스트레스 조건과 독립적으로 K60RTrT에서보다 제형 변이체 G40MSuT에서 더 낮은 HMWS 함량을 나타내었다. 표적 A-scFc는 G40MSuT뿐만 아니라 K60RTrT 제제 둘 다에서 표적 A-hFc보다 더 적은 HMWS를 함유한다는 것은 명백하다. 바람직한 제형으로 표적 A-scFc(G40MSuT)는 K60RTrT 중에서 제형화된 표적 A-hALB보다 HMWS 형성의 경향이 더 적었다. 이전의 실험에서, 이 완충제는 hALB 기반 작제물에 대해 개선된 안정화 잠재력을 나타내었다.
열 스트레스(37℃에서 인큐베이션)에 대한 화학적 변형의 존재비를 펩타이드 맵핑에 의해 모니터링하였다. 단백질 샘플을 효소적으로 분해시키고, 역상 크로마토그래피를 이용하여 얻어진 펩타이드를 분리시켰다. 펩타이드의 동정 및 정량화를 위해 칼럼 용리액을 질량 분석계의 이온 공급원 내로 직접 주사하였다.
최대 범위를 달성하기 위해, 2개의 별개의 효소 분해를 수행하였다: 1회는 트립신 그리고 1회는 키모트립신에 의함. 각각의 경우에, 염화구아니듐을 이용하여 단백질을 변성시키고, 이어서, 다이티오트레이톨(DTT)을 이용하여 환원시켰다. DTT 중에서 인큐베이션시킨 후에, 유리 시스테인 잔기를 아이오도아세트산의 첨가에 의해 알킬화시켰다. 이어서, 샘플을 분해를 위해 50mM 트리스 pH 7.8로 완충제 교환시켰다. 트립신 및 키모트립신을 각각 1:10(샘플:효소)의 비로 별개의 반응관에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안 분해시키고, 트라이플루오로아세트산을 첨가함으로써 반응을 퀀칭시켰다.
각각의 분해의 5㎍의 장입물을 0.1% (V/V) 폼산(FA)에서 평형상태로 만든 조박스(Zorbax) SB-C18(애질런트 #859700-902) 역상 칼럼 상게 별도로 주사하였다. Q-Exactive 플러스 질량 분석기(써모 사이언티픽)의 전기분무 이온 공급원 내로 펩타이드를 직접 용해시키기 위해 0.1% FA를 함유하는 90%까지의 아세토나이트릴의 156분 구배를 사용하였다. 풀 스캔(재용해 70　000; 스캔 범위 200 내지 2000　m/z) 다음에 12가지의 가장 흔한 이온(재용해 17　500)의 고에너지 충돌 해리(HCD)가 이어지는 상위 12가지 방법을 이용하여 데이터 의존적 방식으로 데이터를 수집하였다.
하우스 소프트웨어를 이용하여 정확한 질량 및 탠덤 질량 스펙트럼에 기반하여 펩타이드를 동정하였다. 동정을 수동으로 확인하였다. 핑퐁(Pinpoint) 소프트웨어(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 이용하여 이온 존재비에 기반하여 변형 및 비변형 펩타이드의 상대적 양을 계산하였다.
표적 A-hALB, -hFc 및 -scFc 제제에서 검출된 상보성 결정 영역(CDR) 및 반감기 연장 부분(hALB 또는 Fc)의 화학적 변형의 백분율은 표 10에서 제공한다. 유사한 제형 조건과 비교할 때, 전반적인, 화학적 변형은 scFc 작제물에서 존재비가 가장 적다는 것이 명백하게 되었다.
실시예 5:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 A-hALB, -hFc, -scFc에 pH 점프 실험을 실시하였다. 출발 물질의 농도는 1.0㎎/㎖였다. 유리 바이알에서 각각의 출발 물질의 0.38㎖ 용적을 채웠다. 37℃에서 사전 조건화한 후에, 0.090M 인산칼륨, 0.480M 인산나트륨(둘 다 2염기성), 0.052M 염화칼륨 및 2.76M NaCl로 구성된 20배 인산염 완충 식염수(PBS)를 용액에 첨가하였다. 섞은 샘플을 37℃에서 2주 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 그들을 실시예 4 하에 기재한 방법을 이용하여 SE-UPLC에 의해 분석하였고, HMWS의 백분율 함량을 보고하였다(표 11). K60RTrT에서 제형화한 모든 작제물을 비교할 때, HMWS 함량은 다음의 순서로 증가되었다: hALB < scFc < hFc. 표적 A-scFc는 또한 G40MSuT에서 제형화될 때 표적 A-hFc보다 더 낮은 HMWS 함량을 나타내었다.
실시예 6:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 A-hALB, -hFc 및 -scFc에 교반 스트레스를 실시하였다. 출발 물질의 농도는 1.0㎎/㎖였다. 각각의 용액의 0.5㎖ 용적을 적절한 0.22㎛ 필터를 통해 여과시키고, 3cc 유리 바이알에 채웠다. 바이알을 플라스틱 박스에 넣어서 교반 동안 박스 내에서 움직이지 않도록 보장하였다. 박스를 오비탈 진탕기에 넣었다. 샘플을 500rpm에서 65시간 동안 교반시켰다. Ph Eur 2.9.20에 의해 기재된 방법에 따라 시각적 입자를 평가하였다. 훈련된 작업자에 의해 상기 방법을 수행하였다. 바이알 당 시각적 입자 계수를 표 12에 도시한다. 시각적 단백질성 입자는 표적 A-hFc 제제에서만 관찰되었다.
또한 고 분자량 종(HMWS)의 백분율화한 함량을 정량화하기 위해 크기 배제 초 고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 상기 샘플을 분석하였다. 실시예 4에 기재한 것과 동일한 방법을 적용하였다. 교반시킨 샘플의 HMWS 함량을 표 13에 약술한다. HMWS의 형성은 K60RTrT 제제를 비교할 때 표적 A-hFc에서 가장 확연하였다. HMWS는 표적 A-scFc에서보다 표적 A-hFc에서 더 흔하였다.
실시예 7:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 A-hALB, -hFc 및 -scFc를 가시광선 및 UVA 광(광 스트레스)에 노출시켰다. 단백질 농도는 모든 제제에서 총 1㎎/㎖였다. 단백질 용액을 0.22㎛ 기공 크기를 갖는 필터를 통해 여과시키고, I형 유리 바이알에서 0.5㎖까지 채웠다. 표적 A-hALB 및 -scFc에 각각 0.2 MLux 가시광선/25 W*h/㎡ UVA 광 및 1.2MLux 가시광선/173 W*h/㎡를 포함하는 두 상이한 시험을 실시하였다. 표적 A-hFc에 각각 UVA 광 없이 0.2 MLux 가시광선 및 1.2 MLux 가시광선/30 W*h/㎡ UVA 광을 포함하는 두 상이한 시험을 실시하였다. 챔버 온도를 25℃로 조절하였다. 광 노출 후에, 샘플을 외관 검사(표 14), SE-UPLC(표 15) 및 펩타이드 맵(표 16)에 의해 분석하였다. 앞서 언급한 방법을 실시예 4 하에서 기재한 절차에 따라 수행하였다. 표적 A-hALB 및 -scFc를 더 고량의 UVA 광에 노출시켰지만, 가시적 단백질성 입자는 관찰되지 않은 반면, 표적 A-hFc 샘플은 제형과 상관없이 시험 둘 다에 대해 바이알 당 하나의 가시적 단백질성 입자를 나타내었다.
단백질을 K60RTrT에서 제형화할 때 HMWS는 다음의 순서(표적 A-hALB < -scFc < -hFc)로 증가되었다. HMWS는 G40MSuT에서 제형화될 때 Fc 기반 작제물에 대해 구조될 수 있었다. 그러나 HMWS는 또한 표적 A-scFc에 대해 덜 확연하였다. 표적 A-hFc는 UVA 광 노출에 대해 특히 민감한 것으로 나타났다.
표적 A-hALB, -hFc 및 -scFc 제제에서 검출된 상보성 결정 영역(CDR) 및 반감기 연장 부분(hALB 또는 Fc)의 화학적 변형의 백분율은 표 16에서 제공한다. 유사한 제형 조건과 비교할 때, 전반적인, 화학적 변형은 scFc 작제물에서 존재비가 가장 적다는 것이 명백하게 되었다.
실시예 8:
표적 A-hALB를 K60RTrT에서 제형화하고, 표적 A-scFc를 실시예 4에 기재한 절차에 따라 G40MSuT에서 제형화하였다. 단백질 농도는 총 0.05㎎/㎖였다. 유리(붕규산염, I형, 웨스트(West)로부터의 13㎜ 3cc 바이알, 기술 번호 68000375) 및 폴리프로필렌 시험 용기(예를 들어, 사르스테트(Sarstedt)로부터의 O-링으로 2㎖, 기술 번호 72.694.005)를 500㎕의 시험 용액으로 채운다. 첫 번째 시험 용기에서 5분 동안 시험 용액을 두었다. 이어서, 분석을 위해 150㎕ 분취액을 샘플링하였다. 남아있는 시험 용액(350㎕)을 하나의 용기로부터 다음 용기(총 5개의 용기)까지 옮겼다. 각각의 바이알에서, 다음 전달 전에 용액을 5분 동안 남겼다. 각각의 전달 단계를 위해 동일한 피펫 팁을 사용하였다. 30㎖ 폴리카보네이트 보틀(날겐(Nalgene), 폐쇄된 PCS-000295, PP/20-415/ZTPE)을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 이 용기 유형에 대해, 첫 번째 용기를 5㎖로 채웠다. 150㎕ 분취액을 샘플링한 후에, 잔여 용적을 하나의 시험 용기로부터 다음 용기로 (상기 기재한 절차에 따라) 옮겼다. 용기 #1 및 #5로부터 꺼낸 샘플을 SE-UPLC에 의해 분석하였다(실시예 4 하에 기재한 방법). 추가로, 단백질 농도를 결정하기 위해 PDA 검출기(280㎚)를 이용하여 단백질 검출을 수행하였다. 각각의 시험 용기로부터 백분율화한 단백질 회수는 표 17에 의해 제공한다. 단백질 회수는 용기 유형과 상관 없이 표적 A-hALB보다 표적 A-scFc에 대해 더 확연한 것으로 나타났다.
실시예 9:
표적 A-hALB를 K60RTrT에서 제형화하고, 표적 A-scFc를 실시예 4에 기재한 절차에 따라 K60RTrT 및 G40MSuT에서 제형화하였다. 단백질 농도는 총 1.0㎎/㎖였다. 1950㎕의 각각의 시험 용액에 50㎕의 1000ppm 규소 표준 용액(알파에이사(AlfaAesar)로부터의 스펙퓨어(Specpure), 기술 번호 38717)을 첨가하여 25ppm 섞임을 초래하였다. 섞지 않은 시험 용액은 대조군 샘플로서 작용하였다. 섞인 시험 용액뿐만 아니라 대조군 샘플 용액을 3cc I형 유리 바이알에 채우고 나서, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. HMWS의 양을 정량화하기 위해 실시예 4에 기재한 방법에 따라 SE-UPLC에 의해 모든 샘플을 분석하였다(표 18). K60RTrT에서 제형화할 때, 표적 A-hALB 및 -scFc는 규소 첨가 시 HMWS에서 유사한 증가를 나타내었다.
실시예 10:
정제된 표적 C(cc)-hALB, 표적 C(cc)-hFc, 및 표적 C(cc)-scFc를 각각 함유하는 사전제형화된 약물 물질을 10kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 막을 이용하여 한외여과/정용여과를 통해 완충제 교환하였다. 농축된 저장 용액을 첨가함으로써 최종 제형을 달성하였다. 각각의 작제물에 대해 얻어진 제형을 표 19에 열거한다. 표적 단백질 농도는 1.0㎎/㎖였다. 제형화된 표적 C(cc)- 작제물을 뷰틸 고무 마개로 중단시키고, 알루미늄 마개로 막은 I형 유리 바이알에서 1㎖까지 충전시켰다. 충전시킨 바이알을 -20, 5, 25 및 37℃에서 인큐베이션시켰다. 각각의 형태의 하나의 바이알에 5회 냉동 및 해동(F/T) 주기를 실시하였다. 표적 냉동 온도는 -29℃였다. 표적 해동 온도는 2℃였다. 램프 속도는 대략 0.3K/분이었다. 또한 고 분자량 종(HMWS)의 백분율 함량을 정량화하기 위해 크기 배제 초 고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 상기 기재한 샘플을 분석하였다. 실시예 4 하에 기재한 방법에 따라 SE-UPLC를 수행하였다. K60RTrT에서 제형화할 때, HMWS는 비스트레스 샘플에서 다음의 순서로 증가되었다: scFc < hALB < hFc. 냉동 해동 스트레스 시 HMWS에서 가장 적게 확연한 증가가 scFc-작제물에 대해 관찰되었다. hFc-작제물은 -20℃에서 HMWS 형성에 대한 가장 큰 경향을 나타내었다. HMWS 함량은 5℃에서 4주 저장 후에 증가되었다. 해당 조건 하에 HMWS 형성은 알부민 기반 작제물에 대해서보다 Fc 기반 작제물에 대해 더 확연하였다. K60RTrT에서, 승온(25 및 37℃)의 HMWS에서 상당한 증가는 관찰되지 않았다. G40MSuT에서 제형화될 때, 모든 작제물은 비스트레스 샘플에서 유사한 HMWS 함량을 나타내었다. 냉동 해동 동안 증가는 알부민 기반 작제물에 비해 Fc 기반 작제물에 대해 더 분명하였다. G40MSuT에서, hFc-작제물은 -20℃에서 저장 동안 적어도 안정하였다. 액체 저장 동안 HMWS에서 상당한 증가는 hALB-작제물에 대해서만 관찰되었다.
열 스트레스(37℃에서 인큐베이션)에 대한 화학적 변형의 존재비를 실시예 4에 기재한 방법에 따른 펩타이드 맵핑에 의해 모니터링하였다. 표적 C(cc)-hALB, -hFc 및 -scFc 제제에서 검출된 상보성 결정 영역(CDR)의 화학적 변형의 백분율은 표 20에서 제공한다. 전반적으로, 표적 C(cc)-scFc는 CDR에서 가장 낮은 양의 화학적 변형을 나타내었다. 특히 CDR의 탈아마이드화는 scFc 작제물에 대해 가장 덜 확연하다는 것이 분명하였다.
실시예 11:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 C(cc)-hALB, -hFc 및 -scFC에 pH 점프 실험을 실시하였다. 출발 물질의 농도는 1.0㎎/㎖였다. 유리 바이알에서 각각의 출발 물질의 0.38㎖ 용적을 채웠다. 37℃에서 사전 조건화한 후에, 0.090M 인산칼륨, 0.480M 인산나트륨(둘 다 2염기성), 0.052M 염화칼륨 및 2.76M NaCl로 구성된 20배 인산염 완충 식염수(PBS)을 용액에 첨가하였다. 섞은 샘플을 37℃에서 2주 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 그들을 실시예 4 하에 기재한 방법을 이용하여 SE-UPLC에 의해 분석하였고, HMWS의 백분율 함량을 보고하였다(표 21). 제형과 상관없이 표적 C(cc)-hALB 및 -hFc에 비해 pH 점프 후에 표적 C(cc)-scFc 작제물은 가장 낮은 HMWS 함량을 나타내었다.
실시예 12:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 C(cc)-hALB, -hFc 및 -scFc에 교반 스트레스를 실시하였다. 출발 물질의 농도는 1.0㎎/㎖였다. 각각의 용액의 0.5㎖ 용적을 적절한 0.22㎛ 필터를 통해 여과시키고, 3cc I형 유리 바이알에 채웠다. 바이알을 플라스틱 박스에 넣어서 교반 동안 박스 내에서 움직이지 않도록 보장하였다. 박스를 오비탈 진탕기에 넣었다. 샘플을 500rpm에서 65시간 동안 교반시켰다. 또한 고 분자량 종(HMWS)의 백분율화한 함량을 정량화하기 위해 SE-UPLC에 의해 샘플을 또한 분석하였다. 실시예 4에 기재한 것과 동일한 방법을 적용하였다. 교반시킨 샘플의 HMWS 함량을 표 22에 약술한다. HMWS의 형성은 제형 중 하나에서 표적 C(cc)-scFc에서 덜 확연하였다.
실시예 13:
실시예 4에 기재한 바와 같이 제형화한 표적 C(cc)-hALB, -hFc 및 -scFc를 가시광선 및 UVA 광(광 스트레스)에 노출시켰다. 단백질 농도는 모든 제제에서 총 1㎎/㎖였다. 단백질 용액을 0.22㎛ 기공 크기를 갖는 필터를 통해 여과시키고, I형 유리 바이알에서 0.5㎖까지 채웠다. 표적 C(cc)-hALB 및 -scFc에 각각 0.2 MLux 가시광선/25 W*h/㎡ UVA 광 및 1.2MLux 가시광선/173 W*h/㎡를 포함하는 두 상이한 시험을 실시하였다. 표적 C(cc)-hFc에 각각 UVA 광 없이 0.2 MLux 가시광선 및 1.2 MLux 가시광선/30 W*h/㎡ UVA 광을 포함하는 두 상이한 시험을 실시하였다. 챔버 온도를 25℃로 조절하였다. 광 노출 후에, 샘플을 SE-UPLC(표 23) 및 펩타이드 맵(표 24)에 의해 분석하였다. 앞서 언급한 방법을 실시예 4 하의 절차에 따라 수행하였다. 표적 C(cc)-scFc에 적용된 더 높은 UVA 광 강도에도 불구하고, 이 작제물은 HMWS 형성에 대해 적합하였다. 대조적으로, 표적 C(cc)-hFc 및 표적 C(cc)-hALB는 시험 2 조건에 대해 HMWS에서 증가를 나타내었다.
광 노출 시 전반적인 화학적 변형은 표적 C(cc)-scFc에 대해 가장 덜 확연하였다. 특히, CDR의 탈아마이드화는 표적 C(cc)-hALB 및 표적 C(cc)-hFc에서 더 높은 정도로 형성되었다. Fc 기반 작제물에 비해, scFc 작제물은 hFc-작제물보다 더 높은 UVA 광 용량에 노출되었지만, Fc 부분의 화학적 변형에 대한 경향은 표적 C(cc)-scFc가 더 적은 것으로 나타났다. 표 24는 또한 표적 C(cc)-hALB에서 알부민 부분의 가장 흔한 화학적 변형을 열거하는데, 이는 이 작제물의 반감기 연장 부분이 표적 C(cc)-hFc 및 -scFc의 Fc 부분보다 화학적으로 더 분해되었다는 것을 입증한다.
실시예 14:
표적 F-비 반감기 연장(비 HLE, 정규), 표적 F-hALB, 및 표적 F-scFc를 포함하는 표적 F를 표적화하기 위해 설계한 상이한 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 시험하였다. 표적 단백질 농도는 hALB 및 scFc에 대해 1.0㎎/㎖ 및 비 HLE 형태에 대해 0.4㎎/㎖였다. 제형화된 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 뷰틸 고무 마개로 중단시키고, 알루미늄 마개로 막은 I형 유리 바이알에서 1㎖까지 충전시켰다. 채운 바이알을 -20℃ 및 37℃에서(단백질의 응집을 유도하기 위한 잠재력에 대해 알려진 25ppm 규소 없이 그리고 규소와 함께) 4주 동안 인큐베이션시켰다. 상기 작제물을 광(1.2 MLux 가시광선/173 W*h/㎡ UVA 광)에 노출시켰다. 광 스트레스에 대해, 챔버 온도를 25℃로 설정하였다. -70℃에서 저장한 샘플은 대조군으로서 작용하였다(T0).
고 분자량 종(HMWS)의 백분율화한 함량을 정량화하기 위해 크기 배제 초 고성능 크로마토그래피(SE-UPLC)에 의해 상기 기재한 샘플을 2회 중복해서 분석하였다. 액퀴티(Acquity) UPLC BEH200 SEC 150㎜ 칼럼(워터스)을 액퀴티 H-클레스 UPLC 시스템 상에서 이용하여 SE-UPLC를 수행하였다. 칼럼 온도를 25℃로 설정하였다. 유동 속도 0.4㎖/분으로 등용매 방법을 적용함으로써 크기 변이체의 분리를 달성하였다. 이동상은 pH 6.8에서 100mM 인산나트륨, 250mM NaCl로 구성되었다. 실행 시간 총 6.0분. 오토샘플러 내에서 분석까지 샘플을 8℃에서 보유하였다. 총 3㎍ 단백질의 양을 주사하였다. 40% ACN과 함께 중간체 주사를 캐리 오버하는 것을 피하기 위해 각각의 샘플 후에 수행하였다. 검출은 형광(280㎚에서 여기, 325㎚에서 방출)에 기반하였다. 엠파워(Empower)(등록상표) 소프트웨어를 이용하여 피크 통합을 수행하였다. HMWS의 곡선하 상대적 면적을 기록하였다(표 25).
비-스트레스 샘플 내에서, HMWS는 scFc-작제물에 대해 가장 덜 확연하였다. -20℃에서 4주 저장 동안 HMWS 형성이 배타적으로 관찰되었다. 이들 조건 하에서 HMWS 함량은 다음의 순서로 증가한다: scFc < hALB < 비 HLE.
추가적으로, 규소의 부재 및 존재 하에 열 스트레스로부터 유도된 샘플을 플루이드 이미징 테크놀로지즈 인코포레이티드(Fluid Imaging Technologies, Inc.)로부터의 플로우캄(Flowcam)을 이용하는 미소유체 영상화(Microfluid Imaging)에 의한 현미경으로 보이는 입자의 존재비에 대해 평가하였다. 기기는 FC80FV 유동 세포를 구비하였다. 10배 광학 배율을 적용하였다. 무 입자 물을 이용하여 시스템 적합성을 확인하였다. 초 당 20 프레임의 자동영상 속도를 적용하였다. 암실 및 광 역치를 각각 25 및 20 픽셀로 설정하였다. 단일 측정에 대한 샘플 용적은 총 0.25㎖였다. 샘플을 3회 측정하였다. 각각 3회 측정 전에 시스템을 0.5㎖의 각각의 샘플 용액으로 씻어 내었다. 시작 시 그리고 각각의 3회 측정 사이에 1.0㎖의 무 입자수에 의한 세척을 수행하였다. 비주얼 스프레드시트(Visual Spreadsheet) 소프트웨어를 이용하여 데이터 평가를 수행하였다. 샘플을 3회 측정하였다. 결과를 표 26에서 약술한다.
열 스트레스는 비 HLE 및 hALB 작제물을 함유하는 제제에서 현미경으로 보이는 입자 형성을 초래하였다. 대조적으로, scFc 작제물은 안정하게 남아있었다. 현미경으로 보이는 입자 형성은 BiTE(등록상표) 항체 작제물의 특성과 독립적인 규소의 첨가에 의해 촉진되지 않았다.
워터스로부터의 UPLC 액퀴티 H 클래스를 이용하는 하전 변이체의 백분율화된 함량을 정량화하기 위해 열 스트레스로부터의 샘플을 또한 약한 양이온 교환(Weak Cation Exchange: WCX) 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 프로테인-팩(Protein-Pak) Hi Res CM 4.6 x 100㎜ 칼럼(워터스, 촉매 번호 186004929)을 적용하였다. 칼럼 온도를 30℃로 조정하였다. 유동 속도를 0.65㎖/분으로 설정하였다. 적용된 구배를 다음과 같이 설계하였다(표 27). 오토샘플러의 온도를 2 내지 8℃에서 유지하였다.
총 3㎍ 양의 단백질을 주사하였다. 검출은 형광(280㎚에서 여기, 325㎚에서 방출)에 기반하였다. 엠파워(Empower)(등록상표) 소프트웨어를 이용하여 피크 통합을 수행하였다. 주요 피크뿐만 아니라 산성 및 염기성 전하 변이체의 곡선하 상대적 면적을 보고하였다(표 28).
열 스트레스는 산성 전하 변이체의 우세한 형성에 기여할 감소된 주요 피크 백분율을 초래하였다. 주요 피크 백분율의 상실은 scFc 작제물에 대해 가장 덜 확연하였다(7.5%). 염기성 전하 변이체는 광 노출 시 연장된 반감기를 갖는 작제물 둘 다에서 형성되었다. 염기성 전하 변이체의 증가는 hALB와 scFc 작제물에서 5 내지 6%의 범위였다.
열 및 광 유도 스트레스 후에 표적　F-비 HLE (정규), -hALB 및 -scFc 제조에서
WCX 크로마토그래피에 의한 전하 변이체의 평가.
작제물 비 HLE (정규) hALB scFc
분획 주요% 산성% 염기성% 주요% 산성% 염기성% 주요% 산성% 염기성%
T0 89.9 3.6 6.5 83.3 0.7 16.0 74.5 3.4 22.1
4w 37℃ 79.3 11.1 9.5 75.6 9.8 14.6 67.0 11.2 21.8
추가로, 랩칩(LabChip) GXII 시스템(퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 기반한 미소유체 모세관 전기이동 도데실황산나트륨(CE-SDS) 분석을 이용하여 열 및 광 스트레스 샘플에서 샘플을 정량화하였다. 샘플 변성 용액은 34mM 다이티오트레이톨로 보충한 HT 단백질 발현 샘플 완충제(퍼킨 엘머에 의해 제공됨)로 구성되었다. 각각의 샘플을 변성 용액을 이용하여 1:8로 희석시키고, 단백질 발현 래더(ladder)와 함께 70℃까지 10분 동안 가열하였다. 35㎕의 주사용수(WFI)를 40㎕의 변성 샘플에 첨가하였다. 120㎕ WFI를 12㎕의 래더에 첨가하였다. 샘플, 래더, 단백질 발현 세척 완충제, 겔 염료 및 오물 제거 용액을 각각의 저장소에 옮긴다. 마이크로타이터 플레이트로부터 단백질 및 그의 크기 변이체의 분리, 염색, 오물 제거 및 검출을 통합하는 칩 상에 샘플을 동전기적으로 부하한다. 얻어진 전기영동도를 평가하고, 순도 변화를 보고하였다. 스트레스 후 검출된 백분율화된 순도에 대한 개요를 표 29에 의해 제공하며, 비스트레스 샘플(T0)에 비교하였다.
모든 조건 하의 비 HLE 작제물에 비해 hALB 및 scFc 작제물에 대해 더 높은 순도가 관찰되었다. T0에 비해 약간 감소된 순도가 열 및 광 스트레스 시 hALB 및 scFc 작제물에 대해 검출되었다. 37℃에서 4주 저장 후 순도의 상실은 hALB 작제물에 대해 8.4%이고, scFc 작제물에 대해 6.6%이다. 광 노출 시 상실은 hALB와 scFc 사이에 비슷하였다.
실시예 15
표적 E-hALB 및 표적 E-scFc를 포함하는 표적화를 위해 설계한 상이한 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 각각 제형화하였다. 표적 단백질 농도는 작제물 둘 다에 대해 1.0㎎/㎖였다. 제형화된 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 뷰틸 고무 마개로 중단시키고, 알루미늄 마개로 막은 I형 유리 바이알에서 1㎖까지 충전시켰다. 채운 바이알을 4주 동안 37℃(표적 E-hALB) 및 40℃(표적 E-scFc)에서 인큐베이션시켰다. -70℃에서 저장한 샘플은 대조군으로서 작용하였다(T0). 실시예 13 하에 기재한 방법에 따라 SE-UPLC에 의해 샘플을 분석하였다. 결과를 표 30에서 약술한다.
scFc 작제물은 인큐베이션 온도가 약간 더 높다고 해도 hALB 작제물 (4.0%)에 비해 감소된 단량체 상실(2.3%)을 나타내었다.
실시예 16
표적　I-X바디 및 표적 I-scFc를 포함하는 표적　I를 표적화하도록 설계된 상이한 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 시험하였다. 표적 단백질 농도는 1.0㎎/㎖였다. 제형화된 BiTE(등록상표) 항체 작제물을 뷰틸 고무 마개로 중단시키고, 알루미늄 마개로 막은 I형 유리 바이알에서 1㎖까지 채웠다. 채운 바이알을 4주 동안 -20℃ 및 37℃에서 인큐베이션시켰다. 추가적으로, 모든 샘플을 내지 1.2 MLux 가시광선 및 173 W*h/㎡ UVA 광에 노출시켰다. 챔버 온도를 25℃로 조정하였다. -70℃에서 저장한 샘플은 대조군으로서 작용하였다(T0). 샘플을 -20 및 -37℃에서 저장하고, 실시예 13 하에 기재한 방법에 따라 SE-UPLC에 의해 샘플을 분석하였다. 결과를 표 31에서 약술한다.
X바디에 비해 각각 -20 및 -37℃에서 4주 동안 저장하였을 때 scFc 작제물은 더 높은 단량체 함량을 보존하였다.
추가적으로, 비스트레스 샘플을 실시예 13 하에 기재한 방법을 이용하여 미소유체 영상화(MFI)에 의해 현미경으로 보이는 입자의 존재비에 대해 평가하였다. 결과를 표 32에서 약술한다. 표적　I-scFc 제제는 표적　I-X바디 제제에 비해 상당히 더 적은 양의 현미경으로 보이는 입자를 나타내었다. 이는 모두 포함된 크기 분율에 적용한다.
실시예 13 하에 기재한 방법에 따라 워터스로부터의 UPLC 액퀴티 H 클래스를 이용하는 하전 변이체의 백분율화된 함량을 정량화하기 위해 광 스트레스로부터의 샘플을 또한 약한 양이온 교환(Weak Cation Exchange: WCX) 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 주요 피크뿐만 아니라 산성 및 염기성 전하 변이체의 곡선하 상대적 면적을 보고하였다(표 33).
scFc 작제물은 X바디 작제물에 대한 5.5%에 비해 총 1.4%인 주요 피크에서 덜 확연한 상실로 나타나는 X바디에 비해 광 노출에 대해 향상된 안정성을 나타내었다.
열 및 광 유도 스트레스 후에 　I-X바디 및 -scFc에서
WCX 크로마토그래피에 의한 하전 변이체의 평가.
작제물 X바디 scFc
분획 주요% 산성% 염기성% 주요% 산성% 염기성%
T0 51.4 30.3 18.3 83.5 1.3 15.2
광 노출 45.9 33.2 20.9 82.1 1.2 16.7
실시예 17: 이중특이성 scFc 변이체의 크기 배제 크로마토그래피
작제물 D9F, T2G, D3L, T7I 및 K6C(도 7 참조)는 각각 표준 절차에 따라 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 실행 거동에 대해 시험하였다. 상세하게, 정해진 양의 25㎍의 각각의 작제물을 실온에서 슈퍼덱스 200(Superdex 200) 증가 10/300GL 칼럼 상에서 시트레이트 라이신 완충제 10mM 및 75mM, pH7)에서 (750㎕/분)으로 실행하였고, OD 280㎚을 기록하였다. 후속적으로, 작제물을 그들의 체류 시간으로 비교하였다. 그 결과, 작제물 D9F는 T2G, D3L, T7I 및 K6C에 비해 상당히 지연된 용리를 나타내었는데(표 34), 이는 Fc 도메인의 구조/배열의 차이를 나타낸다. 체류 시간의 이런 차이는 힌지 영역 내 짝지어지지 않은 시스테인 및 CH2 및 CH2CH3의 CH3에 대한 결합을 갖는 작제물 T7I에 의해 가장 유의하였다(18.98분 대 18.62분, 0.36분의 차이). 그러나, 또한 D9F와 T2G 사이의 0.16분의 체류 시간 차이는 BSA 대조군의 각각의 체류 시간을 상당히 고려한다. BSA 대조군은 단량체에 대해 19.07분 및 이량체에 대해 16.82분의 체류시간을 나타내어 2배의 분자량에 대해 체류 시간에서 2.25분의 차이를 나타내었다. 따라서, Fc 부분에서 구조적 차이만을 갖는 작제물로서, 체류 시간의 0.16분 차이는 유의하다. 요약하면, 작제물 D9F는 가장 긴 체류 시간을 나타내었는데, 이는 가장 긴 결합을 나타내었다. 이 결과는 D9F가 생체내에서 가장 긴 반감기를 가진다는 예상을 유도한다.
실시예 18: 인간 FcRn(FCGRT/B2M)에 대한 결합의 표면 플라즈몬 공명-기반 결정
작제물 D9F, T2G, D3L, T7I 및 K6C(도 7)를 표준 절차에 따른 SPR(비아코어) 실험에서 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 능력에 대해 각각 시험하였다. 상세하게, Na 아세트산염 완충제 pH 4.5 및 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA pH 6.0으로 이루어진 실행 완충제를 이용함으로써 FCGRT/B2M(아크로 바이오시스템즈(ACRO Biosystems))의 450 내지 500RU로 CM5 센서칩(GE 헬스케어(GE Healthcare))을 고정시켰다. 이어서, 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 6.0 및 36℃에서 희석시킨 250nM 및 125nM의 2가지 농도에서의 후속적 실행에서 작제물을 주사하였다. 30㎕/분 유속으로 90초 동안 결합을 행한 후에 36℃에서 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 6.0 중의30㎕/분 유속에서 90초 동안 해리가 이어졌다. 10초 동안 30㎕/분으로 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA pH 7.4로 후속적 재생을 행하였다.
결합된 작제물에 기인하는 FcRn 코팅 CM5 상에서의 분자 질량 증가와 동일한 각각의 반응 단위(RU)로서 모든 작제물에 대해 주사 단계 동안의 최대 결합을 측정하였다. 모든 작제물을 2회 중복해서 측정하였다. 2회 결정의 평균 값을 도 8A 및 도 8B에서 각각 도시한다.
그 결과, 작제물 D9F는 T2G, D3L, T7I 및 K6C에 비해 FcRn 코팅 CM5 칩 상에서 상당히 더 큰 질량을 나타내는데, 이는 인간 FcRn에 대한 D9F의 더 강한 결합 친화도를 나타낸다. 이는 각각의 작제물의 농도 둘 다에 대해 관찰되었다.
FcRn에 대한 결합은 작제물 내의 Fc 부분을 통해 매개된다. 문헌에 기재된 바와 같은 인간 FcRn에 대한 더 강한 결합은 각각의 단백질의 더 높은 세포내 구조 및 그에 따라 감소된 분해 속도 때문에 생체내에서 더 긴 반감기의 지표이다. 이런 이유로, 다른 작제물에 비해 인간 FcRn에 대한 D9F의 더 강한 결합은 환자에서 잠재적 약물의 더 긴 노출 및 더 낮은 빈도의 약물 투여를 허용하게 하기 위해 치료 분자에 대한 기본으로서 이 분자를 명확히 더 우수하게 만든다.
실시예 19: 인간 FcRn(FCGRT/B2M)에 대한 결합의 표면 플라즈몬 공명-기반 결정
표준 절차에 따른 SPR(비아코어) 실험에서 작제물 D9F, T2G, D3L, T7I 및 K6C 및 인간 IgG1-카파 항체 MT201를 인간 FcRn에 대한 그들의 결합 능력에 대해 각각 시험하였다. 상세하게, Na 아세트산염 완충제 pH 4.5 및 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA pH 6.0으로 이루어진 실행 완충제를 이용함으로써 FCGRT/B2M(아크로 바이오시스템즈)의 대략 350RU로 CM5 센서칩(GE 헬스케어(GE Healthcare))를 고정시켰다. 이어서, 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 6.0 및 36℃에서 희석시킨 125nM의 농도에서 작제물 및 인간 IgG1-카파 대조군(MT201)을 주사하였다. 30㎕/분 유속으로 90초 동안 결합을 행한 후에 36℃에서 200mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, pH 6.0 중의 30㎕/분 유속에서 60초 동안 해리가 이어졌다. 10초 동안 30㎕/분으로 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA pH 7.4로 후속적 재생을 행하였다.
결합된 작제물에 기인하는 FcRn 코팅 CM5 상에서의 분자 질량 증가와 동일한 각각의 반응 단위(RU)로서 모든 작제물에 대해 주사 단계 동안의 최대 결합을 측정하였다. 모든 작제물을 2회 중복해서 측정하였다. 표준 편차 오차 막대를 포함하는 2회 결정의 평균 값을 도 9에서 도시한다.
그 결과, 작제물 D9F는 T2G, D3L, T7I 및 K6C에 비해 FcRn 코팅 CM5 칩 상에서 상당히 더 큰 질량을 나타내는데, 이는 인간 FcRn에 대한 D9F의 더 강한 결합 친화도를 나타낸다. D9F에 대해 FcRn-코팅된 CM5 칩 상에서 질량 증가는 인간 IgG1-카파 대조군 항체 MT201의 질량 증가와 상당히 유사한데, 인간 FcRn에 대한 작제물 D9F의 비슷한 결합을 나타낸다.
FcRn에 대한 결합은 작제물 내의 인간 IgG1 Fc 부분을 통해 매개된다. 해당 분야에 기재된 바와 같은 인간 FcRn에 대한 더 강한 결합은 각각의 단백질의 더 높은 세포내 구조 및 그에 따라 감소된 분해 속도 때문에 생체내에서 더 긴 반감기의 지표이다. 이런 이유로, 다른 작제물에 비해 인간 IgG1-카파 항체(MT201)의 범위에서 인간 FcRn에 대한 D9F의 더 강한 결합은 추정적으로 전체 인간 IgG1 항체 범위로 환자에서 잠재적 약물의 더 긴 노출 및 더 낮은 빈도의 약물 투여를 허용하게 하기 위한 치료적 분자에 대한 기본으로서 이 분자를 분명히 더 우수하게 만든다.
SEQUENCE LISTING <110> Amgen Research (Munich) GmbH AMGEN Inc. <120> BCMA AND CD3 BISPECIFIC T CELL ENGAGING ANTIBODY CONSTRUCTS <130> IPA180776-DE <150> 62/290,831 <151> 2016-02-03 <160> 109 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 7 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 9 Pro Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 10 Pro Gly 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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 515 520 525 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 530 535 540 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 545 550 555 560 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 565 570 575 Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys 580 585 590 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 595 600 605 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 610 615 620 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 625 630 635 640 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly 645 650 655 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 660 665 670 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 675 680 685 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 690 695 700 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr 705 710 715 720 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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 965 970 975 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 980

Claims (20)

  1. 단일쇄 항체 작제물로서,
    BCMA에 결합하는 제1 도메인,
    인간 CD3ε쇄, 또는 마카카(Macaca) CD3ε쇄, 또는 둘 다의 세포외 에피토프에 결합하는 제2 도메인; 및
    각각 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 단량체를 포함하는 제3 도메인으로서, 상기 2개의 폴리펩타이드 단량체는 펩타이드 링커를 통해 서로 융합되는, 제3 도메인을 포함하고, 상기 제3 도메인은 아미노에서 카복실 순서로 힌지-CH2-CH3-링커-힌지-CH2-CH3를 포함하며,
    여기서, 항체 작제물은 서열번호 55, 56, 61, 62, 73, 74, 79, 80, 91, 92, 97, 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는, 항체 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CH2 도메인은 도메인내 시스테인 이황화 브릿지를 포함하는, 항체 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하고, 상기 제2 도메인은 2개의 항체 가변 도메인을 포함하는, 항체 작제물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 도메인 및 상기 제2 도메인은 펩타이드 링커를 통해 상기 제3 도메인에 융합되는, 항체 작제물.
  5. 제1항에 따른 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  7. 제5항에 따른 폴리뉴클레오타이드로 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 단리된 숙주 세포.
  8. 제1항에 따른 항체 작제물의 생산 방법으로서, 상기 방법이
    제1항에 따른 항체 작제물의 발현을 허용하는 조건 하에, 제1항에 따른 항체 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양시키는 단계, 및
    배양물로부터 생산된 항체 작제물을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 작제물의 생산 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 작제물 또는 제8항의 방법에 따라 생산된 항체 작제물을 포함하는, 약제학적 조성물로서,
    자가면역질환, 다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성골 형질세포종, 수질외 형질세포종, 골경화 골수종, 중쇄 질환, 의미불명의 단클론성 감마글로불린이상증, 무증상 다발성 골수종(smoldering multiple myeloma), B-세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염(RA)으로부터 선택되는 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, -20℃에서 적어도 4주 동안 안정한, 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 작제물 또는 제8항의 방법에 따라 생산된 항체 작제물을 포함하는, 조성물로서,
    다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성골 형질세포종, 수질외 형질세포종, 골경화 골수종, 중쇄 질환, 의미불명의 단클론성 감마글로불린이상증, 무증상 다발성 골수종(smoldering multiple myeloma), B-세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염(RA)으로부터 선택되는 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 작제물, 또는 제8항의 방법에 따라 생산된 항체 작제물, 제5항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제6항에 따른 벡터, 또는 제7항에 따른 단리된 숙주 세포를 포함하는, 키트로서,
    자가면역질환, 다발성 골수종, 형질세포종, 형질 세포 백혈병, 마크로글로불린혈증, 아밀로이드증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 고립성골 형질세포종, 수질외 형질세포종, 골경화 골수종, 중쇄 질환, 의미불명의 단클론성 감마글로불린이상증, 무증상 다발성 골수종(smoldering multiple myeloma), B-세포 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 호지킨 림프종, 전신홍반성루프스(SLE) 또는 류마티스 관절염(RA)으로부터 선택되는 질환의 예방, 치료 또는 개선에 사용하기 위한, 키트.
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