ES2839549T3

ES2839549T3 - Antagonistas de activina-ActRIIa de utilización en la estimulación del crecimiento óseo

Info

Publication number: ES2839549T3
Application number: ES17175570T
Authority: ES
Inventors: John Knopf; Seehra Jasbir
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2005-11-23
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2021-07-05
Anticipated expiration: 2026-11-22
Also published as: EA201300330A1; HK1248598A1; JP2012125259A; HK1158548A1; US10071135B2; CN103479994A; ECSP088463A; JP2013153765A; CA3045808C; KR20160137665A; CA2631013C; JP2016041733A; KR20150115961A; IL259893A; EA018450B1; IL259893B; HK1123215A1; EA201100158A1; BRPI0618947A2; US20070249022A1

Abstract

Método para identificar un agente que estimula el crecimiento óseo e incrementa la densidad ósea, en el que el método comprende: a) identificar un agente que se une a un dominio de unión a ligando de un polipéptido ActRIIa competitivamente con una activina, en la que el polipéptido ActRIIa comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID nº 3 y b) evaluar el efecto del agente sobre el tejido óseo en el que el extremo N-terminal del polipéptido ActRIIa es ILGRSETQE.

Description

DESCRIPCIÓN

Antagonistas de activina-ActRIIa de utilización en la estimulación del crecimiento óseo

Antecedentes de la invención

Los trastornos de hueso, desde la osteoporosis a las fracturas, representan un conjunto de estados patológicos para los que existen pocos agentes farmacéuticos eficaces. Por el contrario, el tratamiento se centra en intervenciones físicas y comportamentales, incluyendo la inmovilización, el ejercicio y los cambios en la dieta. Resultaría beneficioso disponer de agentes terapéuticos que estimulen el crecimiento óseo e incrementan la densidad ósea para los fines de tratamiento de una diversidad de trastornos óseos.

El crecimiento óseo y mineralización son dependientes de las actividades de dos tipos celulares: osteoclastos y osteoblastos, aunque los condrocitos y las células de la vasculatura también participan en aspectos críticos de estos procesos. Durante el desarrollo, la formación del hueso se produce mediante dos mecanismos: la osificación endocondral y la osificación intramembranosa. La primera es responsable de la formación de hueso longitudinal y la segunda, de la formación de huesos topológicamente planos, tales como los huesos del cráneo. La osificación endocondral requiere la formación y degradación secuenciales de estructuras cartilaginosas en las placas de crecimientos que sirven como moldes para la formación de osteoblastos, osteoclastos, la vasculatura y la posterior mineralización. Durante la osificación intramembranosa, se forma hueso directamente en los tejidos conectivos. Ambos procesos requieren la infiltración de osteoblastos y el depósito posterior de matriz.

Las fracturas y otras disrupciones estructurales del hueso cicatrizan mediante un proceso que, por lo menos superficialmente, es similar a la secuencia de sucesos del desarrollo de la osteogénesis, incluyendo la formación de tejido cartilaginoso y la posterior mineralización. El proceso de cicatrización de fracturas puede producirse de dos maneras. La cicatrización ósea directa o primaria se produce sin formación de callo. La cicatrización ósea indirecta o secundaria se produce con un estadio precursor de callo. La cicatrización primaria de fracturas implica el reformado de la continuidad mecánica al través de una disrupción estrecha. Bajo condiciones adecuadas, las células de resorción ósea que circundan a la disrupción muestran una respuesta resortiva en túnel y establecen caminos para la penetración de vasos sanguíneos y la posterior cicatrización. La cicatrización secundaria de huesos sigue un proceso de inflamación, formación de callo blando, mineralización del callo y remodelado del callo. En la etapa de inflamación, resulta la formación de hematoma y hemorragia a partir de la disrupción de los vasos sanguíneos periostiales y endostiales en el sitio de lesión. Las células inflamatorias invaden la zona. En la etapa de formación de callo blando, las células producen vasos nuevos, fibroblastos, material intracelular y células de soporte, formando tejido de granulación en el espacio entre los fragmentos de la fractura. La unión clínica al través de la disrupción se establece mediante tejido fibroso o cartilaginoso (callo blando). Se forman osteoblastos y median en la mineralización del callo blando, que a continuación resultan sustituidos por hueso lamelar y quedan sometidos a los procesos normales de remodelado.

Además de las fracturas y otras disrupciones físicas de la estructura ósea, la pérdida del contenido mineral óseo y masa ósea puede estar causada por una amplia diversidad de condiciones y puede resultar en problemas médicos significativos. Los cambios de masa ósea se producen de una manera relativamente predecible durante la vida de un individuo. Hasta aproximadamente los 30 años de edad, tanto hombres como mujeres crecen hasta la masa máxima mediante crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondral y crecimiento radial. Después de aproximadamente los 30 años de edad (para el hueso trabecular, p.ej., huesos planos como las vértebras y la pelvis) y los 40 años de edad (para el hueso cortical, p.ej., huesos largos en las extremidades), se produce una pérdida lenta de hueso tanto en hombres como en mujeres. En las mujeres, también se produce una etapa final de pérdida sustancial de hueso, probablemente debida a deficiencias postmenopáusicas de estrógenos. Durante dicha etapa, las mujeres pueden perder un 10% adicional de masa ósea del hueso cortical y 25% del compartimiento trabecular. Si la pérdida ósea progresiva resulta en una condición patológica tal como la osteoporosis depende en gran medida de la masa ósea inicial del individuo y de si hay condiciones exacerbantes.

La pérdida ósea en ocasiones se caracteriza como un desequilibrio en el proceso normal de remodelado óseo. El hueso sano se ve sometido constantemente a remodelado. El remodelado se inicia con la resorción de hueso por los osteoclastos. A continuación, el hueso resorbido es sustituido por nuevo tejido óseo, que se caracteriza por la formación de colágeno por osteoblastos y la posterior calcificación. En individuos sanos, las tasas de resorción y formación están equilibradas. La osteoporosis es una condición progresiva crónica, marcada por un desplazamiento hacia la resorción, que resulta en una reducción global de la masa ósea y la mineralización ósea. La osteporosis en el ser humano se ve precedida por osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es inferior al valor medio para el hueso adulto joven en más de una desviación estándar, aunque en menos de 2,5 desviaciones estándares). Globalmente, aproximadamente 75 millones de personas están en riesgo de osteoporosis.

De esta manera, los métodos para controlar el equilibrio entre la actividad de osteoclastos y osteoblastos pueden resultar útiles para estimular la cicatrización de heridas y otros daños a los huesos, así como el tratamiento de trastornos, tales como la osteoporosis, asociados a la pérdida de masa ósea y a la mineralización ósea.

Con respecto a la osteoporosis, los estrógenos, la calcitonina, la osteocalcina con tamina K, o las dosis elevadas de calcio en la dieta se utilizan todos como intervenciones terapéuticas. Entre otros enfoques terapéuticos a la osteoporosis se incluyen bisfosfonatos, hormona paratiroidea, calcimiméticos, estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estroncio, y fluoruro sódico. Sin embargo, dichos terapéuticos están asociados frecuentemente a efectos secundarios no deseables.

De esta manera, es un objetivo de la presente exposición proporcionar composiciones y métodos para estimular el crecimiento y mineralización óseos.

En la técnica anterior, el documento n° WO 2006/012627 A2, que es parte de la técnica anterior según el artículo 54(3) EPC, da a conocer polipéptidos receptores de ActRII. El documento n° WO 2005/097825 A2 da a conocer variantes de BMP-7 (proteínas morfogenéticas óseas) que se unen a ActRIIa. Yamashita et al, JCB, vol. 130, n° 1, 1 de julio de 1995, páginas 217 a 226 describen la proteína osteogénica 1 (OP-1), que se une a ActR-II e induce efectos similares a la activina. Kirsch et al., EMBO Journal, vol. 19, n° 13, 1 de julio de 2000, páginas 3314 a 3324, describen que la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) que induce la formación y regeneración óseas en vertebrados adultos se une a ActR-II.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un método para identificar un agente que estimula el crecimiento óseo e incrementa la densidad ósea, en el que el método comprende: a) identificar un agente que se une a un dominio de unión a aligando de un polipéptido ActRIIa competitivamente con una activina, en la que el polipéptido ActRIIa comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID n° 3 y b) evaluar el efecto del agente sobre el tejido óseo, en el que el extremo N-terminal del polipéptido ActRIIa es ILGRSETQE.

El agente puede seleccionarse del grupo que consiste en moléculas orgánicas no peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácidos nucleicos. El agente puede identificarse mediante un método bioquímico, que puede ser uno o más de fotoentrecruzamiento, unión de ligandos marcados radioactivamente o cromatografía de afinidad, y/o mediante un ensayo basado en mecanismo en un ensayo celular. El agente puede evaluarse en un ensayo in vivo.

El polipéptido ActRIIa puede comprender la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2, la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7 o la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 12. El polipéptido ActRIIa puede consistir en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7.

En parte, la exposición demuestra que las moléculas con actividad antagonista de activina o de ActRIIa ("antagonistas de activina" y "antagonistas de ActRIIa") pueden utilizarse para incrementar la densidad ósea, estimular el crecimiento óseo y/o incrementar la resistencia ósea. En particular, la exposición demuestra que una forma soluble de ActRIIa actúa como un inhibidor de la señalización de activina-ActRIIa y estimula una densidad ósea, crecimiento óseo y/ resistencia ósea incrementados in vivo. Aunque la mayoría de agentes farmacéuticos que estimulan el crecimiento óseo o inhiben la pérdida ósea actúan como agentes anticatabólicos (también comúnmente denominados "agentes catabólicos") (p.ej., los bisfosfonatos) o bien como agentes anabólicos (p.ej., la hormona paratiroidea, PTH, en caso de dosificarse apropiadamente), la proteína ActRIIa soluble muestra actividad dual, presentando efectos tanto catabólicos como anabólicos. De esta manera, la exposición establece que los antagonistas de la ruta de señalización de activina-ActRIIa pueden utilizarse para incrementar la densidad ósea y estimular el crecimiento óseo. Aunque la ActRIIa soluble puede afectar al hueso mediante un mecanismo diferente del antagonismo de activina, la exposición, sin embargo, muestra que los agentes terapéuticos deseables pueden seleccionarse basándose en la actividad antagonista de activina-ActRIIa. Por lo tanto, la exposición proporciona métodos para utilizar los antagonistas de activina-ActRIIa, incluyendo, por ejemplo, los polipéptidos ActRIIa de unión a activina, los anticuerpos anti-activina, los anticuerpos anti-ActRIIa, las moléculas pequeñas y aptámeros con diana en activina o ActRIIa, y ácidos nucleicos que reducen la expresión de la activina y ActRIIa, para tratar trastornos asociados a una densidad ósea baja o una baja resistencia ósea, tal como la osteoporosis, o para estimular el crecimiento óseo en pacientes que lo necesitan, tal como en pacientes que presentan una fractura ósea. Adicionalmente, el polipéptido ActRIIa soluble estimula el crecimiento óseo sin causar un incremento consistentemente medible de la masa muscular.

La exposición proporciona polipéptidos que comprenden un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble que se une a la activina. Los polipéptidos ActRIIa pueden formularse en forma de una preparación farmacéutica que comprende el polipéptido ActRIIa de unión a activina y un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, el polipéptido ActRIIa de unión a activina se une a la activina con una Kd inferior a 1 micromolar o inferior a 100, 10 o 1 nanomolar. Opcionalmente, el polipéptido ActRIIa de unión a activina se une selectivamente a la activina frente a GDF11 y/o GDF8, y preferentemente con una Kd que es por lo menos 10 veces, 20 veces o 50 veces inferior a la activina con respecto a GDF11 y/o GDF8. Aunque sin deseo de restringirse a ningún mecanismo particular de acción, se espera que este grado de selectividad para la inhibición de la activina frente a la inhibición de GDF11/GDF8 explica el efecto selectivo sobre el hueso sin un efecto consistentemente medible sobre el músculo. Puede seleccionarse un polipéptido ActRIIa para causar menos de 15%, menos de 10% o menos de 5% de incremento del músculo a dosis que consiguen efectos deseables sobre el hueso. Preferentemente, la composición es por lo menos 95% pura, con respecto a otros componentes polipéptido, según evaluación mediante cromatografía de exclusión por tamaño, y más preferentemente, la composición es por lo menos 98% pura. Un polipéptido ActRIIa de unión a activina para la utilización en dicha preparación puede ser cualquiera de los dados a conocer en la presente memoria, tal como un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 2, 3, 7 o 12, o que presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 2, 3, 7, 12 o 13. Un polipéptido ActRIIa de unión a activina puede incluir un fragmento funcional de un polipéptido ActRIIa natural, tal como uno que comprende por lo menos 10, 20 o 30 aminoácidos de una secuencia seleccionada de SEC ID n° 1 a 3 o una secuencia de SEC ID n° 2, que no presenta los 10 a 15 aminoácidos C-terminales (la "cola").

Un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble puede incluir una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos (p.ej., en el dominio de unión a ligando) respecto a un polipéptido ActRIIa natural. Se proporcionan ejemplos de polipéptidos ActRIIa alterados en el documento n° WO 2006/012627, páginas 59 a 60. La alteración de la secuencia de aminoácidos puede alterar, por ejemplo, la glucosilación del polipéptido al producirlo en una célula de mamífero, insecto u otra célula eucariótica o alterar el corte proteolítico del polipéptido respecto al polipéptido ActRIIa natural.

Un polipéptido ActRIIa de unión a activina puede ser una proteína de fusión que presenta, como un dominio, un polipéptido ActRIIa (p.ej., una parte de unión a ligando de una ActRIIa) y uno o más dominios adicionales que proporcionan una propiedad deseable, tal como una farmacocinética mejorada, una purificación más fácil, el reconocimiento de tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un domino de una proteína de fusión puede potenciar uno o más de estabilidad in vivo, semivida in vivo, incorporación/administración, localización o distribución en los tejidos, formación de complejos de proteínas, multimerización de la proteína de fusión y/o purificación. Una proteína de fusión de ActRIIa de unión a activina puede incluir un dominio Fc de inmunoglobulina (de tipo salvaje o mutante) o una albúmina sérica u otra parte polipeptídica que proporciona propiedades deseables, tales como una farmacocinética mejorada, una solubilidad mejorada o una estabilidad mejorada. Una fusión ActRIIa-Fc puede comprender un conector relativamente no estructurado entre el dominio Fc y el dominio ActRIIa extracelular. Dicho conector no estructurado puede corresponder a la región no estructurada de aproximadamente 15 aminoácidos en el extremo C-terminal del dominio extracelular de ActRIIa (la "cola") o puede ser una secuencia artificial de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o un tramo de entre 5 y 15, 20, 30, 50 o más aminoácidos que se encuentra relativamente libre de estructura secundaria, o una mezcla de ambos. Un conector puede ser rico en residuos de glicina y prolina y puede contener, por ejemplo, una única secuencia de treonina/serina y glicinas o secuencias repetitivas de treonina/serina y glicinas (p.ej., singuletes o repeticiones de TG⁴o SG⁴). Una proteína de fusión puede incluir una subsecuencia de purificación, tal como una etiqueta epítopo, una etiqueta FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión de GST. Opcionalmente, un polipéptido ActRIIa soluble incluye uno o más residuos aminoácidos modificados seleccionados de: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con una fracción lípido y un aminoácido conjugado con un agente derivatizante orgánico. Una preparación farmacéutica puede incluir además uno o más compuestos adicionales, tal como un compuesto que se utiliza para tratar un trastorno óseo. Preferentemente, una preparación farmacéutica está sustancialmente libre de pirógenos. En general, resulta preferente que la proteína ActRIIa se expresa en una línea celular de mamífero que medie en una glucosilación convenientemente natural de la proteína ActRIIa de manera que se reduzca la probabilidad de una respuesta inmunitaria desfavorable en el paciente. Se han utilizado con éxito líneas celulares humanas y de CHO, y se espera que resultarán útiles otros sistemas de expresión de mamífero comunes.

Tal como se indica en la presente memoria, las proteínas ActRIIa denominadas ActRIIa-Fc (una forma con un conector mínimo entre la parte ActRIIa y la parte Fc) presentan propiedades deseables, incluyendo la unión selectiva a activina frente a GDF8 y/o GDF11, unión de ligandos de alta afinidad y semivida en suero superior a dos semanas en modelos animales. En la presente memoria se dan a conocer polipéptidos ActRIIa-Fc y preparaciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La exposición proporciona ácidos nucleicos codificantes un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble. Un polinucleótido aislado puede comprender una secuencia codificante de un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble, tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede incluir una secuencia codificante de un dominio extracelular (p.ej., un dominio de unión a ligando) de una ActRIIa y una secuencia que codificaría parte o todo el dominio transmembranal y/o el dominio citoplasmático de una ActRIIa, excepto por un codón de parada situado dentro del dominio transmembranal o en el dominio citoplasmático, o situado entre el dominio extracelular y el dominio transmembranal o el dominio citoplasmático. Por ejemplo, un polinucleótido aislado puede comprender una secuencia polinucleótida de ActRIIa de longitud completa, tal como SEC ID n° 4 o n° 5, o una versión parcialmente truncada de la misma, en la que dicho polinucleótido aislado comprende además un codón de terminación de la transcripción por lo menos seiscientos nucleótidos antes del dominio 3'-terminal o de otro modo situado de manera que la traducción del polinucleótido da lugar a un dominio extracelular fusionado opcionalmente con una parte truncada de una ActRIIa de longitud completa. Una secuencia de ácidos nucleicos preferente es la SEC ID n° 14. Los ácidos nucleicos dados a conocer en la presente memoria pueden unirse operablemente a un promotor para la expresión, y la exposición proporciona células transformadas con dichos polinucleótidos recombinantes. Preferentemente, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula CHO.

La exposición proporciona métodos para producir un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble. Dicho método puede incluir la expresión de cualquiera de los ácidos nucleicos (p.ej., SEC ID n° 4, n° 5 o n° 14) dados a conocer en una célula adecuada, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO). Dicho método puede comprender: a) cultivar una célula bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido ActRIIa soluble, en el que dicha célula se transforma con un constructo de expresión de ActRIIa soluble, y b) recuperar el polipéptido ActRIIa soluble expresado de esta manera. Los polipéptidos ActRIIa solubles pueden recuperarse en forma de fracciones en bruto, parcialmente purificadas o altamente purificadas. La purificación puede conseguirse mediante una serie de etapas de purificación, incluyendo, por ejemplo, una, dos, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio aniónico, (p.ej., sefarosa Q), cromatografía de interacción hidrofóbica (p.ej., fenilsefarosa), cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico.

Puede utilizarse un antagonista de activina-ActRIIa dado a conocer en la presente memoria, tal como un polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble, en un método para estimular el crecimiento óseo o para incrementar la densidad ósea en un sujeto. La exposición proporciona métodos para tratar un trastorno asociado a baja densidad ósea, o para estimular el crecimiento óseo, en pacientes que lo necesitan. Un método puede comprender la administración en el sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de antagonistas de activina-ActRIIa. La exposición proporciona usos de antagonistas de activina-ActRIIa para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno o condición tal como se indica en la presente memoria.

La exposición proporciona un método para identificar un agente que estimula el crecimiento o una mineralización incrementada del hueso. El método comprende: a) identificar un agente de ensayo que se une a la activina o un dominio de unión a ligando de un polipéptido ActRIIa, y b) evaluar el efecto del agente sobre el crecimiento o mineralización del hueso.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la purificación de ActRIIa-Fc_h expresado en células CHO. La proteína se purifica en forma de un único pico bien definido.

La figura 2 muestra la unión de ActRIIa-Fc_h a activina y GDF-11, medida mediante ensayo BiaCore™

La figura 3 muestra un esquema del ensayo del gen informador A-204. La figura muestra el vector informador pGL3(CAGA)12 (descrito en Dennler et al., Em BO 17: 3091-3100, 1998). El motivo CAGA12 se encuentra presente en los genes sensibles a TGF-Beta (gen PAI-1), por lo que dicho vector resulta de uso general para factores que señalizan a través de Smad2 y Smad3.

La figura 4 muestra los efectos de ActRIIa-Fc_h (rombos) y ActRIIa-Fc_m (cuadrados) sobre la señalización de GDF-8 en el ensayo del gen informador A-204. Ambas proteínas mostraban una inhibición sustancial de la señalización mediada por GDF-8 a concentraciones picomolares.

La figura 5 muestra los efectos de tres preparaciones diferentes de ActRIIa-Fc_h sobre la señalización de GDF-11 en el ensayo del gen informador A-204.

La figura 6 muestra ejemplos de imágenes DEXA de ratones BALB/c de control y tratados con ActRIIa-Fc_m, antes (paneles superiores) y después (paneles inferiores) del periodo de tratamiento de 12 semanas. El sombreado más pálido indica densidad ósea incrementada.

La figura 7 muestra una cuantificación de los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre la densidad mineral ósea en ratones BALB/c durante el periodo de 12 semanas. Los tratamientos eran control (rombos), dosis de 2 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (cuadrados), dosis de 6 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (triángulos) y dosis de 10 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (círculos). La figura 8 muestra una cuantificación de los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre el contenido mineral óseo en ratones BALB/c durante el periodo de 12 semanas. Los tratamientos eran: control (rombos), dosis de 2 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (cuadrados), dosis de 6 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (triángulos) y dosis de 10 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (círculos). La figura 9 muestra una cuantificación de los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre la densidad mineral ósea del hueso trabecular en ratones C57BL6 ovariectomizados (OVX) o simuladamente operados (SHAM) después de un periodo de 6 semanas. Los tratamientos eran control (PBS) o dosis de 10 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (ActRIIa).

La figura 10 muestra una cuantificación de los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre el hueso trabecular en ratones C57BL6 ovariectomizados (OVX) durante un periodo de 12 semanas. Los tratamientos eran control (PBS; columnas claras) o dosis de 10 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (ActRIIa; columnas oscuras).

La figura 11 muestra una cuantificación de los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre el hueso trabecular en ratones C57BL6 simuladamente operados después de 6 o 12 semanas de periodo de tratamiento. Los tratamientos eran control (PBS; columnas claras) o dosis de 10 mg/kg de ActRIIa-Fc_m (ActRIIa; columnas oscuras).

La figura 12 muestra los resultados del análisis de pQCT de la densidad ósea en ratones ovariectomizados durante 12 semanas de tratamiento. Los tratamientos eran control (PBS, columnas claras) o ActRIIa-Fc_m (columnas oscuras). eje y: mg/ccm.

La figura 13 ilustra los resultados del análisis de pQCT de la densidad ósea en ratones simuladamente operados durante 12 semanas de tratamiento. Los tratamientos eran control (PBS, columnas claras) o ActRIIa-Fc_m (columnas oscuras). eje y: mg/ccm.

Las figuras 14A y 14B muestran el análisis DEXA de cuerpo completo tras 12 semanas de tratamiento (A) y el análisis ex vivo de fémures (B). Las zonas pálidas ilustran zonas de alta densidad ósea.

La figura 15 muestra el análisis pQCT ex vivo de la diáfisis media femoral tras doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron el control de vehículo (PBS, columnas oscuras) y ActRIIa-Fc_m (columnas claras). Las cuatro columnas a la izquierda muestran la densidad ósea, mientras que las cuatro columnas a la derecha muestran la densidad ósea cortical. El primer par de columnas en cada grupo de cuatro columnas representa los datos de ratones ovariectomizados, mientras que el segundo par de columnas representa datos de ratones simuladamente operados.

La figura 16 muestra el análisis pQCT ex vivo del contenido óseo diafisario de la diáfisis media femoral tras doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron el control de vehículo (PBS, columnas oscuras) y ActRIIa-Fc_m (columnas claras). Las cuatro columnas a la izquierda muestran el contenido óseo total, mientras que las cuatro columnas a la derecha muestran el contenido óseo cortical. El primer par de columnas en cada grupo de cuatro columnas representa los datos de ratones ovariectomizados, mientras que el segundo par de columnas representa datos de ratones simuladamente operados.

La figura 17 muestra el análisis pQCT ex vivo de la diáfisis media femoral y del grosor cortical femoral. Los tratamientos fueron el control (PBS, columnas oscuras) y ActRIIa-Fc_m (columnas claras). Las cuatro columnas a la izquierda muestran la circunferencia endosteal, mientras que las cuatro columnas a la derecha muestran la circunferencia periosteal. El primer par de columnas en cada grupo de cuatro columnas representa los datos de ratones ovariectomizados, mientras que el segundo par de columnas representa datos de ratones simuladamente operados.

La figura 18 ilustra los resultados de los ensayos mecánicos de fémures tras doce semanas de tratamiento. Los tratamientos fueron el control (PBS, columnas oscuras) y ActRIIa-Fc_m (columnas claras). Las dos columnas a la izquierda representan datos de ratones ovariectomizados, mientras que las últimas dos barras representan datos de ratones operados simuladamente.

La figura 19 muestra los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre el volumen de hueso trabecular.

La figura 20 muestra los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre la arquitectura trabecular en el fémur distal.

La figura 21 muestra los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre el hueso cortical.

La figura 22 muestra los efectos de ActRIIa-Fc_m sobre la resistencia mecánica del hueso.

La figura 23 muestra los efectos de diferentes dosis de ActRIIa-Fc_m sobre las características óseas a tres dosis diferentes.

La figura 24 muestra datos de histomorfometría ósea que indican que ActRIIa-Fc_m presenta una doble actividad, anabólica y antiresortiva.

Descripción detallada de la invención

1. Descripción general

La superfamilia del factor-beta de crecimiento transformante (TGF-beta, por sus siglas en inglés) contiene una diversidad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Es conocido que estas proteínas ejercen efectos biológicos sobre una amplia diversidad de tipos celulares tanto en vertebrados como invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan importantes funciones durante el desarrollo embrionario en la formación de patrón y la especificación de tejidos, y pueden influir sobre una diversidad de procesos de diferenciación, entre ellos la adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogénesis y diferenciación de las células epiteliales. La familia se divide en dos ramas generales: las ramas de BMP/GDP y la de TGF-beta/activina/BMP10, cuyos miembros presentan efectos diversos, con frecuencia complementarios. Mediante la manipulación de la actividad de un miembro de la familia de TGF-beta, con frecuencia resulta posible provocar cambios fisiológicos significativos en un organismo. Por ejemplo, las razas de vaca piamontesa y azul belga son portadoras de una mutación de pérdida de función en el gen GDF8 (también denominado miostatina) que causa un marcado incremento de la masa muscular. Grobet et al., Nat. Genet. 17(1):71-4, 1997. Además, en el ser humano, los alelos inactivos de GDF8 están asociados a una masa muscular incrementada y, según se informa, una fuerza excepcional. Schuelke et al., N. Engl. J. Med. 350:2682-8, 2004.

Las activinas son factores de crecimiento polipeptídicos diméricos que pertenecen a la superfamilia de TGF-beta. Existen tres formas principales de activina (A, B y AB) que son homo/heterodímeros de dos subunidades p estrechamente relacionadas (pApA, P^bP^by P^aP^b). El genoma humano codifica además una activina C y una activina E, que se expresan principalmente en el hígado. En la superfamilia de TGF-beta, las activinas son factores únicos multifuncionales que pueden estimular la producción hormonal en células ováricas y placentarias, favorecer la supervivencia de las células neuronales, influir sobre el avance del ciclo celular de manera positiva o negativa según el tipo celular, e inducir la diferenciación mesodérmica por lo menos en embriones de anfibio (DePaolo et al., Proc. Soc. Ep. Biol. Med. 198:500-512, 1991; Dyson et al., Curr. Biol. 7:81-84, 1997; Woodruff, Biochem. Pharmacol. 55:953-963, 1998). Además, el factor de diferenciación eritroide (EDF) aislado a partir de células leucémicas monocíticas humanas estimuladas se ha encontrado que es idéntico a la activina A (Murata et al. PNAS, 85:2434, 1988). Se ha sugerido que la activina A actúa como un regulador positivo natural de la eritropoyesis en la médula ósea. En varios tejidos, la señalización de la activina resulta antagonizada por su heterodímero relacionado: la inhibina. Por ejemplo, durante la liberación de la hormona folículoestimulante (FSH) a partir de la pituitaria, la activina estimula la secreción y síntesis de FSH, mientras que la inhibina bloquea la secreción y síntesis de FSH. Entre otras proteínas que pueden regular la bioactividad de la activina y/o unirse a la activina se incluyen la folistatina (FS), la proteína relacionada con la folistatina (FSRP), la macroglobulina a2, Cereberus y la endoglina.

Las señales de TGF-p están mediadas por complejos heteroméricos de receptores de serina/treonina quinasa de tipos I y II, que fosforilan y activan proteínas Simad corriente bajo tras la estimulación de ligando (Massagué, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178, 2000). Dichos receptores de tipo I y tipo II son proteínas transmembranales, compuestas de un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteínas, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático con especificidad de serina/treonina predicha. Los receptores de tipo I resultan esenciales para la señalización y los receptores de tipo II resultan necesarios para la unión de ligandos y para la expresión de los receptores de tipo I. Los receptores de activina de tipo I y de tipo II forman un complejo estable tras la unión de ligandos, resultando en la fosforilación de receptores de tipo I por receptores de tipo II.

Se han identificado dos receptores de tipo Ii relacionados: ActRIIa y ActRIIb, como receptores de tipo II para las activinas (Mathews y Vale, Cell 65:973-982, 1991; Attisano et al., Cell 68: 97-108, 1992). Aparte de las activinas, ActRIIa y ActRIIb pueden interactuar bioquímicamente con varias otras proteínas de la familia de TGF-p, incluyendo BMP7, Nodal, GDF8 y GDF11(Yamashita et al., J. Cell Biol. 130:217-226, 1995; Lee y McPherron, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311, 2001; Yeo y Whitman, Mol. Cells 7: 949-957, 2001; Oh et al., Genes Dev. 16:2749-54, 2002). ALK4 es el receptor de tipo I primario de las activinas, particularmente para la activina A, y ALK-7 también puede funcionar como receptor de las activinas, particularmente de la activina B.

Tal como se demuestra en la presente memoria, un polipéptido ActRIIa soluble (sActRIIa), que muestra una preferencia sustancial en la unión a la activina A al contrario que otros miembros de la familia de TGF-beta, tales como GDF8 o GDF11, resulta eficaz en la estimulación del crecimiento óseo y el incremento de la densidad ósea in vivo. Aunque sin deseo de restringirse a ningún mecanismo particular, se espera que el efecto de sActRIIa esté causado principalmente por un efecto antagonista de activina, dada la unión muy fuerte de la activina (constante de disociación picomolar) mostrada por el constructo de sActRIia particular utilizado en dichos estudios. Con independencia del mecanismo, resulta evidente a partir de los datos presentados en la presente memoria que los antagonistas de ActRIIaactivina incrementan la densidad ósea en ratones normales y en modelos de ratón de osteoporosis. Debe indicarse que el hueso es un tejido dinámico, con crecimiento o encogimiento y densidad incrementada o disminuida según un equilibrio de factores que producen hueso y estimulan la mineralización (principalmente osteoblastos) y factores que destruyen y desmineralizan el hueso (principalmente osteoclastos). El crecimiento y mineralización óseo puede incrementarse mediante el incremento de los factores productores, mediante la reducción de los factores destructores, 0 ambos. Las expresiones "estimula el crecimiento óseo" e "incrementa la mineralización ósea" se refieren a los cambios físicos observables en el hueso y pretenden ser neutras respecto al mecanismo por el que se producen los cambios óseos.

Los modelos de ratón de osteoporosis y crecimiento/densidad ósea que se han utilizado en los estudios indicados en la presente memoria se considera que son altamente predictivos de eficacia en el ser humano y, por lo tanto, la presente exposición proporciona métodos para utilizar polipéptidos ActRIIa y otros antagonistas de activina-ActRIIa para estimular el crecimiento óseo e incrementar la densidad ósea en el ser humano. Entre los antagonistas de activina-ActRIIa se incluyen, por ejemplo, polipéptidos ActRIIa solubles de unión a activina, anticuerpos que se unen a la activina (particularmente las subunidades A o B de la activina, también denominadas pA or pB) e interrumpen la unión de ActRIIa, anticuerpos que se unen a ActRIIa e interrumpen la unión de la activina, proteínas no anticuerpo seleccionadas para la unión de activina o ActRIIa (ver, p.ej., los documentos n° WO/2002/088171, n° WO/2006/055689, n° WO/2002/032925, n° WO/2005/037989, n° US 2003/0133939 y n° US 2005/0238646 para ejemplos de dichas proteínas y métodos de diseño y selección de las mismas), péptidos aleatorizados seleccionados para la unión de activina o ActRIIa, con frecuencia fijos a un dominio Fc. Dos proteínas diferentes (u otras fracciones) con actividad de unión a activina o ActRIIa, especialmente ligantes de activina que bloquean los sitios de unión de tipo 1 (p.ej., un receptor de activina de tipo I soluble) y de tipo II (p.ej., un receptor de activina de tipo II soluble), respectivamente, pueden unirse entre sí para crear una molécula de unión bifuncional. Aptámeros de ácidos nucleicos, moléculas pequeñas y otros agentes que inhiben el eje de señalización de activina-ActRIIa Diversas proteínas presentan actividad antagonista de activina-ActRIIa, incluyendo la inhibina (es decir, la subunidad alfa de inhibina), aunque la inhibina no antagoniza universalmente la activina en todos los tejidos, la folistatina (p.ej., la folistatina 288 y la folistatina 315), Cerberus, FSRP, endoglina, activina C, macroglobulina alfa(2) y una activina A mutante M108A (cambio de metionina por alanina en la posición 108). Generalmente, las formas alternativas de la activina, particularmente aquellas con alteraciones en el dominio de unión a receptores de tipo I, pueden unirse a receptores de tipo II y no consiguen forman un complejo ternario activo, actuando de esta manera como antagonistas. Además, ácidos nucleicos tales como las moléculas antisentido, ARNip o ribozimas que inhiben la activina A, B, C o E, o particularmente, la expresión de ActRIIa, puede utilizarse como antagonistas de activina-ActRIIa. Preferentemente, los antagonistas de activina-ActRIIa que deben utilizarse mostrarán selectividad para la inhibición de la señalización mediada por activina frente a otros miembros de la familia de TGF-beta, y particularmente con respecto a Gdf8 y GDF11. Las proteínas ActRIIb solubles sí se unen a la activina; sin embargo, la proteína de tipo salvaje no muestra una selectividad significativa en la unión a la activina frente a GDF8/11, y los experimentos preliminares sugieren que dicha proteína no proporciona los efectos deseados sobre el hueso, causando simultáneamente un crecimiento muscular sustancial. Sin embargo, se han identificado formas alternativas de ActRIIb con diferentes propiedades de unión (ver, p.ej., el documento n° WO 2006/012627, páginas 55 a 59) y estas proteínas pueden conseguir los efectos deseados sobre el hueso. Puede proporcionarse especificidad añadida para la activina a ActRIIb nativa o alterada mediante acoplamiento con un segundo agente de unión selectivo para la activina.

Los términos utilizados en la presente especificación generalmente presentan sus significados ordinarios en la materia, dentro del contexto de la presente invención y en el contexto específico en el que se utiliza cada término. Determinados términos se comentan posteriormente o en otros sitios en la especificación a fin de proporcionar una guía adicional para el profesional durante la descripción de los métodos de la invención y de cómo generarlos y utilizarlos. El alcance o significado de cualquier utilización de un término resultará evidente a partir del contexto específico en el que se utiliza el término.

El término "aproximadamente" generalmente se referirá a un grado aceptable de error para la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Típicamente, los grados ejemplares de error se encuentran dentro de 20 por ciento (%), preferentemente dentro de 10%, y más preferentemente dentro de 5% de un valor o rango de valores dado.

Alternativamente, y en particular en sistemas biológicos, el término "aproximadamente" puede significar valores que se encuentran dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de un factor de 5 veces, y más preferentemente de 2 veces, de un valor dado. Las cantidades numéricas proporcionadas en la presente memoria son aproximadas, a menos que se indique lo contrario, referido a que el término "aproximadamente" puede inferirse en donde no se indica explícitamente.

Los métodos de la invención pueden incluir etapas de comparación mutua de secuencias, incluyendo secuencias de tipo salvaje en comparación con uno o más mutantes (variantes de secuencia). Dichas comparaciones típicamente comprenden alineaciones de secuencias de polímero, p.ej., utilizando programas y/o algoritmos de alineación de secuencias que son bien conocidos de la técnica (por ejemplo, BLAST, FASTA y MEGALIGN, entre otros). El experto en la materia podrá apreciar fácilmente que, en dichas alineaciones, en donde una mutación contiene una inserción o deleción de residuo, la alineación de las secuencias introducirá un "hueco" (típicamente representado mediante un guión o "A") en la secuencia del polímero que no contiene el residuo insertado o delecionado.

El término "homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas procedentes de diferentes especies de organismo. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) presentan homología de secuencia, según refleja la similitud de sus secuencias, en términos de porcentaje de identidad o la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. La expresión "similitud de secuencias", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que pueden compartir o no un origen evolutivo común.

Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", en el caso de que esté modificado con un adverbio tal como "altamente", puede referirse a la similitud de secuencias y puede estar relacionado o no con un origen evolutivo común.

2. Polipéptidos ActRIIa

En la presente memoria se dan a conocer polipéptidos ActRIIa. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "ActRIIa" se refiere a una familia de proteínas de receptor de activina de tipo IIa (ActRIIa) de cualesquiera especies y variantes derivadas de dichas proteínas ActRIIa mediante mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRIIa en la presente memoria se entiende que es una referencia a cualquiera de las formas actualmente identificadas. Los miembros de la familia de ActRIIa son generalmente proteínas transmembranales, compuestas de un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteínas, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático con la actividad de serina/treonina quinasa predicha.

La expresión "polipéptido ActRIIa" incluye polipéptidos que comprende cualquier polipéptido natural de un miembro de la familia de ActRIIa, así como cualesquiera variantes de la misma (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. Por ejemplo, entre los polipéptidos ActRIIa se incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier ActRIIa conocido que presenta una secuencia por lo menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido ActRIIa, y preferentemente una identidad de por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o superior. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIa dado a conocer en la presente memoria puede unirse e inhibir la función de una proteína ActRIIa y/o activina. Preferentemente, un polipéptido ActRIIa estimula el crecimiento óseo y la mineralización ósea. Entre los ejemplos de polipéptidos ActRIIa se incluyen polipéptido precursor de ActRIIa humano (SEC ID n° 1) y polipéptidos ActRIIa humanos solubles (p.ej., SEC ID n° 2, n° 3, n° 7 y n° 12).

La secuencia de la proteína precursora ActRIIa humana es la siguiente:

MGAAAKLAFAVFLI S C S S GAI LGRSETQECLFFNANWEKDRTN

QTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCY

DRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNP

VTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVL

VPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEY

VAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTS

VDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSWNELCHIAETMARGLA

YLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLA

LKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDM

YAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQE

WVHKKKRPVLRDYWQKHAGMAMLCETIEECWDHDAEARLSAG

CVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL

(SEC ID n° 1)

El péptido de señal presenta un subrayado simple; el dominio extracelular se muestra en negrita y los potenciales sitios de glucosilación unidos a N presentan un doble subrayado.

La secuencia del polipéptido ActRIIa soluble (extracelular) humano procesado es la siguiente:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT

WKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE

GNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEC ID n° 2)

La "cola" C-terminal del dominio extracelular está subrayada. La secuencia con deleción de la "cola" (una secuencia A15) es la siguiente:

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT

WKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE

GNMCNEKFSYFPEM (SEC ID n° 3)

La secuencia de ácidos nucleicos codificante de la proteína precursora ActRIIa humana es la siguiente (nucleótidos 164 a 1705 de la entrada de GenBank NM_001616):

TCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACAT

CCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGT

GCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTC

CAACTCAAGACCCAGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACC

ACTGCAGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAA

GCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACA

AACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCA

TCAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGAT

GTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACT

TTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAAC

CATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGAT

GGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGT

TGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATT

TGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGG

TACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCAT

TTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTC

TCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAG

GAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGC

ATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAAT

GGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCñGAAGCC

AGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAA

CAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAA

^{TGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA} (SEC ID n° 4)

ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTT

CAGGTGCTATACTTGGTAGArCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGC TAATTGGGAAAAAGAGAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTmT'GGT GACAAAGATAAACGGCGGCñrTGTTTTGCTACCTGGAAGAArATTTCTGGTT

CCATTGAAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGA

CAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGC

TGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAG

La secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido ActRIIa (extracelular) humano es la siguiente:

ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGG

AAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGA

TAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAA

ATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTG

ATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGG

CAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAG

^{CCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC} (SEC ID n° 5)

En la presente memoria se dan a conocer polipéptidos ActRIIa solubles. Tal como se indica en la presente memoria, la expresión "polipéptido ActRIIa soluble" se refiere de manera general a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de una proteína ActRIIa. La expresión "polipéptido ActRIIa soluble", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye cualquier dominio extracelular natural de una proteína ActRIIa, así como cualesquiera variantes de la misma (incluyendo mutantes, fragmentos y formas peptidomiméticas). Un polipéptido ActRIIa de unión a activina es uno que conserva la capacidad de unirse a la activina, particularmente la activina AA, AB o BB. Preferentemente, un polipéptido ActRIIa de unión a activina se unirá a la activina AA con una constante de disociación de 1 nM o inferior. Las secuencias de aminoácidos de la proteína precursora ActRIIa humana se proporcionan posteriormente. El dominio extracelular de una proteína ActRIIa se une a la activina y es generalmente soluble y, de esta manera, puede denominarse polipéptido ActRIIa de unión a activina soluble. Entre los ejemplos de polipéptidos ActRIIa de unión a activina solubles se incluyen el polipéptido soluble ilustrado en las SEC ID n° 2, n° 3, n° 7, n° 12 y n° 13. La SEC ID n° 7 se denomina ActRIIa-Fc_h y se describe adicionalmente en los Ejemplos. Otros ejemplos de polipéptidos ActRIIa de unión a activina solubles comprenden una secuencia de señal además del dominio extracelular de una proteína ActRIIa, por ejemplo, la secuencia líder de melitina de abeja melífera (SEC ID n° 8), el líder de activador del plasminógeno tisular (TPA) (SEC ID n° 9) o el líder ActRIIa nativo (SEC ID n° 10). El polipéptido ActRIIa-Fc_h ilustrado en la SEC ID n° 13 utiliza un líder TPA.

Pueden obtenerse fragmentos funcionalmente activos de polipéptidos ActRIIa mediante el cribado de polipéptidos producidos recombinantemente a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico codificante de un polipéptido ActRIIa. Además, pueden sintetizarse fragmentos químicamente, utilizando técnicas conocidas, tales como la reacción de f-Moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield convencional. Los fragmentos pueden producirse recombinantemente o mediante síntesis química y someterse a ensayo para identificar aquellos fragmentos peptidilo que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIa o la señalización mediada por activina.

Pueden obtenerse variantes funcionalmente activas de polipéptidos ActRIIa mediante el cribado de bibliotecas de polipéptidos modificados producidos recombinantemente a partir de los ácidos nucleicos mutagenizados correspondientes codificantes de un polipéptido ActRIIa. Las variantes pueden producirse y someterse a ensayo para identificar aquellas que pueden funcionar como antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIa o de la señalización mediada por la activina. Una variante funcional de los polipéptidos ActRIIa puede comprender una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 2 o n° 3. En determinados casos, la variante funcional presenta una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID n° 2 o n° 3.

Pueden generarse variantes funcionales mediante modificación de la estructura de un polipéptido ActRIIa para fines tales como la potenciación de la eficacia terapéutica o de la estabilidad (p.ej., la vida de almacenamiento ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Dichos polipéptidos ActRIIa modificados, en el caso de que se seleccionen para conservar la unión de la activina, se consideran equivalentes funcionales de los polipéptidos ActRIIa naturales. Los polipéptidos ActRIIa modificados también pueden producirse, por ejemplo, mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por ejemplo, resulta razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado (p.ej., mutaciones conservadoras) no presentará un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia del polipéptido ActRIIa resulta en un homólogo funcional puede determinarse fácilmente mediante la evaluación de la capacidad del polipéptido ActRIIa variante para producir una respuesta en las células de una manera similar al polipéptido ActRIIa de tipo salvaje.

Las mutaciones específicas de los polipéptidos ActRIIa pueden alterar la glucosilación del polipéptido. Dichas mutaciones pueden seleccionarse de manera que introduzcan o eliminen uno o más sitios de glucosilación, tal como sitios de glucosilación unidos a O o unidos a N. Los sitios de reconocimiento de glucosilación unidos a asparagina generalmente comprenden una secuencia de tripéptido, asparagina-X-treonina (o asparagina-X-serina) (en la que "X" es cualquier aminoácido), que resulta específicamente reconocido por los enzimas celulares de glucosilación apropiados. La alteración también puede llevarse a cabo mediante la adición o la sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido ActRIIa de tipo salvaje (para los sitios de glucosilación ligados a O). Una diversidad de sustituciones o deleciones de aminoácido en una de entre la primera y tercera posiciones aminoácidas, o en ambas, de un sitio de reconocimiento de glucosilación (y/o deleción de aminoácido en la segunda posición) resulta en la no glucosilación de la secuencia tripéptido modificada. Otro medio para incrementar el número de fracciones carbohidrato en el polipéptido ActRIIa es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con el polipéptido ActRIIa. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento n° WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre, 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, 1987. La eliminación de una o más fracciones carbohidrato presentes en un polipéptido ActRIIa puede llevarse a cabo química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición del polipéptido ActRIIa al compuesto ácido trifluorometanosulfónico o a un compuesto equivalente. Dicho tratamiento resulta en la escisión de la mayor parte o la totalidad de los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacta la secuencia de aminoácidos. La desglucosilación química se describe adicionalmente en Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52, 1987 y en Edge et al. Anal. Biochem. 118-131, 1981). El corte enzimático de las fracciones carbohidrato en los polipéptidos ActRIIa puede llevarse a cabo mediante la utilización de una diversidad de endoglucosidasas y exoglucosidasas tal como indican Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138-350, 1987). La secuencia de un polipéptido ActRIIa puede ajustarse, según resulte apropiado, dependiendo del tipo de sistema de expresión utilizado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto y vegetales pueden todas introducir diferentes patrones de glucosilación que pueden resultar afectados por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, las proteínas ActRIIa para la utilización en el ser humano se expresan en una línea celular de mamífero que proporcione la glucosilación correcta, tal como las líneas celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que también resulten útiles otras líneas celulares de expresión de mamífero, líneas celulares de levadura con enzimas de glucosilación manipulados y células de insecto.

La presente exposición contempla además un método para generar mutantes, particularmente grupos de mutantes combinatorias de un polipéptido ActRIIa, así como mutantes por truncado; los grupos de mutantes combinatoriales resultan especialmente útiles para identificar secuencias variantes funcionales. El propósito del cribado de dichas bibliotecas combinatoriales puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptido ActRIIa que pueden actuar como agonistas o antagonistas, o alternativamente, que posean actividades totalmente nuevas. Se proporciona posteriormente una diversidad de ensayos de cribado, y dichos ensayos pueden utilizarse para evaluar variantes. Por ejemplo, puede cribarse una variante de polipéptido ActRIIa para la capacidad de unirse a un ligando de ActRIIa, para evitar la unión de un ligando de ActRIIa a un polipéptido ActRIIa o para interferir con la señalización causada por un ligando de ActRIIa.

La actividad de un polipéptido ActRIIa o sus variantes también puede someterse a ensayo en un ensayo celular o in vivo. Por ejemplo, puede evaluarse el efecto de una variante de polipéptido ActRIIa sobre la expresión de genes implicados en la producción ósea o la destrucción ósea. Lo anterior puede, según se requiera, llevarse a cabo en presencia de una o más proteínas ligando de ActRIIa recombinantes (p.ej., activina) y pueden transfectarse células para producir un polipéptido ActRIIa y/o variantes del mismo, y opcionalmente, un ligando de ActRIIa. De manera similar, puede administrarse un polipéptido ActRIIa en un ratón u otro animal, y puede evaluarse una o más propiedades óseas, tales como la densidad o el volumen. También puede evaluarse la velocidad de cicatrización de las fracturas óseas. La absorciometría de rayos X de doble energía (DEXA) es una técnica cuantitativa no invasiva bien establecida para evaluar la densidad ósea en un animal. En el ser humano, pueden utilizarse sistemas DEXA centrales para evaluar la densidad ósea en la médula y la pelvis. Estos son los mejores indicadores de densidad ósea global. Los sistemas DEXA periféricos pueden utilizarse para evaluar la densidad ósea en huesos periféricos, incluyendo, por ejemplo, los huesos de la mano, muñeca, tobillo y pie. Pueden utilizarse sistemas tradicionales de obtención de imágenes de rayos X, incluyendo escaneos de TAC, para evaluar el crecimiento óseo y la cicatrización de fracturas. También puede evaluarse la resistencia mecánica del hueso.

Pueden generarse variantes derivadas combinatorialmente que presentan una potencia selectiva o generalmente incrementada respecto a un polipéptido ActRIIa natural. De manera similar, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que presentan semividas intracelulares drásticamente diferentes de las de un polipéptido ActRIIa de tipo salvaje correspondiente. Por ejemplo, la proteína alterada puede convertirse en más estable o menos estable frente a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que resultan en la destrucción o, de otro modo, en la inactivación de un polipéptido ActRIIa nativo. Dichas variantes, y los genes que las codifican, pueden utilizarse para alterar los niveles de polipéptido ActRIIa mediante la modulación de la semivida de los polipéptidos ActRIIa. Por ejemplo, una corta semivida puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y puede permitir un control más estrecho de los niveles de polipéptido ActRIIa recombinante en el paciente. En una proteína de fusión de Fc, pueden introducirse mutaciones en el conector (en caso de existir) y/o en la parte Fc a fin de alterar la semivida de la proteína.

Puede producirse una biblioteca combinatorial mediante una biblioteca degenerada de genes codificantes de una biblioteca de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye por lo menos una parte de secuencias potenciales de polipéptido ActRIIa. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ligarse enzimáticamente en secuencias génicas de manera que el grupo degenerado de secuencias potenciales de nucleótidos del polipéptido ActRIIa sean expresables como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un grupo de proteínas de fusión más grandes (p.ej., para la expresión fágica).

Existen muchas maneras mediante las que puede generarse la biblioteca de homólogos potenciales a partir de una secuencia oligonucleótida degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador de ADN automático y seguidamente los genes sintéticos pueden ligarse en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es bien conocida de la técnica (ver, por ejemplo, Narang, SA, Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier, páginas 273 a 289, 1981; Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura et al., Science 198:1056, 1984; Ike et al., Nucleic Acid Res. 11:477, 1983). Dichas técnicas se han utilizado en la evolución dirigida de otras proteínas (ver, por ejemplo, Scott et al., Science 249:386-390, 1990; Roberts et al., PNAS USA 89:2429-2433, 1992; Devlin et al., Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., PNAS USA 87: 6378 6382, 1990, así como las patentes US n° 5.223.409, n° 5.198.346 y n° 5.096.815).

Alternativamente, pueden utilizarse otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatorial. Por ejemplo, pueden generarse variantes del polipéptido ActRIIa y aislarse a partir de una biblioteca mediante cribado utilizando, por ejemplo, la mutagénesis por escaneo de alaninas y similares (Ruf et al., Biochemistry 33:1565-1572, 1994; Wang et al., J. Biol. Chem. 269:3095-3099, 1994; Balint et al., Gene 137:109-118, 1993; Grodberg et al., Eur. J. Biochem. 218:597-601, 1993; Nagashima et al., J. Biol. Chem. 268:2888-2892, 1993; Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838, 1991 y Cunningham et al., Science 244:1081-1085, 1989), mutagénesis por escaneo de conectores (Gustin et al., Virology 193:653-660, 1993; Brown et al., Mol. Cell Biol. 12:2644-2652, 1992; McKnight et al., Science 232:316, 1982); mediante mutagénesis por saturación (Meyers et al., Science 232:613, 1986); mediante mutagénesis de PCR (Leung et al., Method Cell Mol. Biol. 1:11-19, 1989); o mediante mutagénesis aleatoria, incluyendo la mutagénesis química, etc. (Miller et al., A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1992 y Greener et al., Strategies in Mol Biol 7:32-34, 1994). La mutagénesis de escaneo de conectores, particularmente en un contexto combinatorial, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de los polipéptidos ActRIIa.

Se conoce de la técnica un amplio abanico de técnicas para el cribado de productos génicos de bibliotecas combinatoriales generadas mediante mutaciones puntuales y truncados, y de hecho, para el cribado de bibliotecas de ADNc para productos génicos que presentan una determinada propiedad. Dichas técnicas generalmente son adaptables al cribado rápido de las bibliotecas génicas generadas mediante la mutagénesis combinatorial de polipéptidos ActRIIa. Las técnicas más ampliamente utilizadas para el cribado de bibliotecas génicas grandes típicamente comprenden la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformando las células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores y expresando los genes combinatoriales bajo condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente sencillo del vector codificante del gen cuyo producto se ha detectado. Entre los ensayos preferentes se incluyen ensayos de unión de activina y ensayos de señalización celular mediada por activina.

Los polipéptidos ActRIIa dados a conocer en la presente memoria pueden comprender además modificaciones posttraduccionales además de cualesquiera naturalmente presentes en los polipéptidos ActRIIa. Entre dichas modificaciones se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los polipéptidos ActRIIa modificados pueden contener elementos no aminoácido, tales como polietilenglicoles, lípidos, polisacáridos o monosacáridos, y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no aminoácido sobre la funcionalidad de un polipéptido ActRIIa pueden someterse a ensayo tal como se indica en la presente memoria para otras variantes de polipéptido ActRIIa. Al producir un polipéptido ActRIIa en células mediante la escisión de una forma naciente del polipéptido ActRIIa, el procesamiento post-traduccional también puede resultar importante para el pliegue y/o función correctos de la proteína. Diferentes células (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) presentan maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades post-traduccionales y pueden seleccionarse para garantizar la modificación y procesamiento correctos de los polipéptidos ActRIIa.

Entre las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos ActRIIa pueden incluirse proteínas de fusión que presentan por lo menos una parte de los polipéptidos ActRIIa y uno o más dominios de fusión. Entre los ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, polihistidina, Glu-Glu, glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada (Fc) de inmunoglobulina, proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina de suero humano. Un dominio de fusión puede seleccionarse de manera que proporcione una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión resultan particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Para el propósito de la purificación por afinidad, se utilizan matrices relevantes para cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa, níquel o cobalto. Muchas de dichas matrices se encuentran disponibles en forma de "kit", tales como el sistema de purificación GST de Pharmacia y el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útiles con parejas de fusión de (HIS6). A título de otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusión de manera que facilite la detección de los polipéptidos ActRIIa. Entre los ejemplos de dichos dominios de detección se incluyen las diversas proteínas fluorescentes (p.ej., GFP), así como "etiquetas epítopo", que habitualmente son secuencias peptídicas cortas para las que se encuentra disponible un anticuerpo específico. Entre las etiquetas epítopo bien conocidas para las que se encuentran fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales específicos se incluyen las etiquetas f La G, hemaglutinina de virus influenza (HA) y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión presentan un sitio de corte de proteasa, tal como para el factor Xa o la trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y de esta manera libere las proteínas recombinantes de las mismas. A continuación, pueden aislarse las proteínas liberadas respecto del dominio de fusión mediante la posterior separación cromatográfica. Un polipéptido ActRIIa puede fusionarse con un dominio que estabiliza el polipéptido ActRIIa in vivo (un dominio "estabilizador"). El término "estabilizador" se refiere a cualquier cosa que incrementa la semivida en suero, con independencia de si ello se debe a una menor destrucción, un lavado reducido por el riñón u otro efecto farmacocinético. Las fusiones con la parte Fc de una inmunoglobulina es conocido que proporcionan propiedades farmacocinéticas deseables a un amplio abanico de proteínas. De manera similar, las fusiones con albúmina sérica humana pueden proporcionar propiedades deseables. Entre otros tipos de dominios de fusión que pueden seleccionarse se incluyen dominios multimerizantes (p.ej., dimerizantes, tetramerizantes) y dominios funcionales (que proporcionan una función biológica adicional, tal como la estimulación adicional del crecimiento óseo o el crecimiento muscular, según se desee).

A título de ejemplo específico, una proteína de fusión comprende un dominio extracelular soluble de ActRIIa fusionado con un dominio Fc (p.ej., SEC ID n° 6).

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKAL

PVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN

GQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYT

QKSLSLSPGK*

Opcionalmente, el dominio Fc presenta una o más mutaciones en residuos tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En determinados casos, el dominio Fc mutante que presenta una o más de dichas mutaciones (p.ej., la mutación de Asp-265), presenta una capacidad reducida de unión al receptor de Fcy respecto a un dominio Fc de tipo salvaje. En otros casos, el dominio Fc mutante que presenta uno o más de dichas mutaciones (p.ej., la mutación de Asn-434) presenta una capacidad incrementada de unión al receptor de Fc relacionado con el CMH de clase I (FcRN) comparado con un dominio Fc de tipo salvaje.

Se entiende que pueden disponerse diferentes elementos de las proteínas de fusión de cualquier manera que resulte consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIa puede situarse en el lado C-terminal de un dominio heterólogo, o alternativamente, un dominio heterólogo puede situarse en el lado C-terminal de un polipéptido ActRIIa. El dominio polipeptídico ActRIIa y el dominio heterólogo no necesitan ser contiguos en una proteína de fusión, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoácidos adicionales en el lado C-terminal o N-terminal respecto a cualquiera de los dominios o entre los dominios.

En determinados casos, los polipéptidos ActRIIa contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos ActRIIa. Por ejemplo, dichas modificaciones potencian la semivida in vitro de los polipéptidos ActRIIa, potencian la semivida circulatoria de los polipéptidos ActRIIa o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos ActRIIa. Entre dichas modificaciones estabilizadoras se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido ActRIIa y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glucosilación a un polipéptido ActRIIa) y modificaciones de la fracción carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de las fracciones carbohidrato de un polipéptido ActRIIa). En el caso de las proteínas de fusión, un polipéptido ActRIIa se fusiona con un dominio estabilizador, tal como una molécula IgG (p.ej., un dominio Fc). Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "dominio estabilizador" no sólo se refiere a un dominio de fusión (p.ej., Fc), tal como en el caso de proteínas de fusión, sino que incluye además modificaciones no proteicas, tales como una fracción carbohidrato o un polímero no proteico, tal como polietilenglicol.

La presente exposición pone a disposición formas aisladas y/o purificadas de los polipéptidos ActRIIa, que se aíslan a partir de otras proteínas, o de otro modo, se encuentran sustancialmente libres de otras proteínas. Los polipéptidos ActRIIa generalmente se producen mediante expresión a partir de ácidos nucleicos recombinantes.

3. Ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos ActRIIa

En la presente memoria se dan a conocer ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes codificantes de cualquiera de los polipéptidos ActRIIa (p.ej., polipéptidos ActRIIa solubles), incluyendo fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión dadas a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, la SEC ID n° 4 codifica el polipéptido precursor de ActRIIa humana natural, mientras que la SEC ID n° 5 codifica el dominio extracelular procesado de ActRIIa. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Dichos ácidos nucleicos pueden utilizarse, por ejemplo, en métodos para preparar polipéptidos ActRIIa o como agentes terapéuticos directos (p.ej., en un enfoque de terapia génica).

Se entiende que los ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos ActRIIa incluyen ácidos nucleicos que son variantes de SEC ID n° 4 o n° 5. Entre las secuencias de nucleótidos variantes se incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas.

En la presente memoria se dan a conocer secuencias de ácidos nucleicos aisladas o recombinantes que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a la SEC ID n° 4 o n° 5. El experto ordinario en la materia apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos complementarias a la SEC ID n° 4 o n° 5, y las variantes de SEC ID n° 4 o n° 5 también se dan a conocer. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser aisladas, recombinantes y/o fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.

Entre los ácidos nucleicos dados a conocer en la presente memoria se incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones altamente restrictivas con la secuencia de nucleótidos designada en SEC ID n° 4 o n° 5, secuencia complementaria de la SEC ID n° 4 o n° 5, o fragmentos de la misma. Tal como se ha comentado anteriormente, el experto ordinario en la materia entenderá fácilmente que pueden modificarse las condiciones de astringencia apropiadas que fomentan la hibridación del ADN. El experto ordinario en la materia entenderá fácilmente que pueden modificarse las condiciones de astringencia apropiadas que fomentan la hibridación del ADN. Por ejemplo, podría llevarse a cabo la hibridación a 6,0x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de 2,0xSSC a 50°C. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de entre una astringencia baja de aproximadamente 2,0xSSC a 50°C y una astringencia elevada de aproximadamente 0,2xSSC a 50°C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede incrementarse de condiciones de baja astringencia a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta astringencia a aproximadamente 65°C. Puede modificarse tanto la temperatura como la condición salina, o la temperatura o la concentración salina puede mantenerse constante mientras que se modifica la otra variable. En la presente memoria se dan a conocer ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones de baja astringencia de 6xSSC a temperatura ambiente seguido de un lavado a 2xSSC a temperatura ambiente.

Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos indicados en la SEC ID n° 4 o n° 5 debido a la degeneración del código genético también se dan a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, varios aminoácidos están designados por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para la histidina) pueden resultar en mutaciones "silenciosas", que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de la secuencia de ADN que no conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención existan en las células de mamífero. El experto en la materia apreciará que dichas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos codificantes de una proteína particular pueden existir en individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Todos y cada una de dichas variaciones de nucleótidos, y polimorfismos de aminoácidos resultantes, se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente exposición.

Los ácidos nucleicos recombinantes dados a conocer en la presente memoria pueden ligarse operablemente con una o más secuencias de nucleótidos reguladores en un constructo de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladores generalmente resultarán apropiadas para la célula huésped utilizada para la expresión. Se conocen de la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. Típicamente, entre dicha secuencia o secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellas, secuencias de promotor, secuencias-líder o de señal, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias de potenciador o activador. Se dan a conocer en la presente memoria promotores constitutivos o inducibles conocidos de la técnica. Los promotores pueden ser promotores naturales o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Puede encontrarse presente un constructo de expresión en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o puede insertarse el constructo de expresión en un cromosoma. El vector de expresión puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la selección de las células huésped transformadas. Los genes marcadores seleccionables son bien conocidos de la técnica y varían según la célula huésped utilizada.

El ácido nucleico de la invención puede proporcionarse en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un polipéptido ActRIIa y operablemente ligada a por lo menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras han sido reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido ActRIIa. De acuerdo con lo anterior, la expresión secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Se describen secuencias reguladoras ejemplares en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Por ejemplo, puede utilizarse en dichos vectores cualquiera de entre una amplia diversidad de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN en el caso de que se encuentren operablemente ligadas a la misma, para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRIIa. Entre las secuencias de control de la expresión útiles se incluyen, por ejemplo, promotores temprano y tardío de SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, promotores del VSR, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TrC, el promotor de T7 cuya expresión está dirigida por la ARN polimerasa de T7, las regiones de operador y promotor mayores del fago lambda, las regiones de control de la proteína de cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otros enzimas glucolíticos, los promotores de la fosfatasa ácida, p.ej., Pho5, los promotores de los factores a de apareamiento de levaduras, el promotor poliédrico del sistema baculovírico y otras secuencias que es conocido que controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de célula huésped que debe transformarse y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, el número de copia del vector, la capacidad de control el número de copia y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores antibióticos, también deberían considerarse.

Puede producirse un ácido nucleico recombinante dado a conocer en la presente memoria mediante ligación del gen clonado, o una parte del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procarióticas, células eucarióticas (de levadura, de ave, de insecto o de mamífero) o ambas. Entre los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ActRIIa recombinante se incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, entre los vectores adecuados se incluyen plásmidos de los tipos siguientes: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procarióticas, tales como E. coli.

Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción eucarióticos que se expresan en células eucarióticas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucarióticas. Algunos de dichos vectores se modifican con secuencias procedentes de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección de resistencia a fármacos tanto en células procarióticas como eucarióticas. Alternativamente, pueden utilizarse derivados de virus, tales como el virus del papiloma bovino (VPB-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) puede utilizarse para la expresión transitoria de proteínas en células eucarióticas. Pueden encontrarse ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (incluyendo retrovíricos) posteriormente en la descripción de sistemas de administración de terapia génica. Los diversos métodos utilizados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos huésped son bien conocidos de la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procarióticas como eucarióticas, así como procedimientos generales de recombinación, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, puede resultar deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante la utilización de un sistema de expresión baculovírico. Entre los ejemplos de dichos sistemas de expresión baculovírica se incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene p-gal).

Puede diseñarse un vector para la producción de los polipéptidos ActRIIa de la invención en células CHO, tales como un vector pCMV-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Tal como resultará evidente, los constructos génicos de la invención pueden utilizarse para causar la expresión de los polipéptidos ActRIIa de la invención en células propagadas en cultivo, p.ej., para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para la purificación.

La presente exposición se refiere además a una célula huésped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante (p.ej., SEC ID n° 4 o n° 5) para uno o más de los polipéptidos ActRIIa de la invención. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, puede expresarse un polipéptido ActRIIa dado a conocer en la presente memoria en células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (p.ej., utilizando un sistema de expresión baculovírico), levadura o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas por el experto en la materia.

En la presente memoria se dan a conocer métodos de producción de los polipéptidos ActRIIa de la invención. Por ejemplo, puede cultivarse una célula huésped transfectada con un vector de expresión codificante de un polipéptido ActRIIa bajo condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido ActRIIa. El polipéptido ActRIIa puede secretarse y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido ActRIIa. Alternativamente, el polipéptido ActRIIa puede retenerse citoplasmáticamente o en una fracción membranal y recolectarse las células, lisarlas y aislar la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medio y otros productos secundarios. Los medios adecuados para el cultivo celular son bien conocidos de la técnica. Los polipéptidos ActRIIa de la invención pueden aislarse a partir de medio de cultivo celular, células huésped o ambos, utilizando técnicas conocidas para la purificación de proteínas, incluyendo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, la ultrafiltración, la electroforesis, la purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos ActRIIa y la purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado con el polipéptido ActRIIa (p.ej., puede utilizarse una columna de proteína A para purificar una fusión ActRIIa-Fc). El polipéptido ActRIIa puede ser una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. La purificación puede llevarse a cabo mediante una serie de etapas de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaños y la cromatografía de intercambio catiónico. La purificación pudo completarse mediante filtración vírica e intercambio de tampones. Tal como se demuestra en la presente memoria, la proteína ActRIIa-Fc_h se purificó hasta una pureza >98% según determinación mediante cromatografía de exclusión por tamaños y >95% según se determinó mediante SDS-PAGE. Dicho nivel de pureza resultó suficiente para conseguir efectos deseables sobre los huesos en ratones y un perfil de seguridad aceptable en ratones, ratas y primates no humanos.

Un gen de fusión codificante de una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de sitio de corte de poli-(His)/enteroquinasa en el extremo N-terminal de la parte deseada del polipéptido ActRIIa recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de metal Ni2+ A continuación, la secuencia líder de purificación puede eliminarse mediante tratamiento con enteroquinasa para proporcionar el polipéptido ActRIIa purificado (p.ej., ver Hochuli et al., J. Chromatography 411:177, 1987 y Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).

Las técnicas para producir genes de fusión son bien conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN codificantes de diferentes secuencias polipeptídicas se lleva a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, utilizando extremos romos o cohesivos, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según resulte apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable, y la ligación enzimática. El gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales, incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede llevarse a cabo utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a extremos protuberantes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse para generar una secuencia génica quimérica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

4. Antagonistas alternativos de activina y ActRIIa

Los datos presentados en la presente memoria demuestran que pueden utilizarse antagonistas de la señalización de activina-ActRIIa para estimular el crecimiento óseo y la mineralización ósea. Aunque los polipéptidos ActRIIa solubles, y particularmente ActRIIa-Fc, son antagonistas preferentes, y aunque dichos antagonistas pueden afectar al hueso mediante un mecanismo diferente del antagonismo de activina (p.ej., la inhibición de la activina puede ser un indicador de la tendencia de un agente a inhibir las actividades de un espectro de moléculas, incluyendo, quizá, otros elementos de la superfamilia de TGF-beta, y dicha inhibición colectiva puede conducir al efecto deseado sobre el hueso), se espera que otros tipos de antagonistas de activina-ActRIIa resulten útiles, incluyendo anticuerpos anti-activina (p.ej., A, B, C o E), anticuerpos anti-ActRIIa, ácidos nucleicos antisentido, ARNi o ribozimas que inhiben la producción de ActRIIa y otros inhibidores de activina o ActRIIa, particularmente los que interrumpen la unión de la activina-ActRIIa.

Un anticuerpo que es específicamente reactivo con un polipéptido ActRIIa (p.ej., un polipéptido ActRIIa soluble) y que se une competitivamente con un ligando al polipéptido ActRIIa o que de otro modo inhibe la señalización mediada por ActRIIa, puede utilizarse como un antagonista de las actividades del polipéptido ActRIIa. De manera similar, un anticuerpo que es específicamente reactivo con un polipéptido activina A y que interrumpe la unión de ActRIIa puede utilizarse como antagonista.

Mediante la utilización de inmunógenos derivados de un polipéptido ActRIIa o un polipéptido activina, pueden prepararse antisueros anti-proteína/anti-péptido o anticuerpos monoclonales mediante protocolos estándares (ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo, puede inmunizarse con una forma inmunogénica del polipéptido ActRIIa, un fragmento antigénico que es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos, o una proteína de fusión. Entre las técnicas para proporcionar inmunogenicidad a una proteína o péptido se incluyen la conjugación con portadores u otras técnicas bien conocidas. Puede administrarse una parte inmunogénica de un polipéptido ActRIIa o activina en presencia de adyuvante. El avance de la inmunización puede monitorizarse mediante la detección de los títulos de anticuerpo en el plasma o suero. Pueden utilizarse ELISA estándares u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno a fin de evaluar los niveles de anticuerpos.

Tras la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido ActRIIa, pueden obtenerse antisueros y, si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales a partir del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recolectarse células productoras de anticuerpos (linfocitos) a partir de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos estándares de fusión de células somáticas con células inmortalizantes, tales como células de mieloma, rindiendo células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma (originalmente desarrollada por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., Immunology Today, 4: 72, 1983), y la técnica del hibridoma del VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas 77 a 96, 1985). Las células de hibridoma pueden cribarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido ActRIIa y anticuerpos monoclonales aislados a partir de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir fragmentos del mismo que también son específicamente reactivos con un polipéptido de la invención. Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas convencionales y los fragmentos pueden cribarse para la utilidad de la manera indicada anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)²mediante el tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)²resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo dado a conocer en la presente memoria pretende además incluir moléculas biespecíficas, monocatenarias, quiméricas, humanizadas y totalmente humanas con afinidad para un polipéptido ActRIIa o activina proporcionada por como mínimo una región CDR del anticuerpo. Un anticuerpo puede comprender además una etiqueta unida al mismo y capaz de ser detectada (p.ej., el marcaje puede ser un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un enzima o un cofactor enzimático).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo recombinante, en el que el término comprende cualquier anticuerpo generado en parte mediante técnicas de biología molecular, incluyendo anticuerpos con injertación de CDR o quiméricos, anticuerpos humanos u otros ensamblados a partir de dominios de anticuerpo de biblioteca seleccionada, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de dominio único (p.ej., proteínas Vh humanas o proteínas Vhh de camélido). Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, y la exposición pone a disposición métodos para generar nuevos anticuerpos. Por ejemplo, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido ActRIIa o a un polipéptido activina puede comprender la administración en un ratón de una cantidad de una composición inmunogénica que comprende el polipéptido antígeno eficaz para estimular una respuesta inmunitaria detectable, obtener células productoras de anticuerpos (p.ej., células del bazo) procedentes del ratón y fusionar las células productoras de anticuerpos con células de mieloma para obtener hibridomas productores de anticuerpos, y someter a ensayo los hibridomas productores de anticuerpos para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno. Una vez obtenido, el hibridoma puede propagarse en un cultivo celular, opcionalmente bajo condiciones de cultivo en las que las células derivadas del hibridoma producen el anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno. El anticuerpo monoclonal puede purificarse a partir del cultivo celular.

El adjetivo "específicamente reactivo con" tal como se utiliza en referencia a un anticuerpo pretende referirse, tal como se entiende generalmente en la técnica, a que el anticuerpo es suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (p.ej., un polipéptido ActRIIa) y otros antígenos que no son de interés, para que el anticuerpo resulte útil para, como mínimo, detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En determinados métodos que utilizan el anticuerpo, tales como aplicaciones terapéuticas, puede resultar deseable un grado más elevado de especificidad de unión. Los anticuerpos monoclonales generalmente presentan una mayor tendencia (en comparación con los anticuerpos policlonales) a discriminar eficazmente entre los antígenos deseados y polipéptidos de reacción cruzada. Una característica que influye sobre la especificidad de una interacción de anticuerpo:antígeno es la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Aunque puede alcanzarse la especificidad deseada con un rango de diferentes afinidades, los anticuerpos generalmente preferentes presentarán una afinidad (una constante de disociación) de aproximadamente 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 o inferior. Dada la unión extraordinariamente fuerte entre la activina y ActRIIa, se espera que un anticuerpo anti-activina o anti-ActRIIa neutralizante generalmente presentará una constante de disociación de 10-10 o inferior.

Además, las técnicas utilizadas para cribar anticuerpos a fin de identificar un anticuerpo deseable pueden influir sobre las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, en el caso de que se deba utilizar un anticuerpo para la unión del antígeno en solución, puede resultar deseable someter a ensayo la unión en solución. Se encuentra disponible una diversidad de diferentes técnicas para someter a ensayo la interacción entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Entre dichas técnicas se incluyen los ELISA, los ensayos de unión de resonancia del plasmón superficial (p.ej., el ensayo de unión Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Suecia), los ensayos de tipo sándwich (p.ej., el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), las transferencias Western, los ensayos de inmunoprecipitación y la inmunohistoquímica.

Entre los ejemplos de categorías de compuestos de ácidos nucleicos que son antagonistas de activina o ActRIIa se incluyen los ácidos nucleicos antisentido, los constructos de ARNi y los constructos de ácidos nucleicos catalíticos. Un compuesto de ácidos nucleicos puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Un compuesto de doble cadena puede incluir además regiones protuberantes o no complementariedad, en las que una u otra cadena es de cadena sencilla. Un compuesto de cadena sencilla puede incluir regiones de autocomplementariedad, es decir, el compuesto forma una denominada "horquilla" o estructura de "tallo-bucle", con una región de estructura de doble hélice. Un compuesto de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región que consiste en no más de 1.000, no más de 500, no más de 250, no más de 100 o no más de 50, 35, 30, 25, 22, 20 o 18 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de la ActRIIa de longitud completa o de la secuencia de ácidos nucleicos de la activina pA o activina pB. La región de complementariedad preferentemente es de por lo menos 8 nucleótidos, y opcionalmente de por lo menos 10 o por lo menos 15 nucleótidos, y opcionalmente de entre 15 y 25 nucleótidos. Una región de complementariedad puede encontrarse dentro de un intrón, una secuencia codificante o una secuencia no codificante del transcrito-diana, tal como la parte de secuencia codificante. Generalmente, un compuesto de ácidos nucleicos presentará una longitud de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 500 nucleótidos o pares de bases, y opcionalmente la longitud será de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 50 nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser un ADN (particularmente para la utilización como molécula antisentido), un ARN o un híbrido de ARN:ADN. Cualquier cadena puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no pueden clasificarse fácilmente como ADN o ARN. De manera similar, un compuesto de doble cadena puede ser ADN:ADn, ADN:ARN o ARN:ARN, y cualquier cadena puede incluir además una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no pueden clasificarse fácilmente como ADN o ARN. Un compuesto de ácidos nucleicos puede incluir cualquiera de entre una diversidad de modificaciones, incluyendo una o más modificaciones del esqueleto (la parte de azúcar-fosfato en un ácido nucleico natural, incluyendo los enlaces internucleotídicos) o la parte de bases (la parte de purinas o pirimidinas de un ácido nucleico natural). Un compuesto de ácidos nucleicos antisentido preferentemente presentará una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos y con frecuencia contendrá una o más modificaciones para mejorar características tales como la estabilidad en el suero, en una célula o en un sitio en el que es probable que se administre el compuesto, tal como el estómago en el caso de compuestos administrados por vía oral y los pulmones, para compuestos inhalados. En el caso de un constructo de ARNi, la cadena complementaria al transcrito-diana generalmente será de ARN o modificaciones del mismo. La otra cadena puede ser de ARN, ADN o cualquier otra variación. La parte de dúplex del constructo de ARNi (horquilla) de doble cadena o de cadena sencilla preferentemente presentará una longitud de entre 18 y 40 nucleótidos y opcionalmente una longitud de entre aproximadamente 21 y 23 nucleótidos, con la condición de que sirva de sustrato Dicer. Los ácidos nucleicos catalíticos o enzimáticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y pueden contener además formas modificadas. Los compuestos de ácidos nucleicos pueden inhibir la expresión de la diana en aproximadamente 50%, 75%, 90% o más al ponerla en contacto con células bajo condiciones fisiológicas y a una concentración en la que una molécula de control sin sentido o de sentido presente poco o ningún efecto. Las concentraciones preferentes para someter a ensayo el efecto de los compuestos de ácidos nucleicos son 1, 5 y 10 micromolar. Los compuestos de ácidos nucleicos también pueden someterse a ensayo para efectos sobre, por ejemplo, el crecimiento y mineralización óseos.

5. Ensayos de cribado

La presente invención se refiere a un método para identificar un agente que estimula el crecimiento óseo e incrementa la densidad ósea, en el que el método comprende: a) identificar un agente que se une a un dominio de unión a ligando de un polipéptido ActRIIa competitivamente con una activina, en la que el polipéptido ActRIIa comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID n° 3 y b) evaluar el efecto del agente sobre el tejido óseo, en el que el extremo N-terminal del polipéptido ActRIIa es ILGRSETQE. Pueden utilizarse polipéptidos ActRIIa (p.ej., polipéptidos ActRIIa solubles) y polipéptidos activina para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de la ruta de señalización de activina-ActRIIa. Los compuestos identificados mediante dicho cribado pueden someterse a ensayo para evaluar su capacidad de modular el crecimiento o mineralización óseo in vitro. Opcionalmente, dichos compuestos pueden someterse a ensayo adicionalmente en modelos animales para evaluar su capacidad de modular el crecimiento de los tejidos in vivo.

Existen numerosos enfoques de cribado para agentes terapéuticos que modulan el crecimiento de los tejidos utilizando como diana los polipéptidos activina y ActRIIa. El cribado de alto rendimiento de compuestos puede llevarse a cabo para identificar agentes que perturban los efectos mediados por activina o ActRIIa sobre el hueso. El ensayo puede llevarse a cabo para cribar e identificar los compuestos que específicamente inhiben o reducen la unión de un polipéptido ActRIIa a la activina. Alternativamente, el ensayo puede utilizarse para identificar compuestos que potencian la unión de un polipéptido ActRIIa a la activina. Los compuestos pueden identificarse por su capacidad de interactuar con un polipéptido activina o ActRIIa.

Resulta suficiente una diversidad de formatos de ensayo y, a la luz de la presente exposición, los no indicados expresamente en la presente memoria sin embargo resultarán comprendidos por el experto ordinario en la materia. Tal como se indica en la presente memoria, los compuestos de ensayo (agentes) pueden crearse mediante cualquier método químico combinatorial. Alternativamente, los compuestos de la invención pueden ser biomoléculas naturales sintetizadas in vivo o in vitro. Los compuestos (agentes) que deben someterse a ensayo para su capacidad de actuar como moduladores del crecimiento de los tejidos pueden ser producidos por, por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (p.ej., productos naturales), producirse químicamente (p.ej., moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos) o producirse recombinantemente. Entre los compuestos de ensayo contemplados en la presente invención se incluyen moléculas orgánicas no peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácidos nucleicos. El agente de ensayo puede ser una molécula orgánica pequeña con un peso molecular inferior a aproximadamente 2.000 daltons.

Los compuestos de ensayo pueden proporcionarse en forma de entidades discretas individuales, o proporcionarse en bibliotecas de mayor complejidad, tal como se generan mediante química combinatorial. Dichas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de compuestos de ensayo al sistema de ensayo puede llevarse a cabo en una forma aislada o en forma de mezclas de compuestos, especialmente en las etapas iniciales de cribado. Opcionalmente, los compuestos pueden derivatizarse opcionalmente con otros compuestos y presentan grupos derivatizantes que facilitan el aislamiento de los compuestos. Entre los ejemplos no limitativos de grupos derivatizantes se incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, perlas magnéticas, glutatión-S-transferasa (GST), entrecruzantes fotoactivables o cualesquiera combinaciones de los mismos.

En muchos programas de cribado farmacológico que someten a ensayo bibliotecas de compuestos y extractos naturales, resultan deseables los ensayos de alto rendimiento a fin de maximizar el número de compuestos estudiados en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se llevan a cabo en sistemas libres de células, tales como los que pueden derivarse con proteínas purificadas o semipurificadas, con frecuencia resultan preferentes como cribados "primarios" en el aspecto de que pueden generarse para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de ensayo. Además, los efectos de toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de ensayo generalmente pueden ignorarse en el sistema in vitro, estando centrado el ensayo principalmente sobre el efecto del fármaco sobre la diana molecular, tal como se pone de manifiesto en una alteración de la afinidad de unión entre el polipéptido ActRIIa y la activina.

A título meramente ilustrativo, en un ensayo de cribado ejemplar, el compuesto de interés se pone en contacto con un polipéptido ActRIIa aislado y purificado que ordinariamente es capaz de unión a la activina. A la mezcla del compuesto y el polipéptido ActRIIa a continuación se añade una composición que contiene un ligando de ActRIia. La detección y cuantificación de los complejos de ActRIIa/activina proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto en la inhibición (o potenciación) de la formación de complejo entre el polipéptido ActRIIa y la activina. La eficacia del compuesto puede evaluarse mediante la generación de curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos utilizando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Además, también puede llevarse a cabo un ensayo de control para proporcionar una línea base para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de contorl, se añade activina aislada y purificada a una composición que contiene el polipéptido ActRIIa, y se cuantifica la formación de complejo de ActRIIa/activina en ausencia del compuesto de ensayo. Se entenderá que, en general, el orden en que se pueden mezclar los reactivos puede variar, y pueden mezclarse simultáneamente. Además, en lugar de proteínas purificadas, pueden utilizarse extractos celulares y lisados para obtener un sistema de ensayo libre de células adecuado.

La formación de complejo entre el polipéptido ActRIIa y la activina puede detectarse mediante una diversidad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos puede cuantificarse utilizando, por ejemplo, proteínas marcadas detectablemente, tales como polipéptido ActRIIa o activina marcado radioactivamente (p.ej., 32P, 35S, 14C o 3H), marcado fluorescentemente (p.ej., FITC) o marcado enzimáticamente), mediante inmunoensayo o mediante detección cromatográfica.

La presente invención contempla la utilización de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) en la medición, directa o indirecta, del grado de interacción entre un polipéptido ActRIIa y su proteína de unión. Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de ondas ópticas (publicación de patente PCT n° WO 96/26432 y patente US n° 5.677.196), resonancia del plasmón superficial (SPR), sensores de carga superficial y sensores de fuerza superficial son compatibles con muchas realizaciones de la invención.

Además, la presente invención contempla la utilización de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como el "ensayo de dos híbridos", para identificar agentes que interrumpen o potencian la interacción entre un polipéptido ActRIIa y su proteína de unión. Ver, por ejemplo, la patente US n° 5.283.317; Zervos et al. Cell 72:223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 268:12046-12054, 1993; Bartel et al., Biotechniques 14:920-924, 1993 y Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696, 1993). En una realización específica, la presente invención contempla la utilización de sistemas de doble híbrido inverso para identificar compuestos (p.ej., moléculas pequeñas o péptidos) que disocian las interaciones entre un polipéptido ActRIIa y su proteína de unión. Ver, por ejemplo, Vidal y Legrain, Nucleic Acids Res 27:919-29, 1999; Vidal y Legrain, Trends Biotechnol 17:374-81, 1999 y patente US n° 5.525.490, n° 5.955.280 y n° 5.965.368.

Los compuestos de la invención pueden identificarse mediante su capacidad de interactuar con un polipéptido activina o ActRIIa. La interacción entre el compuesto y el polipéptido ActRIIa o activina puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interacción puede identificarse al nivel de las proteínas utilizando métodos bioquímicos in vitro, incluyendo el fotoentrecruzamiento, la unión de ligandos marcados radioactivamente y la cromatografía de afinidad (Jakoby WB et al., Methods in Enzymology 46: 1, 1974). En determinados casos, los compuestos pueden cribarse en un ensayo basado en el mecanismo, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un polipéptido de activina o ActRIIa. Lo anterior puede incluir un suceso de unión en fase sólida o en fase fluida. Alternativamente, el gen codificante de un polipéptido activina o ActRIIa puede transfectarse con un sistema informador (p.ej., pgalactosidasa, luciferasa o proteína fluorescente verde) en una célula y cribarse frente a la biblioteca, preferentemente mediante un cribado de alto rendimiento o con elementos individuales de la biblioteca. Pueden utilizarse otros ensayos de unión basados en el mecanismo, por ejemplo ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión pueden llevarse a cabo con la diana fija en un pocillo, perla o chip o capturarla mediante un anticuerpo inmovilizado o resolverla mediante electroforesis capilar. Los compuestos unidos pueden detectarse habitualmente utilizando colorimetría, fluorescencia, o resonancia del plasmón superficial.

En la presente memoria se dan a conocer métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) la formación de hueso e incrementar la masa ósea. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado puede someterse a ensayo en células o tejidos completos, in vitro o in vivo, para confirmar su capacidad de modular el crecimiento o mineralización óseo. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos de la técnica para este fin.

Por ejemplo, el efecto del polipéptido ActRIIa o activina o los compuestos de ensayo sobre el crecimiento del hueso o cartílago puede determinarse mediante medición de la inducción de Msx2 o la diferenciación de las células osteoprogenitoras en ensayos celulares (ver, p.ej., Daluiski et al., Nat Genet. 27(1):84-8, 2001; Hino et al., Front Biosci.

9:1520-9, 2004). Otro ejemplo de ensayos celulares incluye el análisis de la actividad osteogénica de los polipéptidos ActRIIa o activina de la invención y compuestos de ensayo en células progenitoras mesenquimales y células osteoblásticas. A título ilustrativo, pueden construirse adenovirus recombinantes que expresan un polipéptido activina o ActRIIa para infectar células CH3H10T1/2 progenitoras mesenquimales pluripotentes, células C2C12 preosteoblásticas y células TE-85 osteoblásticas. A continuación, la actividad osteogénica se determina mediante medición de la inducción de la fosfatasa alcalina, osteocalcina y mineralización de la matriz (ver, p.ej., Cheng et al., J. Bone Joint Surg. Am. 85-A(8):1544-52, 2003).

La presente exposición contempla además ensayos in vivo para medir el crecimiento de hueso o cartílago. Por ejemplo, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86, 2001, da a conocer un modelo osteoporótico de rata en el que se estudió la reparación ósea durante el periodo temprano posterior a la fractura. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202, 1999 da a conocer además un modelo osteoporótico de rata en el que se estudió la reparación ósea durante el periodo tardío posterior a la fractura. Andersson et al., J. Endocrinol. 170:529-537 describen un modelo de osteoporosis en el ratón en el que se ovariectomizaron ratones, que causa que los ratones pierdan un contenido mineral óseo y densidad mineral ósea sustanciales, perdiendo el hueso trabecular aproximadamente 50% de la densidad mineral ósea. La densidad ósea podría incrementarse en los ratones ovariectomizados mediante la administración de factores tales como la hormona paratiroidea. Pueden utilizarse ensayos de cicatrización de fracturas que son conocidos de la técnica. Entre estos ensayos se incluyen la técnica de fractura, el análisis histológico y el análisis biomecánico, que se describen en, por ejemplo, la patente US n° 6.521.750, que da a conocer protocolos experimentales para causar, además de para medir, la extensión de las fracturas y el proceso de reparación.

6. Usos terapéuticos ejemplares

Pueden utilizarse antagonistas de activina-ActRIIa (p.ej., polipéptidos ActRIIa) para tratar o prevenir una enfermedad o condición que está asociada al daño óseo, sea, p.ej., por fractura, por pérdida o por desmineralización. En la presente memoria se dan a conocer métodos de tratamiento o prevención del daño óseo en un individuo que lo necesita, mediante la administración en el individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de activina-ActRIIa, particularmente un polipéptido ActRIIa. En la presente memoria se dan a conocer métodos de estimulación del crecimiento o mineralización ósea en un individuo que lo necesita, mediante la administración en el individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de activina-ActRIIa, particularmente un polipéptido ActRIIa. Dichos métodos están preferentemente destinados a tratamientos terapéuticos y profilácticos de animales, y más preferentemente, seres humanos. En la presente memoria se da a conocer la utilización de antagonistas de activina-ActRIIa (particularmente polipéptidos ActRIIa solubles y anticuerpos neutralizantes con diana en activina o ActRIIa) para el tratamiento de trastornos asociados a una densidad ósea baja o a una resistencia ósea disminuida.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un terapéutico que "previene" un trastorno o condición se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la incidencia del trastorno o condición en la muestra tratada respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o condición respecto a la muestra de control no tratada. El término "tratando" tal como se utiliza en la presente memoria incluye la profilaxis de la condición indicada o la mejora o eliminación de la condición una vez se ha establecido. En cualquier caso, la prevención o el tratamiento pueden diferenciarse en el diagnóstico proporcionado por el médico y el resultado pretendido de la administración del agente terapéutico.

La exposición proporciona métodos de inducción de la formación de hueso y/o cartílago, la prevención de la pérdida de hueso, el incremento de la mineralización ósea o la prevención de la desmineralización del hueso. Por ejemplo, los antagonistas de activina-ActRIIa de la invención presentan aplicación en el tratamiento de la osteoporosis y en la cicatrización de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y otros animales. Los polipéptidos ActRIIa o activina pueden resultar útiles en pacientes que han sido diagnosticados con densidad ósea baja subclínica, como medida protectora del desarrollo de osteoporosis.

Los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria encuentran utilidad médica en la cicatrización de fracturas óseas y defectos del cartílago en seres humanos y en otros animales. Los métodos y composiciones de la invención pueden presentar además uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas, además de abiertas, y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación de novo de hueso inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumatismo o inducidos por resección oncológica, y también resulta útil en la cirugía plasmática cosmética. En determinados casos, los antagonistas de activina-ActRIIa de la invención pueden proporcionar un medio para atraer las células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Los antagonistas de activina-ActRIIa dados a conocer en la presente memoria también pueden resultar útiles en el tratamiento de la osteoporosis.

Los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria pueden aplicarse a condiciones caracterizadas por la pérdida de hueso o que causan la pérdida de hueso, tales como la osteoporosis (incluyendo la osteoporosis secundaria), el hiperparatiroidismo, la enfermedad de Cushing, la enfermedad de Paget, la tirotoxicosis, el estado diarreico crónico o la malabsorción, la acidosis tubular renal o la anorexia nerviosa.

La osteoporosis puede estar causada o asociada a diversos factores. Ser mujer, particularmente una mujer postmenopáusica, presentar un bajo peso corporal y llevar un estilo de vida sedentario son todos factores de riesgo de osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea, que conduce a riesgo de fractura). Las personas con cualquiera de los perfiles siguientes pueden ser candidatos al tratamiento con un antagonista de ActRIIa: mujer postmenopáusica y que no toma estrógenos u otra terapia de reemplazo hormonal; persona con una historia personal o materna de fractura de cadena o tabaquismo; mujer postmenopáusica alta (más de 1,70 m) o delgada (menos de 56,7 kg); hombre con condiciones clínicas asociadas a la pérdida ósea; persona que utiliza medicaciones que es conocido que causan pérdida ósea, incluyendo corticoesteroides, tales como Prednisone™, diversas medicaciones anticonvulsivas, tales como Dilantin™ y determinados barbitúricos, o fármacos de reemplazo tiroideo de dosis elevada; persona con diabetes de tipo 1, enfermedad hepática, enfermedad renal o antecedentes familiares de osteoporosis; persona con elevada renovación ósea (p.ej., exceso de colágeno en las muestras de orina); persona con una condición del tiroides, tal como hipertiroidismo; persona que ha experimentado una fractura tras un traumatismo leve; persona con evidencia radiográfica de fractura vertebral u otros signos de osteoporosis.

Tal como se ha indicado anteriormente, la osteoporosis puede resultar también como condición asociada a otro trastorno, o de la utilización de determinadas medicaciones. La osteoporosis que resulta de fármacos u otra condición médica se conoce como osteoporosis secundaria. En una condición conocida como enfermedad de Cushing, la cantidad en exceso de cortisol producida por el cuerpo resulta en osteoporosis y fracturas. Las medicaciones más comunes asociadas a la osteoporosis secundaria son los corticoesteroides, una clase de fármacos que actúan como el cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas adrenales. Aunque los niveles adecuados de hormonas tiroideas (que son producidas por la glándula tiroides) resultan necesarios para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede reducir la masa ósea con el tiempo. Los antácidos que contienen aluminio pueden conducir a pérdida ósea al administrarse a dosis elevadas en personas con problemas renales, particularmente las sometidas a diálisis. Entre otras medicaciones que pueden causar osteoporosis secundaria se incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se utilizan para prevenir las convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un fármaco para algunas formas de artritis, cáncer y trastornos inmunitarios; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un fármaco utilizado para tratar algunas enfermedades autoinmunes y para suprimir el sistema inmunitario en pacientes de trasplante de órgano; agonistas de la hormona liberadora de hormona lutenizante (Lupron, Zoladex), utilizados para tratar el cáncer de próstata y la endometriosis; heparina (Calciparina, Liquaemina), una medicación anticoagulante, y la colestiramina (Questran) y el colestipol (Colestid), utilizados para tratar el nivel alto de colesterol La pérdida ósea resultante de la terapia del cáncer es ampliamente reconocida y se denomina pérdida ósea inducida por la terapia del cáncer (POITC). Las metástasis óseas pueden crear cavidades en el hueso que pueden corregirse mediante tratamiento con antagonistas de activina-ActRIIa.

Los antagonistas de activina-ActRIIa, particularmente una ActRIIa soluble, dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse en pacientes de cáncer. Los pacientes que presentan determinados tumores (p.ej., de próstata, de mama, mieloma múltiple o cualquier tumor que cause hiperparatiroidismo) presentan un riesgo elevado de pérdida ósea debida a la pérdida ósea inducida por el tumor, así como metástasis óseas y agentes terapéuticos. Dichos pacientes pueden tratarse con antagonistas de activina-ActRIIa, incluso en ausencia de evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas. Los pacientes también pueden monitorizarse para evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas, y pueden tratarse con antagonistas de activina-ActRIIa en el caso de que los indicadores sugieran un riesgo incrementado. Generalmente, se utilizan escaneos DEXa para evaluar los cambios de densidad ósea, mientras que pueden utilizarse indicadores del remodelado óseo para evaluar la probabilidad de metástasis óseas. Pueden monitorizarse marcadores séricos. La fosfatasa alcalina específica ósea (FAEO) es un enzima que se encuentra presente en los osteoblastos. Los niveles de FAEO se encuentran incrementados en los pacientes con metástasis óseas y otras condiciones que resultan en un remodelado óseo incrementado. La osteocalcina y los péptidos procolágeno también están asociados a la formación de hueso y las metástasis óseas. Se han detectado incrementos de FAEO en pacientes con metástasis ósea causada por cáncer de próstata, y en menor grado, en metástasis ósea originada en cáncer de mama. Los niveles de la proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) son elevados en el cáncer de próstata que se ha metastizado al hueso, pero no en las metástasis óseas debidas a cáncer de vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal de tipo I (TPCI) es un entrecruzamiento observado en el colágeno que se forma durante la resorción del hueso. Debido a que el hueso se descompone y reforma constantemente, se observa TPCI en todo el cuerpo. Sin embargo, en el sitio de la metástasis ósea, el nivel será significativamente superior al nivel observado en una zona de hueso normal. Se ha encontrado TPCI a niveles elevados en metástasis ósea debida a cáncer de próstata, pulmón y mama. Otro entrecruzamiento del colágeno, el telopéptido N-terminal de tipo I (TNx), se produce junto con TPCI durante la renovación ósea. La cantidad de TNx se encuentra incrementada en la metástasis ósea causada por muchos tipos diferentes de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón, próstata y mama. Además, los niveles de TNx se incrementan con el avance de la metástasis ósea. Por lo tanto, dicho marcador puede utilizarse tanto para detectar metástasis como en forma de medida de la extensión de la enfermedad. Entre otros marcadores de la resorción se incluyen la piridinolina y la desoxipiridinolina. Cualquier incremento de los marcadores de resorción o de los marcadores de metástasis óseas indica la necesidad de terapia de antagonistas de activina-ActRIIa en un paciente.

Los antagonistas de activina-ActRIIa pueden administrarse conjuntamente con otros agentes farmacéuticos. La administración conjunta puede llevarse a cabo mediante administración de una única coformulación, mediante la administración simultánea o mediante la administración en tiempos separados. Los antagonistas de activina-ActRIIa pueden resultar particularmente ventajosos en el caso de que se administren con otros agentes óseos activos. Un paciente puede beneficiarse de la recepción conjunta de antagonista de activina-ActRIIa y la administración de complementos de calcio, vitamina D, ejercicio apropiado y/o, en algunos casos, otra medicación. Entre los ejemplos de otras medicaciones se incluyen bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona paratiroidea y raloxifeno. Los bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos y raloxifeno afectan al ciclo de remodelado óseo y se clasifican como medicaciones antiresortivas. El remodelado óseo consiste en dos etapas diferentes: la resorción ósea y la formación de hueso. Las medicaciones antiresortivas retrasan o detienen la parte de resorción ósea del ciclo de remodelado óseo, aunque no retrasan la parte de formación de hueso del ciclo. En consecuencia, la formación de hueso nuevo continúa a una velocidad mayor que la resorción ósea, y la densidad ósea puede incrementarse con el tiempo. La teriparatide, una forma de hormona paratiroidea, incrementa la velocidad de formación ósea en el ciclo de remodelado óseo. El alendronato está autorizado tanto para la prevención (5 mg al día o 35 mg una vez a la semana) como para el tratamiento (10 mg al día o 70 mg una vez a la semana) de la osteoporosis postmenopáusica. El alendronato reduce la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas vertebrales, de muñeca y de cadera. El alendronato también está autorizado para el tratamiento de la osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres como resultado de la utilización a largo plazo de estas medicaciones (es decir, prednisona y cortisona) y para el tratamiento de la osteoporosis en hombres. El alendronato más la vitamina D están autorizados para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres postmenopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D) y para el tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El ibandronato está autorizado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis postmenopáusica. Adminstrado en forma de una píldora una vez al mes (150 mg), el ibandronato debe tomarse el mismo día cada mes. El ibandronato reduce la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas vertebrales. El risedronato está autorizado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis postmenopáusica. Tomado diariamente (dosis de 5 mg) o semanalmente (dosis de 35 mg o dosis de 35 mg con calcio), el risendronato retrasa la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas vertebrales y no vertebrales. El risedronato también está autorizado para la utilización en hombres y mujeres para prevenir y/o tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta de la utilización a largo plazo de estas medicaciones (es decir, prednisona o cortisona). La calcitonina es una hormona natural que participa en la regulación del calcio y el metabolismo del hueso. En mujeres que han iniciado la menopausia hace más de 5 años, la calcitonina retrasa la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea vertebral y puede aliviar el dolor asociado a las fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas vertebrales. La calcitonina se encuentra disponible en forma de inyección (50 a 100 UI diarias) o de spray nasal (200 UI diarias). La terapia de estrógenos (TE)/terapia hormonal (TH) está autorizada para la prevención de la osteoporosis. Se ha demostrado que la TE reduce la pérdida ósea, incrementa la densidad ósea tanto en la columna como en la cadera, y reduce el riesgo de fracturas de cadena y vertebrales en mujeres postmenopáusicas. La TE se administra más comúnmente en forma de una píldora o parche cutáneo que administra una dosis baja de aproximadamente 0,3 mg diarios o una dosis estándar de aproximadamente 0,625 mg diarios y resulta eficaz al iniciarse después de los 70 años de edad. Al tomarse estrógenos solos, pueden incrementar el riesgo de la mujer de desarrollar cáncer del revestimiento uterino (cáncer endometrial). Para eliminar este riesgo, los profesionales sanitarios prescriben la hormona progestina en combinación con los estrógenos (terapia de reemplazo hormonal o TH) a aquellas mujeres que poseen un útero intacto. La TE/TH alivia los síntomas de la menopausia y se ha demostrado que presenta un efecto beneficioso sobre la salud ósea. Entre los efectos secundarios pueden incluirse el sangrado vaginal, sensibilidad mamaria, alteraciones del humor y enfermedad de la vesícula biliar. El raloxifeno, 60 mg al día, está autorizado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis postmenopáusica. Pertenece a una clase de fármacos denominada moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (MSRE) que se ha desarrollado para proporcionar los efectos beneficiosos de los estrógenos sin sus potenciales desventajas. El raloxifeno incrementa la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas vertebrales. Todavía no se encuentran disponibles datos que demuestren que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fractura de cadera y otras fracturas no vertebrales. El teriparatide, una forma de hormona paratiroidea, está autorizado para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres postmenopáusicas y hombres que presentan un riesgo elevado de fractura. Dicha medicación estimula la formación de hueso nuevo e incrementa significativamente la densidad mineral ósea. En mujeres postmenopáusicas, se ha observado reducción de las fracturas en la columna, cadera, pie, costilla y muñeca. En hombres, se ha observado reducción de las fracturas en la columna, aunque no se dispone de datos suficientes para evaluar la reducción de las fracturas en otros sitios. El teriparatide se autoadministra en forma de una inyección diaria durante hasta 24 meses.

7. Composiciones farmacéuticas

Los antagonistas de activina-ActRIIa (p.ej., los polipéptidos ActRIIa) pueden formularse con un portador farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, puede administrarse un polipéptido ActRIIa solo o como componente de una formulación farmacéutica (composición terapéutica). Los compuestos de la invención pueden formularse para la administración de cualquier manera conveniente para la utilización en medicina humana o veterinaria.

El método terapéutico dado a conocer en la presente memoria puede incluir la administración de la composición sistémicamente o localmente en forma de un implante o dispositivo. Al administrarla, la composición terapéutica para la utilización tal como se da a conocer en la presente memoria es evidentemente una forma fisiológicamente aceptable libre de pirógenos. Agentes terapéuticamente útiles diferentes de los antagonistas de ActRIIa que también pueden incluirse opcionalmente en la composición tal como se ha indicado anteriormente pueden administrarse simultánea o secuencialmente con los compuestos de la invención (p.ej., polipéptidos ActRIIa) en los métodos dados a conocer en la presente memoria.

Típicamente, se administran por vía parenteral antagonistas de ActRIIa. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos ActRIIa en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles inmediatamente antes de la utilización, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre del receptor o agentes de suspensión o espesantes pretendidos. Entre los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria se incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de materiales de recubrimiento, tales como la lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante la utilización de surfactantes.

Además, la composición puede encapsularse o inyectarse en una forma de administración en un sitio tisular diana (p.ej., hueso). Entre las composiciones dadas a conocer en la presente memoria puede incluirse una matriz capaz de administrar uno o más compuestos terapéuticos (p.ej., polipéptidos ActRIIa) en un sitio tisular diana (p.ej., hueso), proporcionando una estructura para el tejido en desarrollo y óptimamente capaces de ser resorbidos en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar una liberación lenta de los polipéptidos ActRIIa. Dichas matrices pueden estar formadas de materiales actualmente utilizados para otras aplicaciones médicas implantadas.

La elección de material de matriz se basa en la biocompatiblidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfaz. La aplicación particular de las composiciones de la invención definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y químicamente definidas: sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatito, ácido poliláctico y polianhídridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y están biológicamente bien definidos, tales como el hueso o el colágeno dérmico. Otras matrices adicionales están compuestas de proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tales como hidroxiapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden comprender combinaciones de cualquiera de los tipos anteriormente indicados de material, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatito o colágeno y fosfato tricálcico. La biocerámica puede presentar una composición alterada, tal como en calcio-aluminato-fosfato y procesarse para alterar el tamaño de poro, el tamaño de partícula, la forma de partícula y la biodegradabilidad.

Los método dados a conocer en la presente memoria pueden administrarse por vía oral, p.ej., en forma de cápsulas, sellos, píldoras, tabletas, pastillas (utilizando una base saborizada, habitualmente sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos o en forma de una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o en forma de una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, o como elixir o jarabe, o en forma de pastillas (utilizando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o en forma de colutorio y similares, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un agente como ingrediente activo. También puede administrarse un agente en forma de bolo, electuario o pasta.

En formas de dosis sólida para la administración oral (cápsulas, tabletas, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), puede mezclarse uno o más compuestos terapéuticos dados a conocer en la presente memoria con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato sódico o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: (1) agentes de carga o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico, (2) ligantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o acacia, (3) humectantes, tales como glicerol, (4) agentes desintegrantes, tales como agar agar, carbonato cálcico o almidón de tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato sódico, (5) agentes retardantes de solución, tales como parafina, (6) acelerantes de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario, (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita, (9) lubricantes, tales como talco, estearato cálcico, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico y mezclas de los mismos, y (10) agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, tabletas y píldoras, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además agentes tamponadores. También pueden utilizarse composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas rellenas de gelatina blanda y dura utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Entre las formas de administración líquidas para la administración oral se incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de administración líquidas pueden comprender diluyentes inertes utilizados comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizadores y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (por ejemplo aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos. Aparte de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilén-sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar agar y tragacanto y mezclas de los mismos.

Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria pueden contener además adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede resultar deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, también puede conseguirse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Se entiende que el régimen de administración será determinado por el médico responsable considerando diversos factores que modifican la acción de los compuestos de la invención dada a conocer en la presente memoria (pej., polipéptidos ActRIIa). Entre los diversos factores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cantidad de hueso que se desea formar, el grado de pérdida de densidad ósea, el sitio de daño óseo, la condición del hueso daño, la edad del paciente, sexo y dieta, la severidad de cualquier enfermedad que pueda estar contribuyendo a la pérdida ósea, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Opcionalmente, la dosis puede variar con el tipo de matriz utilizado en la reconstitución y los tipos de compuestos en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final también puede afectar a la dosis. El avance puede monitorizarse mediante la evaluación periódica del crecimiento y/o reparación óseos, por ejemplo, rayos X (incluyendo DEXA), determinaciones histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.

Los experimentos con ratones han demostrado que los efectos de ActRIIa-Fc sobre el hueso son detectables en el caso de que el compuesto se administre a intervalos y en cantidades suficientes para conseguir concentraciones en suero de 0,2 pg/kg o superiores, y los niveles en suero de 1 pg/kg o 2 pg/kg o superiores resultan deseables para conseguir efectos significativos sobre la densidad y resistencia óseas. Aunque no hay indicación de que las dosis más elevadas de ActRIIa-Fc resulten indeseables debido a efectos secundarios, pueden diseñarse regímenes de administración para alcanzar concentraciones en suero de entre 0,2 y 15 pg/kg, y opcionalmente de entre 1 y 5 pg/kg. En el ser humano, pueden conseguirse niveles en suero de 0,2 pg/kg con una única dosis de 0,1 mg/kg o superior y niveles en suero de 1 pg/kg pueden conseguirse con una única dosis de 0,3 mg/kg o superior. La semivida en suero observada de la molécula es de entre aproximadamente 20 y 30 días, sustancialmente más larga que para la mayoría de proteínas de fusión de Fc, y de esta manera, puede conseguirse un nivel en suero eficaz sostenido, por ejemplo mediante la administración de 0,2 a 0,4 mg/kg semanal o bisemanalmente, o pueden utilizarse dosis más elevadas a intervalos más prolongados entre dosis. Por ejemplo, podrían utilizarse dosis de 1 a 3 mg/kg mensual o bimensualmente, y el efecto sobre el hueso podría ser suficientemente duradero para que la administración resultase necesaria sólo cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 o más meses.

En la presente memoria se da a conocer una terapia génica para la producción in vivo de polipéptidos ActRIIa. Dicha terapia conseguiría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias de polipéptido ActRIIa en las células o tejidos que presentan los trastornos listados anteriormente. La administración de las secuencias de polinucleótido de ActRIIa puede conseguirse utilizando un vector de expresión recombinante, tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Resulta preferente para la administración terapéutica de secuencias de polinucleótido ActRIIa la utilización de liposomas dirigidos.

Entre los diversos vectores víricos que pueden utilizarse para la terapia génica tal como se enseña en la presente memoria se incluyen adenovirus, virus herpes, vaccinia o, preferentemente, un virus ARN, tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Entre los ejemplos de vectores retrovíricos en los que puede insertarse un único gen foráneo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos: virus de la leucemia murina de Moloney (VLMuMo), virus del sarcoma murino de Harvey (VSMuHa), virus del tumor mamario murino (VTMMu) y virus del sarcoma de Rous (VSR). Varios vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. La totalidad de dichos vectores puede transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de manera que las células transducidas puedan identificarse y generarse. Los vectores retrovíricos pueden convertirse en específicos de diana mediante la unión de, por ejemplo, un azúcar, un glucolípido o una proteína. El transporte dirigido preferente se consigue mediante la utilización de un anticuerpo. El experto en la materia reconocerá que pueden insertarse secuencias polinucleótidas específicas en el genoma retrovírico o unirse a una cubierta vírica para permitir la administración específica de diana del vector retrovírico que contiene el polinucleótido ActRIIa. El vector preferentemente presenta como diana el hueso o cartílago.

Alternativamente, pueden transfectarse directamente células de cultivo tisular con plásmidos codificantes de los genes estructurales retrovíricos gag, pol y env, mediante transfección convencional con fosfato de calcio. A continuación, dichas células se transfectan con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico al medio de cultivo.

Otro sistema de administración dirigida para los polinucleótidos de ActRIIa es un sistema de dispersión coloidal. Entre los sistemas de dispersión coloidal se incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferente es el liposoma. Los liposomas son vesículas membranosas artificiales que resultan útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Puede encapsularse ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y administrarse en las células en una forma biológicamente activa (ver, p.ej., Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Los métodos para la transferencia génica eficiente utilizando un vehículo liposómico son conocidos de la técnica; ver, p.ej., Mannino et al., Biotechniques 6:682, 1988. La composición del liposoma es habitualmente una combinación de fosfolípidos, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden utilizarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y presencia de cationes divalentes.

Entre los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas se incluyen compuestos fosfatidilo, tales como fosfatidiiglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Entre los fosfolípidos ilustrativos se incluyen, la fosfatidilcolina de huevo, la dipalmitoMfosfatidilcolina y la diestearoilfosfatidilcoNna. El transporte dirigido de liposomas también resulta posible basándose en, por ejemplo, la especificidad de órgano, la especificidad celular y la especificidad de orgánulo y es conocido de la técnica.

Ejemplos

La invención que ahora se describe en términos generales se entenderá más fácilmente en referencia a los ejemplos a continuación, que se incluyen con fines meramente ilustrativos de determinadas realizaciones y de realizaciones de la presente invención, y no pretenden ser limitativos de la misma.

Ejemplo 1: proteínas de fusión ActRIIa-Fc

Los Solicitantes han construido una proteína de fusión de ActRIIa soluble que presenta el dominio extracelular de ActRIIa humana fusionado con un dominio Fc humano o de ratón con un conector mínimo entre ellos. Los constructos se denominan ActRIIa-hFc y ActRIIa-mFc, respectivamente.

Se muestra ActRIIa-Fc_h posteriormente en forma purificada a partir de líneas de células CHO (SEC ID n° 7):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKMSGSI

EIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEV

TOPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV

T C V W D V SFtEDPE VKFN WYVDGVE VFrNAKTKPRFEQYN ST YRVV S VFTVF

HODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTK

NOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK

Las proteínas ActRIIa-Fc_h y ActRIIa-Fc_m se expresaron en líneas de células CHO. Se consideraron tres secuencias líder diferentes:

(i) Melitina de abeja melífera (MLAM): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEC ID n° 8)

(ii) Activador de plasminógeno tisular (APT): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEC ID n° 9)

(iii) Nativo: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEC ID n° 10).

La forma seleccionada utiliza el líder APT y presenta la secuencia de aminoácidos no procesada siguiente:

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQT

GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNTSGSTEIVKQGCWLDDTNCYDRTDCVEKKD

SPEVYFCeCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPA

PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQYN ST Y R W SVLT VLHQD WLNGKE YKCKV SNKALPVPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKJMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG

QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAFHNH

YTQKSLSLSPGK (SEC ID n° 13)

Dicho polipéptido está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos siguiente:

ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAG

CAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAG

GAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAAC

TGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTG

CT ACCTGGAAGAAT ATTT CT GGTT CC ATT GAAT AGT GAAAC AAGGTT GTT

GGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAA

AGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATG

AAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAAT

CCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCAC

CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC

CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT

GCGTGGT GGT GGAC GT GAGCC ACGAAGACC CT GAGGTC AAGTT C AACT G

GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA

GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG

CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA

a a g c c c t c c c a g t c c c c a t c g a g a a a a c c a t c t c c a a a g c c a a a g g g c a

GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATG

ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA

GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT

ACAAGACC ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCT CT AT

AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT

CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG

CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (SEC ID n° 14)

Tanto ActRIIa-Fc_h como ActRIIa-Fc_m eran notablemente susceptibles de expresión recombinante. Tal como se muestra en la figura 1, la proteína se purificó en forma de un único pico bien definido de proteína. La secuenciación N-terminal reveló una única secuencia de -ILGRSTQE (SEC ID n° 11). La purificación pudo llevarse a cabo mediante una serie de etapas de cromatografía de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de sefarosa Q, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaños y la cromatografía de intercambio catiónico. La purificación pudo completarse mediante filtración vírica e intercambio de tampones. La proteína ActRIIa-Fc_h se purificó hasta una pureza >98% según determinación mediante cromatografía de exclusión por tamaños y >95% según se determinó mediante SDS-PAGE.

ActRIIa-Fc_h y ActRIIa-Fc_m mostraron una elevada afinidad para ligandos, particularmente la activina A. Se inmovilizó GDF-11 o Activina A ("ActA") sobre un chip CM5 de Biacore utilizando un procedimiento estándar de acoplamiento de aminas. Se cargaron las proteínas ActRIIa-Fc_h y ActRIIa-Fc_m en el sistema y se midió la unión. ActRIIa-Fc_h se unía a la activina con una constante de disociación (K^d) de 5x10-12, y la proteína se unía a GDF11 con una K^dde 9,96x10'9 Ver la figura 2. ActRIIa-Fc_m se comportaba de manera similar.

Se utilizó un ensayo de gen informador A-204 para evaluar los efectos de las proteínas ActRIIa-Fc_h sobre la señalización de GDF-11 y Activina-A. Línea celular: rabdomiosarcoma humano (derivado de músculo). Vector informador: pGL3(CAGA)12 (descrito en Dennler et al., EMBO 17: 3091-3100, 1998). Ver la figura 3. El motivo CAGA12 se encuentra presente en los genes sensibles a TGF-Beta (gen PAI-1), por lo que dicho vector resulta de uso general para factores que señalizan a través de Smad2 y 3.

Día 1: división de células A-204 en placa de 48 pocillos.

Día 2: células A-204 transfectadas con 10 |jg de pGL3(CAGA)12 o pGL3(CAGA)12 (10 |jg)+ pRLCMV (1 |jg) y Fugene.

Día 3: adición de factores (diluidos en medio BSA al 0,1%). Los inhibidores necesitan preincubarse con Factores durante 1 h antes de añadir a las células. 6 h después, las células se enjuagaron con PBS y se lisaron las células. A continuación, se llevó a cabo un ensayo de luciferasa. Típicamente en este ensayo, en ausencia de ningún inhibidor, la Activina A muestra una estimulación de aproximadamente 10 veces de la expresión del gen informador y una ED⁵⁰~2 ng/ml. GDF-11: estimulación de factor 16, ED⁵⁰: ~1,5 ng/ml. GDF-8 mostraba un efecto similar al de GDF-11. Tal como se muestra en la figura 4, ActRIIa-Fc_h y ActRIIa-Fc_m inhibían la señalización mediada por GDF-8 a concentraciones picomolares. Tal como se muestra en la figura 5, tres preparaciones diferentes de ActRIIa-Fc_h inhibieron la señalización de GDF-11 con una IC⁵⁰de aproximadamente 200 pM.

La ActRIIa-Fc_h era muy estable en los estudios farmacocinéticos. Ratas recibieron dosis de 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg de proteína ActRIIa-Fc_h y se midieron los niveles en plasma de la proteína a las 24, 48, 72, 144 y 168 horas. En un estudio separado, las ratas recibieron dosis de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg. En ratas, la ActRIIa-Fc_h presentaba una semivida en suero de 11 a 14 días y los niveles circulantes del fármaco eran bastante elevados tras dos semanas (11 pg/ml, 110 pg/ml o 304 pg/ml para las administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente). En monos Cynomolgus, la semivida en plasma era sustancialmente superior a los 14 días y los niveles circulantes del fármaco eran de 5 pg/ml, 304 pg/ml o 1440 pg/ml para administraciones iniciales de 1 mg/kg, 10 mg/kg o 30 mg/kg, respectivamente. Los resultados preliminares en seres humanos sugieren que la semivida en suero es de entre aproximadamente 20 y 30 días.

Ejemplo 2: ActRIIa-Fc_m estimula el crecimiento óseo in vivo

Ratones hembra normales (BALB/c) recibieron dosis de ActRIIa-Fc_m al nivel de 1 mg/kg/dosis, 3 mg/kg/dosis o 10 mg/kg/dosis, con administración de dos dosis a la semana. Se determinó la densidad mineral ósea y el contenido mineral óseo mediante DEXA; ver la figura 6.

En ratones BALB/c hembra, los escaneos de DEXA mostraron un incremento significativo (>20%) de densidad y contenido mineral óseo como resultado del tratamiento con ActRIIa-Fc_m. Ver las figuras 7 y 8.

De esta manera, el antagonismo de ActRIIa causó una densidad y contenido óseos incrementados en ratones hembra normales. Como siguiente etapa, se sometió a ensayo el efecto de ActRIIa-Fc_m sobre el hueso en un modelo de ratón de osteoporosis.

Andersson et al. (2001), establecieron que los ratones ovariectomizados sufrían una pérdida ósea sustancial (una pérdida de aproximadamente 50% del hueso trabecular seis semanas después de la operación) y que la pérdida ósea en estos ratones podía corregirse con agentes terapéuticos candidatos, tales como hormona paratiroidea.

Los Solicitantes utilizaron ratones C57BL6 hembra que habían sido ovariectomizados (OVX) o simuladamente operados a las 4-5 semanas de edad. Ocho semanas después de la cirugía, se inició el tratamiento con ActRIIa-Fc_m (10 mg/kg, dos veces a la semana) o control (PBS). Se midió la densidad ósea mediante un escáner de TC.

Tal como se muestra en la figura 9, los ratones ovariectomizados no tratados mostraron una pérdida sustancial de densidad ósea trabecular respecto a los controles simuladamente operados tras seis semanas. El tratamiento de ActRIIa-Fc_m restauró la densidad ósea al nivel de los ratones simuladamente operados. A las 6 y 12 semanas de tratamiento, ActRIIa-Fc_m causó un incremento sustancial del hueso trabecular de los ratones OVX. Ver la figura 10. Tras 6 semanas de tratamiento, la densidad ósea se incrementó en 24% respecto a los controles de PBS. A las 12 semanas, el incremento fue de 27%.

En los ratones simuladamente operados, ActRIIa-Fc_m también causó un incremento sustancial de hueso trabecular. Ver la figura 11. Tras 6 y 12 semanas, el tratamiento produjo un incremento de 35% respecto a los controles.

En un grupo adicional de experimentos, ratones ovariectomizados (OVX) o simuladamente operados tal como se ha indicado anteriormente fueron tratados con ActRIIa-Fc_m (10 mg/kg, dos veces a la semana) o control (PBS) durante doce semanas. De manera similar a los resultados indicados anteriormente para ActRIIa-Fc_m, los ratones OVX que recibieron ActRIIa-Fc_m mostraron un incremento de la densidad ósea trabecular de 15% transcurridos tan solo cuatro semanas, y de 25% tras 12 semanas de tratamiento (figura 12). Los ratones simuladamente operados que recibieron ActRIIa-Fc_m mostraron de manera similar un incremento de la densidad ósea trabecular de 22% transcurrido tan solo cuatro semanas y de 32% tras 12 semanas de tratamiento (figura 13).

Tras doce semanas de tratamiento con ActRIIa-Fc_m, el análisis DEXA de cuerpo completo y de fémur ex vivo mostró que el tratamiento inducía un incremento de la densidad ósea tanto en ratones ovariectomizados como en ratones simuladamente operados (figuras 14A y 14B, respectivamente). Estos resultados resultan corroborados por el análisis de pQCT ex vivo de la diáfisis femoral media, que mostraron un incremento significativo tanto de densidad ósea total como cortical tras doce semanas de tratamiento con ActRIIa-Fc_m. Los ratones ovariectomizados de control tratados con vehículo mostraron densidades óseas que eran comparables a las de ratones simuladamente operados de control tratados con vehículo (figura 15). Además de la densidad ósea, el contenido óseo se incrementó con el tratamiento de ActRIIa-Fc_m. El análisis de pQCT ex vivo de la diáfisis femoral media mostró un incremento significativo tanto de contenido óseo total como cortical tras doce semanas de tratamiento de ActRIIa-Fc_m, mientras que tanto en ratones ovariectomizados como en ratones de control de vehículo simuladamente operados se observó un contenido óseo comparable (figura 16). El análisis de pQCT ex vivo de la diáfisis femoral media también mostró que los ratones tratados con ActRIIa-Fc_m no mostraron un cambio de circunferencia periosteal; sin embargo, el tratamiento con ActRIIa-Fc_m resultó en una reducción de la circunferencia endosteal, indicando un incremento del grosor cortical debido al crecimiento de la superficie interna del fémur (figura 17).

Los ensayos mecánicos de fémures determinaron que ActRIIa-Fc_m era capaz de incrementar las características extrínsecas del hueso (carga máxima, rigidez y energía de fractura) que contribuyeron a un incremento significativo de las propiedades intrínsecas (resistencia última) de los huesos. Los ratones ovariectomizados y tratados con ActRIia-Fc_m mostraron una resistencia ósea incrementada hasta niveles superiores a los controles tratados con vehículo operados simuladamente, indicando una reversión total del fenotipo osteoporótico (figura 18).

Estos datos demuestran que un antagonista de activina-ActRIIa puede incrementar la densidad ósea en ratones hembra normales y, además, corregir defectos de densidad ósea, contenido óseo y resistencia última del hueso en un modelo de ratón de osteoporosis.

En un grupo adicional de experimentos, se ovariectomizaron ratones o se operaron simuladamente a las 4 semanas y a partir de las 12 semanas recibieron un placebo o ActRIIa-Fc_m (2 veces/semana, 10 mg/kg) (también denominado RAP-11 en las figuras 19 a 24) durante un periodo adicional de 12 semanas. Se evaluó una diversidad de parámetros óseos. Tal como se muestra en la figura 19, ActRIIa-Fc_m incrementó las proporciones de volumen óseo trabecular a volumen total de las vértebras (VB/VT) tanto en ratones OVX como operados simuladamente (SHAM). ActRIIa-Fc_m también mejoró la arquitectura trabecular (figura 20), incrementó el grosor cortical (figura 21) y mejoró la resistencia ósea (figura 22). Tal como se muestra en la figura 23, ActRIIa-Fc_m produjo efectos deseables en un abanico de dosis entre 1 mg/kg y 10 mg/kg.

Se llevó a cabo la histomorfometría ósea en el punto temporal de las 2 semanas en los ratones simuladamente operados. Estos datos, presentados en la figura 24, demuestran que ActRIIa-Fc_m presenta un doble efecto: inhibe la resorción ósea y estimula el crecimiento óseo. De esta manera, ActRIIa-Fc_m estimula el crecimiento óseo (efecto anabólico) e inhibe la resorción ósea (efecto anticatabólico).

Ejemplo 4: proteínas ActRIIa-Fc alternativas

Un constructo alternativo puede presentar una deleción de la cola C-terminal (los 15 aminoácidos finales del dominio extracelular de ActRIIa. La secuencia de dicho constructo se presenta a continuación (parte Fc subrayada) (SEC ID n° 12):

ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSI

EIVKOGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTG

GGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV

KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

V SNKALP VPIEKTISKAKGOPREPO V YT LPP SREEMTKNO VSLTCL VKGF YPS

DIAVE WESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCS

VMHEALHNHYTOKSLSLSPGK

Aunque se han comentado realizaciones específicas de la materia objeto de la invención, la especificación anterior es ilustrativa y no limitativa. Muchas variaciones resultarán evidentes para el experto en la materia tras la revisión de la presente especificación y reivindicaciones, posteriormente. El alcance completo de la invención deberá determinarse en referencia a las reivindicaciones, junto su alcance total de los equivalentes y la especificación, junto con dichas variaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

i. Método para identificar un agente que estimula el crecimiento óseo e incrementa la densidad ósea, en el que el método comprende: a) identificar un agente que se une a un dominio de unión a ligando de un polipéptido ActRIIa competitivamente con una activina, en la que el polipéptido ActRIIa comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la SEC ID n° 3 y b) evaluar el efecto del agente sobre el tejido óseo en el que el extremo N-terminal del polipéptido ActRIIa es ILGRSETQE.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en moléculas orgánicas no peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácidos nucleicos.
3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el agente se identifica mediante un método bioquímico.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el método bioquímico es uno o más de fotoentrecruzamiento, unión de ligando marcado radioactivamente o cromatografía de afinidad.
5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente se identifica mediante un ensayo basado en el mecanismo.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente se evalúa en un ensayo celular.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente se evalúa en un ensayo in vivo.
8. Método según cualquiera reivindicación anterior, en el que el polipéptido ActRIIa comprende la secuencia de aminoácidos SEC iD n° 2.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido ActRIIa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido ActRIIa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7.
11. Método según la reivindicación 10, en el que el polipéptido ActRIIa consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido ActRIIa comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 12.