ES2890327T3 - Modelos predictivos basados en miARN para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para predecir la recurrencia bioquímica en un sujeto después de una prostatectomía radical, que comprende a) determinar un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra del sujeto que incluye al menos miR-107; y b) calcular una puntuación de riesgo de recurrencia a partir del perfil de expresión de miARN; donde una puntuación de riesgo de recurrencia alta es una indicación de recurrencia bioquímica dentro de 1 a 5 años.

Description

DESCRIPCIÓN

Modelos predictivos basados en miARN para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata

ANTECEDENTES

El cáncer de próstata (CaP) es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y el cáncer más común en los hombres. Sin embargo, las estrategias de tratamiento siguen siendo muy controvertidas. La prostatectomía radical (PR), o la extirpación completa de la glándula prostática, es una opción de tratamiento común para los hombres con CaP en estadio temprano. Los datos a largo plazo indican que el 30-40 % de estos pacientes experimentan niveles crecientes de antígeno prostático específico (PSA) después de la PR, lo que indica una supervivencia continuada de las células prostáticas. Un aumento significativo en el nivel de PSA después de la PR puede denominarse "falla bioquímica" (FB), "recurrencia bioquímica" o "recaída bioquímica". En este punto, un paciente puede optar por la radioterapia de rescate (RT), la terapia adyuvante o ambas, según el pronóstico del médico. Para algunos pacientes, el FB puede ocurrir nuevamente después de la segunda ronda de terapia.

Actualmente, los datos que se usan para desarrollar pronósticos después de la PR y la RT incluyen los niveles de PSA, la edad, la clasificación de los tumores patológicos (pT) y los ganglios linfáticos (pN) y la puntuación de Gleason. El PSA es fabricado por células de la glándula prostática. Un nivel de PSA en aumento se considera un indicador potencial de cáncer de próstata. El estadio tumoral (pT) indica el tamaño y la capacidad de invasión del tumor (en una escala de 1 a 4, siendo 1 el más pequeño y menos invasivo). La puntuación de los ganglios linfáticos (pN) indica si el cáncer se ha diseminado o no a los ganglios linfáticos cercanos a la glándula prostática. Este valor es 0 si el cáncer no está presente en los ganglios linfáticos o 1 si el cáncer se encuentra en los ganglios linfáticos.

La puntuación de Gleason tiene en cuenta la capacidad del tumor para formar glándulas (una indicación de tejido más sano). Un patólogo asigna un grado primario en función del tejido más destacado observado en el tumor y un grado secundario basado en el segundo tipo de tejido más destacado o más agresivo observado en el tumor. El intervalo de grados es 1-5: 1, 2 y 3 se consideran de grado bajo a moderado (muchas glándulas más pequeñas y uniformes); 4 y 5 se consideran de alto grado (pocas glándulas). El pronóstico para un paciente dado generalmente se encuentra entre el predicho por el grado primario y el grado secundario dado al segundo patrón glandular más destacado. Cuando se suman los dos grados, el número resultante se denomina puntuación de Gleason. La puntuación de Gleason es un predictor de resultado más preciso que cualquiera de los grados individuales. Por tanto, la puntuación de Gleason informada tradicionalmente será la suma de dos números entre 1-5 con una puntuación total de 2-10.

Se han derivado múltiples nomogramas de valoración de riesgos y modelos de clasificación utilizando parámetros tales como pT, pN, puntuación de Gleason o estado de resección. Estos modelos incluyen la puntuación CAPRA, la tabla de Partin, la clasificación de D'Amico y los tres nomogramas de Stephenson. Sin embargo, todavía es difícil distinguir entre cánceres de próstata agresivos e indolentes. La falta de predictores claros de la progresión del cáncer de próstata conduce a una toma de decisiones subjetiva con respecto a los cursos de tratamiento. Algunos tumores de próstata crecen tan lentamente que nunca causan problemas mortales, lo que hace que el tratamiento en estadio inicial sea controvertido. Por lo tanto, se necesitan biomarcadores que predigan la progresión del CaP para guiar la terapia.

El documento WO 2011/127219 detalla los biomarcadores de microARN que se correlacionan con el cáncer de próstata. El documento WO 2014/085906detalla que se ha encontrado que los microARN se correlacionan con cánceres de próstata de bajo y alto riesgo. Bryant et al., 2012 (Changes in circulating microRNA levels associated with prostate cancer, British Journal of Cancer, vol. 106, n.° 4) detalla que los niveles de microARN circulantes pueden estar asociados con el cáncer de próstata.

RESUMEN

La materia en cuestión para la que se solicita protección es la que se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona un procedimiento para predecir la recurrencia bioquímica en un sujeto después de una prostatectomía radical, que comprende a) determinar un perfil de expresión de miARN de una muestra del sujeto que incluye al menos miR-107; y b) calcular una puntuación de riesgo de recurrencia a partir del perfil de expresión de miARN; donde una puntuación de riesgo de recurrencia alta es una indicación de recurrencia bioquímica dentro de 1 a 5 años. Cualquier aspecto que quede fuera de las reivindicaciones se proporciona como divulgación.

Se describen procedimientos para usar miARN como biomarcadores moleculares para predecir la progresión del cáncer de un paciente y ajustar su régimen terapéutico en consecuencia. Los procedimientos incluyen predecir la recurrencia bioquímica en un sujeto después de una prostatectomía radical. Esto puede incluir determinar un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra (p. ej. biopsia de tumor o fluido corporal) del sujeto de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88 de los miARN enumerados en la Tabla 2 y calculando una puntuación de riesgo de recurrencia a partir del perfil de expresión de miARN. Una puntuación de riesgo de recurrencia alta puede ser una indicación de recurrencia bioquímica dentro de 1 a 5 años.

Los procedimientos también incluyen la predicción de la recurrencia bioquímica en un sujeto después de la radioterapia de rescate posterior a la prostatectomía, que incluye la radioterapia de haz externo o la radioterapia interna. Esto puede incluir determinar un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra del sujeto de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de los miARN enumerados en la Tabla 3 y calcular una puntuación de riesgo de recurrencia a partir del perfil de expresión de miARN. En algunas realizaciones, los miARN incluyen miR-4516, miR-601 o una combinación de los mismos, solos o en combinación con cualquiera de los miARN enumerados en la Tabla 3. Una puntuación de riesgo de recurrencia alta puede ser una indicación de recurrencia bioquímica dentro de 1-5 años.

Los procedimientos también pueden incluir la graduación de la biopsia del tumor de acuerdo con una puntuación de Gleason y el uso de la puntuación de Gleason como una covariable para calcular la puntuación de riesgo de recurrencia. Los procedimientos también pueden incluir determinar la clasificación de los ganglios linfáticos, la clasificación del tumor patológico y/o el estado de la resección y el uso de estas propiedades como covariables en el cálculo de la puntuación de riesgo de recurrencia.

Si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta, los procedimientos pueden incluir tratar al sujeto con prostatectomía radical, radioterapia o tratamiento adyuvante. La terapia adyuvante puede ser quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica, radioterapia o una combinación de las mismas. La radioterapia puede ser radioterapia de rescate, que incluye la radioterapia de haz externo o la radioterapia interna. Los procedimientos también pueden incluir el tratamiento de un paciente con cuidados paliativos si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta. Si la puntuación de riesgo de recurrencia es baja, los procedimientos de tratamiento pueden incluir un seguimiento clínico continuado.

También se describen procedimientos de uso de biomarcadores de miARN para detectar cáncer de próstata en un sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento implica determinar un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra del sujeto que incluye al menos miARN-1283, miARN-137 o una combinación de los mismos. Este procedimiento puede incluir además comparar las intensidades de expresión de miARN con niveles preespecificados y usar estos niveles para llegar a un diagnóstico. La etapa para llegar a un diagnóstico también puede incluir determinar el nivel de PSA y/o tomar una biopsia de próstata. Si el procedimiento detecta cáncer de próstata, el procedimiento puede incluir además la administración de un tratamiento tal como tratamiento quirúrgico, tratamiento con radiación, tratamiento adyuvante o una combinación de los mismos.

Para todos los procedimientos, la muestra usada para detectar o pronosticar el cáncer de próstata puede ser un fluido corporal o un tumor.

En algunas realizaciones, se puede usar un kit para determinar un perfil de expresión de miARN de un sujeto, comprendiendo el kit cebadores oligonucleotídicos o sondas configurados para unirse selectivamente a 2 o más miARN enumerados en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, o una combinación de los mismos.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se establecen en los dibujos adjuntos y la descripción que se encuentra más adelante. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra un diagrama de Venn del número de miARN expresados común y diferencialmente en el tumor de próstata, el estroma y el epitelio.

La Figura 2 muestra un diagrama de Venn del número de miARN comúnmente expresados entre todos los tipos de tejidos (tumor, epitelio y estroma), y enumera por nombre aquellos expresados de forma significativamente diferencial 1,5 veces o más entre todos los tipos de tejidos.

La Figura 3A muestra un análisis de conglomerados de 88 miARN predictivo de la primera recurrencia bioquímica. El análisis puede distinguir los marcadores relacionados con la recurrencia temprana frente a tardía después de la prostatectomía radical.

La Figura 3B muestra un gráfico de Kaplan-Meier del análisis de conglomerados en la Fig. 3A

La Figura 4 muestra el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) de un modelo de RT de rescate predictivo basado en miARN.

La Figura 5 muestra un gráfico de Kaplan-Meier para distinguir la recurrencia temprana frente a la tardía después de la radioterapia de rescate.

La Figura 6 muestra un diagrama de flujo del diseño del estudio usado en el ejemplo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La falta de predictores claros de la progresión de cáncer de próstata conduce a una toma de decisiones subjetiva con respecto a los cursos de tratamiento. La identificación de nuevos biomarcadores que puedan detectar el cáncer de próstata y predecir la recurrencia post-PR avanzaría en el campo del tratamiento del CaP. Se divulgan en el presente documento procedimientos de uso de miARN como biomarcadores moleculares para detectar y predecir la progresión del cáncer de un paciente y ajustar su régimen terapéutico en consecuencia.

Se divulgan biomarcadores de miARN que pueden usarse para detectar cáncer de próstata en un sujeto y/o predecir su recurrencia después de la terapia. El término "sujeto" se refiere a cualquier individuo que sea la diana de la administración o el tratamiento. El sujeto puede ser un vertebrado, por ejemplo, un mamífero. Por tanto, el sujeto puede ser un paciente humano o veterinario. El término "paciente" se refiere a un sujeto bajo el tratamiento de un médico, por ejemplo, un doctor.

En algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN es una muestra de tumor que contiene miARN. La muestra de tumor puede estar recién aislada o puede haberse conservado mediante procedimientos conocidos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, la fijación con formalina con inclusión en parafina. En algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN es una biopsia de tejido. En otras realizaciones, la muestra biológica contiene miARN circulantes, por ejemplo, miARN extracelulares. Los miARN circulantes incluyen miARN en las células (miARN celular), miARN extracelular en microvesículas (miARN asociado a microvesículas) y miARN extracelular que no está asociado con células o microvesículas (miARN extracelular no vesicular).

Los miARN extracelulares circulan libremente en un amplio intervalo de fluidos corporales. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN es un fluido corporal, tal como sangre, fracciones de la misma, suero, plasma, orina, saliva, lágrimas, sudor, semen, linfa, secreciones bronquiales o LCR. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra que se obtiene de forma no invasiva. En algunas realizaciones, la muestra biológica usada para determinar el nivel de uno o más biomarcadores de miARN puede contener células. En otras realizaciones, la muestra biológica puede estar libre o sustancialmente libre de células (por ejemplo, una muestra de suero o plasma). Asimismo, la muestra puede estar libre o sustancialmente libre de microvesículas. Por ejemplo, una muestra que está libre o sustancialmente libre de microvesículas es aquella en la que el contenido de microvesículas de la muestra es suficientemente bajo para evitar interferir con la capacidad de determinar con precisión el nivel de miARN no vesiculares en la muestra.

El nivel de uno o más biomarcadores de miARN en una muestra biológica puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado. Puede usarse cualquier procedimiento fiable para medir el nivel o la cantidad de miARN en una muestra. Generalmente, el miARN puede detectarse y cuantificarse a partir de una muestra (que incluye fracciones de la misma), tales como muestras de ARN aislado mediante varios procedimientos conocidos para la detección de ARNm, que incluyen, por ejemplo, procedimientos basados en amplificación (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-TR), reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (PCRc), amplificación por círculo rodante, etc.), procedimientos basados en hibridación (p ej., matrices de hibridación (p. ej., micromatrices), análisis NanoString™, análisis de transferencia Northern , amplificación de señal de ADN ramificado (ADNram) e hibridación in situ) y procedimientos basados en secuenciación (por ejemplo, procedimientos de secuenciación de próxima generación, por ejemplo, usando las plataformas Illumina o IonTorrent). Otras técnicas ejemplares incluyen el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA) y la espectroscopia de masas.

En algunas realizaciones, el ARN se convierte en ADN (ADNc) antes del análisis. El ADNc se puede generar mediante transcripción inversa de miARN aislado usando técnicas convencionales. Los kits de transcripción inversa de miARN son conocidos y están disponibles comercialmente. Los ejemplos de kits adecuados incluyen, pero sin limitación, el kit de transcripción de miARN mirVana TaqMan® (Ambion, Austin, TX) y el kit de transcripción de miARN TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores universales o cebadores específicos, que incluyen los cebadores de tallo-bucle específicos de miARN, son conocidos y están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Applied Biosystems. En algunas realizaciones, el miARN se amplifica antes de la medición. En otras realizaciones, el nivel de miARN se mide durante el proceso de amplificación. En otras realizaciones más, el nivel de miARN no se amplifica antes de la medición. Algunos procedimientos ejemplares adecuados para determinar el nivel de miARN en una muestra se describen con mayor detalle a continuación. Estos procedimientos se proporcionan únicamente a modo de ilustración, y será evidente para un experto que también se pueden usar otros procedimientos adecuados.

Existen muchos procedimientos basados en amplificación para detectar el nivel de secuencias de ácido nucleico de miARN, que incluyen, pero sin limitación, PCR, PCR-TR, PCRc y amplificación por círculo rodante. Otras técnicas basadas en amplificación incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de ligasa, amplificación de sonda dependiente de ligandos múltiples, transcripción in vitro (IVT), amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación mediada por transcripción, amplificación de ARN (Eberwine) y otros procedimientos que son conocidos por los expertos en la materia.

Una reacción de PCR típica incluye múltiples etapas, o ciclos, que amplifican selectivamente las especies de ácido nucleico diana: una etapa de desnaturalización, en la que se desnaturaliza un ácido nucleico diana; una etapa de apareamiento, en la que un conjunto de cebadores de PCR (es decir, cebadores directos e inversos) se aparean con cadenas de ADN complementarias, y una etapa de elongación, en la que una ADN polimerasa termoestable alarga los cebadores. Al repetir estas etapas varias veces, se amplifica un fragmento de ADN para producir un amplicón, correspondiente a la secuencia diana. Las reacciones de p Cr típicas incluyen 20 o más ciclos de desnaturalización, apareamiento y alargamiento. En muchos casos, las etapas de apareamiento y alargamiento se pueden efectuar al mismo tiempo, en cuyo caso el ciclo contiene solo dos etapas. Se puede efectuar una reacción de transcripción inversa (que produce una secuencia de ADNc que tiene complementariedad con un miARN) antes de la amplificación por PCR. Las reacciones de transcripción inversa incluyen el uso de, por ejemplo, una ADN polimerasa (transcriptasa inversa) basada en ARN y un cebador. Los kits para la PCR cuantitativa en tiempo real de miARN son conocidos y están disponibles comercialmente. Los ejemplos de kits adecuados incluyen, pero sin limitación, el ensayo de miARN TaqMan® (Applied Biosystems) y el kit de detección de miARN por PCRc-TR mirVana™ (Ambion). El miARN puede ligarse a un oligonucleótido monocatenario que contiene secuencias de cebadores universales, una secuencia poliadenilada o una secuencia adaptadora antes de la transcriptasa inversa y amplificarse usando un cebador complementario de la secuencia del cebador universal, cebador poli(T) o cebador que comprende una secuencia que es complementaria de la secuencia del adaptador.

En algunos casos, se pueden desarrollar ensayos de PCRc-TR personalizados para determinar los niveles de miARN. Se pueden desarrollar ensayos de PCRc-TR personalizados para medir miARN en una muestra biológica, por ejemplo, un tumor o un fluido corporal, usando, por ejemplo, procedimientos que implican un cebador de transcripción inversa extendido y una PCR modificada con ácido nucleico bloqueado. Los ensayos de miARN personalizados se pueden probar ejecutando el ensayo en una serie de diluciones de miARN sintetizados químicamente correspondientes a la secuencia diana. Esto permite la determinación del límite de detección y del intervalo lineal de cuantificación de cada ensayo. Además, cuando se usa como una curva patrón, estos datos permiten una estimación de la abundancia absoluta de miARN medidos en muestras biológicas.

Las curvas de amplificación pueden comprobarse opcionalmente para verificar que los valores de Ct se valoran en el intervalo lineal de cada gráfico de amplificación. Típicamente, el intervalo lineal abarca varios órdenes de magnitud. Para cada miARN candidato ensayado, se puede obtener y analizar una versión sintetizada químicamente del miARN en una serie de diluciones para determinar el límite de sensibilidad del ensayo y el intervalo lineal de cuantificación. Los niveles de expresión relativos pueden determinarse, por ejemplo, según el procedimiento 2(-AA C(T)).

En algunas realizaciones, dos o más miARN se amplifican en un solo volumen de reacción. Por ejemplo, la PCRc múltiple, tal como la PCRc-TR, permite la amplificación y cuantificación simultáneas de al menos dos miARN de interés en un volumen de reacción mediante el uso de más de un par de cebadores y/o más de una sonda. Los pares de cebadores comprenden al menos un cebador de amplificación que se une específicamente a cada miARN, y las sondas están marcadas de tal manera que se puedan distinguir entre sí, lo que permite la cuantificación simultánea de múltiples miARN.

La amplificación por círculo rodante es una reacción impulsada por la ADN-polimerasa que puede replicar sondas de oligonucleótidos circularizadas con cinética lineal o geométrica en condiciones isotérmicas. En presencia de dos cebadores, uno que se hibrida con la hebra (+) de ADN, y la otra que se hibrida con la hebra (-), un patrón complejo de desplazamiento de hebra da como resultado la generación de más de 109 copias de cada molécula de ADN en 90 minutos o menos. Pueden formarse copias conectadas en tándem de una molécula de ADN de círculo cerrado usando un solo cebador. El proceso también se puede efectuar usando un ADN asociado a matriz. El molde usado para la amplificación por círculo rodante se puede transcribir de forma inversa. Este procedimiento se puede usar como un indicador muy sensible de la secuencia de miARN y el nivel de expresión a concentraciones de miARN muy bajas.

El miARN también puede detectarse usando procedimientos basados en hibridación, que incluyen pero sin limitación matrices de hibridación (por ejemplo, micromatrices), análisis NanoString™, análisis de transferencia Northern, amplificación de señal de ADN ramificado (ADNram) e hibridación in situ.

Las micromaterices se pueden usar para medir los niveles de expresión de un gran número de miARN simultáneamente. Las micromatrices se pueden fabricar usando una variedad de tecnologías, que incluyen la impresión con alfileres de punta fina en portaobjetos de vidrio, fotolitografía usando máscaras prefabricadas, fotolitografía usando dispositivos de microespejos dinámicos, impresión por chorro de tinta o electroquímica en matrices de microelectrodos. También son útiles las matrices microfluídicas TaqMan de baja densidad, que se basan en una matriz de reacciones microfluídicas PCRc-TR, así como procedimientos relacionados microfluídicos basados en PCRc-TR.

En un ejemplo de detección de micromatrices, diversos oligonucleótidos (p. ej., 200+ oligonucleótidos C6 5'-aminomodificados) correspondientes a secuencias de miARN codificante humano se colocan en portaobjetos CodeLink tridimensionales (GE Health/Amersham Biosciences) a una concentración final de aproximadamente 20 pM y se procesan según las recomendaciones del fabricante. El ADNc de la primera hebra sintetizado a partir de 20 pg de ARN total purificado con TRIzol se marca con ddUTP biotinilado usando el kit de marcaje de extremos Enzo BioArray (Enzo Life Sciences Inc.). La hibridación, la tinción y el lavado se pueden efectuar según un protocolo de matriz de genomas anticodificante de Affymetrix modificado.

El escáner Axon B-4000 y el software Gene-Pix Pro 4.0 u otro software adecuado se pueden usar para escanear imágenes. Se retiran los puntos no positivos después de la resta de fondo y los valores atípicos detectados por el procedimiento de ESD. Los valores de intensidad de la señal resultantes se pueden normalizar a los valores de la mediana por chip y luego se pueden usar para obtener medias geométricas y errores estándares para cada miARN. Cada señal de miARN se puede transformar en el logaritmo de base 2 y se puede realizar una prueba t de una muestra. Se pueden efectuar hibridaciones independientes para cada muestra en chips con cada miARN colocado varias veces para aumentar la robustez de los datos.

Las micromatrices se pueden usar para elaborar el perfil de expresión de miARN en enfermedades. Por ejemplo, el ARN se puede extraer de una muestra y, opcionalmente, los miARN se seleccionan por tamaño del ARN total. Se pueden enlazar ligadores de oligonucleótidos a los extremos 5' y 3' de los miARN y los productos de ligación resultantes se usan como moldes para una reacción de PCR-TR. El cebador de PCR de cadena codificante puede tener un fluoróforo enlazado a su extremo 5', marcando así la cadena codificante del producto de PCR. El producto de la PCR se desnaturaliza y luego se hibrida con la micromatriz. Un producto de PCR, denominado ácido nucleico diana que es complementario de la correspondiente secuencia de la sonda de captura de miARN en la matriz, se hibridará, a través del emparejamiento de bases, con el punto en el que se fijan las sondas de captura. Luego, el punto emitirá fluorescencia cuando se excite usando un escáner láser de micromatriz.

La intensidad de fluorescencia de cada punto se evalúa luego en términos del número de copias de un miARN particular, usando una serie de controles positivos y negativos y procedimientos de normalización de datos de matriz, lo que dará como resultado la valoración del nivel de expresión de un miARN particular.

El ARN total que contiene el miARN extraído de una muestra también se puede usar directamente sin selección por tamaño de los miARN. Por ejemplo, el ARN puede marcarse en el extremo 3' usando ARN ligasa T4 y un ligador de ARN corto marcado con fluoróforo. Los miARN marcados con fluoróforos complementarios de las correspondientes secuencias de sonda de captura de miARN en la matriz se hibridan, a través del emparejamiento de bases, con el punto en el que se fijan las sondas de captura. Se evalúa luego la intensidad de fluorescencia de cada punto en términos del número de copias de un miARN particular, usando una serie de controles positivos y negativos y procedimientos de normalización de datos de matriz, lo que dará como resultado una valoración del nivel de expresión de un miARN particular.

Se pueden emplear varios tipos de micromatrices que incluyen, pero sin limitación, micromatrices de oligonucleótidos colocados, micromatrices de oligonucleótidos prefabricados o matrices de oligonucleótidos largos colocados.

Los miARN también se pueden detectar sin amplificación usando el sistema de análisis nCounter® (NanoString™ Technologies, Seattle, WA). Esta tecnología emplea dos sondas basadas en ácidos nucleicos que se hibridan en solución (por ejemplo, una sonda indicadora y una sonda de captura). Después de la hibridación, se eliminan las sondas sobrantes y se analizan los complejos de sonda/diana de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los kits de ensayo de miARN nCounter® están disponibles en NanoString™ Technologies, que son capaces de distinguir entre miARN muy similares con gran especificidad.

Los miARN también se pueden detectar usando amplificación de señal de ADN ramificado (ADNram) (véase, por ejemplo, Urdea, Nature Biotechnology (1994), 12:926-928). Los ensayos de miARN basados en la amplificación de la señal de ADNram están disponibles comercialmente. Uno de tales ensayos es el ensayo de miARN QuantiGene® 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, cA).

También se pueden usar transferencia Northern e hibridación in situ para detectar miARN. Se conocen en la materia procedimientos adecuados para efectuar transferencia Northern e hibridación in situ.

Los procedimientos de secuenciación avanzados también se pueden usar cuando estén disponibles. Por ejemplo, los miARN se pueden detectar usando Illumina® Next Generation Sequencing (p. ej., procedimientos de secuenciación por síntesis o TruSeq, usando, por ejemplo, los sistemas HiSeq, HiScan, GenomeAnalyzer o MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA)). Los miARN también se pueden detectar usando Ion Torrent Sequencing (Ion Torrent Systems, Inc., Gulliford, CT) u otros procedimientos adecuados de secuenciación de semiconductores.

La espectroscopia de masas también se puede usar para cuantificar miRNA usando cartografía de ARNasa. Los ARN aislados se pueden digerir enzimáticamente con ARN endonucleasas (ARNasas) que tienen alta especificidad (p. ej., ARNasa T1, que escinde en el lado 3' de todos los residuos de guanosina no modificados) antes de su análisis por enfoques de Ms o MS en tándem (MS/MS). El primer enfoque desarrollado utilizaba la separación cromatográfica en línea de digestiones de endonucleasa mediante HPLC de fase inversa acoplada directamente a ESTMS. La presencia de modificaciones postranscripcionales puede revelarse mediante desplazamientos de masa de los esperados en función de la secuencia de ARN. Pueden aislarse iones de valores de masa/carga anómalos luego para secuenciación de MS en tándem para localizar la ubicación de la secuencia del nucleósido modificado postranscripcionalmente.

También se ha usado desorción/ionización láser asistida por matriz/espectrometría de masas (MALDI-MS) como un enfoque analítico para obtener información sobre nucleósidos modificados postranscripcionalmente. Los enfoques basados en MALDI se pueden diferenciar de los enfoques basados en EST por la etapa de separación. En MALDI-MS, el espectrómetro de masas se usa para separar el miARN.

Para analizar una cantidad limitada de miARN intactos, se puede emplear un sistema de LC capilar acoplado con nanoESI-MS, usando un espectrómetro de masas híbrido de trampa de iones lineal-orbitrap (LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific) o un espectrómetro de masas en tándem de cuadrupolo-tiempo de vuelo (QSTAR® XL, Applied Biosystems) equipado con una fuente de iones de nanopulverización hecha a medida, una válvula Nanovolume (Valco Instruments) y un sistema nano-HPLC sin división (DiNa, KYA Technologies). Se carga analito/TEAA en una columna trampa de nano-LC, se desala y luego se concentra. Los miARN intactos se eluyen de la columna trampa y se inyectan directamente en una columna capilar CI 8 y se cromatografían mediante HPLC-FI usando un gradiente de disolventes de polaridad creciente. El eluyente cromatográfico se pulveriza desde una punta de pulverización enlazada a la columna capilar, usando un voltaje de ionización que permite escanear los iones en el modo de polaridad negativa.

Los procedimientos adicionales para la detección y medición de miARN incluyen, por ejemplo, ensayo de invasión de cadena (Third Wave Technologies, Inc.), resonancia de plasmón de superficie (SPR), ADNc, MTDNA (ADN metálico; Advance Technologies, Saskatoon, SK) y procedimientos monomoleculares tales como el desarrollado por US Genomics. Se pueden detectar múltiples miARN en un formato de micromatrices usando un enfoque novedoso que combina una reacción enzimática de superficie con formación de imágenes de SPR amplificadas por nanopartículas (SPRI). La reacción de superficie de la poli(A) polimerasa crea colas de poli(A) en miARN hibridados sobre micromatrices de ácido nucleico bloqueado (LNA). Luego, las nanopartículas modificadas con ADN se adsorben sobre las colas de poli(A) y se detectan con SPRI. Esta metodología de SPRI amplificada con nanopartículas ultrasensibles se puede usar para la elaboración de perfiles de miARN a niveles attomolares.

En ciertas realizaciones, se usan marcajes, tintes o sondas marcadas y/o cebadores para detectar miARN amplificados o no amplificados. El experto en la materia reconocerá qué procedimientos de detección son apropiados basándose en la sensibilidad del procedimiento de detección y la abundancia de la diana. Dependiendo de la sensibilidad del procedimiento de detección y la abundancia de la diana, la amplificación puede ser necesaria o no antes de la detección. Un experto en la materia reconocerá los procedimientos de detección en los que se prefiere la amplificación de miARN.

Una sonda o cebador puede incluir bases estándares (A, T o U, G y C) o bases modificadas. Las bases modificadas incluyen, pero sin limitación, las bases AEGIS (de Eragen Biosciences). En ciertos aspectos, las bases se unen mediante un enlace fosfodiéster natural o un grupo de enlace químico diferente. Los diferentes grupos de enlace químicos incluyen, pero sin limitación, un enlace peptídico o un grupo de enlace de ácido nucleico bloqueado (LNA).

En un aspecto adicional, las sondas o cebadores oligonucleotídicos presentes en una reacción de amplificación son adecuados para monitorizar la cantidad de producto de amplificación producido en función del tiempo. En ciertos aspectos, para detectar el ácido nucleico se usan sondas que tienen un carácter monocatenario diferente frente a bicatenario. Las sondas incluyen, pero sin limitación, sondas de ensayo de 5'-exonucleasa (p. ej., TaqMan™), balizas moleculares de tallo-bucle, balizas lineales o sin tallo, balizas moleculares de ácido nucleico peptídico (PNA), balizas de PNA lineales, sondas sin FRET, sondas Sunrise™/AmplifluorB™, sondas de tallo-bucle y dúplex Scorpion™, sondas de bucle abultado, sondas de pseudonudo, ciclicones, sonda MGB Eclipse™ (Epoch Biosciences), sondas de horquilla, sondas de iluminación de PNA, sondas de desactivación anticebador, sondas de nanopartículas autoensambladas y sondas modificadas con ferroceno.

En ciertas realizaciones, uno o más de los cebadores en una reacción de amplificación pueden incluir un marcaje. En otras realizaciones más, diferentes sondas o cebadores comprenden marcajes detectables que se distinguen entre sí. En algunas realizaciones, un ácido nucleico, tal como la sonda o el cebador, puede marcarse con dos o más marcajes distinguibles. En algunos aspectos, un marcaje se enlaza con una o más sondas y tiene una o más de las siguientes propiedades: (i) proporciona una señal detectable; (ii) interactúa con un segundo marcaje para modificar la señal detectable proporcionada por el segundo marcaje, por ejemplo, FRET (transferencia de energía por resonancia fluorescente); (iii) estabiliza la hibridación, por ejemplo, formación de dúplex; y (iv) proporciona un miembro de un complejo de unión o conjunto de afinidad, por ejemplo, afinidad, anticuerpo-antígeno, complejos iónicos, haptenoligando (por ejemplo, biotina-avidina). En otros aspectos más, el uso de marcajes se puede lograr usando cualquiera de un gran número de técnicas conocidas que emplean marcajes, grupos de enlace, grupos de unión, reactivos, condiciones de reacción y procedimientos de análisis y purificación conocidos.

Los miARN pueden detectarse mediante procedimientos directos o indirectos. En un procedimiento de detección directa, uno o más miARN se detectan mediante un marcaje detectable que está conectado a una molécula de ácido nucleico. En tales procedimientos, los miARN pueden marcarse antes de unirse a la sonda. Por lo tanto, la unión se detecta mediante el cribado del miARN marcado que se une a la sonda. La sonda está opcionalmente conectada a una perla en el volumen de reacción.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos se detectan mediante unión directa con una sonda marcada y la sonda se detecta posteriormente. En una realización de la invención, los ácidos nucleicos, tales como los miARN amplificados, se detectan usando microesferas FlexMAP (Luminex) conjugadas con sondas para capturar los ácidos nucleicos deseados. Algunos procedimientos pueden implicar la detección con sondas polinucleotídicas modificadas con marcajes fluorescentes o detección de ADN ramificado (ADNram), por ejemplo.

En otras realizaciones, los ácidos nucleicos se detectan mediante procedimientos de detección indirecta. Por ejemplo, se puede combinar una sonda biotinilada con un tinte conjugado con estreptavidina para detectar el ácido nucleico unido. La molécula de estreptavidina se une a un marcaje de biotina en el miARN amplificado, y el miARN unido se detecta detectando la molécula de tinte enlazada con la molécula de estreptavidina. En una realización, la molécula de tinte conjugada con estreptavidina comprende Phycolink® Streptavidin R-Phycoerythrin (PROzyme). Los expertos en la materia conocen otras moléculas de tinte conjugadas.

Los marcajes incluyen, pero sin limitación: compuestos emisores de luz, dispersores de luz y absorbentes de luz que generan o desactivan una señal detectable fluorescente, quimioluminiscente o bioluminiscente. En algunas realizaciones se usa una sonda fluorescente de doble marcaje que incluye un fluoróforo indicador y un fluoróforo desactivador. Se apreciará que se eligen pares de fluoróforos que tengan espectros de emisión distintos para que puedan distinguirse fácilmente.

En ciertas realizaciones, los marcajes son restos estabilizadores de la hibridación que sirven para potenciar, estabilizar o influir en la hibridación de dúplex, p. ej., intercalantes y tintes intercalantes (que incluyen, pero sin limitación, bromuro de etidio y SYBR-Green), compuestos de unión al surco menor y grupos funcionales de reticulación.

En otras realizaciones, se pueden usar procedimientos que se basan en la hibridación y/o ligación para cuantificar miARN, que incluyen procedimientos de ligación de oligonucleótidos (OLA) y procedimientos que permiten que una sonda distinguible que hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana se separe de una sonda no unida. Como ejemplo, se pueden usar sondas similares a HARP para medir la cantidad de miARN. En tales procedimientos, después de la hibridación entre una sonda y el ácido nucleico diana, la sonda se modifica para distinguir la sonda hibridada de la sonda no hibridada. Después de ello, la sonda puede amplificarse y/o detectarse. En general, una región de inactivación de sonda comprende un subconjunto de nucleótidos dentro de la región de hibridación diana de la sonda. Para reducir o prevenir la amplificación o detección de una sonda HARP que no está hibridada con su ácido nucleico diana, y así permitir la detección del ácido nucleico diana, se lleva a cabo una etapa de inactivación de la sonda posterior a la hibridación usando un agente que es capaz de distinguir entre una sonda HARP que se hibrida con su secuencia de ácido nucleico diana y la sonda HARP no hibridada correspondiente. El agente puede inactivar o modificar la sonda HARP sin hibridar de tal modo que no pueda amplificarse.

También se puede usar una reacción de ligación de sonda para cuantificar miARN. En una técnica de amplificación de sonda dependiente de ligamiento múltiple (MLPA), los pares de sondas que hibridan inmediatamente adyacentes entre sí en el ácido nucleico diana se ligan entre sí impulsados por la presencia del ácido nucleico diana. En algunos aspectos, las sondas de MLPA tienen sitios de unión de cebadores de PCR flanqueantes. Las sondas de MLPA se amplifican específicamente cuando se ligan, lo que permite la detección y cuantificación de biomarcadores de miARN.

Se puede calcular un perfil de expresión de miARN basándose en una muestra de un sujeto. En algunas realizaciones, el perfil de expresión de miARN puede usarse para diagnosticar cáncer de próstata y evaluar su agresividad. En algunas implementaciones, el perfil de expresión de miARN de un sujeto puede usarse para predecir la recurrencia bioquímica después de un primer tratamiento para el cáncer de próstata. Por ejemplo, el perfil puede usarse para predecir la recurrencia después de una prostatectomía radical. En otra implementación, el perfil de expresión de miARN de un sujeto puede usarse para predecir la recurrencia bioquímica después de un segundo tratamiento para el cáncer de próstata. Por ejemplo, el perfil puede usarse para predecir la recurrencia después de radioterapia de rescate. En otras realizaciones, se puede usar un perfil de expresión de miARN para evaluar la efectividad de un régimen de tratamiento del cáncer de próstata.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el perfil incluye miARN-137, miARN-1283 o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el perfil incluye al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 de los miARN enumerados en la Tabla 1. Como se divulga en el presente documento, estos miARN están desregulados en el cáncer de próstata y pueden usarse para diagnosticar cáncer de próstata. En particular, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-1283, hsa-miR-221-3p hsa-miR-222-3p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-1253, hsa-miR- 133a, hsa-miR-1 y hsa-miR-143-3p pueden expresarse diferencialmente al menos dos veces menos en células de cáncer de próstata en comparación con células epiteliales; mientras que hsa-miR-137 y hsa-miR-375 pueden expresarse diferencialmente al menos dos veces más en células de cáncer de próstata en comparación con células epiteliales. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además tratar a un sujeto que tiene un perfil indicativo de cáncer de próstata. El tratamiento puede incluir una biopsia para confirmar la existencia y agresividad del tumor de cáncer de próstata.

Un ejemplo de implementación incluye un procedimiento de uso de un perfil de expresión de miARN para predecir la recurrencia bioquímica después de una prostatectomía radical. El perfil puede incluir al menos uno de los miARN enumerados en la Tabla 2, que incluyen al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 u 88 de los miARN enumerados en la Tabla 2. El perfil de expresión de miARN puede usarse para calcular una puntuación de riesgo de recurrencia. En algunos casos, la puntuación de riesgo de recurrencia puede ser una indicación de lo pronto que ocurrirá la recurrencia. Una puntuación de riesgo más alta puede indicar que la recurrencia ocurrirá en una fecha anterior que una puntuación de riesgo más baja. Un alto riesgo de recurrencia puede indicar una recurrencia de 1 a 5 años después de la prostatectomía radical. En otras implementaciones, un alto riesgo de recurrencia indica una recurrencia dentro de los 2-4 años después del tratamiento. En otras implementaciones más, un alto riesgo de recurrencia indica una recurrencia dentro de los 36 meses posteriores a la prostatectomía radical. Si se encuentra que un sujeto tiene una puntuación de riesgo de recurrencia alta, las opciones de tratamiento posteriores pueden incluir radioterapia, terapia adyuvante o, en algunos casos, cuidados paliativos. Si se encuentra que un sujeto tiene una puntuación de riesgo de recurrencia baja, las opciones de tratamiento posteriores pueden incluir un control clínico continuado sin radiación o terapia adyuvante.

Otra implementación ejemplar incluye un procedimiento de uso de un perfil de expresión de miARN para predecir la recurrencia bioquímica después de la radioterapia, tal como radioterapia de rescate. El perfil puede incluir al menos uno de los miARN enumerados en la Tabla 3, que incluyen al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de los miARN enumerados en la Tabla 3. En algunas realizaciones, el perfil puede incluir al menos miARN-601 y miARN-4516. El perfil se puede usar solo o junto con otros parámetros de pronóstico para calcular la puntuación de riesgo de recurrencia después de la radioterapia. Por ejemplo, el perfil se puede usar en combinación con la edad del sujeto, la puntuación de Gleason, el estadio del tumor (pT), la puntuación de los ganglios linfáticos (pN), los niveles de PSA, el estado de resección, la clasificación de D'Amico, los nomogramas de Stephenson o cualquier combinación de los mismos para calcular la puntuación de riesgo recurrente. En algunos casos, la puntuación de riesgo de recurrencia puede ser una indicación de lo pronto que puede ocurrir la recurrencia. Por ejemplo, un alto riesgo de recurrencia puede indicar una recurrencia entre 1 y 5 años después de la radioterapia. En otras implementaciones, un alto riesgo de recurrencia indica una recurrencia dentro de los 2-4 años después del tratamiento. En otras implementaciones más, un alto riesgo de recurrencia indica una recurrencia dentro de los 36 meses después de la radioterapia. Si se encuentra que un sujeto tiene una puntuación de riesgo de recurrencia alta, las opciones de tratamiento posteriores podrían incluir prostatectomía radical, terapia adyuvante o, en algunos casos, cuidados paliativos. Si se encuentra que un sujeto tiene una puntuación de riesgo de recurrencia baja, las opciones de tratamiento posteriores podrían incluir un seguimiento clínico continuado sin prostatectomía radical o prostatectomía radical con monitorización clínica.

Las puntuaciones de riesgo de recurrencia después de prostatectomía radical o radioterapia o se pueden calcular usando procedimientos, modelos y algoritmos matemáticos estándares. En algunas realizaciones, la puntuación de riesgo es un valor de regresión, por ejemplo, donde un valor de regresión de aproximadamente 1 es una indicación de recurrencia. Por ejemplo, el perfil de miARN puede analizarse mediante un análisis de regresión multivariante (p. ej., determinado por regresión lineal), un modelo de regresión de Cox o un análisis de componentes principales para derivar una puntuación de riesgo. En otras implementaciones, el perfil de miARN o los niveles de biomarcadores de miARN específicos pueden usarse junto con otros factores (por ejemplo, edad, niveles de PSA, clasificación de tumores patológicos (pT) y ganglios linfáticos (pN), puntuación de Gleason, estado de resección, clasificación de d'Amico y/o nomogramas de Stephenson) para calcular una puntuación de riesgo de recurrencia. Por ejemplo, el perfil de miARN puede usarse con otros factores para crear nomogramas para predecir la puntuación de riesgo de recurrencia. En otras implementaciones más, se usan biomarcadores de miARN específicos para calcular la puntuación de riesgo de recurrencia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los niveles de miARN en relación con los valores de control se correlacionan negativa/positivamente con la puntuación de riesgo.

En algunas realizaciones, los paneles de miARN contienen numerosos puntos de datos que se gestionan y almacenan mejor en una forma legible informáticamente. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, la puntuación de riesgo es un valor de regresión derivado de los paneles de miARN como una función ponderada del miARN cuantificado. La función ponderada se puede derivar del análisis de regresión lineal de resultados experimentales que comparan miARN de sujetos normales frente a aquellos con cáncer de próstata y/o recurrencia bioquímica. Cada especie de miARN puede multiplicarse por una constante de ponderación y sumarse.

En términos generales, un valor de regresión es un valor único que es sensible a cambios en la abundancia de especies de miARN de un perfil de miARN, siendo un valor de regresión de aproximadamente 1 indicativo de un alto riesgo de recurrencia. Por ejemplo, un valor de regresión de aproximadamente 0 puede ser indicativo de bajo riesgo de recurrencia, mientras que un valor de regresión de aproximadamente 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 y más puede ser indicativo de alto riesgo de recurrencia.

Antes del análisis, los datos de cada conjunto de datos se pueden recopilar midiendo los valores de cada biomarcador de miARN, generalmente por duplicado o triplicado o en múltiples repeticiones. Los datos se pueden manipular, por ejemplo, los datos brutos se pueden transformar usando curvas patrón, y el promedio de mediciones repetidas se usa para calcular el promedio y la desviación estándar para cada paciente. Estos valores pueden transformarse antes de usarse en los modelos, por ejemplo, transformados logarítmicamente, transformados por Box-Cox, etc. Estos datos pueden luego introducirse en un proceso analítico con un parámetro definido.

El proceso de clasificación analítica puede ser cualquier tipo de algoritmo de aprendizaje con parámetros definidos, o en otras palabras, un modelo predictivo. En general, el proceso analítico tendrá la forma de un modelo generado por un procedimiento analítico estadístico tal como los que se describen a continuación. Los ejemplos de tales procesos analíticos pueden incluir un algoritmo lineal, un algoritmo cuadrático, un algoritmo polinomial, un algoritmo de árbol de decisión o un algoritmo de votación. Usando cualquier algoritmo de aprendizaje adecuado, se puede usar una un conjunto de datos de referencia o entrenamiento apropiado para determinar los parámetros del proceso analítico que se usarán para la clasificación, es decir, desarrollar un modelo predictivo. El conjunto de datos de referencia o de entrenamiento que se usará dependerá de la clasificación que se desee determinar. El conjunto de datos puede incluir datos de dos, tres, cuatro o más clases.

El número de rasgos que puede usar un proceso analítico para clasificar un sujeto de prueba con certeza adecuada es 2 o más. En algunas realizaciones, es 3 o más, 4 o más, 10 o más, o entre 10 y 200. Dependiendo del grado de certeza buscado, sin embargo, el número de rasgos usados en un proceso analítico puede ser mayor o menor, pero en todos los casos es al menos 2. En una realización, el número de rasgos que pueden ser usados por un proceso analítico para clasificar un sujeto de prueba está optimizado para permitir una clasificación de un sujeto de prueba con alta certeza.

Se conocen en la materia algoritmos de análisis de datos adecuados. En una realización, un algoritmo de análisis de datos de la divulgación comprende el árbol de clasificación y regresión (CART), el árbol de regresión aditiva múltiple (MART), el análisis de predicción para micromatrices (PAM) o el análisis de bosque aleatorio. Tales algoritmos clasifican espectros complejos de materiales biológicos, tales como una muestra de sangre, para distinguir sujetos como normales o que poseen niveles de biomarcadores característicos de una afección particular (por ejemplo, recurrencia bioquímica). En otras realizaciones, un algoritmo de análisis de datos de la divulgación comprende ANOVA y equivalentes no paramétricos, análisis discriminante lineal, análisis de regresión logística, análisis clasificador del vecino más cercano, redes neuronales, análisis de componentes principales, análisis de conglomerados jerárquicos, análisis discriminante cuadrático, clasificadores de regresión y máquinas de vector de soporte.

Como apreciarán los expertos en la materia, se pueden usar una serie de criterios cuantitativos para comunicar el rendimiento de las comparaciones realizadas entre un perfil de marcador de prueba y perfiles de marcador de referencia. Estos incluyen área bajo la curva (AUC), cociente de riesgo instantáneo (HR), riesgo relativo (RR), reclasificación, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN), precisión, sensibilidad y especificidad, índice de reclasificación neta, índice de reclasificación neta clínica. Además, se pueden usar otras construcciones tales como las curvas operativas del receptor (ROC) para evaluar el rendimiento del proceso analítico.

El riesgo predicho de recurrencia se puede usar para seleccionar una terapia adecuada y tratar más al sujeto. El término “tratamiento” se refiere a la atención médica de un paciente con la intención de curar, mejorar, estabilizar o prevenir una enfermedad, afección patológica o trastorno. Este término incluye el tratamiento activo, es decir, tratamiento dirigido específicamente a la mejora de una enfermedad, afección patológica o trastorno, y también incluye el tratamiento causal, es decir, tratamiento dirigido a eliminar la causa de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados. Además, este término incluye el tratamiento paliativo, es decir, tratamiento diseñado para el alivio de los síntomas en vez de la cura de la enfermedad, afección patológica o trastorno; tratamiento preventivo, es decir, tratamiento dirigido a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados; y tratamiento de apoyo, es decir, tratamiento empleado para complementar otra terapia específica dirigida a la mejora de la enfermedad, afección patológica o trastorno asociados. Por lo tanto, el término "tratamiento" incluye la intervención clínica para alterar o prevenir el desarrollo o la diseminación del cáncer de próstata. El tratamiento puede incluir enfoques quirúrgicos, radioterapia, terapias adyuvantes o tratamientos con ultrasonido, solos o en cualquier combinación. Las terapias o tratamientos quirúrgicos pueden incluir criocirugía, orquiectomía o prostatectomía. La prostatectomía puede incluir la extirpación parcial o total de la glándula prostática. La prostatectomía radical incluye la extirpación de toda la glándula prostática, las vesículas seminales, el tejido cercano y los ganglios linfáticos cercanos. El procedimiento de prostatectomía puede ser retropúbico, suprapúbico, perineal, mínimamente invasivo, con preservación de nervios, laparoscópico o asistido por robot.

Las radioterapias o tratamientos con radiación pueden incluir radioterapia de haz externo o radioterapia interna. La radioterapia de haz externo puede incluir radioterapia conformada tridimensional, radioterapia de intensidad modulada, radioterapia corporal estereotáctica o radioterapia de haz de proteínas. La radioterapia interna (o braquiterapia) puede incluir enfoques permanentes o temporales. Como se usa en el presente documento, la radioterapia de rescate es un tratamiento con radiación que se produce después de una primera ronda de tratamiento para el cáncer de próstata.

Las terapias o tratamientos adyuvantes pueden incluir quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica (que incluye la inmunoterapia), radioterapia o terapia dirigida. Los tratamientos quimioterapéuticos pueden incluir la administración de docetaxel (Taxotere®), cabazitaxel (Jevtana®), mitoxantrona (Novantrone®), estramustina (Emcyt®), doxorrubicina (Adriamycin®), etopósido (VP-16), vinblastina (Velban®), paclitaxel (Taxol®), Carboplatin (Paraplatin®) o vinorelbina (Navelbine®), solos o en cualquier combinación. Las terapias hormonales pueden incluir agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante, antagonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante, inhibidores de CYP17, antiandrógenos o estrógenos.

También se divulga un kit para predecir la recurrencia bioquímica después de una prostatectomía radical. El kit puede incluir un panel de oligonucleótidos configurado para unirse a un grupo de miARN que consiste en los enumerados en la Tabla 2. También se divulga un kit para predecir la recurrencia bioquímica después de un tratamiento con radiación o radioterapia. El kit puede incluir un panel de oligonucleótidos configurado para unirse a un grupo de miARN que consiste en los enumerados en la Tabla 3.

Se han descrito una serie de realizaciones de la invención. Sin embargo, se entenderá que pueden realizarse varias modificaciones sin apartarse del alcance de la invención. Por consiguiente, otras realizaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

EJEMPLO

Ejemplo 1: Un modelo predictivo basado en miARN para la recurrencia bioquímica después de radioterapia de rescate después de prostatectomía

Materiales y Procedimientos

Cohorte de pacientes. En este estudio se usaron bloques de FFPE de 43 pacientes con CaP que se habían sometido a PR (1997-2009) seguida de RT de rescate entre 2005 y 2011 en la Universidad de Friburgo, Alemania. En la Figura 6 se puede encontrar un diagrama de flujo del diseño del estudio. Los pacientes que recibieron RT adyuvante (RT iniciada menos de 6 meses después de la PR) fueron excluidos del análisis. El tiempo de seguimiento tras la RT se definió como superior a 4 años. Se estableció una base de datos clínica que contenía características de los pacientes, la clasificación tumoral según el sistema TNM 2010 de la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC)/Comisión Conjunta Estadounidense contra el Cáncer (AJCC) debido a las fechas de las prostatectomías radicales más tempranas en el estudio, la graduación tumoral según la puntuación de Gleason sin incluir la puntuación terciaria, los detalles del tratamiento de radiación, que incluye las toxicidades, y los detalles de seguimiento, que incluyen las concentraciones de PSA. No hubo diferencias significativas en términos de técnicas de radiación, planificación de la generación de volumen diana, dosis y volúmenes de radiación en la cohorte. Todos los pacientes fueron tratados con 1,8-2,0 Gy por fracción hasta una dosis total de 66,6-74 Gy. El uso de terapia hormonal y radiación de toda la pelvis quedó a criterio del médico tratante. La recurrencia se definió como falla bioquímica (FB) con un aumento de PSA > 0,2 ng/ml al menos dos veces según la recomendación de la AUA o progresión clínica con recurrencia local (fosa prostática), regional (ganglios linfáticos) o distante (metástasis). Se realizaron pruebas de imagen (TC, TEP/TC o gammagrafía ósea) cuando esté clínicamente indicado en casos de FB.

Declaración ética. Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad del Centro Médico de Friburgo y de la Universidad Estatal de Ohio con la renuncia del consentimiento del paciente debido a la naturaleza de archivo del estudio. Además, los datos y las muestras de tejido pertenecientes a este estudio se desidentificaron antes del análisis.

Procesamiento de muestras y aislamiento de ARN. Todos los bloques fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE) fueron revisados por el mismo patólogo especializado en enfermedades genitourinarias y las puntuaciones de Gleason se volvieron a valorar para cada núcleo usando el sistema de clasificación ISUP 2005 (Epstein et al., American Journal of Surgical Pathology, 2005). Se obtuvieron muestras de tejido del banco de tejidos de patología del Centro Médico de la Universidad de Friburgo que incluían tejido de tumor de próstata, epitelio de próstata no neoplásico y estroma de próstata no neoplásico. Las áreas de interés se marcaron sobre un portaobjetos teñido con H&E y se perforaron núcleos de biopsia de 1 mm de diámetro de cada área de interés. Los núcleos del tumor se tomaron del área con la puntuación de Gleason más alta y estaban enriquecidos en tumor. (>70 %).

El ARN total se aisló usando una combinación de tampón de digestión de aislamiento de ácido nucleico total RecoverAll, AM1975, (Life Technologies; Carlsbad, CA) con el kit Qiagen FFPE miRNeasy, n.° de cat. 217504 (Qiagen; Venlo, Limburgo). En resumen, los núcleos se digirieron durante la noche usando tampón de digestión de aislamiento de ácido nucleico total RecoverAll y proteinasa K, lo que condujo a una digestión potenciada del núcleo. Una vez que se digirieron los núcleos (día siguiente), se siguió el manual Qiagen FFPE miRNeasy comenzando a 80 °C durante 15 minutos de incubación. Las concentraciones de ARN se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific; Waltham, MA).

Análisis de expresión de miARN. Para la generación de datos de expresión de miARN, se usó la matriz NanoString human v2, que contiene 800 sondas de miARN. Se analizaron 43 muestras de tumor, 31 de epitelio y 21 de estroma. El análisis de expresión se realizó en la Nucleic Acid Core Facility de la Universidad Estatal de Ohio (Columbus, OH). Se usó un total de entrada de ARN de 100 ng por muestra y las condiciones se establecieron según el protocolo recomendado por el fabricante (NanoString Technologies; Seattle, WA). Los miARN se cuantificaron usando el analizador digital nCounter como recuentos. Los miARN se filtraron del análisis posterior si los recuentos totales eran inferiores a 32 en el 90 % de las muestras. Quedaron cuatrocientos setenta y siete miR después del filtrado. Los datos se normalizaron mediante la media geométrica de todas las dianas usando el software nSolver (NanoString Technologies; Seattle, WA).

Análisis estadísticoPara las comparaciones específicas de tejido, se usaron 31 pares de tumor y epitelio coincidentes, 21 de tumor y estroma coincidentes y 21 de epitelio y estroma. Los datos normalizados de NanoString se analizaron usando el análisis de varianza (ANOVA) con el procedimiento de medidas repetidas. Se usó una comparación por pares para determinar las diferencias de expresión entre el tumor, el estroma y el epitelio.

Para comparar la diferencia en la expresión de miARN entre el tiempo tardío y temprano hasta la primera recurrencia bioquímica después de la PR (36 meses como punto de corte) o entre el tiempo hasta la recurrencia después de la RT de rescate, se usaron pruebas de t de 2 muestras. Para cada miARN, los pacientes se dividieron en grupos altos y bajos basados en la expresión mediana de miARN y se comparó la diferencia en las probabilidades del tiempo hasta la recurrencia (recurrencia después de PR o después de RT de rescate) usando la prueba de rango logarítmico para cada miARN. Se efectuaron análisis multivariantes usando modelos de regresión de riesgos instantáneos proporcionales COX. Se efectuó un análisis de la curva ROC para determinar la capacidad y el nivel de corte de las variables que distinguían entre la recurrencia y la no recurrencia después de RT de rescate. Todos los análisis se efectuaron usando SAS 9.3 (SAS, Inc; Cary, nC) o R 3.0.

Resultados

Perfiles de expresión de miARN específicos de tejido prostático. Para validar miARN conocidos e identificar miARN novedosos regulados diferencialmente en tejido tumoral de próstata y tejidos adyacentes, se analizaron los datos de expresión del tejido tumoral (n= 43) epitelio benigno (n= 31) y estroma (n= 21) de 43 pacientes evaluables usando tecnología NanoString. Como se muestra en la Tabla 4, 45 miARN se expresaron de forma significativamente diferencial 1,5 veces o más en el tumor en comparación con el epitelio; de esos 11 se expresaron diferencialmente más de 2 veces (valor de p < 0,05) (Tabla 1). Ciento ocho miARN se expresaron de forma significativamente diferencial más de 1,5 veces en el tumor en comparación con el estroma, y de esos miARN, 27 se expresaron diferencialmente 2 veces o más (valor de p < 0,05) (Tabla 4). Al comparar las muestras de epitelio y estroma, 84 miARN se expresaron de forma significativamente diferencial más de 1,5 veces, y de esos miARN, 24 se expresaron diferencialmente 2 veces o más (ANOVA, valor de p < 0,05) (Tabla 4). De los miARN expresados de forma significativamente diferencial 1,5 veces o más entre todos los tipos de tejidos, 330 miARN eran similares entre todas las comparaciones (Figura 1).

Las muestras de tumor tenían 7 miARN regulados positivamente y 25 regulados negativamente en comparación con el tejido del epitelio y del estroma, mientras que las muestras de epitelio tenían 5 miARN regulados positivamente y 3 regulados negativamente en comparación con el tumor y el estroma (Figura 1). La Figura 1 es un diagrama de Venn que muestra el número de miARN expresados común y diferencialmente en el tumor de próstata, el estroma y el epitelio. Se muestran los miARN comúnmente expresados entre todos los tipos de tejidos, así como aquellos expresados de forma significativamente diferencial 1,5 veces o más entre todos los tipos de tejidos, usando el ANOVA de mediciones repetidas. Los miARN que estaban regulados positivamente (gris oscuro) y regulados negativamente (gris claro) se identificaron en tejidos específicos, lo que significa que se expresaron diferencialmente 1,5 veces o más en comparación con los otros dos tipos de tejido. Las muestras de estroma parecían ser las más diferentes en comparación con el tumor o el epitelio, con 27 miARN regulados positivamente y 23 regulados negativamente (Figuras 1 y 2). La Figura 2 da los nombres de los miARN que se expresaron diferencialmente 1,5 veces o más entre todos los tipos de tejidos, usando el ANOVA de mediciones repetidas. Se identificó por primera vez que miR-1283 y miR-137 estaban desregulados en el tejido tumoral de próstata en comparación con el epitelio (Tabla 1).

miARN predictivos de recurrencia de PSA después de prostatectomía. Análisis univariante. Se estableció una base de datos clínica para 43 pacientes con CaP que se sometieron tanto a PR como a RT de rescate. Tabla 5. Los factores de riesgo incluían 32,5 % de los pacientes que tenían una puntuación de Gleason de 8 o superior, 25,6 % de los pacientes que tenían invasión de vesículas seminales o extensión extraprostática, y 41,9 % de los pacientes que tenían márgenes positivos. La RT de rescate se inició con un valor mediano de PSA de 0,39 ng/ml. 19 pacientes (44,2 %) experimentaban FB después de la RT de rescate en una mediana de tiempo de 47,7 meses (intervalo 18,4-138,0 meses). La mediana de los tiempos de seguimiento después de la PR y después de la RT de rescate era de 6,9 y 3,7 años, respectivamente.

(continuación)

Usando estos datos, la expresión de miARN se correlacionó con el tiempo hasta la primera recurrencia bioquímica para determinar si los miARN pueden predecir la recurrencia bioquímica después de la PR. El tiempo hasta la primera recurrencia se definió como el tiempo desde la prostatectomía hasta la fecha de inicio de la RT de rescate. Usando solo la expresión tumoral, se identificaron 54 miARN que se expresaban de forma significativamente diferencial 1,5 veces o más entre pacientes que tenían una recurrencia temprana (< 36 meses) frente a tardía (> 36 meses) (Tabla 6 ). Se utilizó treinta y seis meses como punto de corte, ya que estaba cerca de la mediana de tiempo hasta la recurrencia. Para otro enfoque para identificar los miARN que se correlacionaban con el tiempo hasta la primera recurrencia bioquímica, los pacientes se dividieron según la mediana de expresión de miARN. Las probabilidades en el tiempo hasta las primeras recurrencias se compararon entre los dos grupos (expresión de miARN alta frente a baja) usando pruebas de rango logarítmico. Se identificaron ciento veintitrés miARN que podrían diferenciar a los dos grupos en el tiempo hasta la primera recurrencia bioquímica (valor de p < 0,05) Tabla 7.

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

miRNA predictivos de recurrencia de PSA después de prostatectomía: análisis multivariante. Para determinar si los miARN pueden ser marcadores independientes de recurrencia bioquímica después de la PR, se efectuaron dos análisis de regresión de Cox multivariantes usando los 123 miARN identificados como predictores de la recurrencia bioquímica después de la prostatectomía (valor p < 0,05) mediante análisis univariante de rangos logarítmicos de la Tabla 7. El primer análisis multivariante consideró el valor inicial de PSA (continuo) y la puntuación de Gleason; se eliminaron la edad y el estado de resección, ya que no pareció afectar a la recurrencia en el análisis univariante. Tras el análisis de la primera recurrencia usando el análisis de regresión de Cox multivariante, 97 miARN tenían valores de p < 0,05 (Tabla 8 ). En el segundo análisis multivariante, se tuvieron en cuenta diferentes factores clínicos. Se examinaron de forma independiente tres covariables clínicas, la puntuación de D'Amico, la puntuación de Stephenson (categórica) y la puntuación de Stephenson (continua), respectivamente, para identificar los miARN asociados con el tiempo hasta la primera recurrencia. Los miARN se retiraron de análisis posteriores si no se obtenía un valor p significativo (< 0,05) en ninguno de los tres análisis, lo que dio como resultado 88 miARN que se asociaron estadísticamente con el tiempo hasta la primera recurrencia después del análisis multivariante (Tabla 2). Los pacientes se clasificaron en dos grupos usando un análisis de conglomerado jerárquico no sesgado para los 88 miARN seleccionados (Figura 3A). Para las Figuras 3A-3B, se efectuó un análisis de conglomerados usando los 88 miARN estadísticamente significativos predictivos de la primera recurrencia bioquímica mediante el análisis multivariante de regresión de Cox (puntuación de D'Amico, puntuación de Stephensen (categórica) y puntuación de Stephensen (continua)). La Figura 3A demuestra cómo esta firma parece diferenciar entre pacientes con recurrencia temprana (< 36 meses) frente a aquellos con recurrencia tardía (> 36 meses). La Figura 3B muestra los gráficos de Kaplan-Meier que se generaron usando los dos grupos de conglomerados. El conglomerado 1, el conglomerado de la izquierda, es el grupo de recurrencia temprana. El conglomerado 2, el conglomerado de la derecha, es el grupo de recurrencia tardía. El procedimiento de Kaplan-Meier mostraba que las probabilidades en el tiempo hasta la primera recurrencia bioquímica eran significativamente diferentes entre los dos grupos de pacientes con firmas de miARN distintas (rango logarítmico, p= 0,005).

continuación

continuación

miARN predictivos de la recurrencia de PSA después de RTde rescate. Análisis univariante. Los miARN que podrían predecir la recurrencia bioquímica después del tratamiento de RT de rescate son de sumo interés. En este momento, ningún estudio ha examinado los miARN asociados con los resultados clínicos después de la radiación de rescate después de PR. La recurrencia después del tratamiento con radiación de rescate (también denominada 2a recurrencia) se definió como un aumento del PSA a > 0,2 ng/ml al menos dos veces consecutivas después del nadir (Cookson et al., Journal of Urology, 2007). En la cohorte de pacientes, 19/43 pacientes experimentaban recurrencia bioquímica después de la radioterapia de rescate, Tabla 5. Además, usando solo la expresión de miARN tumoral, se identificaron 4 miARN que se expresaron significativamente 1,5 veces o más en los pacientes que experimentaban una segunda recurrencia en comparación con los que no (valor de p < 0,05) (Tabla 9). En el análisis univariante de rango logarítmico, se identificaron 24 miARN que podrían predecir los que recurrían por segunda vez después de la RT de rescate de los que no recurrían (valor de p < 0,05) (Tabla 10).

miARN predictivos de la recurrencia de PSA después de RT de rescate: análisis multivariante. De manera similar, para determinar si los miARN pueden predecir de forma independiente la recurrencia bioquímica después de RT de rescate, se efectuaron análisis de regresión de Cox multivariantes usando los 24 miARN que estaban significativamente asociados (valor p < 0,05) con recurrencia después de RT de rescate mediante análisis univariante de rango logarítmico (Tabla 10). Debido al pequeño tamaño de la muestra y al número de eventos, solo se examinaron dos covariables en el análisis multivariante. El análisis multivariante se efectuó usando el estado de los ganglios linfáticos y la puntuación de Gleason (estos factores se eligieron por tener los valores de p más bajos en el análisis univariante como se muestra en la (Tabla 11), lo que condujo a la identificación de 9 miARN que predicen la recurrencia bioquímica después de RT de rescate (Tabla 3).

Efecto predictivo de miR-601 miR-4516 y desarrollo de un modelo de RT de rescate predictivo basado en miARN.El estado de los ganglios linfáticos, la puntuación de Gleason y los 9 miARN se usaron como covariables en un modelo de regresión COX y se usó una estrategia de selección del modelo por etapas para capturar miARN que podrían ser buenos candidatos para predecir la recurrencia bioquímica después de RT de rescate. El modelo seleccionó los dos miARN, miR-601 y miR-4516 solos y junto con la puntuación de Gleason y el estado de los ganglios linfáticos. La Figura 4 muestra el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC) de un modelo de RT de rescate predictivo basado en miARN. La curva se generó usando el procedimiento de estimación del vecino más cercano (Heagerty et al. Biometrics, 2000). Específicamente, las curvas de AUC se generaron usando un modelo de regresión de Cox por etapas para determinar una firma predictiva de la recurrencia bioquímica después de radioterapia de rescate. Se encontró que el AUC para los ganglios linfáticos y la puntuación de Gleason era de 0,66, la adición de miR-601 y miR-4516 aumentaba el AUC a 0,83 (Figura 4). Curiosamente, cada miARN solo (AUC de miR-601= 0,77 y AUC de miR-4516= 0,68) o juntos (AUC de miR-601 miR-4516= 0,76) (Figura 4) tenía una mejor capacidad predictiva que la combinación de ganglios linfáticos positivos junto con la puntuación de Gleason (Figura 4).

La Figura 5 es un gráfico de Kaplan-Meier que muestra estimaciones del modelo de RT de rescate predictivo basado en miARN. El gráfico se generó usando el modelo de miR-4516 miR-601 puntuación de Gleason estado de los ganglios linfáticos para la recurrencia bioquímica después de radioterapia de rescate. Usando la puntuación de riesgo mediana generada por este modelo (miR-4516, miR-601, puntuación de Gleason y estado de los ganglios linfáticos), los pacientes se clasificaron en grupos de alto o bajo riesgo. Se encontró que las probabilidades de recurrencia después de RT de rescate de los dos grupos eran significativamente diferentes (rango logarítmico, p < 0,001).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para predecir la recurrencia bioquímica en un sujeto después de una prostatectomía radical, que comprende

a) determinar un perfil de expresión de miARN a partir de una muestra del sujeto que incluye al menos miR-107; y

b) calcular una puntuación de riesgo de recurrencia a partir del perfil de expresión de miARN; donde una puntuación de riesgo de recurrencia alta es una indicación de recurrencia bioquímica dentro de 1 a 5 años.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además graduar un tumor según una puntuación de Gleason y usar la puntuación de Gleason como covariable para calcular la puntuación de riesgo de recurrencia.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además determinar una o más propiedades de un tumor que incluyen la edad del sujeto, los niveles de PSA, la clasificación de los ganglios linfáticos (pN), la clasificación patológica del tumor (pT), el estado de resección, la clasificación de D'Amico y/o nomogramas de Stephenson y el uso de una o más propiedades como covariables para calcular la puntuación de riesgo de recurrencia.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además seleccionar un tratamiento basado en la puntuación de riesgo de recurrencia.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende tratar al sujeto mediante prostatectomía radical o radioterapia, si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende seleccionar tratar al sujeto con cuidados paliativos si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende tratar al sujeto con una terapia adyuvante si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la terapia adyuvante comprende quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica, radioterapia o una combinación de las mismas.

9. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende tratar al sujeto con radioterapia de rescate si la puntuación de riesgo de recurrencia es alta.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la radioterapia de rescate comprende radioterapia de haz externo o radioterapia interna.

11. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende una monitorización clínica continuada si la puntuación de riesgo de recurrencia es baja.