CN117487937B

CN117487937B - miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用

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Publication number: CN117487937B
Application number: CN202410003758.4A
Authority: CN
Inventors: 方晨; 王嘉慧; 马鲁豫; 严江伟; 周鹏; 李杨; 王郡; 杨彭逸; 燕泽宇; 孙萌忆; 李敏; 孟德萍; 许晓群; 于春江; 王昕宇; 熊若彤; 赵财成; 张佳; 魏然; 纪璇
Original assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Current assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date: 2024-01-03
Filing date: 2024-01-03
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2044-01-03
Also published as: CN117487937A

Abstract

本发明提供了miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用，属于基因工程诊断技术领域。本发明对牙齿样本开发了miRNA提取和荧光定量PCR方法，经上述方法分别得出miR‑22‑3p和miR‑29a‑3p的相对表达量，以kNN模型分析出miR‑22‑3p和miR‑29a‑3p的相对表达量与预测年龄的对应关系，得出样本的预测年龄。本发明应用方法具有高检测灵敏度的特点，仅需要0.05ng的牙齿miRNA即可实现年龄预测，能够对20~70岁人群的牙齿样本进行年龄预测，误差在4.5岁以内。

Description

miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用

技术领域

本发明属于基因工程诊断技术领域，具体涉及miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用。

背景技术

法医学年龄推断在司法审判、个体识别、国际移民、儿童领养、竞技体育等多个领域具有重要意义。在刑事案件中，对年龄不详的个体进行法医学年龄推断将直接影响刑罚的定性量刑，并有助于刻画身份不明个体的生物特征。年龄推断指标、方法和参考样本的正确选择将直接影响年龄推断的准确性和可靠性。DNA甲基化作为衰老相关的生物标志物之一，被广泛研究。近年来，随着DNA甲基化检测技术的发展，年龄相关的甲基化位点得到了更多的研究，进一步提高了个体年龄推断的准确性和灵敏度。然而DNA的数量和复杂的亚硫酸盐转化过程使得该方法在痕量或降解样品中应用困难。

牙齿在年龄推断中具有重要意义，因为牙齿抗性强、保存时间长，受内外因素影响小，在犯罪现场容易留下，对案件定性具有重要意义。目前牙龄推断的主要方法包括基于形态学方法、影像学方法以及组织学与胚胎学方法。然而，这些方法在准确度和应用范围上存在一些局限性。对于牙齿年龄推断，存在基于牙髓、牙体长度和宽度的测量，但其误差较大，有待进一步研究确定是否在可接受范围内。还有基于牙冠指数、牙髓和牙体面积的测量，性别可能对结果产生影响。此外，基于牙髓和牙体容积的测量提高了空间分辨率和准确性。

发明内容

本发明提供了miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用，本发明检测方法所需样本量少，精确度高，耗时短，可对20~70岁人群的牙齿样本进行年龄预测，误差在4.5岁以内。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用，所述miRNA标志物组合为牙齿中的miR-22-3p和miR-29a-3p。

本发明提供利用所述miRNA标志物组合预测年龄的方法，包括如下步骤：（1）提取样本牙齿miRNA，反转录得cDNA；（2）对获得的cDNA进行PCR扩增，计算得Ct值，以U6作为内参，计算得△Ct^样本；（3）以20~30年龄段样本作为对照组，按照步骤（1）和（2）方法计算出△Ct^对照；

（4）根据基因相对表达量=2^{-（△Ct 样本-△Ct 对照）}计算出miRNA的相对表达量；

（5）对miRNA的相对表达量用kNN模型进行数据拟合分析，得出预测年龄。

优选的，所述产品包括试剂、芯片、试纸和试剂盒。

优选的，在提取miRNA时，需要利用磨牙器将牙齿粉碎，取牙髓用于后续试验。

优选的，对牙髓的处理步骤包括：于牙髓中加入0.5~1.5mL裂解液和8~12μL蛋白酶k，加热震荡1.5~2.5h。

优选的，进行反转录时，miRNA浓度定为480~520µg/L。

优选的，所述PCR反应体系为：总体积20µL，10µL 2×miRcute增强型miRNA预混液、0.4µL正向引物、0.4µL反向引物、1µL cDNA模板溶液、8.2µL 双蒸水。

优选的，所述PCR反应条件为：95℃ 15min，94℃ 20s，64℃ 30s 5循环，72℃ 34s，94℃ 20s 40循环，60℃ 34s。

优选的，所述kNN模型基于Orange软件和训练集中miR-22-3p和miR-29a-3p基因相对表达量和实际年龄构建得到。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明应用方法针对牙齿样本开发了miRNA提取和荧光定量PCR方法，得出PCR分析数据，然后基于两种miRNA（miR-22-3p和miR-29a-3p）的PCR数据采用kNN模型分析出预测年龄，该方法具有高检测灵敏度的特点，仅需要0.05ng的牙齿miRNA即可实现年龄预测，能够对20~70岁人群的牙齿样本进行年龄预测，误差在4.5岁以内。

本发明应用方法的分析效率高，miRNA提取和荧光定量PCR的完成时间只需3h，一次检测最多可分析96个样本，缩短了检测实验时间。该应用方法的成本低，每个样本的检测成本在100元以内。

具体实施方式

本发明提供了miRNA标志物组合在制备预测年龄产品中的应用，所述miRNA标志物组合为牙齿中的miR-22-3p和miR-29a-3p。本发明所述miR-22-3p和miR-29a-3p的基因是从牙髓中提取得到的。

本发明提供了利用所述miRNA标志物组合预测年龄的方法，包括如下步骤：（1）提取样本牙齿miRNA，反转录得cDNA；（2）对获得的cDNA进行PCR扩增，计算得出Ct值，以U6作为内参，计算得出△Ct^样本；（3）以20~30年龄段样本作为对照组，按照步骤（1）和（2）方法计算出△Ct^对照；（4）根据基因相对表达量=2^{-（△Ct 样本-△Ct 对照）}计算出miRNA的相对表达量；（5）对miRNA的相对表达量用kNN模型进行数据拟合分析，得出预测年龄。本发明通过优化miRNA提取、逆转录和PCR扩增以及模型预测，缩短了检测时间。

在本发明中，为避免牙齿上粘连的血液等体液造成污染，在提取miRNA时，需要利用磨牙器将牙齿粉碎，取牙髓用于后续试验。本发明对牙髓的处理步骤包括：于牙髓中加入0.5~1.5mL裂解液和8~12μL蛋白酶k，加热震荡1.5~3.5h。本发明所述裂解液和蛋白酶K能够破坏牙髓的原本结构，使miRNA充分暴露，便于后续提取。本发明所述裂解液和蛋白酶k未经特殊说明，可通过本领域熟知的商业渠道购买即可。

在本发明中，进行反转录时，miRNA浓度定为480~520µg/L，优选为500µg/L。本发明进行反转录的反转录体系为：10µL 2×miRNA荧光定量反应缓冲液（2×miRNA RT ReactionBuffer）、2µL miRNA荧光定量酶混合液（miRNA RT Enzyme Mix）、2µL总RNA模板、6µL 无核糖核酸酶双蒸水；反转录反应条件为：42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 5min。本发明得到的反转录产物分装后放于-20℃保存。

在本发明中，针对miR-22-3p，PCR扩增所用的正向引物为gcgctgccagttgaagaactgt（SEQ ID No.1），反向引物来源于miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，购自天根生化科技（北京）有限公司)；针对miR-29a-3p，PCR扩增所用的正向引物为gcgcgcaccatctgaaatcggt（SEQ ID No.2），反向引物来源于miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，购自天根生化科技（北京）有限公司)；针对内参U6，PCR扩增所用的正向引物为has-U6荧光定量PCR引物（购自天根生化科技（北京）有限公司，CD201-0145），反向引物来源于miRcute增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒(SYBRGreen，购自天根生化科技（北京）有限公司)。本发明所述内参U6购自天根生化科技（北京）有限公司。

在本发明中，PCR反应体系为：总体积20µL，10µL 2×miRcute增强型miRNA预混液（SYBR&ROX)、0.4µL正向引物、0.4µL反向引物、1µL cDNA模板溶液、8.2µL双蒸水；PCR反应条件为：95℃ 15min，94℃ 20s，64℃ 30s 5循环，72℃ 34s，94℃ 20s 40循环，60℃ 34s。本发明所述PCR为荧光定量PCR，PCR试验结束后可计算样本的miR-22-3p、miR-29a-3p和U6的Ct值。

在本发明中，将荧光定量PCR测定出的miR-22-3p、miR-29a-3p和U6的Ct值通过上述公式计算得出的miR-22-3p和miR-29a-3p的基因相对表达量，利用kNN模型进行数据拟合分析。本发明所述kNN模型是基于Orange软件和训练集中miR-22-3p和miR-29a-3p基因相对表达量和实际年龄构建得到。本发明所述训练集为确定年龄的20例华北地区健康男性牙齿样本。本发明利用kNN模型进行数据拟合训练的参数为邻居数（Number of neighbors）：5；度量（Metric）：欧几里得度量（Euclidean）；权重（Weight）：统一（Uniform）。本发明对数据和模型分析采用了Orange软件评估分析。

在本发明中，利用构建好的kNN模型进行年龄预测分析的包括如下步骤：（1）进入Orange软件操作页面，文件（1）处导入测试数据（miR-22-3p和miR-29a-3p的基因相对表达量）；（2）双击kNN模型，即可弹出参数调整页面，设定参数为参数为邻居数（Number ofneighbors）：5；度量（Metric）：欧几里得度量（Euclidean）；权重（Weight）：统一（Uniform）；（3）选择对测试数据进行测试（Test on test data），即可利用训练好的模型对测试集数据做预测；（4）双击预测（Predictions），即可得出测试集预测的实际结果，即得预测年龄。

在本发明中，若无特殊说明，所有的组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1. 牙齿miR-22-3p和miR-29a-3p基因的提取

在收集到牙齿材料之后，即可进行miR-22-3p和miR-29a-3p基因的制备工作。若需暂时储存，则应以放置于阴凉通风处。

（1）利用磨牙器将牙齿粉碎，取牙髓置入无核糖核酸酶管中。

（2）在上述管中，加入1mL裂解液（购自天根生化科技（北京）有限公司）和10μL蛋白酶k（购自碧云天生物技术）水浴震荡加热摇晃3h。

（3）室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

（4）室温12000rpm(~13400×g)离心10min，取上清，转入一个新的无核糖核酸酶的离心管中。

（5）加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。

（6）室温12000rpm(~13400×g)离心15min，样本分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，把水相转移到新管中。

（7）量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇，混匀；将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12000rpm(~13400×g)离心30，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。

（8）量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀；将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12000rpm(~13400×g)离心30s，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。

（9）向吸附柱miRelute中加入500μL去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12000rpm(~13400×g)离心30s，弃废液。

（10）向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW室温静置2min，室温12000rpm(~13400×g)离心30s,弃废液后重复一次上述步骤。

（11）将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12000rpm(~13400×g)离心1min，去除残余液体。

（12）将吸附柱miRelute转入一个新的无核糖核酸酶1.5ml离心管中，加25μL 无核糖核酸酶双蒸水，室温放置2min，室温12000rpm(~13400×g)离心2min，得溶液。

2. 反转录反应

（1）使用分光光度计检测上述所得溶液浓度，并将miR-22-3p和miR-29a-3p浓度定在500µg/L。

（2）配置20µL反转录反应体系：10µL 2×miRNA荧光定量反应缓冲液（购自天根生化科技（北京）有限公司）、2µL miRNA荧光定量酶混合液（购自天根生化科技（北京）有限公司）、2µL总miR-22-3p或miR-29a-3p基因溶液、6µL 无核糖核酸酶双蒸水。

（3）按以下条件进行反转录反应：42℃ 60min，95℃ 5min，4℃ 5min。

（4）反转录产物分装后放于-20℃保存。

3. PCR反应

（1）取适量cDNA，用无菌去离子水稀释10倍。

（2）配置20µL的PCR反应体系：10µL 2×miRcute增强型miRNA预混液(SYBR&ROX)，0.4µL正向引物，0.4µL反向引物，1µL cDNA模板溶液，8.2µL 双蒸水；该过程中涉及的正向引物见表1，反向引物为试剂盒miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)（购自天根生化科技（北京）有限公司）。

（3）使用荧光定量PCR仪完成实验，PCR反应实验按以下条件进行：

95℃ 15min，94℃ 20s，64℃ 30s 5循环，72℃ 34s，94℃ 20s 40 循环，

60℃ 34s。

（4）实验结束后计算每个样本的miR-22-3p、miR-29a-3p的Ct值。

（5）采用上述方法计算出内参U6（购自天根生化科技（北京）有限公司）的Ct值。

表1 PCR引物

基因	正向引物
		miR-22-3p	gcgctgccagttgaagaactgt（SEQ ID No.1）
miR-29a-3p	gcgcgcaccatctgaaatcggt（SEQ ID No.2）
		U6	has-U6荧光定量PCR引物（购自天根生化科技（北京）有限公司，CD201-0145）

4. PCR结果分析

通过荧光定量PCR得到每组的Ct，其中U6作为内参照；△Ct^样本=Ct^{miR-22-3p或miR-29a-3p}-Ct^U6，按照如下公式对不同组间的基因相对表达量进行计算：基因相对表达量=2^{-（△Ct 样本-△Ct 对照）}。

其中miR-22-3p和miR-29a-3p的△Ct^对照获得：选取了20岁、21岁、24岁、25岁、26岁、27岁、28岁华北地区健康男性各一例牙齿样本，采用上述方法得出各例的Ct值，基于U6内参的Ct值，以公式△Ct=Ct^{miR-22-3p或miR-29a-3p}-Ct^U6计算出7例样本的△Ct，上述7例△Ct值的均值为△Ct^对照值，在计算相对表达量时直接使用即可。结果如下表2。

表2 miR-22-3p和miR-29a-3p的△Ct^对照值

miRNA	△Ct^对照
		miR-22-3p	0.678909421
miR-29a-3p	6.020330407

实施例2 年龄预测

（1）选择确定年龄的20例华北地区健康男性牙齿样本，统计其实际年龄，利用实施例1的方法计算得出各样本中miR-22-3p、miR-29a-3p和U6分别对应的Ct值，结果见表3。由该表数据结合实施例1中的△Ct^对照值和公式计算出各样本中miR-22-3p和miR-29a-3p的相对表达量。

表3 20例样本的Ct值

（2）基于步骤（1）得出的miR-22-3p和miR-29a-3p的相对表达量，应用Orange软件评估支持向量机（SVM）算法、迭代算法（AdaBoost）、随机森林（Random Forest）算法、k-邻近（kNN）算法、决策树（Tree）模型、梯度提升（Gradient Boosting）算法。年龄参数调整采用20倍交叉验证，所有模型最终都使用验证(盲)子集进行验证。为了评估不同的统计模型，使用平均绝对误差(MAE)分析比较残差。评估结果见表4。由表4结果可知，kNN模型的效果最好，误差为4.47岁，R²值达到0.899。

表4 不同机器学习模型拟合数据评估结果

（3）选择10例确定年龄的华北地区健康男性，以上述训练集构建的kNN模型作为预测年龄的评估模型。根据实施例1所述步骤得出该10例样本的miR-22-3p和miR-29a-3p的相对表达量，输入至上述评估好的kNN模型数据库中，设定利用kNN进行数据拟合参数为邻居数（Number of neighbors）：5，度量（Metric）：欧几里得度量（Euclidean），权重（Weight）：统一（Uniform），即可得出预测年龄，结果如表5。由表5结果可知，经该方法预测的样本年龄与实际年龄相似，得出平均误差为4.28，与上述评估kNN模型得出的误差相近，表明该预测方法具有良好的稳定性和灵敏度，可用于年龄预测。

表5 10例样本年龄预测统计结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用miRNA标志物组合预测年龄的方法，其特征在于，

所述miRNA标志物组合为牙齿中的miR-22-3p和miR-29a-3p；

所述利用miRNA标志物组合预测年龄的方法包括如下步骤：

（1）将牙齿粉碎，取牙髓，提取牙髓中的miRNA，反转录得cDNA；

（2）对获得的cDNA进行PCR扩增，计算得Ct值，以U6作为内参，以公式△Ct^样本=Ct^miR ^{-22-3p或miR-29a-3p}-Ct^U6计算得出△Ct^样本；

（3）以20~30年龄段样品作为对照组，按照步骤（1）和（2）方法计算出△Ct^对照；

（4）根据基因相对表达量=2^{-（△Ct 样本-△Ct 对照）}计算出miR-22-3p或miR-29a-3p的相对表达量；

（5）基于miR-22-3p和miR-29a-3p的相对表达量用kNN模型进行数据分析，得出预测年龄；

所述步骤（1）中对牙髓的处理步骤包括：于牙髓中加入0.5~1.5mL裂解液和8~12μL蛋白酶k，加热震荡1.5~3.5h；

所述步骤（1）中进行反转录时，miRNA浓度定为480~520µg/L；

所述步骤（5）中的具体步骤包括：将步骤（4）计算出的miR-22-3p和miR-29a-3p相对表达量，输入至kNN模型数据库中，设定利用kNN进行数据拟合参数为邻居数：5，度量：欧几里得度量，权重：统一，即可得出预测年龄；

所述kNN模型基于Orange软件和训练集中miR-22-3p和miR-29a-3p基因相对表达量和实际年龄构建得到。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：总体积20µL，10µL 2×miRcute增强型miRNA预混液、0.4µL正向引物、0.4µL反向引物、1µL cDNA模板溶液、8.2µL双蒸水。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃ 15min，94℃ 20s，64℃ 30s 5循环，72℃ 34s，94℃ 20s 40循环，60℃ 34s。