CN109055541B - Ad所致mci诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种AD所致MCI诊断标志物，所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa‑miR‑1185‑2‑3p、hsa‑miR‑22‑5p、hsa‑miR‑134‑3p、hsa‑miR‑1909‑3p和hsa‑miR‑107。本发明还涉及该标志物的应用及相应的试剂盒。本发明的有益效果在于：首次发现了对AD所致MCI具有较高诊断价值的生物标志物，突破了无便捷的AD所致MCI的外周血浆诊断标志物的困境，有利于对阿尔茨海默病俗称老年性痴呆的早期诊断和早期干预。

Description

AD所致MCI诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及阿尔茨海默病的前驱期技术领域，特别涉及诊断标志物技术领域，具体是指一种AD所致MCI诊断标志物及其应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)俗称老年性痴呆，是以大脑淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积和高度磷酸化Tau蛋白所致微管结构紊乱所形成的神经元纤维缠结为主要病理特征的神经退行性疾病。AD已成为老年人的常见病、多发病和高负担疾病。AD是一种慢性、非传染性、与年龄相关的复杂病因所致的神经退行性疾病。自1906年德国精神科医生阿尔茨海默首次报道病以来的100多年的时间里，该病从罕见病或少见病已成最常见的老年期痴呆类型，约占50％～70％，是老龄化社会的四大死因之一。流行病学研究表明，60岁以上老年人群的患病率为3～5％，每增加5岁，患病率增加1倍，80岁以上可达20％，90岁以上可达50％。据保守估算，我国目前至少有600万AD患者，到2020年将超过1000万患者。AD医疗和护理负担非常沉重，直接和间接医疗费用都很高，例如，在美国每位中晚期AD病人的年平均医疗护理费用高达5万美元，比未患AD的老年人的医疗护理费用增加2倍。据统计，2010年全球用于痴呆的医疗费用高达6040亿美元，占同期全球国民生产总值的1％。随着我国老龄化的加速，尤其是高龄老年人口绝对数增大，由AD所带来的医疗护理和经济负担问题会越来越严峻。因此，积极开展AD的早期预防、早期诊断和早期治疗，从而减轻医疗护理负担是老龄化社会必须解决的医疗卫生和社会经济课题。

近20年来，AD的诊断研究取得了长足的发展。研究表明，利用现代诊疗技术，如大脑老年斑成像及脑脊液病理标志物检测，可以在AD出现明显临床症状的20多年前就可以检测到大脑的神经生化和神经病理变化。但是老年斑成像检测非常昂贵且国内并无临床应用，同时由于传统的观念及相对严重的有创操作使脑脊液检查也不能实际应用于临床的早期诊断，再者脑结构性影像检查并不能早期发现尤其是AD所致MCI的特征性变化，因此实际上国内并无临床上可推广实际应用的临床生物标志物早期诊断方法。在2011年美国国立衰老研究所和阿尔茨海默病协会新修订的诊断标准(NIA-AA)中，对AD病理生理过程与其所致的临床症状进行了重新定义，正式确定无症状期AD(preclinical AD)、AD所致轻度认知损害期(mild cognitive impairment due to AD)和AD所致痴呆期(dementia due to AD)三个不同阶段的诊断标准。流行病学研究表明，MCI的患病率约为15％～17％，每年有10％～15％进展为AD，正常老人的年发病率约为1％。MCI是早期干预的高危人群，也是早期预防干预的最佳切入点。

近10年来，一些针对AD病理机制的治疗研究遭遇了重大挫折，备受瞩目的药物包括Aβ单克隆抗体Bapineuzumab和Solanezumab等和抗Tau蛋白药物LMTXIII期临床试验均以失败告终。以上结果说明了AD发病机制的复杂性，也提示AD发病机制研究领域存在巨大的机遇。我们注意到BACE1在Aβ病理性剪切过程中的重要作用，近年来研究发现，Aβ的沉积远远早于痴呆症状的产生，我们的研究提示微小RNA(microRNA，miRNA)的遗传调控异常是其中的关键环节。hsa-miR是真核生物中一类19-23个核苷酸组成的小分子单链RNA，隶属于非编码RNA(non-coding RNA)大家族并可在转录后水平调控基因表达的重要小分子，不仅在脑组织中含量丰富，亦可稳定存在于脑脊液及血浆、血清样本中，对神经系统的发育和突触可塑性的形成起着重要的作用。hsa-miR是从初级转录物(pri-miRNA)产生的，pri-miRNA被RNase III Drosha加工为含茎-环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，之后在Dicer(一种RNaseIII)的作用下，发夹状的pre-miRNA在细胞质中进一步被切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。miRNA引导miRNP到达它们的靶mRNA，然后发挥遗传调节功能。

已有研究表明，hsa-miR功能异常与AD病理过程的启动及进展有关。hsa-miR与AD目标基因的3’UTR结合后通过限制翻译启动或促使目标基因裂解而限制了转录后表达。有关hsa-miR在AD发生发展中的调节与功能研究大多以β淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-siteAPP cleaving enzyme 1，BACE1)的3’端UTR区为靶基因位点。尸体脑研究结果表明某些hsa-miRs的表达变化通过其靶目标与与阿尔茨海默病的病理通路相联系。此外，研究发现BACE1除了剪切APP发挥酶功能外还能够破坏细胞生成蛋白激酶A(PKA)——脑中一种引导细胞代谢的蛋白——功能所需的其他分子，损伤神经元功能。特别是近年来研究发现，Aβ的沉积远远早于痴呆症状的产生，这表明Aβ不仅仅参与了AD的发展过程，更是AD发生的种子和诱因。hsa-miR诱导BACE1的表达或活性产生变化在其中的作用尤其突出。对于不同阶段AD患者脑组织RNA进行分析，发现AD疾病进程中miRNA107表达不同程度的减少，BACE1表达增加，从而出现相应的病理改变。该研究认为miRNA107可通过与靶基因BACE1mRNA的3’端UTR区结合调控BACE1的表达，进而影响相关蛋白生成。另有不同研究者的研究结果分别聚焦于miRNA124、micRNA15、miRNA195、miRNA19、miRNA298、miRNA328等miRNAs在AD发病过程中的作用，认为这些miRNAs也部分调控了AD病理的发生发展。

在人体生物标本中，血液是最容易获取、操作最简单、创伤最小、患者承担风险和痛苦最轻的样本之一。血液被认

为是最适合用于筛选AD高危人群，对AD进行早期发现、诊断和治疗干预随访的生物样本。hsa-miR已被证明在人血浆或血清中能够以非常稳定的形式存在，它的结构赋予了它免受内源性RNase酶活性的影响而被检测到并成为稳定的AD诊断血浆标志物的能力。申请人的hsa-miR研究结果提示外周血数个遗传标志物hsa-miR表达在AD所致MCI与正常对照(Normal Control,NC)之间存在明显的差异，可以将检测血浆miRNA的表达水平作为一种筛查性诊断AD的常规手段，优化临床AD诊断策略。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够有效筛查诊断AD、优化临床AD诊断策略的AD所致MCI诊断标志物及其应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种AD所致MCI诊断标志物，具有如下构成：

所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107。

本发明还提供了一种AD所致MCI诊断标志物在制备AD所致MCI诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种AD所致MCI诊断试剂盒，所述的试剂盒测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的含量。

较佳地，所述的试剂盒中包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的引物和探针。

较佳地，所述的试剂盒中含有内参has-miR-93-5p。

较佳地，所述的试剂盒所测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的含量代入的计算公式为：

7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。

所述AD所致MCI诊断试剂盒的使用方法，包括步骤：

(1)从待测试样品中提取总RNA；

(2)将提取得到的总RNA使用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；

(3)将得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以has-miR-93-5p为内参，检测结果以△Ct表示，其中△Ct＝Ct microRNA－Ct has-miR-93-5p；

(4)将得到的结果代入以下公式中：

7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107；

将计算值与0.174比较。

采用本发明的有益效果在于：通过广泛的文献阅读及综述，一方面从公开发表的文献中筛选可能具有临床早期诊断和鉴别诊断AD所致MCI价值的标志物，另一方面通过严谨的试验和统计分析，首次发现了对AD所致MCI具有较高诊断价值的生物标志物hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p以及hsa-miR-107的五个核酸分子的组合。通过对microRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，突破了无便捷的AD所致MCI的外周血浆诊断标志物的困境，有利于对阿尔茨海默病俗称老年性痴呆的早期诊断和早期干预。同时有希望极大的推进发现具有潜在治疗价值新型抗AD治疗药物靶标提供科学依据和临床支撑。

附图说明

图1为本发明的鉴定AD所致MCI患者靶血浆的microRNA组合芯片筛选、训练和验证实验设计流程图。

图2为确定本发明的诊断AD所致MCI患者血浆microRNA组合的主要方法步骤图。

图3为逻辑回归模型、训练集和验证集的ROC曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。

结合图1～3，对本发明提供的AD所致MCI诊断标记物的筛选、验证等进行具体说明。

一、研究对象

受试者为在上海市长宁区社区和徐汇区社区收集的50例AD所致MCI老年病例，对照组为年龄、性别、受教育年数匹配的健康老人。

二、研究方法

1、芯片筛选

(1)使用TRIzol法提取RNA，并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)纯化。使用NanoDropND-1000测量纯化后的RNA浓度，电泳检测RNA完整性。

(2)抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat#208032-A,Exiqon)对miRNA进行标记。标记完成后，将样品与miRCURYTM LNA Array(v.19.0)(Exiqon)芯片杂交，反应总体积为50ul(样品25ul和杂交缓冲液25ul)，95℃下变性2分钟，置于冰上2分钟，与芯片在56℃下杂交16～20小时(杂交系统为NimblegenSystems,Inc,Madison,WI,USA)。杂交完成后使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片。

(3)使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。

2、第一次实时定量PCR验证

芯片筛选后，挑选与对照组比较显著下调的microRNA进行实时定量PCR验证，具体实施方法如下：

(1)使用TRIzol法提取RNA，并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)纯化。使用NanoDropND-1000测量纯化后的RNA浓度。

(2)抽提的RNA经过质检后，进行逆转录反应。反应总体积为20ul(总RNA300ng，逆转录特异引物0.3ul，RNA酶抑制剂0.3ul，缓冲液2ul，MMLV逆转录酶0.3ul，dNTP2ul，核酸酶自由水加至20ul)，在不同温度下(16℃、42℃、85℃)下进行不同时长(30分钟、40分钟、5分钟)反应。逆转录特异引物信息见如下表1：

表1：microRNA逆转录特异引物信息

(3)实时定量PCR扩增总体系为10ul，反应共40个循环，每个反应重复三次。以hsa-miR-93-5p作为内参，检测结果以2-^△△CT表示，其中2-^△△CT值越小，表达量越低。PCR使用引物信息见下表2。

表2：实时定量PCR使用引物信息

3、第二次实时定量PCR验证

第一次实时定量PCR验证后，挑选表达量显著低于对照组的microRNA，同时加入之前经证实在阿尔茨海默病人群中表达量显著下降的hsa-miR-107，进行再次验证，具体实施方法同上。

三、研究结果

芯片筛选阶段，MCI组中hsa-miR-134-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-569和hsa-miR-5691的表达水平显著低于正常对照组，具体数据如下表3所示：

表3：正常对照组(NC)及轻度认知障碍(MCI)组microRNA表达差异水平

实时定量PCR验证阶段，MCI组中hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的表达水平显著低于正常对照组，具体数据如表4所示：

表4：NC及MCI组microRNA表达水平(2-^△△CT值)

ROC曲线分析显示，hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107五种microRNA作为生物标记物对AD所致MCI具有较高的诊断价值(AUC为0.901，敏感度和特异度分别为80.00％和85.00％)。

以上述五种microRNA为自变量，五种microRNA联合预测概率为因变量进行线性拟合，计算得到预测概率值，将该计算模型(计算模型1)所得的数值再次进行ROC曲线分析，结果显示，该计算模型所得数值依然具有较高的诊断价值，AUC为0.901，界限值为0.174，敏感度和特异度分别为80.00％和82.50％。结果见表5和表6。

表5：以五种microRNA2-^△△CT值为变量的线性拟合模型汇总

表6：以五种microRNA2-^△△CT值为变量的线性拟合模型系数表

计算模型1为：

Logit(p＝MCI)＝7.341-0.029×hsa-miR-134-3p-0.150×hsa-miR-22-5p-0.604×hsa-miR-1185-2-3p-5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。

分析方法说明：使用SPSS 20.0软件包进行数据分析，对于两组之间的比较，首先进行方差齐性检验，对于方差齐性的两组数据，采用student’s t-test进行比较分析；对于方差不齐的两组数据，采用Welch校正分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。将具有统计学差异的数据进行二元Logistic回归，得出预测概率值，并将预测概率值用于后续ROC曲线分析。ROC曲线分析用于评价microRNA在AD所致MCI诊断中的价值，曲线下面积(AUC)越接近1则说明该指标的诊断价值越高。

目前AD所致MCI的生物学诊断依靠昂贵且国内无知识产权的大脑老年斑PET-CT检查和有创而不被传统观念接受的腰椎穿刺脑脊液检查，无便捷微创的外周血浆检查早期诊断技术。

本发明的有益效果在于：通过广泛的文献阅读及综述，一方面从公开发表的文献中筛选可能具有临床早期诊断和鉴别诊断AD所致MCI价值的标志物，另一方面通过严谨的试验和统计分析，首次发现了对AD所致MCI具有较高诊断价值的生物标志物hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p以及hsa-miR-107的五个核酸分子的组合。通过对microRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，突破了无便捷的AD所致MCI的外周血浆诊断标志物的困境，有利于对阿尔茨海默病俗称老年性痴呆的早期诊断和早期干预。同时有希望极大的推进发现具有潜在治疗价值新型抗AD治疗药物靶标提供科学依据和临床支撑。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施方式作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种AD所致MCI诊断标志物，其特征在于，所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107。

2.一种权利要求1所述的AD所致MCI诊断标志物在制备AD所致MCI诊断试剂盒中的应用。

3.一种AD所致MCI诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的含量。

4.根据权利要求3所述的AD所致MCI诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的AD所致MCI诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有内参has-miR-93-5p。

6.根据权利要求3所述的AD所致MCI诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒所测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p和hsa-miR-107的含量代入的计算公式为：

7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。

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