ES2759936T3

ES2759936T3 - Proteínas de unión a albúmina sérica

Info

Publication number: ES2759936T3
Application number: ES12727658T
Authority: ES
Inventors: Bruno Dombrecht; Peter Schotte; Cedric Jozef Néotére VERVERKEN
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2011-06-23
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2032-06-14
Also published as: DK2723771T3; US20140228546A1; CY1122691T1; JP7304375B2; JP6843090B2; CA2839779A1; US20170210789A1; CN103619878A; PT2723771T; AU2012271974B2; EP4218933A1; EP2723771A1; JP6324887B2; WO2012175400A1; HRP20170535T4; EP3466972A1; HRP20192160T1; CA2839779C; EP2723771B1; CN106046168A

Abstract

Polipéptido, proteína, constructo, compuesto u otra entidad química que comprende la secuencia de aminoácidos de Alb-23 expuesta en SEQ ID NO: 1 o una variante de Alb-23, en los que Alb-23 o la variante de Alb-23 está dirigida contra albúmina sérica humana, y una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios de unión, unidades de unión u otros restos o entidades químicas, ligados adecuadamente entre sí o bien directamente o bien opcionalmente a través de uno o más ligadores o espaciadores adecuados, en los que dicha variante de Alb-23 comprende: (i) el motivo de aminoácidos GP en las posiciones 44 y 45; (ii) el motivo de aminoácidos SKN en las posiciones 74 a 76; (iii) una CDR1 que es la secuencia de aminoácidos SFGMS expuesta en SEQ ID NO: 29; (iv) una CDR2 que es la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG expuesta en SEQ ID NO: 30; (v) una CDR3 que es la secuencia de aminoácidos GGSLSR expuesta en SEQ ID NO: 31; y que también comprende preferiblemente (vi) una G en la posición 16; y/o (vii) una R en la posición 83 y preferiblemente tanto una G en la posición 16 como una R en la posición 83; en los que dicha variante de Alb-23 comprende además entre 1 y 7, tal como entre 1 y 5 diferencias de aminoácido adicionales con la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 1; y en los que dicha variante de Alb-23 tiene estabilidad térmica mejorada tal como se determina midiendo la Tf en comparación con Alb-8 que tiene la secuencia:

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a albúmina sérica

La presente invención se refiere a secuencias de aminoácidos que son capaces de unirse a albúmina sérica; a proteínas y polipéptidos que comprenden o que consisten esencialmente en tales secuencias de aminoácidos; a ácidos nucleicos que codifican para tales secuencias de aminoácidos, proteínas o polipéptidos; a composiciones, y en particular composiciones farmacéuticas, que comprenden tales secuencias de aminoácidos, proteínas y polipéptidos; y a usos de tales secuencias de aminoácidos, proteínas y polipéptidos.

Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención serán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.

Si cualquier término no está específicamente definido en el presente documento, estos términos tienen el significado que se les da en el documento WO 2009/068627 o el documento WO 06/122787. Si cualquier término usado en el presente documento no está específicamente definido en el presente documento o en el documento WO 2009/068627/WO 06/122787, entonces tiene su significado habitual en la técnica, para lo cual se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales.

Se conocen en la técnica secuencias de aminoácidos que son capaces de unirse a albúmina sérica humana y usos de las mismas en constructos de polipéptido con el fin de aumentar la semivida de proteínas y polipéptidos terapéuticamente relevantes.

Por ejemplo, el documento WO 04/041865 por el solicitante describe Nanobodies dirigidos contra albúmina sérica (y en particular contra albúmina sérica humana) que pueden ligarse a otras proteínas (tal como una o más de otros Nanobodies dirigidos contra una diana deseada) con el fin de aumentar la semivida de dicha proteína.

El documento WO2008/043821 describe secuencias de aminoácidos que se unen a proteínas séricas, tales como albúmina sérica independente del pH.

El documento WO2010/108937 comenta la semivida sérica de fusiones de fármacos que comprenden dominios variables únicos de anticuerpos que se unen a albúmina sérica.

El documento WO 2008/096158 describe dominios variables únicos que se unen específicamente a albúmina sérica, así como ligandos duales específicos que comprenden un primer dominio variable de inmunoglobulina y un segundo dominio variable de inmunoglobulina, que puede unirse a albúmina sérica.

La solicitud internacional WO 06/122787 describe un número de Nanobodies contra albúmina sérica (humana). Estos Nanobodies incluyen el Nanobody denominado Alb-1 (SEQ ID NO: 52 en el documento WO 06/122787) y variantes humanizadas del mismo, tales como Alb-8 (SEQ ID No : 62 en el documento WO 06/122787). [Nanobody® y Nanobodies® son marcas comerciales de Ablynx N.V.]. De nuevo, estos pueden usarse para alargar la semivida de proteínas y polipéptidos terapéuticos y otras entidades o restos terapéuticos.

A partir de la fecha de la primera presentación de la presente solicitud, el uso de Nanobodies contra albúmina sérica (humana) para alargar la semivida de restos terapéuticos tales como Nanobodies se ha validado por medio de ensayos clínicos. Por ejemplo, la seguridad, tolerabilidad, inmunogenicidad y farmacocinética (PK) de ALX-0141, un constructo de proteína que comprende dos Nanobodies contra RANK-L y un Nanobody contra albúmina sérica humana, se ha confirmado en ensayos clínicos de fase I (datos presentados por Ablynx N.V. el 27 de mayo de 2011 en el Congreso Europeo Anual de Reumatología (EULAR) en Londres). Además, numerosas solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V. dan ejemplos de constructos con semivida aumentada que comprenden uno o más Nanobodies contra una diana terapéutica, y uno o más Nanobodies contra albúmina sérica (tales como Alb-8). Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164, WO 2009/068627 y WO 2009/147248.

Aunque se ha establecido que el uso de Nanobodies contra albúmina sérica (humana) (tales como los descritos en los documentos WO 04/041865 y WO 06/122787, y en particular las variantes humanizadas de Alb-1 descritas en el documento WO 06/122787), proporciona una metodología buena y ampliamente aplicable para alargar la semivida de Nanobodies y de otras entidades y restos terapéuticos, esto no significa que el experto en la técnica no se beneficiaría de tener Nanobodies mejorados adicionales contra albúmina sérica humana a su disposición para este propósito.

La presente invención proporciona un Nanobody mejorado de este tipo que está dirigido contra albúmina sérica humana (denominado “Alb-23”; véase la SEQ ID NO: 1), así como un número de variantes de este Nanobody (también denominados en el presente documento “secuencias de tipo Alb-23” o “variantes de Alb-23”, véanse las SEQ ID NO: 3 a 11 para algunos ejemplos no limitativos), así como compuestos, polipéptidos y otros constructos (proteínas) que comprenden el mismo (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Las ventajas que el Nanobody mejorado de SEQ ID NO: 1 y sus variantes pueden proporcionar sobre los Nanobodies descritos en los documentos WO 04/041865 y WO 06/122787 serán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento. Por ejemplo y sin limitación, estas ventajas pueden incluir

- estabilidad mejorada (tal como estabilidad térmica mejorada tal como se determina midiendo la Tf); y/o

- y/o estabilidad en almacenamiento mejorada, tal como se mide, por ejemplo, en el experimento de SEC descrito en el ejemplo 5); y/o

- una tendencia reducida para formar dímeros en determinadas condiciones de formulación (por ejemplo, a altas concentraciones en determinados tampones de formulación acuosos; véase de nuevo, por ejemplo, el ejemplo 5). Además, se ha encontrado que el Nanobody mejorado de SEQ ID NO: 1 y sus variantes son particularmente adecuados para alargar la semivida de dominios variables únicos de inmunoglobulina que contienen más de un puente disulfuro, tal como VHH y Nanobodies que pertenecen a la “clase VHH-1” (que tal como se describe adicionalmente en el presente documento puede comprender dos o incluso tres puentes disulfuro). Por ejemplo y sin limitación, se ha encontrado que polipéptidos que comprenden uno o más VHH/Nanobodies terapéuticos de la clase VHH-1 y el Nanobody Alb-23 (o una variante de Alb-23) pueden tener mejores niveles de expresión en determinados huéspedes o células huésped (y/u otras propiedades ventajosas cuando se trata de expresión, purificación y/o producción/fabricación en general) que los correspondientes polipéptidos que contienen un Nanobody de unión a albúmina sérica según el documento WO 06/122787 tal como “Alb-8” (SEQ ID NO: 62 en el documento WO 06/122787) en lugar de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. De nuevo, esto será evidente a partir de la descripción adicional y la parte experimental en el presente documento.

Estas y otras ventajas, así como los diversos aspectos, realizaciones, usos y aplicaciones de la invención, serán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.

Se conoce que los dominios variables únicos de inmunoglobulina tales como Nanobodies, VHH, anticuerpos de dominio (único), dAb, dominios de IgNAR y microcuerpos (tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/29004) pueden expresarse en varias células huésped y organismos huésped, tales como células bacterianas tales como E. coli, cepas de levaduras tales como Pichia y Saccharomyces, y diversas células o líneas celulares de mamíferos. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos EP 0656 946 y EP 0 698 097, así como a las diversas solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164, WO 2009/068627 o WO 2009/147248.

De manera similar, se conoce que cuando uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina que están dirigidos contra una diana terapéutica están ligados a un Nanobody que está dirigido a albúmina sérica (humana) (tal como los descritos en los documentos WO 04/041865 y WO 06/122787) con el fin de proporcionar un constructo que tenga semivida aumentada (es decir, en comparación con el/los dominio(s) terapéutico(s) solo(s)), los polipéptidos y constructos resultantes también pueden expresarse en un número de células huésped y organismos huésped, tales como células bacterianas tales como E. coli, cepas de levaduras tales como Pichia y Saccharomyces, y diversas células o líneas celulares de mamífero. De nuevo, se hace referencia a los documentos WO 04/041865, WO 06/122787, al documento WO 2010/056550 y a las diversas solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V. mencionadas en el presente documento.

En general, también se conoce que todos los VHH y Nanobodies contienen al menos un puente disulfuro, entre el residuo de cisteína en la posición 22 y el residuo de cisteína en la posición 92 (numeración según Kabat, véanse las solicitudes de patente de Ablynx N.V.).

Aunque la mayoría de VHH sólo contiene este único puente disulfuro, también se conoce que algunos VHH contienen un total de dos (o en casos excepcionales tres) puentes disulfuro. Por ejemplo, una clase de VHH y Nanobodies denominada como el “tipo VHH-1” o la “clase VHH-1”, comúnmente tiene un segundo puente disulfuro entre un residuo de cisteína en la posición 50 (el primer residuo de aminoácido de CDR2) y un residuo de cisteína presente en CDR3 (tales VHH y Nanobodies a menudo también tienen el motivo de secuencia EREG en las posiciones 44 a 47). Además, algunos VHH derivados de camellos a veces tienen un puente disulfuro entre un residuo de cisteína presente en CDR1 y un residuo de cisteína presente en CDR3.

Algunos ejemplos no limitativos de tales Nanobodies de tipo VHH-1 (dados sólo a modo de ilustración; otras secuencias de tipo VHH-1 contra otras dianas pueden encontrarse en algunas de las otras solicitudes de patente de Ablynx N.V.) son las secuencias P23ILPMP37D5 (SEQ ID NO: 2490) y P12ILPMP80F10 (SEQ ID NO: 1954) del documento WO 2009/068627; las secuencias PMP30A2 (SEQ ID NO: 419), PMP31C5 (SEQ ID NO: 413) y PMP30G11 (SEQ ID NO: 416) del documento WO 2008/020079; y las secuencias RSVPMP5A2 (SEQ ID NO: 262), RSVPMP5B2 (SEQ ID NO: 263) y RSVPMP5C3 (SEQ ID NO: 264) del documento WO 2009/147248.

Las solicitudes estadounidenses no publicadas previamente 61/388.172 (presentadas el 30 de septiembre de 2010 y tituladas “Biological materials related to c-Met") y el documento US 61/451.869 (presentado el 11 de marzo de 2011 y titulado “Biological materials related to c-Met"), ambos asignados a Ablynx N.V., describen VHH y Nanobodies que están dirigidos contra la diana terapéutica c-Met; y algunos de estos VHH y Nanobodies (tales como 4E09, SEQ ID NO: 26 en el documento US 61/451.869 y SEQ ID NO: 12 en el presente documento, y algunas de las variantes de 4E09 descritas en el documento US 61/451.869) también pertenecen a la clase VHH-1.

Los documentos US 61/388.172 y US 61/451.869 también describen que tales Nanobodies de tipo VHH-1 pueden ligarse a un Nanobody contra albúmina sérica humana con el fin de aumentar su semivida (el Nanobody contra albúmina sérica humana usado en los documentos US 61/388.172 y US 61/451.869 se denomina “Alb-11" y se da en la SEQ ID NO: 5 en el documento US 61/451.869. Alb-11 tiene la misma secuencia de aminoácidos que Alb-8, que es la SEQ ID NO: 62 en el documento WO 06/122787). Un ejemplo de un polipéptido de este tipo que comprende Alb-11 y 4E09 se da en la SEQ ID NO: 9 del documento US 61/451.869.

Aunque los VHH/Nanobodies del tipo VHH-1 (o más generalmente, VHH/Nanobodies que contienen dos o tres puentes disulfuro), así como los polipéptidos y otros constructos de proteína que comprenden los mismos (incluyendo tales polipéptidos que comprenden además al menos un Nanobody contra albúmina sérica con el fin de proporcionar semivida aumentada), pueden expresarse en cualquier huésped u organismo huésped adecuado, se ha encontrado que los niveles de expresión que se obtienen para tales VHH, Nanobodies, polipéptidos o constructos puede ser significativamente menor que los niveles de expresión que se obtienen para VHH, Nanobodies, polipéptidos o constructos similares/comparables que contienen VHH o Nanobodies que no pertenecen a la clase VHH-1 (o más generalmente, que contienen VHH/Nanobodies con sólo un puente disulfuro). Por ejemplo y sin limitación, mientras que los niveles de expresión de más de 0,8 g/l o más (tal como 1 g/l o más) pueden lograrse habitualmente en Pichia para polipéptidos que comprenden Alb-8 y uno o más Nanobodies terapéuticos que no son del tipo VHH-1 (de nuevo, véanse algunas de las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V.), se ha encontrado que es difícil lograr niveles de expresión de más de 0,5 g/l para polipéptidos que comprenden el Nanobody de tipo VHH-1 anti-c-Met 4E09 (SEQ ID NO: 26 en el documento US 61/451.869 y SEQ ID NO: 12 en el presente documento) o una variante humanizada del mismo y Alb-8 (véase la sección experimental a continuación). De manera sorprendente, se ha encontrado recientemente que cuando se usa el Nanobody de la SEQ ID NO: 1 en tales polipéptidos (es decir, en lugar de Alb-8), pueden obtenerse niveles de expresión significativamente mayores (véase la sección experimental a continuación).

Tal como se mencionó, en un primer aspecto, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que está dirigida contra albúmina sérica (humana), que consiste esencialmente en o es la siguiente secuencia de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG

SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ

GTLVTVS8 [SEQ ID NO:!]

Esta secuencia de aminoácidos también se denomina en el presente documento “Alb-23" o la “secuencia de aminoácidos de la invención". Alb-23 es una versión humanizada de la secuencia de aminoácidos “Alb-1" (SEQ ID NO: 52 del documento WO 06/122787, y también denominada “PMP6A6" en el documento WO 06/122787).

Por conveniencia, la figura 1 da una alineación de Alb-23 con Alb-1 y las versiones humanizadas de Alb-1 divulgadas en la tabla III del documento WO 06/122787 (denominadas “Alb-3" a “Alb-10" en el documento WO 06/122787, véanse también las SEQ ID NO: 57 a 64 del documento WO 06/122787). La secuencia de aminoácidos de Alb-1 es:

AVQLYESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSIS

GSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLOMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRS

SQGTQVTVSS [SEQ ID NO:2]

En la secuencia anterior, las principales diferencias entre Alb1 y Alb-23 se han indicado en negrita y subrayado. Estas son (con la numeración según Kabat, véanse, por ejemplo, las tablas A-5 a A-8 del documento WO 2008/020079; y denominando cada letra un residuo de aminoácido según el código de aminoácidos de una letra convencional, para el que se hace referencia a la tabla A-2 del documento WO 2008/020079): posición 5: de V a L; posición 16: de N a G; posiciones 44 y 45: de EP a GP; posiciones 74 a 76: de AKT a SKN; posición 83: de K a R.

Por tanto, en un aspecto adicional, la divulgación se refiere a una secuencia de aminoácidos que es una variante de la secuencia Alb-1 (SEQ ID NO: 2), cuya variante comprende:

(i) el motivo de aminoácidos GP en las posiciones 44 y 45;

(ii) el motivo de aminoácidos SKN en las posiciones 74 a 76;

(iii) una CDR1 que es la secuencia de aminoácidos SFGMS (SEQ ID NO: 29);

(iv) una CDR2 que es la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 30);

(v) una CDR3 que es la secuencia de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO: 31);

y que preferiblemente también comprende

(vi) una G en la posición 16;

y en la que preferiblemente (pero sin limitación):

(vii) la posición 83 es una R (pero opcionalmente también puede ser una K);

y que comprende además (es decir, además de las diferencias de aminoácidos mencionadas anteriormente en las posiciones 16, 44 y 45, 74 a 76 y 83, siendo las diferencias de aminoácidos en las posiciones 16 y 83 opcionales pero preferidas) entre 1 y 7, tal como entre 1 y 5 “diferencias de aminoácidos” adicionales (tal como se define en el documento WO 2008/020079) con la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 2, que puede ser, por ejemplo, una o más sustituciones humanizantes (tal como se define en el documento WO 2008/020079; de nuevo, véanse por ejemplo las tablas A-5 a A-8) y/u otras sustituciones (siendo ejemplos no limitativos de tales sustituciones humanizantes u otras: posición 1: de A a E, posición 14: de P a A, o posición 108: de Q a L).

De manera similar, la invención se refiere a una secuencia de aminoácidos que es una variante de la secuencia Alb-23 (SEQ ID NO: 1) tal como se define por las reivindicaciones, cuya variante comprende:

(i) el motivo de aminoácidos GP en las posiciones 44 y 45;

(ii) el motivo de aminoácidos SKN en las posiciones 74 a 76;

(iii) una CDR1 que es la secuencia de aminoácidos SFGMS (SEQ ID NO: 29);

(v) una CDR3 que es la secuencia de aminoácidos GGSLSR (SEQ ID NO: 31);

y que preferiblemente también comprende

(vi) una G en la posición 16;

y en la que preferiblemente (pero sin limitación):

(vii) la posición 83 es una R (pero opcionalmente también puede ser una K);

y que comprende además entre 1 y 7, tal como entre 1 y 5 “diferencias de aminoácidos” adicionales (tal como se define en el documento WO 2008/020079) con la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 1, que puede ser, por ejemplo, una o más sustituciones humanizantes (tal como se define en el documento WO 2008/020079; de nuevo, véanse por ejemplo las tablas A-5 a A-8) y/u otras sustituciones (siendo ejemplos no limitativos de tales sustituciones humanizantes u otras: posición 1: de A a E, posición 14: de P a A, o posición 108: de Q a L).

Tal como será evidente para el experto en la técnica, y aunque (el uso de) Alb-23 se prefiere generalmente dentro del contexto de la presente invención, las variantes descritas en los párrafos anteriores comparten con Alb-23 algunas de las mismas sustituciones de aminoácidos (es decir, en comparación con Alb-1) que son características de Alb-23 (también en comparación con las variantes humanizadas de Alb-1 descritas en el documento WO 06/122787), y por tanto se espera que proporcionen al menos algunas o incluso todas las ventajas descritas en el presente documento para Alb-23. Por estos motivos, estas variantes también se denominan en el presente documento “secuencias de tipo Alb-23” o “variantes de Alb-23”.

En un aspecto específico, pero no limitativo, una variante de Alb-23 es tal que, cuando se usa en el ensayo de estabilidad en almacenamiento descrito en el ejemplo 5 (es decir, como parte de un constructo que comprende además IGE045 y un ligador 9GS), el pico previo en SE-HPLC para el constructo que comprende la variante de Alb-23 después de 1 mes de almacenamiento a 25°C (en las condiciones adicionales dadas en el ejemplo 5) es de menos del 10%, preferiblemente menos del 5%; y/o el pico previo en SE-HPLC para el constructo que comprende la variante de Alb-23 después de 1 mes de almacenamiento a 40°C (en las condiciones adicionales dadas en el ejemplo 5) es de menos del 20%, preferiblemente menos del 15%. Se hace referencia, por ejemplo, a los resultados comparativos en la tabla 8.

Algunos ejemplos no limitativos de algunas secuencias de tipo Alb-23 se dan en las SEQ ID NO: 3 a 11. Las variantes de las SEQ ID NO: 6 a 11 (u otras variantes de Alb-23 con de 1 a 3 residuos de aminoácido en el extremo C-terminal, que pueden elegirse cada uno independientemente de residuos de aminoácido que se producen de manera natural y, por ejemplo, pueden elegirse independientemente de A, G, V, L e I) pueden usarse, en particular, cuando se proporciona el Nanobody de unión a albúmina en el extremo C-terminal del polipéptido o constructo de proteína. Una alineación de Alb-23 con las secuencias de las SEQ ID NO: 6 a 11 se da en la figura 2.

Alb-23A:

AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSS [SEQ ID NO:3]

Alb-23B:

AVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT1GGSLSRSSQ GTQVTVSS [SEQ ID NO:4]

Alb-23C:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTQVTVSS [SEQ ID NO:5]

Alb-23D:

EVQLLESGGGLVQFGGSLRLSCAASGFIFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSS A [SEQ ID NO:6]

Alb-23E:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSAA [SEQ ID NO:7]

Alb-23F:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSAAA [SEQ ID NO:8]

Alb-23G:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSÍSG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSG [SEQ ID N0:9]

Alb-23H:

EYQLLESGGGLYQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWYRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSGG [SEQ ID NO: 10]

Alb-23I:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSGGG [SEQ ID NO:l 1]

Por tanto, en un aspecto específico, pero no limitativo, la invención proporciona proteínas o polipéptidos que consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento).

Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la secuencia de aminoácidos Alb-23 y las variantes de Alb-23 adicionales descritas en el presente documento pueden usarse con ventaja como resto, unidad de unión o pareja de fusión con el fin de aumentar la semivida de restos terapéuticos tales como polipéptidos, proteínas, compuestos (incluyendo, sin limitación, moléculas pequeñas) u otras entidades terapéuticas.

Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos, proteínas, constructos, compuestos u otras entidades químicas que comprenden o consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 tal como se define por las reivindicaciones) y una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios (de unión), unidades de unión u otros restos o entidades químicas.

En particular, la invención proporciona polipéptidos, proteínas, constructos, compuestos u otras entidades químicas que comprenden la secuencia de aminoácidos Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 tal como se define por las reivindicaciones) y uno o más (tal como uno o dos) restos terapéuticos (que pueden ser iguales o diferentes, y, por ejemplo, pueden estar dirigidos contra la misma diana o a dianas diferentes, y cuando están dirigidos a la misma diana pueden dirigirse hacia el mismo o diferentes epítopos, partes, dominios o subunidades de dicha diana), ligados adecuadamente entre sí o bien directamente o bien por medio de uno o más ligadores o espaciadores adecuados. Tales polipéptidos, proteínas o constructos pueden ser, por ejemplo y sin limitación, una proteína de fusión, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.

La invención se refiere además a usos terapéuticos de tales polipéptidos, proteínas, constructos o compuestos y a composiciones farmacéuticas que comprenden tales polipéptidos, proteínas, constructos o compuestos.

En un aspecto, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en una proteína, un polipéptido, un compuesto, un factor u otra entidad terapéutica. En una realización preferida, el resto terapéutico está dirigido contra un antígeno o una diana deseada, es capaz de unirse a un antígeno deseado (y en particular capaz de unirse específicamente a un antígeno deseado), y/o es capaz de interaccionar con una diana deseada. En otra realización, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en una proteína o un polipéptido terapéutico. En una realización adicional, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en un dominio de unión o una unidad de unión, tal como una inmunoglobulina o una secuencia de inmunoglobulina (que incluye pero no se limita a un fragmento de una inmunoglobulina), tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (que incluye pero no se limita a un fragmento ScFv), o de otro armazón proteínico adecuado, tal como dominios de proteína A (tal como Affibodies™), tendamistat, fibronectina, lipocalina, CTLA-4, receptores de células T, repeticiones de anquirina diseñadas, avímeros y dominios PDZ (Binz et al., Nat. Biotech 2005, vol. 23:1257), y restos de unión basados en ADN o ARN que incluyen pero no se limitan a aptómeros de ADN o ARN (Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32).

En aún otro aspecto, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en un dominio variable de anticuerpo, tal como un dominio variable de cadena pesada o un dominio variable de cadena ligera.

En un aspecto preferido, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en al menos un dominio variable único de inmunoglobulina, tal como un anticuerpo de dominio, anticuerpo de dominio único, “dAb” o Nanobody (tal como un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado) o un dominio de IgNAR.

En una realización específica, el al menos un resto terapéutico comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody monovalente o un constructo de Nanobody bivalente, multivalente, biespecífico o multiespecífico.

Los polipéptidos, las proteínas (de fusión), los constructos o los compuestos que comprenden una variante de Alb-23 (o un Alb-23) y uno o más restos terapéuticos pueden ser generalmente (preparados y usados) tal como se describe en la técnica anterior citada anteriormente (tal como los documentos WO 04/041865 y WO 06/122787), pero con Alb-23 o una variante de Alb-23 en lugar de los restos que aumentan la semivida descritos en dicha técnica anterior. Los polipéptidos, las proteínas (de fusión), los constructos o los compuestos que comprenden una variante de Alb-23 (o un Alb-23) y uno o más restos terapéuticos tendrán general y preferiblemente una semivida aumentada, en comparación con el resto o los restos terapéuticos per se.

Generalmente, los constructos o las proteínas de fusión descritos en el presente documento tienen preferiblemente una semivida que es al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, tales como al menos 5 veces, por ejemplo al menos 10 veces o más de 20 veces, superior que la semivida del resto terapéutico correspondiente per se (tal como se mide en o bien el hombre o bien un animal adecuado, tal como ratón o macaco cangrejero).

Además, preferiblemente, cualquier proteína de fusión o constructo de este tipo tiene una semivida en el hombre que se aumenta con más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente de más de 6 horas, tal como de más de 12 horas, en comparación con la semivida del resto terapéutico correspondiente per se.

Además, preferiblemente, cualquier proteína de fusión o constructo tiene una semivida en el hombre que es de más de 1 hora, preferiblemente más de 2 horas, más preferiblemente de más de 6 horas, tal como de más de 12 horas, y por ejemplo de aproximadamente un día, dos días, una semana, dos semanas o tres semanas, y preferiblemente no más de 2 meses, aunque este último puede ser menos crítico.

La semivida generalmente puede definirse como el tiempo necesario para que la concentración sérica del polipéptido se reduzca en un 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o eliminación o secuestro del ligando mediante mecanismos naturales. En particular, la semivida puede ser tal como se define en el documento WO 2009/068627.

Los métodos para el análisis farmacocinético y la determinación de la semivida son familiares para los expertos en la técnica. Pueden encontrarse detalles en Kennet, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y en Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edición revisada (1982).

Tal como se mencionó, en un aspecto, la secuencia de aminoácidos de Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento) puede usarse para aumentar la semivida de (uno o más) dominios variables únicos de inmunoglobulina, tales como anticuerpos de dominio, anticuerpos de dominio único, “dAb”, VHH o Nanobodies (tal como VHH, VHH humanizados o VH camelizados tales como VH humano camelizado).

En particular, tal como se menciona en el presente documento, la secuencia de aminoácidos de Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento) puede usarse con ventaja para aumentar la semivida de dominios variables únicos de inmunoglobulina que comprenden dos o más (tal como dos o tres) puentes disulfuro, tales como VHH/Nanobodies de la clase VHH-1.

Por tanto, una realización de la invención se refiere a un polipéptido, un constructo o una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 tal como se define por las reivindicaciones) y una o más (tal como una o dos) secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina, que están ligados adecuadamente entre sí, o bien directamente o bien opcionalmente por medio de uno o más ligadores o espaciadores adecuados. Tal como se menciona en el presente documento, cada dominio variable único de inmunoglobulina presente en un polipéptido, un constructo o una proteína de fusión de este tipo puede ser independientemente un anticuerpo de dominio, anticuerpo de dominio único, “dAb'” o Nanobody (tal como un VHH, VHH humanizado o VH camelizado, tal como un VH humano camelizado); y según un aspecto específico pero no limitativo, al menos uno (y hasta todos) de estos dominios variables únicos de inmunoglobulina comprende dos o tres puentes disulfuro.

Preferiblemente, cada dominio variable único de inmunoglobulina es un Nanobody; y según un aspecto específico pero no limitativo, al menos uno (y hasta todos) de estos dominios variables únicos de inmunoglobulina es un Nanobody de la clase VHH-1.

Por ejemplo y sin limitación, un constructo, una proteína de fusión o un polipéptido de este tipo puede comprender: - una copia de Alb-23 (o de una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento) y una de tal secuencia de dominio variable único de inmunoglobulina;

- una copia de Alb-23 (o de una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento) y dos de tales secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina (que pueden ser iguales o diferentes);

o incluso (aunque habitualmente no requerido y menos preferido porque la proteína resultante es más grande) - dos copias de Alb-23 (o dos copias de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento, que pueden ser iguales o diferentes) y una de tal secuencia de dominio variable único de inmunoglobulina;

- dos copias de Alb-23 (o dos copias de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento, que pueden ser iguales o diferentes) y dos de tales secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina (que pueden ser iguales o diferentes);

- una copia de Alb-23 y tres de tales secuencias de dominio variable único de inmunoglobulina (que pueden ser iguales o diferentes).

Algunos ejemplos no limitativos de constructos, proteínas de fusión o polipéptidos de la invención pueden representarse de manera esquemática de la siguiente manera, en la que “[Alb-23]” representa Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento), “[resto terapéutico 1]” y “[resto terapéutico 2]” representan los restos terapéuticos (que tal como se mencionó puede ser cada uno independientemente un dominio variable único de inmunoglobulina), “ - “ representa un ligador adecuado (que es opcional) y el extremo N-terminal está en el lado izquierdo y el extremo C-terminal está en el lado derecho:

[Alb-23] -[resto terapéutico 1]

[resto terapéutico 1] -[Alb-23]

[Alb-23] -[resto terapéutico 1] -[resto terapéutico 1]

[resto terapéutico 1] -[resto terapéutico 1] -[Alb-23]

[resto terapéutico 1] -[Alb-23] -[resto terapéutico 1]

[Alb-23] -[resto terapéutico 1] -[resto terapéutico 2]

[resto terapéutico 1] -[resto terapéutico 2] -[Alb-23]

[resto terapéutico 1] -[Alb-23] -[resto terapéutico 2]

Cuando están presentes dos o más restos terapéuticos diferentes (tal como dos o más dominios variables únicos de inmunoglobulina diferentes) en los constructos o polipéptidos de la invención, pueden ser iguales o diferentes, y cuando son diferentes pueden dirigirse hacia la misma diana (por ejemplo, a las mismas o diferentes partes, dominios, subunidades o epítopos de dicha diana) o a dianas diferentes.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un constructo de Nanobody multiespecífico (y en particular biespecífico) que comprende Alb-23 (o una de las variantes de Alb-23 tal como se define por las reivindicaciones) y al menos un Nanobody distinto (tal como uno o dos Nanobodies distintos, que pueden ser iguales o diferentes), en el que dicho al menos un Nanobody distinto preferiblemente está dirigido contra una diana deseada (que es preferiblemente una diana terapéutica) y/u otro Nanobody que es útil o adecuado para propósitos terapéuticos, profilácticos y/o de diagnóstico. De nuevo, Alb-23 y los otros Nanobodies pueden estar ligados adecuadamente entre sí o bien directamente o bien opcionalmente por medio de uno o más ligadores o espaciadores adecuados, y según un aspecto específico pero no limitativo, al menos uno (y hasta todos) de los otros Nanobodies puede ser de la clase VHH-1.

Para una descripción general de polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más Nanobodies y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muildermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; así como a, por ejemplo, los documentos WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

Algunos otros ejemplos de algún polipéptido multiespecífico y/o multivalente específico de la invención pueden encontrarse en las solicitudes de Ablynx N.V. mencionadas en el presente documento. En particular, para una descripción general de constructos multivalentes y multiespecíficos que comprenden al menos un Nanobody contra una proteína sérica para aumentar la semivida, de ácidos nucleicos que codifican para el mismo, de composiciones que comprenden el mismo, de la preparación de los anteriormente mencionados, y de usos de los anteriormente mencionados, se hace referencia a las solicitudes internacionales WO 04/041865 y WO 06/122787 mencionadas anteriormente (Alb-23 y las variantes de Alb-23 tal como se define por las reivindicaciones pueden usarse generalmente de manera análoga a los Nanobodies que alargan la semivida descritos los mismos tales como Alb-8), así como a la descripción general y los ejemplos específicos de tales constructos dados en los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

En una realización no limitativa, el uno o más Nanobodies distintos presentes en un polipéptido o constructo de proteína de este tipo pueden estar dirigidos contra c-Met, y en particular, pueden ser Nanobodies de tipo I dirigidos contra c-Met. Algunos ejemplos no limitativos de Nanobodies contra c-Met que pueden estar presentes en un polipéptido o constructo de proteína de este tipo pueden encontrarse en, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses no publicadas previamente US 61/388.172 y US 61/451.869 mencionadas en el presente documento.

Un Nanobody de tipo I contra c-Met particularmente preferido que puede estar presente en un polipéptido multivalente y/o multiespecífico de este tipo (junto a Alb-23 o una variante de Alb-23) es 4E09 (SEQ ID NO: 26 en el documento US 61/451.869 y SEQ ID NO: 12 en el presente documento) o variante del mismo. Una variante de 4E09 de este tipo puede ser generalmente tal como se describe en el documento US 61/451.869 (y generalmente tendrá una identidad de secuencia de al menos el 80%, tal como al menos el 85%, por ejemplo al menos el 90% o más, tal como el 95% o más con 4E09) y es preferiblemente tal que (i) compite con 4E09 para la unión a c-Met (en un ensayo de unión adecuado, tal como el ensayo de Alphascreen descrito en el ejemplo 7, pero usando 4E09 en lugar de HGF tal como se usa en el ejemplo 7); y/o (ii) se une al mismo epítopo en c-Met que 4E09; y/o (iii) bloquea de manera cruzada (tal como se define en el documento WO 2009/068627) la unión de 4E09 a c-Met. Una variante de 4E09 de este tipo puede ser, por ejemplo, una variante humanizada y/u optimizada por secuencia de 4E09 (tal como se describe adicionalmente en el documento US 61/451.869). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitativos, de variantes de 4E09 que pueden estar presentes en tales proteínas o polipéptidos son los siguientes, que también se describen en el documento US 61/451.869: 04E09 (L49S); 04E09 (C50S/C100bG); 04E09 (C22A/C92S); A00790067 = 4E09 (Q108L); A00790068 = 4E09 (A74S, K83R, Q108L); A00790069 = 4E09 (A74S, K83R, G88A, Q108L) y A00790105 = 4E09 (E1D, A74S, K83R, G88A, Q108L), de los que este último es especialmente preferido. Las secuencias de aminoácidos de 4E09 y estas variantes se dan en las SEQ ID NO: 12 a 19.

Por tanto, en un aspecto específico pero no limitativo, la invención se refiere a un polipéptido o constructo de proteína que comprende o consiste esencialmente en Alb-23 (preferido) o una variante de Alb-23 (tal como se describe en el presente documento), que se liga adecuadamente (o bien directamente o bien por medio de uno o más ligadores adecuados) a uno o dos Nanobodies contra c-Met. Tal como se mencionó, según un aspecto específico pero no limitativo, dicho uno o dos Nanobodies contra c-Met comprende dos puentes disulfuro (es decir, son de “clase I”). En particular, la invención se refiere a un polipéptido o constructo de proteína que comprende o consiste esencialmente en Alb-23 (preferido) o una variante de Alb-23 (tal como se define por las reivindicaciones), que se liga adecuadamente (o bien directamente o bien por medio de uno o más ligadores adecuados) a uno o dos (y preferiblemente sólo uno) Nanobodies contra c-Met, que son 4E09 (SEQ ID NO: 12) o una variante de 4E09 (tal como se describe en el presente documento y en el documento US 61/451.869), y preferiblemente una variante de 4E09 humanizada u optimizada por secuencia, y más preferiblemente A00790105 (SEQ ID NO: 19).

Algunos ejemplos específicos pero no limitativos de tales proteínas y polipéptidos son los constructos Alb23-9GS-4E09, 4E09-9GS-Alb23, Alb23-9GS-A00790105, A00790105-9GS-Alb23, Alb23-35GS-4E09, 4E09-35GS-Alb23, Alb23-35GS-A00790105, A00790105-35GS-Alb23 y A00790105-35GS-A00790105-35GS-Alb23. Las secuencias de estos se dan en las SEQ ID NO: 20 a 28, respectivamente. De estos, el constructo A00790105-9GS-Alb23 (SEQ ID NO: 23) es particularmente preferido, y por tanto un aspecto de la invención también se refiere a un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, tal como al menos el 85%, por ejemplo al menos el 90%, tal como al menos el 95% o más con el polipéptido de la SEQ ID NO: 23.

La invención también se refiere a secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos que codifican para secuencias de aminoácidos, proteínas de fusión y constructos descritos en el presente documento. La invención incluye además constructos genéticos que incluyen las secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos anteriores y uno o más elementos para constructos genéticos conocidos per se. El constructo genético puede estar en forma de un plásmido o vector. De nuevo, tales constructos pueden ser generalmente tal como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a huéspedes o células huésped que contienen tales secuencias de nucleótidos o ácidos nucleicos y/o que expresan (o son capaces de expresar) las secuencias de aminoácidos, proteínas de fusión y constructos descritos en el presente documento. De nuevo, tales células huésped pueden ser generalmente tal como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a un método para preparar una secuencia de aminoácidos, una proteína de fusión o un constructo tal como se describe en el presente documento, cuyo método comprende cultivar o mantener una célula huésped tal como se describe en el presente documento en condiciones tales que dicha célula huésped produce o expresa una secuencia de aminoácidos, una proteína de fusión o un constructo tal como se describe en el presente documento, y opcionalmente comprende además aislar la secuencia de aminoácidos, la proteína de fusión o el constructo así producido. De nuevo, tales métodos pueden realizarse tal como se describe generalmente en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una secuencia de aminoácidos, una proteína de fusión o un constructo tal como se describe en el presente documento, y opcionalmente al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales preparaciones, portadores, excipientes y diluyentes pueden ser generalmente tal como se describe en las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

Sin embargo, dado que las secuencias de aminoácidos, las proteínas de fusión o los constructos descritos en el presente documento tienen una semivida aumentada, se administran preferiblemente en la circulación. Como tal, pueden administrarse de cualquier manera adecuada que permita que las secuencias de aminoácidos, las proteínas de fusión o los constructos entren en la circulación, tal como por vía intravenosa, por medio de inyección o infusión, o de cualquier otra manera adecuada (incluyendo administración oral, administración subcutánea, administración intramuscular, administración a través de la piel, administración intranasal, administración a través de los pulmones, etc.) que permita que las secuencias de aminoácidos, las proteínas de fusión o los constructos entren en la circulación. Los métodos y vías de administración adecuados serán evidentes para el experto en la técnica, de nuevo, por ejemplo, también a partir de la enseñanza de las solicitudes de patente publicadas de Ablynx N.V., tal como, por ejemplo, los documentos WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 o WO 2009/068627.

Por tanto, en otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento de al menos una enfermedad o un trastorno que puede prevenirse o tratarse mediante el uso de una proteína de fusión o un constructo tal como se describe en el presente documento, cuyo método comprende administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de una proteína de fusión o un constructo de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo. Las enfermedades y los trastornos que pueden prevenirse o tratarse mediante el uso de una proteína de fusión o un constructo tal como se describe en el presente documento serán generalmente los mismos que las enfermedades y los trastornos que pueden prevenirse o tratarse mediante el uso del resto terapéutico que está presente en la proteína de fusión o el constructo de la invención.

En el contexto de la presente invención, el término “prevención y/o tratamiento” no sólo comprende la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad, sino que también comprende generalmente la prevención de la aparición de la enfermedad, la reducción o la reversión del progreso de la enfermedad, la prevención o reducción de la aparición de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la reducción y/o mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la reducción de la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma y/o la prevención de un aumento adicional en la gravedad de la enfermedad y/o de cualquier síntoma asociado con la misma, la prevención, reducción o reversión de cualquier daño fisiológico provocado por la enfermedad, y generalmente cualquier acción farmacológica que es beneficiosa para el paciente que va a tratarse. El sujeto que va a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero en particular es un mamífero, y más en particular un ser humano. Tal como será evidente para el experto en la técnica, el sujeto que va a tratarse, en particular, será una persona que padece, o corre el riesgo de, las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento.

En otra realización, la divulgación se refiere a un método para inmunoterapia, y en particular para inmunoterapia pasiva, cuyo método comprende administrar, a un sujeto que padece o corre el riesgo de las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento, una cantidad farmacéuticamente activa de una proteína de fusión o un constructo de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende el mismo.

La proteína de fusión o el constructo y/o las composiciones que comprenden el mismo se administran según un régimen de tratamiento que es adecuado para prevenir y/o tratar la enfermedad o el trastorno que va a prevenirse o tratarse. El médico será capaz, generalmente, de determinar un régimen de tratamiento adecuado, dependiendo de factores tales como la enfermedad o el trastorno que va a prevenirse o tratarse, la gravedad de la enfermedad que va a tratarse y/o la gravedad de los síntomas de la misma, el polipéptido específico de la invención que va a usarse, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica que va a usarse, la edad, el género, el peso, la dieta, el estado general del paciente, y factores similares bien conocidos por el médico.

Generalmente, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de una o más proteínas de fusión o constructos de la invención, o de una o más composiciones que comprenden los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente eficaces. La(s) cantidad(es) o dosis específica(s) que va(n) a administrarse puede(n) determinarse por el médico, de nuevo basándose en los factores citados anteriormente.

Generalmente, para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento y dependiendo de la enfermedad o el trastorno específico que va a tratarse, la potencia y/o la semivida de las proteínas de fusión o los constructos específicos que van a usarse, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica específica usada, los Nanobodies y polipéptidos de la invención se administrarán generalmente en una cantidad entre 1 gramo y 0,01 microgramos por kg de peso corporal por día, preferiblemente entre 0,1 gramos y 0,1 microgramos por kg de peso corporal por día, tal como aproximadamente 1, 10, 100 ó 1000 microgramos por kg de peso corporal por día, o bien de manera continua (por ejemplo, mediante infusión), como una dosis diaria individual o bien como múltiples dosis divididas durante el día. El médico será capaz, generalmente, de determinar una dosis diaria adecuada, dependiendo de los factores mencionados en el presente documento. También será evidente que en casos específicos, el médico puede elegir desviarse de esas cantidades, por ejemplo, basándose en los factores citados anteriormente y su juicio experto. Generalmente, puede obtenerse alguna orientación sobre las cantidades que van a administrarse a partir de las cantidades administradas habitualmente para anticuerpos o fragmentos de anticuerpo convencionales comparables contra la misma diana administrados por medio de esencialmente la misma vía, teniendo en cuenta, sin embargo, las diferencias en afinidad/avidez, eficacia, biodistribución, semivida y factores similares bien conocidos para el experto en la técnica.

Habitualmente, en el método anterior, se usará un único polipéptido de la invención. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención usar dos o más polipéptidos de la invención en combinación.

Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir, como un régimen de tratamiento combinado, que puede o no conducir a un efecto sinérgico. De nuevo, el médico será capaz de seleccionar tales compuestos o principios adicionales, así como un régimen de tratamiento combinado adecuado, basándose en los factores citados anteriormente y su juicio experto.

En particular, los polipéptidos de la invención pueden usarse en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que se usan o pueden usarse para la prevención y/o el tratamiento de las enfermedades y los trastornos que pueden prevenirse o tratarse con las proteínas de fusión o los constructos de la invención, y como resultado de lo cual puede obtenerse o no un efecto sinérgico.

La eficacia del régimen de tratamiento usado según la divulgación puede determinarse y/o seguirse de cualquier manera conocida per se para la enfermedad o el trastorno implicado, tal como será evidente para el médico. El médico también será capaz, cuando sea apropiado y/o caso por caso, de cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, de manera que se logre el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados y/o para lograr un equilibrio apropiado entre, por un lado lograr los efectos terapéuticos deseados y, por otro lado, evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados.

Generalmente, el régimen de tratamiento se seguirá hasta que se logren los efectos terapéuticos deseados y/o mientras se mantenga el efecto terapéuticos deseado. De nuevo, esto puede determinarse por un médico.

El sujeto que va a tratarse puede ser cualquier animal de sangre caliente, en particular un mamífero, y más en particular un ser humano. Tal como será evidente para el experto en la técnica, el sujeto que va a tratarse, en particular, será una persona que padece, o corre el riesgo de, las enfermedades y los trastornos mencionados en el presente documento.

La invención se ilustrará adicionalmente a continuación por medio de la parte experimental y las figuras no limitativas, en las que:

- la figura 1 es una alineación de Alb-23 (SEQ ID NO: 1) con Alb-1 y las diversas variantes humanizadas del mismo descritas en el documento WO 06/122787;

- la figura 2 es una alineación de Alb-23 (SEQ ID NO: 1) con algunas de las variantes de Alb-23 descritas en el presente documento;

- la figura 3 muestra las diversas secuencias denominadas en la presente memoria descriptiva;

- la figura 4 muestra un perfil de expresión que usa análisis SDS-PAGE de A007900009 producido por clones de Pichia con un bajo (L = 1) y un alto (H = más de 1) número de copias (CN) del casete de expresión.

- La figura 5 muestra un perfil de expresión que usa análisis SDS-PAGE de A007900171 producido por clones de Pichia con un bajo (L = 1) y un alto (H = más de 1) número de copias (CN) del casete de expresión.

- La figura 6 muestra un perfil de expresión que usa análisis SDS-PAGE de A007900057 y A007900058 producidos por clones de Pichia con un bajo (L = 1) y un alto (H = más de 1) número de copias (CN) del casete de expresión. - La figura 7 muestra un perfil de expresión que usa análisis SDS-PAGE de variante de A007901219 producida por clones de Pichia con un bajo (L = 1) y un alto (H = más de 1) número de copias (CN) del casete de expresión.

- La figura 8 muestra el análisis SDS-Page (condiciones no reductoras) de muestras de fermentación al final de la inducción de expresiones de Pichia pastoris de A00700171 y A00701219. Se cargan 5 |il de medio libre de células en el gel (carril 1-4). Los carriles 5 a 7 contienen un Nanobody de control cargado en diferentes cantidades. El carril izquierdo contiene el marcador de peso molecular.

Parte experimental:

Ejemplo 1: perfil de expresión de 4E09 en combinación con Alb11 o Alb23

La tabla 1 ofrece un resumen general de los formatos basados en el elemento estructural del Nanobody de VHH1 anti-c-Met 4E09 (SEQ ID NO: 12) en combinación con Alb11 y Alb23. Se clonaron los diferentes Nanobodies en el vector de expresión pPiczalpha y se transformaron en la cepa X-33 de Pichia pastoris (sistema de expresión comercialmente disponible de Invitrogen/RCT). Se seleccionaron los clones sobre placas que contenían zeocina y se realizó una qPCR para clasificar los clones según sus números de copias. Se compararon los niveles de expresión entre clones con números de copias bajos y altos en experimentos con matraces de agitación. Se observó una correlación inversa entre el nivel de expresión y los números de copias para los formatos que contenían Alb11 (figuras 4 y 5). Por el contrario, se observó una correlación positiva entre el nivel de expresión y los números de copias con formatos de Nanobody que contenían el Nanobody Alb23 (figuras 6 y 7).

Tabla 1: resumen general de 5 formatos del elemento estructural del Nanobody de VHH1 4E09 o la versión optimizada por secuencia fusionada por medio de un ligador 9GS o 35GS al elemento estructural del Nanobody Alb11 o Alb23.

Ejemplo 2: rendimiento de fermentación de 4E09 en combinación con Alb11 o Alb23

Se evaluó la expresión del Nanobody® A007900171 (4E9 optimizado por secuencia-9GS-Alb11) y A007901219 (4E9 optimizado por secuencia-9GS-Alb23) usando X33 de Pichia pastoris como organismo huésped. Se evaluaron tanto el promotor AOX (promotor inducible por MeOH) como el promotor GAP (promotor inducido constitutivo).

Se usó un medio complejo basado en peptona para los procedimientos de fermentación. Para las fermentaciones con el clon X33 que usa el promotor ^aO^x, se usó MeOH para la expresión del Nanobody. De manera breve, este procedimiento puede dividirse en 3 fases: una fase discontinua, una fase semicontinua de glicerol y una fase de inducción por MeOH. Durante la fase discontinua y la fase semicontinua de glicerol, la biomasa se acumuló hasta aproximadamente el 40% (peso húmedo por volumen). A continuación, se comenzó una fase de adaptación e inducción por MeOH durante la que el Nanobody® se expresó y secretó en el medio.

Para las fermentaciones con el clon X33 que usa el promotor GAP, se usó glucosa para inducir la expresión del Nanobody®. Este procedimiento también puede dividirse en 3 fases: una fase discontinua en glicerol, una fase semicontinua de glucosa que usa una alta tasa de alimentación para acumular biomasa hasta aproximadamente el 40% (peso húmedo por volumen) y una segunda fase semicontinua de glucosa a una tasa de alimentación menor para inducir adicionalmente la expresión/secreción del Nanobody®.

Todas las fermentaciones se llevaron a cabo a escala de fermentador de 2 l usando equipos Sartorius (Biostat® Aplus, Biostat® Bplus y controladores gemelos de Biostat® Bplus, reactores Univessel® de 2 l, control mediante el software MFCSwin). Durante las fermentaciones, se monitorizaron/condujeron los siguientes parámetros: OD (oxígeno disuelto), pH, formación de espumas, biomasa (DO⁶⁰⁰para E. coli y peso celular húmedo (WCW, por sus siglas en inglés Wet Cell Weight) para Pichia pastoris), nivel de expresión y calidad del producto. El OD típico fue del 30% y se controlaba a través de una cascada de agitación, y se compensaba adicionalmente mediante la adición de oxígeno puro según las necesidades. El pH se monitorizó a través de un electrodo de pH y se ajustó mediante adiciones de amoniaco a través de una bomba de base. Se realizaron mediciones de pH fuera de línea para comprobar el funcionamiento del electrodo de pH después del autoclave.

La tabla 2 ofrece un resumen general de las ejecuciones de fermentación realizadas para la expresión de A007900171 y A007901219 usando Pichia pastoris como organismo huésped.

La figura 8 muestra el análisis SDS-Page (condiciones no reductoras) de muestras de las diferentes fermentaciones al final de la inducción con Pichia pastoris. ]

En la tabla 3 se muestra un resumen general de las diferentes fermentaciones con Pichia pastoris con sus respectivas configuraciones de parámetros, características de fermentación y el rendimiento de expresión estimado de muestras al final de la inducción basándose en el análisis SDS-Page.

El título y la pureza del Nanobody® producido al final de la fermentación se determinaron a través de un procedimiento de limpieza con protA a pequeña escala seguido por análisis RP-HPLC. De manera breve, la preparación de la muestra se basa en cromatografía de afinidad de protA que purifica el Nanobody® del medio. La concentración de proteína de la fracción de elución se determina usando espectrofotometría UV y se sigue por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que permite la determinación del título del producto y la pureza/heterogeneidad del producto. La tabla 4 resume los resultados de RPC.

Ejemplo 3: purificación deA007900171 yA007901219.

Se purificaron moléculas de tanto A007900171 como A007901219 según el esquema mostrado en la tabla 5:

Tabla 5: resumen general de las etapas de purificación.

*Sólo para A007901219

Ejemplo 4: comparación de propiedades de Alb-1, Alb-8 (= Alb-11) y Alb-23.

Se determinaron y compararon diversas propiedades de Alb-1, Alb-8 y Alb-23. Los resultados se muestran en la tabla 6.

Además, para una comparación lado a lado de la tendencia de Alb-8 y Alb-23 para formar dímeros, se calcularon cinéticas de dimerización para Alb-8 (Ea = 73,0 kcal/mol) y Alb-23 (Ea = 50,8 kcal/mol) monovalentes a diversas temperaturas en tampón PBS a partir de un gráfico de Arrhenius. Los resultados se muestran en la tabla 7, y muestran que para Alb-11, la cinética comienza a aumentar a partir de temperatura ambiente hacia arriba, en particular cuando se compara con Alb-23.

Ejemplo 5: estabilidad en almacenamiento de constructos que comprenden Alb-23 en comparación con Alb-11. Para comparar la estabilidad en almacenamiento de constructos biespecíficos que comprenden Alb-8 y Alb-23, respectivamente, se prepararon dos constructos de Nanobody biespecíficos que comprenden el mismo Nanobody contra IgE (IGE045, SEQ ID NO: 43) ligado a Alb-23 (IGE045-9GS-ALB23; SEQ ID NO: 41) y Alb-11 (IGE045-9GS-ALB11; SEQ ID NO: 42), formulados en tampón D-PBS a una concentración de 50 mg/ml y almacenados en tubos de PCR de plástico en oscuridad durante 1 mes a diferentes temperaturas. Después de eso, se determinó la cantidad de pico previo (correspondiente a la formación de dímero) y se comparó usando SE-HPLC. El análisis SE-HPLC se realizó usando una columna BioSep SEC-2000 (Phenomenex) y D-PBS como tampón de transferencia a una velocidad de flujo de 0,2 ml/min. Se inyectaron 10 |ig de material y se analizaron los datos usando el software Chromeleon. Los resultados se muestran en la tabla 8.

En un experimento similar, se comparó la estabilidad en almacenamiento de dos constructos biespecíficos trivalentes (a una concentración de 50 mg/ml en tampón de His 20 mM, pH 6,5, sacarosa al 8%). Los constructos fueron OX40L079 (SEQ ID NO: 44), un constructo de Nanobody biespecífico trivalente que comprendía Alb-11 y dos Nanobodies contra OX40L (véase la SEQ ID NO: 229 del documento PCT/EP2010/069606 de Ablynx N.V., presentado el 14 de diciembre de 2010) y OX40L089 (SEQ ID NO: 45), un constructo correspondiente que comprende los mismos dos Nanobodies contra OX40L, pero con Alb-23 en lugar de Alb-11. Los resultados también se muestran en la tabla 8A.

Tabla 8A: estabilidad en almacenamiento comparativa de constructos de Alb-23 y Alb-11 (% de pico previo en SE-HPLC después del almacenamiento para el periodo de almacenamiento indicado a las temperaturas indicadas)

En otro experimento, se comparó la estabilidad en almacenamiento del rendimiento de fermentación de cuatro constructos de Nanobody diferentes contra c-Met (A007901222/SEQ ID NO: 46; A007901256/SEQ ID NO: 47; A007901259/SEQ ID NO: 48 y A007901260/SEQ ID NO: 49). De estos constructos, A007901222 contiene el Nanobody de unión a albúmina Alb-23 (invención) así como un Nanobody anti-c-Met de “tipo VHH-1” (4E09, véanse de nuevo las solicitudes estadounidenses 61/388.172 y US 61/451.869 mencionadas anteriormente) mientras que los otros constructos (usados como referencias comparativas) contienen el Nanobody de unión a albúmina Alb-11 y Nanobodies anti-c-Met que no son del tipo VHH-1. Para una descripción más detallada de los constructos usados, se hace referencia a la solicitud estadounidense en tramitación junto con la presente 13/435.567 (Beste et al.) por el solicitante presentada el 30 de marzo de 2012.

Se produjeron diferentes constructos de Nanobody en Pichia pastoris (véanse de nuevo los documentos US 13/435.567, US 61/388.172 y US 61/451.869) y proporcionaron rendimientos de fermentación ampliamente comparables (1,03 g/l para; 1,43 g/l para A007901256; 0,91 g/l para A007901259 y 1,45 g/l para A007901260), confirmando que la presente invención hace posible proporcionar constructos que comprenden Nanobodies de tipo VHH-1 con rendimientos de expresión que son comparables con los rendimientos de expresión de constructos que no contienen un Nanobody de tipo VHH-1.

A continuación, se purificaron los constructos de Nanobody (>99% de pureza en SEC y >90% de pureza en RPC) y se incubaron a -70°C, -20°C, 5°C, 25°C y 40°C a una concentración de aproximadamente 15 mg/ml en D-PBS durante 7,5 semanas. Se evaluaron las muestras mediante mediciones de turbidez (DO500), RP-HLPC y SE-HLPC. Los resultados se resumen en la tabla 8B. La estabilidad era aceptable para todas las muestras sometidas a prueba cuando se almacenaron a -70°C, -20°C o 5°C durante 7,5 semanas.

Tabla 8B: estabilidad en almacenamiento comparativa de diferentes constructos de Nanobody anti-c-Met Constructo_________ | Estabilidad en almacenamiento (7,5 semanas de incubación)

Ejemplo 6: determinación de afinidad usando resonancia de plasmón superficial

Se realizó el análisis cinético de los constructos de fusión Nanobody-Alb anti-c-Met A007900171 (SEQ ID NO: 40) y A007901219 (SEQ ID NO: 23) para albúmina sérica humana, de macaco cangrejero y de ratón usando resonancia de plasmón superficial en el instrumento Biacore T100. Se usó HBS-EP tampón (tampón HEPES 0,01 M que contenía NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y el 0,05% de tensioactivo p20, pH 7,4) como tampón de transferencia y los experimentos se realizaron a 25°C. La albúmina sérica se acopló químicamente en un chip CM5 de chip sensor de la serie S con superficie de dextrano carboximetilado mediante una seire de inmovilización manual a una velocidad de flujo de 5 |il/min. En primer lugar, se activaron las superficies con una inyección de 7 min de una mezcla 1:1 de 75 mg/ml de EDC y 11,5 mg/ml de NHS (kit de acoplamiento de aminas de Biacore). Se inyectó albúmina sérica a 10 |ig/ml en acetato 10 mM a pH 4,5, hasta que se alcanzó un nivel de 970RU (célula de flujo 2), 890RU (célula de flujo 3) y 1360RU (célula de flujo 4) para, respectivamente, albúmina sérica humana, de macaco cangrejero y de ratón. Después de la inmovilización, se desactivaron las superficies con una inyección de 7 min de etanolamina 1 M a pH 8,5. Se activó una superficie de referencia en blanco (célula de flujo 1) y se desactivó tal como se describió anteriormente. Se preparó una serie de concentraciones de Nanobody en HBS-EP (es decir, 0 nM, 1,9 nM, 7,8 nM, 31,25 nM, 125 nM, 500 nM, 0 nM, 7,8 nM, 125 nM), se inyectaron durante 2 min a 45 |il/min (trayectoria de flujo 1, 2, 3 y 4) y se les dejó disociarse en tampón de transferencia durante 10 min. Entre muestras diferentes, se regeneraron las superficies con tampón de regeneración de glicina-HCl 10 mM a pH 1,5, 100 s a 45 |il/min. Los datos se referenciaron dos veces mediante sustracción de las curvas en el canal de referencia y de una curva de inyección de tampón de transferencia en blanco. Se evaluaron las curvas procesadas ajustando un modelo de unión 1:1 sobre las curvas de unión en el software de evaluación Biacore T100. Se notificaron tasas de activación (ka), tasas de desactivación (kd) y afinidades (KD), y se muestran en la tabla 9.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Polipéptido, proteína, constructo, compuesto u otra entidad química que comprende la secuencia de aminoácidos de Alb-23 expuesta en SEQ ID NO: 1 o una variante de Alb-23, en los que Alb-23 o la variante de Alb-23 está dirigida contra albúmina sérica humana, y una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios de unión, unidades de unión u otros restos o entidades químicas, ligados adecuadamente entre sí o bien directamente o bien opcionalmente a través de uno o más ligadores o espaciadores adecuados, en los que dicha variante de Alb-23 comprende:

(i) el motivo de aminoácidos GP en las posiciones 44 y 45;

(ii) el motivo de aminoácidos SKN en las posiciones 74 a 76;

(iii) una CDR1 que es la secuencia de aminoácidos SFGMS expuesta en SEQ ID NO: 29;

(iv) una CDR2 que es la secuencia de aminoácidos SISGSGSDTLYADSVKG expuesta en SEQ ID NO:

30;

(v) una CDR3 que es la secuencia de aminoácidos GGSLSR expuesta en SEQ ID NO: 31;

y que también comprende preferiblemente

(vi) una G en la posición 16; y/o (vii) una R en la posición 83 y preferiblemente tanto una G en la posición 16 como una R en la posición 83;

en los que dicha variante de Alb-23 comprende además entre 1 y 7, tal como entre 1 y 5 diferencias de aminoácido adicionales con la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 1; y en los que dicha variante de Alb-23 tiene estabilidad térmica mejorada tal como se determina midiendo la Tf en comparación con Alb-8 que tiene la secuencia:

EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSI

SGSGSDTFYADSVKGRFTISRDNAKTTFYFQMNSFRPEDTAYYYCTIGGSF

SRSSQGTFYTYSS.
2. Polipéptido, proteína, constructo, compuesto u otra entidad química según la reivindicación 1, que comprende o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de Alb-23 expuesta en SEQ ID NO: 1 y una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios, unidades de unión u otros restos o entidades químicas, ligados adecuadamente entre sí o bien directamente o bien opcionalmente a través de uno o más ligadores o espaciadores adecuados.
3. Polipéptido, proteína, constructo, compuesto u otra entidad química según la reivindicación 1 ó 2, en los que dicha una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios, unidades de unión u otros restos o entidades químicas son una o más secuencias de aminoácidos, dominios, unidades de unión, restos o entidades terapéuticos.
4. Polipéptido, proteína o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que la una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios, unidades de unión u otros restos o entidades químicas son uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina.
5. Polipéptido, proteína o constructo según la reivindicación 4, en los que la una o más de otras secuencias de aminoácidos, dominios, unidades de unión u otros restos o entidades químicas son uno o más VHH, VHH humanizados o VH camelizados.
6. Polipéptido, proteína o constructo según la reivindicación 4 ó 5, en los que al menos uno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina comprende al menos dos puentes disulfuro.
7. Polipéptido, proteína o constructo según la reivindicación 5 ó 6, en los que al menos uno de los VHH, VHH humanizados, VH camelizados o dominios variables únicos de inmunoglobulina es un VHH de clase I.
8. Polipéptido, proteína o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en los que al menos uno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina está dirigido contra c-met.
9. Polipéptido, proteína o constructo según la reivindicación 8, en los que al menos uno de los dominios variables únicos de inmunoglobulina dirigidos contra c-met comprende dos puentes disulfuro.
10. Polipéptido, proteína o constructo según la reivindicación 8 ó 9, en los que dicho dominio variable único de inmunoglobulina contra c-met es 4E09 expuesto en SEQ ID NO: 12 o una variante de 4E09.
11. Polipéptido, proteína o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en los que dicho dominio variable único de inmunoglobulina contra c-met es A00790105 expuesto en SEQ ID NO: 19.
12. Polipéptido, proteína o constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que es A00790105-9GS-Alb23 expuesto en SEQ ID NO: 23 o un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, tal como al menos el 85%, por ejemplo al menos el 90%, tal como al menos el 95% o más con SEQ ID NO: 23.
13. Composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido, una proteína, un constructo o un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y opcionalmente al menos un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, para su administración de una manera que permita que el polipéptido, la proteína, el constructo, el compuesto u otra entidad química entre en la circulación.
15. Secuencia de nucleótidos o ácido nucleico que codifica para un polipéptido, una proteína o un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Célula huésped que contiene y es capaz de expresar una secuencia de nucleótidos o un ácido nucleico según la reivindicación 15.
17. Método para preparar un polipéptido, una proteína o un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, método que comprende cultivar o mantener una célula huésped según la reivindicación 16 en condiciones tales que dicha célula huésped produzca o exprese dicho polipéptido, proteína o constructo, y opcionalmente comprende además aislar el polipéptido, la proteína o el constructo así producido.