CN110988361B

CN110988361B - 人血清白蛋白去除试剂盒

Info

Publication number: CN110988361B
Application number: CN201911290897.5A
Authority: CN
Inventors: 赵冠华; 靳昌忠
Original assignee: Hangzhou Heavy Chain Technology Co ltd; Shandong Minkang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Heavy Chain Technology Co ltd; Shandong Minkang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110988361A

Abstract

本发明公开一种人血清白蛋白去除试剂盒，由免疫亲和材料、缓冲液、洗液、一次性耗材和人血清白蛋白标准品组成，免疫亲和材料包括载体基质和纳米抗体。本发明提供的人血清白蛋白去除试剂盒，由于具有特异性的纳米抗体和特殊结构的载体基质，能够特异性识别和吸附人血清白蛋白，可用于去除人血浆或血清中的白蛋白，提高生物质谱对外周血低丰度蛋白指标的检出能力，从而促进生物质谱在外周血蛋白质组学检测中的应用。此外，本发明中的纳米抗体，具有亲和力高、性状稳定、耐酸碱、耐高盐、易于制备等特点，使得本试剂盒应用范围广泛。

Description

人血清白蛋白去除试剂盒

技术领域

本发明属于免疫学和生物质谱技术领域，涉及一种纳米抗体、基于该纳米抗体的免疫亲和材料，尤其涉及一种人血清白蛋白去除试剂盒，应用该免疫亲和材料的人血清白蛋白去除试剂盒，可用于去除人血浆或血清中的白蛋白。

背景技术

随着精准医疗概念的提出和精准医学的发展，基于生物质谱的蛋白质组学在临床诊断和精准治疗中的作用越来越重要。高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法作为一种新兴的检测平台，已广泛应用于生物医学研究领域。随着技术的不断革新，LC-MS/MS逐渐转向临床实验室检测，为临床内分泌相关疾病诊疗监测提供更具可靠的检测结果。相比目前市场上广泛使用的商品化免疫学方法，这一方法具有多种目标分析物共检测、抗干扰能力强(嗜异性抗体、自身抗体、交叉反应)、高特异性和灵敏度等优点。几年前，LC-MS/MS在临床诊断中的应用仅限于一些微量元素、维生素、激素和脂类等小分子物质的检测，以及病原微生物的检测。而在大量的蛋白质类临床检验学指标的检测中，生物质谱技术鲜有应用。随着近几年质谱技术的不断发展，检测灵敏度、检测通量以及数据处理能力不断提高。此外大量生物学靶标的发现，将蛋白质组学检测应用于大规模的常规临床检测成为可能。通过生物质谱和蛋白质组学的方法，仅用1滴血(约几十微升)即可检测数十甚至上百个蛋白质指标，不仅大大降低了检测成本，提高了检测效率，同时还可以实现全面诊断和个体化治疗的目标，是精准医学的一大进步。

但目前制约生物质谱在外周血蛋白质组学检测中的应用的一个重要因素是样本的制备。外周血作为临床检测最常用的生物样本，具有方便、快捷、创伤小、靶标丰富等特点，对临床诊断的参考价值较大。人类血清中的总蛋白含量约为60-80g/L，其中白蛋白含量约为40-55g/L，占总蛋白含量的50-70％左右，球蛋白约为20-30g/L，占总蛋白含量的30％左右，其余蛋白含量<5％。大量的白蛋白占用了质谱仪器的分析容量，导致许多含量较低的蛋白质成分无法被检测出来，从而限制了生物质谱在外周血蛋白质生物指标检测中的应用。因此，快速、有效地去除人血浆或者血清中的白蛋白将大大提高生物质谱对外周血低丰度蛋白指标的检出能力，有力促进生物质谱在外周血蛋白质组学检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种人血清白蛋白去除试剂盒，是一种基于纳米抗体的免疫亲和材料的人血清白蛋白去除试剂盒。

本发明的人血清白蛋白去除试剂盒，由免疫亲和材料、缓冲液、洗液、一次性耗材和人血清白蛋白标准品组成。

所述免疫亲和材料，包含抗人血清白蛋白纳米抗体和载体基质。所述的抗人血清白蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码核酸分子核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。该纳米抗体可以高亲和力结合人血清白蛋白，而不结合人血浆或血清中的其它蛋白。所述纳米抗体可以通过将含有编码核酸分子的表达载体导入大肠杆菌或者酵母细胞内表达产生。

所述的载体基质为多孔材料，多孔材料选自琼脂糖凝胶微球、纤维微球、磁珠、硅胶微球、活性炭、树脂微球中的一种。所述的载体基质可特异性吸附人血清白蛋白。

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，PH值为7.4，不含钙离子和镁离子。

所述洗液为含有0.1％Tween 20的磷酸盐缓冲液，PH值为7.4，不含钙离子和镁离子。

所述一次性耗材为低吸附的1.5mL离心管。

所述人血清白蛋白标准品为浓度100mg/mL的人血清白蛋白，溶于PH 7.4的磷酸盐缓冲液。

本发明的有益效果是：本发明提供的人血清白蛋白去除试剂盒，由于具有特异性的纳米抗体和特殊结构的载体基质，能够特异性识别和吸附人血清白蛋白，可用于去除人血浆或血清中的白蛋白，提高生物质谱对外周血低丰度蛋白指标的检出能力，从而促进生物质谱在外周血蛋白质组学检测中的应用。此外，本发明中的纳米抗体，具有亲和力高、性状稳定、耐酸碱、耐高盐、易于制备等特点，使得本试剂盒应用范围广泛。

附图说明

图1.纳米抗体纯化电泳图。

图2.免疫亲和材料的吸附容量检测图。

图3.人血清白蛋白去除试剂盒对人血浆中白蛋白的去除效果。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明优先实施方案进行描述，但是应该理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是本发明权利要求的限制。

实施例1、抗人血清白蛋白纳米抗体的制备

(1)按照上述SEQ ID NO.2所示的序列，合成编码上述抗人血清白蛋白纳米抗体的核酸分子。同时，在该核酸分子的5’端添加Nde I酶切位点(CATATG)，3’端添加Not I酶切位点(GCGGCCGC)。

(2)使用pET30a(+)原核表达质粒作为纳米抗体表达载体。该表达载体和上述纳米抗体的核酸分子片段使用Not I和Nde I酶双酶切，酶切条件为：DNA 1μg，10X缓冲液5μL，Not I和Nde I酶各1μL，加水至50μL，37℃水浴20分钟后80℃灭活10分钟，跑胶后回收片段。

(3)载体与片段连接：载体50μg，片段40μg，T4连接酶1μL，10X缓冲液2μL，加水至20μL，室温1小时。

(4)取5μL连接产物，加入50μL融化的BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，冰上放置30分钟，42℃热休克30秒，冰上修复5分钟，加入2mL SOC培养基37℃培养1h。离心收集细胞，弃大部分上清，留100μL左右上清，吹打混匀后均匀涂于氨苄西林阳性的LB琼脂培养板上，37℃培养过夜。

(5)挑选阳性克隆6-8个，于2mL氨苄西林阳性的LB培养基中37℃培养过夜，取1mL提取质粒，用Not I和Nde I酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小。连接正确的质粒即为上述包含编码纳米抗体核酸分子的载体，含有该载体的BL21(DE3)大肠杆菌细胞即为上述宿主细胞。

(6)选取双酶切鉴定正确的宿主细胞，于2mL氨苄西林阳性的LB培养基中37℃培养过夜。按1:100将菌液稀释到氨苄西林阳性的LB培养基中，37℃培养至OD值0.6左右，加入IPTG至1mmol/L，37℃培养3-4小时

(7)离心收集菌体，用PBS清洗一次，离心收集菌体。用含有1％Triton X-100的PBS10mL吹打混匀菌体，置冰上超声破碎菌体，超声5s，间隔5s，功率20％，共计10分钟。

(8)将破碎的菌液10000g 4℃离心20分钟，取上清，使用HisPur^TM Ni-NTASuperflow Agarose镍离子亲和层析柱纯化带有His标签蛋白的重组纳米抗体。洗脱的纳米抗体用PBS透析后，测定蛋白浓度，放置-20℃保存备用。

(9)SDS-PAG凝胶电泳鉴定纯化的抗体，结果如图1所示，纳米抗体纯度较高。

实施例2、免疫亲和材料的制备

(1)取2mg纯化的抗人血清白蛋白纳米抗体，用交联缓冲液配成1mg/mL；

(2)取0.3mg溴化氰活化琼脂糖，用0.1M盐酸浸泡20分钟，制成溴化氰活化琼脂糖凝胶微球；

(3)用交联缓冲液洗涤3次溴化氰活化琼脂糖凝胶微球，将纳米抗体溶液与凝胶微球混合，室温震荡孵育2小时；

(4)用交联缓冲液和低PH乙酸溶液交替洗涤3次溴化氰活化琼脂糖凝胶微球；

(5)用1mL PBS重悬溴化氰活化琼脂糖凝胶微球，4℃保存备用。

实施例3、免疫亲和材料吸附容量的测定

(1)取25μg人血清白蛋白稀释到50μLPBS缓冲液中，共制备5份；

(2)分别取12.5μL、25μL、37.5μL、50μL、62.5μL溴化氰活化琼脂糖凝胶微球，与人血清白蛋白稀释液混合，室温震荡孵育20分钟；

(3)100g室温离心2分钟，取上清；

(4)取4μL上清和1μL琼脂糖凝胶微球，跑SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2所示，图中凝胶微球上样量0.5uL，上清上样量4uL；

(5)计算1μL溴化氰活化琼脂糖凝胶微球的吸附人血清白蛋白容量为2ug。

实施例4、人血清白蛋白去除试剂盒去除血清/血浆中的白蛋白

(1)取5μL人血浆，10,000g快速离心2分钟后取上清，用PBS稀释至100μL；

(2)取10μL溴化氰活化琼脂糖凝胶微球，与血浆稀释液混合，室温震荡孵育20分钟；

(3)100g室温离心2分钟，取上清；

(4)将收集的溴化氰活化琼脂糖凝胶微球用100μL含有0.1％Tween 20的PBS洗涤3次；

(5)SDS-PAGE鉴定血浆白蛋白去除效果，结果如图3所示，血浆白蛋白去除效率达95％以上。

序列表

<110> 山东民康生物科技有限公司

杭州重链科技有限公司

<120> 人血清白蛋白去除试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> 纳米抗体氨基酸序列(天然抗体)

<400> 1

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

20 25 30

Ser Gly Arg Thr Phe Glu Thr His Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala

35 40 45

Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Arg

50 55 60

Ser Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

85 90 95

Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Phe Ala Tyr Gly Val Gly Leu

100 105 110

Tyr Lys Leu Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys

130 135

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 纳米抗体核苷酸序列(天然抗体)

<400> 2

gagaacctgt attttcaggg tgcacaggtt cagctggttg aaagcggtgg tggtctggtt 60

caggcaggcg atagcctgcg tctgagctgt gcagcaagcg gtcgtacctt tgaaacccat 120

gcaatgggct ggtttcgtca ggcaccgggt aaagaacgtg aatttgttgc aaccattaca 180

ccgagcggtc gcagcaccag ctatggtgat agcgttaaag gtcgttttac cattagcagc 240

gataatgcca aaaataccgt ttacctgcag atgaatagcc tgaaaccgga tgataccgca 300

atctattatt gtgcatttgc ctatggtgtg ggcctgtata aactggcacg tcagtatgat 360

tattggggtc agggcaccca ggttaccgtt agcgaaccga aaacaccgaa a 411

Claims

1.一种人血清白蛋白去除试剂盒，由免疫亲和材料、缓冲液、洗液、一次性耗材和人血清白蛋白标准品组成，其特征在于，所述免疫亲和材料，包含抗人血清白蛋白纳米抗体和载体基质，所述的载体基质为多孔材料，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述洗液为含有0.1%Tween 20的磷酸盐缓冲液，所述一次性耗材为低吸附的1.5mL离心管，所述抗人血清白蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码核酸分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.4，不含钙离子和镁离子，所述洗液的PH值为7.4，不含钙离子和镁离子，所述人血清白蛋白标准品为浓度100mg/mL的人血清白蛋白，溶于PH 7.4的磷酸盐缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种人血清白蛋白去除试剂盒，其特征在于，所述多孔材料选自琼脂糖凝胶微球、纤维微球、磁珠、硅胶微球、活性炭、树脂微球中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种人血清白蛋白去除试剂盒，其特征在于，所述免疫亲和材料能特异性吸附人血清白蛋白。