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ES2622006T3 - Técnicas para predecir, detectar y reducir la interferencia proteica no específica en ensayos que implican dominios variables individuales de inmunoglobulina - Google Patents

Técnicas para predecir, detectar y reducir la interferencia proteica no específica en ensayos que implican dominios variables individuales de inmunoglobulina Download PDF

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ES2622006T3
ES2622006T3 ES12729968.3T ES12729968T ES2622006T3 ES 2622006 T3 ES2622006 T3 ES 2622006T3 ES 12729968 T ES12729968 T ES 12729968T ES 2622006 T3 ES2622006 T3 ES 2622006T3
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Abstract

Proteína o polipéptido para su uso en terapia, proteína o polipéptido que contiene un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) en su extremo C-terminal, en el que dicho ISV o bien es un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado, o bien es un ISV que comprende una secuencia de VH distinta de un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado o que deriva de una secuencia de VH, ISV que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en la que: - n >= 1, 2 o 3 en el que cada X >= Ala o Gly; o - n >= 1, 2 o 3 en el que cada X >= Ala; o - n >= 1, 2 o 3 en el que cada X >= Gly; o - n >= 2 o 3 en el que al menos un X >= Ala o Gly ; o - n >= 2 o 3 en el que todos menos un X >= Ala o Gly, y proteína o polipéptido que incluye un péptido de unión a seroalbúmina o dominio de unión a seroalbúmina y tiene una semivida expresada como t1/2-beta en un sujeto humano de al menos 3 días.

Description

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Tecnicas para predecir, detectar y reducir la interferencia proteica no especffica en ensayos que implican dominios variables individuales de inmunoglobulina
La presente invencion se refiere al campo de los dominios variables individuales de inmunoglobulina. Un dominio variable individual de inmunoglobulina o “ISV” se define en general en el presente documento como una secuencia de aminoacidos que:
- comprende un plegamiento de inmunoglobulina o que, en condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiologicas) es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina (es decir, mediante plegamiento), es decir, de modo que se forma un dominio variable de inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, un dominio VH, VL o VHH);
y que
- forma (o en tales condiciones adecuadas es capaz de formar) un dominio variable de inmunoglobulina que comprende un sitio de union a antfgeno funcional (en el sentido de que no requiere una interaccion con otro dominio variable de inmunoglobulina (tal como una interaccion VH-VL) para formar un sitio de union a antfgeno funcional).
Algunos ejemplos de dominios variables individuales de inmunoglobulina que se conocen actualmente en la tecnica son VHH y/o (otros) Nanobodies, dAb y anticuerpos de dominio (individual). De estos, en la fecha de presentacion de la presente solicitud, diversos Nanobodies estan en ensayos clfnicos de fase I y fase II. Esto hace que sea importante disponer de ensayos fiables para analizar muestras biologicas de personas que se tratan con los ISV (tales como sujetos en ensayos clfnicos y, despues que de tales ISV salgan al mercado, los pacientes que se tratan con tales ISV).
Esto no solo es importante con propositos reguladores, sino tambien para el tratamiento de pacientes con farmacos biologicos, porque los medicos que prescriben el tratamiento tambien desearfan disponer de ensayos fiables para realizar un seguimiento de diversos aspectos del tratamiento.
Por ejemplo, en el desarrollo clfnico de moleculas de farmacos biologicos, es importante evaluar su potencial inmunogenico, y en particular el grado en que pueden producir los denominados “anticuerpos anti-farmaco” o “ADA”. Esto se determina usando los denominados “anticuerpo anti-farmaco” o “(inmuno)ensayos de ADA” (veanse, por ejemplo, la revision de Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; asf como Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; y Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28. Tales ensayos de ADA y los metodos para llevarlos a cabo son de conocimiento convencional en el campo de la farmacologfa y se usan de manera rutinaria durante el desarrollo clfnico de productos farmacologicos biologicos (asf como se requiere por diversos organismos reguladores en todo el mundo).
Por ejemplo, tal como se describe en las paginas 3 y 4 del artfculo de Mire-Sluis y, por ejemplo, tal como se ejemplifica tambien esquematicamente en las figuras del artfculo de Peng, se conocen varios formatos de ensayo de ADA diferentes, tales como el “formato de puente de ELISA”, “formato directo de ELISA”, “formato indirecto”, ensayo de radioinmunoprecipitacion (RIP), “resonancia de plasmon superficial” y “formato de puente de electroquimioluminiscencia”. Otros formatos para realizar inmunoensayos de ADA resultaran evidentes al experto.
El experto tambien estara familiarizado con varias plataformas de tecnologfa disponibles comercialmente diferentes que se ha demostrado que son adecuadas para establecer y realizar los ensayos de ADA. Estas incluyen pero no se limitan a la plataforma MSD (Mesoscale), Gyrolab (Gyros) y la plataforma Octet (Fortebio).
Algunos ejemplos no limitativos de formatos de ensayo de ADA tambien se muestran esquematicamente en las figuras 1A a 1C.
Generalmente, debe observarse que en tales ensayos de ADA para detectar o medir ADA contra un ISV, el ISV se usa como “agente analftico” (es decir, como el compuesto usado para detectar si cualquier ADA esta presente en la muestra que se somete a prueba), y los ADA son el “antfgeno” (es decir, el compuesto que va a detectarse en la muestra que se somete a prueba). Por tanto, en estos ensayos, el ISV se unira habitualmente/a menudo al portador (tal como la placa de ELISA), mientras que los ADA (si los hubiera) estaran presentes en la muestra que se somete al ensayo.
Para entender mejor la invencion descrita en el presente documento, ya se ha observado que, en cambio, en los metodos que se usan en el presente documento para predecir si un ISV dara lugar a interferencia proteica, el ISV se usara habitualmente como “antfgeno” (es decir, como el compuesto que va a detectarse), y un anticuerpo (que es tal como se describe adicionalmente en el presente documento) se usa como “agente analftico” (es decir, como medio
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para detectar si un ISV dado se une o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no, respectivamente). Por tanto, en este metodo descrito en el presente documento, el anticuerpo usado como agente analftico (que tambien se denomina en el presente documento “anticuerpo analftico”) se unira habitualmente al portador (es decir, a la placa de ELISA) y el ISV estara (presente en) la muestra que va a someterse a prueba. Sin embargo, debe observarse generalmente que la descripcion no se limita a ensayos en los que el “anticuerpo analftico” se une al portador. Por ejemplo, en un modo alternativo de realizar un ensayo descrito en el presente documento (tal como se muestra por ejemplo en la figura 1 y se describe en los ejemplos), el anticuerpo analftico se usa mas bien como agente de puente y, por tanto, estara en disolucion en vez de unido a la placa (aunque se une indirectamente a la placa mediante el ISV que se recubre sobre la placa). Sin embargo, tambien en el ensayo de puente especffico descrito en los ejemplos (que es un ensayo competitivo) el anticuerpo analftico se usa todavfa como agente analftico (es decir, para determinar si el ISV de interes se une o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no, respectivamente). Tambien se preve que, basandose en la divulgacion adicional en el presente documento, el experto sera capaz de disenar otros formatos de ensayo en los que el anticuerpo analftico puede usarse como agente analftico con el fin de determinar si un ISV dado puede unirse o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no).
Como resultado de la investigacion sobre Fv de cadena sencilla o “ScFv” (que son construcciones que contienen dominios variables individuales de inmunoglobulina que, de manera similar a los ISV, no estan asociados con dominios constantes), se ha descrito en la tecnica que el extremo C-terminal de un dominio variable de inmunoglobulina forma una zona hidrofoba que en un anticuerpo esta incrustada en la superficie de contacto entre el dominio variable y el dominio constante pero que queda expuesta al disolvente cuando el dominio variable no esta asociado con un dominio constante (Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). Tambien se ha descrito que el extremo C-terminal expuesto puede formar epftopos de celulas B que pueden dan lugar a y/o interaccionar con anticuerpos anti-farmaco (emergentes y/o preexistentes) (documento WO 11/07586), cuya presencia puede determinarse entonces usando los ensayos de ADA a los que se hizo referencia anteriormente. Por este motivo, se ha propuesto realizar mutaciones a algunos de los residuos de aminoacido que forman parte del extremo C-terminal de los dominios variables para reducir dicha hidrofobicidad y/o para eliminar dichos epftopos. Por ejemplo, Nieba et al. sugieren mutar las posiciones 11, 14, 41, 84, 87 y/u 89 de una region VH (numeracion segun Kabat), mientras que en el documento Wo 11/07586 se sugiere mutar las posiciones 99, 101 y/o 148 (numeracion de AHo) de un dominio VL o las posiciones 12, 97, 98, 99, 103 y/o 144 de un dominio VH (de nuevo, numeracion de AHo, estas posiciones corresponden a las posiciones 11, 83, 84, 85, 89 y 103 segun Kabat).
Sin embargo, ninguna de estas referencias reconoce que determinadas protefnas presentes en la sangre o el suero de un sujeto pueden interferir en los ensayos de ADA que implican ISV, y debido a esto estas referencias no se refieren a (ni ofrecen una solucion para) el problema de como evitar la interferencia proteica no especffica en tales ensayos de ADA de modo que se permita que se use el ensayo de ADA para determinar la verdadera presencia/extension de anticuerpos anti-farmaco (que surgen o preexistentes) en la muestra que va a someterse a prueba.
El documento WO 2010/042815 se refiere a fragmentos de anticuerpo VHH para su uso en la deteccion y el tratamiento de cancer. El documento WO2011/073954 se refiere a anticuerpos antagonistas y a sus fragmentos Fab contra GP VI y a usos de los mismos. El documento WO2013/024059 se refiere a protefna y peptidos modificados que tienen capacidad reducida para unirse a anticuerpos preexistentes.
En cambio, la presente descripcion proporciona metodos y ensayos que permiten facilmente al experto predecir si un dominio variable individual de inmunoglobulina tendra o no tendencia a experimentar interferencia proteica no especffica en un ensayo de ADA. Los metodos y ensayos descritos en el presente documento tambien permiten al experto, cuando se encuentra que un dominio variable puede tener tendencia o riesgo de experimentar tal interferencia proteica en un ensayo de ADA, someter a prueba facilmente modificaciones (propuestas) a un dominio variable con el fin de predecir si cualquiera de tales modificaciones (propuestas) reducira o evitara esencialmente por completo tal interferencia proteica.
La presente invencion tambien describe varias modificaciones que pueden realizarse a dominios variables con el fin de reducir o evitar esencialmente tal interferencia proteica. Segun un aspecto no limitativo, esta modificacion implica anadir un numero limitado (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) de residuos de aminoacido (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) al extremo C-terminal del dominio variable. Sorprendentemente, se ha encontrado que, para varios dominios variables diferentes o construcciones basadas en los mismos, la adicion de incluso un solo residuo de aminoacido al extremo C-terminal (tal como un solo residuo de alanina) puede eliminar sustancialmente o incluso esencialmente por completo el problema de interferencia proteica en ensayos de ADA, aun cuando la adicion de un aminoacido de este tipo por sf mismo no es suficiente para “cubrir” o “incrustar” la zona hidrofoba que segun Nieba et al. esta presente en el extremo C-terminal de un ISV. De manera similar, pero sin querer limitar la invencion en modo alguno o a ningun mecanismo o explicacion, tambien se supone que anadir un aminoacido de este tipo no serfa suficiente para “cubrir” o “incrustar” cualquier epftopo de celulas B que segun el documento WO 11/07586 puede estar presente en el extremo C- terminal de un dominio variable. Tambien debe observarse que, aunque segun este aspecto especffico de la
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presente invencion, anadir un numero limitado o incluso un solo aminoacido en el extremo C-terminal del dominio variable (es decir, sin realizar ninguna sustitucion dentro de la propia region C-terminal, tal como proponen Nieba et al y el documento WO 11/07586) puede reducir, y en muchos casos reducira, significativamente o incluso eliminara esencialmente el problema de la interferencia proteica no especffica, tambien esta dentro del alcance de este aspecto de la invencion que tales adiciones al extremo C-terminal se combinen con mutaciones en la region C- terminal. A este respecto, sin embargo, tambien debe observarse que la invencion no esta particularmente limitada en cuanto a la justificacion subyacente a la realizacion de tales mutaciones. Por ejemplo, se sabe bien como realizar mutaciones a residuos de aminoacido dentro del extremo C-terminal (incluyendo en aquellas posiciones a las que hacen referencia explfcitamente Nieba et al. y en el documento WO 11/07586) con el fin de humanizar un dominio variable (incluyendo, sin limitacion, un dominio Vhh) o con el fin de “camelizar” un dominio Vh (por ejemplo, se hace referencia al documento WO 08/020079 y algunas de las demas solicitudes de Ablynx N.V. a las que se hace referencia en el presente documento).
Se preve que los metodos, ensayos y modificaciones ensenados en el presente documento pueden aplicarse a cualquier dominio variable que no este ligado a o asociado de otro modo con un dominio constante (o con otro grupo o resto peptfdico que funciona para “blindar”, cubrir o “incrustar” la region C-terminal del dominio variable) y mas generalmente, a cualquier dominio variable que tiene una region C-terminal que esta expuesta al disolvente. Sin embargo, segun un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, las modificaciones pueden aplicarse en particular a dominios variables de cadena pesada (dominios Vh), y segun un aspecto especffico de la invencion a dominios Vhh.
Tambien se preve que los metodos, ensayos y modificaciones descritos en el presente documento puedan aplicarse de manera adecuada a construcciones de protefna que contienen uno o mas dominios variables, y en particular a tales construcciones en las que un dominio variable forma la parte C-terminal de la construccion o, en el caso de los metodos y ensayos descritos en el presente documento, en los que la region C-terminal de un dominio variable esta por lo demas expuesto al disolvente. De nuevo, segun un aspecto preferido, pero no limitativo de la invencion, las modificaciones se aplican a construcciones en las que un dominio Vh (y en particular un dominio Vhh) forma la parte C-terminal de la construccion o, en caso de los metodos y ensayos descritos en el presente documento, esta por lo demas expuesto al disolvente.
Algunos ejemplos no limitativos de tales construcciones son construcciones multivalentes, multiespecfficas (tales como biespecfficas) o multiparatopicas (tales como biparatopicas) que contienen dos o mas ISV ligados directamente o mediante uno o mas ligadores adecuados (de nuevo con, segun un aspecto especffico, un dominio Vh o Vhh) que forma la parte C-terminal de una construccion de este tipo. Por ejemplo, y sin limitacion, una construccion de este tipo puede componerse totalmente de dominios Vh, y en particular de Nanobodies (es decir, dominios Vhh, dominios Vhh humanizados o dominios Vh camelizados), de nuevo ligados directamente o mediante uno o mas ligadores adecuados. Para algunos ejemplos no limitativos de tales construcciones y ensenanzas generales sobre como pueden producirse tales construcciones (en particular basandose en Nanobodies), por ejemplo, se hace referencia a Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001) asf como al artfculo de revision de Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).
Sin embargo, tambien se preve, por ejemplo, que la invencion pueda aplicarse a otras construcciones que tienen un dominio variable expuesto al disolvente y, en particular, tienen un dominio variable en su extremo C-terminal, tal como, por ejemplo, Fv de cadena sencilla, y en particular, ScFv que tienen su dominio variable de cadena pesada en el extremo C-terminal.
En la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, terminos como “ISV”, “agente analftico” e “interferencia proteica” tienen el significado tal como se define adicionalmente en el presente documento.
En particular, un ISV tal como se describe en el presente documento puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
Ademas, cualquier protefna o polipeptido que comprende un ISV (tal como un farmaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos uno) de tales ISV en su extremo C-terminal. De nuevo, dicho ISV puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
La invencion descrita en el presente documento en particular esta destinada y es adecuada para aplicarse a ISV que comprenden, se basan en y/o han derivado de dominios variables de cadena pesada, tales como dominios VH (incluyendo dominios VH humanos) y Nanobodies tales como dominios Vhh (incluyendo dominios VHH humanizados y de secuencia optimizada) o dominios VH camelizados. Estos pueden ser sinteticos (por ejemplo, obtenidos partiendo de una coleccion sintetica y/o basandose en regiones de armazon fijas), semisinteticos (por ejemplo, humanizados, camelizados o de secuencia optimizada, u obtenidos mediante maduracion de afinidad o injerto de CDR, partiendo de un dominio natural VH o VHH) o dominios VH o VHH que se producen de manera totalmente natural. Por tanto, la invencion se describira adicionalmente en el presente documento con referencia a
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los ISV que son, se basan en y/o han derivado de dominios VH o VHH.
Al establecer la presente invencion, se ha encontrado que en algunos ensayos (tales como, por ejemplo, en inmunoensayos de ADA) que se usan para analizar muestras biologicas (tales como muestras de sangre incluyendo sangre completa, suero y plasma, lfquido ocular, lfquido broncoalveolar/LBA, lfquido cefalorraqufdeo u otras muestras de lfquidos biologicos) puede producirse interferencia proteica, y que tal interferencia proteica puede dar lugar a una senal no especffica en algunos de estos ensayos y/o en algunas de estas muestras. Tambien se ha encontrado que puede producirse tal interferencia proteica no solamente en muestras que se obtuvieron de sujetos que se han tratado con los ISV (y en particular con Nanobodies; o con protefnas, polipeptidos u otros farmacos biologicos que comprenden al menos un ISV o Nanobody de este tipo) y/o a los que se les han administrado los mismos (tales como pacientes o sujetos en ensayos clfnicos), pero tambien en muestras de sujetos que nunca han recibido un ISV (indicando que tal interferencia se debe probablemente a una interaccion no especffica entre protefnas con protefnas preexistentes en vez de cualquier ADA emergente).
Aunque se ha encontrado que tal interferencia proteica y/o tal senal en tales ensayos no esta asociada con ningun cambio o reduccion en las propiedades farmacologicas (tales como propiedades farmacocineticas/PK o farmacodinamicas/PD) de los ISV, serfa deseable disponer de tecnicas para predecir, detectar, reducir y/o si es posible evitar tal interferencia proteica no especffica. Esto es el objetivo general de la presente invencion.
En particular, la invencion proporciona, y en determinados aspectos especfficos pero no limitativos se refiere a:
- - ensayos que pueden usarse para predecir si un ISV dado estara sujeto a tal interferencia proteica y/o dara lugar a tal senal (no especffica) en un ensayo de este tipo (tal como, por ejemplo, en un inmunoensayo de ADA). Tales ensayos predictivos podrfan usarse, por ejemplo, para someter a prueba si un ISV dado podrfa tener tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica y/o tal senal; seleccionar los iSv que no son propensos, o lo son menos, a tal interferencia proteica o a dar lugar a tal senal; como ensayo o prueba que puede usarse para someter a prueba si determinada(s) modificacion/modificaciones a un ISV reducira(n) (total o parcialmente) su tendencia a dar lugar a tal interferencia o tal senal; y/o como ensayo o prueba que puede usarse para guiar la modificacion o mejora de un ISV de modo que se reduzca su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica o senal;
- metodos para modificar y/o mejorar los ISV de modo que se elimine o se reduzca su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica o tal senal;
- modificaciones que pueden introducirse en un ISV que eliminan o reducen su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica o tal senal;
- los ISV que se han seleccionado especfficamente (por ejemplo, usando el/los ensayo(s) descrito(s) en el presente documento) para que no tengan tendencia o una tendencia baja/menor/reducida a dar lugar a tal interferencia proteica o tal senal;
- ISV modificados y/o mejorados que no tienen tendencia o una tendencia baja/menor/reducida a dar lugar a tal interferencia proteica o tal senal.
Por ejemplo, en un primer aspecto no limitativo, la descripcion se refiere a un metodo que puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a (o tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a) interferencia proteica en un inmunoensayo (es decir, despues de haberse administrado a un sujeto, haberse obtenido una muestra de un lfquido biologico de dicho sujeto, y dicha muestra se somete a un inmunoensayo tal como se describe adicionalmente en el presente documento), comprendiendo dicho metodo realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
(i) poner en contacto dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado, generado y/o aislado basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un ISV o Nanobody (el “anticuerpo analftico”); y
(ii) determinar si dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) se une por dicho anticuerpo en dicho inmunoensayo.
En este metodo, cuando el ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody se une por dicho anticuerpo analftico, puede esperarse que dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody dara lugar a (o tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a) tal interferencia proteica (tal como se define adicionalmente en el presente documento). Basandose en esto, por ejemplo, dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody puede modificarse o mejorarse de modo que se reduzca o elimine su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica (que puede determinarse de nuevo usando el ensayo anterior), y algunas estrategias que pueden usarse para modificar dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en iSv o farmaco basado en Nanobody se describiran en el presente documento (y, por ejemplo, incluyen unir un pequeno numero de
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residuos de aminoacido al extremo C-terminal y/o introducir una o mas sustituciones de aminoacidos especfficas).
Por tanto, generalmente, la descripcion pone a disposicion del experto ensayos y metodos/tecnicas que pueden usarse para predecir la tendencia de un ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody a dar lugar a interferencia proteica y/o como herramienta para mejorar ISV de modo que se reduzca o evite su tendencia a dar lugar a interferencia proteica. Al hacer esto, la invencion tambien proporciona al experto medios para seleccionar los ISV, Nanobodies, farmacos basados en ISV o farmacos basados en Nanobody basandose en su capacidad baja o reducida (o ausencia de cualquier capacidad) a dar lugar a interferencia proteica. Por tanto, la descripcion proporciona al experto un ensayo y una herramienta importantes que pueden usarse en la optimizacion y el desarrollo de los ISV, Nanobodies, farmacos basados en ISV o farmacos basados en Nanobody.
Ademas, tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la invencion ensena al experto varios modos en los que puede modificarse o mejorarse un iSv, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody de modo que se reduzca o evite su tendencia a dar lugar a interferencia proteica. Por tanto, la invencion tambien pone a disposicion generalmente ISV, Nanobodies, farmacos basados en ISV o farmacos basados en Nanobody modificados y/o mejorados con tendencia reducida, baja o sin tendencia a dar lugar a interferencia proteica.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la descripcion puede usarse en particular para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo, y mas en particular en un ensayo de ADA. Dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra ISV generalmente, y puede ser en particular un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra el ISV usado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
De nuevo, tal como se menciona en el presente documento, un ISV tal como se describe en el presente documento puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
Ademas, cualquier protefna o polipeptido que comprende un ISV (tal como un farmaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos uno) de tales ISV en su extremo C-terminal. De nuevo, dicho ISV puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
La muestra que se somete a prueba en dicho inmunoensayo o ensayo de ADA tambien se denomina en el presente documento “muestra de prueba” o “muestra de ensayo”. Para evitar confusiones, tal como “muestra de prueba” o “muestra de ensayo” no debe confundirse con la muestra biologica que se usa en el presente documento como material de partida para obtener el “anticuerpo analttico” (policlonal o monoclonal) usado en la invencion.
En un aspecto preferido particular pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de un ISV de este tipo. De nuevo, dicho ensayo de Ada puede ser, por ejemplo, un ensayo de Ada para detectar o medir ADA contra ISV generalmente, y puede ser en particular un ensayo de Ada para detectar o medir ADA contra el ISV usado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
En un aspecto incluso mas particular pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que esta destinado para determinar o medir si la muestra contiene cualquier Ada contra ISV. De nuevo, por ejemplo, tal inmunoensayo puede ser uno de los tipos conocidos de ensayo de ADA (para los que se hace referencia, por ejemplo, a la tecnica anterior sobre ensayos de ADA citados en el presente documento) que se realiza para determinar o medir si esta presente cualquier ADA contra dicho ISV en la “muestra de prueba”, en el que dicha muestra de prueba es una muestra de lfquido biologico (tal como se describe en el presente documento) que se obtiene de un sujeto al que se le ha administrado dicho ISV (tal como se describe adicionalmente en el presente documento).
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, en todos estos aspectos (y los aspectos adicionales de la invencion descritos en el presente documento), la descripcion tambien puede usarse para seleccionar ISV que no son propensos, o lo son menos, a tal interferencia proteica en tales inmunoensayos o ensayos de ADA; como ensayo o prueba que puede usarse para someter a prueba si determinada(s) modificacion/modificaciones a un ISV reducira(n) (total o parcialmente) su tendencia a dar lugar a tal interferencia en tales inmunoensayos o ensayos de ADA; y/o como ensayo o prueba que puede usarse para guiar la modificacion o mejora de un ISV de modo que se reduzca su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica en tales inmunoensayos o ensayos de ADA.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invencion quedaran claro a partir de la descripcion
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adicional en el presente documento y las reivindicaciones.
En la presente memoria descriptiva, siempre que se usa el termino “ISV”, debe entenderse que:
- un ISV de este tipo es preferentemente un Nanobody, en el que el termino “Nanobody” es generalmente tal como se define en o bien el documento WO 08/020079 o bien el documento WO 09/138519, y por tanto, en un aspecto especffico indica generalmente un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado (tal como un VH humano camelizado) o generalmente un VHH de secuencia optimizada (tal como, por ejemplo, optimizado para mayor estabilidad y/o solubilidad qufmica, maximo solapamiento con regiones de armazon humanas conocidas y maxima expresion). Se indica que los terminos Nanobody o Nanobodies son marcas registradas de Ablynx N.V. y, por tanto, tambien puede hacerse referencia a ellos como Nanobody® y/o Nanobodies®);
- el termino “ISV” en su sentido mas amplio tambien incluye “productos biologicos basados en ISV” y, cuando el ISV es un Nanobody, “productos biologicos basados en Nanobody”. Un “producto biologico basado en ISV” se define en el presente documento como una protefna, un polipeptido u otro farmaco biologico que comprende o consiste esencialmente en al menos un (tal como uno, dos o tres) ISV. De manera similar, un “producto biologico basado en Nanobody” se define como una protefna, un polipeptido u otro farmaco biologico que comprende o consiste esencialmente en al menos un (tal como uno, dos o tres) Nanobodies. Como con el termino “ISV”, siempre que se usa el termino “producto biologico basado en ISV”, debe entenderse que un producto biologico basado en ISV de este tipo es preferentemente un producto biologico basado en Nanobody. Dentro del contexto de la presente invencion, tanto un “producto biologico basado en ISV” como un “producto biologico basado en Nanobody” puede ser, por ejemplo, una construccion de ISV o construccion de Nanobody monovalente, bivalente (o multivalente), biespecffica (o multiespecffica) y biparatopica (o “multiparatopica), respectivamente. Ademas, cualquier producto biologico basado en ISV o basado en Nanobody puede comprender, por ejemplo, ademas del uno o mas (tal como uno, dos o tres) ISV o Nanobodies, opcionalmente ademas uno o mas (tal como uno o dos) de otros restos terapeuticos adicionales y/o uno o mas (tal como uno o dos) de otros restos que influyen en las propiedades farmacocineticas o farmacodinamicas del producto biologico basado en ISV o basado en Nanobody (tales como su semivida). Ejemplos adecuados de tales restos terapeuticos u otros adicionales resultaran claros para el experto, y por ejemplo, generalmente pueden incluir cualquier protefna, polipeptido terapeuticamente activo u otro dominio de union o unidad de union, asf como, por ejemplo, modificaciones tales como las descritas en las paginas 149 a 152 del documento WO 09/138159. Un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody es preferentemente un agente terapeutico o esta destinado para su uso como agente terapeutico (lo que incluye profilaxis y diagnostico) y con este proposito contiene preferentemente al menos un ISV contra una diana terapeuticamente relevante (tal como, por ejemplo, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 u otras interleucinas, etc.). Para algunos ejemplos especfficos pero no limitativos de tales productos biologicos basados en ISV o basados en Nanobody, por ejemplo, se hace referencia a las diversas solicitudes de Ablynx N.V. (tales como, por ejemplo, y sin limitacion los documentos WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 y WO 2009/068627), asf como, por ejemplo, (y sin limitacion) a solicitudes tales como los documentos WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 y WO 07/085814. Ademas, en la presente memoria descriptiva, a menos que se mencione explfcitamente de otro modo en el presente documento, todos los terminos mencionados en el presente documento tienen el significado facilitado en el documento WO 09/138519 (o en la tecnica anterior citada en el documento WO 09/138519) o el documento WO 08/020079 (o en la tecnica anterior citada en el documento WO 08/020079). Ademas, cuando no se describe especfficamente un metodo o una tecnica en el presente documento, puede realizarse tal como se describe en el documento WO 09/138519 (o en la tecnica anterior citada en el documento WO 09/138519) o el documento WO 08/020079 (o en la tecnica anterior citada en el documento WO 08/020079).
En particular, los siguientes terminos tienen el mismo significado que se facilita en, y/o cuando sea aplicable puede determinarse de la manera descrita en las paginas 62-75 del documento WO 09/138519: “agonista”, “antagonista”, “agonista inverso”, “residuo de aminoacido apolar, no cargado”, “residuo de aminoacido polar no cargado”, “residuo de aminoacido polar, cargado”, “identidad de secuencia”, “exactamente iguales” y “diferencia de aminoacidos” (cuando se hace referencia a una comparacion de secuencia de dos secuencias de aminoacidos), “(en forma) esencialmente aislada”, “dominio”, “dominio de union”, “determinante antigenico”, “epftopo”, “contra” o “dirigido contra” (un antfgeno), “especificidad” y “semivida”. Ademas, los terminos “que modula” y “para modular”, “sitio de interaccion”, “especffico para”, “bloqueo cruzado”, “bloqueado de manera cruzada” y “que produce bloqueo de manera cruzada” y “esencialmente independiente del pH” son tal como se definen en (y/o pueden determinarse tal como se describe en) las paginas 74-79 del documento WO 10/130832 del solicitante. Ademas, cuando se hace referencia a una construccion, compuesto, protefna o polipeptido de la invencion, terminos como “monovalente”, “bivalente” (o “multivalente”), “biespecffico” (o “multiespecffico”) y “biparatopico” (o “multiparatopico”) pueden tener el significado facilitado en los documentos WO 09/138,519, WO 10/130832 o WO 08/020079.
El termino “semivida” tal como se usa en el presente documento en relacion con un ISV, Nanobody, producto biologico basado en ISV, producto biologico basado en Nanobody o cualquier otra secuencia de aminoacidos, compuesto o polipeptido puede definirse generalmente tal como se describe en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079 y tal como se menciona en ese documento se refiere al tiempo que lleva que la concentracion en suero de la secuencia de aminoacidos, el compuesto o polipeptido se reduzca en el 50 %, in vivo,
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por ejemplo, debido a degradacion de la secuencia o el compuesto y/o aclaramiento o secuestro de la secuencia o el compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia de aminoacidos, un compuesto o polipeptido de la invencion puede determinarse de cualquier manera conocida per se, tal como mediante analisis farmacocinetico. Las tecnicas adecuadas estaran claras para el experto en la tecnica, y pueden ser, por ejemplo, generalmente tal como se describe en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079. Tal como se menciona tambien en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079, la semivida puede expresarse usando parametros tales como el t1/2-alfa, t1/2-beta y el area bajo la curva (ABC). A este respecto, debe observarse que el termino “semivida” tal como se usa en el presente documento se refiere en particular al t1/2-beta o semivida terminal (en la que el t1 /2-alfa y/o el ABC o ambos pueden considerarse). Por ejemplo, se hace referencia a la parte experimental mas adelante, asf como a manuales convencionales, tales como Kennet, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Tambien se hace referencia a “Pharmacokinetis”, M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edicion rev. (1982). De manera similar, los terminos “aumento de la semivida” o “semivida aumentada” tambien tal como se definen en el parrafo o) en la pagina 57 del documento WO 08/020079 y se refieren en particular a un aumento del t1/2-beta, o bien con o bien sin un aumento del t1/2-alfa y/o el ABC o ambos.
Cuando no se define especfficamente un termino en el presente documento, tiene su significado habitual en la tecnica, que resultara claro para el experto. Por ejemplo, se hace referencia a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2a ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2a edicion, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6a ed.), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10a ed. Blackwell Publishing, R.U. (2001); y Janeway et al., “Immunobiology” (6a ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Nueva York (2005), asf como a la tecnica anterior general citada en el presente documento.
Ademas, en el presente documento, los residuos de aminoacido de un Nanobody se numeran segun la numeracion general para dominios VH facilitada por Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, publicacion n.° 91), tal como se aplica a dominios VHH de camelidos en el artfculo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods, 23 de junio de 2000; 240 (1-2): 185-195; o tal como se hace referencia en el presente documento. Segun esta numeracion, FR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoacidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 95-102, y FR4 de un Nanobody comprende los residuos de aminoacido en las posiciones 103-113. [A este respecto, debe observarse que, tal como se sabe bien en la tecnica para dominios VH y para dominios VHH, el numero total de residuos de aminoacido en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al numero total de residuos de aminoacido indicado por la numeracion de Kabat (es decir, una o mas posiciones segun la numeracion de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener mas residuos de aminoacido que el numero permitido por la numeracion de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeracion segun Kabat puede corresponder o no a la numeracion real de los residuos de aminoacido en la secuencia real. Generalmente, sin embargo, puede decirse que, segun la numeracion de Kabat e independientemente del numero de residuos de aminoacido en las CDR, la posicion 1 segun la numeracion de Kabat corresponde al inicio de FR1 y viceversa, la posicion 36 segun la numeracion de Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceversa, la posicion 66 segun la numeracion de Kabat corresponde al inicio de FR3 y viceversa, y la posicion 103 segun la numeracion de Kabat corresponde al inicio de FR4 y viceversa.].
Metodos alternativos para la numeracion de residuos de aminoacido de dominios VH, metodos que tambien pueden aplicarse de manera analoga a dominios VHH de camelidos y a Nanobodies, son el metodo descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), la denominada “definicion de AbM” y la denominada “definicion de contacto”. Sin embargo, en la presente descripcion, aspectos y figuras, se seguira la numeracion segun Kabat tal como se aplica a dominios VHH por Riechmann y Muyldermans, a menos que se indique de otro modo.
Tambien debe observarse que las figuras, cualquier lista de secuencia y la parte experimental/ejemplos se proporcionan unicamente para ilustrar adicionalmente la invencion y no deben interpretarse ni considerarse limitativas del alcance de la invencion y/o de las reivindicaciones adjuntas en modo alguno, a menos que se indique explfcitamente de otro modo en el presente documento.
Debe observarse ademas que la presente invencion no se limita especfficamente a ninguna causalidad, explicacion, hipotesis o mecanismo de/para la interferencia proteica (y/o senales que surgen en inmunoensayos) que se observa en, y que puede reducirse segun, la presente invencion. Sin embargo, se supone que la sangre o el suero (u otros lfquidos biologicos, tales como los mencionados en el presente documento) de determinados individuos o grupos de individuos puede contener determinadas protefnas (preexistentes) que en determinadas circunstancias pueden unirse (de manera no especffica) a los ISV conduciendo a una senal interferente en determinados ensayos que se
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usan para analizar muestras de sangre o suero obtenidas de tales individuos. Esto se basa, entre otros, en la observacion realizada al establecer la presente invencion de que la interferencia proteica no especffica que se aborda mediante la presente invencion no solamente se produce cuando se someten a ensayo muestras que se han obtenido de sujetos a los que se les ha administrado previamente un ISV, sino tambien cuando se someten a ensayo muestras que se han obtenido de sujetos que no han recibido previamente un ISV.
En particular, basandose en las observaciones que se han realizado al establecer la presente invencion, y aunque la invencion no se limita a las mismas, se cree que tales protefnas (preexistentes) pueden (ser capaces de) unirse en particular al extremo C-terminal de tales ISV (que, en anticuerpo monoclonal de 4 cadenas convencional de tamano completo asf como en los anticuerpos “de cadena pesada unicamente” que se encuentran en Camelidae, se ligan a la parte restante del anticuerpo, es decir, a la region CH1 en anticuerpos monoclonales convencionales y a la region bisagra en los anticuerpos de cadena pesada de Camelidae, respectivamente, y por tanto, en tales anticuerpos de tamano completo pueden blindarse frente a tal interferencia proteica).
Esto se confirma por los hallazgos realizados por los presentes inventores al establecer la presente invencion (hallazgos que se describen adicionalmente en el presente documento) de que determinadas modificaciones (simples) de los ISV en su extremo C-terminal pueden reducir sustancialmente o impedir esencialmente tal interferencia proteica. Por consiguiente, metodos para modificar los ISV de esta manera asf como los ISV que se han modificado de esta manera forman aspectos adicionales de la invencion, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.
La presente invencion puede usarse en particular para reducir o evitar la interferencia proteica y/o senales debidas a union no especffica en inmunoensayos que se realizan con muestras biologicas (tales como muestras de sangre o suero) obtenidas de un sujeto al que se le ha administrado un farmaco (biologico) (de nuevo, tales muestras tambien se denominan en el presente documento “muestra de prueba” o “muestra de ensayo”). Algunos ejemplos de esto son inmunoensayos que se usan para la caracterizacion de la disposicion del farmaco y de la formacion de anticuerpos tras la administracion de un farmaco biologico a un sujeto, tales como aquellos a los que se hace referencia en “Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacokinetics of Therapeutic Proteins” (documento CHMP/EWP/89249/2004 con fecha del 27 de enero de 2007) expedido por el Comite de Especialidades Farmaceuticas para Uso Humano (CHMP) de la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA). Tal como se afirma en las paginas 4 y 5 de este documento:
“Se han identificado varias posibles debilidades y pueden dar como resultado una caracterizacion erronea de la disposicion del farmaco y de la formacion de anticuerpos. Deben considerarse los siguientes asuntos [...]:
Inmunoensayo
Ensayo farmacologico:
[...]
(iii) Interferencia por sustancias endogenas.
(iv) Interferencia por componentes del plasma o anticuerpos anti-farmaco que se unen al analito y que inhiben la union complementaria al anticuerpo de captura’’.
La descripcion puede usarse en particular con el fin de predecir, reducir o evitar este tipo de interferencia en inmunoensayos que se usan en el analisis de muestras de prueba/muestras de ensayo de lfquidos biologicos tomadas de sujetos a los que se les ha administrado ISV (y en particular Nanobodies; o un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento).
La descripcion puede usarse en particular con el fin de predecir, reducir o evitar este tipo de interferencia proteica (no especffica) en inmunoensayos que se usan para la caracterizacion de la disposicion del farmaco y/o para determinar la formacion de cualquier anticuerpo ADA (anti-farmaco). A este respecto, debe observarse que generalmente en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, cuando se usa una redaccion como “predecir, reducir o evitar la interferencia proteica”, esto no solamente incluye predecir, reducir o evitar tal interferencia proteica per se, sino tambien generalmente predecir, reducir o evitar la aparicion de senales no especfficas en inmunoensayos (tales como aquellos en los que pueden producirse senales (no especfficas) asociadas con interferencia proteica, por ejemplo, en ensayos de ADA), y en particular, predecir, reducir o evitar, en tales inmunoensayos, la aparicion de senales no especfficas que, cuando se observan en un ensayo de este tipo, habitualmente se atribuyen a, estan asociadas con y/o se toman como signo de interferencia proteica (no especffica). A este respecto, debe observarse generalmente que, tal como se menciona en el presente documento, la presente invencion no se limita especfficamente a ninguna causalidad, explicacion, hipotesis o mecanismo.
En un aspecto especffico pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir, evitar o reducir tal
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interferencia proteica en ensayos de “anticuerpo anti-farmaco” o “ADA” que se realizan con muestras (es decir, “muestras de prueba”) de lfquidos biologicos tomadas de sujetos a los que se les ha administrado ISV (y en particular, Nanobodies; o un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento).
En otro aspecto especffico pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir, evitar o reducir tal interferencia proteica (y/o senales no especfficas habitualmente asociadas con la misma) en ensayos de “anticuerpo anti-farmaco” o “ADA” que se usan para detectar, medir y/o caracterizar la presencia de (cualquier) anticuerpo anti - farmaco contra uno o mas ISV (y en particular contra Nanobodies; o un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento). En particular, la descripcion puede usarse para predecir, evitar o reducir tal interferencia proteica en tales ensayos de “anticuerpo anti-farmaco” o “ADA” que se realizan con muestras (es decir, “muestras de prueba”) de lfquidos biologicos, y mas en particular con muestras de lfquidos biologicos que se han obtenido de un sujeto al que se le han administrado uno o mas ISV o Nanobody de este tipo (o un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento). Por ejemplo, la descripcion puede usarse para predecir, evitar o reducir tal interferencia proteica en tales ensayos de “anticuerpo anti-farmaco” o “ADA” que se usan para detectar, medir y/o caracterizar la presencia de (cualquier) anticuerpo anti-farmaco contra el ISV o Nanobody (o un producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento) que se ha administrado al sujeto del que se ha obtenido la muestra (o bien en el contexto de un ensayo clfnico y/o bien en el contexto de terapia).
Por tanto, en un aspecto especffico, pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir, evitar o reducir tal interferencia proteica (y/o senales no especfficas habitualmente asociadas con la misma) en muestras biologicas (es decir, “muestras de prueba”) obtenidas de un sujeto al que se le han administrado uno o mas ISV o Nanobodies de este tipo (o un producto biologico basado en iSv o producto biologico basado en Nanobody, tal como se define adicionalmente en el presente documento), en el que dichas muestras son adecuadas para y/o estan destinadas para su uso en un ensayo inmunologico, tal como un ensayo de ADA. Tal como se menciono, una muestra biologica de este tipo puede ser sangre (incluyendo sangre completa, suero o plasma), lfquido ocular, lfquido broncoalveolar/LBA, lfquido cefalorraqufdeo o cualquier otra muestra o lfquido biologico adecuado que sea adecuado para su uso en un inmunoensayo, y en particular un ensayo de ADA.
En un aspecto especffico, pero no limitativo, una muestra de prueba de este tipo puede haberse obtenido de un sujeto que se ha sometido a multiples administraciones (por ejemplo, al menos de 1 a 3 administraciones independientes a lo largo de un periodo de al menos 10 dfas, tal como al menos un mes o mas tiempo) y/o a tratamiento prolongado (es decir, tratamiento durante al menos 10 dfas tal como al menos un mes) con un ISV, Nanobody, un producto biologico basado en ISV (tal como se define adicionalmente en el presente documento) o producto biologico basado en Nanobody (tal como se define adicionalmente en el presente documento). Un ISV, Nanobody, producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody de este tipo puede haberse administrado, por ejemplo, a dicho sujeto en el contexto de terapia o en el contexto de un ensayo clfnico.
En un aspecto especffico, pero no limitativo, una muestra de prueba de este tipo puede haberse obtenido de un sujeto al que se le ha administrado un ISV, Nanobody, producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody, que tiene (y/o se le ha proporcionado) una semivida aumentada (tal como se define en el presente documento, y en comparacion con un ISV monovalente), por ejemplo, una semivida de al menos 1 dfa, preferentemente al menos 3 dfas, mas preferentemente al menos 7 dfas, tal como al menos 10 dfas en el sujeto al que se le ha administrado el mismo.
A un ISV, Nanobody, producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody se le proporciona una semivida aumentada mediante funcionalizacion y/o incluyendo en la construccion un resto o una unidad de union que aumenta la semivida de la construccion. Ejemplos de tal funcionalizacion, restos o unidades de union resultaran claros para el experto y pueden ser, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, y por ejemplo, pueden incluir pegilacion, fusion a seroalbumina, o fusion a un peptido o unidad de union que puede unirse a una protefna serica tal como seroalbumina. Tal dominio de union o peptido de union a seroalbumina puede ser cualquier dominio de union o peptido de union a seroalbumina adecuado capaz de aumentar la semivida de la construccion (en comparacion con la misma construccion sin el dominio de union o peptido de union a seroalbumina), y pueden ser en particular peptidos de union a seroalbumina tal como se describen en el documento WO 2008/068280 por el solicitante (y en particular el documento WO 2009/127691 y la solicitud estadounidense no publicada previamente 61/301.819, ambos del solicitante), o un ISV de union a seroalbumina (tal como un Nanobody de union a seroalbumina; por ejemplo Alb-1 o una version humanizada de Alb-1 tal como Alb-8, para los que se hace referencia, por ejemplo, al documento WO 06/122787).
Por tanto, en un aspecto especffico pero no limitativo, una muestra biologica de este tipo puede haberse obtenido de un sujeto al que se le ha administrado un ISV, Nanobody, producto biologico basado en ISV o producto biologico basado en Nanobody que comprende un dominio de union o peptido de union a seroalbumina (humana).
Tal como ya se menciono anteriormente, en un aspecto no limitativo, la descripcion se refiere en general a un
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metodo que puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a (o tiene tendencia elevada o aumentada a dar lugar a) interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (es decir, despues de haberse administrado dicho ISV a un sujeto, haberse obtenido una muestra de un lfquido biologico de dicho sujeto, y haberse sometido dicho lfquido biologico a un inmunoensayo tal como se describe adicionalmente en el presente documento), comprendiendo dicho metodo realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
(i) poner en contacto dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado, generado y/o aislado basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un ISV o Nanobody (el “anticuerpo analftico”); y
(ii) determinar si dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) se une por dicho anticuerpo en dicho inmunoensayo.
De nuevo, tal como se menciona en el presente documento, un ISV tal como se describe en el presente documento puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
Ademas, cualquier protefna o polipeptido que comprende un ISV (tal como un farmaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos uno) de tales ISV en su extremo C-terminal. De nuevo, dicho ISV puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
En una realizacion alternativa, que tambien se describe adicionalmente en el presente documento, en vez del anticuerpo mencionado anteriormente obtenido de un sujeto humano, puede usarse el anticuerpo monoclonal denominado en el presente documento “21-4-3” (o “21-4” abreviado, veanse las SEQ ID NO 35 y 36 para las secuencias de VH y VL). Se genero 21-4 usando la tecnologfa del hibridoma partiendo de un raton inmunizado con la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825, tal como se describe adicionalmente en el ejemplo 7, y una lrnea celular de hibridoma (denominada “ABH0015”) que expresa 21 -4 se ha depositado el 4 de junio de 2012 ante la BCCM, Gante, Belgica, con el numero de acceso LMBP-9680-CB. Se ha mostrado que el anticuerpo monoclonal 21-4 reconoce el extremo C-terminal de la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825, extremo C-terminal que consiste en un Nanobody (VhH humanizado) producido contra el factor de Von Willebrand (vWF). 21-4 se produjo originariamente como reactivo analftico para su uso en la deteccion de Nanobodies proteicos (en particular, la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825) en muestras (de suero); sorprendentemente, se ha encontrado ahora que 21-4 tambien puede usarse con el fin de predecir si un ISV tiene tendencia a experimentar interferencia proteica no especffica (mas asf que algunos otros anticuerpos monoclonales (de raton), comparables producidos contra la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825 o contra otros Nanobodies).
En particular, se ha encontrado que si se mide la union de 21-4 a un ISV (o a una protefna o un polipeptido que contiene un ISV en su extremo C-terminal, o protefna o polipeptido similar tal como se menciona en el presente documento) proporciona un valor de UR de menos de 500 (despues de ajustar el valor de UR medido para el peso molecular para la protefna, segun la formula [UR medidas]/[PM de la protefna] x 106) cuando se determina segun el protocolo expuesto en el ejemplo 9, que dicho ISV o protefna no tendra probablemente tendencia a experimentar interferencia proteica (dentro de la confianza proporcionada por los datos expuestos en los ejemplos mas adelante). Con los propositos de la formula anterior, puede calcularse el PM como la suma de todos los PM de todos los residuos de aminoacido presentes en el ISV.
Por consiguiente, cualquier ISV, protefna o polipeptido descrito en el presente documento tiene preferentemente tal valor de UR para la union por 21-4 de menos de 500 (determinado segun el protocolo expuesto en el ejemplo 9, y despues de ajustar el valor de UR medido para el peso molecular del ISV o la protefna usados segun la formula expuesta anteriormente).
Por tanto, este aspecto de la descripcion se refiere en general a un metodo que puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a (o tiene tendencia elevada o aumentada a dar lugar a) interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (es decir, despues de haberse administrado dicho ISV a un sujeto, haberse obtenido una muestra de un lfquido biologico de dicho sujeto, y haberse sometido dicho lfquido biologico a un inmunoensayo tal como se describe adicionalmente en el presente documento), comprendiendo dicho metodo realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
(i) poner en contacto dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) con el anticuerpo monoclonal 21-4 (es decir, usado como “anticuerpo analftico”); y
(ii) determinar si dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) se une por el
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anticuerpo monoclonal 21-4 en dicho inmunoensayo.
Dicho metodo puede realizarse en particular usando BiaCore o una tecnica similar, y mas en particular usando el protocolo expuesto en el ejemplo 9. Tal como se menciona en el presente documento, cuando la union del ISV o farmaco basado en ISV en este protocolo muestra un valor de UR de menos de 500 (despues de ajustar el valor de UR medido para el peso molecular para la protefna, segun la formula [UR medidas]/[PM de la protefna] x 106), dicho ISV o protefna basada en ISV probablemente no se unira por ningun factor de interferencia presente en la sangre o el suero de un ser humano y/o no tendra probablemente tendencia a experimentar interferencia proteica no especffica en un ensayo de aDa (es decir, dentro de los grados de confianza expuestos en la parte experimental mas adelante).
De nuevo, tal como se menciona en el presente documento, un ISV tal como se describe en el presente documento puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
Ademas, cualquier protefna o polipeptido que comprende un ISV (tal como un farmaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos uno) de tales ISV en su extremo C-terminal. De nuevo, dicho ISV puede ser en particular o bien un Nanobody o bien un/otro ISV (es decir, distinto de un Nanobody) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanobody.
Tal como se menciona tambien en el presente documento, el metodo anterior que usa 21-4 tambien puede usarse para determinar si un ISV o una protefna o un polipeptido que comprende un ISV se une por (o tiene tendencia a unirse por) factor(es) de interferencia que estan presentes en la sangre o el suero de un ser humano.
Ademas, tal como se menciona en el presente documento, se preve que dicho metodo que usa 21-4 tambien puede usarse para predecir si cualquier protefna o polipeptido (tal como un fragmento de anticuerpo o ScFv) que tiene un dominio VH en su extremo C-terminal se unira por (o tiene tendencia a unirse por) factor(es) de interferencia que estan presentes en la sangre o el suero de un ser humano y/o tiene tendencia a experimentar interferencia proteica en un ensayo de ADA.
Ademas de 21-4, se preve que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento Fab adecuado) que contiene los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de 21-4 (veanse las SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente) o incluso solamente las secuencias de CDR de 21-4 (injertadas de manera adecuada en otros armazones de VH y VK adecuadas) tambien pueden usarse en los metodos descritos en el presente documento.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la descripcion puede usarse en particular para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo que es un ensayo de ADA. Dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra ISV generalmente, y puede ser en particular un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra el ISV usado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
En un aspecto preferido particular pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de un ISV de este tipo. De nuevo, dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra ISV generalmente, y puede ser en particular un ensayo de ADA para detectar o medir ADA contra el ISV usado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
En un aspecto incluso mas particular pero no limitativo, la descripcion puede usarse para predecir si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a interferencia proteica (tal como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de un ISV de este tipo. Por ejemplo, tal inmunoensayo puede ser un ensayo de ADA (es decir, que implican el ISV) que se realiza para determinar o medir si esta presente cualquier ADA contra dicho ISV en la muestra que se somete a prueba, en el que dicha muestra es una muestra de lfquido biologico (tal como se describe en el presente documento) que se obtiene de un sujeto al que se le ha administrado dicho ISV (tal como se describe adicionalmente en el presente documento). Por ejemplo, tal como se menciona adicionalmente en el presente documento, dicha muestra (es decir, la “muestra de prueba”) puede ser una muestra de (que incluye sangre completa, suero o plasma), lfquido ocular, lfquido broncoalveolar/LBA, lfquido cefalorraqufdeo o cualquier otro lfquido biologico adecuado, y puede ser en particular una muestra biologica que es adecuada para y/o esta destinada para su uso en un ensayo inmunologico, tal como un ensayo de ADA.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, en todos estos aspectos (y los aspectos adicionales de la invencion descritos en el presente documento), la invencion tambien puede usarse para seleccionar los ISV que no son propensos, o lo son menos, a tal interferencia proteica en tales inmunoensayos o ensayos de ADA; como ensayo o prueba que puede usarse para someter a prueba si determinadas modificacion/modificaciones a un ISV
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reduciran (total o parcialmente) su tendencia a dar lugar a tal interferencia en tales inmunoensayos o ensayos de ADA; y/o como ensayo o prueba que puede usarse para guiar la modificacion o mejora de un ISV de modo que se reduzca su tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica en tales inmunoensayos o ensayos de ADA.
Tal como se menciono, la etapa (i) del metodo descrito en el presente documento comprende poner en contacto dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un ISV o Nanobody (tal como se describe adicionalmente en el presente documento). En dicha etapa (i) del metodo descrito en el presente documento, “dicho ISV o Nanobody (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody)” se usa como antfgeno en el inmunoensayo (es decir, como la sustancia que va a detectarse). Ademas, en dicha etapa (i), el “anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un ISV o Nanobody” se usa como reactivo analftico (es decir, del mismo modo que se usan otros anticuerpos en inmunoensayos para detectar la presencia de un antfgeno contra el que se dirigen).
Tal como ya se menciono, y con el fin de entender mejor la invencion descrita en el presente documento, debe observarse que, en la etapa (i), el ISV se usara habitualmente como “antfgeno” (es decir, como el compuesto que va a detectarse), y el “anticuerpo analftico” se usara como agente analftico (es decir, como medio para detectar si un ISV dado se une o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no, respectivamente). Por ejemplo, cuando se realiza la etapa (i) en un formato de ELISA, el “anticuerpo/agente analftico” se unira habitualmente al portador (es decir, a la placa de ELISA) y el ISV estara (presente en) la muestra que va a someterse a prueba.
En cambio, debe observarse que en ensayos de ADA para detectar o medir ADA contra un ISV, el ISV se usa como “agente analftico” (es decir, como el compuesto usado para detectar si esta presente cualquier ADA), y los ADA son el “antfgeno” (es decir, el compuesto que va a detectarse). Por tanto, en estos ensayos, el ISV se unira habitualmente/a menudo al portador (tal como la placa de ELISA), mientras que los ADA (si los hubiera) estaran presentes en la muestra que se somete al ensayo.
Sin embargo, tal como ya se menciono, debe observarse generalmente que la descripcion no se limita a ensayos en los que el “anticuerpo analftico” se une al portador. Por ejemplo, en un modo alternativo de realizar un ensayo segun la invencion (tal como se muestra en el ejemplo 5), el anticuerpo analftico se usa mas bien como agente de puente y, por tanto, estara en disolucion en vez de unido a la placa (aunque se une indirectamente a la placa mediante el ISV que se recubre sobre la placa). Sin embargo, tambien en el ensayo (de puente) especffico descrito en el ejemplo 5 (que es un ensayo competitivo) el anticuerpo analftico se usa todavfa como agente analftico (es decir, para determinar si el ISV de interes se une o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no, respectivamente). Tambien se preve que, basandose en la divulgacion adicional en el presente documento, el experto sera capaz de disenar otros formatos de ensayo en los que el anticuerpo analftico puede usarse como agente analftico con el fin de determinar si un ISV dado puede unirse o no, respectivamente; y por tanto, tiene un riesgo elevado o aumentado de dar lugar a interferencia proteica o no).
El “anticuerpo analftico” usado en la etapa (i) puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.
Cuando el anticuerpo analftico es un anticuerpo policlonal, puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal (preparacion) que se ha obtenido/purificado/aislado de una muestra biologica obtenida de un sujeto humano (tal como sangre, plasma, celulas B u otra muestra o lfquido biologico adecuado del que pueden aislarse de manera adecuada anticuerpos policlonales). Esto puede ser, por ejemplo, una muestra biologica adecuada que se ha obtenido de un sujeto humano al que se le ha administrado al menos un ISV (tal como el ISV usado en la etapa (i), pero esto no se requiere ni es esencial), pero tambien puede ser (y preferentemente es) una muestra biologica adecuada de un sujeto humano que nunca ha recibido o se ha tratado con un ISV. Lo que es mas importante es que el anticuerpo policlonal se haya obtenido de dicha muestra biologica mediante un metodo que implica al menos una etapa de afinidad usando una matriz o columna de afinidad que porta un ISV como resto de afinidad (y una o mas etapas adicionales para obtener/purificar/aislar anticuerpos policlonales conocidos per se). Por ejemplo, el anticuerpo policlonal puede haberse obtenido de una muestra biologica de este tipo por medio de cromatograffa de afinidad usando una columna de afinidad que porta un ISV, tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 2. Esto puede realizarse, por ejemplo, usando tecnicas bien conocidas para cromatograffa de inmunoafinidad para aislar anticuerpos de una muestra biologica, usando una matriz de afinidad que porta un ISV como antfgeno. Tales tecnicas se conocen generalmente en la tecnica y ejemplos adecuados de las mismas resultaran claros para el experto basandose en la divulgacion del presente documento.
Un anticuerpo policlonal (preparacion) de este tipo puede ser en particular una IgG (o fraccion de IgG).
Por ejemplo, puede ser un anticuerpo policlonal que se ha obtenido por medio de un metodo que implica cromatograffa de (inmuno)afinidad, realizada con una muestra de lfquido biologico obtenido de un sujeto humano, usando como antfgeno unido a la matriz de afinidad un ISV (y en particular un Nanobody, tal como un VHH, VHH humanizado y/o de secuencia optimizada o un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) que no contiene
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un marcador C-terminal (es decir, cuyo extremo C-terminal termina con la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33)). En particular, el ISV usado como antfgeno unido a la matriz de afinidad puede ser un VHH humanizado o de secuencia optimizada (o alternativamente un VH humano camelizado correspondiente) cuyo extremo C-terminal termina con la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33). En un aspecto espedfico, pero no limitativo, el ISV usado como antfgeno unido a la matriz de afinidad puede ser un VHH humanizado o de secuencia optimizada que, como resultado de tal humanizacion u optimizacion de secuencia, comprende un residuo de prolina (P) en la posicion 14 en la que el VHH “virgen” correspondiente comprende una alanina (A) en la posicion 14 (dicho de otro modo, el ISV usado como antigeno es una version humanizada de un VHH que de manera natural comprende una alanina en la posicion 14, residuo de alanina que, como resultado de la humanizacion y/u optimizacion de secuencia, se ha reemplazado por un residuo de prolina (P)). El ISV usado como antigeno tambien puede comprender una o mas de otras sustituciones de aminoacidos como resultado de tal humanizacion u optimizacion de secuencia, por ejemplo, descrito generalmente en los documentos WO 08/020079 o WO 09/138519.
Algunos ejemplos espedficos de ISV que pueden usarse como antigeno para generar/aislar el “anticuerpo analftico” usado en la invencion se proporcionan en las SEQ ID NO: 1 y 2.
De nuevo, el metodo usado para obtener el anticuerpo policlonal tambien puede comprender, ademas de las etapas de (inmuno)afinidad, una o mas etapas adicionales para aislar/purificar un anticuerpo policlonal de la muestra biologica (realizadas o bien antes o bien despues de las etapas de afinidad). De nuevo, tales etapas y tecnicas para realizarlas resultaran claras para el experto.
Por tanto, en un aspecto, la descripcion comprende un metodo tal como se describe adicionalmente en el presente documento que comprende las etapas (i) y (ii) descritas en el presente documento, en el que el “anticuerpo analftico” (es decir, el anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un iSv o Nanobody) se ha obtenido de una muestra biologica obtenida de un sujeto humano (en el que dicha muestra biologica es una muestra que es adecuada para su uso en un metodo para generar/aislar un anticuerpo de dicha muestra) usando un metodo que comprende al menos una etapa de afinidad (tal como una etapa de cromatograffa de afinidad, tal como cromatograffa de inmunoafinidad) en el que un ISV (y preferentemente un Nanobody) se usa como antfgeno, y preferentemente un ISV se usa como antfgeno que comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como secuencia C-terminal, y mas preferentemente se usa un Nanobody humanizado y/o de secuencia optimizada como antfgeno que comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como secuencia C-terminal, e incluso mas preferentemente, se usa un Nanobody humanizado y/o de secuencia optimizada como antfgeno que comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como secuencia C-terminal y que comprende un residuo de prolina en la posicion 14, tal como un Nanobody que comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como secuencia C-terminal y que comprende un residuo de prolina en la posicion 14 que se ha introducido en el Nanobody como resultado de dicha humanizacion y/u optimizacion de secuencia (por ejemplo, para reemplazar un residuo de alanina que se produce de manera natural en dicha posicion en el VHH que se ha humanizado y/o optimizado su secuencia).
Los ISV anteriores tambien pueden usarse en metodos para aislar anticuerpos monoclonales (de nuevo partiendo de una muestra biologica adecuada obtenida de un ser humano) que son adecuados para su uso en la invencion como “anticuerpo analftico”.
Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de este tipo puede obtenerse partiendo de sangre, celulas B u otra muestra o material adecuado para aislar anticuerpos, puede seleccionarse basandose en su capacidad para reconocer y/o unirse a (el extremo C-terminal de) un ISV o Nanobody (en el que, de nuevo, el/los ISV usado(s) como antfgeno durante el examen y/o la seleccion es/son preferentemente tal como se describe en los parrafos anteriores, incluyendo las preferencias establecidas para tal ISV/antfgeno). Tales examen y seleccion pueden realizarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, usando tecnicas de seleccion y/o expansion de celulas B esencialmente iguales o de manera adecuada similares a las tecnicas de seleccion de celulas B descritas en los documentos EP 0 488 470, WO 92/02551, EP 1 633 787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 o WO 04/106377 o tecnicas similares a la tecnica Nanoclone descrita en el documento WO 06/079372 (pero usando celulas B humanas en vez de celulas B de camelidos).
Una vez que se han identificado/aislado una o mas celulas B que expresan un anticuerpo adecuado, dicho anticuerpo puede aislarse, expresarse y/o producirse de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, dicha(s) celula(s) B puede(n) inmortalizarse como hibridomas que producen el/los anticuerpo/anticuerpos adecuado(s) (usando tecnicas bien conocidas per se para generar hibridomas partiendo de celulas B seleccionadas), y dicho(s) anticuerpo/anticuerpos puede(n) aislarse entonces de (el sobrenadante de cultivo de) dicho(s) hibridoma(s), de nuevo usando tecnicas adecuadas bien establecidas en la tecnica y descritas en diversos tratados y manuales, y tambien descritas y/o a las que se hace referencia en las publicaciones de patente mencionadas en el parrafo anterior.
Alternativamente, dicha(s) celula(s) B puede(n) expandirse usando tecnicas de expansion de celulas B conocidas per se, y el/los anticuerpo/anticuerpos puede(n) aislarse de (el sobrenadante de cultivo de) dicha(s) celula(s) B
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expandida(s). De nuevo, esto puede realizarse usando tecnicas adecuadas bien establecidas en la tecnica y descritas en diversos tratados y manuales, y tambien descritas y/o a las que se hace referencia en las publicaciones de patente mencionadas en los parrafos anteriores.
En aun otra alternativa, puede obtenerse ADN que codifica el/los anticuerpo/anticuerpos de interes (por ejemplo, mediante amplificacion) de dicha(s) celula(s) B u otras celulas adecuadas, o bien directamente (por ejemplo, usando tecnicas de clonacion por PCR de celula individual adecuadas) o despues de la expansion adecuada de la(s) celula(s) B deseada(s). Entonces puede expresarse dicho ADN de manera adecuada en una celula huesped u organismo huesped adecuado para proporcionar el/los anticuerpo/anticuerpos deseado(s). De nuevo, esto puede realizarse usando tecnicas adecuadas bien establecidas en la tecnica y descritas en diversos tratados y manuales, y tambien descritas y/o a las que se hace referencia en las publicaciones de patente mencionadas en los parrafos anteriores.
Tambien es posible generar anticuerpos monoclonales que son adecuados para su uso como “anticuerpo analftico” mediante un metodo que implica clonacion de repertorio (partiendo de una muestra adecuada obtenida de un sujeto humano) y examen del repertorio clonado para detectar anticuerpos que se unen al ISV usado como antfgeno (en el que, de nuevo, el/los ISV usado(s) como antfgeno durante el examen y/o la seleccion es/son preferentemente tal como se describio en los parrafos anteriores, incluyendo las preferencias establecidas para tal ISV/antfgeno). Metodos para la clonacion de repertorio y diversas tecnicas para presentar repertorios clonados para seleccion y examen (tal como presentacion en fagos, presentacion en ribosomas y presentacion en levaduras) resultaran claros para el experto, y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0 589877, EP 0 774 511, WO 90/14430 y EP 0368 684) asf como diversos manuales sobre el tema.
Generalmente, la muestra biologica que se usa como punto de partida para obtener el anticuerpo analftico (policlonal o monoclonal) puede ser cualquier muestra adecuada (es decir, adecuada como material de partida para obtener un anticuerpo policlonal o monoclonal, respectivamente) obtenida de cualquier sujeto humano adecuado. En un aspecto especffico pero no limitativo, una muestra de este tipo puede haberse obtenido, por ejemplo, de una mujer, y en particular, una mujer posmenopausica. Por tanto, en un aspecto especffico pero no limitativo, el anticuerpo analftico usado en las etapas (i) y (ii) anteriores se ha obtenido partiendo de una muestra biologica que se ha obtenido/derivado de una mujer posmenopausica (o que se ha derivado de un anticuerpo que se ha obtenido/derivado de una mujer posmenopausica).
Ademas, la muestra biologica que se usa como punto de partida para obtener el anticuerpo analftico (policlonal o monoclonal) puede obtenerse de un sujeto al que se le han administrado previamente un ISV (por ejemplo, como parte de un ensayo clfnico o de manera terapeutica), pero se obtiene preferentemente de un sujeto al que no se le ha administrado previamente ningun ISV.
Sin embargo, debe observarse que la descripcion no se limita particularmente a la fuente del/de los anticuerpo/anticuerpos analftico(s) usado(s), y se ha demostrado que es posible en algunos casos, usar las tecnicas descritas en el presente documento, para obtener (generar, aislar) otros anticuerpo analfticos adecuados a partir de otras fuentes, incluyendo sangre o plasma humano disponible comercialmente (e incluso sangre, plasma o celulas B de otras especies de mamfferos o primates, tales como de babuino o macaco cangrejero).
Tal como se menciono anteriormente, el anticuerpo analftico (policlonal o monoclonal) usado en las etapas (i) y (ii) debe ser tal que sea capaz de reconocer o unirse al extremo C-terminal de un ISV o Nanobody, y se selecciona/afsla lo mas preferentemente basandose en esta capacidad para unirse al extremo C-terminal de un iSv o Nanobody.
Tal como puede observarse a partir de la figura 2, cuando el ISV se basa en o deriva de un dominio VH o VHH, el extremo C-terminal de un ISV comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33), y por consiguiente el anticuerpo analftico debe ser capaz de reconocer cualquier ISV que tenga la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) en su extremo C-terminal. Tal como puede observarse ademas a partir de la figura 2, (al menos algunos de los residuos de aminoacido en) la secuencia VTVSS (SEQ ID NO: 33) forma parte de un supuesto epftopo en el ISV que tambien incluye, entre otros residuos, el residuo de aminoacido en la posicion 14 (y los residuos de aminoacido junto/proximos al mismo en la secuencia de aminoacidos, tales como las posiciones 11, 13 y 15) y tambien puede comprender el residuo de aminoacido en la posicion 83 (y los residuos de aminoacido junto/proximos al mismo en la secuencia de aminoacidos, tales como las posiciones 82, 82a, 82b y 84) y/o el residuo de aminoacido en la posicion 108 (y los residuos de aminoacido junto/proximos al mismo en la secuencia de aminoacidos, tales como las posiciones 107. La posicion 109 es la primera V de la secuencia C-terminal VTVSS (SEQ ID NO: 33) y se ha mostrado que, por ejemplo, la posicion 110 tambien puede tener influencia sobre la interferencia proteica). Esta tambien se denomina colectivamente en el presente documento “region C-terminal”, entendiendose que esta region C-terminal comprende al menos la secuencia C-terminal VTVSS (SEQ ID NO: 33) y el residuo de aminoacido en la posicion 14, y tambien puede comprender los residuos de aminoacido en las posiciones 83 y 108, y posiblemente tambien los residuos de aminoacido en las posiciones 13, 15, 82b, 83, 84 y 107.
Tal como ya se menciono, y de nuevo sin limitarse a ninguna hipotesis o explicacion, en un anticuerpo monoclonal de 4 cadenas de tamano completo, o en un anticuerpo solamente de cadena pesada de tamano completo tal como
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los presentes en Camelidae, el extremo C-terminal de un dominio VH o VHH se liga a la parte restante del anticuerpo, es decir, a la region CH1 en anticuerpos monoclonales convencionales o a la region bisagra en los anticuerpos de cadena pesada de Camelidae, respectivamente, y por tanto, en tales anticuerpos de tamano completo puede blindarse frente a tal interferencia proteica) y/o cubrirse mediante la interaccion VH/VL (en anticuerpos de 4 cadenas convencionales) de modo que esta “region C-terminal” y, por tanto, habitualmente no expuesta al disolvente y/o accesible como sitio de interaccion para protefnas que estan presentes en la sangre, suero o cuerpo de una persona a la que se administra un ISV de este tipo. Sin embargo, si se usa un ISV o Nanobody per se (es decir, sin ligarse a ninguna otra parte de un anticuerpo), o si se usa un farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody que porta un ISV o Nanobody en su extremo C-terminal, este epftopo C-terminal esta disponible para la interaccion (no especffica) con otras protefnas, y de nuevo sin limitarse a ninguna hipotesis o explicacion, se supone que esta region C-terminal puede ser accesible ahora para experimentar una interaccion proteica (no especftica) con una o mas protemas que son preexistentes en la “muestra de prueba” (por ejemplo, una o mas IgG) que va a someterse a prueba y que esto puede provocar interferencia proteica y/o senales no especfficas en los inmunoensayos (y en particular en ensayos de ADA).
Tal como se menciono, los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para predecir, reducir o evitar tal interaccion proteica, y tambien pueden usarse como herramienta para guiar la modificacion al ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody de modo que se le proporcione al mismo una tendencia reducida (parcial o preferentemente de manera esencialmente completa) a dar lugar a tal interferencia proteica.
Tal como quedara claro a partir del parrafo anterior, y de nuevo sin limitarse a ninguna hipotesis o explicacion, se espera en particular (y parte de las ensenanzas de la presente invencion) que (determinadas) modificaciones a la “region C-terminal” alteraran (y preferentemente reduciran) la tendencia de un ISV a experimentar tal interaccion proteica no especffica, y esto tambien es lo que se observa experimentalmente (veanse, por ejemplo, los resultados experimentales presentados en los ejemplos 1C y 3 mas adelante).
Basandose en esto, y de nuevo sin limitarse a ninguna hipotesis o explicacion, la presente invencion tambien ensena determinadas modificaciones que pueden introducirse con este proposito en la region C-terminal de un ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody (cuya (posible) eficacia puede someterse a prueba usando los metodos descritos en el presente documento). Ademas, basandose en las ensenanzas en el presente documento, se preve que el experto sera capaz de elegir, disenar o proponer otras modificaciones (candidatas) a la region C-terminal que podrfan introducirse con este proposito (y cuya (posible) eficacia puede someterse a prueba de nuevo usando los metodos descritos en el presente documento).
Volviendo al anticuerpo analftico usado en la descripcion, este es preferentemente un anticuerpo (policlonal o monoclonal) que reconoce la region C-terminal (tal como se definio anteriormente) de un ISV, y en particular pero sin limitacion la region C-terminal de un Nanobody.
Por ejemplo, en un aspecto especffico pero no limitativo, el “anticuerpo analftico” puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (y/o es capaz de unirse a, y en particular de unirse de manera especffica a) la region C- terminal de un ISV o Nanobody cuyo extremo C-terminal de la secuencia termina con VTVSS (SEQ ID NO: 33), pero no reconoce (y/o no es capaz de unirse de manera especffica a) la region C-terminal de un ISV o Nanobody (que puede ser un ISV diferente pero es preferentemente el mismo ISV) cuando hay uno o mas residuos de aminoacido adicionales (tal como de 1 a 5 residuos de aminoacido, o alternativamente una secuencia peptfdica pequena o incluso otro polipeptido o protefna) ligados al VTVSS C-terminal (SEQ ID NO: 33).
En otro aspecto mas especffico pero todavfa no limitativo, el “anticuerpo analftico” puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (y/o es capaz de unirse a, y en particular de unirse de manera especffica a) la region C- terminal de un ISV o Nanobody cuyo extremo C-terminal de la secuencia termina con VTVSS (SEQ ID NO: 33) y en el que la posicion 14 es un aminoacido que no se produce de manera natural en la posicion 14 y/o se ha modificado en comparacion con el aminoacido que se produce de manera natural en la posicion 14 (por ejemplo, como resultado de humanizacion, camelizacion y/u optimizacion de secuencia), pero que no reconoce (y/o no es capaz de unirse de manera especffica a) la region C-terminal de un ISV o Nanobody (que puede ser un ISV diferente pero es preferentemente el mismo ISV) en el que hay uno o mas residuos de aminoacido adicionales (tal como de 1 a 5 residuos de aminoacido, o alternativamente una secuencia peptfdica pequena o incluso otro polipeptido o protefna) ligados al VTVSS C-terminal (SEQ ID NO: 33); y/o en el que la posicion 14 es un aminoacido que se produce de manera natural en la posicion 14 (por ejemplo, alanina o, cuando el ISV contiene de manera natural una prolina en la posicion 14, prolina).
Por ejemplo, el “anticuerpo analftico” tambien puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (y/o es capaz de unirse a, y en particular de unirse de manera especffica a) la region C-terminal de un ISV o Nanobody cuyo extremo C-terminal de la secuencia termina con VTVSS (SEQ ID NO: 33) y en el que la posicion 14 es prolina (y en particular cuando la posicion 14 se ha modificado a prolina, por ejemplo, como resultado de humanizacion, camelizacion y/u optimizacion de secuencia), pero no reconoce la region C-terminal de un ISV o Nanobody (que puede ser un ISV diferente pero es preferentemente el mismo ISV) en el que hay uno o mas residuos de aminoacido
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El “anticuerpo analftico” tambien puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (y/o es capaz de unirse a, y en particular de unirse de manera especffica a) la region C-terminal de un ISV o Nanobody cuyo extremo C-terminal de la secuencia termina con VTVSS (SEQ ID NO: 33) y en el que la posicion 14 es prolina (en particular, cuando un residuo de prolina se produce de manera natural en dicha posicion en dicho ISV), pero no reconoce la region C-terminal de un ISV o Nanobody (que puede ser un ISV diferente pero es preferentemente el mismo ISV) en el que hay uno o mas residuos de aminoacido adicionales (tal como de 1 a 5 residuos de aminoacido, o alternativamente, una secuencia peptfdica pequena o incluso otro polipeptido o protefna) ligados al VTVSS C- terminal (SEQ ID NO: 33) en el que la posicion 14 es todavfa una prolina (que se produce de manera natural o no modificada).
El “anticuerpo analftico” tambien puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (la region C-terminal de) la secuencia del ISV denominada “Nb 3.4” en el presente documento (SEQ ID NO: 5) pero no reconoce (la region C-terminal de) la secuencia del ISV denominada “Nb 3.1” en el presente documento (SEQ ID NO: 3) y/o (y preferentemente y) no reconoce la secuencia del ISV denominada “Nb 3.2” en el presente documento (SEQ ID NO: 4).
Con el proposito anterior, puede determinarse si un “anticuerpo analftico” reconoce (o no) un ISV o Nanobody (y/o es o no es capaz de unirse (especfficamente) a un ISV o Nanobody) usando cualquier ensayo de union adecuado (tal como Biacore), pero tambien puede determinarse usando o bien el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3 o bien un ensayo de ADA tal como el ensayo de puente/competencia de ADA descrito en el ejemplo 5 (veanse tambien las figuras 1A a 1C y en particular la figura 1B).
Formatos/tecnicas adecuados para realizar un ensayo de este tipo resultaran claros para el experto basandose en la divulgacion en el presente documento, y por ejemplo incluyen (sin limitacion):
- Un ensayo colorimetrico tal como ELISA con anticuerpo analftico recubierto directa o indirectamente en la placa y deteccion de ISV unido con anticuerpo anti-ISV monoclonal o policlonal. Otras tecnologfas alternativas utiles para esta configuracion incluyen pero no se limitan a electroquimioluminiscencia (la plataforma MSD), fluorescencia (DELFIA, GYROS), y otros metodos que se basan en la deteccion secundaria del ISV unido.
- Un metodo de resonancia de plasmon superficial (tal como BIACORE) u otro con biosensor en tiempo real (es decir, distinto de usar SPR) con anticuerpo analftico inmovilizado directa o indirectamente y seguimiento de la union de ISV inyectado/administrado posteriormente. Estos metodos no requieren la deteccion adicional del ISV unido. Un metodo representativo para realizar este tipo de ensayo se describe en el ejemplo 3.
- Analizar el comportamiento competitivo del ISV en un ensayo de puente (ensayo de ADA) usando el anticuerpo analftico en vez de ADA que contiene lfquido biologico. Para el ensayo de puente, puede hacerse uso de diferentes tecnologfas tales como ELISA, la plataforma MSD. Se muestran esquematicamente metodos representativos para realizar este tipo en las figuras 1A a 1C y un ejemplo especffico de esta clase de ensayo tambien se describe en el ejemplo 5.
- Cualquier metodo cromatografico en el que el anticuerpo analftico se inmoviliza sobre la matriz cromatografica y se realiza la captura/aislamiento especffico de ISV a partir de una disolucion.
Una vez que se ha obtenido un anticuerpo analftico adecuado usando uno de los metodos descritos en el presente documento o en uno de los ejemplos (o un metodo esencialmente equivalente a los mismos), dicho anticuerpo analftico puede usarse para determinar si un ISV o Nanobody dado (o farmaco basado en ISV o basado en Nanobody) dara lugar a (o tiene tendencia elevada o aumentada a dar lugar a) interferencia proteica (tal como se define en el presente documento), es decir, realizando las etapas (i) y (ii) descritas anteriormente. Tal como ya se describio en el presente documento, esto implica generalmente poner en contacto dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody con el anticuerpo analftico y determinar si dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody se reconoce por (y/o se une por, y en particular se une especfficamente por) dicho anticuerpo analftico (y en particular si la region C-terminal de dicho ISV o Nanobody o de cualquier ISV o Nanobody que forma el extremo C-terminal de dicho farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody se reconoce por dicho anticuerpo analftico).
Esto puede realizarse generalmente usando cualquier tecnica adecuada para determinar si un antfgeno (en el caso, el ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody) se une por un anticuerpo, y tecnicas de (inmuno)ensayo adecuadas resultaran claras para el experto. Algunos ejemplos no limitativos son tecnicas de ELISA adecuadas (incluyendo, por ejemplo, ELISA de tipo sandwich); en las que, dependiendo del formato de ELISA usado (tal como resultara claro para el experto), o bien el anticuerpo analftico o bien el ISV puede recubrirse sobre la placa y o bien el anticuerpo analftico o bien el ISV puede marcarse de manera detectable. Otras tecnicas pueden implicar,
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por ejemplo, el uso de un instrumento de BIAcore (en el que de nuevo o bien el anticuerpo analftico o bien el ISV puede recubrirse sobre el chip, vease, por ejemplo, el ejemplo 3). Otra alternativa puede ser un ensayo de puente competitivo (tal como se ejemplifica, por ejemplo, en el ejemplo 5), en el que se somete a prueba la capacidad del ISV para competir con otro ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody que se sabe que se une por el anticuerpo analftico (o viceversa). Estas y otras tecnicas adecuadas para determinar si un ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody dado se une (especfficamente) o reconoce por el anticuerpo analftico resultaran claras para el experto basandose en la divulgacion en el presente documento.
Tambien resultara claro, basandose en la divulgacion en el presente documento, que la presente descripcion (y en particular el anticuerpo analftico usado en la presente invencion) puede usarse para determinar si un ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody dado contiene o no un sitio de interaccion (tal como un sitio de interaccion presente en o dentro de la region C-terminal, y/o del que forma parte la region C-terminal) que es capaz de experimentar una interaccion proteica (no especffica) con una o mas protefnas u otros componentes que pueden estar presentes en una muestra biologica (es decir, una “muestra de prueba”) obtenida de un sujeto que va a someterse a un inmunoensayo tal como un ensayo de ADA (en particular, un ensayo de ADA para determinar la presencia de cualquier ADA contra ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody). Por tanto, cuando un ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody se reconoce por el anticuerpo analftico usado en la invencion, es muy probable que dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody contenga un sitio de interaccion de este tipo (accesible o expuesto), y por tanto, tendra tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica (tal como se define en el presente documento) cuando se usa en tal inmunoensayo o ensayo de ADA para someter a prueba la muestra de prueba. Tal como resultara claro para el experto, esto es algo que debe evitarse preferentemente, o bien seleccionando/usando otro ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody si es posible, o bien modificando el ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o basado en Nanobody de tal manera que su tendencia a tal interferencia proteica se reducira sustancialmente o se eliminara esencialmente (de nuevo, esto puede someterse a prueba usando el metodo y anticuerpo analftico divulgados en el presente documento).
Tal como resultara claro tambien para el experto basandose en la divulgacion en el presente documento, tal modificacion puede comprender, por ejemplo, realizar una o mas modificaciones (tales como inserciones, adiciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos) al sitio de interaccion en el ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody, de tal manera que su capacidad para experimentar una interaccion proteica (no especffica) con una o mas protefnas u otros componentes que pueden estar presentes en una muestra de prueba se reducira o eliminara. De nuevo, esto puede realizarse mediante ensayo y error limitado introduciendo una o mas modificaciones y luego sometiendo a prueba si esta capacidad se ha reducido o no, de nuevo usando el metodo y anticuerpo analftico divulgados en el presente documento. Por ejemplo, pueden introducirse una o mas de tales modificaciones, y luego puede compararse la capacidad del ISV modificado para unirse al anticuerpo analftico con la del ISV original/no modificado. Alternativamente, usando un formato de puente competitivo (tal como se ejemplifica, por ejemplo, en el ejemplo 5), o usando BIAcore (vease, por ejemplo, el ejemplo 3), puede determinarse la capacidad del ISV modificado para competir (todavfa) con el ISV original para unirse al anticuerpo analftico.
De nuevo, y aunque la invencion no se limita a ninguna hipotesis o explicacion, basandose en las evidencias experimentales que se exponen en los ejemplos mas adelante, los inventores han encontrado que este sitio de interaccion es probable que este ubicado en/proximo a la region C-terminal (tal como se define en el presente documento) o que dicho sitio de interaccion forma parte de la region C-terminal (o que la region C-terminal forma parte de este sitio de interaccion). Esto se basa, por ejemplo, al menos en parte en la observacion de que, si un ISV tiene tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica y tiene VTVSS (SEQ ID NO: 33) como los residuos de aminoacido en su extremo C-terminal, que la union de o bien un numero limitado de residuos de aminoacido (de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5), o bien alternativamente un marcador u otro peptido, protefna u otro resto a este extremo C-terminal habitualmente reducira sustancialmente o eliminara esencialmente dicha tendencia. En algunos casos, se ha encontrado que incluso la adicion de 1, 2 o 3 residuos de aminoacido al VTVSS C-terminal (SEQ ID NO: 33) (que puede ser cualquier aminoacido o combinacion de aminoacidos adecuados, que puede elegirse cada uno independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural tal como los enumerados en la tabla A-2 en la pagina 64 del documento WO 09/138519, por ejemplo, y sin limitacion de alanina, glicina, valina, leucina o isoleucina) puede reducir ya sustancialmente o eliminar esencialmente dicha tendencia. Esto se basa tambien en parte en la observacion de que en algunos casos, cuando un VHH contiene de manera natural un residuo de alanina en la posicion 14 (que tal como se menciona forma parte de la region C-terminal; vease la figura 2), el VHH que se produce de manera natural a menudo no tiene (o tiene una baja) tendencia a dar lugar a tal interferencia proteica, mientras que un VHH correspondiente en el que dicha alanina en la posicion 14 se ha reemplazado por un residuo de prolina (por ejemplo, con los propositos de humanizacion u optimizacion de secuencia) puede tener como resultado una tendencia aumentada a dar lugar a tal interferencia proteica (es decir, en comparacion con el VHH con alanina en la posicion 14).
En un aspecto, la invencion se refiere a un VHH, un Nanobody (tal como se define en el presente documento, y en particular un VHH humanizado o un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) u otro ISV (o farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody con un VHH, Nanobody u otro ISV en su extremo C-terminal) que se ha modificado (por ejemplo, introduciendo una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos), y en
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particular modificado en las regiones C-terminal (tal como mediante una o mas sustituciones de aminoacidos o adiciones en la region C-terminal), de tal manera que (i) tiene una tendencia sustancialmente reducida (tal como al menos una tendencia reducida de manera estadfsticamente relevante) a dar lugar a interferencia proteica (tal como se define en el presente documento); y/o de tal manera que (ii) tiene, en el metodo de la invencion descrito en el presente documento (tal como en el ensayo especffico descrito en el ejemplo 3 o 5), una capacidad sustancialmente reducida para unirse por un anticuerpo analftico tal como se describe en el presente documento (tal como el anticuerpo policlonal descrito en el ejemplo 2 y usado en los ejemplos 3 y 5), en ambos casos preferentemente en comparacion con el mismo VHH, Nanobody o ISV pero sin las modificaciones.
Por tanto, en un aspecto, la invencion se refiere a un VHH, un Nanobody (tal como se define en el presente documento, y en particular un VHH humanizado o un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) u otro ISV (o farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody con un VHH, Nanobody u otro ISV en su extremo C- terminal) que es un dominio VHH o VH (es decir, un ISV que es un dominio VH o deriva de un dominio VH) y/o que se ha basado en o ha derivado de (la secuencia de aminoacidos de) un dominio VHH o VH, VHH, Nanobody o ISV que comprende la secuencia de aminoacidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) en su extremo C-terminal, en el que n es de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 (y preferentemente 1 o 2, tal como 1), y en el que cada X es un residuo de aminoacido (preferentemente que se produce de manera natural) que se elige independientemente (y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I); sin embargo, tal como puede observarse a partir de los datos presentados mas adelante, tambien pueden usarse otros residuos de aminoacido (preferentemente que se producen de manera natural) o combinaciones de los residuos de aminoacido preferidos mencionados anteriormente con otros residuos de aminoacido (tales como serina, prolina, treonina y/o lisina). Preferentemente, dicho VHH, Nanobody o ISV con la secuencia de aminoacidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) en su extremo C-terminal es tal que (i) tiene una tendencia sustancialmente reducida (tal como al menos una tendencia reducida de manera estadfsticamente relevante) a dar lugar a interferencia proteica (tal como se define en el presente documento); y/o tal que (ii) tiene, en el metodo de la invencion descrito en el presente documento (tal como en el ensayo especffico descrito en el ejemplo 3 o 5), una capacidad sustancialmente reducida para unirse por un anticuerpo analftico tal como se describe en el presente documento (tal como el anticuerpo policlonal descrito en el ejemplo 2), en ambos casos preferentemente en comparacion con el mismo VHH, Nanobody o ISV pero con la secuencia de aminoacidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) en su extremo C-terminal. Por ejemplo, se hace referencia al ensayo y los datos presentados en el ejemplo 3.
Los VHH, Nanobodies o (otros) ISV mencionados anteriormente son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la union por 21-4 de menos de 500 (determinado segun el protocolo expuesto en el ejemplo 9, y despues
de ajustar el valor de UR medido para la molecula. Tambien debe observarse que, cualquier vez que se hace
referencia en la descripcion en el presente documento o en las reivindicaciones a cualquier secuencia C-terminal VTVSS(X)n (incluyendo cualquiera de los aspectos (a) a (p) anteriores, que segun un aspecto especffico de la invencion, ninguno de los aminoacidos X es un residuo de cistefna.
Por ejemplo, en algunos aspectos preferidos, el extremo C-terminal del ISV o construccion que contiene ISV (cuando este extremo C-terminal es un ISV derivado de VH, VHH o Nanobody) puede ser:
(a) VTVSS(X)n, en el que n = 1 y X = Ala;
(b) VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Ala;
(c) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Ala;
(d) VTVSS(X)n, en el que n = 2 y al menos un X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(e) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(f) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(g) VTVSS(X)n, en el que n = 1 y X = Gly;
(h) VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Gly;
(i) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Gly;
(j) VTVSS(X)n, en el que n = 2 y al menos un X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s)
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independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(k) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(l) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
(m) VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Ala o Gly;
(n) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Ala o Gly;
(o) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Ala o Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile); o
(p) VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Ala o Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
prefiriendose particularmente los aspectos (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) y (n), prefiriendose los aspectos en los que n = 1 o 2 y prefiriendose particularmente los aspectos en los que n = 1.
Tambien debe observarse que, cualquier vez que se hace referencia en la descripcion en el presente documento o en las reivindicaciones a cualquier secuencia C-terminal VTVSS(X)n (incluyendo cualquiera de los aspectos (a) a (p) anteriores, que segun un aspecto especffico de la invencion, ninguno de los aminoacidos X es un residuo de cistefna.
Por tanto, en un aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 1 y X = Ala (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Ala (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 2 y al menos un X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Ala (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
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En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Ala (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 1 y X = Gly (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Gly (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Gly (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 2 y al menos un X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 2 y cada X = Ala o Gly (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y cada X = Ala o Gly (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que es o bien un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos un X = Ala o Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu
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y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 3 y al menos dos X = Ala o Gly (eligiendose el/los residuo(s) de aminoacido X restante(s) independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala o Gly.
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que:
- n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala o Gly; o
- n = 2 o 3 en el que todos menos un X = Ala o Gly (eligiendose independientemente los residuos de aminoacido X
restantes de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile)
o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal).
En otro aspecto preferido, la invencion se refiere a un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV), que o bien es un Nanobody o bien un/otro ISV que comprende una secuencia de VH o bien deriva de una secuencia de VH (prefiriendose Nanobodies) que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en el que:
- n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala o Gly; o
- n = 2 o 3 en el que al menos un X = Ala o Gly (eligiendose independientemente los residuos de aminoacido X
restantes de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
- n = 2 o 3 en el que todos menos un X = Ala o Gly (eligiendose independientemente los residuos de aminoacido X restantes de cualquier aminoacido que se produce de manera natural pero preferentemente eligiendose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
o una protefna o un polipeptido que contiene un ISV de este tipo (y preferentemente un Nanobody de este tipo) en su extremo C-terminal.
En los aspectos anteriores, con dicho (otro) “ISV que comprende una secuencia de VH o deriva de una secuencia de VH” quiere decirse cualquier ISV que comprende una secuencia de VH o que deriva de una secuencia de VH y que no es un Nanobody (es decir, no es un VHH, VHH humanizado o VH camelizado). Por ejemplo, tal (otro) ISV puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de dominio (individual) basado en VH, dAb™ basado en VH o micro cuerpo basado en VH (vease el documento WO 00/29004).
De nuevo, debe observarse que, cualquier vez que uno de los ISV tal como se hace referencia en el presente documento tiene una secuencia C-terminal VTVSS(X)n (incluyendo sin limitacion en los ISV a los se hace referencia en los aspectos anteriores) que segun un aspecto especffico de la invencion, ninguno de los aminoacidos X en la secuencia VTVSS(X)n es un residuo de cistefna.
Tal como se describe adicionalmente en el presente documento, cualquiera de tales protefnas o polipeptidos puede ser, por ejemplo, una construccion que contiene dos o mas ISV (tal como dos o mas Nanobodies), opcionalmente ligados mediante uno o mas ligadores adecuados. Por tanto, por ejemplo, una construccion de este tipo puede ser una construccion bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente (tal como una construccion de Nanobody bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente), y puede ser, por ejemplo, una construccion bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente (tal como una construccion de Nanobody bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente) que es una construccion biespecffica, triespecffica o biparatopica (incluyendo, por ejemplo, construcciones monoespecfficas, biespecfficas o biparatopicas que tambien pueden unirse a seroalbumina (preferido) u otra protefna serica para la ampliacion de la semivida).
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De nuevo, los Nanobodies, los ISV y protefnas/polipeptidos segun cada uno de los aspectos descritos anteriormente son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la union por 21-4 de menos de 500 (determinado segun el protocolo expuesto en el ejemplo 9, y despues de ajustar el valor de UR medido para el peso molecular del ISV o la protefna usados segun la formula expuesta anteriormente).
Tal como se menciona en el presente documento, tambien se preve que la invencion tambien pueda aplicarse a otras protefnas o polipeptidos (y en particular fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab u otras protefnas o polipeptidos basados en fragmentos de anticuerpo, tales como ScFv) que tienen un dominio VH en su extremo C- terminal. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a una protefna o un polipeptido de este tipo (tal como un ScFv) que tiene un dominio VH en su extremo C-terminal con la secuencia de aminoacidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) en su extremo C-terminal, en el que n es de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y en el que cada X es un residuo de aminoacido (preferentemente que se produce de manera natural) que se elige independientemente (y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I). De nuevo, segun algunos aspectos especfficos, dicho extremo C-terminal puede ser segun cualquiera de los puntos (a) a (p) anteriores, y preferentemente segun uno de (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) o (n), siendo n 1, 2 o 3 y preferentemente 1 o 2.
De nuevo, tales protefnas o polipeptidos son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la union por 21-4 de menos de 500 (determinado segun el protocolo expuesto en el ejemplo 9, y despues de ajustar el valor de UR medido para el peso molecular del ISV o la protefna usados segun la formula expuesta anteriormente). Ademas, de nuevo, segun un aspecto especffico de este aspecto de la invencion, ninguno de los aminoacidos X en la secuencia C-terminal VTVSS(X)n es un residuo de cistefna.
La invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende un ISV terapeutico o una protefna o un polipeptido que comprende al menos un ISV terapeutico, en la que dicho ISV, protefna o polipeptido es tal como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, protefna o polipeptido segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular segun uno o mas de los aspectos descritos en las paginas anteriores; y mas en particular un ISV, protefna o polipeptido que tiene una secuencia/extremo C-terminal que es segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento), y al menos un portador, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmaceutico), y opcionalmente uno o mas principios activos adicionales. Tales composiciones, portadores, diluyentes o excipientes pueden ser, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 08/020079 para composiciones farmaceuticas que comprenden un Nanobody o una protefna o un polipeptido que comprende al menos un Nanobody (y tal como ya se menciono, segun la presente invencion, el ISV es tambien preferentemente un Nanobody).
La invencion se refiere ademas a un ISV o una protefna o un polipeptido que comprende al menos un ISV para su uso en terapia de una enfermedad en un ser humano (por ejemplo, un paciente que necesita tal terapia), en los que dicho ISV, protefna o polipeptido es tal como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, protefna o polipeptido segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular segun uno o mas de los aspectos descritos en las paginas anteriores; y mas en particular un iSv, protefna o polipeptido que tiene una secuencia/extremo C-terminal que es segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento).
La invencion se refiere ademas al uso de un ISV o una protefna o un polipeptido que comprende al menos un ISV en la preparacion de una composicion farmaceutica, en el que dicho ISV, protefna o polipeptido es tal como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, protefna o polipeptido segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular segun uno o mas de los aspectos descritos en las paginas anteriores; y mas en particular un ISV, protefna o polipeptido que tiene una secuencia/extremo C-terminal que es segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento).
La invencion se refiere ademas a un metodo de tratamiento que comprende administrar a un sujeto humano (por ejemplo, a un paciente que necesita tal tratamiento) un ISV o una protefna o un polipeptido que comprende al menos un ISV en la preparacion de una composicion farmaceutica, en el que dicho ISV, protefna o polipeptido es tal como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, protefna o polipeptido segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular segun uno o mas de los aspectos descritos en las paginas anteriores; y mas en particular un ISV, protefna o polipeptido que tiene una secuencia/extremo C-terminal que es segun uno o mas de los aspectos descritos en el presente documento); o una composicion farmaceutica (tal como se describio anteriormente) que comprende al menos tal ISV, protefna o polipeptido.
Con respecto a lo anterior, resultara claro que el uso terapeutico de los ISV, las protefnas y los polipeptidos descritos en el presente documento son un aspecto muy importante de la invencion, ya que tal uso terapeutico (o el desarrollo clfnico de tales ISV, protefnas y polipeptidos para tal uso terapeutico) puede implicar el uso de ensayos de ADA para determinar si dicho ISV, protefna o polipeptido es inmunogenico (es decir, puede dar lugar a ADA cuando se administra a un sujeto humano). A este respecto, tambien resultara claro que tendran que abordarse en particular preocupaciones sobre su posible inmunogenicidad cuando un agente terapeutico o bien se usa durante periodos de
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tiempo mas prolongados (para durante semanas, meses o anos), y/o bien tiene una semivida (expresada como t1/2- beta) en un sujeto humano de al menos 3 dfas, tal como al menos un semana, y hasta 10 dfas o mas.
Por tanto, segun un aspecto espedfico de la invencion, un ISV, una protema, un polipeptido o una composicion farmaceutica tal como se describe en el presente documento esta destinado al tratamiento de una enfermedad cronica en un ser humano, y/o tal ISV, protema, polipeptido tal como se describe en el presente documento esta destinado a estar presente en la circulacion del sujeto (es decir, a niveles farmacologicamente activos) al que se administra (es decir, a una dosis terapeuticamente activa) durante al menos un periodo de una semana, preferentemente al menos dos semanas, tal como al menos un mes; un ISV, protema, polipeptido tal como se describe en el presente documento es tal que tiene una semivida (preferentemente expresada como t1/2-beta) en un sujeto humano de al menos 3 dfas, tal como al menos un semana, y hasta 10 dfas o mas. Un ISV, una protema, un polipeptido o una composicion farmaceutica de este tipo tal como se describe en el presente documento esta destinado a administrarse a un ser humano como dos o mas dosis que se administran a lo largo de un periodo de al menos 3 dfas, tal como al menos un semana, por ejemplo, al menos dos semanas o al menos un mes, o incluso mas tiempo (es decir, al menos 3 meses, al menos 6 meses o al menos un ano), o incluso administrarse de manera cronica.
La descripcion se refiere ademas a un metodo para reducir (sustancialmente) o eliminar esencialmente la tendencia de un ISV, un Nanobody o un farmaco basado en ISV o un farmaco basado en Nanobody a dar lugar a interferencia proteica, comprendiendo dicho metodo al menos las etapas de:
- opcionalmente determinar la tendencia del ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody a dar lugar a interferencia proteica, usando un metodo que comprende al menos las etapas (i) y (ii) tal como se hace referencia en el presente documento;
- modificar dicho ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody introduciendo una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos en dicho ISV o Nanobody, o en el ISV o Nanobody C- terminal (si lo hubiera) del farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody; y en particular introduciendo una o mas sustituciones o adiciones de aminoacidos en la region C-terminal de dicho ISV o Nanobody, o en la region C-terminal del ISV o Nanobody C-terminal (si lo hubiera) del farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody, por ejemplo, anadiendo al extremo C-terminal de la secuencia de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoacido cada uno elegido independientemente de cualquier aminoacido que se produce de manera natural (tales como los enumerados en la tabla A-2 en la pagina 64 del documento WO 09/138519, por ejemplo y sin limitacion de alanina, glicina, valina, leucina o isoleucina);
- determinar la tendencia del ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody asf modificado a dar lugar a interferencia proteica, usando un metodo que comprende al menos las etapas (i) y (ii) tal como se hace referencia en el presente documento; opcionalmente de manera que permita que la tendencia del ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody asf modificado a dar lugar a interferencia proteica se compare con la tendencia del ISV, Nanobody, farmaco basado en ISV o farmaco basado en Nanobody original a dar lugar a interferencia proteica (incluyendo, sin limitacion, compararlos en un ensayo de competencia para unirse al anticuerpo analftico tal como se describe en el presente documento). Alternativamente, puede usarse el metodo descrito en el presente documento que implica el uso de 21-4.
La invencion se describira ahora adicionalmente por medio de los siguientes aspectos, ejemplos y figuras preferidos no limitativos, en los que:
- Las figuras 1A a 1C muestran esquematicamente algunos ejemplos no limitativos de formatos de ensayo de ADA. Algunos protocolos representativos pero no limitativos para realizar estos ensayos se mencionan en el ejemplo 4.
- La figura 2 muestra esquematicamente una estructura 3D representativa de un ISV, tal como un Nanobody.
- La figura 3 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la
union de los NB 3.4 a 3.9 (SEQ ID NO 5 a 10) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el ejemplo 2.
- La figura 4 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la union de los NB 3.4, 3.11, 3.12 y 3.13 (SEQ ID NO: 5, 12, 13 y 14) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el ejemplo 2.
- La figura 5 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la
union de los NB 3.4, 3.14 y 3.15 (SEQ ID NO: 5, 15 y 16) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el
ejemplo 2.
- La figura 6 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la union de los NB 3.1, 3.2 y 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el ejemplo
2.
- La figura 7 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la union de los NB 4.1 y 4.2 (SEQ ID NO: 17 y 18) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el ejemplo 2.
5
- La figura 8 es una curva de union (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el ejemplo 3) que muestra la union de los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 (SEQ ID NO 19 a 22) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el ejemplo 2.
10 - La figura 9 proporciona una tabla que muestra las secuencias usadas en el ejemplo 8 (SEQ ID NO: 37 a 89) y
que expone la secuencia de referencia correspondiente.
Las secuencias a las que se hace referencia en la presente descripcion y reivindicaciones se enumeran en la tabla A
mas adelante (SEQ ID NO: 1 a 37) y en la figura 9 (SEQ ID NO: 38 a 89).
15
TABLA A
Nombre
ISV Ej. 1/2-
Alt. ISV
>Nb3.1
>Nb3.2
SEQ ID NO:
1
2
3
4
Secuencia
E VQL VE S G Ci G LVQ P G G S LR L S C A A S G FTF S S Y AMS W V R Q A P G K
GLEWVSGIKSSGDSTRYAGSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSL
RPEDTAVYYCAKSRVSRTGLYTYDNRGQGTLVTVSSGGGGSG
GGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTF
NN Y AMGWFRQ AP GKEREF V A AITRS G VRS G V S Al Y GD S VKDR
FTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFE
YD Y SGQGTLVT V S S
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGK
GREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLR
PEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGG
GSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWV
RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYL
QMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGS
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGK
GREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLR
PEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTG
EPRELVATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLK
PEDTA VYY CNFNKY VTSRDTW GQGTQ VT V S S EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTG
EPRELVATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLK
PEDTAVYY CNFNKY VTSRDTW GQGTQ VTV S S AAAEQKLISEED
LNGAAHHHHHH
Nombre
Secuencia
>Nb3.4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGE PRELV ATIT GGS SINY GDS VKGRFTISIDNSKNTV YLQMNS LRPE DT AV YY CNFNKY VTSRDTW GQGTL VT V S S
>Nb3.5
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW
YRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ
MNSLRPEDTAVYYCNFNKYYTSRDTWGQGTLVTVSSAA
>Nb3.6
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRP GEPRELV ATIT GGS S IN Y GD S VKGRFTISIDN SKNTV YLQ MNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA
>Nb3.7
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW
YRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ
MNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSG
>Nb3.8
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDT A V YY CNFNKY VTSRDTW GQGTLVT V S SGG
>Nb3.9
10
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATIT GGS SINY GDS VKGRFTIS IDNSKNTVYLQ MNSLRPEDT AVYY CNFNKY VTSRDTW GQGTLVT V S SGGG
>Nb3.10
11
HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDT AVYY CNFNKY VTSRDTWGQGTLVT V S S_________
>Nb3.11
12
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS_________
>Nb3.12
13
HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS
>Nb3.13
14
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDT AVYY CNFNKY VTSRDTW GQGT Q VT V S S
>Nb3.14
15
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELV ATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVQVSS
5
6
7
8
9
Nombre
SEQ ID NO: Secuencia
>Nb3.15
16 HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGW YRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQ MNSLRPEDT AVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
>Nb4.1
17 EVQLVES GGGLV QPGGSLRLS C AAS GS VFKINVMA WYRQ APG KGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLR PEDT AVYY C AFITTESD YDLGRRYWGQGTL VT V S S
>Nb4.2
18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMA WYRQ APG KGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLR PEDTAVYYCAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGG GSRDWDFDVFGGGTPVGG
>Nb6.1
19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGK EREFVARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSL KAEDT A VY Y C ASGERSTYIGSN YYRTNEYD YW GTGTQ VTV S S AA AEQKLIS EED LN G AAHHHHHH
>Nb6.2
20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGK EREFVARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSL KAEDTA VY Y C ASGERSTYIGSNYYRTNE YD YW GTGTQVTV S S
>Nb6.4
21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGK GREFVSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSSA AAEOKLISEEDLNGAAHHHHHH
>Nb6.5
22 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGK GREFVSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSS
Ejemplo 1C: de tipo natural
23 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMG WFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA ICNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT QVTVSS
Ejemplo 1C: (A14P)
24 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMG WFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA KNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT QVTVSS
Nombre
Secuencia
Ejemplo 1C: (K83R)
HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMG
WFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA
KNTLYLQMNSLRPEDTAYYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT
QVTVSS
Ejemplo 1C: (Q108L)
26
HHHHHHE VQL VES GGGL V Q AGG S LRLS C A AS GRTFNN Y AMG WFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA KNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT LVTVSS
Ejemplo 1C:
(A14P,K83R,
Q108L)
27
HHHHHHE V QLVES GGGLV QP GG S LRLS C A AS GRTFNN Y AMG WFRRAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT LVTVSS_______________________________________________________
Ejemplo 1c: (A14P,R39Q, K83R,T91Y,Q 108L)
28
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMG
WFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA
KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT
LVTVSS
Ejemplo 1C: (A14P,R39Q, K83R,T91Y,Q 108L)-1A
29
HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMG WFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRPEDTAVYY CAAS AIGSGALRRFEYD Y SGQGT LVTVSS A_____________________________________________________
Ejemplo 1C: (A14P,R39Q, K83R,T91Y,Q 108L)-3A
30
HHHHHHE VQL VE S GGGL V QPGGSLRLS CAAS GRTFNN Y AMG WFRQAPGKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNA KNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGT LVTVSS AAA__________________________________________________
Nb3.16
31
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPREL VATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC NFNKYVTSRDTW GQGTLVTV S SGGGGSGGG SE V QLVESGGGLV QPG NSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADS VKGRFTISRDNAKTTLYLQMN SLRPEDTAVYY CTIGGSLSRS SQGTLV TVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRM GWYRHRPGEPRELVATITGGS SINYGDS VKGRFTISIDN SKNTVYLQM NSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
5
10
15
20
25
30
Nombre
SEQ ID NO: Secuencia
Nb3.17
32 DV QLVESGGGLV QPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPREL VATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYC NFNKYVTSRDTW GQGTLVTV S SGGGGSGGGSEV QLVESGGGLV QPG NSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADS VKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRM GWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQM NSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA
Secuencia C- terminal
33 VTVSS
Secuencia C- terminal
34 VTVSS(X)n
21-4-3, IGH consenso
35 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTAYSMHWVKQAPG KGLKWMGWINTVTGEPAYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQIS S LKNEDT AT YF CTRGLIHF Y Y W GQGTTLT V S S AKTTPP S V YP L APGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTF PAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKK IVPRDC
21-4-3-IGK consenso
36 DIQMTQTPSSLSASLGGRVTITCKASQDIHNFISWYQHKPGKV PRLIIHDTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSITNLEPEDIATYYCL HYDNLLRSFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASV VCF LNNF YPKD IN VKWKID GS ERQN G VLN S WTD QD SKD S T Y SMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Parte experimental:
Ejemplo 1: Generacion de un anticuerpo analitico policlonal
Se genera un anticuerpo policlonal (fraccion de IgG) que puede usarse como “anticuerpo analttico” de la siguiente manera:
A. Identificacion de muestras de plasma adecuadas para aislar el anticuerpo policlonal
Se evaluaron veinte muestras de plasma de individuos sanos que nunca se habfan tratado con un ISV para determinar la presencia de anticuerpos contra ISV que pueden usarse como anticuerpo analitico en la invencion.
El ISV que se uso inicialmente en este ejemplo fue SEQ ID NO: 1. Posteriormente, para confirmar que la interaccion no es especifica para este ISV particular, sino que es una interaccion no especifica entre proteinas que puede producirse con varios ISV, se repitieron los ensayos mas adelante con otros ISV (vease el parrafo C) mas adelante). Como alternativa para SEQ ID NO: 1, por ejemplo tambien puede usarse SEQ ID NO: 2.
El ensayo usado fue un ensayo de puente basado en ECL (electroquimioluminiscencia) que uso ISV biotinilado (una variante biotinilada de SEQ ID NO: 1) para capturar y marcar con marcador de sulfo ISV para detectar anticuerpos anti-farmaco. Tambien se usa un formato similar para realizar ensayos de ADA. Se realizaron la biotinilacion y el marcaje con marcador de sulfo del ISV usando una quimica de acoplamiento convencional en aminas primarias usando sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce) y ester de NHS de marcador de sulfo (MSD), respectivamente segun las instrucciones del fabricante. Se diluyeron 1/5 las muestras de plasma en PBS/caseina al 0,1 % y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, 600 rpm en placas de polipropileno de 96 pocillos. Luego se diluyeron 1/3 las muestras (50 pl) en una mezcla 1:1 (100 pl) de ISV biotinilado 2 pg/ml y marcado con marcador de sulfo 2 pg/ml (SEQ ID NO: 1) y se incubaron durante 1 hora a T.A., 600 rpm. Se bloquearon placas de estreptavidina convencionales de 96 pocillos MA® de MSD con 150 pl/pocillo de Superblock® T20 durante 1 hora a T.A., luego se lavaron 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05 % (= tampon de lavado). Se transfirio la muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y marcado con marcador de sulfo (SEQ ID NO: 1) (50,0 pl) de la placa de polipropileno a la placa de MSD y se incubo durante 1
5
10
15
20
25
30
35
40
hora a T.A., 600 rpm. Se lavaron las placas tres veces antes de la adicion de tampon de lectura 2 x (MSD) (150 pl/pocillo) y la lectura de las unidades de ECL (ECLU) en un instrumento de MSD (lector Sector Imager 2400). Se examinaron las muestras y se determinaron como positivas o negativas usando el punto de corte de examen determinado durante la validacion del metodo. Se calculo el punto de corte de examen basandose en los valores de fondo de 118 muestras de plasma individuales de individuos sanos que nunca se habfan tratado con un ISV, usando un analisis estadfstico apropiado tal como se recomienda por las directrices para el desarrollo de un ensayo de ADA (Shankar, 2008). Se uso una evaluacion no parametrica y se calculo el valor del punto de corte basandose en el percentil 95, despues de la exclusion de los datos aberrantes.
Claramente, seis muestras de plasma puntuaron como positivas: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 e IHuP#002-001-ABL-20 (tabla I).
Se analizaron adicionalmente estas muestras en una configuracion de desplazamiento de farmaco (ensayo de confirmacion) para confirmar la especificidad del resultado de examen positivo (tabla II). Por tanto, se diluyeron 1/5 las muestras en PBS/casefna al 0,1 % que contenfa ISV 12,5 pg/ml (SEQ ID NO: 1) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C, 600 rpm en placas de polipropileno de 96 pocillos. Luego se diluyen 1/3 las muestras (50 pl) en una mezcla 1:1 (100 pl) de ISV biotinilado 2 pg/ml y marcado con marcador de sulfo 2 pg/ml (SEQ ID NO: 1) y se incuban durante 1 hora a T.A., 600 rpm. Posteriormente, se transfirio la muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y marcado con marcador de sulfo) (50,0 pl) de la placa de polipropileno a la placa de estreptavidina convencional de 96 pocillos MA® de MSD bloqueada tal como se describio anteriormente para el ensayo de examen y se incubo durante 1 hora a T.A., 600 rpm. Se lavaron las placas tres veces antes de la adicion de tampon de lectura 2 x (MSD) (150 pl/pocillo) y la medicion de las unidades de ECL (ECLU) en un instrumento de MSD (lector Sector Imager 2400). Se confirmo que las muestras eran verdaderos positivos usando el punto de corte de confirmacion determinado durante la validacion del metodo y se calculo con la respuesta de ECL de 118 muestras de plasma individuales de individuos sanos que nunca se habfan tratado con ISV, a las que se anadieron cantidades conocidas de ISV 50 pg/ml (SEQ ID NO: 1) usando un analisis estadfstico apropiado tal como se recomienda por las directrices para el desarrollo de un ensayo de ADA (Shankar, 2008). Se calculo una reduccion de senal minima del 50 % basandose en el intervalo de confianza del 99 %.
Se seleccionaron muestras que fueron positivas en el ensayo de puente basado en ECL y que se confirmaron como positivas en el ensayo de configuracion de desplazamiento de farmaco como fuente para generar el anticuerpo policlonal usando cromatograffa de afinidad.
Tabla I: resultados de examen de 20 muestras de plasma en el ensayo de ISV de ADA
ID de muestra
Ensayo de examen de ECLU
IHu P#002-001 -ABL-01
13081
IHu P#002-001 -ABL-02
56
IHu P#002-001 -ABL-03
272
IHu P#002-001 -ABL-04
125
IHu P#002-001 -ABL-05
70
IHu P#002-001 -ABL-06
99
IHu P#002-001 -ABL-07
170
IHu P#002-001 -ABL-08
659358
IHu P#002-001 -ABL-09
798
IHu P#002-001 -ABL-10
1101
IHuP#002-001-ABL-11
83
IHu P#002-001 -ABL-12
72
IHu P#002-001 -ABL-13
403
IHu P#002-001 -ABL-14
62
IHu P#002-001 -ABL-15
1141
IHu P#002-001 -ABL-16
159
IHu P#002-001 -ABL-17
72
IHu P#002-001 -ABL-18
170
IHu P#002-001 -ABL-19
4503
IHu P#002-001 -ABL-20
8243
Tabla II: Confirmacion de muestras de plasma examinadas y determinadas como positivas en el ensayo de confirmacion. Se uso un punto de corte del 50 % para la evaluacion de los resultados. Una muestra no se confirmo como muestra verdaderamente positiva
ID de muestra de plasma
Ensayo de examen de ECLU: plasma Ensayo de confirmacion de ECLU: plasma % de inhibicion de senal
IHu P#002-001 -ABL-01
13081 685 95
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
IHu P#002-001 -ABL-08
659358 169410 74
IHu P#002-001 -ABL-10
1101 582 47
IHu P#002-001 -ABL-15
1141 467 59
IHu P#002-001 -ABL-19
4503 1531 66
IHu P#002-001 -ABL-20
8243 1450 82
Tambien se evaluaron tres muestras de suero adicionales de individuos que no se habfan tratado con un ISV usando el ensayo de puente basado en ECL descrito anteriormente y se confirmaron usando el ensayo de configuracion de desplazamiento de farmaco.
Claramente, dos muestras de suero se puntuaron como positivas en el ensayo de puente basado en ECL: IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311a20 (tabla III). Se analizaron adicionalmente las 2 muestras examinadas y determinadas positivamente en la configuracion de desplazamiento de farmaco para confirmar la especificidad del resultado de examen positivo.
Tabla III: Resultados de examen y confirmacion de 3 muestras de suero y fraccion purificada de IgG correspondiente
ID de muestra de plasma
Ensayo de examen de senal de ECL: suero Ensayo de confirmacion de senal de ECL: suero % de inhibicion de senal Ensayo de examen de senal de ECL: IgG Ensayo de confirmacion de senal de ECL: IgG % de inhibicion de senal
IHUS#B09032311A3
2388 286 88 % 3716 370 90 %
IHUS#B09032311A20
19272 915 95 % 31309 1160 96 %
IHUS#B09032311A1
62
B. Generacion de fraccion de IgG policlonal purificada
Se purifico una IgG policlonal de las muestras IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311A20 (vease anteriormente) usando columnas HP Spin Trap de protefna G (GE Healthcare) segun las instrucciones del fabricante. Brevemente, despues de la retirada de la disolucion de almacenamiento de la columna mediante centrifugacion (30 s a 100 x g), se equilibro la columna anadiendo tampon de union (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0). Despues de la centrifugacion, se anadio la disolucion que contenfa el anticuerpo policlonal deseado (max. 1 mg en 600 pl) y se incubo la columna durante 4 min mientras que se mezclaba con cuidado. Luego se centrifugo la columna y se lavo 2 veces mediante la adicion sucesiva de tampon de union (600 pl) y centrifugacion. Despues de la adicion de 400 pl de tampon de elucion (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7) y mezclado mediante inversion, se eluyo el anticuerpo mediante centrifugacion en 30 pl de tampon de neutralizacion (Tris-HCl 1 M, pH 9,0).
Con el fin de confirmar que la fraccion de IgG asf obtenida estaba implicada en la union no especffica al/a los ISV, se analizo el anticuerpo de IgG purificado en el ensayo de puente basado en ECL descrito anteriormente y se confirmo usando el ensayo de configuracion de desplazamiento de farmaco usado en el punto A) anterior. En ambas muestras (IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311A20), se confirmo que el anticuerpo de IgG purificado estaba implicado en la union no especffica que conduce a una senal positiva en los ensayos (tabla III). Esto confirmo que la IgG policlonal purificada podna usarse como “anticuerpo analftico”, y se uso como tal en (los ensayos de) los ejemplos 3 y 5.
C. Union no especffica a otros ISV
Con el fin de determinar si la interferencia proteica observada es especffica para un ISV individual, y/o es especffica para una region, un epftopo o determinante antigenico particular en los ISV, y/o para determinadas mutaciones realizadas a los ISV de tipo natural (tal como una o mas mutaciones de humanizacion), se repitieron el ensayo de puente basado en ECL y el ensayo de configuracion de desplazamiento de farmaco (ambos tal como se describen en el punto A) anterior, usandose SEQ ID NO: 1 como ISV marcado con marcador de sulfo) usando las muestras de plasma IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 e IHUS#B09032311A1. Como estas muestras de plasma contienen el anticuerpo “analftico” policlonal aislado en el punto B) anterior, esto tambien proporciona informacion sobre la especificidad, selectividad y el reconocimiento de epftopos del anticuerpo analftico policlonal.
Se sometieron a prueba 8 ISV (SEQ ID NO 23 a 30, respectivamente, vease la tabla A anterior), de los que uno era un VHH de tipo natural (SEQ ID NO: 23) y los otros 7 ISV eran versiones humanizadas de la secuencia de tipo natural con diferentes sustituciones de humanizacion. Dos ISV (SEQ ID NO: 29 y 30) tambien contenfan residuos de aminoacido adicionales en el extremo C-terminal (1 y 3 residuos de alanina adicionales, respectivamente).
Se muestran los datos en la tabla IV. Sin limitarse a ninguna explicacion o hipotesis, puede observarse que cambios en la region C-terminal (tal como se define en el presente documento) aparentemente pueden influir enormemente en la extension en que las muestras de plasma usadas pueden dar lugar a interferencia proteica. Por ejemplo, puede observarse que la adicion de uno o tres residuos de aminoacido al extremo C-terminal puede reducir enormemente
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que surja la tendencia a la interferencia proteica (por ejemplo, una reduccion de solo el 18 y el 13 % del ensayo de ECLU con la muestra IHUS#B09032311A3 para SEQ ID NO: 29 y 30, en comparacion con una reduccion del 90 % para SEQ ID NO: 28, la variante humanizada correspondiente sin ningun residuo de aminoacido anadido al extremo C-terminal). De manera similar, la introduccion de un residuo de prolina en la posicion 14 de la secuencia de tipo natural aparentemente tambien puede influir enormemente en la extension en que las muestras de plasma usadas pueden dar lugar a interferencia proteica (por ejemplo, una reduccion de solo el 20 % en el ensayo de ECLU con la muestra IHUS#B09032311A3 para la secuencia de tipo natural de SEQ ID NO: 23, en comparacion con una reduccion del 91 % para SEQ ID NO: 24, la secuencia de tipo natural con una sustitucion A14P). K83R y Q108L, que tambien son sustituciones proximas a la region C-terminal, tambien conducen a cierto aumento de la tendencia a dar lugar a interferencia proteica, pero no tanto como la sustitucion A14P, y puede anularse el efecto combinado total de las sustituciones A14P+K83R+Q108L anadiendo uno o mas residuos de aminoacido al extremo C-terminal (comparense de nuevo los datos para SEQ ID NO: 29 y 30 con los datos para las demas variantes humanizadas).
Basandose en estos datos, tambien se concluyo que aparentemente, el anticuerpo analftico policlonal reconocio la region C-terminal (tal como se define en el presente documento) de los ISV generalmente. Tal como puede observarse a partir de la figura 2, la posicion 14 (y, en menor grado, las posiciones 83 y 108) tambien forman parte de la region C-terminal de un ISV (cuando se tiene en cuenta la estructura ternaria tridimensional de un ISV).
Tabla IV: Evaluacion de diferentes variantes de Nanobody como competidor en el ensayo de ADA de ISV usando el anticuerpo analftico
ID de muestra de suero
IHUS#B09032311A3 IHUS#B09032311A20 IHUS#B09032311A1
ECLU en el examen ensayo (usando SEQ ID NO: 1)
2217 18494 62
Variante de Nanobody (la columna a la derecha menciona las sustituciones de humanizacion y adiciones C-terminales realizadas en comparacion con la secuencia de tipo natural de SEQ ID NO: 23)
Ensayo de confirma- cion de ECL % de reduccion Ensayo de confirma- cion de ECL % de reduccion Ensayo de confirma- cion de ECL % de reduccion
SEQ ID NO: 23
VHH de tipo natural 1778 20 8682 53 60 4
SEQ ID NO: 24
VHH de tipo natural +A14P 205 91 668 96 56 10
SEQ ID NO: 25
VHH de tipo natural +K83R 1403 37 6912 63 62 1
SEQ ID NO: 26
VHH de tipo natural +Q108L 1533 31 6991 62 59 5
SEQ ID NO: 27
VHH de tipo natural + A14P + K83R + Q108L 156 93 628 97 57 8
SEQ ID NO: 28
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R+T91Y+ Q108L 228 90 570 97 58 6
SEQ ID NO: 29
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R+T91Y+ Q108L+ 1 A adicional en el extremo C-terminal (A114) 1814 18 15087 18 60 3
SEQ ID NO: 30
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R+T91Y+ Q108L + 3 A en el extremo C-terminal (A114+A115+A116) 1933 13 15244 18 62 0
Ejemplo 2: Purificacion por afinidad de anticuerpo analftico
Este ejemplo describe dos metodos que pueden usarse para aislar de un lfquido biologico de un sujeto humano un anticuerpo analftico que es capaz de reconocer y/o unirse al extremo C-terminal de un ISV. El anticuerpo se afsla de 4 muestras de suero diferentes que se caracterizaron porque estas indujeron una senal positiva en un ensayo de
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ADA segun la prueba tal como se describe en el ejemplo 1.
Partiendo de muestras de suero, cada uno de estos protocolos proporciona una preparacion de factor(es) de interferencia purificado(s) que puede(n) usarse como anticuerpo analftico en los metodos descritos en el presente documento. Estos metodos tambien pueden usarse mas generalmente para purificar el/los factor(es) de interferencia con otros propositos (por ejemplo, tambien se usaron experimentalmente el/los factor(es) de interferencia purificado(s) usando los protocolos mas adelante, en el ejemplo 8 con el fin de mostrar que la union a un ISV o construccion de ISV por el anticuerpo monoclonal 21-4 es predictiva de la union del mismo ISV o construccion de ISV por factores de interferencia, y por tanto mediante la tendencia de dicho ISV o construccion de ISV a experimentar interferencia proteica no especffica en un ensayo de ADA).
Ejemplo 2A: Purificacion usando cromatografia de afinidad y proteina A
En una primera etapa, se enriquecio la fraccion de anticuerpo de IgG de las muestras de suero usando cromatografia de afinidad con proteina A. Las columnas tfpicas que se usaron para este enriquecimiento incluyeron HiTrap MabselectSure y MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). Se realizo la purificacion de los anticuerpos de IgG de las muestras de suero de manera automatizada y similar a lo largo de todos los experimentos. Se realizaron series cromatograficas en los sistemas de purificador AKTA (GE Healthcare) y se registraron en tiempo real usando el software de purificacion de protefnas UNICORN (GE Healthcare). En resumen, se diluyo 1:1 la muestra de suero con D-PBS (solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco) y se filtro a traves de un filtro de 0,22 pm antes de la carga superior en la columna a un caudal fijo de 0,5 ml/min. Se lavo la columna para retirar componentes de union inespecffica a lo largo de 5 volumenes de columna usando D-PBS a un caudal de 0,5 ml/min. Se eluyo la fraccion de IgG mediante elucion acida, usando tampon glicina 100 mM, pH 2,6, y un caudal de 0,5 ml/min. Despues de la elucion, se neutralizaron las fracciones usando tampon Tris 1,5 M, pH 8,8. Se ejecuto SDS-PAGE para confirmar el aislamiento de anticuerpos de IgG en la elucion.
En una segunda etapa, se enriquecieron adicionalmente las IgG interferentes mediante la aplicacion de la fraccion de IgG purificada con proteina A de los 4 sueros diferentes sobre columnas de afinidad acopladas con ISV. Mas especfficamente, se enriquecieron adicionalmente las IgG interferentes mediante la union a una columna que contenfa un ISV con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En esta, se ligo covalentemente el ISV a Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) usando el metodo de acoplamiento con CNBr (bromuro de cianogeno) segun el procedimiento del fabricante. Se realizo la purificacion por afinidad de manera automatizada y similar a lo largo de todos los experimentos. Se realizaron series cromatograficas en los sistemas de purificador AKTA y se registraron en UNICORN. En resumen, se cargo de forma superior la muestra enriquecida en IgG (hasta 10 ml de volumen de carga) en la columna a un caudal fijo de 0,5 ml/min. Se lavo la columna para retirar componentes de union inespecffica a lo largo de 5 volumenes de columna usando D-PBS a un caudal de 0,5 ml/min. Se eluyeron los componentes de union a ISV mediante elucion acida, usando tampon glicina 100 mM, pH 2,6, y un caudal de 0,5 ml/min. Despues de la elucion, se neutralizaron las fracciones usando tampon Tris 1,5 M, pH 8,8. Se analizaron las fracciones usando SDS-PAGE que confirmo el aislamiento de anticuerpos de IgG en la elucion (datos no mostrados).
Se reunieron estas fracciones y se usaron para analisis adicionales tales como los descritos en el ejemplo 3.
Ejemplo 2B: Purificacion usando cromatografia con CaptureSelect™
Alternativamente, se recuperaron factor(es) de interferencia de plasma y se purificaron usando la resina de afinidad de union a IgA disponible comercialmente CaptureSelect hIgA™ (BAC BV), que se basa en dominios variables solamente de cadena pesada (VHH) derivados de camelidos. La “fraccion de IgA” recogida que conterna IgA junto con IgG interferente se cargo posteriormente sobre una columna de proteina A para retirar la fraccion de IgA. Se proceso la columna de proteina A segun condiciones de purificacion de IgG genericas (tampon de ejecucion: PBS; tampon de elucion: glicina 100 mM, pH=2,7; neutralizacion tras la elucion mediante Tris 1 M). Se recupero el factor de interferencia de la elucion con proteina A con un rendimiento >95 %.
En una variacion de este metodo, se uso otra resina de afinidad CaptureSelect (resina CaptureSelect Alpha-1 Antitrypsin, una resina de afinidad basada en VHH disponible comercialmente, que no se dirige a ninguna proteina relacionada con anticuerpos). Esta resina proporciono una alta eficacia de union a factor de interferencia y permitio una elucion selectiva en 2 etapas: antitripsina mediante elucion a pH neutro usando MgCl2 2,0 M, seguido por la elucion de factor de interferencia mediante una etapa acida (glicina 0,1 M, pH 3,0, de manera similar a las condiciones de elucion con proteina A/G; neutralizacion usando Tris 1,5 M). Esta purificacion en una etapa produjo hasta 15 pg de IgG1 interferente por ml de plasma de alta interferencia, que es aproximadamente el 0,3 % de la IgG total presente. Opcionalmente, la fraccion de interferencia neutralizada puede desalarse y purificarse adicionalmente mediante una columna de exclusion molecular equilibrada en D-PBS.
Ejemplo 3: Influencia de diferentes sustituciones de ISV sobre la tendencia de ISV a dar lugar a interferencia proteica Tal como se menciona en la descripcion anterior, la presente invencion pone a disposicion determinados ensayos y
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tecnicas que hacen que sea posible realizar una evaluacion de si un ISV dado tiene tendencia o no a dar lugar a interferencia proteica. Estos incluyen el ensayo de puente basado en ECL y el ensayo de configuracion de desplazamiento de farmaco usado en el ejemplo 1, asf como el ensayo BIACORe descrito en este ejemplo 3 y el ensayo de ADA de puente/competencia descrito en los ejemplos adicionales mas adelante.
Tal como se menciona tambien en la descripcion anterior, estos ensayos tambien pueden usarse para determinar si cambios especfficos (tales como deleciones, sustituciones o adiciones de aminoacidos) pueden incluir (y preferentemente reducir) la tendencia de un ISV dado a dar lugar a interferencia proteica. Algunos de estos cambios resultaran o le quedaran claros al experto basandose en la divulgacion en el presente documento y en los datos experimentales presentados en el ejemplo 1 y este ejemplo 3.
Tal como ya se indico mediante los datos generados en el ejemplo 1, parece que determinadas mutaciones en o cerca de la region C-terminal (tal como se define en el presente documento) de un ISV pueden influir (enormemente) en su tendencia a dar lugar a interferencia proteica. Por ejemplo, la adicion de unos pocos residuos de aminoacido al extremo C-terminal (tal como 1 o 3 residuos de alanina) parece reducir enormemente la tendencia de un ISV a dar lugar a interferencia proteica, y parece incluso ser capaz de anular la presencia de otras sustituciones (por ejemplo, en o cerca de la region C-terminal) que parecen aumentar la tendencia a dar lugar a interferencia proteica (por ejemplo, una sustitucion A14P).
En este ejemplo 3, se investigo tanto el efecto de otras sustituciones asf como el efecto de la adicion de aminoacidos adicionales al extremo C-terminal comparando ISV relacionados con diferentes sustituciones, usando el anticuerpo analftico policlonal generado en el ejemplo 2. Se realizo el analisis midiendo la cinetica de interaccion entre cada uno de los ISV investigados y el anticuerpo analftico policlonal por medio de resonancia de plasmon superficial (SPR) usando el biosensor Biacore™ T100 de GE Healthcare. Los ISV sometidos a prueba en este ejemplo 3 eran los de SEQ ID NO 3 a 22 (vease la tabla A anterior y la tabla V mas adelante).
En un experimento tfpico, se preparo una disolucion de anticuerpo policlonal a 10 pg/ml en NaOAc 10 mM, pH 5,0. Este anticuerpo policlonal se inmovilizo luego sobre un chip sensor CM5 usando acoplamiento de amina mediante el metodo de EDC/NHS (EDC = N-etil-N'-[3-dietilamino-propil]-carbodiimida; NHS = N-hidroxisuccinimida) segun el procedimiento del fabricante. La cantidad inmovilizada proporciono aproximadamente 2700 unidades de respuesta (UR). Luego se inyecto una concentracion fija de 500 nM de ISV sobre la superficie durante 120 segundos a un caudal de 45 pl por minuto. Dado que no pudo identificarse un tampon de regeneracion eficaz, se alargo el tiempo de disociacion hasta 2400 segundos. Se resto la serial obtenida inyectando el ISV en una celda de flujo de blanco de la serial obtenida inyectando el ISV en la celda de flujo con anticuerpo policlonal unido. Se activo/desactivo la celda de flujo de blanco de un modo similar que la celda de flujo para el anticuerpo policlonal, pero sin anadir protefna. Ademas, se resto una inyeccion de blanco (HBS-EP + tampon de ejecucion (HBS = solucion salina tamponada con Hepes: GE Healthcare) para corregir una posible deriva del valor inicial.
Para examinar el efecto de la adicion de residuos de aminoacido al extremo C-terminal, se investigo la influencia de la adicion de 1 o 2 alaninas y 1, 2 o 3 glicinas comparando la union de ISV con las diferentes adiciones, usando un anticuerpo analftico policlonal generado tal como se describe en el ejemplo 2. Los ISV generados y sometidos a prueba con este proposito fueron los NB 3.4 a 3.9 (SEQ ID NO: 5 a 10).
Como ejemplos representativos de la clase de datos obtenidos, la figura 3 muestra la union de los NB 3.4 a 3.9 al anticuerpo policlonal inmovilizado. La tabla V resumen los resultados obtenidos.
TABLA V
ID de clon
SEQ ID NO Posicion 113(1) Posicion 114(1) Posicion 115(1) Posicion 116(1) Union** (UR)
NB 3.4
5 S 75
NB 3.5
6 S A 9
NB 3.6
7 S A 8
A
NB 3.7
8 S G 31
NB 3.8
9 S G G 13
NB 3.9
10 S G G G 13
**: Senal de union obtenida al final de la inyeccion (= senal en UR maxima)
(1) En esta numeracion, la posicion 113 es la ultima “S” del motivo VTVSS C-terminal, y las posiciones 114, 115 y 116 son las posiciones inmediatamente siguientes (en el sentido de 3') de dicha posicion 113.
Para examinar el efecto de (otras) sustituciones en la region C-terminal, se investigo la influencia de diferentes sustituciones comparando ISV relacionados que contenfan estas sustituciones, usando el mismo anticuerpo analftico policlonal tal como se describio anteriormente. Se realizo el analisis tal como se describio anteriormente.
Los ISV que contenfan dichas sustituciones que se sometieron a prueba fueron los NB 3.1, 3.2 y 3.4 (SEQ ID NO 3, 4 y 5); los NB 3.10 a 3.15 (SEQ ID NO 11 a 16), que se compararon con NB 3.4; los NB 4.1 y 4.2 (SEQ ID NO 17 y 18) y los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 (SEQ ID NO 19 a 22).
Como ejemplos representativos de la clase de datos obtenidos:
- La figura 4 muestra la union de los NB 3.4, 3.11, 3.12 y 3.13 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
10 - La figura 5 muestra la union de los NB 3.4, 3.14 y 3.15 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
- La figura 6 muestra la union de los NB 3.1, 3.2 y 3.4 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
- La figura 7 muestra la union de los NB 4.1 y 4.2 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
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- La figura 8 muestra la union de los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 al anticuerpo policlonal inmovilizado.
Las tablas VI, VII y VIII resumen los resultados obtenidos.
20 TABLA VI
ID de clon
SEQ ID NO Posicion 14(l) Posicion 83(1) Posicion 108(1) Union** (UR)
NB 3.4
5 p R L 75
NB 3.10
11 A R L 91
NB 3.11
12 P K L 88
NB 3.12
13 A R Q 86
NB 3.13
14 P R Q 90
**: Senal de union obtenida al final de la inyeccion (= senal en UR maxima) (1) numeracion segun Kabat.
25 TABLA VII
ID de clon
SEQ ID NO Posicion 11(1) Posicion 110(1) Union** (UR)
NB 3.4
5 L T 75
NB 3.14
15 L Q 79
NB 3.15
16 S T 22
**: Senal de union obtenida al final de la inyeccion (= senal en UR maxima) (1) numeracion segun Kabat.
30 TABLA VIII
ID de clon
SEQ ID NO Posicion 14 Posicion 83(1) Posicion 108(2) Marcador* Union** (UR)
NB 3.1
3 A K Q - 2
NB 3.2
4 A K Q + 0
NB 3.3
5 P R L - 59
ID de clon
Posicion 14 Posicion 8313 Posicion 108(4) Marcador* Union** (UR)
NB 4.1
17 P R L - 51
NB 4.2
18 P R L + 0
ID de clon
Posicion 14 Posicion 83CT Posicion 108(6) Marcador* Union** (UR)
NB 6.1
19 P K Q + 0
NB 6.2
20 P K Q - 39
NB 6.4
21 P R L + 0
NB 6.5
22 P R L - 66
*: si aparece “+”, este ISV contiene aminoacidos adicionales en el extremo de VTVSS C-terminal **: Senal de union obtenida al final de la inyeccion (= senal en UR maxima)
(1): numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 87 en SEQ ID NO 3 a 5).
35 (2): numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 123 en SEQ ID NO 3 a 5).
(3) : numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 86 en SEQ ID NO 17 y 18).
(4) : numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 116 en SEQ ID NO 17 y 18).
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(5) : numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 86 en SEQ ID NO 19 a 22).
(6) : numeracion segun Kabat (corresponde a los a.a. en la posicion 112 en SEQ ID NO 19 a 22).
De nuevo, sin limitarse a ninguna hipotesis o explicacion especffica, los datos presentados anteriormente muestran que (diversas) sustituciones en la region C-terminal (tal como se define en el presente documento) de un ISV pueden alterar/mejorar su tendencia a dar lugar a interferencia proteica.
Ejemplo 4: Protocolos representativos para realizar los ensayos de ADA de la figura 1
Este ejemplo proporciona algunas condiciones representativas pero no limitativas que podrfan usarse para realizar los ensayos de ADA competitivos/de puente mostrados esquematicamente en la figura 1:
- Ensayo de ADA de la figura 1A en disolucion: muestras del 100 % de matriz, 30', 37 °C, tratamiento con acido usando acido acetico en matriz 10, 5', T.A., muestra de preincubacion/neutralizacion con acido: ISV-Sulfo (:Tris) 1:1:1 (1: 0,9: 0,9: 0,1), 1 h, T.A.; sobre placa 1 h, T.A.; tampon de lavado 3x, de lectura 4x
- Ensayo de ADA de la figura 1B en disolucion: muestras del 20 % de matriz, 30', 37 °C, muestra de preincubacion: ISV- -Sulfo 1:1:1, 1 h, T.A., sobre placa 1 h, T.A., tampon de lavado 3x, de lectura 2x
- Ensayo de ADA secuencial de la figura 1C: Capture ISV-Bio, 1 h, T.A., lavado 3x, muestras del 20 % de matriz, 15', T.A., sobre placa: 2 h, T.A., lavado 3x, deteccion ALX-0141-Sulfo, 1 h, T.A., tampon de lavado 3x, de lectura 4x
Ejemplo 5: Prediccion de la sensibilidad del ISV a la interferencia proteica no especffica usando el anticuerpo analitico
Este ejemplo describe un ensayo de ADA de puente/competencia que usa el anticuerpo analitico que puede usarse para predecir la sensibilidad de un ISV a la interferencia proteica no especffica.
Se diluye el ISV que va a someterse a prueba a una concentracion de 10 pg/ml y se incuba con el anticuerpo analitico a 400 ng/ml, purificado segun el ejemplo 2, y se incuba a 37 °C a 600 rpm en placas de polipropileno de 96 pocillos. Luego se diluye 1/3 la muestra (50 pl) en una mezcla 1:1 (100 pl) de ISV biotinilado 2 pg/ml y marcado con marcador de sulfo 2 pg/ml y se incuba durante 1 hora a T.A., 600 rpm. Se bloquean placas de estreptavidina convencionales de 96 pocillos MSD MA® con 150 pl/pocillo de Superblock® T20 durante 1 hora a T.A., luego se lavan 3 veces con PBS/Tween 20 al 0,05 % (= tampon de lavado). Se transfiere la muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y marcado con marcador de sulfo) (50,0 pl) de la placa de polipropileno a la placa de MSD y se incuba durante 1 hora a T.A., 600 rpm. Se lavan las placas tres veces antes de la adicion de tampon de lectura 2 x (MSD) (150 pl/pocillo) y la lectura de las unidades de ECL (ECLU) en un instrumento de MSD (lector Sector Imager 2400).
Usando este ensayo, se sometieron a prueba y se compararon los ISV de SEQ ID NO 23 a 30. Se muestran los datos en la tabla IX. Estos datos no solamente muestran que puede usarse el ensayo descrito en este ejemplo para predecir la tendencia de un ISV a dar lugar a interferencia proteica, sino que los datos generados tambien confirman los hallazgos de los ejemplos anteriores sobre el efecto de sustituciones en la region C-terminal. Tal como puede observarse, la adicion de 3 residuos de alanina (y en menor extension 1) en el extremo C-terminal del ISV totalmente humanizado suprimio su capacidad para competir con la union del anticuerpo analitico. La mutacion de la posicion 14 en la variante de ISV de tipo natural de alanina a prolina aumento claramente su capacidad como competidor en el ensayo, (= haciendo que la variante de ISV sea mas propensa a la interferencia proteica no especffica), mientras que la mutacion de las posiciones 83 y 108 no influyo claramente en la sensibilidad del ISV a la interferencia proteica no especffica.
Tabla IX
ID de anticuerpo purificado por afinidad
IHUS#B09032311A3
ECLU en el ensayo de examen (usando SEQ ID NO: 1)
2919
Variante de Nanobody (la columna a la derecha menciona las sustituciones de humanizacion y adiciones C-terminales realizadas en comparacion con la secuencia de tipo natural de SEQ ID NO: 23)
Ensayo de confirma- cion de ECL % de reduccion
SEQ ID NO: 23
VHH de tipo natural 2706 7,3
SEQ ID NO: 24
VHH de tipo natural + A14P 268 90,8
SEQ ID NO: 25
VHH de tipo natural + K83R 2460 15,71
SEQ ID NO: 26
VHH de tipo natural + Q108L 2533 13,23
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SEQ ID NO: 27
VHH de tipo natural +A14P + K83R + Q108L 319 89,1
SEQ ID NO: 28
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L 251 91,4
SEQ ID NO: 29
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L+ 1 A adicional en el extremo C-terminal (A114) 1207 58,64
SEQ ID NO: 30
VHH de tipo natural + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 3 A en el extremo C-terminal (A114 + A115 + A116) 3301 -13,09
Ejemplo 6: Influencia de la adicion de aminoacidos al extremo C-terminal de Nanobodies anti-OX40L sobre su potencia de bloqueo de OX40L
Este ejemplo demuestra que la extension C-terminal no tiene influencia sobre la actividad o potencia de bloqueo de los Nanobodies.
Se comparo la potencia in vitro del Nanobody trivalente anti-OX40L biespecffico de secuencia optimizada Nb 3.16 (SEQ ID NO: 31) con la potencia del Nanobody correspondiente que contenfa una Ala adicional en su extremo C- terminal Nb 3.17 (SEQ ID NO: 32).
Se realizo un primer ensayo, el ensayo de activacion de celulas T, de la siguiente manera. Se aislaron PBMC de capas leucocfticas (Cruz Roja, Gante, Belgica) de donantes sanos usando el reactivo Ficoll Paque Plus (GE Healthcare) y se lavaron usando medio RPMI 1640 completo (RPMI1640 + GlutaMAX + HEPES 25 mM + suero bovino fetal al 10 % + penicilina/estreptomicina al 1 %; Invitrogen). Se estimularon las PBMC (1x105 celulas/pocillo) con fitohemaglutinina (PHA-L; concentracion final de 0,6 |ig/ml) antes de la adicion a 1x104 celulas CHO que expresan hOX40L (irradiadas con centelleador gamma a 3000 rad; Hospital Universitario (UZ) de Gante, Belgica) y series de dilucion de medio RPMI 1640 completo con Nanobodies anti-OX40L y se incubo durante 22 horas a 37 °C en incubador de CO2. Se midio la produccion de IL2 por las PBMC en ELISA. Se recubrieron pocillos de una placa Maxisorp durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal anti-IL2 humana (BD BioSciences). Despues de lavado y bloqueo de los pocillos recubiertos, se anadio una dilucion A del sobrenadante celular. Como patron, se incluyeron series de dilucion A de IL2 humana recombinante (BD BioSciences) partiendo de 2000 pg/ml. Se realizo la deteccion usando anticuerpo monoclonal anti-IL2 humana biotinilado (BD BioSciences) y estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific) y esTMB (SDT Reagents). Se detuvo la reaccion con HCl 1 N y se midio la DO a 450 nm. Tal como se esperaba, la potencia del Nanobody trivalente biespecffico de secuencia optimizada Nb 3.17 (CI50 = 0,13 nM, IC del 95 % = 0,098-0,17 nM) era comparable a la de Nb 3.16 (CI50= 0,10 nM, IC del 95 % = 0,0710,15 nM).
En un segundo ensayo de competencia basado en ELISA, se preincubo una serie de dilucion (desde 1,5 |iM hasta 0,083 pM) de los Nanobodies durante la noche a temperatura ambiente con OX40/Fc humana 100 ng/ml (R&D Systems) y OX40L humana biotinilada 10 ng/ml (R&D Systems; biotinilado de manera interna tal como se describe en el ejemplo 1) en PBS + BSA al 0,1 % + Tween-20 al 0,01 %. A continuacion, se incubaron las muestras sobre placas Maxisorp recubiertas con Nanobody anti-Fc humano 10 |ig/ml (generado de manera interna) y se bloquearon con PBS + BSA al 1 % + Tween-20 al 0,1 %. Se detecto la OX40/Fc humana unida usando estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific) y sTMB (SDT Reagents). Se detuvo la reaccion con HCl 1 N y se midio la DO a 450 nm. Segun el ensayo basado en celulas, la potencia de los Nanobodies trivalentes biespecfficos de secuencia optimizada Nb 3.17 (CI50 = 0,178 nM, IC del 95 % = 0,152-0,200 nM) era comparable a la de Nb 3.16 (CI50 = 0,179 nM, IC del 95 % = 0,149-0,215 nM).
Ejemplo 7: Generacion del anticuerpo monoclonal 21-4-3
Se inmunizaron por via intraperitoneal dos grupos de diferentes razas de ratones (BALB/c y NMRI, tres ratones de cada una) con la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825, en una emulsion de agua en aceite de volumenes iguales de antfgeno y adyuvante completo o incompleto de Freund) a lo largo de un periodo de 39 dfas, con refuerzo hasta que se obtuvieron los tftulos de antisuero adecuados.
Despues de asfixia de los ratones estimulados en CO2, se extirparon de manera aseptica los bazos y se preparo una suspension monocelular de los bazos reunidos. Se lavaron las celulas de bazo y celulas de mieloma varias veces con DMEM y se fusionaron en presencia de 1 ml de PEG 3350 al 50 % (p/v) (razon de celulas de bazo con respecto a SP2/0 de 3:1). Para la fusion, se uso la lfnea celular de mieloma SP2/0-Ag14 de la Coleccion Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ GmbH, Brunswick). Esta lfnea celular es un hfbrido entre celulas de bazo BALB/c y la lfnea celular de mieloma P3x63Ag8. Se resuspendieron los hibridomas asf producidos en CGM que contenfa FCS al 20 % y aminopterina (medio HAT) y se sembraron (140 ^l/pocillo) en ocho placas de fondo plano para cultivo tisular de 96 pocillos (Corning-Costar) que contenfan 140 ^l/pocillo de CGM (FCS al 20 %) con celulas de exudado peritoneal como celulas de soporte. Se incubaron las placas durante 10 dfas en un medio de
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crecimiento completo (CGM) que contenfa DMEM con complementos de 2-mercaptoetanol, L-glutamina, glutamina estable, HT y aminoacidos no esenciales (en concentraciones recomendadas por el proveedor) y FCS a diferentes concentraciones (el 10 %, el 15 % o el 20 %). Durante este periodo, se alimentaron las celulas dos veces con medio HAT. Los sobrenadantes de cultivo celulas de las celulas de hibridoma contenfan habitualmente de 1 a 20 pg/ml de anticuerpo, que se sometieron a prueba en un ELISA de union para confirmar la union a la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825.
Se transfirieron celulas de pocillos de produccion de IgG positiva a pocillos de placas de 48 pocillos y se cultivaron durante 2-4 dfas (dependiendo de las caracterfsticas de crecimiento de las celulas). Se llevaron a cabo ELISA de union con ALX081 e IgG humana/de macaco con el fin de excluir los agentes de union inespecffica. Se clonaron dos veces las celulas de hibridoma que expresaban agentes de union especfficos para la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825 usando dilucion limitada. Despues de la fusion y el nuevo examen, se identificaron 7 cultivos primarios que produjeron anticuerpos contra ALX-081. Todos estos cultivos primarios produjeron anticuerpos que no dan reaccion cruzada con IgG humana o de macaco. Se volvieron a clonar (dos veces) los cultivos primarios.
Al clon 21-4 (uno de los clones que produjo de manera estable anticuerpos contra ALX-081 despues de la segunda clonacion) se le dio la designacion “ABH0015” y se deposito ante la Coleccion Coordinada Belga de Microorganismos (BCCM) en Gante, Belgica el 4 de junio de 2012 con el numero de acceso LMBP-9680-CB. El raton monoclonal producido mediante ABH0015 se denomino 21-4-3: la determinacion del isotipo para 21-4-3 mostro una cadena pesada de IgG1 y una cadena ligera kappa, que se secuenciaron (veanse las SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente). Se mostro que 21-4-3 se unfa a la region C-terminal de la construccion de Nanobody de SEQ ID NO: 98 en el documento WO 2006/122825 (datos no mostrados).
Ejemplo 8: La union de 21-4 a un ISV es predictiva de la tendencia de un ISV a experimentar interferencia proteica no especffica
Este ejemplo junto con el siguiente ejemplo 9 demuestra que la union del anticuerpo monoclonal 21-4 a un ISV puede usarse para predecir (dentro de los grados de certidumbre indicados en este ejemplo) si un ISV dado tendra tendencia a experimentar interferencia proteica no especffica (por ejemplo, en un ensayo de ADA).
Este ejemplo 8 en particular muestra que puede usarse 21-4 para predecir si determinadas modificaciones propuestas a un ISV dado (tal como la adicion de uno o mas residuos de aminoacido al extremo C-terminal de un ISV y/o la sustitucion de una o mas sustituciones de aminoacidos dentro de la region C-terminal de un ISV) conduciran a una reduccion de la tendencia de dicho ISV a experimentar interferencia proteica no especffica.
Brevemente, se sometio a prueba un conjunto de 53 Nanobodies y construcciones de Nanobody diferentes (vease la figura 9 y SEQ ID NO: 38 a 89) para determinar la union por el anticuerpo monoclonal 21-4-3. Tambien se sometieron a prueba los mismos Nanobodies y construcciones de Nanobody para determinar la union por preparaciones de factor(es) de interferencia purificadas obtenidas de tres donantes humanos diferentes (denominados en el presente documento “donante 8”, “donante 19” y “donante 30”), para ver si habfa cualquier correlacion entre la union por 21-4 y por los factores de interferencia purificados.
Se establecio que la union de un ISV por 21-4 puede usarse en efecto para predecir la union de los mismos ISV por el/los factor(es) de interferencia (dentro del grado de confianza global proporcionado por los datos expuestos en el presente documento).
Para demostrar esto, tal como se detalla mediante los datos experimentales expuestos mas adelante, se midio la union de los 53 Nanobodies o construcciones de Nanobody (enumerados en la figura 9; veanse las SEQ ID NO: 38 a 89) por 21-4 usando un instrumento T100 de Biacore (segun el protocolo expuesto mas adelante) y se comparo con la union de un Nanobody o construccion de referencia (tambien enumerados en la figura 9), tal como se mide usando el mismo instrumento de BIAcore y el mismo protocolo. Se muestran los resultados en la tabla X mas adelante.
Tabla X
SEQ ID NO:
Amino- acido(s) C- terminal(es) mutaciones en la region C-terminal reduccion de la union de 21-4-3 frente a la union de la secuencia de referencia (=100 %) reduccion de interferencia en suero del donante A en comparacion con la secuencia de referencia (=100 %) reduccion de interferencia en suero del donante B en comparacion con la secuencia de referencia (=100 %) reduccion de interferencia en suero del donante C en comparacion con la secuencia de referencia (=100 %) Reduccion de mas del 70 % de la union de Nanobody a 21-4-3 predice una reduccion de >50 % de la union de Nanobody a factor de interferencia Reduccion de mas del 90 % de la union de Nanobody a 21-4-3 predice una reduccion de >50 % de la union de Nanobody a factor de interferencia
37
A ninguna 7 % 3 % 21 % 31 % ok ok
38
A ninguna 0 % 9 % 25 % 7 % ok ok
39
A ninguna 0 % 10 % 43 % 35 % ok ok
40
A ninguna 1 % 6 % #N/A #N/A ok ok
41
A ninguna 7 % 6 % 9 % #N/A ok ok
42
A ninguna 0 % 1 % 4 % #N/A ok ok
43
A ninguna 3 % 3 % 20 % #N/A ok ok
44
A ninguna 1 % 5 % #N/A #N/A ok ok
45
ninguno P14A, P41T, S62F, S74A, S82bN, R83K, L108Q 22 % 0 % #N/A #N/A ok
46
AAEQKLI SEEDLN GAAHHH HHH A14P, T41P, F62S, A74S, N82bS, K83R, Q108L 2 % 0 % #N/A #N/A ok ok
47
GGGGSG GGSRDW DFDVFG GGTPVGG ninguna 4 % 1 % #N/A #N/A ok ok
48
AAEQKLI SEEDLN GAAHH HHH ninguna 3 % 0 % #N/A #N/A ok ok
49
AAEQKLI SEEDLN GAAHH HHH V5L, I23A, E44G, A49S, A68T, A74S, T78L, W79Y, K83R, T110Q, Q108L 4 % 0 % #N/A #N/A OK OK
50
ninguno L11S 44 % 77 % 33 % #N/A (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
51
ninguno T110Q 88 % 85 % 84 % #N/A (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
52
ninguno S112G 100 % 84 % 58 % #N/A (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
53
ninguno S113G 13 % 85 % 88 % #N/A NO OK (reduccion de <90 %)
54
ninguno L11S, T110Q, S112G, S113G 16 % 39 % 16 % #N/A OK OK
55
A ninguna 6 % 2 % 21 % 31 % OK OK
56
G S113G 3 % 2 % 25 % 0 % OK OK
57
AS ninguna 6 % 1 % 2 % #N/A OK OK
58
AST ninguna 6 % 2 % 2 % #N/A OK OK
59
ASTK ninguna 6 % 2 % 1 % #N/A OK OK
60
ASP ninguna 6 % 2 % 1 % #N/A OK OK
61
AP ninguna 6 % 2 % 2 % #N/A OK OK
62
APT ninguna 6 % 2 % 1 % #N/A OK OK
63
W ninguna 3 % 4 % 8 % #N/A OK OK
64
L ninguna 6 % 3 % 4 % #N/A OK OK
65
ninguno P14A 23 % 73 % 121 % 64 % NO OK (reduccion de <90 %)
66
ninguno L11S 48 % 81 % 29 % 84 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
67
ninguno R83K 101 % 102 % 117 % 96 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
68
ninguno P14A,L108Q 26 % 38 % 115 % 49 % NO OK (reduccion de <90 %)
69
ninguno L108Q 106 % 80 % 120 % 84 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
70
ninguno T110Q 106 % 90 % 105 % 98 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
71
ninguno S113G 44 % 88 % 105 % 87 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
72
ninguno S112G, 45 % 70 % 47 % 56 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
73
G S112G, S113G 1 % 6 % 8 % 9 % OK OK
74
G ninguna 1 % 4 % 41 % 33 % OK OK
75
AA ninguna 1 % 1 % 11 % 16 % OK OK
76
GGG ninguna 2 % 2 % 17 % 20 % OK OK
77
A ninguna 1 % 2 % 12 % 13 % OK OK
78
ninguno Q13R 1 % 96 % 96 % 100 % NO OK NO OK
79
GG ninguna 2 % 1 % 17 % 13 % OK OK
80
ninguno T110Q, S112G, S113G 51 % 65 % 5 % 58 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
81
ninguno L11V 75 % 94 % 50 % 89 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
82
ninguno P84A 56 % 96 % 80 % 100 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
83
ninguno T87A 79 % 56 % 73 % 61 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
84
ninguno S112G 91 % 84 % 50 % 83 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
85
ninguno L11S, T110Q, S112G, S 113G 32 % 46 % 5 % 42 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
86
ninguno L11S, T110Q 64 % 76 % 6 % 86 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
87
ninguno L11S, S112G, S113G 41 % 51 % 5 % 39 % (reduccion de <70 %) (reduccion de <90 %)
88
A L11S, T110Q 1 % 1 % 5 % 11 % OK OK
89
ninguno L11S, P14A, T110Q, S112G, S113G 2 % 14 % 5 % 17 % OK OK
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Para cada uno de los 53 Nanobodies o construcciones de Nanobody sometidos a prueba, se eligio la referencia de tal manera que, en comparacion con la referencia, los Nanobodies o construcciones de Nanobody sometidos a prueba tenfan o bien uno o mas residuos de aminoacido adicionales en el extremo C-terminal (que se anadieron con el fin de someter a prueba el efecto de tal adicion sobre la interferencia proteica, y en particular con el fin de reducir dicha interferencia) y/o bien una o mas mutaciones dentro de la region C-terminal (por ejemplo, como resultado de humanizacion en comparacion con la referencia).
Se expresaron los resultados como un porcentaje de reduccion de la union (medida como unidades UR) para el Nanobody dado frente a la union de la referencia (tambien medida en unidades UR, por ejemplo, si el nivel de union medido (UR) del Nanobody de referencia era de 276 y el nivel de union del Nanobody dado (tambien en UR) era de 9, entonces la reduccion del nivel de union era hasta un nivel de [9 UR/276 UR] x 100 % = 3 %), lo que significa una reduccion del 97 % en comparacion con la referencia (100 %).
De manera similar, se midio la union del/de los factor(es) de interferencia purificado(s) de cada uno de los tres donantes a cada uno de los 53 Nanobodies o construcciones de Nanobody usando el mismo instrumento de Biacore y se comparo con la union del/de los factor(es) de interferencia purificado(s) al mismo Nanobody o construccion de referencia. Se expresaron los resultados de manera similar como un porcentaje de reduccion de la union del factor de interferencia al Nanobody o construccion de Nanobody dado frente a la referencia.
Se encontro que para esencialmente todos los Nanobody o construcciones de Nanobody en los que se habfan anadido uno o mas residuos de aminoacido al extremo C-terminal en comparacion con la referencia, que la union del/de los factor(es) de interferencia se reducfa drasticamente. Esto confirma de nuevo que la adicion de uno o mas residuos de aminoacido al extremo C-terminal de un ISV (VTVSS) puede reducir la interferencia proteica no especffica en un ensayo de ADA. Tambien se encontro que en la mayorfa de los casos, solamente la realizacion de sustituciones dentro de la region C-terminal (es decir, sin anadir uno o mas residuos de aminoacido al extremo C- terminal) en comparacion con la referencia a menudo no tuvo un impacto drastico similar sobre la union del/de los factor(es) de interferencia.
Luego se analizaron adicionalmente los datos para determinar si una reduccion de la union por 21-4 en comparacion con la referencia estaba correlacionada de algun modo con una reduccion de la union por cada uno de las tres preparaciones diferentes de factor de interferencia purificado en comparacion con la referencia. Se encontraron tales correlaciones.
Por ejemplo, se encontro que de los 54 Nanobodies o construcciones de Nanobody sometidos a prueba, 36 mostraron una reduccion de la union por 21-4 de mas del 70 % en comparacion con su secuencia de referencia respectiva (teniendo la mayor parte de estos 36 uno o mas residuos de aminoacido adicionales en el extremo C- terminal, en algunos casos en combinacion con sustituciones dentro de la region C-terminal). De estos 36, 32 tambien mostraron reduccion de la union por el/los factor(es) de interferencia en comparacion con la referencia de mas del 50 % (y en un gran numero de casos, en particular para Nanobodies o construcciones de Nanobody con uno o mas residuos de aminoacido anadidos en el extremo C-terminal, la reduccion fue bastante mayor del 50 %, tal como de mas del 70 % o incluso de mas del 90 %, veanse los datos facilitados en la tabla X). Esto demuestra que en 32 de los 36 casos (es decir, el 89 %), una reduccion de la union por 21-4 de mas del 70 % (en comparacion con la referencia = 100 %) es predictiva de una reduccion de la union por los factores de interferencia de mas del 50 % (en comparacion con la misma referencia). Para mayor claridad, en cada caso, se calculo la reduccion como del 100 %, [el porcentaje facilitado en las tablas mas adelante para el nivel de reduccion logrado con el Nanobody sometido a prueba].
De manera similar, se encontro que de los 53 Nanobodies o construcciones de Nanobody sometidos a prueba, 33 mostraron una reduccion de la union por 21-4 de mas del 90 % en comparacion con su secuencia de referencia respectiva (de nuevo, teniendo la mayor parte de estos 33 uno o mas residuos de aminoacido adicionales en el extremo C-terminal, en algunos casos en combinacion con sustituciones dentro de la region C-terminal). De estos 33, 32 tambien mostraron una reduccion de la union por el/los factor(es) de interferencia en comparacion con su secuencia de referencia respectiva de mas del 50 %. Esto demuestra que en 32 de los 33 casos (es decir, el 97 %), una reduccion de la union por 21-4 de mas del 90 % (en comparacion con la referencia) es predictiva de una reduccion de la union por los factores de interferencia de mas del 50 % (en comparacion con la misma referencia).
Tambien debe observarse que tal reduccion de la union del/los factor(es) de interferencia en mas del 50 % (tal como se evidencia mediante una reduccion de la union por 21-4 de mas del 70 %) significa que tal(es) factor(es) de interferencia esencialmente no interfiere(n) ya en un ensayo de ADA para el ISV en cuestion: la confirmacion experimental usando un ensayo de ADA mostro que cuando la union por el/los factor(es) de interferencia se reduce en mas del 45 %, que no pudo observarse una influencia significativa de la presencia del/los factor(es) de interferencia sobre el ensayo de ADA. A este respecto, tambien resultara claro al experto que esto sera incluso mas el caso cuando la union por factor(es) de interferencia se reduzca hasta una extension bastante mayor del 50 % (tal como en mas del 70 % o incluso mas del 90 %), tal como se observa en algunos casos (veanse de nuevo los datos presentados en el presente documento).
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De hecho, se ha encontrado que una reduccion de mas del 45 % de la union por 21-4 es indicativa de una reduccion de la union por factores de interferencia de mas del 45 %, que tal como se menciona significa que el/los factor(es) de interferencia ya no interfiere(n) en el ensayo de ADA.
Ademas, los datos presentados en el presente documento sobre la correlacion entre (la reduccion de) la union por 21-4 y (la reduccion de) la union por el factor de interferencia tambien permitio a los presentes inventores fijar un valor absoluto para la union por 21-4 por debajo del que puede esperarse (dentro de la confianza proporcionada por los datos expuestos en este ejemplo 8) que un ISV o construccion basada en ISV no sera susceptible a la union por factor(es) de interferencia de modo que pudiesen interferir en un ensayo de ADA. Tal como se expone en el siguiente ejemplo 9, este valor es de 500 UR (determinado y calculado tal como se expone en el ejemplo 9).
Se purifico el anticuerpo monoclonal 21-4 del medio de cultivo del hibridoma obtenido en el ejemplo 7 anterior de la siguiente manera: Se cultivaron celulas de hibridoma que secretan el anticuerpo monoclonal 21-4-3 en frascos de agitacion en medio libre de suero (hibridoma CD, Gibco, complementado con L-glutamina 8 mM (Invitrogen) y colesterol 1x (concentrado lipfdico de colesterol 250 x, Gibco)) a un volumen de 100 ml o 500 ml. Se filtro el sobrenadante aclarado, y se capturo la IgG1 murina en una columna de protefna A (HiTrap MabSelect SuRe, 5 ml, GE Healthcare) a un caudal reducido de 2 ml/min. Se eluyo el anticuerpo unido en tampon citrato 0,1 M, pH 3,0, y se neutralizaron las fracciones de elucion (de 5 ml) directamente con 1 ml de TRIS 1 M, pH 9. Se verifico la pureza del anticuerpo mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras.
Se obtuvieron las preparaciones purificadas de factor(es) de interferencia de los donantes 8 y 19 a partir de muestras de suero de dichos donantes por medio de purificacion por afinidad, esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2A. El/los factor(es) de interferencia del donante 30 se obtuvieron de una muestra de suero del donante 30, esencialmente tal como se describe en el ejemplo 2B.
Para determinar la union de 21-4 a cada uno de los Nanobodies o construcciones de Nanobody, se uso el protocolo descrito en el ejemplo 9.
Se determino la union de los factores de interferencia de los tres donantes a cada uno de los Nanobodies o construcciones de Nanobody usando un instrumento T100 de Biacore esencialmente tal como se describe en el ejemplo 3, usando el factor de interferencia de cada uno de los donantes 8, 19 y 30, directamente inmovilizado sobre un chip sensor CM5.
Ejemplo 9: Protocolo para predecir si un ISV tendra tendencia a experimentar interferencia proteica no especifica (usando monoclonal 21-4)
Se realizaron mediciones de union usando un instrumento T100 de Biacore usando un chip sensor CM5 T120416, con tampon de ejecucion HBS-EP+, 25 °C. Se capturo 21-4 mediante anticuerpo de conejo anti-IgG murina inmovilizado, ya que se encontro que no podia regenerarse eficazmente una superficie con AcM 21-4-3 directamente inmovilizado. El anticuerpo anti-IgG murina usado era un anticuerpo de conejo anti-IgG murina policlonal que reacciona con todas las subclases de IgG, con IgA e IgM (GE Healthcare; n.° de cat. BR-1008-38; n.° de lote 10056316). La inmovilizacion del anticuerpo anti-IgG murina se realizo usando acoplamiento de amina manual usando una inyeccion durante 7 minutos de EDC/NHS para la activacion y una inyeccion durante 7 minutos de etanolamina HCl 1 M, pH 8,5 para la desactivacion (Biacore, kit de acoplamiento de amina). Se enumeran las condiciones de union en la tabla XI. Basandose en el nivel de inmovilizacion y el PM de las proteinas, la Rmax teorica para la union del AcM 21-4-3 al anticuerpo anti-IgG murina inmovilizado era de ~13000 UR (cuando se une una molecula de AcM 21-4-3 a una molecula anti-IgG murina).
Tabla XI
Protefna
Conc. (pg/ml) Tiempo de contacto (s) Caudal (ul/min) Tampon de inmovilizacion Nivel de inmovilizacion (UR)
Anti-IgG murina
30 420 5 acetato 10 mM, pH 5,0 13028
Anti-IgG murina
30 420 24 5 acetato 10 mM, pH 5,0 13318
Las condiciones usadas para el experimento de union (instrumento T100 de Biacore) usando 21-4 inmovilizado de esa manera se facilitan en la tabla XII. La superficie anti-IgG murina pudo regenerarse satisfactoriamente despues de la captura del AcM 21-4-3 y la inyeccion de todas las muestras (con un aumento limitado para el nivel inicial despues de cada regeneracion).
Tabla XII

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
  2. 2.
    25
  3. 3.
  4. 4.
    30
  5. 5.
    35 6.
    40
  6. 7.
    45 8.
    50
    55
  7. 9.
  8. 10.
    60
  9. 11.
    Protefna o polipeptido para su uso en terapia, protefna o polipeptido que contiene un dominio variable individual de inmunoglobulina (ISV) en su extremo C-terminal, en el que dicho ISV o bien es un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado, o bien es un ISV que comprende una secuencia de VH distinta de un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado o que deriva de una secuencia de VH, ISV que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en la que:
    - n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala o Gly; o
    - n = 1,2 o 3 en el que cada X = Ala; o
    - n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Gly; o
    - n = 2 o 3 en el que al menos un X = Ala o Gly ; o
    - n = 2 o 3 en el que todos menos un X = Ala o Gly,
    y protefna o polipeptido que incluye un peptido de union a seroalbumina o dominio de union a seroalbumina y tiene una semivida expresada como t1/2-beta en un sujeto humano de al menos 3 dfas.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que el peptido de union a seroalbumina o dominio de union a seroalbumina es un ISV de union a seroalbumina.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que n = 1 o n = 2.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que n = 2 o 3 y al menos un X = Ala o Gly
    o n = 2 o 3 y todos menos un X = Ala o Gly, eligiendose independientemente los residuos de aminoacido X restantes de cualquier aminoacido que se produce de manera natural.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 4, en el que los residuos de aminoacido X restantes se eligen independientemente de Val, Leu y/o Ile.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que:
    - n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala o Gly; o
    - n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Ala; o
    - n = 1, 2 o 3 en el que cada X = Gly.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 1, en el que X no es cistefna.
    Protefna o polipeptido para su uso en terapia, protefna o polipeptido que contiene un ISV en su extremo C- terminal, en el que dicho ISV o bien es un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado, o bien es un ISV que comprende una secuencia de VH distinta de un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado o que deriva de una secuencia de VH, ISV que tiene un extremo C-terminal de la secuencia VTVSS(X)n, en la que n es de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y en la que cada X es un residuo de aminoacido que se elige independientemente, con la condicion de que X no es cistefna,
    y protefna o polipeptido que incluye un peptido de union a seroalbumina o dominio de union a seroalbumina y tiene una semivida expresada como t1/2-beta en un sujeto humano de al menos 3 dfas.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 8, en el que n es 1 o 2.
    Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 8 o 9, en el que cada X es un aminoacido que se produce de manera natural.
    Protefna o polipeptido para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que cada X se elige del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).
    Protefna o polipeptido para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicho ISV C- terminal es un VHH, VHH de secuencia optimizada, VHH humanizado o VH camelizado.
  10. 13. Protefna o polipeptido para su uso segun la reivindicacion 8, en el que el peptido de union a seroalbumina o dominio de union a seroalbumina es un ISV de union a seroalbumina.
    10
    15
    20
    25
  11. 14. Composicion farmaceutica para su uso en terapia, que comprende una protefna o un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-13, y al menos un portador, diluyente o excipiente adecuado.
  12. 15. Composicion farmaceutica para su uso en terapia segun la reivindicacion 14, en la que:
    - dicha composicion, protefna o polipeptido esta destinado al tratamiento de una enfermedad cronica en
    un ser humano, y/o
    - dicha protefna, polipeptido esta destinado a estar presente en la circulacion del sujeto al que se administra durante al menos un periodo de una semana; y/o
    - dicha protefna, polipeptido es tal que tiene una semivida expresada como t1/2-beta en un sujeto humano de al menos 3 dfas; y/o
    - dicha protefna, polipeptido o composicion farmaceutica esta destinado a administrarse a un ser humano como dos o mas dosis que se administran a lo largo de un periodo de al menos 3 dfas.
  13. 16. Composicion farmaceutica para su uso en terapia segun la reivindicacion 15, en la que dicha protefna,
    polipeptido esta destinado a estar presente a niveles farmacologicamente activos en la circulacion del sujeto al que se administra a una dosis terapeuticamente activa durante al menos un periodo de una semana.
  14. 17. Composicion farmaceutica para su uso en terapia segun la reivindicacion 15 o 16, en la que dicha protefna, polipeptido o composicion farmaceutica esta destinado a administrarse a un ser humano como dos o mas dosis que se administran en un tratamiento prolongado.
    5
    imagen1
    imagen2
    Nb-SULFO
    Anticuerpo anti-farmaco
    (ADA)
    Nb-BIO
    Estreptavidina
    Formato de puente de MSD
    imagen3
    imagen4
    osicion 10
    Posicion 83
    Extremo
    C-terminal
    Posicion 14
    imagen5
    imagen6
    imagen7
    Respuesta (0 = valor inicial)
    UR
    imagen8
    Respuesta (0 = valor inicial)
    UR
    imagen9
    UR
    imagen10
    148
    Figura 9
    SEQ ID NO
    Amino- acido(s) N- terminal(es) Mutaciones en la region C-terminal Secuencia Secuencia de referencia
    37
    A ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTriYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSA SEQ ID NO: 37 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    38
    A ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSYAMSWVR QAPGKGLEWVSG1KSSGDSTRYAGSVKGRFTISRDNAKN TLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKSRVSRTGLYTYDNRGQG TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKEREFVA A1TRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFT1SRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVS SA SEQ ID NO: 38 sin los residuos de aminoaddo C-terminales afiadidos
    39
    A ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFR QAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFT1SRDNAKN TLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAY1RPDTYLSRDYRKYDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSL RI.SCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSD TLYADSVKGRFTISRDNAK1TLYLQMNSLRPEDTAVYY CTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGG LVQPGGSLRLSCAASGn'FSSYPMGWFRQAPGKGREFVS SITGSGGSTYYADSVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMNSLRP EDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSS A SEQ ID NO: 39 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    149
    40
    A ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWV RQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAK NTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVS SGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTF SSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGR FT1SRDNAKTTLYLQMNSI.RPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQ GTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITK. YPDSVKGRFT1SRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCA RSPSGFNRGQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 40 sin los residuos de aminoacido C-terminales artadidos
    41
    A ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYR QAPGKGRELVAGIISGGSTSYADSVKGRFT1SRDNAKNT LYLQMNSLRPEDTAVYYCAF1TTESDYDLGRRYWGQGT LVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCA ASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYAD SVKGRFT1SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGS LSRSSQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 41 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    42
    A ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFR QAPGKGRELVAA1SRTGGSTYYPDSVEGRFT1SRDNAKR MVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSE YTFWGQGTQVTVSSAAAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGRELVAA1SRTGGSTY YPDSVEGRFTISRDNAKRMVYLQMNSLRAEDTAVYYCA AAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSA SEQ ID NO: 42 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    150
    43
    A ninguna DVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFILDYYAIGWFRQ APGKEREGVLC1DASDDITYYADSVKGRFT1SRDNSKNT VYLQMNSLRPEDTAVYYCATPIGLSSSCLLF.YDYDYWG QGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIG GSLSRSSQGTLVTVSSA SEQ ID NO: 43 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    44
    A ninguna DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYR HRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFTJS1DNSKNTV YLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTV SSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFT FSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKG RFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSS QGTLV'l VSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPRELVA HI GGSSINY GDSVK.GRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFN KYVTSRDTWGQC.TLVTVSSA SEQ ID NO: 44 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    45
    ninguno PI4A, P41T, S62F, S74A, S82bN, R83K, LI 080 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRS1GRLDRMGWYR HRTGEPRELVATITGGSSINYGDFVKGRFTIS1DNAKNTV YLQMNNLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTV SS SEQ ID NO: 45 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    46
    AAEQKLIS EEDLNGA AHHHHH H A14P.T4IP, F62S, A74S, N82bS, K83R, Q108L EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRS1GRLDRMGWYR HRTGEPRELVAT1TGGSSINYGDFVKGRFT1SIDNAKNTV YLQMNN LKP EDTAVYYCNFN KY VTSRDT WGQGTQ VT V SSAAAI1HIII11111G AAEQKLIS EEDLNGA A SEQ ID NO: 46 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    47
    GGGGSGG GSRDWDF DVFGGGT PVGG ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYR QAPGKGRELVAGI1SGGSTSYADSVKGRFT1SRDNAK.NT LYLQMNSLRPEDTAVYYCAF1TTESDYDLGRRYWGQGT LVTVSSGGGGSGGGSRDWDFDVFGGGTPVGG SEQ ID NO: 47 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    48
    AAEQKL1S EEDLNGA AHHHHH H ninguna EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQ APGKEREFVARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNT TWLQMNSLKAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEYD YWGTGTQVTVSSAAAEQKL1SEEDLNGAAHHHHHH SEQ ID NO: 48 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    49
    AAEQKLIS EEDLNGA AHHHHH H V5L, 123A, E44G, A49S, A68T, A74S, T78L, W79Y, K.83R, TI10Q, Q108L EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTK.SMGWFR QAPGKGREFVSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGERSTYIGSNYYRTNEY DYWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHH SEQ ID NO: 49 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    50
    ninguno LI IS HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFl'lSR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV IVSS SEQ ID NO: 50 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    51
    ninguno TI10Q HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAN^YYCTIGGSLSRSSQGTLV QVSS SEQ ID NO: 51 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    152
    52
    ninguno SII2G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT1GGSLSRSSQGTLV TVGS SEQ ID NO: 52 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    53
    ninguno S113G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISR UNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSG SEQ ID NO: 53 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    54
    ninguno LI IS, T110Q, SI12G, S113G HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVK.GRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV QVGG SEQ ID NO: 54 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    55
    A ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT1GGSLSRSSQGTLV TVSSA SEQ ID NO: 55 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    56
    G SII3G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFT1SR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV IVSSGG SEQ ID NO: 56 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    57
    AS ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRIrnSR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSAS SEQ ID NO: 57 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    58
    AST ninguna HMHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAK.TTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSAST SEQ ID NO: 58 sin los residuos de aminoacido C-terminales afiadidos
    153
    59
    ASTK ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFIFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSASTK. SEQ ID NO: 59 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    60
    ASP ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFT1SR DNAK.TTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSASP SEQ ID NO: 60 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    61
    AP ninguna HHI1HHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGK.GLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSAP SEQ ID NO: 61 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    62
    APT ninguna HHHIlMMEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFrFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTL.YLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLV TVSSAPT SEQ ID NO: 62 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    63
    W ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAK.TTLYLQMNSLRPEDTAVYYCT1GGSLSRSSQGTLV TVSSW SEQ ID NO: 63 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    64
    L ninguna HHHHHHOVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFG MSWVRQAPGKGLEWVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISR DNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTI.V TVSSL SEQ ID NO: 64 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    65
    ninguno P14A HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGWYRHRPGEPREI.VATITGGSS1NYGDSVKGRFT1SID nskntvyi.qmnslrpedtavyycnfnkyvtsrdtwgq GTLVTVSS SEQ ID NO: 65 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    154
    66
    ninguno LI IS HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDR MGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSS1NYGDSVKGRFT1S1DN SK.NTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 66 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    67
    ninguno R83K HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSS1NYGDSVKGRFTIS1D NSK.NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 67 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    68
    ninguno PI4A, L108Q HllimilHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTQVTVSS SEQ ID NO: 68 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    69
    ninguno L108Q HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTIS1D NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTQVTVSS SEQ ID NO: 69 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    70
    ninguno T110Q HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGVVYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFriSID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVQVSS SEQ ID NO: 70 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    71
    ninguno SII3G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTIS1D NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSG SEQ ID NO: 71 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    72
    ninguno SII2G, SI13G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSS1NYGDSVKGRFT1SID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVGG SEQ ID NO: 72 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    155
    73
    G SI12G, SII3G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVGGG SEQ ID NO: 73 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    74
    G ninguna HHI1HHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFT1SID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKY V I'SRD i WGQ GTLVTVSSG SEQ ID NO: 74 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    75
    AA ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSSAA SEQ ID NO: 75 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    76
    GGG ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSS1NYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSSGGG SEQ ID NO: 76 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    77
    A ninguna HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSS1NYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSSA SEQ ID NO: 77 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    78
    ninguno QI3R HHHHHHEVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASRS1GRLDR MGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFT1S1DN SKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 78 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    79
    GG ninguna HHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLDR MGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFIISIDN SK.NTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVTVSSGG SEQ ID NO: 79 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos
    156
    80
    ninguno TIIOQ, SII2G, S113G I1HHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRI.D RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFI'ISID NSICNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVQVGG SEQ ID NO: 80 sin las mutaciones mencionadas en la region C-temninal
    81
    ninguno LI IV HHHHHHEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFT1S1D NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 81 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    82
    ninguno P84A HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 82 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    83
    ninguno T87A HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISID NSKNTVYLQMNSLRPEDAAVYYCNFNK.YVTSRDTWGQ GTLVTVSS SEQ ID NO: 83 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    84
    ninguno SII2G HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRS1GRLD RMGWYRHRPGEPRELVAT1TGGSSINYGDSVKGRFT1S1D NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVTVGS SEQ ID NO: 84 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    85
    ninguno LI IS, T110Q, SI12G, SI13G HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDR MGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFT1SIDN SKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVQVGG SEQ ID NO: 85 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    86
    ninguno LI IS,TIIOQ HHIIHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRS1GRLDR MGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDN SKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVQVSS SEQ ID NO: 86 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    157
    87
    ninguno LI IS, S1I2G, SII3G HHIIHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDR MGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDN SKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVTVGG SEQ ID NO: 87 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    88
    A LI 1S, T110Q HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDR MGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDN SK.NTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQG TLVQVSSA SEQ ID NO: 88 sin los residuos de aminoacido C-terminales anadidos y sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
    89
    ninguno LIIS.P14A, T110Q, S1I2G, SII3G HHHHHHEVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFT1S1D NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQ GTLVQVGG SEQ ID NO: 89 sin las mutaciones mencionadas en la region C-terminal
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