ES2299524T3 - Compuestos heteroaromaticos biciclicos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto heteroaromático bicíclico seleccionado del grupo que consiste en 5-amino-2-metiltio-4-(3-(aliloxicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amino-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica ó 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.
Description
Compuestos heteroaromáticos bicíclicos.
La invención se refiere a compuestos que tienen
actividad de agonista o antagonista de hormona glicoproteína, en
particular a compuestos que tienen actividad de hormona luteinizante
(LH). La invención se refiere además a derivados heteroaromáticos
bicíclicos, a composiciones farmacéuticas que los contienen así como
el empleo de estos compuestos en terapia médica, en particular para
su uso como control de la fertilidad.
Las gonadotropinas ejercen un importante papel
en diversidad de funciones corporales que incluyen el metabolismo,
la regulación de la temperatura y el proceso reproductor. La
gonadotropina hipofiseal FSH, por ejemplo, juega un papel
fundamental en la estimulación de desarrollo y maduración de
folículos mientras que la LH induce la ovulación (Sharp, R.M.
Clin. Endocrinol. 33:787-807, 1990;
Dorrington y Amstrong, Recent Prog. Horm. Res.
35:301-342, 1979). Actualmente, la LH se aplica
clínicamente en combinación con FSH, por estimulación ovárica, es
decir, hiperestimulación ovárica para fertilización in vitro
(IVF) e inducción de la ovulación en mujeres no fértiles
anovulatoriamente (Insler, V., Int. J. Fertility
33:85-97, 1988, Navot y Rosenwaks, J. Vitro Fert.
Embryo Transfer 5:3-13, 1988), así como para
hipogonadismo masculino e infertilidad masculina.
Las gonadotropinas actúan sobre tipos de células
gonadales específicas para iniciar la diferenciación ovárica y
testicular y la esteroidogénesis. Las acciones de estas hormonas
pituitarias y placentales están mediadas por receptores de membrana
de plasma específicos que son miembros de la gran familia de
receptores copulados con proteína G. Consisten en un polipéptido
simple con siete dominios de transmembrana y son capaces de
interactuar con proteínas G, lo que lleva a la activación de adenil
ciclasa.
Las gonadotropinas destinadas a propósitos
terapéuticos se pueden aislar de orina humana y son de baja pureza
(Morse y col. Amer. J. Reproduct. Immunol. and Microbiology
17:143, 1988). Alternativamente, se pueden preparar como
gonadotropinas recombinantes.
Lo mismo que con otras proteínas terapéuticas,
es necesario administrar gonadotropinas o bien subcutáneamente o
intra-muscularmente. Sería ventajoso, sin embargo,
activar el receptor con una molécula pequeña que pudiera
administrarse por vía oral o vía transdérmica.
La presente invención describe la preparación de
tales análogos de hormona de bajo peso molecular que activan
selectivamente uno de los receptores de gonadotropina. Esta podría
ser considerada como una de las mayores ventajas de la presente
invención.
Según esto, la invención se refiere a derivados
heteroaromáticos bicíclicos según la fórmula general 1, o una sal
farmacéuticamente aceptable de los mismos.
donde
R^{1} es fenilo
R^{2} es metilo;
R^{3} es terc-butilo;
Y es N; Z es NH_{2}; A es S y B es
N(H)
El fenilo en R^{1} está sustituido en la
posición meta con NHR^{5} donde R^{5} es
aliloxicarbonilo, morfolinocarbonilo o
1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilo.
En los compuestos según la invención
X1-X2 es S.
Según esto, la invención se refiere a compuestos
seleccionados del grupo que consiste en
5-amino-2-metiltio-4-(3-(aliloxicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
terc-butílica,
5-amini-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4-il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
ter-butílica y
5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
terc-butílica.
Se ha demostrado que compuestos según la
invención son capaces de unirse a receptor de LH y mostrar actividad
agonista de LH.
La invención se refiere además a una composición
farmacéutica que comprende un derivado heteroaromático bicíclico o
sales del mismo según la invención.
Por tanto, los compuestos según la invención
pueden utilizarse en terapia. Otro aspecto de la invención se
refiere a la manufactura de un medicamento para control de la
fertilidad. Preferiblemente, los presentes compuestos se utilizan
para activar el receptor de LH.
Para uso terapéutico, las sales de los
compuestos según la invención son aquellas donde el
contra-ión es farmacéuticamente aceptable. Sin
embargo, se pueden emplear también sales de adición de ácido a las
bases según la invención, por ejemplo, en la preparación o
purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Todas las
sales, sean farmacéuticamente aceptables o no, están incluidas
dentro del marco de la presente invención.
Entre los ejemplos de sales de adición de ácido,
se incluyen las derivadas de ácidos minerales tales como ácido
clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, preferiblemente ácido
clorhídico, y ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido
tartárico, ácido acético, ácido láctico, ácido maleico, ácido
malónico, ácido fumárico, ácido glicólico, ácido succínico y
similares.
Las vías adecuadas de administración para los
compuestos según la invención o sales farmacéuticamente aceptables
de los mismos, citadas aquí también como ingrediente activo, son
inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones
intravenosas o inyecciones intraperitoneales, administración oral y
administración intranasal. Preferiblemente, los compuestos se
pueden administrar por vía oral. La dosis exacta y el régimen de
administración del ingrediente activo, o una composición
farmacéutica del mismo, será necesariamente dependiente del efecto
terapéutico que trata de alcanzarse (tratamiento de infertilidad,
contracepción), y puede variar con el compuesto particular, vía de
administración, y la edad y estado de sujeto individual al que se ha
de administrar el medicamento.
En general, la administración parenteral
requiere dosis más bajas que otros métodos de administración que
son más dependientes de la adsorción. Sin embargo, una dosis para
humanos contiene preferiblemente 0,0001-25 mg por
kg de peso del cuerpo. La dosis deseada puede estar presente como
dosis unitaria o como subdosis múltiples que se administran a
intervalos apropiados a lo largo del día o, en el caso de pacientes
mujer, como dosis que se administran a intervalos diarios
apropiados a lo largo del ciclo menstrual. La dosificación así como
el régimen de administración puede diferir entre un paciente
femenino o masculino.
En el caso de aplicaciones in vitro o
ex vivo, como en aplicaciones IVF, los compuestos de la
invención se han de utilizar en medios de incubación a una
concentración de aproximadamente 0,01-5
\mu/ml.
La presente invención se refiere también a
composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto
heteroaromático bicíclico según la invención en mezcla con
auxiliares farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente otros
agentes terapéuticos. Los auxiliares deben ser "aceptables" en
el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la
composición y no perjudiciales para el paciente que lo recibe. Las
composiciones farmacéuticas incluyen las adecuadas para
administración oral, rectal, nasal, tópica (incluida transdérmica,
bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea,
intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las composiciones se
pueden preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica farmacéutica, por ejemplo, utilizando métodos tales como
los descritos en Gennaro y col., Remington Pharmaceutical
Sciences (18ª edición, Mack Publishing Company, 1990, véase
especialmente la Parte 8: Pharmaceutical Preparations and their
Manufacture).
Estos métodos incluyen la etapa de poner en
asociación el ingrediente activo con cualquier agente auxiliar. El
(los) agente(s) auxiliar(es), llamados también
ingredientes accesorios, incluyen los convencionales en la técnica
(Gennaro, antes citado) tales como cargas, aglutinantes, diluyentes,
disgregantes, lubricantes, colorantes, agentes para dar sabor y
agentes humectantes.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
administración oral pueden presentarse como unidades de dosis
discretas tales como píldoras, tabletas o cápsulas, o como un polvo
o gránulos, o como una solución o suspensión. El ingrediente activo
se puede presentar también como bolus o pasta. Las composiciones
pueden además estar en forma de supositorio o como enema para
administración rectal.
Para la administración parenteral, las
composiciones adecuadas incluyen inyección estéril acuosa y
no-acuosa. Las composiciones se pueden presentar en
dosis unitaria o en recipientes multidosis, por ejemplo viales
cerrados y ampollas, y se pueden almacenar en estado desecado por
congelación (liofilizado) que únicamente requiere la adición de
vehículo líquido estéril, por ejemplo agua, antes del uso.
Las composiciones, o formulaciones, adecuadas
para administración por inhalación nasal incluyen polvos o nieblas
que pueden generarse mediante aerosoles a presión con dosis medidas,
nebulizadores o insufladores.
Los derivados heteroaromáticos bicíclicos de la
invención se pueden administrar también en la forma de dispositivos
farmacéuticos implantables, que consisten en un núcleo de material
activo, encajado en una membrana que regula la velocidad de
liberación. Estos implantes se aplican subcutáneamente o localmente,
y liberarán el ingrediente activo a una velocidad aproximadamente
constante a lo largo de un período de tiempo relativamente grande,
que va de semanas a años. Métodos para la preparación de
dispositivos farmacéuticos implantables son conocidos como tales en
la especialidad, por ejemplo los descritos en la Patente europea
0.303.306 (AKZO N. V.).
Según esto, los compuestos de la presente
invención se pueden utilizar para los mismos propósitos clínicos
que la HL natural, con la ventaja de que presentan propiedades de
estabilidad alteradas y pueden administrarse de manera
diferente.
Los compuestos de la presente invención en los
que B=NH, representados por la fórmula (I-a) se
pueden preparar en general mediante la condensación, conocida en la
técnica, de un ácido de fórmula (II) con una amina de fórmula
(III).
La reacción antes mencionada se lleva a cabo a
temperatura ambiente en un disolvente adecuado, por ejemplo, un
disolvente aprótico tal como N,N-dimetilformamida
(DMF) o diclorometano, utilizando un reactivo de copulación tal
como tetrafluoroborato de
O-(benzotriazol-1-il)-N.N,N',N'-tetrametiluronio
(TBTU) o hexafluorofosfato de bromotripirrolidinofosfonio (PyBrOP)
y una base amina terciaria, por ejemplo
N,N-diisopropiletilamina (DiPEA).
Un método adecuado para la preparación de ácidos
intermedios (II) es la saponificación mediada por base, conocida en
la técnica, de ésteres de etilo de la estructura general (VI). La
saponificación tiene lugar en presencia de una base tal como
hidróxido de litio, hidróxido de potasio o hidróxido de sodio en
dioxano acuoso a temperatura elevada (40ºC a reflujo), seguido por
tratamiento con ácido.
Las tienopiri(mi)dinas de la
fórmula general (XXIV) son accesibles por tratamiento de cloruros
(XV) con mercaptoacetato de etilo bajo la influencia de una base
fuerte. En un experimento típico, se hace reaccionar un equivalente
de cloruro (XV) con 1,5 equivalentes de mercaptoacetato de etilo y 2
equivalentes de terc-butóxido de potasio en THF.
En estas condiciones, el sulfuro acíclico sufre una ciclación
espontánea para formar tienopiri(mi)dina de la
fórmula general (XXIV). Si R^{1} es (hetero)arilo,
sustituido con un grupo que arrastra un electrón tal como nitro, la
ciclación antes mencionada se realiza por un procedimiento en dos
etapas, que supone el aislamiento del tioéter intermediario,
seguido de tratamiento con una base terciaria tal como DIPEA en
tolueno/EtOH a la temperatura de reflujo, para efectuar la
formación de anillo de tiofeno.
Los compuestos de fórmula (XXI) donde Y = N
representados por la fórmula (XXI-a) se pueden
preparar por diversos métodos que están en la bibliografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, los derivados de fórmula
(XXI-a) donde R^{1} =
arilo(6-14C) pueden sintetizarse por
condensación de ésteres etílicos (XXVII), donde W es como se ha
definido previamente, con aldehidos (XXVIII) y compuestos (XXIX),
que pueden ser isotiourea (XXIX-a), isourea
(XXIX-b), guanidinas monosustituidas
(XXIX-c), guanidinas disustituidas
(XXIX-d) o amidinas (XXIX-e).
\vskip1.000000\baselineskip
En un experimento típico, los componentes
(XXVII), (XXVIII) y (XXIXa-e) se suspenden en un
disolvente apropiado, por ejemplo, etanol, metanol,
N.N-dimetilformamida,
N-metilpirrolidinona, tetrahidrofurano o piridina y
se añade una base tal como carbonato de potasio, acetato de sodio,
metóxido de sodio o etóxido de sodio. La reacción tiene lugar a
temperatura elevada (70ºC a reflujo). Véase, por ejemplo, S. Kambe,
K. Saito y H- Kishi, Syntesis: 287, 1979; A.M.
Abd-Elfattah, S.M. Hussain y A.M.
El-Reedy, Tetrahedron 39: 3197, 1983; S.M.
Hussain, A.A. El-Barbary y S.A. Mansour, J.
Heterocicl. Chem. 22: 169, 1985. En el caso en que W =
C(O)OEt, tiene lugar aromatización en la adición de
oxidante, tal como DDQ u oxígeno. Las ciclaciones mencionadas se
puede llevar a cabo también sobre un soporte sólido tal como resina
Merrifield utilizando un ligando apropiado, véase por ejemplo A.I.
Mrzinzik y E.R. Felder, J. Org. Chem. 63: 723. 1998; T.
Masquelin, D. Sprenger, R. Baer, F. Gerber e Y. Mercadal, Helv.
Chim. Acta 81: 646, 1998.
Los compuestos de fórmula general (XX) donde
Y=N, representados por la fórmula (XX-a) se pueden
preparar a través de una estrategia de condensación similar,
utilizando malonitrilo
\vskip1.000000\baselineskip
Alternativamente, los compuestos de fórmula
general (XX) son accesibles por amonolisis de cloruros de fórmula
(XV), utilizando amoníaco acuoso y un co-disolvente
orgánico apropiado tal como 1,4-dioxano. Esta
transformación se puede llevar a cabo también con cloruro de amonio
y una base amina terciaria tal como DiPEA en un disolvente aprótico
tal como DMF.
\vskip1.000000\baselineskip
El cloruro de la fórmula general (XV) se puede
sintetizar por una reacción conocida en la técnica de lactamas
(XXI) con POCl_{3} en un disolvente apropiado, tal como
1,4-dioxano, a temperaturas elevadas (60ºC a
reflujo)
Los métodos para determinar la unión a receptor
así como los ensayos in vitro e in vivo para
determinar la actividad biológica de gonadotropinas son muy
conocidos. En general, el receptor expresado se pone en contacto
con el compuesto que se va a ensayar y se mide la unión o
estimulación o inhibición de una respuesta funcional.
Para medir la respuesta funcional, se expresa
ADN aislado que codifica el gen de receptor de LH, preferiblemente
el receptor humano, en células huésped adecuadas. Estas células
pueden ser células de ovario de hamster chino, pero también son
adecuadas otras células. Preferiblemente las células son de origen
mamífero (Jia y col., Mol. Endocrin.,
5:759-776, 1991.
Los métodos para construir líneas celulares que
expresan LH recombinante son muy conocidas en la especialidad
(Sambrook y col., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Cold Spring Harbor, última
edición). La expresión de receptor se consigue por expresión del ADN
que codifica la proteína deseada. Las técnicas para mutagénesis
dirigida a sede, ligado de sentencias adicionales, PCR, y
construcción de sistemas de expresión adecuados son todos, por
ahora, muy conocidos en la especialidad. Se pueden construir
sintéticamente porciones o todo el ADN que codifica la proteína
deseada utilizando técnicas de fase sólida convencionales,
preferiblemente incluyendo sedes de restricción para facilitar el
ligado. A las secuencias que codifican el ADN, se pueden
proporcionar elementos de control adecuados para transcripción y
traducción de la secuencia de codificación incluida. Como es bien
sabido, se dispone ahora de sistemas de expresión que son
compatibles con una amplia variedad de huéspedes, que incluyen
huéspedes procarióticos como bacterias y huéspedes eucarióticos
tales como levaduras, células de vegetales, células de insecto,
células de mamífero, células de aves y similares.
Las células que expresan el receptor se ponen en
contacto entonces con el compuesto de ensayo para observar la unión
o estimulación o inhibición de una respuesta funcional.
Alternativamente, se pueden utilizar membranas
celulares aisladas que contienen el receptor expresado para medir
la unión del compuesto.
Para medir la unión se pueden utilizar
compuestos marcados radiactivamente o fluorescentemente. Como
compuesto de referencia se puede emplear LH recombinante humana. En
la alternativa también se pueden realizar ensayos de unión
competitiva.
Otro ensayo supone análisis de selección
(screening) para compuestos agonistas de receptor de LH por
determinación de la estimulación de la acumulación de AMPc mediada
por receptor. Según esto, tal método supone la expresión del
receptor sobre la superficie celular de una célula huésped y la
exposición de la célula al compuesto de ensayo. Se mide entonces la
cantidad de AMPc. El nivel de AMPc se reducirá o incrementará,
dependiendo del efecto inhibidor o estimulante del compuesto de
ensayo sobre la unión a receptor.
Además de la medición directa de por ejemplo
niveles de AMPc en la célula expuesta, se pueden utilizar líneas
celulares que además de la transfección con ADN que codifica
receptor sean transfectadas también con un segundo ADN que codifica
un gen informador, cuya expresión responde al nivel de cAMP. Estos
genes reformadores pueden ser inducibles por AMPc o pueden
construirse de tal manera que se conecten a elementos de respuesta a
AMPc. En general, la expresión del gen informador puede ser
controlada por cualquier elemento de respuesta que reaccione al
cambio de niveles de AMPc. Los genes informadores adecuados son, por
ejemplo, LacZ, fosfatasa alcalina, luciferasa de luciérnaga y
proteína de fluorescencia verde. Los principios de tales ensayos de
transactivación son bien conocidos en la técnica y están descritos,
por ejemplo, en Stratowa, Ch., Himmler, A y Czernilofsky, A.P.
(1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:574.
Para seleccionar compuestos activos, los ensayos
a 10^{-5}M deben dar por resultado una actividad de más del 20%
de la actividad máxima cuando se utiliza LH como referencia. Otro
criterio puede ser el valor de EC_{50} que debe ser
<10^{-5}M preferiblemente <10^{-7}M.
El especialista se dará cuenta de que los
valores de EC_{50} deseables dependen del compuesto ensayado. Por
ejemplo, un compuesto con una EC_{50} inferior a 10^{-5}M está
considerada en general como un candidato para selección del
fármaco. Preferiblemente, este valor es inferior a 10^{-7}M, más
preferiblemente 10^{-8}M. Sin embargo, un compuesto que tenga una
EC_{50} más alta pero que sea selectivo para el receptor
particular, puede ser incluso un buen candidato.
El análisis de selección para compuestos
agonistas de receptor de LH se puede realizar también utilizando un
bioensayo de células Leydig de ratón (Van Damme, M. Robersen, D. y
Diezfalusy, E. (1974), Acta Endocrinol. 77:
655-671 Mannaerts, B. Kloosterboer, H. y Schuurs, A.
(1987), Neuroendocrinology of Reproduction, R. Rolland y
col. Eds, Elsevier Science Publishers B.V., 49-58).
En este ensayo, la estimulación de producción de testosterona
mediada por receptor de LH se puede medir en células Leydig aisladas
de ratones macho.
Para medir la actividad in vivo de
compuestos agonistas de receptor de LH, se puede estudiar la
inducción de ovulación en ratones inmaduros. En este ensayo, se
puede cebar ratones hembra inmaduros con FSH urinaria y tratarse,
aproximadamente 48 horas después, con compuesto agonista de LH. Los
animales se sacrifican después del tratamiento con LH y se puede
comprobar microscópicamente el número de óvulos en el oviducto.
Los compuestos de la presente invención se
pueden aplicar clínicamente en aquellos regímenes en los que ahora
se emplea LH o hCG. Estos incluyen la substitución de LH entre
sujetos con hipogonadismo hipogonadal, ya sea masculino o femenino,
administración en mitad del ciclo para inducir la ovulación
(inducción de ovulación (OI) o hiperestimulación controlada (COH) o
estimulación del corpus luteum.
Ejemplo
1
Se agitó a 60ºC durante 5 horas una mezcla de
sulfato de S-metilisotiourea (139 mg),
3-metoxibenzaldehido (243 \mul), cianoacetato de
etilo (112 \mul) y carbonato de potasio (145 mg) en etanol
absoluto (2 ml). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC en baño de
hielo, se filtró y el residuo se calentó en agua (H_{2}O) hasta
obtener una solución transparente. Se aciduló la solución con HCl
acuoso 2N a pH 2 y se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Los
cristales resultantes se recogieron por filtración y se secaron al
vacío.
- Rendimiento:
- 186 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 274,2
- TLC:
- R_{f} = 0,50, gel de sílice, diclorometano (CH_{2}Cl_{2})/metanol (CH_{2}OH) = 9/l (v/v).
Se añadió oxicloruro de fósforo (0,75 ml) a una
solución agitada de
5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-6-hidro-
xi-pirimidina (ejemplo 1 a, 305 mg) en 1,4-dioxano seco (1 ml). Se añadió una gota de N,N-dimetilanilina. Al cabo de 3 horas a 80ºC, se enfrió la mezcla a 0ºC en un baño de hielo y se le añadió lentamente hielo triturado. Después de cesar la reacción exotérmica, se añadió H_{2}O (3 ml). Se recogieron los sólidos por filtración y se secaron al vacío.
xi-pirimidina (ejemplo 1 a, 305 mg) en 1,4-dioxano seco (1 ml). Se añadió una gota de N,N-dimetilanilina. Al cabo de 3 horas a 80ºC, se enfrió la mezcla a 0ºC en un baño de hielo y se le añadió lentamente hielo triturado. Después de cesar la reacción exotérmica, se añadió H_{2}O (3 ml). Se recogieron los sólidos por filtración y se secaron al vacío.
- Rendimiento:
- 244 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 292,2
- TLC
- R_{f} = 0,86, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}.
Se añadió terc-butóxido de
potasio (150 mg) a una solución agitada de
2-mercaptoacetato de etilo (92 \mul) y
6-cloro-5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-pirimidina (Ejemplo 1b, 244 mg) en tetrahidrofurano seco (THF) (4 ml). Al cabo de 1 hora, la mezcla se enfrió a 0ºC en baño de hielo, se diluyó con H_{2}O (10 ml). Los sólidos se recogieron por filtración y se secaron al vacío.
6-cloro-5-ciano-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-pirimidina (Ejemplo 1b, 244 mg) en tetrahidrofurano seco (THF) (4 ml). Al cabo de 1 hora, la mezcla se enfrió a 0ºC en baño de hielo, se diluyó con H_{2}O (10 ml). Los sólidos se recogieron por filtración y se secaron al vacío.
- Rendimiento:
- 260 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 376,2
- TLC
- Rf = 0,44, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}.
Se disolvió
5-Amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxílato
de etilo (Ejemplo 1c, 9,27 g) en una mezcla de
1,4-dioxano (270 ml) y H_{2}O (30 ml). Se añadió
hidróxido de litio (10 g) y la mezcla se agitó a 80ºC durante 48
horas. Se separó, por evaporación,1,4-dioxano de la
mezcla y el residuo se recogió en H_{2}O. La solución remanente
se aciduló a pH 2 por adición de HCl acuoso 3N. El precipitado
resultante se separó por filtración y se lavó con H_{2}O. Las
trazas de agua en el precipitado se eliminaron por
co-evaporación con 1,4-dioxano y
luego con éter dietílico y se secó al vacío a 50ºC durante toda la
noche.
- Rendimiento:
- 8,45 g
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 348,0
- TLC
- R_{f} = 0,2, gel de sílice, CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH = 9/1 (v/v).
Se disolvió ácido
5-amino-4-(3-metoxifenil)-2-metiltio-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxílico
(Ejemplo 1d, 7,0 g) en CH_{2}Cl_{2} seco (100 ml). Se añadieron
tetrafluoroborato de
benzotriazol-1-il-N,N,N,N'-tetrametiluronio
(TBTU) (8,0 g), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)
(6,6 ml) y terc-butilamina (4,0 ml) y la mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. La mezcla de reacción
se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5%), (2* 100 ml) y HCl acuoso 1M.
Esta capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró al vacío. El
compuesto del título se purificó por cromatografía sobre gel de
sílice con heptano (heptano/acetato de etilo (EtOAc) = 1/0 a 3/2
(v/v) como eluyente.
- Rendimiento:
- 6,5 g
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 403,0
- HPLC
- R_{f} = 33,56 min, columna 5 \mum Luna (C-18(2) 100* 2,0 mm, flujo 0,25 ml/min, temperatura de la estufa 40ºC, detección 210 nm + 254 nm, eluyente H_{2}O/acetonitrilo(CH_{3}CN)/ CH_{3}- OH= 70/28,5/1,5 a 0/95/5 (v/v) en 50 minutos.
Se disolvió
5-amino-2-metiltio-4-(3-metoxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 1e, 1,8 g) en
CH_{2}Cl_{2} (30 ml) y la solución resultante se enfrió hasta
0ºC. Se añadió, gota a gota, una solución de tribromuro de boro
(1,28 ml) en CH_{2}Cl_{2} seco (30 ml) y la mezcla se agitó
durante toda la noche a temperatura ambiente. Se añadió, gota a
gota, NaHCO_{3} saturado acuoso a la mezcla de reacción hasta que
cesaba la reacción exotérmica. Se separó después CH_{2}Cl_{2} de
la mezcla por evaporación y se añadió una gran cantidad de EtOAc.
La capa orgánica se lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado, se secó
(MgSO_{4}) y se concentró al vacío.
- Rendimiento:
- 1,3 g
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 389,2
- HPLC
- R_{f} = 17,44 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente H_{2}O/CH_{3}CN)/CH_{3}OH = 90/ 9,5/0,5 a 0/95/5 (v/v) en 50 minutos.
Se disolvió
5-amino-2-metiltio-4-(3-hidroxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo
1f,100 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron DIPEA (500 \mul) y cloroformiato de metilo (199 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por H^LC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente CH_{3}CN/H_{2}O = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
1f,100 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron DIPEA (500 \mul) y cloroformiato de metilo (199 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por H^LC utilizando columna Luna C-18 con el siguiente gradiente CH_{3}CN/H_{2}O = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
- Rendimiento:
- 93 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 447,4
- HPLC
- R_{f} = 17,56 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente H_{2}O/CH_{3}CN) = 40/60 a 0/100 (v/v) en 25 min.
\newpage
Ejemplo
2
Se llevó a cabo la reacción de
5-amino-2-metiltio-4-(3-hidroxifenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida
terc-butílica (ejemplo 1 f, 400 mg) con
cloroformiato de p-nitrofenilo (207 mg) según los
métodos descritos en el Ejemplo 1h. La evaporación del disolvente a
presión reducida condujo al compuesto del título bruto.
- Rendimiento:
- 569
- MS-ESI:
- [M+H] = 554,6
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Ejemplo
3
Se disolvió
5-amino-2-metiltio-4-(p-nitro-fenoxicarboniloxi)-fenilo)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 2, 142 mg) en
CH_{2}Cl_{2}. Se añadieron
1,2,3,6-tetrahidropiridina (117 \mul) y DIPEA
(224 \mul) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante
toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2}
y se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se concentró a presión
reducida. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando
columna Luna C-18 con el siguiente gradiente:
CH_{3}CN/H_{2}O = 20/80 (v/v) en 45 minutos. El compuesto del
título se liofilizó entonces desde una mezcla de
1,4-dioxano y H_{2}O.
- Rendimiento:
- 76 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 498,2
- HPLC
- R_{f} = 13,90 min, columna Luna C-18 (2) 150*4,60 mm, flujo 1 ml/min, detección 210 nm, eluyente H_{2}O/CH_{3}CN) = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.
Ejemplo
4
Se agitó a 60ºC durante 16 horas una mezcla de
sulfato de S-metil isotiourea (69,0 g),
3-nitrobenzaldehido (75,0 g), cianoacetato de etilo
(56,0 ml) y carbonato de potasio (72,5 g) en EtOH absoluto (1500
ml). La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. El
precipitado resultante. El precipitado resultante se recogió por
filtración, se lavó con EtOH absoluto y se disolvió en agua caliente
(100ºC). La solución se enfrió a temperatura ambiente, se aciduló
con HCl 2N a pH 2 y se enfrió a 0ºC en agua de hielo. El precipitado
resultante se recogió por filtración y se lavó con agua. El agua
residual del precipitado se separó por evaporación con
1,4-dioxano.
- Rendimiento
- 54,0 mg
- MS-ESI:
- [M+H]* = 289,0
- TLC:
- R_{f} = 0,3, gel de sílice, DCM/MeOH = 9/1 (v/v).
Se añadió POCl_{3} (100 ml) a una solución
agitada de
5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-hidroxi-pirimidina
(Ejemplo 4(a), 25,0 g) en 1,4-dioxano seco
(300 ml). Al cabo de 3 horas a 90ºC, la mezcla se enfrió a
temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo
se disolvió en 1,4-dioxano (100 ml) y la solución
resultante se enfrió a 8ºC. Se añadió cuidadosamente agua con hielo.
El precipitado resultante se recogió por filtración y se lavó con
agua. El agua residual del precipitado se separó por evaporación con
1,4-dioxano.
- Rendimiento:
- 26,0 g
- MS-ESI
- [M+H]* = 307,0
- TLC
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Se añadió DIPEA (15,7 ml) a una solución agitada
de 2-mercaptoacetato de etilo (9,3 ml) y
6-cloro-5-ciano-4-(3-nitrofenil).2.metiltio-pirimidina
(Ejemplo 4(b), 26,0 g) en una mezcla de EtOH (259 ml) y DCM
(250 ml). Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadió HCl
acuoso 0,1N (500 ml) a la mezcla que se extrajo entonces con DCM
(3*500 ml), se secó (mgSO_{4}) y se concentró a presión
reducida.
- Rendimiento:
- 28,0 g
- MS-ESI:
- [M+H]* = 390.4
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).
Se agitó a temperatura de reflujo (100ºC)
durante 16 horas una mezcla de etil
5-ciano-4-(3-nitrofenil)-2-metiltio-6-(etoxicarbonilmetiltio)-pirimidina
(Ejemplo 4(c) 28,0 g) y DIPEA (30 ml) en una mezcla de
tolueno (150 ml y EtOH (150 ml). Se enfrió entonces la mezcla hasta
temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. Se separó la
DIPEA residual por evaporación con tolueno.
- Rendimiento:
- 28,0 g
- MS-ESI:
- [M+H]* = 391,2
- TLC:
- R_{f} = 0,5, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).
Se disolvió
5-amino-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxilato
de etilo (Ejemplo 4d, 780 mg) en 1,4-dioxano (10
ml). Se añadieron etanol (10 ml) y cloruro de estaño(II) (1,1
g) y la mezcla de reacción se agitó durante toda la noche a 90ºC.
Después de concentrarse la mezcla de reacción al vacío, se volvió a
disolver en EtOAc (50 ml) y se lavó con NaOH acuoso 4M (10 ml), se
secó (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. El grupo éster
etílico en el derivado resultante
5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]-pirimidin-6-carboxilato
de etilo (558 mg) se saponificó al correspondiente ácido (430 mg)
utilizando el método descrito en el Ejemplo 1d y se hizo reaccionar
subsiguientemente con terc-butilamina (200 \mul)
para formar la correspondiente terc-butilamida
(según el Ejemplo 1e). El compuesto del título s purificó por
cromatografía sobre gel de sílice con heptano/EtOAc = 3/1 (v/v)
como eluyente.
- Rendimiento:
- 391 mg
- MS-ESI:
- [M+H]* = 388,0
- TLC:
- R_{f} = 0,43, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v,v).
Se disolvió en piridina seca (5 ml)
5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg) en piridina seca
(5 ml). Se añadió cloruro de toluensulfonilo (70 mg) y la mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción
se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con HCl acuoso 0,1M. Se
secó la capa orgánica (MgSO_{4}) y se concentró a presión
reducida. El compuesto del título se purificó por cromatografía
sobre gel de sílice con heptano/EtOAc = 3/2 (v/v) como
eluyente.
- Rendimiento:
- 63 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 542,4
- HPLC
- R_{f} = 23,46 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/H_{2}O/CH_{3}CN/CH_{3}CH) = 10/72/17/1 a 10/18/68/4 (v/v) en 50 minutos.
Ejemplo
5
Se disolvió en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml)
5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg). Se añadieron
cloroformiato de etilo (199 \mul) y DIPEA (500 \mul) y la
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la
noche. Se lavó la mezcla de reacción con H_{2}O. Se secó la capa
orgánica (MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida. Se purificó
el compuesto del título por HPLC utilizando columna Luna
C-18 con el siguiente gradiente
CH_{3}CN/CH_{3}CN acuoso al 10% = 10/90 a 90/10 (v/v) en 30
minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde una
mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
- Rendimiento:
- 80 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 446,2
- HPLC
- R_{f} = 20,44 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/ H_{2}O/CH_{3}CN/ = 10/72/18 a 10/18/72 (v/v) en 20 minutos.
Ejemplo
6
Se llevó a cabo la reacción de
5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 4e, 100 mg) (5 ml) con
cloroformiato de alilo (274 \mul) utilizando los métodos descritos
en el Ejemplo 5. Se purificó el compuesto del título por HPLC
utilizando columna Luna C-18 con el siguiente
gradiente CH_{3}CN/CH_{3}CN acuoso al 10% = 10/90 a 90/10 (v/v)
en 30 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título desde
una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
- Rendimiento:
- 66 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 472,2
- HPLC
- R_{f} = 22,37 min, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 1e) eluyente tampón fosfato 50 mM pH2,1/ H_{2}O/CH_{3}CN/ = 10/72/18 a 10/18/72 (v/v) en 20 minutos.
Ejemplo
7
Se disolvió
5-amino-2-metiltio-4-(3-aminofenil)-tieno[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 4e, 1g) en CH_{2}Cl_{2}
seco (100 ml). A continuación, se añadió una solución de
cloroformiato de p-nitro-fenilo
(520 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (10 ml), gota a gota y la reacción
resultante se agitó a temperatura ambiente. Al cabo de 1 hora, la
mezcla de reacción se lavó con H_{2}O. Se secó la capa orgánica
(MgSO_{4}) y se concentró a presión reducida.
- Rendimiento:
- 1,42 g
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 553,6
- TLC
- R_{f} = 0,7, gel de sílice, heptano/EtOAc = 3/2 (v/v).
Ejemplo
8
Se disolvió
5-amino-2-metiltio-4-(3-(p-nitro-fenoxicarbonilamino)-fenil)tieno-[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 7, 142 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron morfolina (112 \mul) y DIPEA (225 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: H_{2}O/CH_{3}N = 80/20 a 0/1000 (v/v) en 45 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título a partir de una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
terc-butílica (Ejemplo 7, 142 mg) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml). Se añadieron morfolina (112 \mul) y DIPEA (225 \mul) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con H_{2}O. La capa orgánica se concentró a presión reducida. El compuesto del título se purificó por HPLC utilizando una columna Luna C-18 con el siguiente gradiente: H_{2}O/CH_{3}N = 80/20 a 0/1000 (v/v) en 45 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título a partir de una mezcla de 1,4-dioxano y H_{2}O.
- Rendimiento:
- 22 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 501,2
- HPLC:
- R_{f} = 8,62 minutos, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 3), eluyente H_{2}O/CH_{3}CN = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.
Ejemplo
9
Se llevó a cabo la copulación de
5-amino-2-metiltio-4-(3-(p-nitro-fenoxi-carbonilamino)-fenil)tieno-[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida
terc-butílica (Ejemplo 7, 142 mg) con
1,2,3,6-tetrahidropiridina (118 \mul) según los
métodos descritos en el Ejemplo 8. El compuesto del título se
purificó por HPLC utilizando una columna Luna C-18
con el siguiente gradiente: H_{2}O/CH_{3}N = 80/20 a 0/100
(v/v) en 45 minutos. Se liofilizó entonces el compuesto del título
a partir de una mezcla de 1,4-dioxano y
H_{2}O.
- Rendimiento:
- 22 mg
- MS-ESI
- [M+H]^{+} = 497,2
- HPLC:
- R_{f} = 11,19 minutos, columna Luna C-18 (véase Ejemplo 3), eluyente H_{2}O/CH_{3}CN = 40/60 a 0/100 (v/v) en 15 minutos.
Ejemplo
10
Se ensayó la actividad agonista para LH de
compuestos en células de ovario de hamster chino (CHO) transfectadas
establemente con receptor humano de LH y
co-transfectadas con un elemento (CRE) de respuesta
de AMPc/promotor que dirige la expresión de un gen informador de
luciferasa de luciérnaga. La unión de ligando al receptor de LH
copulado con Gs dará lugar a un incremento de AMPc, que a su vez
inducirá una transactivación de la construcción de informador de
luciferasa. La señal de luciferasa se cuantificó utilizando un
contador de luminiscencia. Se calcularon cuantitativamente, para
los compuestos de ensayo, los valores de EC_{50} (concentración
del compuesto de ensayo que causaba una estimulación de la mitad de
la máxima (50%). Se utilizó el programa de ordenador GraphPad
PRISM, versión 3,0 (GraphPad software Inc., San Diego, con este
propósito. Los resultados indicaron que el valor de EC_{50} para
los compuestos de los Ejemplos 6, 8 y 9 eran más bajos de
10^{-8}M.
Claims (4)
1. Un compuesto heteroaromático bicíclico
seleccionado del grupo que consiste en
5-amino-2-metiltio-4-(3-(alilo-
xicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amino-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4-
il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica ó 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.
xicarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]-pirimidina-6-carboxamida terc-butílica, 5-amino-2-metiltio-4-(3-((morfolin-4-
il)-carbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida ter-butílica ó 5-amino-2-metiltio-4-(3-1,2,3,6-tetrahidropiridinocarbonilamino)-fenil)-tieno[2,3-d]pirimidina-6-carboxamida terc-butílica.
2. El compuesto según la reivindicación 1 para
utilizarlo en terapia.
3. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto hetero-aromático bicíclico según la
reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato
del mismo, en mezcla con una substancia auxiliar farmacéuticamente
aceptable.
4. Utilización de un compuesto heteroaromático
bicíclico según la reivindicación 1 o una sal o solvato del mismo
farmacéuticamente aceptable para la manufactura de un medicamento
para el control de la fertilidad.
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