DE60318020T2

DE60318020T2 - Modulation der verteilung artverwandter sekundärer metaboliten

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Publication number: DE60318020T2
Application number: DE60318020T
Authority: DE
Inventors: Peter J. Fremont LICARI; Bryan Oakland JULIEN; Scott Hayward FRYKMAN; Hiroko Berkeley TSURUTA
Original assignee: Kosan Biosciences Inc
Current assignee: Kosan Biosciences Inc
Priority date: 2002-02-25
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2008-11-13
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: WO2003072730A2; CN1639319B; US7220560B2; EP1485462A2; KR20040088531A; EP1485462A4; JP4280810B2; ATE380861T1; NZ535515A; WO2003072730A3; ES2295574T3; AU2003223190A1; DE60318020D1; EP1485462B1; CN1639319A; JP2005518210A; AU2003223190A8; US20040014183A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Verfahren und Materialien zur Herstellung von Polyketiden durch DNA-Rekombinationstechnologie und Verfahren zur Modulierung der Polyketid-Congener-Verteilung durch Modulieren der Sauerstoffspannung. Die Erfindung betrifft die Gebiete Landwirtschaft, Tierhaltung, Chemie, Arzneimittelchemie, Medizin, Molekularbiologie, Pharmakologie und Veterinärtechnologie.
Hintergrund der Erfindung
Polyketide stellen eine große Familie von verschiedenen Verbindungen dar, die aus 2-Kohlenstoffeinheiten durch eine Reihe von Kondensationen und anschließenden Modifikationen synthetisiert werden.
Polyketide treten in vielen Typen von Organismen auf, einschließlich Fungi und Mycel-Bakterien, insbesondere in den Actinomyceten. Es existiert eine breite Vielfalt von Polyketid-Strukturen, und die Klasse der Polyketide umfasst zahlreiche Verbindungen mit diversen Aktivitäten. Erythromycin, FK-506, FK-520, Megalomicin, Narbomycin, Oleandomycin, Picromycin, Rapamycin, Spinocin und Tylosin sind Beispiele für solche Verbindungen.
Angesichts der Schwierigkeit bei der Herstellung von Polyketid-Verbindungen durch traditionelle chemische Methoden und der typischerweise niedrigen Produktion von Polyketiden in Wildtypzellen besteht beträchtliches Interesse daran, verbesserte oder alternative Mittel zur Herstellung von Polyketid-Verbindungen zu finden. Siehe die Veröffentlichung Nrn. WO 93/13663 ; WO 95/08548 ; WO 96/40968 ; 97/02358 ; und 98/27203 ; US Patentschriften Nrn. 4,874,748 ; 5,063,155 ; 5,098,837 ; 5,149,639 ; 5,672,491 ; 5,712,146 ; und 5,962,290 ; und Fu et al., 1994, Biochemistry 33: 9321–9326; McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546–1550; und Rohr, 1995, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34(8): 881–888.
Polyketide werden in der Natur durch Polyketid-Synthase(PKS)-Enzyme synthetisiert.
Diese Enzyme, die Komplexe von mehreren großen Proteinen sind, sind den Synthasen sehr ähnlich, die die Kondensation von 2-Kohlenstoffeinheiten bei der Biosynthese von Fettsäuren katalysieren. PKS-Enzyme werden durch PKS-Gene codiert, die im Allgemeinen aus drei oder mehr offenen (ORFs) bestehen. Zwei Haupttypen von PKS-Enzymen sind bekannt; diese unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung und der Syntheseweise. Diese zwei Haupttypen von PKS-Enzymen werden im Allgemeinen als Typ-I- oder „modulare" und Typ-II „iterative" PKS-Enzyme bezeichnet. Ein dritter Typ von PKS, der hauptsächlich in Pilzzellen vorkommt, besitzt die Merkmale sowohl der Typ-I- als auch der Typ-II-Enzyme und wird als „fungale" PKS-Enzyme bezeichnet.
Modulare PKSs sind für die Herstellung einer großen Anzahl von 12-, 14-, und 16-gliedrigen Macrolidantibiotika verantwortlich, einschließlich Erythromycin, Megalomicin, Methymycin, Narbomycin, Oleandomycin, Picromycin, und Tylosin. Jedes ORF einer modularen PKS kann ein, zwei oder mehr „Module" von Ketosynthaseaktivität einschließen, wobei jedes Modul aus mindestens zwei (sofern ein Ladungsmodul) und typischer aus drei (für das einfachste Verlängerungsmodul) oder mehr enzymatischen Aktivitäten oder „Domänen" besteht. Diese großen multifunktionellen Enzyme (> 300,000 kDa) katalysieren die Biosynthese von Polyketid-Macrolactonen durch mehrstufige Wege, die decarboxylative Kondensationen zwischen Acylthioestern und anschließende Zyklen von variierenden β-Kohlenstoffprozessierenden Aktivitäten einschließen (siehe O'Hagan, D. The polyketide metabolites; E. Horwood: New York, 1991,).
Während der letzten Hälfte des Jahrzehnts wurde die Untersuchung der modularen PKS-Funktion und -Spezifität großenteils durch das Plasmid-basierte Streptomyces-coelicolor-Expressionssystem erleichtert, das mit den 6-Deoxyerythronolid B (6-dEB)-Synthase(DEBS)-Genen entwickelt wurde (siehe Kao et al., 1994, Science, 265: 509–512, McDaniel et al., 1993, Science 262: 1546–1557, und US Patentschriften Nrn. 5,672,491 und 5,712,146 ). Die Vorteile dieses Plasmid-basierten genetischen Systems für DEBS bestehen darin, dass es die aufwendigen und begrenzten Techniken zur Manipulation des natürlichen DEBS-Wirtsorganismus, Saccharopolyspora erythraea, abschafft, leichtere Konstruktion von rekombinanten PKSs gestattet und die Komplexität der PKS Analyse durch Bereitstellen eines „sauberen" Wirtshintergrundes herabsetzt. Dieses System beschleunigte auch die Konstruktion der ersten kombinatorischen modularen Polyketid-Bibliothek in Streptomyces (siehe PCT Veröffentlichung Nrn. WO 98/49315 and 00/024907 ).
Die Fähigkeit zur Kontrolle der Aspekte der Polyketid-Biosynthese, wie Monomer-Selektion und β-Kohlenstoffprozessierungsgrad, durch genetische Manipulation der PKSs hat großes Interesse an dem kombinatorischen Engineering von neuen Antikörpern hervorgerufen (siehe Hutchinson, 1998, Curr. Opin. Microbiol. 1: 319–329; Carreras and Santi, 1998, Curr. Opin. Biotech. 9: 403–411; und US Patentschriften Nrn. 5,712,146 und 5,672,491 ). Dieses Interesse hat zu dem Klonieren, der Analyse und der Manipulation durch DNA-Rekombinationstechnik von Genen geführt, die PKS-Enzyme codieren. Durch die resultierende Technologie lässt sich ein bekanntes PKS-Gencluster manipulieren, entweder um das durch dieses PKS-synthetisierte Polyketid auf höherem Niveau zu produzieren als es in der Natur vorkommt oder in Wirtszellen, die ansonsten das Polyketid nicht produzieren. Die Technologie gestattet auch die Produktion von Molekülen, die strukturverwandt sind mit, jedoch von den aus bekannten PKS-Genclustern produzierten Polyketiden verschieden sind.
Es bestand ein großes Maß an Interesse an der Expression von Polyketiden, die durch Typ-I- und Typ-II-PKS-Enzyme in Wirtszellen produziert werden, die normalerweise solche Gene nicht exponieren. Beispielsweise wurde bereits über die Produktion der fungalen Polyketid-6-Methylsalicylsäure (6-MSA) in heterologen E. coli-, Hefe-, und Pflanzenzellen berichtet. Siehe Kealey et al., Jan. 1998, Produktion of a polyketide natural product in nonpolyketideproducing prokaryotic and eukaryotic host, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 505–9, US Patentschrift Nr. 6,033,883 , und PCT Patentveröffentlichungen Nrn. 98/27203 und 99/02669. Die heterologe Produktion von 6-MSA erforderte oder war beträchtlich erhöht durch Coexpression einer heterologen Acyl-Carrier-Proteinsynthase (ACPS) und das, für E. coli, Medienanreicherungen hilfreich bei der Erhöhung der Konzentration des Malonyl-CoA-Substrats waren, das bei der 6-MSA-Biosynthese verwendet wird. Siehe auch PCT Patentveröffentlichung Nr. 97/13845.
Die Biosynthese von anderen Polyketiden erfordert Substrate, die anders sind als, oder zusätzlich zu, Malonyl-CoA. Solche Substrate umfassen beispielsweise Propionyl-CoA, 2-Methylmalonyl-CoA, 2-Hydroxymalonyl-CoA, und 2-Ethylmalonyl-CoA. Von den Abertausenden von Wirtszellen, die zur Verwendung als Polyketid-produzierende Wirte möglich sind, produzieren viele von Natur aus solche Substrate nicht. Zusätzlich zu der Manipulation von Ausgangssubstraten und Verlängerungsmolekülen gibt es Manipulationen von Tailoring-Enzymen in verschiedenen Wirten, um diverse Polyketidprodukte zu erzielen. Außerdem spielt der Wirt eine signifikante Rolle bei der Polyketid-Congener-Produktion.
Bakterien werden als strikt aerob (Sauerstoff ist zum Wachstum notwendig), fakultativ anaerob (Sauerstoff ist nicht notwendig, ergibt jedoch ein schnelleres Wachstum), lufttolerant anaerob (Sauerstoff hat auf das Wachstum keine Auswirkungen), strikt anaerob (Sauerstoff verhindert das Wachstum), oder als microaerophil (niedrige Konzentrationen von Sauerstoff sind für das Wachstum erforderlich) klassifiziert. Sauerstoffabhängige, intrazelluläre Prozesse in aeroben Baktieren werden durch Oxidase- und Oxygenase-Enzyme vermittelt. Die meisten Myxobacteria und Actinomycetes sind Beispiele für strikt aerob. Das Wachstum von aeroben Bakterien unter mikroaeroben (sauerstoffarmen) Bedingungen ist von Interesse, da das Wachstumsverhalten der Kultur und die Produktion von primären und sekundären Metaboliten oft unterschiedlich ist von denjenigen, das typischerweise unter einem Zustand überschüssiger Oxigenierung beobachtet wird (Winkelheusen et al., 1996; Schneider et al., 1999; Jensen et al., 2001; Liefke et al., 1990; Kaiser et al., 1994; Dick et al., 1994). Referenzen sind nachfolgend nach Author und Jahr der Veröffentlichung in einer vollständigen Liste angeordnet.
Viele sekundäre Metaboliten, die durch die Mitglieder der Actinomycetales und Myxococcales produziert werden, zeigen potente und verschiedenartige biologische Aktivitäten. Polyketide sind eine Klasse dieser Naturstoffe, die durch große multifunktionelle Enzyme produziert werden, die Polyketidsyntasen (PKS) genannt werden, worauf oft die Modifikation über einen anschließenden enzymatischen Weg folgt (Carreras et al., 2000). Die Wirkungen dieser Tailoring-Enzyme im Reaktionsvorgang/Reaktionsablauf können Glycosilierungen, Hydroxylierungen, Methylierungen, Epoxidierungen oder eine Anzahl von anderen Änderungen an der Kernstruktur des Moleküls einschließen.
Intermediäre Verbindungen entlang dieser Tailoring-Wege besitzen oft biologische Potentiale, die von der Endverbindung verschieden sind. Beispiele hierfür sind die antibakteriellen Verbindungen Erythromycin B, C und D, die zu dem potenteren Erythromycin A-Congener über einen enzymatischen Weg prozessiert werden können, der die sauerstoffabhängige EryK-Hydroxylase (siehe 1) umfasst. Erythromycin B und seine 13-substituierten Analoge sind als Vorläufer für die halbsynthetische Produktion von prokinetischen gastrointestinalen Mitteln, die Motilide genannt werden, geeignet. Allerdings ist Erythromycin B ein sehr schlechtes Substrat für das EryK-Enzym und ist im Wesentlichen ein nebensächliches Endprodukt dieses Weges (Lambalot et al., 1995). Das ultimative Schicksal eines Erythromycin D-Moleküls ist dann von einer kompetitiven Reaktion zwischen der EryG-Methylase und der sauerstoffabhängigen EryK-Hydroxylase abhängig. Es wurde bereits gezeigt, dass die gelöste Sauerstoffkonzentration während der S. erythraea-Biokonversionen von 6-Deoxyerhythronolid B (6-dEB)-Analogen bei der Bestimmung kritisch ist, ob der Erythromycin A- oder B-Congener das vorherrschende Endprodukt dieser Kultivierungen ist (Carreras et al., 2002).
Die Epothilone (2) haben neuerdings Interesse als potentielle chemotherapeutische Nachfolger der potenten Antikrebsverbindung Paclitaxel hervorgerufen (Bollag et al., 1995, Gerth et al., 1996). Sowohl Paclitaxel (Taxol^®) als auch die Epothilone stabilisieren die Microtubuli über den gleichen Wirkmechanismus, jedoch sind die Epothilone wirksamer gegen Paclitaxel-resistente Tumore und stärker wasserlöslich (Kowalski et al., 1997, Su et al., 1997). Mindestens 39 verschiedene Epothilon-Varianten und verwandte Verbindungen wurden bereits in der Fermentationslösung des Wildtyp-produzierenden Organismus, Sorangium cellulosum, identifiziert (Hardt et al., 2001). Es wird berichtet, dass Epothilon D den höchsten therapeutischen Index der vier Haupt-Epothilon-Congener A, B, C oder D besitzt (Chou et al., 1998, Chou et al., 2001), jedoch durch S. Cellulosum in sehr geringer Menge produziert wird (Gerth et al., 2000). Die Acyl-Transferase 4 (AT4)-Domäne der Epothilon-PKS kann entweder eine Malonyl-CoA- oder Amethylmalonyl-CoA-Verlängerungseinheit umfassen, wobei diese Selektivität das Endverhältnis zwischen Epothilonen A und B oder zwischen Epothilonen C und D beeinflusst (Gerth et al., 2000). Der Epothilon D-Congener ist ein direkter Vorläufer zur Epoxidierung zu Epothilon B (3), die durch die EpoK-Monooxygenase katalysiert wird (Julien et al., 2000, Gerth, et al., 2001). WO 01/83800 beschreibt rekombinante Wirtszellen der Subordnung Cystobacterineae und der Art Myxococcus, die rekombinante Expressionsvektoren enthalten, die heterologe PKS-Gene codieren. Diese Zellen werden als bei der Produktion von Epothilonen und anderen Polyketiden als geeignet beschrieben.
Beispielsweise berichtet WO 01/83800 über die Produktion von Epothilon D durch Myxococcus xanthus, Stamm K111-40.1, der Epothilon PKS-Gene exprimiert, und mit einem nicht funktionellen EpoK-Gen, wobei gelöster Sauerstoff bei 50% oder bei mehr als 80% Sättigung kontrolliert wird. WO 01/83800 beschreibt auch die Produktion von Epothilon B durch Myxococcus xanthus, Stamm K111-32.25, der Epothilon PKS-Gene exprimiert, und mit einem funktionellen EpoK-Gen, wobei Sauerstoff bei mehr als 80% Sättigung gelöst ist.
Erythromycin B und Epothilon D werden als Beispiele für Zwischenstufen von Sekundärmetabolit-Tailoring-Wegen präsentiert, wobei die Zwischenstufe manchmal das gewünschte Produkt ist. Zusätzlich gibt es viele weitere Beispiele für Naturstoffe, in denen eine Monooxygenase-Enzymreaktion zur Prozessierung einer Zwischenstufe auf dem Weg in das Endprodukt notwendig ist. Beispiele umfassen die Biokonversion von Compactin zu dem Cholesterin-senkenden Arzneimittel Pravastatin (Serizawa et al., 1991, Watanabe et al., 1995); die Produktion des Pflanzenhormons, Gibberellin (Tudzynski et al., 1998); die Produktion eines fungalen Mycotoxins, Sterigmatocystin (Keller et al., 2000); und die Produktion von Doxorubicin, ein Antikrebsmittel (Lomovskaya et al., 1999, Walczak et al., 1999).
Die Aktivität dieser sauerstoffabhängigen Enzyme kann durch genetische Mittel ausgeschaltet werden, jedoch kann sich dieses Engineering aus verschiedenen Gründen als schwer oder unmöglich zu erreichen herausstellen. Die direkte genetische Inaktivierung eines Monooxygenase-Enzyms erfordert Wissen über und Zugang zu seiner Sequenz sowie die Fähigkeit zur Manipulation der DNA des Wirtsorganismus. Die vorliegende Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zur Produktion dieser Zwischenstufen als die Hauptprodukte bereit, ohne dass eine genetische Manipulation der Tailoring-Enzyme erforderlich ist.
Angesichts des Potentials zur Herstellung wertvoller und geeigneter Polyketide in großen Mengen in heterologen Wirtszellen besteht Bedarf an Wirtszellen, die in der Lage sind, Polyketide in der modifizierten Verteilung von Congenern herzustellen. Die vorliegende Erfindung unterstützt dabei das Bedürfnis der Bereitstellung rekombinanter Wirtszellen, Expressionsvektoren und Verfahren zur Herstellung von Polyketiden in verschiedenen Wirtszellen zu erfüllen.
Die folgenden Druckschriften stellen Hintergrundinformationen für die vorliegende Erfindung bereit.

Winkelhausen, E.; Pittman, P.; Kuzmanova, S.; Jeffries, T. Xylitol formation by Candida boidinii in oxygen limited chemostat culture. Biotechnol. Lett. 1996, 18, 753–758.
Schneider, S.; Wubbolts, M.; Oesterhelt, G.; Sanglard, D.; Witholt, B. Controlled regioselectivity of fatty acid oxidation by whole cells producing cytochrome P450_BM-3 monooxygenase under varied dissolved oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 1999, 64, 333–341.
Jensen, N.; Melchiorsen, C.; Jokumsen, K.; Villadsen, J. Metabolic behavior of Lactococcus lactis MG1363 in microaerobic continuous cultivation at a low dilution rate. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 2677–2682.
Liefke, E.; Kaiser, D.; Onken, U. Growth and product formation of actinomycetes cultivated at increased total pressure and oxygen partial pressure. Appl. Environ. Microbiol. 1990, 32, 674–679.
Kaiser, D.; Onken, U.; Sattler, I.; Zeeck, A. Influence of increased dissolved oxygen concentration on the formation of secondary metabolites by manumycin-producing Streptomyces parvulus. Appl. Environ. Microbiol. 1994, 41, 309–312.
Dick, O.; Onken, U.; Sattler, I.; Zeeck, A. Influence of increased dissolved oxygen concentration on productivity and selectivity in cultures of a colabomycin-producing strain of Streptomyces griseoflavus. Appl. Environ. Microbiol. 1994, 41, 373–377.
Carreras, C.; Ashley, G. W. Manipulation of Polyketide Biosynthesis for New Drug Discovery. In New Approaches to Drug Development; Jolles, P., Ed.; Birkhauser-Verlag, Switzerland, 2000; pp 89–108.
Lambalot, R. H.; Cane, D. E.; Aparicio, J. J.; Katz, L. Overproduction and characterization of the erythromycin C-12 hydroxylase, EryK. Biochemistry 1995, 34, 1858–1866.
Carreras, C.; Frykman, S.; Ou, S.; Cadapan, L.; Zavala, S.; Woo, E.; Leaf, T.; Carney, J.; Burlingame, M.; Patel, S.; Ashley; G.; Licari, P. J. Saccharopolyspora erythraea-catalyzed bioconversion of 6-deoxyerythronolide B analogs for production of novel erythromycins. J. Biotechnol. 2002, 92, 217–228.
Bollag, D. M.; McQueney, P. A.; Zhu, J.; Hensens, O.; Koupal, L.; Liesch, J.; Goetz, M.; Lazarides, E.; Woods, C. M. Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a taxol-like mechanism of action. Cancer Res. 1995, 55, 2325–2333.
Gerth, K.; Bedorf, N.; Höfle, G.; Irschik, H.; Reichenbach, H. Epothilons A and B: Antifungal and cytotoxic compounds from Sorangium cellulosum (myxobacteria)-production, physico-chemical, and biological properties. J. Antibiot. 1996, 49, 560–563.
Kowalski, R. J.; Giannakakou, P.; Hamel, E. Activities of the microtubulestabilizing agents epothilones A and B with purified tubulin and in cells resistant to paclitaxel. J. Biol. Chem. 1997, 272, 2534–41.
Su, D. S.; Meng, D.; Bertinato, P.; Balog, A.; Sorensen, E. J.; Danishefsky, S. J.; Zheng, Y. H.; Chou, T. C.; He, L.; Horwitz, S. B. Structure-activity relationships of the epothilones and the first in vivo comparison with paclitaxel. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 2093–2096.
Hardt, I.; Steinmetz, H.; Gerth, K.; Sasse, F.; Reichenbach, H.; Höfle, G. New natural epothilones from Sorangium cellulosum, strains So ce90/B2 and So ce90/D13: Isolation, structure elucidation, and SAR studies. J. Nat. Products 2001, 64, 847–856.
Chou, T. C.; Zhang, X. G.; Balog, A.; Su, D. S.; Meng, D.; Savin, K.; Bertino, J. R.; Danishefsky, S. J. Desoxyepothilone B: An efficacious microtubule-targeted antitumor agent with a promising in vivo profile relative to epothilone B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 9642–9647.
Chou, T. C.; O'Connor, O. A.; Tong, W. P.; Guan, Y.; Zhang, Z.; Stachel, S. J.; Lee, C.; Danishefsky, S. J. The synthesis, discovery, and development of a highly promising class of microtubule stabilization agents: Curative effects of desoxyepothilones B and F against human tumor xenografts in nude mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 8113–8118.
Gerth, K.; Steinmetz, H.; Höfle. G.; Reichenbach, H. Studies on the biosynthesis of epothilones: the biosynthetic origin of the carbon skeleton. J. Antibiot. 2000, 53, 1373–1377.
Julien, B.; Shah, S.; Zierman, R.; Goldman, R.; Katz, L.; Khosla, C. Isolation and characterization of the epothilone biosynthetic gene cluster from Sorangium cellulosum. Gene. 2000, 249, 153–160.
Gerth, K.; Steinmetz, H.; Höfle, G.; Reichenbach, H. Studies on the biosynthesis of epothilones: The PKS and epothilone C/D monooxygenase. J. Antibiot. 2001, 54, 144–148.
Serizawa, N.; Matsuoka, T. A two component-type cytochrome P-450 monooxygenase system in a prokaryote that catalyzes hydroxylation of ML- 236B to pravastatin, a tissue-selective inhibitor of 3-hydroy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Biochem. Biophys. Acta 1991, 1084, 35–40.
Watanabe, I.; Nara, F.; Serizawa, N. Cloning, characterization and expression of the gene encoding cytochrome P-450sca-2 from Streptomyces carbophilus involved in production of pravastatin, a specific HMG-CoA reductase inhibitor. Gene. 1995, 163, 81–85.
Tudzynski, B.; Holter, K. Gibberellin biosynthetic pathway in Gibberella fujikuroi: evidence of a gene cluster. Fungal Genet. Biol. 1998, 25, 157–170.
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Lomovskaya, N.; Otten, S.; Doi-Katayama, Y.; Fonstein, L.; Liu, X.; Takatsu, T.; Inventi-Solari, A.; Filippini, S.; Torti, F.; Columbo, A.; Hutchinson, C. R. Doxorubicin overproduction in Streptomyces peucetius: cloning and characterization of the dnrU ketoreductase and dnrV genes and the doxA cytochrome P-450 hydroxylase gene. J. Bacteriol. 1999, 181, 305–318.
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Zusammenfassung der Erfindung
Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Modulation der Polyketid-Congener-Verteilung in einer heterologen Wirtszelle ohne genetische Manipulation der Polyketidsynthase(PKS)-Gene oder Tailoring-Enzyme. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Modulation des Polyketid-Congener-Verteilungsproduktionsverhältnisses in einer myxobakteriellen Wirtszelle bereit, welche ein aktives sauerstoffabhängiges Tailoring-Enzym umfasst, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens der Wirtszelle unter Sauerstoffabgereicherter Kultivierung in Wachstumsmedium unter Bedingungen, die zu der Produktion von Polyketiden führen, wobei das Produktionsverhältnis von Polyketid-Congenern von Epothilon A und Epothilon B zu Epothilon C und D verschoben ist, umfasst.
Beschrieben werden hier metabolische, genetisch hergestellte heterologe Wirtszellen, die manipuliert werden können, um eine bestimmte Verteilung von Polyketid-Congenern zu produzieren, durch Kontrolle der Sauerstoffspannung während der Kultivierung der Wirtszellen.
Ebenfalls beschrieben werden hier rekombinante Polyketid-produzierende Wirtszellen, die, wenn sie unter modulierten Sauerstoffbedingungen kultiviert werden, die Produktion von Congenern verschieben. Die rekombinanten Wirtszellen können Sorangium cellulosum-Wirtszellen sein, die Epothilone A und B produzieren und die Produktion nach Epothilon C und D verschieben, wenn sie unter Sauerstoff-abgereicherten Bedingungen kultiviert werden.
Das durch die heterologe Wirtszelle produzierte Polyketid kann Epothilon sein, und die Epothilon-Congener-Verteilung kann moduliert sein, um Epothilon D zu produzieren, durch Modulieren der Sauerstoffspannung während der Kultivierung.
Die Epothilon-Congener-Verteilung, die durch die Sauerstoffspannung moduliert ist, kann zu einem höheren Verhältnis von Epothilon D-Congener zu Epothilon C-Congener unter überschüssiger Sauerstoffspannung führen. Das Verhältnis von Epothilon C- zu Epothilon D-Congenern kann unter Sauerstoff-abgereicherten Bedingungen zunehmen. Die Epothilon-Congenern können durch einen heterologen Myxococcus xanthus-Stamm K111-32.25 produziert werden. Die Epothilone A und B können unter überschüssiger Sauerstoffspannung produziert werden, und die Epothilone C und D können unter abgereicherter Sauerstoffspannung im Stamm K111-32.25 produziert werden.
Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Veränderung der Spezifität von Acetyl-Transferase(AT)-Domänen von Epothilon durch Modulieren der Sauerstoffspannung von Modul 4 des Epothilon-Polyketid-Synthase(PKS)-Clusters ohne genetische Manipulation. Die AT-Spezifität von Stamm K111-32.25 kann zu Methylmalonyl-CoA verschoben werden, was zu einer Verschiebung in Richtung Congenern mit einer Methylgruppe an C-12 (Epothilone B oder D) führt.
Ebenfalls beschrieben werden hier neue Polyketide, die durch metabolisch hergestellte heterologe Wirtszellen mit einer aktiven EpoK-Monooxygenase produziert werden.
Das durch Modulieren der Sauerstoffspannung während der Kultivierung einer heterologen Wirtszelle produzierte neue Polyketid kann Epothilon 506 sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Eryhtromycine B, C und D, die zu dem potenteren Erythromycin A-Congener über einen enzymatischen Weg prozessiert werden können, welcher die Sauerstoff-abhängige EryK-Hydroxylase einschließt.
2 zeigt die chemische Struktur verschiedener Epothilone. (a) Epothilon A (R₁ = H; R₂ = S); Epothilon B (R₁ = CH₃; R₂ = S); Epothilon G₁ (R₁ = H; R₂ = O); Epothilon G₂ (R₁ = CH₃; R₂ = O). (b) Epothilon C (R₁ = H; R₂ = S); Epothilon D (R₁ = CH₃; R₂ = S); Epothilon H₁ (R₁ = H; R₂ = O); Epothilon H₂ (R₁ = CH₃; R₂ = O); (c) 10,11-Didehydro-Epothilon A (R₁ = H); 10,11-Didehydro-Epothilon B (R₁ = CH₃). (d) 10,11-Didehydro-Epothilon C (R₁ = H); 10,11-Didehydro-Epothilon D (R₁ = CH₃).
3 zeigt den Epothilon D-Congener, der ein direkter Vorläufer für die durch die EpoK-Monooxygenase katalysierte Epoxidierung zu Epothilon B ist.
4 zeigt die Kultivierung des Stammes K111-32.25 (EpoK⁺) unter (a) überschüssiger oder (b) abgereicherter Oxigenierung, wobei die abgereicherte Oxigenierung zu einer 60% höheren Zelldichte führt als diejenige, die während der Kultivierung des gleichen Stammes in Gegenwart von Sauerstoffüberschuss erhalten wird.
5 zeigt HPLC-Chromatographien von Harzextrakten aus Fermentationen des Stammes K111-40.1 (EpoK⁺) kultiviert unter (a) Sauerstoffüberschussbedingungen, die zur maximalen Aktivität des EpoK-Enzyms und Produktion der Epothilone A und B als primäre Endprodukte führt; (b) abgereicherte Sauerstoffbedingung beschränkt die Aktivität dieses Enzyms, was zur Produktion von Epothilonen C und D als die primären Endprodukte führt; (c) das Ergebnis dieser Kultivierungen unter abgereicherter Oxigenierung entspricht denjenigen, die mit einem anderen Stamm (K111-40.1) unter überschüssiger Oxigenierung erhalten werden, wobei die Aktivität des EpoK-Enzyms gentechnisch ausgeschaltet wurde.
6 zeigt vinyloge Payne-Umlagerung von (a) 10,11-Didehydro-Epothilon B, das sich in (b) Epo506 unter Sauerstoffüberschussbedingungen umlagert.
7 zeigt die Kultivierung von Stamm K165-79.7 sowohl unter abgereicherten als auch überschüssigen Oxygenierungsbedingungen, die zur Verschiebung des Congener-Verhältnisses zwischen 10,11-Didehydro-Epothilon B und Epo506 führen.
8 zeigt die Modulierung der Sauerstoffspannung während der Kultivierung von Sorangium cellulosum Stamm Soce K111-150.17, der die Epothilon-Produkt-Verteilung verschiebt. (a) Zellwachstum unter 50% gelöstem Sauerstoff (DO); und (b) und (c) niedrige Sauerstoffspannung.
9 zeigt den Titer-Zeitverlauf für 3 verschiedene gelöste Sauerstoffbedingungen.
10 zeigt ein HPLC-Chromatogramm, das die Epo A und Epo B-Congener-Verteilung von einer Bedingung mit 50% gelöstem Sauerstoff bei t = 112 h zeigt.
11 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der Epothilone A-, B-, C- und D-Peaks aus der Bedingung mit 0% gelöstem Sauerstoff bei 112 h.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Polyketid-Zwischenstufen als die Hauptprodukte bereit, ohne dass eine genetische Manipulation der Tailoring-Enzyme erforderlich ist. Die vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren verwenden Wirtszellen, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter dem Budapester Vertrag hinterlegt wurden und denen Zugriffsnummern zugeordnet wurden. Myxococcus xanthus-Stamm K111-32.25 wurde am 1. Mai 2000 unter der Hinterlegungsbezeichnung PTA-1700 hinterlegt und Myxococcus xanthus-Stamm K111-40.1 wurde am 18. Januar 2001 unter der Hinterlegungsnummer PTA-2712 hinterlegt.
Ein Fed-Batch-Kultivierungsverfahren wurde bereits für die Produktion von Epothilon D in dem heterologen M. xanthus-System beschrieben. Während dieser Fed-Batch-Kultivierungen kann die gelöste Sauerstoffspannung aus überschüssigem Sauerstoff moduliert oder reguliert werden, etwa 50% gemessene gelöste Sauerstoffsättigung bis Sauerstoffabreicherung oder 0% gelöster Sauerstoff, um die Verschiebung der Congener-Produktion zu erzielen. Während der Fed-Batch-Kultivierungen wird die gelöste Sauerstoffspannung bei 50% der Luftsättigung durch automatische Kontrolle der Rührgeschwindigkeit gehalten. Wenn der obere Bereich der Rührgeschwindigkeit auf einen Wert begrenzt ist, der zur Aufrechterhaltung dieser gelösten Sauerstoffspannung nicht ausreicht, kann die kontinuierliche Zunahme des metabolischen Bedarfs der Kultur durch ihre zunehmende Zelldichte gegebenenfalls das Kultivierungsmedium an Sauerstoff abreichern. Die Kultur ist dann in einem metabolischen Zustand, in dem die Geschwindigkeit der Sauerstoffauflösung in der Kulturlösung seiner Verbrauchsgeschwindigkeit durch die Zelle entspricht. Dieser metabolische Zustand fährt zu einer Ablesung von 0 von der gelösten Sauerstoffsonde, was anzeigt, dass keine Restsauerstoffaktivität in der Kulturlösung nachgewiesen wird. Dieser Kulturzustand kann dann genutzt werden, um die Aktivität der Sauerstoff-abhängigen Tailoring-Enzyme des Prozessierweges zu minimieren, während immer noch genügend Sauerstoff bereitgestellt wird, um die Kultur-Überlebensfähigkeit aufrecht zu erhalten.
Kulturen von K111-32.25 (ATCC Hinterlegungsbezeichnung PTA-1700, 1. Mai 2000), ein Epothilon-produzierender Stamm (EpoK⁺), wurden bei überschüssiger (50% Sättigung) und abgereicherter (0%) gelösten Sauerstoffspannungen während der gesamten Epothilonproduktionsphase durch Kontrollieren der Rührgeschwindigkeit gehalten (4a, b). Die Sauerstoff-Überschussbedingung führt zu einer maximalen Aktivität des EpoK-Enzyms und zur Produktion von Epothilon A und B als primäre Endprodukte (5a). Die abgereicherte Sauerstoffbedingung begrenzt die Aktivität dieses Enzyms, was zur Produktion der Epothilone C und D als primäre Endprodukte führt (5b). Das Ergebnis dieser Kultivierungen unter abgereicherter Oxigenierung entspricht denjenigen, die mit einem anderen Stamm (K111-40.1, ATCC Hinterlegungsbezeichnung PTA-2712, 18. Januar 2001) unter überschüssiger Oxigenierung erhalten wurde, wobei die Aktivität des EpoK-Enzyms gentechnisch ausgeschaltet wurde (5c).
Die Modulierung der gelösten Sauerstoffspannung beeinflusst das Verhältnis zwischen den Epothilon A- und B-(oder C- und D-)Congenern, zusätzlich zu dem maximalen Gesamttiter der Epothilone (siehe Beispiel 2, Tabelle 1). Allerdings war die Zeit, bei der diese maximalen Titer erreicht wurden, nicht von dem Stammtyp oder dem Niveau der Oxigenierung in dem Bioreaktor abhängig, da alle drei in Tabelle 1 beschriebenen Kultivierungsbedingungen ihren maximalen Epothilon-Gesamttiter um den Tag 12 erreichten. Die Acyltransferase 4 (AT4)-Domäne der Epothilon-PKS kann entweder eine Malonyl-CoA oder eine Methylmalonyl-CoA- Verlängerungseinheit umfassen, wobei diese Selektivität das Endverhältnis zwischen diesem Epothilon-Congenern beeinflusst (17). Die Sauerstoffkonzentration kann einen indirekten Einfluss auf die intrazelluläre Poolverteilung zwischen Malonyl- und Methylmalonyl-CoA haben. Die Kultivierung der Stämme K111-40.1 (EpoK^–) und K111-32.25 (EpoK⁺) mit überschüssiger Oxigenierung führte zu einer deutlichen Verschiebung in Richtung des Congeners mit der Methylgruppe C-12 (Epothilone B oder D), was angibt, dass die Zellen die Produktion und/oder den Einbau von Methylmalonyl-CoA unter dieser Bedingung (Tabelle 1) favorisieren.
Die Kultivierung des EpoK⁺-Stammes mit abgereicherter Oxigenierung führte zu einer Zelldichte, die 60% höher war als diejenige, die während der Kultivierung des gleichen Stammes in Gegenwart von überschüssigem Sauerstoff erhalten wurde (4a, b). Die exponentielle Wachstumsphase der Sauerstoffüberschuss-Kultivierung hörte am Tag 7 auf, wonach die Zelldichte relativ konstant blieb (4a). Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit (μ) während dieser exponentiellen Phase betrug 0,7 d^–1. Wenn allerdings die gelöste Sauerstoffspannung in der abgereicherten Sauerstoff-Kultivierung am Tag 4 auf Grund der Einschränkung der Rührkaskadenreaktion 0 erreichte, verschob sich diese Kultur von ihrer exponentiellen Wachstumsphase zu einer niedrigeren Wachstumsgeschwindigkeit (μ = 0,15 d^–1) was sich bis zum Tag 12 fortsetzte (4b). Ein ähnliches Muster im Wachstumsverhalten und in der Zunahme der maximalen Zelldichte wurde auch mit dem EpoK^–-Stamm mit abgereicherter Oxigenierung sowie mit anderen gentechnisch hergestellten M. xanthus-Stämmen festgestellt, die neue Epothilone produzieren.
Die Zunahme in der Zelldichte bei den abgereicherten Sauerstoff-Kultivierungen kann dem zugeschrieben werden, dass (i) die Zellen Nährstoffe bei einer unterschiedlichen Geschwindigkeit oder in einem unterschiedlichen selektiven Muster während des langsamen durch die Sauerstoffbegrenzung vorgegebenen Wachstums verwenden können, wodurch die Erschöpfung kritischer Nährstoffe verschoben wird, (ii) die Kulturen verschiedene Typen oder Niveaus von potentiell wachstumsinhibitorischen Metaboliten während der Sauerstoffbegrenzung produzieren als wie unter überschüssiger Oxigenierung ausgeschieden werden oder dass (iii) die Begrenzung von Sauerstoff die Expression von Genen und die Aktivität von Enzymen, die an bakteriellen Wachstums- und Respirationsprozessen beteiligt sind, verstärkt oder unterdrückt.
Die Kontrolle der gelösten Sauerstoffkonzentration während der Kultivierung von bakteriellen Kulturen kann eine dramatische Auswirkung auf die Zelldichte der Kultur sowie auf Sekundärmetabolit-Titer und ihre Congener-Verteilung haben. Die Sauerstoff-eingeschränkte Kultivierungsstrategie kann zur Produktion der Zwischenstufen eines Sauerstoff-abhängigen Tailoring-Weges als Primärprodukte eingesetzt werden. Allerdings ist die Monooxigenase-Aktivität nicht vollständig ausgeschaltet, sondern bloß auf einen Bruchteil der maximalen Geschwindigkeit herabgesetzt, die typischerweise unter Sauerstoffüberschussbedingungen festgestellt wird. Um diese Zwischenstufen daran zu hindern immer noch bei einer niedrigeren Geschwindigkeit prozessiert zu werden, kann es für sie notwendig sein, in irgendeiner Weise stabilisiert zu werden. Ein Beispiel hierfür ist die kompetitive Reaktion zwischen der EryK-Hydrolase und der EryG-Methylase für das Erythromycin D-Substrat (1). Wenn die Aktivität von EryK herabgesetzt ist, ist EryG in der Lage die Umwandlung von Etythromycin D zu Erythromycin B, einem schlechten Substrat für die EryK-Hydrolase, zu katalysieren. Dies verursacht die Akkumulation der Zwischenstufe des enzymatischen Weges, Erythromycin B. Dieser Weg enthält auch ein weiteres Sauerstoff-abhängiges Tailoring-Enzym EryF (1), das die Fähigkeit beibehält, unter begrenzten Sauerstoffbedingungen 6-Deoxyerythronolid B (6-dEB) zu Erythronolid B zu prozessieren.
Ein weiteres Beispiel für diese Zwischenstufen-Akkumulation ist die Produktion von Epothilon D während der Kultivierung eines heterologen M. xanthus-Systems mit einem aktiven EpoK-Enzym. Diese Herabsetzung in der Aktivität eines Sauerstoff-abgereicherten EpoK-Enzyms ist anscheinend ausreichend, um die Katalysierung der Epothilon D-Zwischenstufe zu ihrem Epothilon B-Congener zu verlangsamen und es Epothilon D zu erlauben, aus der Zelle heraus zu diffundieren und durch das XAD-16-Harz in dem Bioreaktor gebunden und stabilisiert zu werden. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Epothilon C und D zu Schüttelkolbenkulturen eines nicht produzierenden Stamms von S. cellulosum, der die EpoK-Aktivität beibehält, zu der Diffusion dieser Verbindungen zurück in die Zellen und zu ihrer Transformation zu Epothilon A und B führt, wenn kein Harz vorhanden ist. Julien und Mitarbeiter haben gezeigt, dass dies auch mit einem Myxococcus xanthus-Stamm der Fall ist, wobei die Epothilon-PKS nicht funktionell, jedoch EpoK-aktiv ist.
Neue Epothilone werden durch Stämme erzeugt, in denen die Epothilon-Polyketid-Synthasesequenz manipuliert worden ist (Julien et al., 2000, Tang et al., 2000). Die Modulierung der gelösten Sauerstoffspannung in Kombination mit der Zugabe spezieller Vorläufer, wie Acetat und Propionat, zu dem Produktionsmedium gestattet die Produktion von jedem der 4 Haupt-Epothilon-Congener A, B, C oder D (2) als das Hauptprodukt aus einem einzigen M. xanthus-Stamm mit einem aktiven EpoK-Enzym (Frykman et al., 2002).
Die Zunahme der Serinkonzentration in dem Produktionsmedium erhöht seinen relativen Einbau durch die nicht ribosomale Epothilon-Peptid-Synthetase (NRPS) in Epothilon an Stelle von Cystein (Frykman et al., 2002). Die Anreicherung des Produktionsmediums des Stamms K111-32.25 mit Serin in Verbindung mit der Modulation der gelösten Sauerstoffkonzentration führt zur Produktion von einem der Oxazol-Epothilone G₂ oder H₂ (2) als das Hauptprodukt. Die Anreicherung von Serin, Acetat und/oder Propionat zu dem Produktionsmedium zusätzlich zur Kontrolle der gelösten Sauerstoffspannung gestattet die Akkumulation von einem der 8 Thiazol- und Oxazol-Hauptverbindungen (Epothilone A, B, C, D, G₁, G₂, H₁ und H₂) als das Hauptprodukt aus einem einzigen M. xanthus-Stamm. Dieser Ansatz sollte auch die Produktion und die Congener-Modulation der Oxazol-Gegenstücke von 10,11-Didehydroepothilon D und Epo506 ebenso erlauben.
Es hat sich gezeigt, dass die Wildtyp-Epothilon PKS nahezu 35 zusätzliche Epothilon-Varianten zusätzlich zu den Epothilonen A bis D produziert (Hardt et al., 2001). Gleichermaßen wurde festgestellt, dass die heterologe Expression der Epothilon PKS und gentechnisch hergestellte Varianten zu einer Anzahl von neuen Verbindungen zusätzlich zu dem erwarteten Produkt führen. Die Konzentration dieser Produkte kann durch die Kultivierungsbedingungen verstärkt oder unterdrückt werden. Die Fähigkeit zur Erzeugung neuer Verbindungen und zur Modulierung ihrer Verteilung durch Manipulation der Kultivierungsbedingungen eines Stamms, der eine einzige genetische Änderung in seiner PKS-Sequenz prozessiert, zeigt, wie mächtig ein durch Engineering hergestelltes PKS-Werkzeug bei der schnellen Erzeugung von neuen Naturstoffen mit sehr wirksamen biologischen Aktivitäten sein kann, wenn es mit einer geeigneten physiologischen Feinabstimmung kombiniert wird.
Da eine ausführliche Beschreibung der Erfindung vorstehend bereitgestellt wurde, werden die folgenden Beispiele für den Zweck der Erläuterung der Erfindung angegeben.
Beispiel 1
Kultivierung von Wirtszellen unter modellierten Sauerstoffspannungsbedingungen
Bakterienstämme.
Die Epothilon-Polyketid-Synthase wurde aus Sorangium cellulosum, SMP44 kloniert und in Myxococcus xanthus-Stamm DZ1 eingebaut (Julien et al.). Der M. xanthus-Epothilon B-Producer (K111-32.25) besitzt eine funktionelle EpoK-Epoxidase (EpoK⁺), während dieses Enzym genetisch in dem Epothilon D produzierenden Stamm (K111-40.1) inaktiviert worden ist. Die Aktivität der Enoyl-Reduktase (ER5)-Domäne der Epothilon-PKS wurde durch Einbringen einer Punktmutation sowohl in den K111-32.25- als auch in den K111-40.1-Stamm ausgeschaltet, um die Stämme K165-79.7 bzw. K165-76.2 zu produzieren. Die Stämme K165-79.7 und K165-76.2 wurden gentechnisch hergestellt um 10,11-Didehydroepothilone B bzw. D zu produzieren (2).
Bioreaktor, Inoculum-Expansion.
Sämtliche Mediumkomponenten wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten, wenn nicht anders angegeben. Sämtliche M. xanthus-Kulturen wurden durch Wiederbeleben eines tiefgefrorenen 1 ml Zellbankröhrchens in einem sterilen 25 ml Glasröhrchen initiiert, das 3 ml CYE-MOM-Medium (10 g/l Casiton, ein Pankreasverdau von Casein (Difco, Detroit, MI), 5 g/l Hefeextrakt (Difco), 1 g/l MgSO₄·7H₂O (EM Science, Gibbstown, NJ) und 2 ml/l Methyloleat (Emerest 2301, Cognis Corporation, Cincinnati, OH)) enthielt, für 2 Tage bei 28°C und 175 U/min. Der gesamte Inhalt dieses Röhrchens wurde für 1 Tag in 50 ml CYE-MOM in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Prallblech expandiert, und anschließend wurde dieser Kolben zur Beimpfung von 500 ml CYE-MOM in eine 2,8 l kultivierten Fernbach-Kolben mit Prallblech für einen Tag verwendet.
Fed-Batch-Bioreaktor-Kultivierung.
100 g XAD-16 hydrophobes Harz (Rohm und Haas, Philadelphia, PA) und 10 mg MgSO₄·7H₂O wurden in 4,5 l deionisiertem Wasser kombiniert und sterilisiert (90 min, 121°C) in einem 5 l Bioreaktor (B. Braun, Allentown, PA). Dieses Harz wird in das Produktionsmedium eingebracht, um die Epothilone zu binden und sie vor einem Abbau zu stabilisieren. Zwei getrennte Zufuhrschleifen einer 250 g/l Lösung des Caseinverdaus und von Methyloleat wurden an den Bioreaktor angeschlossen, und eine ausreichende Menge dieser beiden Nährstoffe dem Bioreaktor zugesetzt, um die initiale Caseinverdau- und Methyloleat-Konzentration auf 5 g/l bzw. 2 ml/l zu bringen. Schließlich wurden 25 ml von einer 0,22 μm-filtersterilisierten Spurenelementlösung (1% Vol./Vol.) konzentrierte H₂SO₄, 14,6 g/l FeCl₃·6H₂O, 2,0 g/l ZnCl₃, 1,0 g/l MnCl₂·4H₂O, 0,43 g/l CuCl₂·2H₂O, 0,31 g/l H₃BO₃, 0,24 g/l CaCl₂·6H₂O, und 0,24 g/l Na₂MO₄·2H₂O aseptisch zugesetzt. Anschließend wurde der Bioreaktor beimpft (5% Vol./Vol.) mit der CYE-MOM-Saatkultur, wobei der Caseinverdau (2g/l/Tag) und Methyloleat (3 ml/l/Tag)-Zufuhr 48 h nach der Beimpfung gestartet wurde. Der Luftstrom wurde in dem Bioreaktor konstant bei 0,4 vvm (Luftstromvolumen pro Gefäßvolumen pro min) gehalten.
Die in dem Bioreaktor gelöste Sauerstoffspannung wurde unter Verwendung eines polarografischen in situ-Sauerstoffsensors aufgezeichnet. Diese Sonde wurde bei 0% gelöster Sauerstoffspannung durch Equilibrieren des Produktionsmediums mit 100% Stickstoff und bei einer 100% gelösten Sauerstoffspannung durch Equilibrieren des Produktionsmediums mit Luft geeicht. Die initiale Rührgeschwindigkeit wurde auf 400 U/min eingestellt, ohne zusätzlichen Bioreaktor-Rückdruck, der während der Kultivierungen verwendet wurde. Die Sättigungskonzentration von Sauerstoff beträgt ungefähr 7,7 mg/ml bei 28°C (Pirt, S. J., 1975). Die gelöste Sauerstoffspannung wurde bei einem Minimum von 50% Luftsättigung (3,9 mg/l O₂) durch eine Rührkaskade in den überschüssigen Sauerstoffkultivierungen gehalten, wobei die Rührgeschwindigkeit auf ein Maximum von 450 U/min in den verarmten Sauerstoffkultivierungen begrenzt war. Der pH-Einstellpunkt von 7,4 wurde durch automatische Zugabe von 2,5N H₂SO₄ und 2,5N KOH gehalten. Aus den Bioreaktoren wurden täglich Proben für 12 bis 14 Tage genommen, worauf die Ernte des Harzes folgte.
Die quantitative Bestimmung von Zelldichte und Epothilon-Titern.
Eine 50 ml Kulturprobe wurde täglich aus dem Bioreaktor in ein konisches Röhrchen entnommen und die Nährlösung von dem Harz abdekantiert. Ein 1 ml Aliquot der Nährlösung wurde in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bei 12.000 g 5 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. Das Zellpellet wurde mit deionisiertem Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml resuspendiert, und die Extinktion dieser Zellsuspension spektralfotometrisch bei 600 nm (Genesys 20, Thermo Spectronic, Rochester, NY) gemessen. Myxococcus xanthus-Kulturen wachsen als diskrete unizelluläre Stäbchen, was die genauen Messungen der optischen Dichte (OD-Messung) erleichtert. Eine OD-Messung von 1,0 Extinktionseinheiten korreliert mit einem Trockenzellgewicht von ungefähr 0,3 g/l, wobei diese Korrelation linear in dem Bereich von 0 bis 40 OD-Einheiten ist.
Das XAD-16-Harz wurde einmal mit 45 ml deionisiertem Wasser gewaschen, worauf es wiederum abdekantiert wurde. Das Harz wurde in 25 ml analysereinem Methanol 30 min extrahiert, und die Epothilon-Titer entweder durch HPLC oder LC/MS quantitativ bestimmt. Die HPLC-Analyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 1090 HPLC (Palo Alto, CA) mit einer UV-Detektion bei 250 nm durchgeführt. Ein 50-μl-Aliquot der Methanolextrahierten Lösung wurde über zwei 4,6 × 10 mm Guard-Säulen (MetaChem Inertsil C18 ODS 3,5 μm, Ansys, Lake Forest, CA) injiziert, und eine längere Säule aus dem gleichen Material für die chromatographische Trennung (4,6 × 150 mm) injiziert. Das Verfahren war isokratisch mit 70% Acetonitril und 30% Wasser während eines 12-minütigen Laufs. Die LC/MS-Analyse wurde mit den gleichen Proben durch Injektion in ein PE Sciex AP1100LC (Perkin-Elmer, Shelton, CT) unter Verwendung einer APCI-Quelle und der gleichen Guard- und Chromatographie-Säulen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Das chromatographische Verfahren war ein Acetonitril/Wasser-Gradient der linear von 30% auf 100% während eines 10-minütigen Zeitraums anstieg.
Beispiel 2
Produktion neuer Epothilon
Die Epothilon-PKS wurde genetisch verändert um erfindungsgemäße Stämme zu erzeugen, die neue Epothilone produzieren, die potentiell erhöhte Wasserlöslichkeit und/oder Wirksamkeit gegen Tumorzelllinien aufweisen können. Das erfindungsgemäße Oxigenierungs-Kontrollverfahren wurde auf einem durch Engineering hergestellten Myxococcus xanthus-Produktionsstamm (Stamm K165-79.7, EpoK⁺) angewandt, der genetisch hergestellt wurde, um ein neues Epothilon, 10,11-Didehydroepothilon B (2) herzustellen. Wenn sein Gegenstück, der Stamm K165-76.2 (EpoK^–) unter einer Oxigenierungsüberschuss-Bedingung kultiviert wurde, wurden die 10,11-Didehydroepothilone C und D (2) als einzige Produkte gefunden. Es wurde erwartet, dass das aktive EpoK-Enzym in Stamm K165-79.7 die Epoxidierung dieser 10,11-Didehydroepothilon D-Zwischenstufe zu 10,11-Didehydroepothilon B (6a) in Gegenwart eines Sauerstoffüberschusses katalysiert. Allerdings wurde diese Verbindung nicht nachgewiesen; stattdessen war ein neues Isomer (Epo506) das Hauptprodukt dieser Kultivierungen (6b). Die hoch auflösende Massenspektrometrie und die ein- und zweidimensionale NMR wurden zur Entwicklung der Struktur dieses Tetrahydrofuran-Produkts verwendet (siehe Beispiel 1).
Dieses beobachtete Ergebnis kann das Produkt eines Verfahrens sein, wobei das unter diesen Sauerstoffüberschuss-Bedingungen gebildete 10,11-Didehydroepothilon B anschließend zu Epo506 über eine vinyloge Payne-Umlagerung umgewandelt wird, wie in 6 zusammengefasst. Diese Reaktion wird auf Grund der Epoxid-Öffnung begünstigt, um eine relativ stabile allylische Carbocation-Zwischenstufe zu ergeben. Die Kultivierung des Stamms K165-79.7 sowohl unter abgereicherten und überschüssigen Oxigenierungsbedingungen führte zur Verschiebung des Congener-Verhältnisses zwischen 10,11-Didehydroepothilon D und Epo506 (7), was der Congener-Verschiebung zwischen den epoxidierten und nicht epoxidierten Epothilon-Verbindungen entsprach, die durch Kultivierung des Elternstamms, K111-32.25 unter diesen beiden gelösten Sauerstoff-Konzentrationen erhalten wurden (Tabelle 1).
Ein hoch auflösendes Massenspektrum von Epo506 wurde mit einem Mariner TOF-Spektralphotometer (Applied Biosystems, Foster City, CA) konfiguriert mit einer Turbo-Ionensprayquelle im positiven Ionenmodus erhalten. 1-D und 2-D NMR-Spektren von Epo506 wurden bei 300K mit einem DRX 400-Spektrometer (Bruker, Billerica, MA), ausgestattet mit einem QNP z-Achsen Gradienten Sondenkopf, aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen wurden als δ 7,26 und 77,0 für die ¹H- bzw. ¹³C-Spektren bezeichnet.

Die Molekülformel von Epo506 wurde als C₂₇H₃₉NO₆ durch HREIMS-Messung des [M+H]⁺-Peaks bei m/z 506,25887 (berechnet für C₂₇H₄₀NO₆S 506,25709) bestimmt, was den Einbau von einem Sauerstoffatom bezüglich 10,11-Didehydroepothilon D angab. Das ¹³C-Spektrum gab an, dass Epo506 eine Doppelbindung weniger als 10,11-Didehydroepothilon D besaß, was nahe legt, dass Epo506 einen zusätzlichen Ring enthält (HSQC-, HMBC-, COSY- und TOCSY-Daten erlaubten eine eindeutige Zuordnung der Kohlenstoff-Konnektivität. Die chemischen Verschiebungen bei den Kohlenstoffen 3, 7, 10 und 13 gaben an, dass alle vier dieser Kohlenstoffe an Sauerstoffatome gebunden waren. Zwei dieser oxigenierten Kohlenstoffe wurden als Teil eines zyklischen Ethers postuliert, der für die Molekülformel verantwortlich war. Die Hydroxylprotonen an Kohlenstoff 3 und 13 waren sowohl in 1-D- als auch 2-D-Spektren sichtbar, und ihre HMBC- und COSY-Korrelationen zu benachbarten Atomen bestätigten diese Zuordnungen. Darum muss der zyklische Ester die Kohlenstoffe 7 und 10 einschließen, was eine Tetrahydrofuran-Struktur anzeigt. Signifikante Na⁺- und K⁺-Addukte in dem Massenspektrum bestätigten auch, dass das bei 506,3 durch LC/MS festgestellte Ion tatsächlich das Molekülion ist und kein Fragment, das bei Ionisierung eines hypothetischen Elterndiols erzeugt wird. Tabelle 1. Epothilon-Congener-Verschiebungen in dem Stamm K111-40.1

Kultivierungsbedingungen (Stamm, Sauerstoff-Niveau)	Peak Epothilon B-Titer (mg/l)	Peak Epothilon-D-Titer (mg/l)	Gesamter (A–D) Epothilon-Titer (mg/l)	Epothilon B:A Congener-Verhältnis	Epothilon D:C Congener-Verhältnis
K111-32.25 (EpoK⁺) Sauerstoffüberschuss	48	3	60	5,8:1	3,6:1
K111-32.25 (EpoK⁺) Sauerstoff-Abreicherung	3	19	34	2,5;1	1,7:1
K111-40.1 (EpoK^–) Sauerstoffüberschuss	0	30	36	-	5,2:1

Beispiel 3
Modulierte Epothilon-Congener-Produktion in Sorangium cellulosum-Stamm Soce90 K111-150.17
Die Modulierung von gelöstem Sauerstoff während der Kultivierung von heterologen Wirtszellen hat gezeigt, dass die Polyketid-Congener-Verteilung verschoben wird. In diesem Beispiel wurde ein Epothilon-produzierender Stamm einer Sauerstoffspannung unterzogen, was bei Kultivierung unter Sauerstoff-Abreicherungs-Bedingungen zu einer Verschiebung der Epothilon-Congener-Verteilung führte. Sorangium cellulosum, Stamm Soce90 K111-150.17 ist eine Rifamycin-resistente Mutante, die sich von dem Elternstamm Soce90 durch UV-Mutagenese ableitet (B. Julien, unveröffentlichte Ergebnisse). Die Kultivierungsmethoden und analytischen Methoden, die bei diesem Beispiel eingesetzt wurden, wurden wie in Beispiel 1 vorstehend beschrieben, vorgenommen.
Sorangium cellulosum-Stamm Soce90 K111-150.17 ist ein Epothilon A- und B-Produzent, der ein aktives EpoK-Gen aufweist. 8a erläutert das Zellwachstum während der Zeit, das durch optische Dichte (OD) bei 600 nm unter drei verschiedenen gelösten Sauerstoff (DO)-Bedingungen gemessen wurde, und der Luftstrom wurde in lpm (Liter pro min) gemessen.
8b zeigt die Auswirkung der gelösten Sauerstoffmodulation auf die Epothilon-Produktverteilung. Der Sorangium cellulosum-Stamm Soce90 K111-150.17, ein Epothilon A- und B-Produzent, produziert die Epothilone C und D bei 0% abgereicherten gelösten Sauerstoffbedingungen. Tabelle 2 zeigt die beobachteten Epothilon-Titer, die durch den Stamm K111-150.17 unter verschiedenen Sauerstoffspannungsbedingungen produziert wurden. Die beobachtete Produktion von Epothilon D ist mehrfach höher unter 0% abgereichertem gelöstem Sauerstoff als bei 50% gelöstem Sauerstoffüberschuss für den Stamm K111-150.17. Tabelle 2. Epothilon-Congener-Verhältnisverschiebungen unter abgereichertem Sauerstoff in Stamm K111-150.17

DO konz. LPM v/v/m EpoA (mg/l) EpoB (mg/l) EpoC (mg/l) EpoD (mg/l)

50% 1 0,2 13,3 6,54 0 0,08

0% 0,4 0,2 3,87 2,06 0,66 0,35

0% 0,3 0,15 3,04 1,71 0,4 0,32
9 zeigt einen zeitlichen Verlauf der Epothilon A-, B-, C-, und D-Produktion durch den Stamm K111-150.17 bei drei verschiedenen gelösten Sauerstoffvorgaben, die höhere Epothilon D-Produktion unter den niedrigeren Sauerstoffspannungs-Bedingungen zeigen. HPLC-Chromatogramme aus den Fermentationen, die unter 50% gelöster Sauerstoffspannung und 0% gelöster Sauerstoffspannung durchgeführt wurden zeigen die fast ausschließliche Epothilon A- und B-Produktion bei 50% Sauerstoffspannung und die höheren Mengen an Epothilon C und D, die unter einer geringen Sauerstoffspannung produziert werden.
Die vorgenannten Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

Claims

Verfahren zur Modulierung des Polyketid-Congener-Verteilungsproduktionsverhältnisses in einer myxobakteriellen Wirtszelle, die ein aktives Sauerstoff-abhängiges tailoring-Enzym umfasst, wobei das Verfahren die Schritte der Kultivierung der Wirtszelle unter Sauerstoff-abgereicherter Kultivierung in Wachstumsmedium unter Bedingungen umfasst, die zur Produktion von Polyketiden führen, wobei das Produktionsverhältnis von Polyketid-Congenern von Epothilon A und B nach Epothilon C und D verschoben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Anreicherung des Wachstumsmediums mit Serin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Anreicherung des Wachstumsmediums mit Acetat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Anreicherung des Wachstumsmediums mit Propionat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle Myxococcus xanthus mit einer aktiven EpoK⁺ Monooxygenase ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle Sorangium cellulosum ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle Myxococcus xanthus, Stamm K111.32.25, Hinterlegungs-Nr. PTA-1700, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sauerstoff-abhängige tailoring-Enzym EpoK ist.