ES2291493T3 - Proceso de hidrolisis de las proteinas de la leche. - Google Patents
Proceso de hidrolisis de las proteinas de la leche. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición que comprende proteína de caseína hidrolizada y proteína del suero de la leche en una proporción de desde 9:1 a 1:1 en peso seco, la cual es un líquido claro a pH 4 cuando está disuelta o presente en agua en una cantidad de 40 g/litro a 10°C, teniendo una absorción óptica por debajo de 1.00 medida a 480 nanómetros y usando una celda de vidrio de 1 cm contra un sobrenadante de la misma composición a 10°C y pH4 que ha sido obtenido después de la centrifugación a 20.000 g durante 20 minutos.
Description
Proceso de hidrólisis de las proteínas de la
leche.
La presente invención se relaciona con
composiciones que comprenden caseína de la leche hidrolizada y
preferiblemente proteína del suero de la leche no hidrolizada y en
particular con nuevos procesos para la producción de hidrolizados
que comprenden caseína hidrolizada y preferiblemente proteína del
suero de la leche no hidrolizada. Como resultado, tales
hidrolizados pueden ser usados en la fabricación de bebidas tales
como bebidas para deportistas y bebidas no alcohólicas, productos
dietéticos, productos alimenticios varios y para la nutrición
infantil o productos fermentados.
La fracción de proteína de la leche bovina está
asociada con la salud. Las propiedades que promueven la salud
residen no solamente en los aspectos nutricionales de esta fracción
de proteína sino también en los diversos factores presentes que
promueven la salud. Las proteínas de la leche consisten de
aproximadamente 80% de caseína. La proteína remanente se explica
por una variedad de proteínas del suero de la leche. La fracción de
caseína es la fuente principal de amino ácidos, calcio y fosfato
todos requeridos para el crecimiento del animal joven. La fracción
de proteína del suero de la leche es también una fuente de amino
ácidos y en adición contiene muchas proteínas promotoras de la
salud bioactivas y putativas tales como inmunoglobulinas, proteína
de enlace folato, lactoferina, lactoperoxidasa y lisozima. Es
también conocido que al metabolizar la caseína y las fracciones de
la proteína del suero de la leche se forman un número de nuevos
péptidos bioactivos. Ejemplos de tales péptidos bioactivos
nuevamente formados incluyen casomorfinas, casoquininas,
inmunoglobulinas, inmunopéptidos, caseínafosfopéptidos, lactifinas
y lactoferricina. Por lo tanto, el uso de la caseína y de la
proteína del suero de la leche en la combinación en la cual las
mismas se encuentran de manera natural en la leche ofrecen
beneficios de salud y nutricionales significativos. Más
recientemente se encontró que los hidrolizados industrialmente
preparados de las proteínas de la leche contienen péptidos
bioactivos nuevamente formados y notablemente inhibidores de la ACE
para evitar la hipertensión.
La apariencia blanca de la leche es provocada
por la dispersión de la luz por los glóbulos grasos y los micelos
de caseína. La leche desnatada, es decir la leche a la que le ha
sido eliminada la grasa, es todavía blanca debido a los micelos de
caseína. La fracción de proteína del suero de la leche, es decir la
leche después de eliminar la grasa y la fracción de caseína, es una
solución de proteína clara pero amarillenta la cual es rica en
varias proteínas, péptidos, lactosa, minerales y vitaminas. Todos
estos constituyentes son completamente solubles incluso bajo
condiciones ácidas. Sin embargo la disolución de las proteínas del
suero de la leche puede producir soluciones turbias como resultado
de la desnaturalización parcial durante el secado por rociado. La
hidrólisis enzimática parcial puede mejorar las características de
la disolución de alguna de estas proteínas del suero de la leche
desnaturalizadas secadas por rociado. Una hidrólisis enzimática más
exhaustiva de las proteínas del suero de la leche mejora además su
solubilidad pero también conduce a un modesto incremento de la
amargura y de los niveles de amino ácidos libres presentes. El
objetivo usual de una hidrólisis enzimática más exhaustiva de las
proteínas del suero de la leche es lograr una reducción de la
alergenicidad y una tolerancia intestinal mejorada. Especialmente
el aspecto de la alergenicidad reducida es comercialmente
importante. Por ejemplo en diferentes países de Europa del Norte la
intolerancia a la leche de vaca ha sido diagnosticada en casi el 3%
de las población general de infantes en los primeros dos años de
vida. Las beta-lactoglobulinas pertenecen, junto
con la caseína a los mayores alergenos en la leche bovina. Los
adultos raramente muestran alergias a la leche bovina y los
productos especializados para este grupo pueden ser ajustados para
ser fácilmente asimilables, proporcionar un buen sabor y mostrar
buena estabilidad al almacenamiento, especialmente bajo condiciones
ácidas. Por lo tanto no es sorprendente que exista considerable
literatura con relación a la digestión enzimática exhaustiva de los
hidrolizados del suero de la leche dirigida a aplicaciones clínicas,
dietéticas y deportivas así como la nutrición infantil.
En contraste con el suero de la leche, la
caseína es rica en amino ácidos hidrofóbicos de manera que sus
hidrolizados son notoriamente amargos y tienden a tener mal sabor
rancio y caldoso. Debido a su extrema amargura las caseínas
enzimáticamente hidrolizadas encuentran solamente aplicación
limitada. Además su alto contenido de amino ácidos hidrofóbicos
hacen a los péptidos derivados de la caseína difíciles de disolver,
especialmente bajo condiciones ácidas.
Los procesos para la preparación de hidrolizados
parciales de la caseína descritos en la literatura generalmente
incluyen hidrólisis de múltiples pasos con un poco de endoproteasas
seguido de la incubación con una o más exoproteasas. Las
combinaciones de varias endoproteasas son comúnmente usadas para
obtener el alto Grado de Hidrólisis (alto DH) requerido para
minimizar las posibles reacciones alérgicas y mejorar la
solubilidad. La subsiguiente incubación con exoproteasas libera los
residuos de amino ácidos amino- o carboxi- terminales para
minimizar los sabores amargos. Sin embargo, la liberación de los
amino ácidos libres implica pérdidas en el rendimiento y una
disminución del valor nutricional. Debido a los altos niveles de
amino ácidos libres puede también resultar en mal sabor caldoso y
valores osmóticos incrementados del hidrolizado final, son práctica
común realizar pasos adicionales de procesamiento para eliminar los
amino ácidos libres, y los péptidos fuertemente hidrofóbicos que
explican el sabor amargo.
La solicitud de patente EP 0 610 411 describe
hidrolizados de caseína completamente solubles de buenas cualidades
organolépticas con péptidos de bajo peso molecular y un valor de DH
en el orden de magnitud de 15 a 35%.
La solicitud de patente WO 96/13174 describe un
método para la producción de un hidrolizado de proteína de leche
caracterizado por una reacción de hidrólisis que incluye cualquier
proteasa neutral o alcalina a partir del Bacillus en combinación
con un complejo de la enzima Asperigillus comprendiendo endo- y
exopeptidasas y un grado de hidrólisis entre 35% y 55%.
La solicitud de patente EP 334 303 describe un
método para la producción de un hidrolizado de proteína que muestra
baja amargura y un bajo valor de DH usando una aminopeptidasa.
La solicitud de patente EP 223 560 describe un
método para la producción de proteína de la leche por medio de una
hidrólisis de la enzima secuencial.
La solicitud de patente EP 0 631 731 describe
una hidrólisis parcial de una mezcla de proteína que comprende
caseína y proteína del suero de la leche donde el hidrolizado tiene
un grado de hidrólisis entre 4 y 10% y se obtiene un hidrolizado de
poca amargura usando una combinación de tripsina y
quimotripsina.
La Patente US 4,600,588 describe un hidrolizado
de la proteína de la leche que consiste de caseína precipitada con
ácido que ha sido tratada con una proteasa de hongo ácida a.o.
La solicitud de patente JP11243866 describe un
hidrolizado de caseína útil en bebidas y alimentos la cual es
insabora e inodora y tiene un grado de hidrólisis de 17 a 30%.
La Patente
US-A-5405756 se relaciona con un
producto alimenticio transparente soluble en ácido. La leche o la
leche desnatada son usadas como material de partida para producir un
producto de caseína fosfopeptidasa (CPP).
La solicitud de patente
EP-A-1062873 se relaciona con
hidrolizados de proteína de la leche que tienen un bajo grado de
hidrólisis y péptidos/proteínas relativamente de alto peso
molecular.
La solicitud de patente
WO-402045523 se relaciona con la producción de
hidrolizados usando una endoproteasa específica para la prolina.
Este documento es solamente publicado después de la fecha de
prioridad de la presente solicitud.
La presente invención proporciona una
composición de proteínas que comprende la proteína de caseína
hidrolizada y la proteína del suero de la leche en una proporción
de 9:1 a 1:1 en peso seco. Preferiblemente la proteína del suero de
la leche no está hidrolizada. La composición de proteínas es un
líquido claro a pH 4 cuando la proteína de caseína hidrolizada y la
proteína del suero de la leche están disueltas o presentes en agua
en una cantidad de 40 g de proteína (peso seco)/litros a 10ºC.
En caso de que la composición de proteína
comprenda menos de 40 g de proteína (peso seco)/litro, esta
composición es aún un líquido claro a 10 grados C cuando es
concentrada para un líquido de 40 g de proteína (peso
seco)/litro.
La presente invención también proporciona un
método de producción de una composición que comprende proteína de
caseína y proteína del suero de la leche, donde al menos la fracción
de caseína es hidrolizada.
La presente invención también proporciona un
producto que comprende una composición de la invención, por ejemplo
una bebida tal como una bebida para deportistas o bebida no
alcohólica o una bebida saludable o un alimento dietético tal como
un producto para personas ancianas o delgadas o una formula infantil
tal como un producto de seguimiento o de término. Además puede ser
un producto fermentado o puede ser incorporada en diferentes
productos de cuidado personal.
El producto de acuerdo a la invención
preferiblemente comprende proteína del suero de la leche y caseína
en una proporción como está presente en la leche bobina. Para tomar
ventaja de los péptidos bioactivos y de las proteínas presentes,
preferiblemente la hidrólisis enzimática de la proteína del suero de
la leche debe ser mínima. La hidrólisis enzimática de las caseínas
debe ser con mucho suficiente para garantizar un alto rendimiento
de la proteína en un producto claro bajo condiciones ácidas. Por lo
tanto la proteína de caseína es hidrolizada mediante una cantidad
suficiente de enzimas por un período de tiempo suficiente para
convertirse en una proteína casi completamente hidrolizada. Casi
completamente hidrolizada implica que solamente un por ciento bajo
del caseinato no es completamente soluble y puede provocar alguna
turbidez en el hidrolizado final. De manera similar la fracción del
suero de la leche puede contener algún material insoluble residual
tal como trazas de caseínas. Para eliminar este material insoluble
de la mezcla del hidrolizado de caseína y de suero de leche, tanto
una centrifugación a baja velocidad (por ejemplo a
2000-5000 g) o una simple sedimentación seguida por
la decantación proporciona pasos de procesamiento industrialmente
aceptables para obtener un producto claro. Debe ser entendido que
la leche de vaca regular no puede ser clarificada usando la
centrifugación a baja velocidad o el paso
sedimentación/decantación. Después del mezclado las proteínas de
caseína hidrolizadas con las proteínas del suero de la leche y
preferiblemente una centrifugación a baja velocidad, el producto
resultante produce un líquido claro a pH 4 cuando es disuelto o
presente en agua en una cantidad de 40 g de proteína (peso seco)
por litro. En general la hidrólisis tiene lugar a pH desde 3.5 a 9 y
a una temperatura desde 40 a 80ºC.
Preferiblemente el hidrolizado de proteína tiene
una proporción suero de la leche a caseína tal y como está presente
en la leche bobina, y es claro bajo condiciones ácidas.
Preferiblemente el hidrolizado tiene un sabor neutral o suave
mejorado y una buena estabilidad al almacenamiento.
Una composición líquida es "clara" si a
10ºC y pH 4 su absorción óptica medida a 480 nanómetros y usando una
celda de vidrio de 1cm está por debajo de 1.00, preferiblemente por
debajo de 0.50, si se mide contra un sobrenadante de la misma
composición a 10ºC y pH 4 que ha sido obtenido después de la
centrifugación a 20,000 g durante 20 minutos.
La presente invención proporciona una mezcla de
hidrolizados de proteínas de la leche, preferiblemente hidrolizado
de caseína y suero de la leche, en proporciones de caseína a suero
de la leche de 9:1 a 1:1 peso seco, preferiblemente en una
proporción como la que está presente en la leche bobina. Además la
presente invención proporciona un método de producción de tales
mezclas y bebidas nutricionales derivadas de las mismas. El
hidrolizado de proteína puede también ser usado en fórmulas
infantiles, alimentos dietéticos,
fármaco-nutrientes, helados, aderezos, productos
fermentados, yogures, y productos de cuidado personal. En general la
composición de acuerdo a la invención tiene una alergenicidad
fuertemente reducida comparada con la leche bobina. En general la
composición de acuerdo a la invención tiene un sabor neutral o
suave y una solubilidad mejorada y transparencia bajo condiciones
ácidas y puede ser usada como base para otras bebidas tales como
bebidas para deportistas o bebidas no alcohólicas o bebidas
saludables o productos fermentados. Por el término sabor suave se
entiende un nivel menos amargo que es similar o inferior a un nivel
de 5 mg/litro de sulfato de quinina disuelto en agua destilada y
degustado a una temperatura de 14ºC.
Para mejorar adicionalmente los beneficios para
la salud del producto de la presente invención, la composición de
la proteína puede ser combinada con concentrados de vitamina, frutas
o fracciones de frutas para elevar el contenido de vitaminas y
fibras del producto final e incluso fracciones de hidrolizado para
elevar el nivel de los péptidos bioactivos. Además el producto de
la invención puede ser fermentado con una variedad de cultivos
microbianos para mejorar el sabor, para mejorar los beneficios para
la salud o aumentar la viscosidad del producto final. Idealmente la
fermentación es llevada a cabo simultáneamente con la incubación de
la endoproteasa específica para la prolina a temperatura entre 40 y
50 grados C. Si el cultivo de partida usado genera una alta
viscosidad, entonces la fermentación es llevada a cabo mejor después
del paso de centrifugación a baja velocidad. A continuación de la
inoculación con un cultivo de partida apropiado o una combinación de
varios cultivos de partida, la mezcla completa es fermentada hasta
que el pH ácido requerido es alcanzado y entonces enfriado a
10-20 grados C. La base fermentada así producida
puede ser homogenizada o diluida con agua o jugo, enfriada hasta 4
grados C y llenada en los contenedores de venta al por menor
requeridos, es decir con o sin un paso de pasteurización o de
esterilización. Para ganar una amplia aceptación entre los
consumidores con necesidades no médicas, una impresión apetitosa
así como un cierto aspecto físico-químico tal como
la solubilidad bajo condiciones ácidas son de importancia capital.
Una apariencia clara y no blanca es de importancia extra así como
la ausencia de olores y de aromas tales como el diacetil los cuales
están usualmente asociados con los productos lácteos. Por lo tanto
la presente invención proporciona un método para producir un líquido
claro bajo condiciones ácidas con baja alergenicidad comparado con
la leche bobina y teniendo las propiedades de promover la salud y
el efecto nutricional de la leche, que puede ser usado en
aplicaciones alimenticias tales como bebidas, incluyendo bebidas
carbonatadas, productos fermentados y productos alimenticios.
El método de producción de hidrolizados de
acuerdo a la invención puede ser llevado a cabo usando leche
desnatada, polvos de leche desnatada, concentrados de proteínas de
la leche, mezclas de la proteína del suero de la leche y caseína en
proporciones preferidas o fracciones de proteína del suero de la
leche aisladas y fracciones de caseína aisladas que son luego
mezclados para obtener las proporciones preferidas, como materiales
de partida o pueden ser mezclados después que (parte de) las
fracciones son hidrolizadas o pueden ser mezcladas durante la
hidrólisis.
Las proteínas del suero de la leche pueden
extraerse del líquido del suero de la leche obtenido de la
fabricación del queso, preferiblemente un suero dulce de la leche
tal como aquel que resulta de la coagulación de la caseína por un
cuajo animal o microbiano que es adicionalmente purificado de las
caseínas contaminantes, por ejemplo por acidificación seguido de la
centrifugación. Preferiblemente las versiones no secadas por
rociado, concentradas de este producto del suero de la leche son
usadas. Opcionalmente los polvos de proteína del suero de la leche
comercialmente disponibles pueden ser usados tal como BiPRO (Davisco
Foods International), PROXIME 660 o HIPROTAL 875 o DOMOVICTUS 535
(BDI, Holanda) o más preferiblemente su equivalente no secado por
rociado. Opcionalmente el suero de la leche usado puede haber sido
sometido a enzimas no-proteolíticas tales como
lactasa para convertir la lactosa presente en la glucosa y
galactosa. Opcionalmente el material del suero de la leche puede
haber sido desmineralizado.
La presente invención preferiblemente considera
ninguna o solamente una muy limitada hidrólisis de la fracción de
la proteína del suero de la leche. Adicionalmente, la presente
invención considera un hidrolizado en el cual la fracción del suero
de la leche y la fracción de caseína son hidrolizadas como ocurriría
durante la hidrólisis de por ejemplo la leche desnatada o de los
polvos de leche desnatada. La leche desnatada es la leche que es
desgrasada y que contiene así preferiblemente menos de 1 g/litro de
grasa, preferiblemente menos de 0.8 g/litro de grasa. En el
producto de acuerdo a la invención el uso de leche desnatada o polvo
de leche desnatada como material de partida, la fracción del
péptido con un peso molecular por debajo de 1500 Daltons
típicamente representa más del 85% en peso de la proteína presente
en la composición de la invención mientras que la fracción del
péptido por debajo de 5000 Daltons típicamente representa más del
95% en peso de la proteína presente en la composición de la
invención. Por lo tanto, los productos de acuerdo a la invención
preferiblemente exhibirán una alergenicidad marcadamente reducida
comparado con la proteína de partida. La invención también
considera los hidrolizados con valores osmóticos disminuidos tal
como puede ser obtenido después de la nanofiltración, intercambio
iónico o electro diálisis.
La transparencia y la solubilidad en ácido de la
fracción de caseína pueden ser obtenidas hidrolizando
enzimáticamente los micelos de caseína para los péptidos más
pequeños. La fuente de caseína puede ser caseína rennet, caseína
ácida o caseinato de sodio, calcio o potasio. Para el proceso de
esta invención, las proteínas son diluidas o reconstituidas en una
solución que contiene desde 10 a 150 gramos de proteína por litro (1
- 15% p/p), preferiblemente desde 20 a 60 gramos de proteína por
litro.
El método de producir los hidrolizados es
indicado en las reivindicaciones anexas.
Para obtener hidrolizados parciales las
proteínas son primero sometidas a una endoproteasa con un pH óptimo
entre 4 y 10 y una preferencia por las proteínas de ruptura en el
lado carboxiterminal de los residuos de amino ácidos hidrofóbicos
voluminosos. Preferiblemente la endoproteasa está libre de
exoproteasa.
Endoproteasas preferidas con tales
características son subtilisina (EC3.4.24.4 o Pescalase suministrada
por DSM Food Specialities, Seclin, Francia o Alcalase suministrada
por NOVO, Bagsvaerd, Dinamarca), termolisin (EC3.4.24.4 o Thermoase
suministrada por Daiwa Kasei, Osaka, Japón), proteasa metalo neutral
(EC3.4.24.28 o Brewers Protease 2000 suministrada por DSM Food
Specialities, Seclin, Francia o Neutrasa suministrada por NOVO) o
quimotripsina (EC3.4.21.1). Otra endoproteasa preferida es una
endoproteasa específica para la prolina. Una endoproteasa
específica para la prolina puede implicar una ruptura preferencial
tanto en el lado aminoterminal como el carboxiterminal de la
prolina. Las endoproteasas capaces de romper en el lado
aminoterminal de la prolina son conocidas (Nature, Vol 391, 15
Enero 15, pp301-304, 1998): Endoproteasas con una
preferencia por la ruptura en el terminal carboxilo de la prolina
son también conocidos (EC3.4.21.26). El último tipo de endoproteasa
específica para la prolina es preferiblemente obtenido a partir de
cepas recombinantes superproductoras de grado comestible tales como
Aspergillus. Un ejemplo de un productor apropiado de esta
enzima ha sido descrito en la Solicitud de patente de EP
co-pendiente número PCT/EP01/14480. Ya que esta
endoproteasa específica para la prolina puede solamente hidrolizar
los enlaces peptídicos incluyendo los residuos de prolina, esta
enzima es ventajosamente combinada con una de las endoproteasas
preferidas para hidrolizar la proteína combinada del suero de la
leche y la caseína o las fracciones aisladas. Una ventaja importante
de usar una endoproteasa específica para la prolina es que la misma
es capaz de romper los epítopos alergénicos mayores en caseínas y
proteínas del suero de la leche. Por ejemplo, la caseína es muy rica
en residuos de prolina y así puede ser frecuentemente cortada por
la endoproteasa específica para la prolina. Los tres epítopos
alergénicos mayores de la beta-lactoglobulina
(fragmentos 41-60, 102-124 y
149-162; Clinical and Experimerital Allergy, 1999,
Vol 29, pp1055-1063) todos contienen un residuo de
prolina central de manera que la incubación con la endoproteasa es
probable para reducir el reconocimiento por el IgE humano relevante
minimizando la alergenicidad del producto final. Una realización
preferida del proceso de acuerdo a la invención es que la fracción
de caseína o ambas, la fracción del suero de la leche y la fracción
de caseína, son sometidas a hidrólisis incluyendo dicha combinación
de enzimas.
Otra realización preferida del proceso de
acuerdo a la invención es que la hidrólisis enzimática de la
fracción del suero de la leche, la fracción de caseína o la
fracción de proteína, como están presentes en la leche entera, es
hidrolizada con el uso de endoproteasas solamente es decir, sin el
uso de ninguna exoproteasa.
La hidrólisis puede ser llevada a cabo bajo
condiciones de pH constante o de pH no controlado. Preferiblemente
la hidrólisis es llevada a cabo en dos pasos, en primer lugar las
proteínas son incubadas bajo condiciones alcalinas o neutrales con
una endoproteasa con una preferencia por las proteínas de ruptura en
el lado carboxiterminal de los residuos amino ácidos, hidrofóbicos
voluminosos. Durante esta hidrólisis el pH cae a valores ácidos (es
decir por debajo de pH 7) y solamente entonces la segunda
endoproteasa es adicionada, preferiblemente una endoproteasa
específica para la prolina, más preferiblemente una endoproteasa
específica para la prolina obtenida a partir de
Aspergillus.
La cantidad de enzima requerida para lograr este
grado de hidrólisis deseado depende de la enzima usada. Sin
embargo, la dosificación de la enzima y las condiciones de
incubación son optimizadas de tal manera que la mayor parte de la
fracción de proteína caseína es disuelta en la fase acuosa de la
reacción después de períodos de incubación de típicamente 6 a 20
horas. Por la mayor parte se entiende que bajo pH 4, menos del 20%,
preferiblemente menos del 10%, más preferiblemente menos del 5% de
la proteína presente en la fracción de caseína puede ser
precipitada por centrifugación durante 10 minutos a 2000 g.
Una eliminación de la amargura adicional del
hidrolizado resultante de la incubación con las endoproteasas puede
ser beneficioso. La eliminación de la amargura adicional es
preferiblemente llevada a cabo por incubación simultánea o
subsiguiente con una preparación de exoproteasa que está
preferiblemente libre de actividad endoproteolítica. Si la
incubación es llevada a cabo subsiguientemente a la incubación con
la endoproteasa, puede ser necesario el ajuste de pH con ácido
clorhídrico; la inactivación de la endoproteasa no es usualmente
requerida. La eliminación de la amargura puede también ser llevada
a cabo bajo condiciones ligeramente ácidas o neutrales con una
aminopeptidasa apropiada que exhibe una preferencia por eliminar
los residuos de amino ácidos hidrofóbicos amino terminales tales
como por ejemplo Accellerzyme (DSM Food Specialities; Delft,
Holanda) o Corrolase LAP (Röhm Darmstadt, Germany) o APII del
Bacilos estearotermófilo y aislado como es descrito por Stoll y
otros (BBA 438(1976) 212-220).
Alternativamente la eliminación de la amargura puede ser llevada a
cabo bajo condiciones ligeramente ácidas con una carboxipeptidasa
apropiada la cual exhibe preferencia por eliminar los residuos de
amino ácidos hidrofóbicos carboxiterminales tales como CPDI (PepG)
de Aspergillus (Dal Degan y otros, Appl. Environ Microbial,
58(7)2144-2152). Opcionalmente una
combinación de los dos tipos de endoproteasas puede ser usada bajo
condiciones ligeramente ácidas. Las temperaturas de incubación
preferidas para las endoproteasas así como para las exoproteasas
son 40ºC o mayores, preferiblemente 50ºC a 80ºC.
Independientemente de las condiciones de la
hidrólisis, el hidrolizado final es preferiblemente sometido a un
paso adicional de inactivación de la enzima. El paso adicional de
inactivación de la enzima puede ser un tratamiento con calor el
cual comprende calentar a una temperatura de al menos 85ºC durante
al menos 10 minutos. Si se usan temperaturas más altas o valores de
pH extremos, períodos más cortos pueden ser factibles. Tal
tratamiento con calor es preferiblemente llevado a cabo a un valor
de pH ácido, preferiblemente entre 3 y 7. Para eliminar cualquier
material no solubilizado del producto final, la decantación o
centrifugación a baja velocidad a por ejemplo
2000-4000 g como pueden ser llevadas a cabo a escala
industrial es preferida. Opcionalmente el hidrolizado puede ser
filtrado usando un ultra-filtro, un microfiltro,
tierra diatomácea, filtros de fibra de vidrio o usando filtración
de flujo cruzado. La inactivación completa de la enzima puede ser
confirmada por una prueba de gelatina coloreada. Opcionalmente el
hidrolizado final filtrado puede ser tratado con carbón activado o
con nanofiltración, intercambio iónico o electro diálisis para
eliminar el exceso de sales. El hidrolizado filtrado puede ser
pasteurizado o esterilizado y, si es requerido, concentrado
adicionalmente por técnicas de secado tales como la evaporación,
nanofiltración, secado por rociado, secado en lecho fluidizado o
una combinación de las mismas. Preferiblemente el producto obtenido
está en forma granular.
Ventajosamente la proporción de caseína y de
proteína del suero de la leche está sustancialmente presente como
en la leche bobina. La proteína del suero de la leche es
preferiblemente proteína no-hidrolizada.
Ventajosamente la caseína o la proteína del
suero de la leche o una combinación de los dos son hidrolizadas
usando endoproteasas solamente es decir sin el uso de una
exoproteasa.
Preferiblemente la mezcla de proteína final
comprende desde 10 a 50% de la proteína del suero de la leche y
desde 90 a 50% de caseína. Más preferiblemente la mezcla de proteína
comprende desde 20 a 40% de la proteína del suero de la leche y
desde 80 a 60% de caseína. Los porcentajes de la caseína y la
proteína del suero de la leche son ambos expresados en base a peso
seco.
En una realización preferida de la invención el
caseinato es hidrolizado con una endoproteasa preferida y luego
sometido a la incubación con una endoproteasa específica para la
prolina. Como tal o preferiblemente después de la centrifugación,
el hidrolizado de caseína es concentrado y secado. El producto
secado puede ser re-disuelto en suero de leche no
hidrolizado para obtener una concentración de proteína y una
proporción de proteína deseada luego, si es requerido, centrifugado
o filtrado y pasteurizado o esterilizado para obtener el producto
de acuerdo a la invención. Alternativamente el hidrolizado de
caseína concentrado es mezclado con la proteína del suero de la
lecho no hidrolizada concentrada, para alcanzar la concentración de
proteína y la proporción de proteína deseadas y luego opcionalmente
centrifugado o filtrado y opcionalmente pasteurizado o esterilizado
para obtener el producto de acuerdo a la invención.
Obviamente el producto puede ser sometido a
tratamientos adicionales de la enzima tales como lactasas o
fermentado con diferentes tipos de cultivos de partida combinados
con todo tipo de ingredientes tales como concentrados de frutas,
sabores, colorantes, alcohol, dióxido de carbono, espesantes,
acidulantes, antioxidantes, hierbas o extractos de hierbas,
compuestos promotores de la salud como vitaminas o
pro-vitaminas o péptidos bioactivos o carbohidratos
o amino ácidos para formular un producto el cual está en línea con
las necesidades del mercado.
En una aplicación final en la cual el valor de
pH es en general mayor que 3, preferiblemente mayor que 3.5 y la
concentración de proteína total es menor que 5% p/p preferiblemente
menor que 3,6% p/p, la absorción óptica de la solución
(comprendiendo 40 g/l de proteína) medido a una longitud de onda de
480 nm es menor que 1.000, preferiblemente menor que 0,50 medido
contra el sobrenadante de la solución, que ha sido obtenido después
de una centrifugación a 20,000 g durante 20 minutos, usando una
celda de vidrio de 1 cm a 10ºC y pH 4.
Ejemplo
1
La incubación de 1 gramo de termosilin por kg de
un polvo de caseinato de sodio, en una solución/suspensión
conteniendo 60 gramos de caseinato de sodio (Miprodan 30
suministrado por MD Foods, Viby, Dinamarca) por litro a pH 6.7 bajo
condiciones de pH constante después de 3 horas resultó en una
solución clarificada, casi sin precipitado.
Después del ajuste del pH a 5.0, la enzima fue
inactivada a 95ºC durante 45 minutos.
El líquido fue enfriado y degustado dando un
sabor muy amargo. El pH fue ajustado a 6,0 y 3 unidades de
endoproteasa específica para la prolina de A. niger fueron
adicionados a 25 ml de este hidrolizado de caseinato. Una unidad de
actividad de la endoproteasa específica para la prolina de A.
Niger es definida como la cantidad de enzima requerida para
liberar 1 \mumol de pNA por minuto de
N-carbobenzoxi-glicina-pralina-p
NitroAnilida
(z-Gly-Pro-pNA(Bachem,
Suiza) a pH 5 y 37ºC. La liberación de pNA es medida por absorción
óptica a 410 nm. Después de la incubación a 50ºC durante toda la
noche, el pH fue nuevamente ajustado a 5,0 y fue llevado a cabo
otro paso de inactivación de la enzima (30 minutos a 90ºC). Después
del enfriamiento a temperatura ambiente, el hidrolizado de
caseinato fue completamente disuelto y claro.
El sabor demostró la ausencia de cualquier
amargura.
La HPLC usando un espectrómetro de masa de
trampa de iones (Themoquest, Breda, Holanda) acoplado a una bomba
P4000 (Themoquest, Breda, Holanda) fue usado para caracterizar una
distribución de peso molecular de los péptidos de caseína como los
producidos por la incubación de la enzima. Los péptidos formados
fueron separados usando una columna PEPMAP C18 300A
(MIC15-03-C18-PM, LC
Packings, Amsterdam, Holanda) en combinación con un gradiente de
0.1% de ácido fórmico en agua Milli Q (Millipore, Bedford, MA, USA;
Solución A) y 0.1% de ácido fórmico en acetonitrilo (Solución B)
para elusión. El gradiente comenzó a 100% de la solución A y aumentó
hasta 70% de la solución B en 45 minutos y fue mantenida en la
última proporción durante otros 5 minutos. El volumen de inyección
de 50 \mul fue usado, el régimen de flujo fue 50 \mul por minuto
y la temperatura de la columna fue mantenida a 30ºC. La
concentración de proteína de la muestra inyectada fue aprox. 50
\mug/ml. De acuerdo a la información obtenida, la mayoría de los
péptidos de caseína tuvieron pesos moleculares que oscilaban desde
300 a 1200 D.
Ejemplo
2
Una bebida similar a la leche no amarga, clara,
obtenida mezclando ampliamente el hidrolizado de caseinato con
suero de leche dulce no hidrolizado.
A 200 mL de una solución de caseinato de sodio
(Miprodan 30 suministrado por MD Foods Viby, Dinamarca), conteniendo
60 gramos por litros, fueron adicionados 300 mg de Thermoase (una
metalo endoproteasa estable al calor a partir del Bacillus
Thermoproteolyticus Rokko con una actividad de 14 000 PU/ mg
producido por Daiwa Kasei, Osaka, Japón). Durante la incubación a
pH 6.7 y 75ºC ocurrió la floculación inmediata y la precipitación de
la proteína caseinacea. Una incubación adicional durante tres horas
bajo condiciones de pH constante resultó en una solución
clarificada, casi sin precipitado. El pH de la solución fue ajustado
a pH 6.0 y la Thermoase inactivada por calentamiento durante 45 mm
a 95ºC. Después del enfriamiento, la solución fue degustada y se
encontró muy amarga. Después del ajuste del pH a pH 6.0, 3 unidades
de endoproteasa específica para la prolina (medida usando
Z-Gly-Pro-pNA a pH 5
y 37ºC) a partir de A. niger fueron adicionadas a 25 ml del
hidrolizado. Después de la incubación durante 20 horas a 50ºC, otro
ciclo de inactivación de la enzima fue llevado a cabo calentando la
solución durante 30 minutos a 90ºC. Después del enfriamiento a
temperatura ambiente y del ajuste del valor del pH a 4.0, se
encontró que el hidrolizado de caseína era completamente disuelto y
claro es decir mostrando una absorción óptica de 0.24 determinada
espectro-fotométricamente a 480 nm en una celda de a
1 cm contra agua. El sabor demostró la ausencia de cualquier
amargura o mal sabor.
Mezclando esta solución de caseína concentrada
dos veces con la misma cantidad de suero de leche dulce doblemente
concentrado fresco, el cual había sido liberado de la proteína de
caseína contaminante por acidificación a pH 4.0 seguido por
centrifugación a baja velocidad, finalmente produjo una bebida
similar a la leche no amarga, clara.
Ejemplo
3
Una solución no amarga, clara, de las proteínas
del suero de la leche hidrolizada obtenida por hidrólisis del suero
de leche dulce.
El suero de leche dulce fue liberado de la
proteína caseinacea por acidificación de la solución a pH 4. Después
de la centrifugación el sobrenadante claro fue decantado. El pH de
la fracción del suero de la leche fue ajustado a pH 6.8. A 200 ml
de esta solución 200 mg de Thermoase (una metalo endoproteasa
estable al calor a partir del Bacillus Thermoproteolyticus
Rokko con una actividad de 14 000 PU/ mg producido por Daiwa
Kasei, Osaka, Japón) fueron adicionados. Durante la incubación a pH
6.7 y 75ºC ocurrió una ligera floculación y precipitación de la
proteína. Una incubación adicional durante tres horas bajo
condiciones de pH constante resultó en una solución clarificada,
conteniendo aún algún precipitado. El pH de la solución fue ajustado
a pH 5.0 y la Thermoase inactivada por calentamiento durante 45 min
a 95ºC. Después del enfriamiento, la solución fue saboreada y se
observó que era ligeramente amarga. Después de otro ajuste del pH a
pH 6.0, 3 unidades de endoproteasa específica para la prolina
(medida usando
Z-Gly-Pro-pNA a pH 6
y 37 grados C) de A. niger fueron adicionadas a 25 ml del
hidrolizado. Después de la incubación durante 20 horas a 50ºC, otro
ciclo de inactivación de la enzima fue llevado a cabo calentando la
solución durante 30 minutos a 90ºC. Después del enfriamiento a
temperatura ambiente y del ajuste del valor de pH a 4.0, se
encontró que la proteína del suero de la leche hidrolizada estaba
completamente disuelta y clara es decir mostrando una absorción
óptica de 0.35 determinado espectro-fotométricamente
a 480 nm en una celda de 1 cm contra agua. El sabor demostró la
ausencia de cualquier amargura o mal sabor.
Ejemplo
4
Una solución basada en la proteína de la leche,
no amarga, clara, obtenida por hidrólisis de la leche desnatada sin
el uso de exoproteasas.
\newpage
A 200 ml de una leche desnatada comercialmente
disponible fueron adicionados 300 mg de Thermoase (una metalo
endoproteasa estable al calor a partir del Bacillus
Thermoproteolyticus Rokko con una actividad de 14 000 PU/ mg
producido por Daiwa Kasei, Osaka, Japón). Durante la incubación a pH
6.7 y 75ºC ocurrió la floculación inmediata y la precipitación de
la proteína. Una incubación adicional durante tres horas bajo
condiciones de pH constante resultó en una solución clarificada,
casi sin precipitado. El pH de la solución fue ajustado a pH 5.0 y
la Thermoase fue inactivada por calentamiento durante 45 min a 95ºC.
Después del enfriamiento, la solución fue saboreada y se observó
que era muy amarga. Después de otro ajuste de pH a pH 6.0, fueron
adicionadas 3 unidades de endoproteasa específica para la prolina
(medida usando
Z-Gly-Pro-pNA a pH 5
y 37 grados C) a partir de A. niger a 25 mililitros del
hidrolizado. Después de la incubación durante 20 horas a 50ºC, otro
ciclo de inactivación de la enzima fue llevado a cabo calentando la
solución durante 30 minutos a 90ºC. Después del enfriamiento a
temperatura ambiente y del ajuste del valor del pH a 4.0, se
encontró que el hidrolizado de caseinato era completamente disuelto
y claro es decir mostrando una absorción óptica de menos de 0.900
determinada espectro-fotométricamente a 480 nm en
una celda de a 1 cm contra agua. El sabor demostró la ausencia de
cualquier amargura o mal sabor.
Ejemplo
5
Un líquido no amargo, estable al ácido, claro,
con una composición similar a la leche obtenida mezclando el
hidrolizado de caseinato de sodio con varias preparaciones de suero
de leche no hidrolizado.
El pH de una solución 6% (en peso) de caseinato
de sodio (90% proteína obtenido de DMV International, Holanda) fue
ajustado a 8.0 después de lo cual 40 microlitros de Delvolasa
(Delvolase®, 560 000 DU por gramo obtenido de DSM Food
Specialities, Seclin, Francia) fueron adicionados por gramo de
caseína. Luego la mezcla fue incubada a 60 grados C con agitación
constante durante otros 150 o 210 minutos a un pH no controlado o
mantenido constante en 8.0. Después de la incubación, la reacción
de hidrólisis fue detenida disminuyendo el pH a 5.0 usando ácido
láctico seguido por un impacto de calor de 10 minutos a 90 grados C.
Luego la temperatura fue disminuida a 50 grados C y fue adicionada
la endoproteasa específica para la prolina a partir de A.
niger (ver WO 02/45523). Por gramo de caseína 250 microlitros
de una solución de enzimas conteniendo 8 unidades por mililitro (es
decir 2 unidades/gramos de caseinato, medido como se describió en
el Ejemplo 1) fueron adicionados e incubados por 240, 480 o 960
minutos. Finalmente un impacto adicional de calor de 10 minutos a 95
grados C fue aplicado después de lo cual las muestras fueron
diluidas con agua destilada para alcanzar una concentración de
caseinato de 3%, enfriado hasta 14 grados C y luego ofrecidas a un
panel de degustación especializado entrenado para cuantificar los
malos sabores amargos en los productos lácteos. Después de la
degustación, todos los miembros del panel coincidieron que todas
las muestras obtenidas a partir de las diferentes incubaciones de la
Delvolasa y su subsiguiente incubación por 480 o 960 minutos con la
endoproteasa específica para la prolina no eran amargas. Las
muestras obtenidas después de la incubación con solo Delvolasa
fueron consideradas extremadamente amargas, las muestras obtenidas
con Delvolasa y una incubación de 240 minutos con la endoproteasa
específica para la prolina fueron calificadas ligeramente
amargas.
El grado de hidrólisis usando el método OPA
descrito por Nielsen, P.M. y otros (Journal of Food Science, Vol 66
No 5,PP 642-646, 2001) medido después de las
incubaciones con Delvolasa fue alrededor de 12%; después de la
incubación con la endoproteasa específica para la prolina los
valores de DH aumentaron a valores entre 16 y 20%.
Para preparar un producto con una composición la
cual es esencialmente la misma que la leche bobina, los diferentes
hidrolizados de caseína no amargos, doblemente concentrados (es
decir 6 gramos/litros) producidos usando el protocolo antes
mencionado fueron mezclados con un volumen igual de proteínas del
suero de la leche, no hidrolizado, doblemente concentradas (es
decir 1.3 gramos/litros). Primero diferentes soluciones de la
proteína del suero de la leche fueron preparadas usando productos
comerciales y no comerciales. Entre los diferentes productos del
suero de leche degustados, BiPRO (Davisco Foods International),
PROXIME 660 o HiPROTAL 875 o DOMOVICTUS 535 (DBI, Holanda) todos
produjeron productos suaves al gusto y relativamente claros. El
suero de queso fresco produjo un producto amarillento turbio con un
fuerte aroma lácteo. Entre las combinaciones hechas con estos
diferentes productos del suero y los diferentes hidrolizados de
caseína, especialmente la combinación con una versión no
pasteurizada (no comercial) de PROXIM 660 probó ser particularmente
interesante debido a su sabor atractivo y la pérdida de la turbidez
o mal olor.
A pesar del hecho que las mezclas similares a la
leche así preparadas fueron casi transparentes, una centrifugación
a baja velocidad de 10 minutos a 2000 g o una simple sedimentación
durante unas pocas horas seguido de la decantación resultaron en
productos completamente claros. Los productos centrifugados
típicamente resultaron en una absorción óptica por debajo de 0.90
determinado espectro-fotométricamente a 480 nm en
una celda de 1 cm contra agua. Lo más importante los últimos pasos
del proceso resultaron en pérdidas de proteína que fueron
típicamente menores de 10% de la fracción disuelta. Las soluciones
claras así preparadas también permanecieron claras aún con la
acidificación a valores de pH tan bajos como 4.0 y 2.8.
Ejemplo
6
Un protocolo de hidrólisis simplificada para
convertir la leche desnatada en un producto final claro, suave al
gusto y estable al ácido.
Leche desnatada comercialmente disponible
(Friesche Vlag, Holanda) con una concentración de 39 gramos/litro
de proteínas, 51 gramos/litro de carbohidratos, 0.5 gramos/litro de
grasa y un pH final de 6.5 fue equilibrada en un baño de agua a 60
grados C después de lo cual 40 microlitros de Delvolasa (ver Ejemplo
5) fueron adicionados por gramos de caseína (la leche desnatada
usada contiene 30 gramos de caseína/litro). La mezcla fue incubada
con agitación constante sin ajustes de pH. Después de 150 minutos de
incubación, el pH fue disminuido a 5.0 usando ácido láctico y la
solución fue dividida en dos porciones. Una porción fue calentada
durante 10 minutos a 90 grados C para inactivar la subtilisina
mientras que la otra porción fue mantenida a 60 grados C durante 10
minutos adicionales. Entonces ambas porciones fueron transferidas a
un baño de agua de 50 grados C y después del equilibrio fue
adicionada la endoproteasa específica para la prolina a los dos
frascos para alcanzar concentraciones de 250 microlitros de enzima
(es decir 2 unidades; ver ejemplo 5) por gramo de caseína presente.
Después de un período de incubación adicional de 960 minutos a 50
grados C, ambas porciones fueron sometidas a un impacto con calor
de 10 minutos a 95 grados C.
Luego los valores de DH fueron determinados
usando el protocolo subrayado en el Ejemplo 5. Después de la
incubación de la Delvolasa, el DH fue 20%. Después de la incubación
con la endoproteasa específica para la prolina la muestra sometida
a un impacto de calor para inactivar la Delvolasa tuvo un valor de
DH de 26% mientras que la otra muestra mostró un DH of 30%. La
degustación de las dos soluciones finales fue llevada a cabo otra
vez a 14 grados C y por el mismo panel entrenado mencionado en el
Ejemplo 5. De acuerdo a la conclusión de del panel de degustación,
ambas soluciones fueron igualmente no amargas.
Nuevamente, la centrifugación a baja velocidad
de las dos preparaciones produjo una solución clara que permaneció
clara con la acidificación adicional a pH 4. El análisis del tamaño
del péptido fue llevado a cabo por cromatografía en una columna
Superdex Peptido HR 1030. La información obtenida mostró que en el
material preparado con inactivación de la Delvolasa, la fracción
conteniendo los péptidos menores de 1500 Daltons representaron 94%
en peso de la proteína presente en la solución mientras que la
fracción conteniendo péptidos menores de 5000 Daltons representaron
99% en peso de la proteína presente en la solución. En el material
preparado sin inactivación de la Delvolasa, la fracción conteniendo
péptidos menores de 1600 Daltons representaron 87% en peso y la
fracción conteniendo péptidos menores de 5000 Daltons también 99%
en peso de todas las proteínas presentes.
En conclusión los resultados mostrados en el
presente Ejemplo demostraron que la leche desnatada así como las
caseínas pueden ser efectivamente hidrolizadas a hidrolizados
claros, no amargos, usando un protocolo de hidrólisis simplificado.
La gran proporción de pequeños péptidos presentes sugiere una
alerginicidad fuertemente reducida del hidrolizado de leche
desnatada resultante en comparación con la leche desnatada
regular.
Claims (17)
-
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1. Una composición que comprende proteína de caseína hidrolizada y proteína del suero de la leche en una proporción de desde 9:1 a 1:1 en peso seco, la cual es un líquido claro a pH 4 cuando está disuelta o presente en agua en una cantidad de 40 g/litro a 10ºC, teniendo una absorción óptica por debajo de 1.00 medida a 480 nanómetros y usando una celda de vidrio de 1 cm contra un sobrenadante de la misma composición a 10ºC y pH 4 que ha sido obtenido después de la centrifugación a 20.000 g durante 20 minutos. - 2. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 donde la fracción de proteína del suero de la leche no es hidrolizada.
- 3. Una composición de acuerdo a las reivindicaciones 1 o 2 teniendo una alergenicidad reducida comparada con la composición de la proteína antes de la hidrólisis.
- 4. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la fracción del péptido de la proteína hidrolizada que tiene un peso molecular por debajo de 5000 Daltons es más de 95% en peso de la proteína presente en el hidrolizado de proteína y donde la fracción del péptido de la proteína hidrolizada que tiene un peso molecular por debajo de 1500 Daltons es más de 85% en peso de la proteína presente en el hidrolizado de proteína.
- 5. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la leche desnatada es usada como fuente de proteína.
- 6. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 la cual contiene desde 10 a 150 g de proteína total en peso seco por 1000 g de la composición.
- 7. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 la cual contiene menos de 10% p/p, preferiblemente menos de 5% p/p de agua.
- 8. Un comestible, preferiblemente una bebida, que comprende una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
- 9. Una bebida de acuerdo a la reivindicación 8, la cual es una bebida para deportistas o una bebida no alcohólica o una bebida saludable.
- 10. Un método de producción de una composición que comprende proteína de caseína hidrolizada y proteína del suero de la leche la cual comprende hidrolizar enzimáticamente al menos la proteína de caseína para resultar en una composición que es un líquido claro a pH 4 cuando está disuelta o presente en agua en una cantidad de 40 g/litros a 10ºC teniendo una absorción óptica por debajo de 1.00 medida a 480 nanómetros y usando una celda de vidrio de 1 cm contra un sobrenadante de la misma composición a 10ºC y pH 4 que ha sido obtenido después de la centrifugación a 20,000 g durante 20 minutos, donde la fracción de proteína del suero de la leche y de caseína están presentes en una proporción de desde 9:1 a 1:1 peso seco donde primero una hidrólisis es llevada a cabo por una endoproteasa con un pH óptimo entre 4 y 10 para romper las proteínas en el lado carboxi terminal de los de los residuos de amino ácidos hidrofóbicos, voluminosos y subsiguientemente una hidrólisis mediante una endoproteasa específica para la prolina es llevada a cabo seguida por un paso de inactivación de la enzima.
- 11. Un método de acuerdo a la reivindicación 10 donde la fracción del suero de leche y la fracción de caseína son hidrolizadas.
- 12. A método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde simultáneamente o subsiguientemente a la hidrólisis con endoproteasa, es adicionada exoproteasa.
- 13. A método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 donde la composición es adicionalmente fermentada con una variedad de cultivos microbianos para mejorar el sabor, para mejorar los beneficios a la salud o para aumentar la viscosidad del producto final.
- 14. Uso de la composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en alimentos o comestibles.
- 15. Uso de acuerdo a la reivindicación 14 en alimentos o comestibles para obtener una alergenicidad reducida o bioactividad aumentada de la proteína en el alimento o comestible comparada con la proteína no hidrolizada.
- 16. Uso de acuerdo a la reivindicación 14 en fórmulas infantiles, alimentos dietéticos, fármaco-nutrientes, helados, aderezos, productos fermentados, yogures o productos de cuidado personal.
- 17. Uso de una endoproteasa específica para la prolina para hidrolizar la proteína de caseína para producir caseína hidrolizada la cual da un líquido claro a pH 4 cuando está disuelta o presente en agua en una cantidad de 40 g/litros a 10ºC, teniendo una absorción óptica por debajo de 1.00 medida a 480 nanómetros y usando una celda de vidrio de 1 cm contra un sobrenadante de la misma composición a 10ºC y pH 4 que ha sido obtenido después de la centrifugación a 20,000 g durante 20 minutos.
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