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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die hydrolysiertes
Milchcasein und vorzugsweise nicht-hydrolysiertes Molkeprotein enthalten,
und insbesondere neue Verfahren zur Herstellung von Hydrolysaten,
die hydrolysiertes Casein und vorzugsweise nicht-hydrolysiertes Molkeprotein enthalten.
Infolgedessen können
solche Hydrolysate zur Herstellung von Getränken, wie Sportgetränken und
Softdrinks, Diätprodukten,
Säuglingsnahrung oder
verschiedenen Nahrungsprodukten oder fermentierten Produkten verwendet
werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Proteinfraktion von Kuhmilch steht mit der Gesundheit in Zusammenhang.
Die gesundheitsfördernden
Eigenschaften liegen nicht nur in den Ernährungsaspekten dieser Proteinfraktion,
sondern auch in verschiedenen vorhandenen gesundheitsfördernden
Faktoren.
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Milchproteine
bestehen aus etwa 80% Caseinen. Eine Vielzahl an Molkeproteinen
macht das restliche Protein aus. Die Caseinfraktion ist die Hauptquelle
für Aminosäuren, Calcium
und Phosphat, die sämtlich
für das
Wachstum des Jungtiers erforderlich sind. Die Molkeproteinfraktion
ist ebenfalls eine Quelle für
Aminosäuren
und enthält
zusätzlich mehrere
biologisch aktive und vermutlich gesundheitsfördernde Proteine, wie Immunglobuline,
Folatbindungsprotein, Lactoferrin, Lactoperoxidase und Lysozym.
Es ist ebenfalls bekannt, dass nach Verstoffwechselung der Casein-
und Molkeproteinfraktionen eine Reihe neuer biologisch aktiver Peptide
gebildet wird. Beispiele für
solche neu gebildeten biologisch aktiven Peptide sind u.a. Casomorphine,
Casokinine, Immunglobuline, Immunpeptide, Caseinphosphopeptide,
Lactiphine und Lactoferrin. Daher bietet die Verwendung von Casein
und Molkeproteinen in der Kombination, in der sie in Milch vorkommen,
signifikante Ernährungs-
und Gesundheitsvorteile.
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Vor
Kurzem wurde gefunden, dass industriell hergestellte Hydrolysate
von Milchproteinen ebenfalls neu gebildete biologisch aktive Peptide
und insbesondere ACE-Inhibitoren zur Bekämpfung von Hypertonie enthalten.
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Das
weiße
Aussehen von Milch wird durch Streuung von Licht durch Fettglobuli
und Caseinmizellen verursacht. Magermilch, d.h. Milch, aus der das
gesamte Fett entfernt wurde, ist aufgrund dieser Caseinmizellen
immer noch weiß.
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Die
Molkeproteinfraktion der Milch, d.h. Milch nach Entfernen sowohl
der Fett- als auch der Caseinfraktion, ist eine gelbliche, aber
klare Proteinlösung,
die reich an verschiedenen Proteinen, Peptiden, Lactose, Mineralien
und Vitaminen ist. Alle diese Bestandteile sind sogar unter sauren
Bedingungen vollständig
löslich.
Dennoch kann das Lösen
von Molkeproteinen infolge einer teilweisen Denaturierung während des
Sprühtrocknens
trübe Lösungen ergeben.
Eine partielle enzymatische Hydrolyse kann die Löseeigenschaften dieser leicht
denaturierten sprühgetrockneten
Molkeproteine verbessern. Eine umfassendere enzymatische Hydrolyse
von Molkeproteinen verbessert deren Löslichkeit weiter, führt aber
auch zu leichten Zunahmen in der Bitterkeit und den Spiegeln an
vorhandenen freien Aminosäuren. Das übliche Ziel
einer umfassenderen enzymatischen Hydrolyse von Molkeproteinen ist
es, eine Verringerung der Allergenität und eine verbesserte Aufnahme
im Intestinum zu erzielen. Insbesondere der Aspekt der verringerten
Allergenität
ist kommerziell von Bedeutung. Zum Beispiel wurde in verschiedenen
nordeuropäischen
Ländern
eine Kuhmilchunverträglichkeit
bei fast 3% der allgemeinen Säuglingspopulationen
in den ersten zwei Lebensjahren diagnostiziert. Zusammen mit den
Caseinen gehört
beta-Lactoglobulin
zu den hauptsächlichen
Allergenen in Kuhmilch. Erwachsene zeigen selten Kuhmilchallergien, und
spezialisierte Produkte für
diese Gruppe müssen derart
zugeschnitten sein, dass sie leicht aufnehmbar sind, einen guten
Geschmack bieten und gute Lagerstabilitäten, insbesondere unter sauren
Bedingungen, aufweisen. Daher ist es nicht überraschend, dass es eine erhebliche
Literatur im Hinblick auf die umfassende enzymatische Spaltung von
Molkehydrolysaten gibt, die auf klinische, diätetische und Sport-Anwendungen sowie
auf die Säuglingsernährung abzielt.
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Im
Gegensatz zu Molke ist Casein reich an hydrophoben Aminosäuren, so
dass seine Hydrolysate durchwegs bitter sind und zu ranzigen und
brüheartigen
Geschmacksabweichungen neigen. Aufgrund ihrer extremen Bitterkeit
finden enzymatisch hydrolysierte Caseine nur beschränkte Anwendung. Außerdem macht
ihr hoher Gehalt an hydrophoben Aminosäuren Peptide, die von Casein
herrühren,
insbesondere unter sauren Bedingungen schwierig zu lösen.
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In
der Literatur beschriebene Verfahren zur Herstellung partieller
Caseinhydrolysate beinhalten in der Regel Mehr-Schritt-Hydrolysen
mit wenigen Endoproteasen, gefolgt von Inkubation mit einer oder mehreren
Exoproteasen. Kombinationen verschiedener Endoproteasen werden gewöhnlich dazu
verwendet, den hohen Hydrolysegrad (degree of hydrolysis, DH) zu
erzielen, der erforderlich ist, um mögliche allergene Reaktionen
zu minimieren und die Löslichkeit
zu verbessern. Eine anschließende
Inkubation mit Exoproteasen setzt amino- oder carboxyterminale Aminosäurereste
frei, wodurch bittere Geschmacksabweichungen minimiert werden. Die
Freisetzung freier Aminosäuren
impliziert jedoch Verluste in der Ausbeute und einen verringerten
Nährwert. Weil
hohe Spiegel an freien Aminosäuren
auch zu brüheartigen
Geschmacksabweichungen und erhöhten
osmotischen Werten des endgültigen
Hydrolysats führen
können,
sind zusätzliche
Verfahrensschritte zur Entfernung freier Aminosäuren und stark hydrophober
Peptide, die für
die bitteren Geschmacksabweichungen verantwortlich sind, übliche Praxis.
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Die
Patentanmeldung
EP 0 610 411 beschreibt
vollständig
lösliche
Caseinhydrolysate von guter organoleptischer Qualität mit niedermolekularen
Peptiden und einem DH-Wert in der Größenordnung von 15 bis 35%.
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Die
Patentanmeldung
WO 96/13174 beschreibt
ein Verfahren, das durch eine Hydrolysereaktion, die eine beliebige
neutrale oder alkalische Protease aus Bacillus in Kombination mit
einem Aspergillus-Enzymkomplex beinhaltet, der sowohl Endo- als
auch Exopeptidasen umfasst, gekennzeichnet ist, zur Produktion eines
Milchproteinhydrolysats mit einem Hydrolysegrad zwischen 35% und
55%.
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Die
Patentanmeldung
EP 384 303 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats, das wenig
Bitterkeit und einen niedrigen DH-Wert aufweist, unter Verwendung
einer Aminopeptidase.
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Die
Patentanmeldung
EP 223 560 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung von Milchproteinen mithilfe einer
sequentiellen Enzymhydrolyse.
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Die
Patentanmeldung
EP 0 631 731 beschreibt
ein partielles Hydrolysat eines Proteingemischs, das Molkeprotein
und Casein umfasst, wobei das Hydrolysat einen Hydrolysegrad zwischen
4 und 10% hat, und ein wenig bitteres Hydrolysat unter Verwendung
einer Kombination von Trypsin und Chymotrypsin erhalten wird.
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Das
Patent
US 4,600,588 beschreibt
ein Milchproteinhydrolysat, das aus säurepräzipitiertem Casein besteht,
das u.a. mit einer sauren Pilz-Protease behandelt wurde.
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Die
Patentanmeldung
JP11243866 beschreibt
ein Caseinhydrolysat, das sich für
Getränke und
Nahrungsmittel eignet, geschmacklos und geruchlos ist und einen
Hydrolysegrad von 17 bis 30% besitzt.
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Das
Patent
US-A-5405756 betrifft
ein transparentes säurelösliches
Lebensmittelprodukt. Milch oder Magermilch werden als Ausgangsmaterial
zur Herstellung eines Caseinphosphopeptidase-(CPP-)Produkts verwendet.
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Die
Patentanmeldung
EP-A-1062873 betrifft Milchproteinhydrolysate
mit einem niedrigen Hydrolysegrad und relativ hochmolekularen Peptiden/Proteinen.
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Die
Patentanmeldung
WO-A-02045523 betrifft
die Produktion von Hydrolysaten unter Verwendung einer prolinspezifischen
Endoprotease. Dieses Dokument wurde erst nach dem Prioritätsdatum
der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Proteinzusammensetzung bereit,
die hydrolysiertes Casein-Protein und Molkeprotein in einem Verhältnis von 9:1
bis 1:1, bezogen auf das Trockengewicht, umfasst. Vorzugsweise ist
das Molkeprotein nicht hydrolysiert. Die Proteinzusammensetzung
ist eine klare Flüssigkeit
bei pH 4, wenn das hydrolysierte Casein-Protein und Molkeprotein
in Wasser in einer Menge von 40 g Protein (Trockengewicht)/Liter
bei 10°C gelöst oder
vorhanden ist.
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Falls
die Proteinzusammensetzung weniger als 40 g Protein (Trockengewicht)/Liter
umfasst, ist diese Zusammensetzung bei 10°C immer noch eine klare Flüssigkeit,
wenn sie auf eine Flüssigkeit
mit 40 g Protein (Trockengewicht)/Liter aufkonzentriert wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung
einer Zusammensetzung bereit, die Casein-Protein und Molkeprotein
umfasst, wobei zumindest die Caseinfraktion hydrolysiert ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Produkt bereit, das eine erfindungsgemäße Zusammensetzung
umfasst, zum Beispiel ein Getränk,
wie ein Sportgetränk
oder ein Softdrink oder ein Gesundheitsgetränk, oder ein Diätnahrungsmittel,
wie ein Produkt für Ältere oder
für abnehmende
Menschen, oder eine Säuglingsformulierung,
wie ein Geburts- oder Anschlussprodukt. Außerdem kann es sich um ein
fermentiertes Produkt handeln, oder es kann in verschiedene Körperpflegeprodukte
eingebracht werden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Das
erfindungsgemäße Produkt
umfasst vorzugsweise Molkeprotein und Casein in einem Verhältnis, wie
sie in Kuhmilch vorkommen. Um die vorhandenen biologisch aktiven
Peptide und Proteine zu nutzen, sollte die enzymatische Hydrolyse
des Molkeproteins vorzugsweise minimal sein. Die enzymatische Hydrolyse
der Caseine sollte weit genug gehen, dass eine hohe Proteinausbeute
in einem klaren Produkt unter sauren Bedingungen gewährleistet
ist. Daher wird das Casein-Protein von einer ausreichenden Menge
an Enzymen für
einen ausreichenden Zeitraum hydrolysiert, dass es zu einem fast
vollständig hydrolysierten
Protein wird. Fast vollständig
hydrolysiert impliziert, dass nur wenige Prozent des Caseinats nicht
vollständig
löslich
sind und eine gewisse Trübheit
in dem endgültigen
Hydrolysat verursachen können.
Ebenso kann die Molkefraktion etwas restliches unlösliches
Material, wie Spuren von Caseinen, enthalten. Um diese unlösliche Substanz
aus dem Gemisch von Caseinhydrolysat und Molke zu entfernen, bieten
entweder Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (zum Beispiel
bei 2000–5000
g) oder einfaches Absetzen, gefolgt von Dekantierung, industriell
annehmbare Verfahrensschritte, um ein klares Produkt zu erhalten.
Es sollte selbstverständlich sein,
dass normale Kuhmilch nicht unter Verwendung entweder der Zentrifugation
bei niedriger Geschwindigkeit oder durch den Absetz-/Dekantierungsschritt geklärt werden
kann. Nach dem Mischen der hydrolysierten Casein-Proteine mit den Molkeproteinen und
vorzugsweise nach einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit
liefert das erhaltene Produkt eine klare Flüssigkeit bei pH 4, wenn es
in Wasser in einer Menge von 40 g Protein (Trockengewicht) pro Liter
gelöst
wird oder vorhanden ist. Im Allgemeinen erfolgt die Hydrolyse bei
einem pH von 3,5 bis 9 und einer Temperatur von 40 bis 80°C. Vorzugsweise
hat das Proteinhydrolysat ein Verhältnis von Molke zu Casein,
wie es in Kuhmilch vorhanden ist, und ist unter sauren Bedingungen
klar. Vorzugsweise hat das Hydrolysat einen verbesserten neutralen
oder milden Geschmack und eine gute Lagerungsstabilität.
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Eine
flüssige
Zusammensetzung ist "klar", wenn bei 10°C und pH
4 ihre optische Absorption, die bei 480 nm unter Verwendung einer
1-cm-Glaszelle gemessen wird, unter 1,00, vorzugsweise unter 0,50, ist,
wenn sie gegen einen Überstand
der gleichen Zusammensetzung bei 10°C und pH 4 gemessen wird, der
nach einer Zentrifugation bei 20000 g für 20 Minuten erhalten wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Gemisch von Milchproteinhydrolysaten,
vorzugsweise Caseinhydrolysat und Molke, in Casein-Molke-Verhältnissen von
9:1 bis 1:1, bezogen auf das Trockengewicht, vorzugsweise in einem
Verhältnis,
wie es in Kuhmilch vorliegt, bereit. Außerdem stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Produktion solcher Gemische und von
Ernährungsgetränken, die
davon stammen, bereit. Das Proteinhydrolysat kann in Säuglingsformulierungen,
Diätnahrungsmitteln,
Nutrazeutika, Eiscremes, Soßen,
fermentierten Produkten, Joghurts und Körperpflegeprodukten verwendet
werden. Im Allgemeinen hat die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine stark
verringerte Allergenität
verglichen mit Kuhmilch. Im Allgemeinen hat die erfindungsgemäße Zusammensetzung
einen milden bis neutralen Geschmack und eine verbesserte Löslichkeit
und Transparenz unter sauren Bedingungen und kann als Grundlage
für andere
Getränke,
wie Sportgetränke oder
Softdrinks oder Gesundheitsgetränke,
oder fermentierte Produkte verwendet werden. Mit dem Begriff milder
Geschmack ist ein Bitterkeitsspiegel gemeint, der ähnlich oder
niedriger ist als ein Spiegel von 15 mg/Liter Kininsulfat, das in
destilliertem Wasser gelöst
und bei einer Temperatur von 14°C
probiert wird.
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Um
den Nutzen des erfindungsgemäßen Produkts
für die
Gesundheit weiter zu verbessern, kann die Proteinzusammensetzung
mit Vitaminkonzentraten, Frucht oder Fruchtfraktionen, um den Vitamin-
und Fasergehalt des Endprodukts zu erhöhen, und sogar mit Hydrolysatfraktionen
kombiniert werden, um den Spiegel an biologisch aktiven Peptiden zu
erhöhen.
Außerdem
kann das erfindungsgemäße Produkt
mit einer Reihe an Mikrobenkulturen fermentiert werden, um den Geschmack
und den Nutzen für die
Gesundheit zu verbessern oder die Viskosität des Endprodukts zu erhöhen. Idealerweise
erfolgt die Fermentation gleichzeitig mit der Inkubation mit der prolinspezifischen
Endoprotease bei einer Temperatur zwischen 40 und 50°C. Wenn die
verwendete Starterkultur eine hohe Viskosität erzeugt, dann wird die Fermentation
am besten nach dem Zentrifugationsschritt bei niedriger Geschwindigkeit
durchgeführt.
Nach der Inkubation mit einer geeigneten Starterkultur oder einer
Kombination verschiedener Starterkulturen wird das gesamte Gemisch
fermentiert, bis der erforderliche saure pH erreicht ist, und dann auf
10–20°C abgekühlt. Die
so hergestellte fermentierte Grundlage kann mit Wasser oder Saft
homogenisiert oder verdünnt,
auf 4°C
abgekühlt
und in die benötigten
Verkaufsbehälter
gefüllt
werden, d.h. mit oder ohne einen Pasteurisierungs- oder Sterilisationsschritt.
Um eine breite Verbraucherakzeptanz unter den Verbrauchern mit nicht-medizinischem
Bedarf zu erzielen, sind ein hoher Wohlgeschmack sowie bestimmte
physikochemische Aspekte, wie Löslichkeit
unter sauren Bedingungen, von allergrößter Bedeutung. Ein klares
und nicht-weißes
Aussehen ist ein wichtiges Plus ebenso wie das Fehlen von Gerüchen und
Aromen, wie Diacetyl, die in der Regel mit Milchprodukten einhergehen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Flüssigkeit,
die unter sauren Bedingungen klar ist, mit niedriger Allergenität verglichen
mit Kuhmilch und mit den gesundheitsfördernden Eigenschaften und
der Nährwirkung
von Milch bereit, die bei Nahrungsmittelanwendungen, wie Getränken, einschließlich kohlensäurehaltigen
Getränken,
fermentierten Produkten und Nahrungsprodukten, eingesetzt werden kann.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Produktion von Hydrolysaten kann unter Verwendung von Magermilch,
Magermilchpulvern, Milchproteinkonzentraten, Gemischen von Molkeprotein
und Casein in bevorzugten Verhältnissen
oder isolierten Molkeproteinfraktionen und isolierten Caseinfraktionen,
die dann gemischt werden, um die bevorzugten Verhältnisse
zu erhalten, als Ausgangsmaterialien, oder die gemischt werden können, nachdem
die Fraktionen (zum Teil) hydrolysiert wurden, oder die während der
Hydrolyse gemischt werden können, durchgeführt werden.
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Die
Molkeproteine können
aus Flüssigmolke stammen,
die aus der Käseherstellung
erhalten wird, vorzugsweise aus einer Süßmolke, wie derjenigen, die
sich aus der Gerinnung von Casein durch ein tierisches oder mikrobielles
Lab ergibt und die, zum Beispiel durch Ansäuern, gefolgt von Zentrifugation,
weiter von verunreinigenden Caseinen gereinigt wird. Vorzugsweise
werden konzentrierte, nicht sprühgetrocknete
Versionen dieser Molkeprodukte verwendet. Gegebenenfalls können kommerziell
erhältliche Molkeproteinpulver,
wie BiPRO (Davisco Foods International), PROXIME 660 oder HIPROTAL
875 oder DOMOVICTUS 535 (BDI, Niederlande) oder stärker bevorzugt
ihre nicht sprühgetrockneten Äquivalente
verwendet werden. Gegebenenfalls kann die verwendete Molke nicht-proteolytischen
Enzymen, wie Lactase, unterworfen worden sein, wodurch die vorhandene
Lactose in Glucose und Galactose umgewandelt wird. Gegebenenfalls
können
die Molkesubstanzen entmineralisiert worden sein.
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Die
vorliegende Erfindung zieht vorzugsweise keine oder nur eine sehr
beschränkte
Hydrolyse der Molkeproteinfraktion in Betracht. Zusätzlich sieht die
vorliegende Erfindung ein Hydrolysat vor, bei dem sowohl die Molkefraktion
als auch die Caseinfraktion hydrolysiert sind, wie es während der
Hydrolyse von beispielsweise Magermilch oder Magermilchpulvern vorkommt.
Magermilch ist Milch, die entfettet ist und somit vorzugsweise weniger
als 1 g/Liter Fett, vorzugsweise weniger als 0,8 g/Liter Fett, enthält. In dem
erfindungsgemäßen Produkt,
bei dem Magermilch oder Magermilchpulver als Ausgangsmaterial eingesetzt
wird, stellt die Peptidfraktion mit einem Molekulargewicht unter
1500 Dalton üblicherweise mehr
als 85 Gew.-% des in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorhandenen
Proteins dar, wohingegen die Peptidfraktion unter 5000 Dalton üblicherweise
mehr als 95 Gew.-% des in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung vorhandenen
Proteins ausmacht. Daher zeigen die erfindungsgemäßen Produkte
vorzugsweise eine deutlich verringerte Allergenität verglichen
mit dem Ausgangsprotein. Die Erfindung zieht auch Hydrolysate mit
verringerten osmotischen Werten in Betracht, wie sie nach Nanofiltration,
Ionenaustausch oder Elektrodialyse erhalten werden können.
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Transparenz
und Säurelöslichkeit
der Caseinfraktion können
durch enzymatisches Hydrolysieren von Caseinmizellen in kleinere
Peptide erhalten werden.
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Die
Caseinquelle kann entweder Labcasein, Säurecasein oder Natrium-, Calcium-
oder Kaliumcaseinat sein. Für
das erfindungsgemäße Verfahren werden
die Proteine zu einer Lösung
verdünnt
oder rekonstituiert, die 10 bis 150 Gramm Protein pro Liter (1–15% w/w),
vorzugsweise 20 bis 60 Gramm Protein pro Liter, enthält.
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Das
Verfahren zur Herstellung der Hydrolysate ist in den beigefügten Patentansprüchen angegeben.
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Um
partielle Hydrolysate zu erhalten, werden die Proteine zuerst einer
Endoprotease im einem pH-Optimum zwischen 4 und 10 und einer Präferenz für die Spaltung
von Proteinen auf der carboxyterminalen Seite von raumgreifenden
hydrophoben Aminosäureresten
unterworfen.
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Bevorzugte
Endoproteasen mit solchen Eigenschaften sind Subtilisin (EC 3.4.24.4
oder Pescalase, wie von DSM Food Specialities, Seclin, Frankreich,
geliefert, oder Alcalase, wie von NOVO, Bagsvaerd, Dänemark,
geliefert), Thermolysin (EC 3.4.24.4 oder Thermoase, wie von Daiwa
Kasei, Osaka, Japan, geliefert), neutrale Metalloprotease (EC 3.4.24.28
oder Brewers Protease 2000, wie von DSM Food Specialities, Seclin,
Frankreich, geliefert, oder Neutrase, wie von NOVO geliefert) oder
Chymotrypsin (EC 3.4.21.1). Eine andere bevorzugte Endoprotease
ist eine prolinspezifische Endoprotease. Eine prolinspezifische
Endoprotease kann eine bevorzugte Spaltung entweder auf der aminoterminalen
oder der carboxyterminalen Seite von Prolin implizieren. Endoproteasen,
die in der Lage sind, auf der aminoterminalen Seite von Prolin zu
spalten, sind bekannt (Nature, Bd. 391, 15. Januar 15, S. 301–304, 1998). Endoproteasen
mit einer Präferenz
für die
Spaltung auf der carboxyterminalen Seite von Prolin sind ebenfalls
bekannt (EC 3.4.21.26). Der letztere Typ der prolinspezifischen
Endoprotease wird vorzugsweise aus überproduzierenden rekombinanten
Stämmen
mit Nahrungsmittelqualität,
wie Aspergillus, erhalten. Ein Beispiel für einen geeigneten Produzenten
dieses Enzyms ist in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung
Nummer
PCT/EP01/14480 beschrieben.
Weil diese prolinspezifische Endoprotease nur Peptidbindungen hydrolysieren
kann, an denen Prolinreste beteiligt sind, wird das Enzym vorteilhafterweise
mit einer der bevorzugten Endoproteasen zur Hydrolyse des kombinierten
Molkeproteins und Caseins oder der isolierten Fraktionen kombiniert.
Ein bedeutender Vorteil der Verwendung einer prolinspezifischen
Endoprotease ist, dass sie zur Spaltung der hauptsächlichen
allergenen Epitope sowohl in Caseinen als auch in Molkeproteinen
in der Lage ist. Zum Beispiel ist Casein sehr reich an Prolinresten
und kann somit von der prolinspezifischen Endoprotease oft gespalten
werden. Die drei hauptsächlichen
allergenen Epitope von beta-Lactoglobulin (Fragmente 41–60, 102–124 und
149–162;
Clinical and Experimental Allergy, 1999, Bd. 29, S. 1055–1063) enthalten
sämtlich
einen zentralen Prolinrest, so dass eine Inkubation mit der Endoprotease wahrscheinlich
die Erkennung durch die entsprechenden menschlichen IgEs verringert,
wodurch die Allergenität
des Endprodukts minimiert wird. Eine bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, dass die Caseinfraktion oder sowohl die Molkefraktion als auch
die Caseinfraktion einer Hydrolyse unterzogen werden, an der die
Kombination von Enzymen beteiligt ist.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahren
ist, dass die enzymatische Hydrolyse der Molkefraktion, der Caseinfraktion
oder der Proteinfraktion, wie sie in Vollmilch vorliegt, nur unter
Verwendung von Endoproteasen, d.h. ohne Verwendung irgendwelcher
Exoproteasen, hydrolysiert wird.
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Die
Hydrolyse kann unter einem konstanten pH oder unter ungeregelten
pH-Bedingungen durchgeführt
werden. Vorzugsweise erfolgt die Hydrolyse in zwei Schritten, zuerst
werden die Proteine unter neutralen oder alkalischen Bedingungen
mit einer Endoprotease mit einer Präferenz zur Spaltung von Proteinen
auf der carboxyterminalen Seite raumgreifender, hydrophober Aminosäurereste
inkubiert. Während
dieser Hydrolyse fällt
der pH auf saure Werte (d.h. auf unter pH 7), und nur dann wird
die zweite Endoprotease, vorzugsweise eine prolinspezifische Endoprotease,
stärker
bevorzugt eine aus Aspergillus erhaltene prolinspezifische Endoprotease,
hinzugefügt.
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Die
Menge an Enzym, die erforderlich ist, um den gewünschten Hydrolysegrad zu erzielen,
hängt von
dem verwendeten Enzym ab. Die Enzymdosierung und die Inkubationsbedingungen
werden jedoch derart optimiert, dass der Großteil der Casein-Proteinfraktion
nach Inkubationszeiträumen
von üblicherweise
6 bis 20 Stunden in der wässrigen
Phase der Umsetzung gelöst
ist. Mit Großteil
ist gemeint, dass bei pH 4 weniger als 20%, vorzugsweise weniger
als 10%, stärker
bevorzugt weniger als 5%, des in der Caseinfraktion vorliegenden
Proteins nach Zentrifugation für
10 Minuten bei 2000 g ausgefällt
werden kann.
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Eine
zusätzliche
Entbitterung des Hydrolysats, das sich aus der Inkubation mit den
Endoproteinasen ergibt, kann vorteilhaft sein. Zusätzliches
Entbittern wird vorzugsweise durch gleichzeitige oder anschließende Inkubation
mit einer Exoproteasezubereitung durchgeführt, die vorzugsweise frei
von endoproteolytischer Aktivität
ist. Wenn die Inkubation anschließend an die Inkubation mit
der Endoprotease durchgeführt
wird, kann eine pH-Einstellung mit Salzsäure notwendig sein; eine Inaktivierung
der Endoprotease ist in der Regel nicht erforderlich. Entbittern
kann auch unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen mit einer
geeigneten Aminopeptidase durchgeführt werden, die eine Präferenz für die Entfernung
aminoterminaler hydrophober Aminosäurereste zeigt, wie zum Beispiel
Accellerzyme (DSM Food Specialities; Delft, Niederlande) oder Corrolase LAP
(Röhm,
Darmstadt, Deutschland) oder APII aus Bacillus stearothermofilus,
wie von Stoll et al. (BBA 438 (1976) 212–220) beschrieben isoliert.
Alternativ kann Entbittern unter leicht sauren Bedingungen mit einer
geeigneten Carboxypeptidase durchgeführt werden, die eine Präferenz zur
Entfernung carboxyterminaler hydrophober Aminosäurereste zeigt, wie CPDI (PepG)
aus Aspergillus (Dal Degan et al., Appl. Environ Microbial, 58(7)
2144–2152).
Gegebenenfalls kann eine Kombination der beiden Exoprotease-Typen
unter schwach sauren Bedingungen eingesetzt werden. Bevorzugte Inkubationstemperaturen für die Endoproteasen
sowie für
die Exoproteasen sind 40°C
oder höher,
vorzugsweise 50°C
bis 80°C.
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Ungeachtet
der Hydrolysebedingungen wird das endgültige Hydrolysat vorzugsweise
einem zusätzlichen
Enzyminaktivierungsschritt unterzogen. Der Enzyminaktivierungsschritt
kann eine Hitzebehandlung sein, die Erhitzen auf eine Temperatur
von mindestens 85°C
für mindestens
10 Minuten umfasst. Wenn höhere
Temperaturen oder extremere pH-Werte verwendet werden, können kürzere Zeiträume durchführbar sein.
Eine solche Hitzebehandlung wird vorzugsweise bei einem sauren pH- Wert, vorzugsweise
zwischen 3 und 7, durchgeführt.
Zur Entfernung von jeglicher nicht-solubilisierter Substanz aus
dem Endprodukt ist Dekantierung oder Zentrifugation bei niedriger
Geschwindigkeit, zum Beispiel bei 2000–4000 g, wie sie im industriellen Maßstab durchgeführt werden
kann, bevorzugt. Gegebenenfalls kann das Hydrolysat unter Verwendung eines
Ultrafilters, eines Mikrofilters, von Diatomeenerde, Fiberglasfiltern
oder unter Verwendung von Cross-Flow-Filtration filtriert werden.
Eine vollständige
Enzyminaktivierung kann mit einem Farbstoff-Gelatine-Test bestätigt werden.
Gegebenenfalls kann das filtrierte endgültige Hydrolysat mit Aktivkohle oder
mittels Nanofiltration, Ionenaustausch oder Elektrodialyse behandelt
werden, um einen Überschuss
an Salzen zu entfernen. Das filtrierte Hydrolysat kann pasteurisiert
oder sterilisiert und, wenn erforderlich, durch Trocknungstechniken,
wie Verdampfung, Nanofiltration, Sprühtrocknen, Fließbetttrocknen
oder Kombinationen davon, weiter eingeengt werden. Vorzugsweise
liegt das erhaltene Produkt in Granulatform vor.
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Vorteilhafterweise
liegt das Verhältnis
von Casein und Molkeprotein im Wesentlichen wie in Kuhmilch vor.
Das Molkeprotein ist vorzugsweise nicht-hydrolysiertes Protein.
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Vorteilhafterweise
werden Casein oder Molkeprotein oder eine Kombination von Beidem
unter Verwendung von nur Endoproteasen, d.h. ohne Verwendung einer
Exoprotease, hydrolysiert.
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Vorzugsweise
umfasst das endgültige
Proteingemisch von 10 bis 50% Molkeprotein und von 90 bis 50% Casein.
Stärker
bevorzugt umfasst das Proteingemisch von 20 bis 40% Molkeprotein
und von 80 bis 60% Casein. Die Prozentangaben für Casein und Molkeprotein beziehen
sich jeweils auf das Trockengewicht.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird Caseinat mit einer bevorzugten Endoprotease hydrolysiert
und dann einer Inkubation mit einer prolinspezifischen Endoprotease
unterzogen. Als solches oder vorzugsweise nach Zentrifugation wird
das Caseinhydrolysat eingeengt und getrocknet. Das getrocknete Produkt
kann wieder in nicht-hydrolysierter Molke gelöst werden, um die gewünschte Proteinkonzentration
und das gewünschte
Proteinverhältnis
zu erhalten, und dann, wenn erforderlich, zentrifugiert oder filtriert
und pasteurisiert oder sterilisiert werden, um das erfindungsgemäße Produkt
zu erhalten. Alternativ wird das konzentrierte Caseinhydrolysat
mit konzentriertem, nicht-hydrolysiertem Molkeprotein gemischt,
um die gewünschte
Proteinkonzentration und das gewünschte
Proteinverhältnis zu
erhalten, und dann gegebenenfalls zentrifugiert oder filtriert und
gegebenenfalls pasteurisiert oder sterilisiert, um das erfindungsgemäße Produkt
zu erhalten.
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Offensichtlich
kann das Produkt zusätzlichen Enzymbehandlungen,
wie Lactasen, unterzogen werden oder mit unterschiedlichen Typen
von Starterkulturen fermentiert oder mit allen Arten von Inhaltsstoffen,
wie Fruchtkonzentraten, Geschmacksstoffen, Farbstoffen, Alkohol,
Kohlendioxid, Verdickern, Säuerungsmitteln,
Antioxidantien, Kräutern oder
Kräuterextrakten,
gesundheitsfördernden
Verbindungen, wie Vitaminen oder Provitaminen oder biologisch aktiven
Peptiden oder Kohlehydraten oder Aminosäuren, kombiniert werden, um
ein Produkt zu formulieren, das die Anforderungen des Marktes erfüllt.
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Bei
der endgültigen
Anwendung, bei der der pH-Wert gewöhnlich höher als 3, vorzugsweise höher als
3,5, und die Gesamtproteinkonzentration kleiner als 5% w/w, vorzugsweise
kleiner als 3,5% w/w, ist, ist die optische Absorption der Lösung (die
40 g/l Protein umfasst), wie bei einer Wellenlänge von 480 nm gemessen, kleiner
als 1,000, vorzugsweise kleiner als 0,50, wie gegen den Überstand
der Lösung,
die nach einer Zentrifugation bei 20000 g für 20 Minuten erhalten wurde,
unter Verwendung einer 1-cm-Glaszelle bei 10°C und pH 4 gemessen.
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Beispiel 1
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Hydrolyse von Casein unter Verwendung
einer prolinspezifischen Endoprotease
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Die
Inkubation von 1 Gramm Thermolysin pro kg eines Natriumcaseinatpulvers
in einer Lösung/Suspension,
die 60 Gramm Natriumcaseinat (Miprodan 30, wie von MD Foods, Viby,
Dänemark, geliefert)
pro Liter enthielt, bei pH 6,7 und 75°C unter konstanten pH-Bedingungen führte nach
3 Stunden zu einer geklärten
Lösung
fast ohne Niederschlag. Nach Einstellen des pH auf 5,0 wurde das
Enzym für 45
Minuten bei 95°C
inaktiviert. Die Flüssigkeit
wurde abgekühlt
und probiert, was einen sehr bitteren Geschmack ergab. Der pH wurde
auf 6,0 eingestellt, und 3 Einheiten prolinspezifische Endoprotease
aus A. niger wurden zu 25 ml dieses Caseinathydrolysats hinzugefügt. Eine
Aktivitätseinheit
der prolinspezifischen Endoprotease aus A. niger ist definiert als
die Menge Enzym, die erforderlich ist, um 1 μmol pNA pro Minute aus N-Carbobenzoxy-Glycin-Prolin-p-Nitroanilid
(z-Gly-PropNA) (Bachem, Schweiz) bei pH 5 und 37°C freizusetzen. Die Freisetzung
von pNA wird mittels optischer Absorption bei 410 nm gemessen. Nach
Inkubation bei 50°C über Nacht
wurde der pH wiederum auf 5,0 eingestellt und ein weiterer Enzyminaktivierungsschritt
(30 Minuten bei 90°C)
durchgeführt.
Nach Abkühlen
auf Raumtemperatur war das Caseinathydrolysat vollständig gelöst und klar.
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Probieren
ergab das Fehlen von jeglicher Bitterkeit.
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HPLC
unter Verwendung eines Ionenfallen-Massenspektrometers (Thermoquest, Breda, Niederlande),
gekoppelt mit einer P4000-Pumpe (Themoquest, Breda, Niederlande),
wurde zur Charakterisierung der Molekulargewichtsverteilung der Caseinpeptide,
wie sie durch die Enzyminkubation hergestellt wurden, verwendet.
Die gebildeten Peptide wurden unter Verwendung einer PEPMAP-C18-300A-(MIC-15-03-C18-PM,
LC Packings, Amsterdam, Niederlande) Säule in Kombination mit einem
Gradienten von 0,1% Ameisensäure
in Milli-Q- Wasser
(Millipore, Redford, MA, USA; Lösung A)
und 0,1% Ameisensäure
in Acetonitril (Lösung
B) für
die Elution aufgetrennt. Der Gradient startete bei 100% Lösung A,
stieg in 45 Minuten auf 70% Lösung B
an und wurde weitere 5 Minuten lang bei dem letzteren Verhältnis gehalten.
Es wurde ein Einspritzvolumen von 50 μl verwendet, die Flussrate betrug
50 μl pro
Minute, und die Säulentemperatur
wurde bei 30°C
gehalten. Die Proteinkonzentration der eingespritzten Probe betrug
etwa 50 μg/ml.
Den erhaltenen Daten zufolge hatten die meisten Caseinpeptide Molekulargewichte
im Bereich von 300 bis 1200 D.
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Beispiel 2
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Ein klares, nicht-bitteres, milchähnliches
Getränk, das
durch Mischen von ausgiebig hydrolysiertem Caseinat mit nicht-hydrolysierter
Süßmolke erhalten wird.
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Zu
200 ml einer Lösung
von Natriumcaseinat (Miprodan 30, von MD Foods, Viby, Dänemark,
geliefert) mit 60 Gramm pro Liter wurden 300 mg Thermoase (eine
hitzebeständige
Metallo-Endoprotease aus Bacillus thermoproteolyticus Rokko mit
einer Aktivität
von 14000 PU/mg, wie von Daiwa Kasei, Osaka, Japan, hergestellt)
hinzugefügt.
Während
der Inkubation bei pH 6,7 und 75°C
traten unmittelbare Ausflockung und Ausfällung von Casein-Protein auf. Eine
weitere dreistündige
Inkubation unter konstanten pH-Bedingungen führte zu einer geklärten Lösung fast
ohne Niederschlag. Der pH der Lösung wurde
auf pH 5,0 eingestellt und die Thermoase durch 45-minütiges Erhitzen
bei 95°C
inaktiviert. Nach dem Abkühlen
wurde die Lösung
probiert und als sehr bitter befunden. Nach Einstellen des pH auf pH
6,0 wurden 3 Einheiten prolinspezifische Endoprotease (wie unter
Verwendung von Z-Gly-Pro-pNA bei pH 5 und 37°C gemessen) aus A. niger zu
25 ml des Hydrolysats hinzugefügt.
Nach Inkubation für
20 Stunden bei 50°C
wurde ein weiterer Enzyminaktivierungszyklus durch Erhitzen der
Lösung
für 30
Minuten bei 90°C durchgeführt. Nach
Abkühlen
auf Raumtemperatur und Einstellen des pH-Werts auf 4,0 wurde gefunden,
dass das Caseinathydrolysat vollständig gelöst und klar war, d.h. eine
optische Absorption von 0,24, wie spektralphotometrisch bei 480
nm in einer 1-cm-Zelle gegen Wasser gemessen, aufwies. Probieren
ergab das Fehlen von jeglicher Bitterkeit oder Geschmacksabweichungen.
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Das
Mischen dieser zweifach konzentrierten Caseinlösung mit der gleichen Menge
an frischer, doppelt konzentrierter Süßmolke, die durch Ansäuern auf
pH 4,0, gefolgt von einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit,
von verunreinigendem Casein-Protein befreit worden war, lieferte
schließlich ein
klares, nicht-bitteres, milchähnliches
Getränk.
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Beispiel 3
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Eine klare, nicht-bittere Lösung von
hydrolysierten Molkeproteinen, die durch Hydrolyse von Süßmolke erhalten
wird.
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Süßmolke wurde
mittels Ansäuern
der Lösung
auf pH 4 von Casein-Protein befreit. Nach Zentrifugation wurde der
klare Überstand
dekantiert. Der pH der Molkefraktion wurde auf pH 6,8 eingestellt.
Zu 200 ml dieser Lösung
wurden 200 mg Thermoase (eine hitzebeständige Metallo-Endoprotease
aus Bacillus thermoproteolyticus Rokko mit einer Aktivität von 14000
PU/mg, wie von Daiwa Kasei, Osaka, Japan, hergestellt) hinzugefügt. Während der
Inkubation bei pH 6,7 und 75°C
traten leichte Ausflockung und Ausfällung von Protein auf. Eine
weitere dreistündige
Inkubation unter konstanten pH-Bedingungen führte zu einer geklärten Lösung, die
immer noch etwas Niederschlag enthielt. Der pH der Lösung wurde
auf pH 5,0 eingestellt und die Thermoase durch 45-minütiges Erhitzen
bei 95°C
inaktiviert. Nach dem Abkühlen wurde
die Lösung
probiert und für
leicht bitter erachtet. Nach einer weiteren pH-Einstellung auf pH
6,0 wurden 3 Einheiten prolinspezifische Endoprotease (wie unter
Verwendung von Z-Gly-Pro-pNA bei pH 5 und 37°C gemessen) aus A. niger zu
25 ml des Hydrolysats hinzugefügt.
Nach Inkubation für
20 Stunden bei 50°C
wurde ein weiterer Enzyminaktivierungszyklus durch Erhitzen der
Lösung
für 30
Minuten bei 90°C
durchgeführt.
Nach Abkühlen
auf Raumtemperatur und Einstellen des pH-Werts auf 4,0 wurde gefunden,
dass das Molkeproteinhydrolysat vollständig gelöst und klar war, d.h. eine
optische Absorption von 0,35, wie spektralphotometrisch bei 480 nm
in einer 1-cm-Zelle gegen Wasser gemessen, aufwies. Probieren zeigte
das Fehlen von jeglicher Bitterkeit oder Geschmacksabweichungen.
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Beispiel 4
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Eine klare, nicht-bittere Lösung auf
Milchproteinbasis, die durch Hydrolyse von Magermilch ohne Verwendung
von Exoproteasen erhalten wurde.
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Zu
200 ml einer kommerziell erhältlichen
Magermilch wurden 300 mg Thermoase (eine hitzebeständige Metallo-Endoprotease
aus Bacillus thermoproteolyticus Rokko mit einer Aktivität von 14000 PU/mg,
wie von Daiwa Kasei, Osaka, Japan, hergestellt) hinzugefügt. Während der
Inkubation bei pH 6,7 und 75°C
traten unmittelbare Ausflockung und Ausfällung von Protein auf. Eine
weitere dreistündige Inkubation
unter konstanten pH-Bedingungen führte zu einer geklärten Lösung fast
ohne Niederschlag. Der pH der Lösung
wurde auf pH 5,0 eingestellt und die Thermoase durch 45-minütiges Erhitzen
bei 95°C inaktiviert.
Nach dem Abkühlen
wurde die Lösung probiert
und für
sehr bitter erachtet. Nach einer weiteren pH-Einstellung auf pH
6,0 wurden 3 Einheiten prolinspezifische Endoprotease (wie unter
Verwendung von Z-Gly-Pro-pNA bei pH 5 und 37°C gemessen) aus A. niger zu
25 Milliliter des Hydrolysats hinzugefügt. Nach Inkubation für 20 Stunden
bei 50°C wurde
ein weiterer Enzyminaktivierungszyklus durch Erhitzen der Lösung für 30 Minuten
bei 90°C
durchgeführt.
Nach Abkühlen
auf Raumtemperatur und Einstellen des pH-Werts auf 4,0 wurde gefunden, dass das
Caseinathydrolysat vollständig
gelöst
und klar war, d.h. eine optische Absorption von weniger als 0,900,
wie spektralphotometrisch bei 480 nm in einer 1-cm-Zelle gegen Wasser
gemessen, aufwies. Probieren zeigte das Fehlen von jeglicher Bitterkeit oder
Geschmacksabweichungen.
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Beispiel 5
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Eine klare, säurebeständige, nicht-bittere Flüssigkeit mit
einer milchähnlichen
Zusammensetzung, die durch Mischen von hydrolysiertem Natriumcaseinat mit
verschiedenen nicht-hydrolysierten Molkezubereitungen erhalten wird.
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Der
pH einer 6 (Gew.-)%igen Lösung
von Natriumcaseinat (90% Protein, wie von DMV International, Niederlande,
erhalten) wurde auf 8,0 eingestellt, wonach 40 Mikroliter Delvolase
(Delvolase
®, 560000
DU pro Gramm, wie von DSM Food Specialities, Seclin, Frankreich,
erhalten) pro Gramm Casein hinzugefügt wurden. Dann wurde das Gemisch
bei 60°C
unter konstantem Rühren
für entweder
150 oder 210 Minuten bei einem pH inkubiert, der entweder nicht
reguliert oder konstant bei 8,0 gehalten wurde. Nach der Inkubation
wurde die Hydrolysereaktion durch Senken des pH auf 5,0 unter Verwendung
von Milchsäure,
gefolgt von einem Hitzeschock für
10 Minuten bei 90°C,
abgestoppt. Dann wurde die Temperatur auf 50°C gesenkt, und prolinspezifische
Endoprotease aus A. niger (siehe
WO
02/45523 ) wurde hinzugefügt. Pro Gramm Casein wurden
250 Mikroliter einer Enzymlösung,
die 8 Einheiten pro Milliliter hinzugefügt (d.h. 2 Einheiten/Gramm
Caseinat, wie im Beispiel 1 beschrieben gemessen) und entweder für 240, 480
oder 960 Minuten inkubiert. Schließlich wurde ein zusätzlicher
Hitzeschock für
10 Minuten bei 95°C
wurde angewendet, worauf alle Proben mit destilliertem Wasser verdünnt wurden,
um eine Caseinatkonzentration von 3% zu erreichen, auf 14°C abgekühlt und
dann einem spezialisierten Geschmackspanel angeboten wurden, das
für die Quantifizierung bitterer
Geschmacksabweichungen in Milchprodukten ausgebildet war. Nach dem
Probieren kamen sämtliche
Mitglieder des Panels überein,
dass alle Proben, die aus den verschiedenen Delvolase-Inkubationen
und ihrer anschließenden 480-
oder 960-minütigen
Inkubation mit der prolinspezifischen Endoprotease stammten, nicht
bitter waren. Proben, die nach Inkubation mit nur Delvolase erhalten
wurden, wurden als äußerst bitter
angesehen, Proben, die mit Delvolase und einer 240-minütigen Inkubation
mit prolinspezifischer Endoprotease erhalten wurden, wurden als
leicht bitter bewertet.
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Der
Hydrolysegrad unter Verwendung des OPA-Verfahrens, wie von Nielsen, P.M., et
al. (Journal Food Science, Bd. 66, Nr. 5, S. 642–646, 2001) beschrieben, wie
er nach den Inkubationen mit Delvolase gemessen wurde, betrug etwa
12%; nach der Inkubation mit der prolinspezifischen Endoprotease stiegen
die DH-Werte auf Werte zwischen 16 und 20%.
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Um
ein Produkt mit im Wesentlichen derselben Zusammensetzung wie in
Kuhmilch herzustellen, wurden die verschiedenen doppelt konzentrierten
(d.h. 6 Gramm/Liter) nicht-bitteren Caseinhydrolysate, wie unter
Verwendung der vorstehend erwähnten
Protokolle hergestellt, mit einem gleichen Volumen an doppelt konzentrierten
(d.h. 1,3 Gramm/Liter) nicht-hydrolysierten
Molkeproteinen gemischt. Zunächst
wurden unterschiedliche Molkeproteinlösungen unter Verwendung kommerzieller und
nicht-kommerzieller Produkte hergestellt. Von den verschiedenen
getesteten Molkeprodukten, BiPRO (Davisco Foods International),
PROXIME 660 oder HIPROTAL 875 oder DOMOVICTUS 535 (BDI, Niederlande),
ergaben alle relativ klare und mild schmeckende Produkte. Frische
Käsemolke
lieferte ein gelbliches, trübes
Produkt mit starkem Milchproduktaroma. Unter den Kombinationen,
die mit diesen verschiedenen Molkeprodukten und den verschiedenen
Caseinhydrolysaten hergestellt wurden, erwies sich insbesondere
die Kombination mit einer nicht- pasteurisierten
(nicht-kommerziellen) Version von PROXIM 660 aufgrund ihres anziehenden
Geschmacks und des Fehlens von Trübung oder Geschmacksabweichungen
als besonders interessant.
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Trotz
der Tatsache, dass die so hergestellten milchähnlichen Gemische recht transparent
waren, führte
eine Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit von 10 Minuten
bei 2000 g oder einfaches Absetzen für wenige Stunden, gefolgt von
Dekantierung, zu vollständig
klaren Produkten. Die zentrifugierten Produkte lieferten üblicherweise
eine optische Absorption unter 0,90, wie spektralphotometrisch bei 480
nm in einer 1-cm-Zelle gegen Wasser bestimmt. Am bedeutsamsten ist,
dass die letzteren Verfahrensschritte zu Proteinverlusten führten, die üblicherweise
weniger als 10% der gelösten
Fraktion betrugen. Die so hergestellten klaren Lösungen blieben auch nach Ansäuerung auf
pH-Werte von nur 4,0 und 2,8 klar.
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Beispiel 6
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Ein vereinfachtes Hydrolyseprotokoll zur
Umwandlung von Magermilch in ein klares, mild schmeckendes und säurebeständiges Endprodukt.
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Kommerziell
erhältliche
Magermilch (Friesche Vlag, Niederlande) mit einer Konzentration
von 39 Gramm/Liter Proteinen, 51 Gramm/Liter Kohlenhydrat, 0,5 Gramm/Liter
Fett und einem endgültigen pH
von 6,5 wurde in einem Wasserbad bei 60°C äquilibriert, wonach 40 Mikroliter
Delvolase (siehe Beispiel 5) pro Gramm Casein (die verwendete Magermilch
enthielt 30 Gramm Casein/Liter) hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde
unter konstantem Rühren
ohne pH-Einstellungen inkubiert. Nach 150-minütiger
Inkubation wurde der pH unter Verwendung von Milchsäure auf
5,0 gesenkt, und die Lösung
wurde in zwei Portionen aufgeteilt. Eine Portion wurde für 10 Minuten
auf 90°C
erhitzt, um das Subtilisin zu inaktivieren, wohingegen die andere
Portion für
weitere 10 Minuten bei 60°C
gehalten wurde. Dann wurden beide Portionen in ein Wasserbad bei
50°C überführt, und
nach Äquilibrierung
wurde zu den beiden Gefäßen eine
prolinspezifische Endoprotease derart hinzugefügt, dass Konzentrationen von
250 Mikroliter Enzym (d.h. 2 Einheiten; siehe Beispiel 5) pro Gramm
an vorhandenem Casein erreicht wurden. Nach einem weiteren Inkubationszeitraum
von 960 Minuten bei 50°C
wurden beide Portionen einem Hitzeschock von 10 Minuten bei 95°C unterzogen.
Dann wurden die DH-Werte unter Verwendung des Protokolls, wie im
Beispiel 5 beschrieben, bestimmt. Nach der Delvolase-Inkubation
betrug der DH 20%. Nach Inkubation mit der prolinspezifischen Endoprotease hatte
die Probe, die einem Hitzeschock zur Inaktivierung der Delvolase
unterworfen worden war, einen DH-Wert von 26%, wohingegen die andere
Probe einen DH von 30% aufwies. Das Probieren der beiden endgültigen Lösungen wurde
wiederum bei 14°C
und durch dasselbe ausgebildete Panel, wie im Beispiel 5 erwähnt, durchgeführt. Der
Schlussfolgerung des Geschmackspanels zufolge waren beide Lösungen gleichermaßen nicht-bitter.
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Wiederum
ergab eine Zentrifugation der beiden Zubereitungen bei niedriger
Geschwindigkeit klare Lösungen,
die nach weiterer Ansäuerung
auf pH 4 klar blieben. Mittels Chromatographie über eine Superdex-Peptid-HR-1030-Säule wurde
eine Peptidgrößenanalyse
durchgeführt.
Die erhaltenen Daten zeigten, dass in der mit Delvolase-Inaktivierung
hergestellten Substanz die Fraktion, die kleinere Peptide als 1500
Daltons enthielt, 94 Gew.-% des in der Lösung vorhandenen Proteins ausmachte,
während
die Fraktion, die kleinere Peptide als 5000 Daltons enthielt, 99
Gew.-% des in der Lösung
vorhandenen Proteins darstellte. In der ohne Inaktivierung der Delvolase
hergestellten Substanz stellte die Fraktion, die kleinere Peptide
als 1500 Daltons enthielt, 87 Gew.-% dar, und die Fraktion, die
kleinere Peptide als 5000 Daltons enthielt, machte ebenfalls 99
Gew.-% aller vorhandenen Proteine aus.
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Zusammengefasst
lässt sich
sagen, dass die in dem erfindungsgemäßen Beispiel gezeigten Ergebnisse demonstrieren,
dass Magermilch sowie Caseine unter Verwendung eines vereinfachten
Hydrolyseprotokolls wirksam zu nicht-bitteren, klaren Hydrolysaten
hydrolysiert werden können.
Der sehr große
vorhandene Anteil an kleinen Peptiden deutet auf eine stark verringerte
Allergenität
des erhaltenen Magermilchhydrolysats verglichen mit normaler Magermilch
hin.