ES2267605T3

ES2267605T3 - Uso de compuestos de indolinona para la fabricacion de productos farmaceuticos destinados a modular la funcion de la c-kit-tirosina-proteina-quinasa.

Info

Publication number: ES2267605T3
Application number: ES00991704T
Authority: ES
Inventors: Ken Lipson; Gerald Mcmahon
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: CA2395461A1; WO2001045689A2; DE60029138T2; US7211600B2; ATE331514T1; EP1255536A2; NZ519697A; US20020010203A1; JP5004392B2; PT1255536E; MXPA02006263A; EP1255536B1; AU3436301A; DE60029138D1; CY1106165T1; HK1050642A1; US20050288353A1; AU784266B2; JP2004500363A; CA2395461C

Abstract

Uso de un compuesto de indolinona para fabricar una composición farmacéutica destinada al tratamiento o prevención de uno o varios tumores del estroma gastrointes- tinal en un organismo, dicha composición contiene una canti- dad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto de indolinona, dicho compuesto es capaz de inhibir la función de la c-kit- tirosina-quinasa de tipo receptor y se elige entre el grupo formado por:

Description

Uso de compuestos de indolinona para la fabricación de productos farmacéuticos destinados a modular la función de la c-kit-tirosina-proteína-quinasa.

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere al uso de compuestos y composiciones para inhibir trastornos de proliferación celular. La invención es particularmente útil para inhibir trastornos de proliferación celular caracterizados por una hiperactividad y/o actividad inapropiada de la c-kit-quinasa.

Antecedentes de la invención

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se proporciona para facilitar la comprensión de la invención, pero no pretende describir ni definir el estado anterior de la técnica.

La señalización del kit es crítica para el desarrollo gonadal fetal y continúa teniendo un papel importante en la fertilidad de los adultos (Mauduit y col., Human Reproduction Update 5, 535-545, 1999). En ausencia del SCF se inhibe la espermatogénesis (Ohta y col., Development 127, 2125-2131, 2000) o la capacidad del kit para señalizar a través de la vía de la PI3-quinasa (Blume-Jensen y col., Nature Genetics 24, 157-162, 2000; Kissel y col., EMBO Journal 19, 1312-1326, 2000). Se ha observado que la expresión del kit es más baja en testículos subfértiles que en tejido testicular normal (Feng y col., Fertility & Sterility 71, 85-89, 1999). La señalización del kit es importante para la oogénesis y para la foliculogénesis (Parrott & Skinner, Endocrinology 140, 4262-4271, 1999; Driancourt y col., Reviews of Reproduction 5, 143-152, 2000). Estas observaciones sugieren que los inhibidores de la kit-quinasa podrían reducir tanto la fertilidad masculina como la femenina.

Como mediador clave de la función de los mastocitos, el kit desempeña un papel importante en las patologías asociadas con los mastocitos. Por ejemplo, los mastocitos se han asociado con la fibrosis intersticial en el rechazo crónico de injertos renales ajenos humanos (Pardo y col., Virchows Archiv 437, 167-172, 2000). Los mastocitos se cree que intervienen además en el rechazo del injerto hepático ajeno (Yamaguchi y col., Hepatology 29, 133-139, 1999) y en la fibrosis hepática, en la que las células asteriformes hepáticas producen el SCF que recluta a los mastocitos (Gaca y col., J. Hepatology 30, 850-858, 1999). Estas observaciones sugieren que los inhibidores de la kit-quinasa pueden ser útiles para prevenir el rechazo de órganos y la fibrosis.

Las células cebadas o mastocitos intervienen en la patología de la esclerosis múltiple (Secor y col., J. Experimental Medicine 191, 813-822, 2000) y en la lesión de isquemia por reperfusión (Andoh y col., Clinical & Experimental Immunology 116, 90-93, 1999) en modelos experimentales empleando ratones con receptores mutantes de kit, que son deficientes en mastocitos. En ambos casos, la patología de la enfermedad se atenúa significativamente en lo que respecta a los ratones con poblaciones normales de kit y de mastocitos. Por tanto, el papel de los mastocitos en estas enfermedades sugiere que los inhibidores de la kit-quinasa pueden ser agentes terapéuticos valiosos.

La transducción de señales celulares es un mecanismo fundamental, mediante este mecanismo los estímulos extracelulares se introducen en el interior de las células y a continuación regulan diversos procesos celulares. Uno de mecanismos bioquímicos claves de la transducción de señales consiste en la fosforilación reversible de proteínas. La fosforilación de polipéptidos regula la actividad de proteínas maduras alterando su estructura y su funcionamiento. El fosfato reside con gran frecuencia en los restos hidroxilo (-OH) de la serina, treonina y los aminoácidos de tirosina de las proteínas.

Las enzimas que median la fosforilación de efectores celulares por lo general pueden subdividirse en dos grupos. El primer grupo está formado por las proteína-quinasas que transfieren un resto fosfato de la adenosina-trifosfato a sustratos proteicos. El segundo grupo está formado por proteína-fosfatasas que hidrolizan los restos fosfato de los sustratos de proteínas fosforiladas. Las funciones inversas de las proteína-quinasas y de las proteína-fosfatasas equilibran y regulan el flujo de señales en los procesos de transducción de señales.

Las proteína-quinasas y las proteína-fosfatasas se dividen por lo general en dos grupos: las proteínas de tipo receptor y de tipo no receptor. La mayoría de las proteína-tirosina-fosfatasas de tipo receptor contienen dos dominios catalíticos conservados, cada uno de ellos abarca un segmento de 240 residuos aminoácido, ver Saito y col., Cell Growth and Diff. 2, 59-65, 1991. Las proteína-tirosina-fosfatasas de tipo receptor pueden subdividirse en grupos atendiendo a la diversidad de secuencias de aminoácidos de sus dominios extracelulares, ver Saito y col., lugar citado; Krueger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 7417-7421, 1992.

Las proteína-quinasas y las proteína-fosfatasas se dividen también típicamente en tres grupos, tomando en consideración a los aminoácidos sobre los que actúan. Algunas catalizan la adición o la hidrólisis de fosfato únicamente de la serina o de la treonina, algunos catalizan la adición o la hidrólisis de fosfato únicamente de la tirosina y algunos catalizan la adición o la hidrólisis del fosfato de la serina, treonina y tirosina.

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Las tirosina-quinasas pueden regular la actividad catalítica de otras proteína-quinasas que intervienen en la proliferación celular. Las proteína-quinasas que despliegan una actividad inadecuada pueden intervenir también en algunos tipos de cáncer. Los niveles anormalmente altos de proliferación celular se asocian con proteína-quinasas de tipo receptor o de tipo no receptor que tienen una actividad descontrolada.

Además de su papel en la proliferación celular se cree que las proteína-quinasas intervienen en los procesos de diferenciación celular. La diferenciación celular tiene lugar en algunas células a través de la estimulación del factor de crecimiento nervioso (NGF) o del factor de crecimiento epidérmico (EGF). La diferenciación celular se caracteriza por el rizado rápido de las membranas, el alisado de las células y el aumento de la adhesión celular (Chao, Cell 68, 995-997, 1992).

En un esfuerzo por descubrir nuevos tratamientos del cáncer y de otras enfermedades, los investigadores biomédicos y los químicos han diseñado, sintetizado y probado moléculas que inhiben la función de las proteína-quinasas. Algunas moléculas orgánicas pequeñas forman un grupo de compuestos que modulan la función de las proteína-quinasas. Son ejemplos de moléculas, de las que se ha descrito que inhiben la función de las proteína-quinasas, los compuesto arilo monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT WO 92/20642), los derivados de vinileno-azaindol (PCT WO 94/14808), las 1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas (patente US-5 330 992), los compuestos estirilo (ver Levitzki col., patente US-5 217 999, titulada ``Styryl Compound which Inhibit EGF Receptor Protein Tyrosine Kinase, Lyon & Lyon, docket nº 208/050), los compuestos piridilo sustituidos por estirilo (patente US-5 302 606), ciertos derivados de quinazolina (solicitud de patente EP-0 566 266-A1), los selenoindoles y los selenuros (PCT WO 94/03427), los compuestos
polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y los compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495).

Los compuestos que pueden atravesar las membranas celulares y son resistentes a la hidrólisis ácida son agentes terapéuticos potencialmente ventajosos por el hecho de convertirse en altamente biodisponibles después de la administración oral a los pacientes. Sin embargo, muchas de estos inhibidores de proteína-quinasas inhiben escasamente la función de las proteína-quinasas. Además pueden inhibir una gran variedad de proteína-quinasas y, por tanto, pueden provocar múltiples efectos secundarios cuando se aplican como agentes terapéuticos para tratar enfermedades.

A pesar de los progresos significativos que se han conseguido en el desarrollo de compuestos para el tratamiento del cáncer, sigue habiendo demanda en la técnica de estructuras y modelos de sustitución específicos que permitan obtener compuestos capaces de modular la función de proteína-quinasas concretas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de compuestos de indolinona para modular la función de proteína-quinasas con estos compuestos.

La presente invención se refiere a compuestos de indolinona que inhiban de modo potente las proteína-quinasas de tipo receptor del grupo c-kit y a productos y métodos relacionados. Otros inhibidores y/o activadores de c-kit-proteína-quinasas pueden obtenerse añadiendo sustituyentes químicos a los compuestos de indolinona no sustituidos (ver siguientes fórmulas I y II). Los compuestos utilizados en la invención proporcionan agentes terapéuticos y/o profilácticos de enfermedades asociadas con una o varias c-kit-proteína-quinasas funcionales. Ciertos tipos de cáncer forman parte de este tipo de enfermedades, así como ciertos trastornos inmunes asociados con la sobreproducción o la sobreestimulación de los mastocitos. Los compuestos pueden modificarse para hacerlos específicos de su diana o dianas y por lo tanto provocarán pocos efectos secundarios. Estas propiedades constituyen mejoras significativas respecto a los productos anticancerosos convencionales utilizados actualmente, ya que estos provocan múltiples efectos secundarios y debilitan a los pacientes de forma nociva.

Los compuestos utilizados en esta invención reducirán al mínimo o destruirán ciertos tipos de tumores sólidos y leucemias, inhibiendo la actividad de las c-kit-proteína-quinasas de tipo receptor o, por lo menos, modularán o inhibirán el crecimiento tumoral y/o las metástasis. Ciertos tipos de cáncer, por ejemplo el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), se expresan tanto en c-kit-proteína-quinasas de tipo receptor como en el factor celular germinal (SCF), un ligando de c-kit.

Para llevar a la práctica la presente invención no se requiere una comprensión exacta del mecanismo, por el que los compuestos inhiben las fosfotirosina-quinasas (PKT) (p.ej. las c-kit-quinasas de tipo receptor, un receptor de factor de crecimiento de tirosina-quinasa transmembrana), pero se cree que los compuestos interaccionan con los aminoácidos de la región catalítica de las PKT. Las PKT poseen como es sabido una estructura bilobulada y el ATP parece que se fija sobre la hendidura existente entre ambos lóbulos, en una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PKT; se cree que los inhibidores de las PKT se fijan sobre las PKT mediante interacciones no covalentes, por ejemplo un puente de hidrógeno, en la misma región general, en la que el ATP se fija sobre las PKT. Se cree más concretamente que el componente oxindol (ver siguiente fórmula III) de los compuestos de la presente invención se fija sobre el mismo espacio general ocupado por el anillo adenina del ATP. La especificidad de un inhibidor de PKT por una PKT concreta puede atribuirse a las interacciones entre los constituyentes en torno al núcleo oxindol con los dominios de aminoácidos específicos de la PK individual. Por ello, diferentes sustituyentes pueden contribuir a la fijación preferente sobre PK concretas. La capacidad de seleccionar estos compuestos activos en diferentes posiciones de fijación de ATP los convierte en útiles para impactar sobre cualquier proteína que posea tal posición, incluidas no solo las proteína-tirosina-quinasas, sino también las serina/treonina-quinasas. Por consiguiente, estos compuestos son útiles para ensayos "in vitro" con tales proteínas y para conseguir efectos terapéuticos "in vivo" a través de dichas proteínas. Por ejemplo, tal como se ha mencionado antes, ciertos tipos de cáncer expresan tanto la c-kit-proteína-quinasa de tipo receptor como el factor celular germinal (SCF) y este apareamiento constituirá un bucle autocrino de estimulación del crecimiento de estas células cancerosas. Por lo tanto, la inhibición de la c-kit-proteína-quinasa puede desbaratar este bucle autocrino y, de este modo, retrasar el crecimiento tumoral y/o destruir los tumores a través del mecanismo normal de la apóptosis.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona el uso definido en la reivindicación 1 para tratar o prevenir un estado patológico de un organismo definido a continuación. El estado patológico está asociado con una aberración del conducto de transducción de señales, mediada por una interacción entre la c-kit-quinasa y un reactivo natural de fijación. La composición se administra al organismo en forma de una cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto de indolinona. El compuesto de indolinona modula la interacción entre la c-kit-quinasa y un reactivo natural de fijación. Por lo tanto, la promoción o el desbaratamiento (con preferencia el desbaratamiento) de esta interacción tendrá previsiblemente efectos terapéuticos en una población determinada de pacientes que necesiten tal tratamiento. En una forma preferida de ejecución, la cantidad de señalización que pasa a través de la c-kit-quinasa es anormal y el compuesto facilita o desbarata dicha señalización.

El término "tratamiento" indica que tiene un efecto terapéutico y un alivio o reducción por lo menos parcial de un estado patológico en un organismo. El término "tratamiento" indica con preferencia una mejora de un síntoma de un estado patológico en un grupo de pacientes, al que se administra la indolinona, con respecto a un grupo de control, que no recibe la indolinona. Puede hacerse el seguimiento del efecto del tratamiento midiendo el cambio o la ausencia de cambio en un fenotipo celular, el cambio o ausencia de cambio en la proliferación celular, el cambio o ausencia de cambio en la actividad catalítica de esta c-kit-proteína-quinasa y el cambio o ausencia de cambio en la interacción entre esta proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación. El término "tratamiento" no necesariamente indica la curación total. Cualquier tipo de alivio de los síntomas molestos de la enfermedad en cualquier grado o cualquier reducción del progreso de una enfermedad pueden considerarse también como tratamientos. El tratamiento puede incluir además actos, que empeoren la sensación o aspecto del estado general de salud del paciente. Por ejemplo, la administración de quimioterapia a pacientes de cáncer, que puede provocar que los pacientes se sientan todavía "más enfermos", se considera también un tratamiento.

El término "actividad catalítica", empleado antes en el contexto de la invención, indica el grado de fosforilación de un sustrato causado por una proteína-quinasa. La actividad catalítica puede medirse por ejemplo determinando la cantidad de un sustrato que se ha convertido en un producto en función del tiempo. La fosforilación del sustrato tiene lugar en el sitio activo de una proteína-quinasa. El sitio activo es normalmente una cavidad, en la que el sustrato se fija sobre la proteína-quinasa y se fosforila.

El término "sustrato" empleando antes indica una molécula fosforilada por una proteína-quinasa. El sustrato es con preferencia un péptido y con mayor preferencia una proteína.

El término "prevención" indica la disminución de la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle un estado patológico. El término "prevención" indica con preferencia la reducción del porcentaje de individuos que desarrollan el estado patológico, cuando se comparan con un grupo de control al que no se administra la indolinona.

El término "estado patológico" indica una función de las células o tejidos de un organismo que se desvía de sus funcionales normales en el organismo. Un estado patológico puede referirse a la proliferación celular, la diferenciación celular o la supervivencia celular. Los estados patológicos incluyen la mastocitosis, la presencia de uno o varios tumores de mastocitos, el asma, la rinitis crónica asociada con la alergia y los tumores de estroma gastrointestinal. En una forma preferida de ejecución, estos estados patológicos, por ejemplo los tumores de mastocitos y la mastocitosis, surgen en organismos no humanos y por ello pueden prevenirse o tratarse durante la práctica de la medicina veterinaria.

Los estados patológicos de supervivencia celular se refieren a los estados en los que se activan o se eliminan los mecanismos de muerte celular programada (apóptosis). Un gran número de proteína-quinasas están asociadas con los mecanismos de apóptosis. Las aberraciones de la función de una cualquiera de las proteína-quinasas podrían conducir a la inmortalidad celular o a la muerte celular prematura.

El término "función" empleado en relación con una proteína-quinasa indica el rol celular de una proteína-quinasa, con preferencia una c-kit-quinasa. El grupo de las proteína-quinasas incluye los miembros que regulan muchos pasos de las cascadas de señalización, incluidas las cascadas de control del crecimiento celular, la migración, la diferenciación, la expresión genética, las contracciones musculares, el metabolismo de la glucosa, la síntesis de proteínas celulares y la regulación del ciclo celular. La "función" de una quinasa de membrana de tipo receptor consiste usualmente en transducir una señal procedente del exterior de la membrana e introducirla en el interior de la célula. Para efectuarlo se pueden realizar una o varias de las funciones siguientes: fijación sobre un ligando, dimerización para formar otra quinasa de membrana de tipo receptor, fosforilar otras proteínas del interior de la célula y provocar la localización de las proteínas dentro de la célula.

El término "organismo" indica cualquier entidad viva que contenga por lo menos una célula. Un organismo puede ser tan sencillo como una célula eucariótica y tan complejo como un mamífero. El organismo es con preferencia un mamífero, con mayor preferencia un ser humano.

El término "mamífero" indica con preferencia los organismos del tipo ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas y cabras, con mayor preferencia gatos, perros y monos. En las formas preferidas de ejecución, el estado patológico asociado con los mamíferos puede incluir la mastocitosis y la presencia de uno o varios tumores de mastocitos.

El término "aberración" indica una proteína-quinasa, es decir, una c-kit-proteína-quinasa que se sobre- o infra-expresa en un organismo, que ha sufrido una mutación tal que su actividad catalítica es menor o mayor que la actividad de la proteína-quinasa de tipo salvaje, ha sufrido una mutación tal que ya no puede interaccionar con su reactivo natural de fijación, no puede funcionar ya en el bucle autocrino dentro de la célula, ya no puede modificarse por otra proteína-quinasa ni proteína-fosfatasa, o ya no interacciona con un reactivo natural de fijación. La aberración incluye con preferencia una señalización excesiva o deficiente después de la interacción con un reactivo natural de fijación.

El término "conducto de transducción de señales" indica a las moléculas que propagan una señal extracelular a través de la membrana celular para convertirla en una señal intracelular. A continuación, esta señal puede estimular una respuesta celular. Las moléculas de polipéptidos que intervienen en los procesos de transducción de señales incluyen proteína-tirosina-quinasas de tipo receptor y de tipo no receptor, las proteína-fosfatasas de tipo receptor y de tipo no receptor, las proteínas que contienen los dominios 2 y 3 de homología SRC, las proteínas de fijación sobre fosfotirosinas (homología SRC 2 (SH2) y las proteínas que contienen el dominio de fijación sobre fosfotirosina (PTB y PH), las proteínas de fijación ricas en prolina (proteínas que contienen el dominio SH3), las GTPasas, las fosfodiesterasas, las fosfolipasas, las prolil-isomerasas, las proteasas, las proteínas de fijación de Ca^{2+}, las proteínas de fijación de cAMP, las guanil-ciclasas, las adenilil-ciclasas, las proteínas que generan NO, los factores de intercambio de nucleótidos y los factores de transcripción.

El término "mediado" indica la intervención en el control o efecto de la interacción entre la c-kit-quinasa y los reactivos naturales de fijación en la aberración del conducto de transducción de señales. Por lo tanto, el conducto de transducción de señales que tiene una aberración y está asociado a un estado patológico contiene una c-kit-quinasa que interacciona con un reactivo natural de fijación.

La "interacción" de una molécula de c-kit-quinasa es la fijación de esta molécula de c-kit-quinasa sobre un reactivo o molécula natural de fijación, que se halla dentro de la célula, o la fosforilación causada por la molécula de c-kit-quinasa de otra proteína o molécula que se halla dentro de la célula, o cualquier otra asociación de la c-kit-quinasa en el interior de la célula. Estas interacciones incluye las interacciones no covalentes, por ejemplo un puente de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas y enlace iónico.

El término "c-kit-quinasa" indica una proteína-tirosina-quinasa de membrana de tipo receptor, que se activa con preferencia por fijación de un factor celular germinal (SCF) sobre su dominio extracelular (Yarden y col., 1987; Qiu y col., 1988). La c-kit-tirosina-quinasa de tipo receptor contiene 5 motivos de tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular y un dominio citoplásmico de quinasa "split" (dividida), ver figura 1. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de una c-kit-quinasa es con preferencia la definida por Yarden y col., EMBO J. 11, 3341-3351, 1987; y Qiu y col., EMBO J. 7, 1003-1011, 1988. El término "c-kit-quinasa" abarca también las versiones mutantes de la c-kit-quinasa e incluye a las que pertenecen a los dos grupos siguientes: (1) las que tienen una sola sustitución de aminoácido en el codón 816 de la c-kit-quinasa humana o su posición equivalente de otras especies (Ma y col., J. Invest. Dermatol. 112, 165-170, 1999); y (2) las que tienen mutaciones que implican la hélice z yuxtamembrana putativa de la proteína (Ma y col., J. Biol. Chem. 274, 13399-13402, 1999).

El término "reactivo natural de fijación" significa un polipéptido o un compuesto, por ejemplo el ATP, que se fija a la proteína-quinasa de las células. Los reactivos naturales de fijación pueden desempeñar un rol en la propagación de una señal en un proceso de transducción de señales de proteína-quinasa. Un cambio en la interacción entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación puede manifestar por sí mismo una probabilidad mayor o menor de que la interacción se forme o una concentración mayor o menor del complejo de la proteína-quinasa/reactivo natural de fijación.

Una cantidad "terapéuticamente eficaz" indica una cantidad de un compuesto que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto tratado. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las atribuciones de los expertos en la materia, en especial a la luz de la descripción detallada que sigue. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" referida al tratamiento del cáncer indica una cantidad suficiente para lograr uno o varios de los resultados siguientes: reducir el tamaño del cáncer, inhibir la metástasis del cáncer, inhibir la expansión del cáncer, interrumpir la expansión del cáncer, atenuar las molestias producidas por el cáncer o prolongar la vida del paciente afectado por el cáncer. Una cantidad "terapéuticamente eficaz" referida al tratamiento de un trastorno de proliferación celular diferente del cáncer, indica una cantidad suficiente para proporcionar uno o varios de los efectos siguientes: inhibir el crecimiento de las células que provocan el trastorno, aliviar las molestias provocadas por el trastorno o prolongar la vida el paciente afectado por dicho trastorno.

El término "indolinona" tiene el significado entendido habitualmente en la técnica e incluye un amplio subgrupo de compuestos sustituidos o sin sustituir que pueden sintetizarse a partir de un resto aldehído y de un resto oxindol. En las formas preferidas de ejecución, las indolinonas incluidas en el presente método tienen las estructuras de las fórmulas I y II (ver más abajo) y con mayor preferencia se eligen entre los compuestos de uno a trece (ver más
abajo).

Los ejemplos de compuestos indolinona representativos y la síntesis de los mismos se describen en las solicitudes siguientes: (1) solicitud PCT número US-99/06468, depositada con fecha 26 de marzo de 1999 por Fong y col. y titulada: Methods of modulating tyrosine protein kinase (Lyon & Lyon, docket número 231/250 PCT); (2) solicitud provisional US nº 60/131 192, depositada con fecha 26 de abril de 1999 por Tang y col. y titulada: Diaryl indolinone compounds as kinase inhibitors (Lyon & Lyon, docket número 239/205); (3) solicitud provisional US nº 60/132 243, depositada con fecha 3 de mayo de 1999 por Tang y col. y titulada: Synthesis of 4-substituted oxindole and indolinone compounds and their use in treatment of disease (Lyon & Lyon, docket número 231/251); (4) solicitud U.S. 09/283 657, depositada con fecha 1 de abril de 1999 por Tang y col., y titulada: Methods of modulating tyrosine protein kinase function with indolinone compounds (Lyon & Lyon, docket número 241/180); y (5) patente US nº 5 792 873, publicada con fecha 11 de agosto de 1998 por Tang y col., titulada: 3-Heteroaryl-2-indolinone compounds for the treatment of disease.

Los compuestos empleados en la invención son uno de los siguientes:

Compuesto uno, que sigue:

1

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Compuesto dos, que sigue:

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Compuesto tres, que sigue:

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Compuesto cuatro, que sigue:

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Compuesto cinco, que sigue:

5

Compuesto seis, que sigue:

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Compuesto siete, que sigue:

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Compuesto ocho, que sigue:

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Compuesto nueve, que sigue:

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Compuesto diez, que sigue:

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Compuesto once, que sigue:

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Compuesto doce, que sigue:

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Compuesto trece, que sigue:

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Compuesto catorce, que sigue:

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Compuesto quince, que sigue:

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Compuesto dieciséis, que sigue:

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Los compuestos de indolinona empleados en la invención modulan con preferencia la actividad de la proteína-tirosina-quinasa "in vitro". Estos compuestos presentan con preferencia resultados positivos en uno o en varios ensayos "in vitro" para determinar una actividad correspondiente al tratamiento de la enfermedad o trastorno en cuestión (por ejemplo los ensayos descritos en los ejemplos que siguen). La proteína-tirosina-quinasa que se modula con los compuestos de indolinona empleados en la invención es con preferencia la c-kit-quinasa. En los ejemplos que siguen se describen procedimientos ilustrativos y resultados obtenidos con los mismos para tal modulación.

El término "modula" indica la alteración de la función de una proteína-quinasa aumentando o disminuyendo la probabilidad de que se formen un complejo entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación. Un modulador aumenta con preferencia la probabilidad de que se forme tal complejo entre la proteína-quinasa y el reactivo natural de fijación, con mayor probabilidad aumenta o disminuye la probabilidad de que se forme un complejo entre la proteína-quinasa y el reactivo natural de fijación dependiendo de la concentración del compuesto expuesto a la proteína-quinasa y con preferencia especial disminuye la probabilidad de formación del complejo entre la proteína-quinasa y el reactivo natural de fijación. Un modulador activa con preferencia la actividad catalítica de una proteína-quinasa en función de la concentración del compuesto expuesto a la proteína-quinasa o con preferencia especial inhibe la actividad catalítica de la proteína-quinasa.

El término "complejo" significa la unión por lo menos de dos moléculas fijadas una sobre otra. Los complejos de transducción de señales contienen a menudo por lo menos dos moléculas de proteína unidas una a la otra.

El término "activa" indica el aumento de la función de una proteína-quinasa. La función de la proteína-quinasa es con preferencia la interacción con un reactivo natural de fijación y con preferencia especial la actividad catalítica.

El término "inhibe" indica la disminución de la función de una proteína-quinasa. La función de la proteína-quinasa es con preferencia la interacción con un reactivo natural de fijación y con preferencia especial la actividad catalítica.

Un reactivo natural de fijación de una proteína-quinasa puede fijarse sobre una región extracelular o intracelular de la proteína-quinasa con alta afinidad. Alta afinidad significa una constante de equilibrio de fijación del orden de 10^{-6} M o menos. Además, un reactivo natural de fijación puede interacción también de modo transitorio con una región extracelular o intracelular de una proteína-quinasa y modificarla químicamente. Los reactivos naturales de fijación de proteína-quinasas se eligen entre un grupo que incluye, pero no se limita a: dominios 2 (SH2) ó 3 de homología SRC, otros dominios de fijación de fosforil-tirosina (PTB), factores de intercambio de nucleótidos de guanina, proteína-fosfatasas, otras proteína-quinasas y compuestos de tipo ATP. Los métodos para determinar los cambios en las interacciones entre las proteína-quinasas y sus reactivos naturales de fijación ya están disponibles en la técnica.

El término "se refiere a" indica una enfermedad, de la que se ha observado que suele ir acompañada de una expresión inapropiada de la c-kit-quinasa, cuando se compara con el mismo tejido sano, aislado del organismo. La expresión inapropiada puede ser una elevación de las actividades normales, una depresión de las actividades normales, o la presencia de la actividad de la c-kit-quinasa, en aquellas situaciones en las que normalmente no existe actividad de este tipo.

El término "in vitro" indica que la c-kit-quinasa se ensaya fuera de un organismo vivo con un compuesto útil para esta invención, explorándose la eficacia de tales compuestos. El término "in vitro" incluye el uso de células de cultivo hístico.

El término "promueve o desbarata la interacción anormal" indica un método que puede llevarse a la práctica administrando un compuesto de la invención a células o tejidos de un organismo. Un compuesto puede facilitar la interacción entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación formando interacciones favorables mediante múltiples átomos de la interfase del complejo. Como alternativa, un compuesto puede inhibir una interacción entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación desbaratando las interacciones favorables formadas entre los átomos en la interfase del complejo. En las formas preferidas de ejecución, la promoción o el desbaratamiento de una interacción
anormal se refiere al compuesto de la invención que promueve un cambio conformacional en una de las proteínas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama esquemático que presenta 5 motivos de tipo inmunoglobulina del dominio extracelular y un dominio citoplásmico de quinasa "split" (dividida) de la c-kit-quinasa. Los semi-bucles representan los motivos de tipo inmunoglobulina y los recuadros sombreados representan la región conservada de la quinasa de los receptores.

En la figura 2 se representan los efectos de los derivados de indolinona en la actividad de la c-kit-quinasa, determinados en un ensayo ELISA descrito en el ejemplo 1 de la sección experimental.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos, compuestos y composiciones capaces de regular y/o modular la transducción de señales celulares y, en las formas de ejecución preferidas, la transducción de señales de la c-kit-quinasa.

La transducción de señales mediada por quinasas de tipo receptor se inicia con la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) y posterior dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de la proteína-quinasa y fosforilación.

Para ello se crean las posiciones de fijación de las moléculas de transducción de señales intracelulares, que conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmica, que facilitan la respuesta celular apropiada (p.ej. la división celular, los efectos metabólicos sobre el microentorno extracelular), véase Schlessinger y Ullrich, Neuron 9, 303-391, 1992.

La transducción de señales de quinasa produce, entre otras respuestas, la proliferación celular, la diferenciación celular y el metabolismo. Una proliferación celular anormal puede traducirse en un amplio abanico de trastornos y enfermedades, incluida el desarrollo de neoplasias, tales como el carcinoma, el sarcoma, la leucemia, el glioblastoma, la psoriasis, la arteriosclerosis, la artritis y la retinopatía diabética (y otros trastornos denominados angiogénesis y/o vasculogénesis descontroladas).

Esta invención se refiere además al uso de compuestos y composiciones que regulan, modulan y/o inhiben la transducción de señales de quinasas que afectan la actividad enzimática de quinasas de tipo receptor e interfieren en la señal transducida por tales proteínas. Más en concreto, la presente invención se refiere al uso de compuestos y composiciones que regulan, modulan y/o inhiben la c-kit-tirosina-quinasa de tipo receptor como estrategia terapéutica para curar muchos tipos de enfermedades relacionadas. La presente invención se refiere, pues, al tratamiento y/o prevención de estados patológicos caracterizados por la sobreexpresión de mastocitos, o por la regulación excesiva inapropiada de mastocitos, incluyendo, pero sin limitarse a ellas: la mastocitosis y la rinitis crónica asociada con la alergia, la inflamación y el asma. Estos estados patológicos se describen seguidamente con mayor detalle.

I. Enfermedades a tratar con los compuestos empleados en esta invención

Los compuestos descritos son útiles para el tratamiento de trastornos debido a la transducción descontrolada de señales de quinasas, incluidos los trastornos de proliferación celular, los trastornos fibróticos y los trastornos metabólicos. Los trastornos de proliferación celular que pueden tratarse o estudiarse con mayor profundidad mediante la presente invención incluyen los cánceres y los trastornos de proliferación de mastocitos.

Las PKT se han asociado con tales trastornos de proliferación celular. Por ejemplo, algunos miembros del grupo de las tirosina-quinasas de tipo receptor (RTK) se han asociado con el desarrollo del cáncer. Algunos de tales receptores, por ejemplo el EGFR (Tuzi y col., Br. J. Cancer 63, 227-233, 1991; Torp y col., APMIS 100, 713-719, 1992), el HER2/neu (Slamon y col., Science 244, 707-712, 1989) y el PDGF-R (Kumabe y col., Oncogene 7, 627-633, 1992) se sobreexpresan en muchos tumores y/o se activan de modo persisten por bucles autocrinos. De hecho, en los cánceres más habituales y severos se han demostrado estas sobreexpresiones de receptor (Akbasak y Suner-Akbasak y col., J. Neurol. Sci. 111, 119-133, 1992; Dickson y col., Cancer Treatment Res. 61, 249-273, 1992; Korc y col., J. Clin. Invest. 90, 1352-1360, 1992) y los bucles autocrinos (Lee y Donoghue, J. Cell. Biol. 118, 1057-1070, 1992; Korc y col., lugar citado; Akbasak y Suner-Akbasak y col., lugar citado). Por ejemplo, se ha asociado el receptor AGFR con el carcinoma de células escamosas, el astrocitoma, el glioblastoma, el cáncer de cabeza y cuello, el cáncer de pulmón y el cáncer de vejiga. El HER2 se ha asociado con el cáncer de mama, de ovarios, de estómago, de pulmón, de páncreas y de vejiga. El PDGF-R se ha asociado con el glioblastoma, el cáncer de pulmón, de ovarios, el melanoma y el cáncer de próstata.

La c-kit-quinasa de tipo receptor se ha asociado con tales trastornos proliferativos. Por ejemplo se ha encontrado que el receptor de c-kit-quinasa se expresa de forma aberrante en más de la mitad de las células SCLC estudiadas junto con su ligando SCF (Hibi y col., Oncogene 6, 2291-2296, 1991). Potencialmente, la inhibición de la c-kit-quinasa mejorará a largo plazo la supervivencia de los pacientes aquejados de SCLC.

La presencia de la c-kit-RTK y/o el SCF se ha asociado también con otros tipos de cáncer, que se describen a continuación. Sin embargo, la asociación de las anormalidades de las RTK y las enfermedades no se restringe el cáncer. Por ejemplo la c-kit-quinasa de tipo receptor se ha asociado con enfermedades inmunes, tales como la mastocitosis, el asma y la rinitis crónica. La activación excesiva de la c-kit puede estar asociada con enfermedades resultantes de la sobreabundancia de mastocitos. La mastocitosis es el término empleado para describir una serie heterogénea de trastornos caracterizados por una proliferación excesiva de mastocitos (Metcalfe, J. Invest. Derm. 93, 2S-4S, 1991; Valent, Wein/Klin. Wochenschr. 108, 385-397, 1996; y Golkar y col., Lancet 349, 1379-1385, 1997). Se ha publicado que una expresión elevada de la c-kit en mastocitos de pacientes que sufren mastocitosis agresiva, pero no en mastocitos de pacientes que sufren mastocitosis indolente (Nagata y col., Leukemia 12, 175-181, 1998).

Además, los mastocitos y los eosinófilos constituyen las células clave que intervienen en la alergia, la inflamación y el asma (Thomas y col., Gen. Pharmacol. 27, 593-597, 1996; Metcalfe y col., Physiol. Rev. 77, 1033-1079, 1997; Holgate, CIBA Found. Symp. 1997; Naclerio y col., JAMA 278, 1842-1848, 1997; y Costa y col., JAMA 278, 1815-1822, 1997).

El SCF y por tanto la c-kit regulan directa o indirectamente la activación tanto de los mastocitos como de los eosinófilos, influyendo pues en las células primarias que intervienen en la alergia y el asma a través de múltiples mecanismos. Debido a esta regulación mutua de la función de mastocitos y eosinófilos y al rol que el SCF puede desempeñar en esta regulación, la inhibición de la c-kit-quinasa puede proporcionar un medio para tratar la rinitis crónica asociada con la alergia, la inflamación y el asma.

II. c-kit-quinasa

La c-kit-quinasa desempeña un papel fundamental en el desarrollo de melanocitos, mastocitos, células germinales y células hematopoyéticas. La proteína codificada por el locus SI se ha llamado ligando "kit" (KL), factor celular germinal (SCF) o factor de crecimiento de mastocitos (MGF), basándose en las propiedades biológicas empleadas para identificarla (ver revisión en Tsujimura, Pathol. Int. 46, 933-938, 1996; Loveland y col., J. Endocrinol. 153, 337-344, 1997; Vliagoftis y col., Clin. Immunol. 100, 435-440, 1997; Broudy, Blood 90, 1345-1364, 1997; Pignon, Hematol. Cell. Ther. 39, 114-116, 1997; y Lyman y col., Blood 91, 1101-1134, 1998). Para simplificar, utilizaremos el SCF para designar al ligando de la c-kit-RTK. Se sintetiza el SCF en forma de proteína transmembrana con un peso molecular de 220 a 248 daltones, dependiendo del empalme alternativo del mRNA para codificar al exón 6. La proteína mayor puede escindirse proteolíticamente para formar una proteína glucosilada soluble, que dimeriza de forma no covalente. Tanto las formas solubles como la fijada sobre membrana del SCF pueden fijarse sobre la c-kit y activarla. Por ejemplo, en la piel, el SCF se expresa de modo predominante mediante fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales, que modulan la actividad de los melanocitos y mastocitos que expresan la c-kit. En el hueso, las células del estroma de la médula expresan el SCF y regulan la hematopoyesis de las células germinales que expresan la c-kit. En el tracto gastrointestinal, las células epiteliales intestinales expresan el SCF y afectan a las células intersticiales de Cajal y a los linfocitos intraepiteliales. En los testículos, las células de Sertoli y las células granulosas expresan el SCF que regula la espermatogénesis por interacción de la c-kit de las células germinales.

a. Enfermedades malignas a tratar, que implican la c-kit-quinasa y/o el SCF

La expresión y/o activación aberrantes de la c-kit intervienen en una gran variedad de tumores. Los indicios de la contribución de la c-kit a la patología neoplásica incluyen su asociación con leucemias y tumores de mastocitos, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer testicular y algunos cánceres del tracto gastrointestinal y del sistema nervioso central (véase el texto que sigue). Además, la c-kit se ha implicado desarrollando un papel en la carcinogénesis del tracto genital femenino (Inoue y col., Cancer Res. 54 (11), 3049-3053, 1994), sarcomas de origen neuroectodérmico (Ricotti y col., Blood 91, 2397-2405, 1998) y neoplasia de células de Schwann asociada con neurofibromatosis (Ryan y col., J. Neuro. Res. 37, 415-432, 1994).

Leucemias

La fijación del SCF sobre la c-kit-RTK protege las células germinales hematopoyéticas y las células progenitoras contra la apóptosis (Lee y col., J. Immunol. 159, 3211-3219, 1997), contribuyendo de este modo a la formación de colonias y a la hematopoyesis. La expresión de la c-kit se observa con frecuencia en la leucemia mielocítica aguda (AML), pero es menos frecuente en la leucemia linfocítica aguda (ALL) (véase las revisiones de Sperling y col., Haemat. 82, 617-621, 1997; Escribano y col., Leuk. Lymph. 30, 459-466, 1998). Aunque la c-kit se expresa en la mayoría de las células de la AML, su expresión no parece un pronóstico del progreso de la enfermedad (Sperling y col., Haemat. 82, 617-621, 1997). Sin embargo, el SCF protege las células AML contra la apóptosis inducida por agentes quimioterapéuticos (Hassan y col., Acta Hem. 95, 257-262, 1996). La inhibición de la c-kit por la presente invención mejorará la eficacia de estos agentes y puede inducir la apóptosis de las células de la AML.

Se ha encontrado que el crecimiento clonal de células de pacientes que padecen síndrome mielodisplásico (Sawada y col., Blood 88, 319-327, 1996) o leucemia mielógena crónica (CML) (Sawai y col., Exp. Hem. 2, 116-122, 1996) resulta significativamente impulsado por el SCF en combinación con otras citocinas. La CML se caracteriza por la expansión de células positivas de cromosoma Filadelfia de la médula (Verfaillie y col., Leuk. 12, 136-138, 1998), que parece ser el resultado primario de la inhibición de la muerte por apóptosis (Jones, Curr. Opin. Onc. 9, 3-7, 1997). Se ha publicado que el producto del cromosoma Filadelfia, el p210^{BCR-ABL}, media en la inhibición de la apóptosis (Bedi y col., Blood 86, 1148-1158, 1995). Dado que tanto el p210^{BCR-ABL} como la c-kit-RTK inhiben la apóptosis y se ha sugerido como sustrato el p62^{dok} (Carpino y col., Cell 88, 197-204, 1997), es posible que la expansión clonal mediada por estas quinasas tenga lugar a través de un conducto de señalización común. Sin embargo, se ha publicado que la c-kit interacciona directamente con el p210^{BCR-ABL} (Hallek y col., Brit. J. Haem. 94, 5-16, 1996), lo cual sugiere que la c-kit puede tener un rol causal más acusado en la patología de la CML. Por consiguiente, la inhibición de la c-kit-quinasa podría ser útil para el tratamiento de los trastornos anteriores.

Cánceres gastrointestinales

La mucosa colorrectal normal no expresa la c-kit (Bellone y col., J. Cell Physiol. 172, 1-11, 1997). Sin embargo, la c-kit se expresa frecuentemente en el carcinoma colorrectal (Bellone y col., J. Cell Physiol. 172, 1-11, 1997) y se han observado bucles autocrinos de SCF y de c-kit en varias líneas celulares de carcinoma de colon (Toyota y col., Turn. Biol. 14, 295-302, 1993; Lahm y col., Cell Growth & Differ. 6, 1111-1118, 1995; Bellone y col., J. Cell Physiol. 172, 1-11, 1997). Además, el desbaratamiento del bucle autocrino por el uso de anticuerpos neutralizadores (Lahm y col., Cell Growth & Differ. 6, 1111-1118, 1995) y la regulación a la baja de la c-kit y/o del SCF inhiben de modo significativo la proliferación celular (Lahm y col., Cell Growth & Differ. 6, 1111-1118, 1995; Bellone y col., J. Cell Physiol. 172, 1-11, 1997).

Se han observado bucles autocrinos de SCF/c-kit en líneas celulares de carcinoma gástrico (Turner y col., Blood 80, 374-381, 1992; Hassan y col., Digest. Dis. Science 43, 8-14, 1998) y parece también que la activación constitutiva de la c-kit es un factor importante de los tumores del estroma gastrointestinal (GIST). Los GIST son los tumores más frecuentes de mesénquima del sistema digestivo. Más del 90% de los GIST expresan la c-kit, lo cual es consistente con el origen putativo de estas células tumorales a partir de las células intersticiales de Cajal (ICC) (Hirota y col., Science 279, 577-580, 1998). Se cree que las ICC regulan la contracción del tracto gastrointestinal y los pacientes que carecen de c-kit en sus ICC despliegan una forma miopática de pseudo-obstrucción intestinal idiopática crónica (Isozaki y col., Amer. J. of Gast. 9, 332-334, 1997). Se observa que la c-kit expresada en los GIST de varios pacientes diferentes tiene mutaciones en el dominio de yuxtamembrana intracelular que conducen a la activación constitutiva de esta RTK (Hirota y col., Science 279, 577-580, 1998). Por consiguiente, la inhibición de la c-kit-quinasa podría ser un medio eficaz para el tratamiento de estos cánceres.

Cánceres testiculares

Los tumores de células germinales masculinas se han dividido histológicamente en seminomas, que conservan las características de las células germinales, y no seminomas, que pueden presentar características de diferenciación embrionaria. Se cree que tanto los seminomas como los no seminomas se inician a partir de un estadio preinvasivo denominado carcinoma "in situ" (CIS) (Murty y col., Sem. Oncol. 25, 133-144, 1998). Se ha publicado que tanto la c-kit como el SCF son esenciales para el desarrollo normal de las gónadas durante la embriogénesis (Loveland y col., J. Endocrinol. 153, 337-344, 1997). La pérdida del receptor o del ligando se traduce en animales privados de células germinales. En los testículos postnatales, se ha encontrado que la c-kit se expresa en las células de Leydig y en la espermatogonia, mientras que el SCF se expresa en las células de Sertoli (Loveland y col., J. Endocrinol. 153, 337-344, 1997). Los tumores testiculares se desarrollan a partir de células de Leydig con gran frecuencia en ratones transgénicos que expresan los oncogenes E6 y E7 del virus 16 del papilloma humano (HPV16) (Kondoh y col., J. Virol. 65, 3335-3339, 1991; Kondoh y col., J. Urol. 152, 2151-2154, 1994). Estos tumores expresan tanto la c-kit como el SCF y un bucle autocrino puede contribuir a la génesis tumoral (Kondoh y col., Oncogene 10, 341-347, 1995) asociada con la pérdida celular del p53 funcional y el gen de retinoblastoma producto de la asociación del E6 con el E7 (Dyson y col., Science 243, 934-937, 1989; Werness y col., Science 248, 76-79, 1990; Scheffner y col., Cell 63, 1129-1136, 1990). Los mutantes defectuosos de señalización del SCF (Kondoh y col., Oncogene 10, 341-347, 1995) o la c-kit (Li y col., Canc. Res. 56, 4343-4346, 1996) inhiben la formación de tumores testiculares en ratones que expresan el HPV16-E6 y E7. La activación de la c-kit-quinasa es crucial para la génesis tumoral en estos animales y por tanto la modulación del conducto de la c-kit-quinasa con la presente invención permitirá impedir o tratar estos trastornos.

La expresión de la c-kit en tumores de células germinales pone de manifiesto que el receptor se expresa por la mayoría de carcinomas "in situ" y seminomas, pero la c-kit se expresa únicamente en una minoría de no seminomas (Strohmeyer y col., Canc. Res. 51, 1811-1816, 1991; Rajpert-de Meyts y col., Int. J. Androl. 17, 85-92, 1994; Izquierdo y col., J. Pathol. 177, 253-258, 1995; Strohmeyer y col., J. Urol. 153, 511-515, 1995; Bokenmeyer y col., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 301-306, 1996; Sandlow y col., J. Androl. 17, 403-408, 1996). Por lo tanto, la inhibición de la c-kit-quinasa proporcionará un nuevo medio valioso para tratar estos trastornos.

Cánceres del SNC

El SCF y la c-kit se expresan en todo el SNC de los roedores en desarrollo y los modelos de expresión sugieren que tienen un rol en el crecimiento, la migración y la diferenciación de las células neuroectodérmicas. Se ha publicado la expresión tanto del receptor como del ligando en el cerebro adulto (Hamel y col., J. Neuro-Onc. 35, 327-333, 1997). Se ha observado también la expresión de la c-kit en el tejido del cerebro humano normal (Tada y col., J. Neuro. 80, 1063-1073, 1994). El glioblastoma y el astrocitoma, que definen la mayoría de tumores intracraneales, aparecen por transformación neoplásica de los astrocitos (Levin y col., Principles & Practice of Oncology 2022-2082, 1997). Se ha observado la expresión de la c-kit en líneas celulares de glioblastoma y en tejidos (Berdel y col., Canc. Res. 52, 3498-3502, 1992; Tada y col., J. Neuro. 80, 1063-1073, 1994; Stanulla y col., Act. Neuropath. 89, 158-165, 1995).

La asociación de la c-kit con la patología del astrocitoma es menos clara. Se han publicado informes de la expresión de la c-kit en astrocitos normales (Natali y col., Int. J. Canc. 52, 197-201, 1992; Tada y col., J. Neuro. 80, 1063-1073, 1994), mientras que otros informan de que no se expresa (Kristt y col., Neuro. 33, 106-115, 1993). En el último caso se observan niveles elevados de expresión de la c-kit en tumores de grado alto (Kristt y col., Neuro. 33, 106-115, 1993), mientras que los primeros grupos son incapaces de detectar expresión alguna en los astrocitomas. Existen además artículos contradictorios sobre la expresión de la c-kit y del SCF en neuroblastomas. Un estudio describe que se ha encontrado que las líneas celulares de neuroblastoma expresan el SCF con frecuencia y raramente expresan la c-kit. En tumores primarios, la c-kit se detecta en un 8% de los neuroblastomas, mientras que el SCF se encuentra en un 18% de los tumores (Beck y col., Blood 86, 3132-3138, 1995). En cambio, otros estudios (Cohen y col., Blood 84, 3465-3472, 1994) han descrito que todas las 14 líneas celulares de neuroblastoma contienen bucles autocrinos de c-kit/SCF y se ha observado la expresión tanto del receptor como del ligando en un 45% de las muestras de tumores examinadas. En dos líneas celulares, los anticuerpos anti-c-kit inhiben la proliferación celular, lo cual sugiere que el bucle autocrino de SCF/c-kit contribuye al crecimiento (Cohen y col., Blood 84, 3465-3472, 1994). Por consiguiente, los inhibidores de la c-kit-quinasa han demostrado que son terapéuticamente útiles como medios para tratar estos
cánceres.

b. Enfermedades de mastocitos, en las que intervienen la c-kit-quinasa y/o el SCF y que pueden tratarse/prevenirse con la presente invención Mastocitosis

Tal como se ha mencionado antes, se ha publicado que la estimulación de la c-kit con el SCF (también conocido como factor de crecimiento de mastocitos) es esencial para el crecimiento y desarrollo de los mastocitos (Hamel y col., J. Neuro-Onco. 35, 327-333, 1997; Kitamura y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 107, 54-56, 1995). Los ratones con mutaciones de la c-kit, que atenúan su actividad de señalización, presentan un número significativamente menor de mastocitos en su piel (Tsujimura, Pathol. Int. 46, 933-938, 1996). La activación excesiva de la c-kit podría estar asociada con enfermedades resultantes de una sobreabundancia de mastocitos.

Mastocitosis es el término empleado para describir una serie heterogénea de trastornos caracterizados por una proliferación excesiva de mastocitos (Metcalfe, J. Invest. Derm. 93, 2S-4S, 1991; Valent, 1996; Golkar y col., Lancet 349, 1379-1385, 1997). La mastocitosis se limita a la piel en la mayoría de pacientes, pero puede afectar a otros órganos en un 15-20% de los pacientes (Valent, Wein/Klin. Wochenschr. 108, 385-397, 1996; Golkar y col., Lancet 349, 1379-1385, 1997). Incluso entre los pacientes de mastocitosis sistémica, la enfermedad puede variar entre un pronóstico relativamente benigno y una mastocitosis agresiva y la leucemia de mastocitos (Valent, Wein/Klin. Wochenschr. 108, 385-397, 1996; Golkar y col., Lancet 349, 1379-1385, 1997). Se ha observado la c-kit en mastocitos malignos de tumores de mastocitos caninos (London y col., J. Compar. Pathol. 115, 399-414, 1996) y también en mastocitos de pacientes que sufren una mastocitosis sistémica agresiva (Baghestanian y col., Leuk. 116-122, 1996; Castells y col., J. Allerg. Clin. Immunol. 98, 831-840, 1996).

Se ha descrito la expresión elevada de la c-kit en mastocitos de pacientes de mastocitosis agresiva, pero en mastocitos de pacientes de mastocitosis indolente (Nagata y col., Mastocytosis Leuk. 12, 175-181, 1998). Se ha demostrado que el SCF se expresa en células de estroma en forma de proteína fijada a membrana y su expresión puede inducirse con factores de crecimiento fibrogénico, por ejemplo con el PDGF (Hiragun y col., 1998). Se ha constatado incluso que se expresa en queratinocitos en forma de proteína fijada a membrana en la piel normal. Sin embargo, en la piel de pacientes de mastocitosis se ha observado una cantidad mayor de SCF soluble (Longley y col., New Engl. J. Med. 328, 1302-1307, 1993).

Se ha publicado que la quimasa de mastocitos descompone el SCF asociado a membrana en una forma soluble y biológicamente activa. Este proceso mediado por mastocitos podría servir para generar un bucle de realimentación que fomenta la proliferación de mastocitos y su función (Longley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 9017-9021, 1997) y puede ser importante para la etiología de la mastocitosis. Los ratones transgénicos que sobreexpresan una forma del SCF, que no puede ser liberado proteolíticamente a partir de queratinocitos, no desarrollan mastocitosis, mientras que animales similares que expresan el SCF normal en queratinocitos presentan un fenotipo similar al de la mastocitosis cutánea humana (Kunisada y col., J. Exp. Med. 187, 1565-1573, 1998). La formación de grandes cantidades de SCF soluble puede contribuir a la patología asociada con la mastocitosis en algunos pacientes y la presente invención puede tratar o prevenir tales trastornos modulando la interacción entre el SCF y la c-kit-quinasa. Diversas mutaciones de la c-kit-RTK que producen actividad constitutiva de quinasa se han encontrado en líneas celulares tumorales de mastocitos de humanos y de roedores (Furitsu y col., J. Clin. Invest. 92, 1736-1744, 1993; Tsujimura y col., Blood 9, 2619-2626, 1994; Tsujimura y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 106, 377-385, 1995; Tsujimura, Pathol. Int. 46, 933-938, 1996). Se han observado además mutaciones que activan el gen de la c-kit en células mononucleares periféricas, aisladas de pacientes que sufren mastocitosis y asociadas a trastornos hematológicos (Nagata y col., Mastocytosis Leuk. 12, 175-181, 1998) y en mastocitos de paciente que sufren urticaria pigmentosa y mastocitosis agresiva (Longley y col., Nat. Gen. 12, 312-314, 1996). Por lo tanto, la inhibición de la c-kit-quinasa ha demostrado tener un excelente rol terapéutico para el tratamiento de estos trastornos.

En algunos pacientes, la activación de mutaciones de la c-kit-RTK puede ser la causa de la patogénesis de la enfermedad y estos pacientes pueden tratarse o bien sus enfermedades pueden prevenirse mediante la modulación de la interacción del SCF con la c-kit-quinasa. La activación de la c-kit por el SCF se considera que previene la apóptosis de mastocitos, que puede ser crítica para mantener la homeostasis de mastocitos cutáneos (Iemura y col., Amer. J. Pathol. 144, 321-328, 1994; Yee y col., J. Exp. Med. 179, 1777-1787, 1994; Mekori y col., J. Immunol. 153, 2194-2203, 1994; Mekori y col., Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 137-138, 1995). La inhibición de la apóptosis de mastocitos podría conducir a la acumulación de mastocitos, asociada con la mastocitosis. Por ello, la observación de la activación de la c-kit resultante de la sobreexpresión del receptor, la formación excesiva de SCF soluble o las mutaciones del gen de la c-kit, que activan constitutivamente su quinasa, proporcionan un indicio racional de que la inhibición de la actividad de la c-kit-quinasa disminuirá el número de mastocitos y proporcionará un beneficio a los pacientes que sufren mastocitosis.

Asma y alergia

Los mastocitos y los eosinófilos constituyen las células clave de las infecciones parasitarias, de la alergia, de la inflamación y del asma (Thomas y col., Gen. Pharmacol. 27, 593-597, 1996; Metcalfe y col., Physiol. Rev. 77, 1033-1079, 1997; Holgate, CIBA Found. Symp., 1997; Naclerio y col., JAMA 278, 1842-1848, 1997; Costa y col., JAMA 278, 1815-1822, 1997). Se ha constatado que el SCF es esencial para el desarrollo de los mastocitos, su supervivencia y crecimiento (Kitamura y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 107, 54-56, 1995; Metcalfe y col., Physiol. Rev. 77, 1033-1079, 1997). Además, el SCF coopera con el regulador específico de eosinófilos, la IL-5, para aumentar el desarrollo de progenitores de eosinófilos (Metcalfe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6408-6412, 1998). Se ha publicado también que el SCF induce a los mastocitos a secretar factores (Okayama y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 114, 75-77, 1997; Okayama y col., Eur. J. Immunol. 28, 708-715, 1998), que promueve la supervivencia de los eosinófilos (Kay y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 113, 196-199, 1997), que puede contribuir a la inflamación crónica, mediada por eosinófilos (Okayama y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 114, 75-77, 1997; Okayama y col., Eur. J. Immunol. 28, 708-715, 1998). Al respecto, el SCF regula directa o indirectamente la activación tanto de los mastocitos como de los eosinófilos.

El SCF induce la liberación de mediadores a partir de los mastocitos, así como el cebado de estas células para la desgranulación inducida por la IgE (Columbo y col., J. Immunol. 149, 599-602, 1992) y la sensibilización de su capacidad de respuesta a la proteína básica principal granulada derivada de eosinófilos (Furuta y col., Blood 92, 1055-1061, 1998). Entre los factores liberados por los mastocitos activados cabe mencionar la IL-5, el GM-CSF y el TNF-\alpha, que influye en la secreción de proteína de eosinófilo (Okayama y col., Int. Arch. Aller. Immunol. 114, 75-77, 1997; Okayama y col., Eur. J. Immunol. 28, 708-715, 1998). Además de inducir la liberación de histamina a partir de los mastocitos (Luckacs y col., J. Immunol. 156, 3945-3951, 1996; Hogaboam y col., J. Immunol. 160, 6166-6171, 1998), el SCF promueve la producción de mastocitos del factor quimiotáctico de eosinófilos, la eotaxina (Hogaboam y col., J. Immunol. 160, 6166-6171, 1998) y la infiltración de eosinófilos (Luckacs y col., J. Immunol. 156, 3945-3951, 1996).

El SCF influye también directamente en la adhesión tanto de mastocitos (Dastych y col., J. Immunol. 152, 213-219, 1994; Kinashi y col., Blood 83, 1033-1038, 1994) como de eosinófilos (Yuan y col., J. Exp. Med. 186, 313-323, 1997), que a su vez regula la infiltración en el tejido. Por lo tanto el SCF puede influir en las células primarias que intervienen en la alergia y en el asma a través de múltiples mecanismos. Actualmente, los corticosteroides son el tratamiento más eficaz contra la rinitis crónica y la inflamación asociada con la alergia (Naclerio y col., JAMA 278, 1842-1848, 1997; Meltzer, Aller. 52, 33-40, 1997). Estos agentes trabajan a través de múltiples mecanismos, incluidas la reducción de la circulación y la infiltración de mastocitos y eosinófilos y la supervivencia disminuida de los eosinófilos, asociada con la inhibición de la producción de citocina (Meltzer, Aller. 52 33-40, 1997). Se ha publicado que los esteroides inhiben la expresión del SCF por fibroblastos y células de tejido conjuntivo residente, lo cual conduce a una supervivencia disminuida de mastocitos (Finotto y col., J. Clin. Invest. 99, 1721-1728, 1997). Debido a la regulación mutua de la función de los mastocitos y de los eosinófilos y al rol que el SCF puede desempeñar en esta regulación, la inhibición de la c-kit-quinasa puede proporcionar un medio para tratar la rinitis crónica, la inflamación y el asma, asociados con la alergia.

c. Identificación de agonistas y antagonistas del receptor c-kit

En vista de la importancia deducida de las RTK en el control, la regulación y la modulación de la proliferación de células endoteliales y potencialmente en la carcinogénesis, se han realizado muchos intentos para identificar "inhibidores" de las RTK, recurriendo a múltiples estrategias. Estas incluyen el uso de ligandos mutantes (patente US-4 966 849); de receptores solubles y de anticuerpos (solicitud WO 94/10202; Kendall y Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709, 1994; Kim y col., Nature 362, 841-844, 1993) y de ligandos de RNA (Jellinek y col., Biochemistry 33, 10450-10456, 1994).

Se han identificado además inhibidores de quinasas (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; patente US-5 330 992; Mariani y col., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35, 2268, 1994) e inhibidores que actúan sobre los procesos de transducción de señales de quinasas de tipo receptor, por ejemplo los inhibidores C de proteína-quinasas (Schuchter y col., Cancer Res. 51, 682-687, 1991; Takano y col., Mol. Bio. Cell 4, 358A, 1993; Kinsella y col., Exp. Cell Res. 199, 56-62, 1992; Wright y col., J. Cellular Phys. 152, 448-57, 1992).

En fecha más recientes se han dirigido esfuerzos a identificar moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de quinasas, para emplearlas en el tratamiento del cáncer. Por consiguiente, sigue habiendo una demanda no satisfecha de identificación y de generación de compuestos pequeños eficaces que inhiban de modo selectivo la transducción de señales de la c-kit-RTK con el fin de suprimir de modo eficaz y específico este bucle autocrino.

Algunos de los compuestos empleados en la presente invención demuestran una actividad excelente en ensayos biológicos y, por tanto, estos compuestos y los compuestos afines se espera que sean eficaces para el tratamiento de los trastornos mediados por la c-kit-RTK, como son los mencionados anteriormente. Además, los ensayos y las condiciones descritos pueden utilizarse para identificar otros moduladores de las funciones de la c-kit-quinasa.

III. Actividad biológica de los compuestos de la invención

Se ensaya la capacidad de los compuestos de indolinona empleados en la presente invención para inhibir la mayoría de actividades de las proteína-quinasas. Los ensayos biológicos y sus resultados se describen en esta solicitud. Los métodos empleados para medir la modulación causada por el compuesto de indolinona en la función de la proteína-quinasa se han descrito en la solicitud internacional WO 98/07695, publicada con fecha 26 de marzo de 1998, a nombre de Tang y col. y titulada: "Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease" y la patente US-5 792 783, publicada el 11 de agosto de 1998, a nombre Tang y col. y titulada: "3-Heteroaryl-2-indolinone compounds for the treatment of disease", en lo que respecta al aspecto de la alta productividad del método.

IV. Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Los compuestos aquí descritos pueden administrarse a un paciente humano tal cual o en forma de composiciones farmacéuticas, en las que están mezclados con otros ingredientes activos, por ejemplo para una terapia de combinación, o con excipientes y vehículos idóneos. Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud se describen por ejemplo en la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA.

a) Vías de administración

Las vías idóneas para la administración puede incluir, por ejemplo la administración oral, rectal, transmucosal o intestinal; la administración parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea, intravenosa, intramedular así como las inyecciones intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Como alternativa se puede administrar el compuesto de modo local mejor que sistémico, por ejemplo mediante la inyección directa del compuesto a un tumor sólido, a menudo en una formulación "depot" o de liberación prolongada.

Además se puede administrar el fármaco en un sistema de entrega dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico del tumor. Los liposomas pueden dirigirse y absorberse selectivamente en el tumor.

b) Composición/formulación

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera de por sí conocida, p. ej. mediante operaciones convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsionado, encapsulado, oclusión o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para utilizar según la presente invención pueden formularse, pues, de una manera convencional empleando uno o varios vehículos fisiológicamente aceptables, que contienen excipientes y adyuvantes que facilitan el procesado de los compuestos activos dentro de las preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación correcta dependerá de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, con preferencia en tampones fisiológicamente compatibles, como son la solución de Hank, la solución de Ringer o el tampón de solución salina fisiológica. Para la administración transmucosal pueden utilizarse en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que conviene atravesar. Tales penetrantes ya son conocidos en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente por combinación de los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables, ya conocidos de la técnica. Tales vehículos permiten formular los compuestos de la invención en forma de tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral del paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas de uso oral pueden fabricarse por mezclado de uno o varios excipientes sólidos con uno o varios compuestos de la invención, opcionalmente molienda de la mezcla resultante y procesado de la mezcla de gránulos, después adición de los adyuvantes idóneos, si se desea, para obtener las tabletas o los núcleos de grageas. Tales excipientes son, en concreto, cargas de relleno por ejemplo azúcares, incluidas la lactosa, la sucrosa, la manita o la sorbita; preparados de celulosa, por ejemplo almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden añadirse agentes desintegrantes, por ejemplo la polivinilpirrolidona reticulada, el agar, el ácido algínico o las sales del mismo, como es el alginato sódico.

Los núcleos de grageas se dotan de un recubrimiento apropiado. A tal fin se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, geles Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de barniz y disolventes orgánicos apropiados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse a las tabletas o al recubrimiento de las grageas colorantes o pigmentos con fines de identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen las cápsulas duras (resistentes al empuje, push-fit), hechas de gelatina, así como las cápsulas blandas selladas, hechas de gelatina y un plastificante, por ejemplo la glicerina o la sorbita. Las cápsulas duras pueden llevar los ingredientes activos mezclados con cargas de relleno, por ejemplo lactosa, aglutinantes, por ejemplo almidones, y/o lubricantes por ejemplo talco o estearato magnésico y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos idóneos, por ejemplo aceites grasos, parafinas líquidas o polietilenglicoles líquidos. Pueden añadirse también estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deberán presentarse en dosificaciones idóneas para tal administración.

Para la administración bucal, las composiciones pueden tomarse en forma de tabletas o de pastillas, formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos a utilizarse según la presente invención se administran de modo conveniente en forma de espray aerosol, en envases presurizados o en nebulizadores, que contienen un gas propelente, p.ej. diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse mediante una válvula que entregue una cantidad calibrada. Las cápsulas o cartuchos p.ej. de gelatina para el uso en un inhalador o insuflador pueden formularse de modo que contengan una mezcla pulverulenta del compuesto junto con un polvo base idóneo, que puede ser lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, p.ej. inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones inyectables pueden presentarse en formas unitarias de dosificación, p.ej. ampollas o recipientes multidosis, que contienen un conservante. Las composiciones pueden adoptar la forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos líquidos o acuosos o pueden contener agentes formulatorios, como son los agentes de suspensión, los estabilizantes y/o los dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de suspensiones inyectables aceitosas adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos idóneos incluyen los aceites de ácidos grasos, por ejemplo el aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo el oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, por ejemplo la carboximetilcelulosa sódica, la sorbita o el dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener además estabilizantes idóneos o agentes que aumenta la solubilidad de los compuestos para permitir la fabricación de soluciones muy concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede adoptar la forma de polvo para la constitución con un vehículo idóneo, p.ej. agua estéril, libre de pirógenos, antes del uso.

Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales, como son los supositorios o los enemas de retención, p.ej. los que contienen bases de supositorios convencionales, como son la manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos pueden formularse también en forma de preparados "depot". Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Los compuestos pueden formularse, pues, con materiales poliméricos o hidrófobos idóneos (por ejemplo en forma de emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o en derivados difícilmente solubles, por ejemplo una sal difícilmente soluble.

Un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de la invención es un sistema de co-disolventes que contiene alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible con agua y una fase acuosa. El sistema de co-disolventes puede ser el sistema de codisolventes VPD. El VPD es una solución que contiene un 3% en p/v de alcohol bencílico, un 8% en p/v de un tensioactivo no polar Polysorbate 80 y un 65% en p/v de polietilenglicol 300, completándose el volumen hasta el 100% con etanol absoluto. El sistema de co-disolventes VPD (VPD:D5W) consiste en el VPD diluido 1:1 con una solución de dextrosa al 5% en agua. Este sistema de codisolventes disuelve bien los compuestos hidrófobos y, por sí mismo, causa una toxicidad baja cuando se administra de modo sistémico. Naturalmente, las proporciones de un sistema de co-disolventes pueden variar de forma considerable sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los codisolventes pueden variarse: por ejemplo, puede utilizarse otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar del Polysorbate 80; puede variarse el porcentaje del polietilenglicol; otros polímeros biocompatibles pueden sustituir al polietilenglicol, p.ej. la polivinilpirrolidona; y otras azúcares y polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

Como alternativa pueden utilizarse otros sistemas de entrega de compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o excipientes de entrega de fármacos hidrófobos. Pueden emplearse también ciertos disolventes orgánicos, por ejemplo el sulfóxido de dimetilo, aunque normalmente con el inconveniente de una mayor toxicidad. Además, los compuestos pueden administrarse empleando un sistema de entrega sostenida, por ejemplo matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Varios materiales de entrega sostenida se han establecido en el mercado y son bien conocidos de los expertos en la materia. Las cápsulas de entrega sostenida pueden estar entregando el compuesto, en función de su naturaleza química, durante unas pocas semanas o incluso durante más de 100 días. En función de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico podrán emplearse estrategias adicionales para la estabilización de las proteínas.

Muchos compuestos moduladores de las PTK de la invención pueden proporcionarse en forma de contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden formarse con muchos ácidos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, el ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos o protónicos que las correspondientes formas de base libre.

c) Dosis eficaz

Las composiciones farmacéuticas idóneas para el uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos intervienen en una cantidad eficaz para lograr el propósito perseguido. Más en concreto, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de compuesto que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto tratado. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es incumbencia de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la descripción detallada de esta solicitud.

La dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto cualquiera, empleado en los métodos de la invención, puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentraciones circulantes que incluya la IC_{50} determinada en un cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de la actividad de la PTK). Esta información puede utilizarse para determinar de forma más cuidadosa las dosis que serán útiles en humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos aquí descritos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, p.ej. para determinar la LD_{50} (la dosis letal del 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz para el 50% de la población). La relación entre los efectos tóxicos y terapéuticos de una dosis es el índice terapéutico y puede expresarse como relación entre la LD_{50} y la ED_{50}. Son preferidos los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivo celular y estudios con animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis a utilizar en humanos. La dosificación de dichos compuestos se sitúa con preferencia dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED_{50} con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. El facultativo podrá elegir la formulación exacta, la vía de administración y la dosificación tomando en consideración el estado de salud del paciente (véase p.ej. Fingl y col., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1, p. 1, 1975).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para conseguir niveles en plasma del principio activo que sean suficiente para mantener los efectos moduladores de la quinasa o la concentración eficaz mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto pero puede estimarse a partir de datos "in vitro"; p.ej. la concentración necesaria para logar una inhibición del 50-90% de la quinasa aplicando los ensayos que se describen a continuación. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Sin embargo, podrá realizarse análisis HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma.

Los intervalos de dosificación pueden determinarse también en base al valor de la MEC. Los compuestos deberían administrarse aplicando un régimen que mantenga niveles en plasma superiores a la MEC durante un 10-90% del tiempo, con preferencia entre el 30 y el 90% y con preferencia especial entre el 50 y el 90%.

En los casos de administración local o de absorción selectiva, la concentración local eficaz del fármaco no guarda relación con la concentración en plasma.

La cantidad de composición administrada dependerá, obviamente, del sujeto a tratar, de su peso, de la severidad de la dolencia, del modo de administración y del criterio del facultativo que atiende al paciente.

d) Envase

Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o en dispositivo dispensador, que puede contener una o varias formas unitarias de dosificación, que contienen el principio activo. El envase puede tener por ejemplo la forma de una lámina metálica o de plástico, por ejemplo un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado además de un prospecto, adjunto al recipiente, de la forma prescrita por el ministerio que regula la fabricación del medicamento, su utilización y su venta, dicho prospecto deberá reflejar que dicho compuesto ha sido aprobado por dicho ministerio para la administración humana o veterinaria. Tal prospecto puede ser, por ejemplo, el etiquetado aprobado por la U.S. Food and Drug Administration para los fármacos de prescipción o el prospecto aprobado para adjuntar al producto. Las composiciones que contienen un compuesto de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible pueden fabricarse también, colocarse en un recipiente idóneo y etiquetarse para el tratamiento de un estado patológico indicado. Los estados patológicos idóneos, indicados en la etiqueta, pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de la angiogénesis, el tratamiento de la fibrosis y la diabetes.

Los métodos adicionales para la fabricación de formulaciones farmacéuticas de los compuestos, los métodos para determinar las cantidades de compuestos a administrar a un paciente y los modos de administración de los compuestos a un organismo se publican en el documento U.S. número de serie 08/702 232 de Tang y col., titulado "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", depositado con fecha 23 de agosto de 1996 y en la publicación de patente internacional número WO 96/22976 de Buzzetti y col., titulada "Hydrosoluble 3-Arylidene-2-Oxindole Derivatives as Tyrosine Kinase Inhibitors", publicada el 1 de agosto de 1996. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que dichas descripciones son aplicables a la presente invención y pueden adaptarse fácilmente a ella.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen son representativos de varios aspectos y características de la presente invención. En los ejemplos se describen métodos para sintetizar compuestos de la invención y métodos para medir un efecto de un compuesto en la función de las proteína-quinasas.

Las células empleadas en los métodos son productos comerciales o pueden obtenerse de laboratorios académicos o pueden diseñarse a partir de células que son productos comerciales. Los vectores de ácidos nucleicos albergados en las células son también productos comerciales y las secuencias de los genes de las diversas proteína-quinasas son fácilmente accesibles en los bancos de datos de secuencias. Por lo tanto, una persona experta en la materia podrá recrear fácilmente las líneas celulares en una manera rápida combinando las células que son productos comerciales, los vectores de ácidos nucleicos que son productos comerciales y los genes de proteína-quinasas aplicando técnicas ya disponibles y conocidas de las personas expertas en la materia.

Procedimientos de ensayo

Los siguientes ensayos "in vitro" podrán utilizarse para determinar el nivel de actividad y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en una o en varias PK. Pueden diseñarse ensayos similares de la misma forma para cualquier PK aplicando métodos bien conocidos de la técnica.

Los ensayos celulares/catalíticos aquí descritos se realizan en formato ELISA. El procedimiento general es el siguiente: se introduce un compuesto en las células que expresan la quinasa a ensayar, ya sea de forma natural, ya sea recombinante, durante un cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa ensayada es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el receptor. Se lisan las células y se transfiere el lisado a hoyos de una placa ELISA recubiertos previamente con un anticuerpo específico que reconoce al sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Se eliminan por lavado los componentes no sustrato del lisado celular y se determina la cantidad de fosforilación del sustrato con un anticuerpo que reconoce específicamente a la fosfotirosina y se compara con células de control, que no han recibido el compuesto de ensayo. El ensayo puede adaptarse para realizar una detección de tipo Western Blotting.

Con los ensayos celulares/biológicos aquí descritos se mide la cantidad de DNA obtenida como respuesta a la activación de una quinasa ensayada, que es la medición general de una respuesta proliferante. El procedimiento general de este ensayo es el siguiente: se introduce un compuesto en las células que expresan la quinasa a ensayar, ya sea de forma natural, ya sea recombinante, durante un cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa ensayada es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el receptor. Después de la incubación por lo menos durante una noche se añade un reactivo marcador del DNA, por ejemplo la bromodesoxi-uridina (BrdU) o la 3H-timidina. Se determina la cantidad de DNA marcado con un anticuerpo anti-BrdU o midiendo la radiactividad y se compara con la que presentan las células de control, que no han tenido contacto con el compuesto de ensayo.

Ensayos celulares/catalíticos

Los ensayos inmunosorbentes con fijación a una enzima (ELISA) pueden realizarse para detectar y medir la presencia de actividad de una PK. El ensayo ELISA puede realizarse con arreglo a los métodos conocidos, descritos por ejemplo por Voller y col., "Enzyme Linked Immunosorbent Assay", en: Manual of Clinical Immunology, 2ª edición, coordinado por Rose y Friedman, pp. 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., 1980.

El protocolo publicado puede adaptarse a la determinación de la actividad de una PK específica, por ejemplo de la c-kit-quinasa. A continuación se describen los métodos preferidos para realizar los ensayos ELISA de la PK específica, la c-kit-quinasa. Dentro de los conocimientos de los expertos en la materia está la adaptación de estos métodos para determinar la actividad de un compuesto sobre otros miembros del grupo de las RTK, tanto las CTK como las STK.

Ejemplo 1

La actividad de los compuestos de la invención.

La actividad bioquímica de algunos compuestos de la invención se ensaya empleando los métodos descritos. Se determinan los valores IC_{50} para varios compuestos de la invención. Los resultados se recogen en la figura 2.

A. Materiales y reactivos

1) HNTG: concentración patrón 5X: 100 mM HEPES, pH 7,2, 750 mM NaCl, 50% glicerina, 2,5% Triton X-100.

2) PBS (solución salina tamponada con fosfato Dulbecco's): Gibco, nº de catálogo: 450-1300EB.

3) tampón de bloqueo 1X: 10 mM TRIS, pH 7,5, 1% BSA, 100 mM NaCl, 0,1% Triton X-100.

4) tampón de quinasa 1X: 25 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl_{2}, 6 mM MnCl_{2}.

5) solución patrón de PMSF = 100 mM (Sigma, nº de catálogo: P-7626).

6) 10 mM ATP (fuente bacteriana), Sigma, A-7699, 5 g.

7) anticuerpo monoclonal (mAb) UB40 anti-fosfotirosina.

8) IgG de oveja anti-ratón conjugada con HRP (Amersham, NA 931).

9) ABTS (5Prime-3Prime, 7-579844).

10) TRIS HCl, Fisher, BP 152-5.

11) NaCl: Fisher, S271-10.

12) Triton X-100: Fisher, BP151-100.

13) Na_{3}VO_{4}: Fisher, S454-50.

14) MgCl_{2}: Fisher, M33-500.

15) MnCl_{2}: Fisher, M87-500.

16) HEPES: Fisher, BP310-500.

17) albúmina bovina (BSA): Sigma, A-8551.

18) tampón TBST: 50 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100.

19) IgG de cabra, anticuerpo anti-conejo, purificado por afinidad (molécula completa): Cappel, 55641.

20) anticuerpo IgG policlonal de conejo anti-kit (C-20): Santa Cruz, sc-168.

21) células kit/CHO: células CHO que expresan de modo estable la GyrB/kit, cultivadas en medio CHO estándar, suplementado con 1 mg/ml de G418.

22) compuestos de indolinona: se sintetizan los compuestos de indolinona del modo descrito en la solicitud siguiente: solicitud PCT número US 99/06468, depositada con fecha 26 de marzo de 1999 por Fong y col. y titulada: "Methods of modulating tyrosine protein kinase" (Lyon & Lyon, docket número 231/250 PCT).

B. Procedimiento

Todos los pasos que siguen se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique expresamente lo contrario. Todos los lavados de la placa ELISA se realizan por enjuague 4x con TBST.

Lisis de células kit

Se efectúa este procedimiento 1 hora antes de iniciar la captura del receptor.

1) Se lava un plato de 15 cm, confluyente en >95%, con PBS y se aspira tanto como sea posible.

2) Se lisan las células con 3 ml de 1x HNTG que contiene 1 mM PMSF/plato de 15 cm. Se raspan las células de la placa y se trasladan a un tubo de centrífuga de 50 ml.

3) Se reúnen los líquidos sobrenadantes, se dejan sedimentar sobre hielo durante una hora, realizando tratamientos ocasionales en vórtice. Si no se realiza, hay que contar con una mayor línea de fondo (aproximadamente 3 veces más alta).

4) Se equilibran los tubos y se centrifugan a 10.000 rpm a 4ºC durante 10 min. Se saca una parte alícuota para determinar la proteína.

5) Se realiza la determinación de la proteína con arreglo al procedimiento estándar de trabajo (SOP) para la determinación de proteína empleando el ácido bicinconínico (BCA).

Procedimiento ELISA

1) Se recubren las placas Corning para ELISA de 96 hoyos con 2 \mug por hoyo de anticuerpo de cabra anti-conejo en PBS para un volumen total por hoyo de 100 \mul. Se almacena a 4ºC durante una noche.

2) Se desecha el anticuerpo de cabra anti-conejo que no se ha fijado invirtiendo la placa para quitar el líquido.

3) Se añaden a cada hoyo 100 \mul de tampón de bloqueo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 min.

4) Se lava 4x con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

5) Se añaden 0,2 \mug por hoyo de anticuerpo de conejo anti-kit diluido en TBST para un volumen total de hoyo de 100 \mul. Se agita a temperatura ambiente durante 60 min.

6) Se diluye el lisado en HNTG (180 \mug de lisado/100 \mul).

7) Se añaden 100 \mul de lisado diluido a cada hoyo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 min.

8) Se lava 4x con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

9) Se diluyen los compuestos/extractos (o lo que convenga) en 1x de tampón de quinasa, con 5 \muM ATP en una placa de polipropileno de 96 hoyos.

10) Se trasvasan 100 \mul de fármaco diluido a los hoyos de la placa ELISA. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 60 min.

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11) Se interrumpe la reacción con la adición de 10 \mul de EDTA 0,5 M. La placa es ahora estable durante un tiempo razonable.

12) Se lava 4x con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

13) Se añaden 100 \mul de UB40 (dilución 1:2000 en TBST) a cada hoyo. Se incuba a temperatura ambiente durante 60 min, con agitación.

14) Se lava 4x con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

15) Se añaden a cada hoyo 100 \mul de IgG de oveja anti-ratón conjugado con HRP (dilución 1:5000 en TBST). Se incuba a temperatura ambiente durante 60 min, con agitación.

16) Se lava 4x con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

17) Se añaden a cada hoyo 100 \mul de ABTS. Se incuba con agitación durante 15-30 min.

18) Se leen los resultados del ensayo en un aparato Dynatech MR7000 ELISA Reader:

: filtro de ensayo = 410 nm

: filtro de referencia = 630 nm.

Ejemplo 2

La actividad de los compuestos de la invención.

Se ensaya la actividad bioquímica de dos compuestos de la invención aplicando los ensayos que se describen a continuación.

Métodos Líneas celulares

Se mantienen células MO7E, una línea celular de leucemia mieloide humana, en medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y 10 ng/ml tanto de IL-3 como de GM-CSF.

Detección de la fosforilación de la c-kit-tirosina

Se mantienen las células MO7E en privación de suero durante una noche con un 0,1% de suero. Se tratan previamente las células con el compuesto ocho durante 2 horas o con el compuesto seis durante 22 horas (de modo simultáneo con la privación de suero), antes de la estimulación del ligando. Se estimulan las células con 250 ng/ml de rh-SCF durante 15 minutos. Después de la estimulación se lisan las células y se inmunoprecipitan con un anticuerpo anti-c-kit. Se determinan los niveles de fosfotirosina y de proteína por ensayo Western Blotting.

Ensayo de proliferación MTT

Se someten las células MO7E a privación de suero y se tratan previamente con un compuesto del modo descrito en el ensayo de fosforilación. Se depositan las células en placas a razón de 4x10^{5} células/hoyo en un plato de 96 hoyos, en 100 \mul de RPMI + 10% de suero. Se añade el rh-SCF (100 ng/ml) y se incuba la placa durante 48 horas. Pasadas las 48 horas se añaden 5 mg/ml de MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio] y se mantiene en incubación durante 4 horas. Se añade ácido en isopropanol (100 \mul de HCl 0,04 N en isopropanol) y se mide la densidad óptica a una longitud de onda de 550 nm.

Ensayos de apóptosis

Se incuban las células MO7E con +/- SCF y +/- compuesto (compuesto seis o compuesto ocho, en una concentración 5 y 25 \muM) en 10% PBS con rh-GM-CSF (10 ng/ml) y rh-IL-3 (10 ng/ml). Se ensayan las muestras durante 24 y 48 horas. Para medir la caspasa-3 activada se lavan las muestras con PBS y se permeabilizan con etanol del 70% enfriado con hielo. Después se tiñen las células con anticuerpo policlonal de conejo conjugado con PE anti-caspasa-3 y se analizan por FACS. Para medir el PARP descompuesto se lisan las muestras y se analizan por Western Blotting con un anticuerpo anti-PARP.

Inhibición de las funciones biológicas de la c-kit por acción del compuesto ocho y del compuesto seis Resultados Inhibición de la fosforilación de la tirosina de la c-kit

El compuesto ocho y el compuesto seis inhiben la fosforilación de la tirosina de la c-kit en las células MO7E, una línea celular de leucemia mieloide humana, como respuesta a la estimulación del ligando con el factor celular germinal (SCF). En las células tratadas con el compuesto ocho, no se observa inhibición de la fosforilación con una concentración de 0,01 \muM de compuesto, se observa inhibición parcial con 0,1 \muM y una inhibición completa con 1 y 10 \muM. En las células tratadas con el compuesto seis no se observa inhibición de la fosforilación de la tirosina de la c-kit con una concentración de 0,01 \muM o de 0,1 \muM de compuesto, se observa una inhibición parcial con un 1 \muM y una inhibición total con 10 \muM.

Inhibición de la proliferación mediada por la c-kit

El compuesto ocho y el compuesto seis inhiben también la señalización mediada por la c-kit en células MO7E en un ensayo de proliferación MTT. El valor IC_{50} para la inhibición de proliferación causada por el compuesto ocho es de aproximadamente 0,5 - 1,0 \muM, y el valor IC_{50} para el compuesto seis es de aproximadamente 5 - 7 \muM.

Inducción de apóptosis

El compuesto ocho y el compuesto seis también inducen la apóptosis de las células MO7E, de un modo dependiente de la dosis y del tiempo. Se evalúa la apóptosis en dos ensayos: un análisis FACS con un anticuerpo que reconoce la caspasa-3 activada en las células, inducida durante la apóptosis y un ensayo Western Blotting que detecta un fragmento descompuesto de una poli(ADP-ribosa)polimerasa, también inducido durante la apóptosis.

Aplicando el ensayo de la caspasa-3 se observa un aumento de aproximadamente un 50% del número de células apópticas al cabo de 48 horas, después de la estimulación con SCF y el tratamiento con 25 \muM del compuesto ocho, si se compara con las células estimuladas con SCF pero no tratadas. Se observa un ligero efecto al cabo de 48 horas por tratamiento con 25 \muM del compuesto ocho en ausencia de estimulación con SCF. El tratamiento con 25 \muM del compuesto ocho durante 24 horas (+/- estimulación con SCF) da lugar a un número medible pero menor de células apópticas.

El tratamiento de las células con 5 \muM del compuesto ocho durante 24 ó 48 horas (+/- estimulación con SCF) da lugar también a un número medible pero menor de células apópticas.

Se obtienen resultados similares con el compuesto seis, excepto que no se observa efecto con un 5 \muM del compuesto seis al cabo de 24 horas, con o sin estimulación con SCF.

Aplicando el ensayo PARP, el tratamiento con 25 \muM del compuesto ocho durante 48 horas da lugar al mayor aumento de la cantidad del PARP descompuesto. El efecto aumenta ligeramente con estimulación con SCF. La muestra tratada durante 24 horas con 25 \muM del compuesto ocho es similar a la muestra tratada durante 48 horas.

El tratamiento con 5 \muM del compuesto ocho, al cabo de ambos períodos, da lugar a un aumento mínimo del PARP descompuesto.

Se obtienen resultados similares con el compuesto seis.

Claims

1. Uso de un compuesto de indolinona para fabricar una composición farmacéutica destinada al tratamiento o prevención de uno o varios tumores del estroma gastrointestinal en un organismo, dicha composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto de indolinona, dicho compuesto es capaz de inhibir la función de la c-kit-tirosina-quinasa de tipo receptor y se elige entre el grupo formado por:

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2. Uso de un compuesto de indolinona para fabricar una composición farmacéutica destinada al tratamiento o prevención de la rinitis crónica asociada a la alergia, de la mastocitosis, la presencia de uno o varios tumores en mastocitos o del asma en un organismo, dicha composición contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto de indolinona, que se ha definido en la reivindicación 1.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho organismo es un mamífero.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que dicho organismo es un ser humano.