JP4546727B2

JP4546727B2 - キナーゼ阻害剤及びその使用

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Publication number: JP4546727B2
Application number: JP2003513551A
Authority: JP
Inventors: チルチンウラディミール; アタナシオスジアニス; マツィチェクラルフ; スリーマンジョナサン
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2010-09-15
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Also published as: EP1406615A1; US20040248965A1; US8324267B2; DE10134196A1; DE10134196B4; EP1406615B1; JP2004536127A; WO2003007943A1; DE50214750D1; ATE486598T1

Description

本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤、及び病的なシグナル形質導入カスケードにより引き起こされた疾患を治療するためのその使用に関する。

タンパク質キナーゼはトランスフェラーゼに属する酵素であり、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）又はグアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）のリン酸基の、タンパク質への転移を触媒する。リン酸基が転移されたアミノ酸基により、例えばタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質ヒシチジンキナーゼ、タンパク質アスパラギン酸キナーゼ又はタンパク質チロシンキナーゼが区別される。

タンパク質キナーゼは、受容体タンパク質の活性（シグナル形質導入カスケード）を制御する際に重要な役割を担う。細胞の外側のシグナルは、細胞表面受容体、例えば受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）により受容される(Ullrichら, 1990, Cell, 61; 203-212; Fantlら, 1993, Annu. Rev. Biochem., 62: 453-481）。“シグナル放出”分子又はいわゆるエフェクター又は配位子の結合により、ＲＴＫは自己リン酸化される(Weissら, 1997, Curr. Opin. Genet. Div., 7:80-86)。この自己リン酸化により、ＲＴＫは別のタンパク質、とりわけいわゆるアダプタータンパク質と相互作用を示すことができる(Robertsonら, 2000, Trends Genet., 16: 268-271)。このタンパク質複合体は、その側で別の細胞内タンパク質を活性化させることができ、このことはタンパク質相互作用の完全な連鎖をもたらし、それにより、本来、細胞外シグナルは細胞表面から細胞核内へと伝達される(Treismanら, 1996, Curr. Opin. Cell. Biol., 8:205-215; Tanら, 1999, Trends Genet., 15:1456-149)。従って伝達シグナルは、遺伝子発現、細胞周期又は別の重要な細胞機能に影響を与え得る。

受容体チロシンキナーゼのエフェクターには、例えばインスリン及び多くの成長因子、例えば血小板成長因子（ＰＤＧＦ）又は上皮成長因子（ＥＧＦ）が属する。受容体チロシンキナーゼは、とりわけ、新たな血管の形成（血管新生）又は新たなリンパ管の形成（リンパ管新生）の制御において重要な役割を担う。この場合、新たな毛細血管を形成するために、すでに存在する血管の内皮細胞は刺激され、成長、増殖及び拡大する。これに関連して、殊に細胞表面受容体ＶＥＧＦＲ（血管内皮成長因子受容体）及びＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体）が挙げられ、かつエフェクターとして、ＶＥＧＦファミリー又はＦＧＦファミリーの相当する成長因子が挙げられる(Korpelainenら, 1998, Curr. Opin. Cell. Biol., 10:159-164; Malonneら, 1999, Clin. Exp. Metastasis., 17:1-14)。元来の血管新生エフェクター（配位子）のための他の公知の例は、とりわけ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン８又はいわゆるＴｉｅ_２配位子(Malonneら, 1999, Clin. Exp. Metastasis., 17:1-14)である。

タンパク質キナーゼの制御されない刺激は、病的なプロセス、例えばガンを招き得る(Porterら, 1998, Oncogene, 17: 1343-1352)。例えば、遺伝子的に変更された受容体、即ち、適当なエフェクターの不在でも構成的にシグナルを別のタンパク質へ伝達する、突然変異した受容体チロシンキナーゼは、ガンの発症を招き得る。ＲＴＫのこのような活性化突然変異は、数多くのヒトの疾患と関連している(Robertsonら, 2000, Trends Genet., 16: 268-271)。例えば、構成的に、活性ＦＧＦ受容体は数多くの遺伝病の原因である（第１表）。血管新生の誤制御は、第２表に示した数多くの疾患の進行において重要な役割を担う(Malonneら, 1999, Clin. Exp. Metastasis., 17:1-14)。例えばガン疾患の場合、種々の研究により、腫瘍は十分な血液供給に極めて依存していることが示された。血管新生を阻害することができる場合、腫瘍の成長も停止することができるか、又はそれどころか逆行させることができる(Zetterら, 1998, Annu. Rev. Med., 49:407-424)。リンパ管新生の誘発も、ガン疾患及びフィラリア症の際に重要な役割を担う(Skobeら, 2000, Nature Med., 7:192-198; Raoら, 1996, J. Parasitol., 82:550-556)。

受容体チロシンキナーゼのタンパク質キナーゼ活性の制御は、原理的に種々の方法で行うことができる。例えば、受容体キナーゼ／配位子結合の相互作用をブロックする抗体を使用することができる(Brekkenら, 2000, Cancer Res., 60:5117-5124; Klementら, 2000, J. Clinic. Invest., 第105巻, No.8:15-24)。これとは別に、不活性複合体への相応する配位子の結合（ゼクエストレーション）のための、可溶性の細胞外受容体断片の使用が、Aielloら(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. 第92巻:10457-10461)により記載されている。しかしながら、上記抗体のみならず可溶性の受容体部分もが著しい欠点を有している。双方は迅速に循環系から除去される。さらに、双方の場合において、分子は極めて大きく、組織浸透の可能性は極めて限定されている。製薬的な適用のためのその製造、殊に抗体の製造には極めて費用がかかり、高価である。更に、これらは免疫応答を引き起こし得る化合物を表すものであり、従ってその生物学的な有効性は強度に低減されるか、又は完全に失効される。

タンパク質キナーゼの活性を制御するもう１つの可能性は、例えば、基質結合ドメインに関して元来の基質であるＡＴＧ又はＧＴＰと競合する基質類似化合物による阻害である。これに関連して、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を阻害することのできるインドリノンが記載されている。特別なＲＴＫである線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に関する結晶学的研究により、インドリノンのオキシインドール部分が、元来の基質であるＡＴＰのアデニン環と同じ結合部位と相互に作用することが示された(Mohammadi, Mら, Science, 276: 955-960)。しかしながらオキシインドールのＣ３−原子上の置換基の化学構造により、更に、どのＲＴＫの活性が阻害されるかが決定される。幾つかのインドリノンは唯一のＲＴＫの活性をブロックし；別のインドリノンはより幅広いＲＴＫを阻害する。

従って、タンパク質キナーゼの活性が病的で制御不可能であるような疾患を治療するために、表面受容体タンパク質キナーゼ、有利に受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のこの制御されない活性を制御し、有利にブロックすることができる化合物を提供し、それにより疾患の進行を低減するか、又は阻止することは医学的に極めて重要である。タンパク質キナーゼの活性が病的で制御不可能であるような疾患とは、例えば、制御されない細胞増殖及び／又は障害のある細胞自滅により引き起こされるガン種であり得る。さらに、疾患、例えばフィラリア症、又は障害のあるプロセスにより血管新生及び／又はリンパ管新生の際に引き起こされる疾患もあり得る（これに関しては第２表も参照のこと）。これに関連して、元来の活性、又はタンパク質キナーゼの病的に変更された（構成的な）活性により血管新生及び／又はリンパ管新生を直接ブロックし、従って一方で腫瘍の血液供給を悪化させ、又はそれどころか阻止し、それにより腫瘍成長の停止又は病的な組織の壊死をもたらすか、又は他方で腫瘍細胞の転移を回避させる化合物を提供することも所望される。

上記課題は、本発明により有利な方法で解決される。

本発明の対象は、一般構造式

の化合物
又は化合物Ｉ）−ＩＩＩ）の塩
の群から選択された、制御されない細胞増殖及び／又は細胞の障害のある自滅及び／又は血管新生及び／又はリンパ管新生及び／又は血管新生に依存する疾患及び／又はリンパ管新生に依存する疾患及び／又はフィラリア症に関与するタンパク質キナーゼの活性を阻害し、かつインドリン−２−オンの、Ｃ３−原子上で置換された誘導体である化合物である。

上記化合物は、本願明細書の記載において、ＭＡＥ８７（＝構造式Ｉ）、ＭＡＥ１０６（＝構造式ＩＩ）、ＭＡＺ５１（＝構造式ＩＩＩ）とも呼称される。本発明の対象は、更に、化合物ＭＡＺ５１の塩として、ＭＡＺ５１の他の比較可能な特性を有するより可溶性である変形の、ＭＡＺ５１−２なる記号を有する化合物である。

本発明の有利な変形において、該化合物は、血管新生及び／又はリンパ管新生に関与する受容体チロシンキナーゼの活性をブロックする。もう１つの変形において、本発明による化合物は、単独か又はその組み合わせで、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞成長因子受容体）、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥｒｂＢ２、ＩＧＦ１Ｒ及びＦＧＦＲ１（線維芽細胞成長因子受容体）の群からなる受容体チロシンキナーゼの活性を阻害する。本発明の有利な変形には、細胞表面受容体ＶＥＧＦＲ−３の活性をブロックする化合物が含まれる。

本発明の範囲内で、該化合物は、タンパク質キナーゼの元来の活性に加え、病的に変更されたタンパク質キナーゼ、即ち活性が病的で制御不可能であるタンパク質キナーゼの活性をも阻害する。例えば、タンパク質キナーゼは持続的に（構成的に）刺激されることができる。これは、配位子（エフェクター）又は別のタンパク質成分との相互作用挙動における変更された特性、又はＲＴＫの変更された自己刺激により引き起こされ得る。

病的に変更されたタンパク質キナーゼ変形とは、本発明の範囲において、例えば、核酸レベル及び／又はタンパク質レベルでの変更により、制御されない細胞増殖及び／又は細胞の障害のある自滅を引き起こし、かつ／又は障害のある血管新生及び／又はリンパ管新生及びそれと関連した疾患を招き（第２表参照）、かつ／又はフィラリア症に関与しているタンパク質キナーゼであると理解されるべきである。本発明によれば、核酸レベルでの変更とは、１種以上のヌクレオチドの欠失、挿入又は交換であると理解されるべき突然変異であると理解されるべきである。タンパク質レベルでの変更とは、１種以上のアミノ酸の欠失、挿入又は交換であると理解されるべきである。

本発明による化合物の作用原理は、該化合物が、タンパク質キナーゼの元来の基質、例えばＡＴＰをシミュレートすることに基づく。即ち、該化合物はいわばＡＴＰ類似物として作用する。この場合、該化合物はそのオキシインドール部分を伴って、元来ＡＴＰのアデニン環が結合するのと同じ、タンパク質キナーゼのドメインに結合する。従って、本発明による化合物及び元来の基質は基質結合部位に関して競合し、即ち、本発明による化合物はＡＴＰを基質結合部位から排除する。これに基づき、タンパク質キナーゼは目的分子へのリン酸基の転移を触媒せず、このようにして、もはやキナーゼとしてのその意図的な機能を果たさない。従って、本発明による化合物により、その構造に基づき、一般的にタンパク質キナーゼの活性を阻害するのみならず、突然変異された（構成的）活性ＲＴＫにより引き起こされるヒトの疾患を治療することも可能である。この場合、各々単独の化合物の使用が考えられるが、しかしながらその組み合わせも考えられる。

本発明による化合物は、該化合物が極めて良好な細胞浸透性ないし組織浸透性を有する小さい分子であるという利点を有する。更に、該化合物は患者への投与、有利に経口投与に極めて好適である。更に、該化合物の製造は、製薬的な使用のための大工業的な規模においても容易であり、かつ廉価である。更に、該化合物が免疫応答を引き起こさないことは殊に有利である。

又、本発明の対象は、発症、進行、軽減及び／又は治療に、自然に発生する及び／又は病的に変更されたタンパク質キナーゼが関与している疾患を治療するための、上記の種の本発明による化合物を少なくとも１種含有する薬剤である。これには、上記の種の化合物を少なくとも１種含有する、制御されない増殖を阻害するための、及び／又は細胞の自滅を誘発するための、及び／又は血管新生及び／又はリンパ管新生を阻害するための、本発明による薬剤が含まれる。更に、本発明による化合物を少なくとも１種含有する本発明による薬剤は、血管新生に依存する疾患及び／又はリンパ管新生に依存する疾患（例えば第２表に示されているもの）及び／又はフィラリア症の治療に適当である。

上記薬剤は、更に、該薬剤が本発明による種の化合物少なくとも１種を、約１〜２０ｍｇ／被験者の体重ｋｇ、有利に約２〜１５ｍｇ／被験者の体重ｋｇ、殊に有利に約３〜１０ｍｇ／被験者の体重ｋｇ、殊に約４〜８ｍｇ／被験者の体重ｋｇの濃度で含有することが特徴的である。本発明による化合物を、上記範囲の自由に組み合わせ可能な濃度割合で組み合わせることも可能である。

本発明によれば、本発明による化合物により次々に阻害されるタンパク質キナーゼにより、その活性に関してそれ自体が制御される（シグナル形質導入）タンパク質の生物学的機能を制御するための、上記種の化合物少なくとも１種を含有する薬剤も含まれる。

更に、本発明による薬剤は、より良好な処理又は患者への投与に必要又は適当な、付加的な物質を含有してもよい。このような物質は、本発明による薬剤のための製造法と同様に慣用の実験室での実地であり、従ってここでは詳説しない。

本発明の対象は、制御されない増殖を阻害するための、及び／又は細胞の自滅を誘発するための、及び／又は血管新生及び／又はリンパ管新生を阻害するための薬剤を製造するための、上記種の化合物の使用である。同様に、血管新生に依存する疾患及び／又はリンパ管新生に依存する疾患（第２表）及び／又はフィラリア症を治療するための、本発明による化合物の使用も含まれる。

以下の例は本発明を詳説するためのものであるが、しかしながらこれにより本発明が制限されることはない：

１）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１の構造及び合成
一般的な方法：
オキソインドール１０ミリモル、アルデヒド１０ミリモル及びピペリジン数滴をエタノール４０ｍｌ中に溶解させる。反応混合物を９０℃で５時間撹拌する。反応の間及び室温への冷却の後、所望の生成物（Ｅ／Ｚ−混合物）が析出する。沈殿物を濾別し、エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させる。

ＮＭＲスペクトルをBruker DRX500分光計で記録した。化学シフトをｐｐｍ（百万分率）で示す。内部標準として、溶剤の残留プロトンシグナルを使用する。高分解能質量スペクトルを、Finnigan MAT MS 70 質量分析計を用いて記録した。融点は補正されていない。

１ａ）３−（２，４−ジヒドロキシ−ベンジリデン）―１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（ＭＡＥ８７）
インドール−２−オン１．３３ｇ（１０ミリモル）、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド１．３８ｇ（１０ミリモル）及びピペリジン３滴の混合物を、エタノール４０ｍｌ中で５時間還流させる。反応の間、所望の生成物が黄色の固体として析出する。室温に冷却した後、この生成物を濾別し、エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させる。収量１．２８ｇ（５１％）
融点：２５０℃ 分解

１ｂ）３−（３−フルオロ−４−メトキシ−ベンジリデン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（ＭＡＥ１０６）
インドール−２−オン１．３３ｇ（１０ミリモル）、３−フルオロ−４−メトキシ−ベンズアルデヒド１．５４ｇ（１０ミリモル）及びピペリジン３滴の混合物を、エタノール４０ｍｌ中で５時間還流させる。室温に冷却した後、所望の生成物が黄色の結晶質の固体として析出する。この生成物を濾別し、エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させる。収量２．２ｇ（８２％）
融点：２２０℃

１ｃ）３−（４−ジメチルアミノ−ナフタレン−１−イルメチレン）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（ＭＡＺ５１）
インドール−２−オン１．３３ｇ（１０ミリモル）、４−ジメチルアミノ−１−ナフトアルデヒド１．９９ｇ（１０ミリモル）及びピペリジン３滴の混合物を、エタノール４０ｍｌ中で５時間還流させる。室温に冷却した後、所望の生成物がオレンジ色の固体として析出する。この生成物を濾別し、エタノールで洗浄し、真空中で乾燥させる。収量２．６７ｇ（８５％）

融点：２５０℃ 分解
２）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１はインビトロでのチロシンキナーゼアッセイにおいて、数多くの受容体チロシンキナーゼを阻害する。

インビトロで、ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１により、種々の受容体チロシンキナーゼの阻害を試験した。阻害剤を２つの異なる濃度（１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌ）で試験した。阻害を％で記載する。“＋”＝制御に対するキナーゼ活性の刺激、“−”＝制御に対するキナーゼ活性の阻害。

ＲＴＫ阻害剤の活性を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。このアッセイにおいて、相応するキナーゼを組換え型ＧＳＴ融合タンパク質（グルタチオン、Ｓ−トランスフェラーゼ）として使用する。受容体として、合成によるｐｏｌｙＧｌｕ、Ｔｙｒ４：１を使用する。種々の濃度の試験物質が上記受容体のＲＴＫに仲介されたリン酸化を阻害する能力を評価した。全ての試験を二重測定で実施した。

ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．２ｍｇ／ｍｌｐｏｌｙＧｌｕ、Ｔｙｒ４：１で一晩被覆させた。この溶液を除去し、微量定量プレートをＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、１０ｍＭＮａＣｌ）で２回洗浄し、次いで５％ＢＳＡ／ＴＢＳで３０分間ブロックした。試験物質５０μｌ（１０％ＤＭＳＯ中の２又は２０μｇ／ｍｌ）、４倍のキナーゼ緩衝液（２００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＮａＣｌ、８０μＭＮａ_３ＶＯ_４及び０．０４％ＢＳＡ）中のＧＳＴキナーゼ２５μｌを装入した。キナーゼの基質として（４０ｍＭＭｎＣｌ_２中の）１６０μＭＡＴＰ２５μｌを添加することにより反応を開始させた。従って、試験化合物の最終濃度は、５％ＤＭＳＯ中で１ないし１０μｇ／ｍｌである。ＧＳＴ融合タンパク質を以下の濃度で使用した。ＶＥＧＦＲ−２５０ＮＧ／ウェル、ＶＥＧＦＲ−３３００ｎｇ／ウェル、Ｔｉｅ２３００ｎｇ／ウェル、ＥＧＦＲ５０ｎｇ／ウェル、ＥｒｂＢ２２００ｎｇ／ウェル、ＩＧＦ−１Ｒ５０ｎｇ／ウェル、ＦＧＦＲ１２００ｎｇ／ウェル。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。３０ｍＭＥＤＴＡ５０μｌ／ウェルを添加することによりキナーゼ反応を停止させた。微量定量プレートを０．０５％トゥウィーン(Tween)２０／ＴＢＳで２回洗浄した。抗ホスホチロシン抗体（１：５００）を０．０５％トゥウィーン(Tween)２０／ＴＢＳ（０．５％ＢＳＡ、０．０２５％脱脂粉乳及び１００μＭＮａ_３ＶＯ_４を含有する）中に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。微量定量プレート０．０５％トゥウィーン(Tween)２０／ＴＢＳで３回洗浄した。引き続き、ＨＲＰ結合検出抗体（１：１０００）を０．０５％トゥウィーン(Tween)２０／ＴＢＳ（０．５％ＢＳＡ、０．０２５％脱脂粉乳及び１００μＭＮａ_３ＶＯ_４を含有する）中に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。微量定量プレート０．０５％トゥウィーン(Tween)２０／ＴＢＳで３回洗浄した。ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホネート））基質(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)を添加した。ＯＤをＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。

３）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１は、ＲＴＫＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の配位子に誘発された自己リン酸化を阻害する。

ＶＥＧＦＲ−２ないしＶＥＧＦＲ−３発現ＰＡＥ細胞（ブタ大動脈内皮細胞）を、相応する試験化合物０．５μＭ、５μＭ又は５０μＭでインキュベートした。その後、細胞をＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＲ−２）又はＶＥＧＦ−Ｃ（ＶＥＧＦＲ−３）を用いるか、又は負の制御としての成長因子なしで刺激した。１５分後、細胞を採取し、ＶＥＧＦＲ−２ないしＶＥＧＦＲ−３を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を電気泳動後にブロッティングし、抗ホスホチロシン抗体を用いて試験した。ブロットを採取し、負荷試験のためにＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３抗体を用いて試験した。５μＭの際にＭＡＺ５１は選択的にＶＥＧＦＲ−３を阻害する。

ＰＡＥ／ＶＥＧＦＲ−２又はＰＡＥ／ＶＥＧＦＲ−３を１５ｃｍの組織培養用シャーレ内に分散させ、５０％集合まで培養した。その後、細胞を無血清培地（０．２％ＢＳＡを含有する）内で１６〜２４時間（ＰＡＥ／ＶＥＧＦＲ−３）又は７２時間（ＰＡＥ／ＶＥＧＦＲ−３）枯渇させる。１ｍＭ無血清培地（１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４）５ｍｌを用いて種々の阻害剤濃度で３０〜６０分予めインキュベートした後、細胞を５分間（ＶＥＧＦＲ−３）又は８分間（ＶＥＧＦＲ−２）３７℃で刺激した。その後、細胞を氷冷されたＰＢＳで迅速に２回洗浄し（１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４を伴う）、氷冷された変性ＲＩＰＡ緩衝液（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）トリトン(Triton) X 100、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭＮａＦ）で溶解させ、この場合これは１ｍＭＰＭＳＦ、０．１Ｕ／ｍｌアプロチニン、１０ｎｇ／ｍｌロイペプチン及び５ｍＭＮａ_３ＶＯ_４を用いて新たに調合したものである。細胞をゴム冠ポリスマンを用いてプレートから採取し、遠心分離小管内で氷上で収集する。溶解産物を２５Ｇカニューレを有するシリンジにより加圧して可溶化させ、４℃／１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して不溶性成分を分離した。

澄明な溶解産物を抗−ＶＥＧＦＲ−２（Ｃ−１１５８、Santa Cruz）又は抗−ＶＥＧＦＲ−２抗体（Ｍ２０、Santa Cruz）４μｇを用いて４℃で一晩インキュベートした。

受容体−抗体−複合体を沈殿させるために、タンパク質Ａ−セファロース(Amersham)３０μｌ／小管を添加し、４℃でさらに２時間インキュベートした。

その後セファロースを４℃で１分間遠心分離し、冷却された洗浄用緩衝液（３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）トリトン(Triton) X 100、０．５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１０ｍＭＮａＦ）で３回洗浄し、、この場合これは１ｍＭＰＭＳＦ、０．１Ｕ／ｍｌアプロチニン、１０ｎｇ／ｍｌロイペプチン及び５ｍＭＮａ_３ＶＯ_４を用いて新たに調合したものである。洗浄用緩衝液の残分を、２７Ｇカニューレを備えたシリンジにより吸引濾過することによって除去した。セファロースの小球状物をＳＤＳ負荷緩衝液５０μｌ内に再懸濁させ、沸騰させ、６％アガロースゲル上に負荷させた。電気泳動による分離後、タンパク質をウェスタンブロットにより相応する膜上に固定した。ブロットをまず抗ホスホチロシン抗体（ＲＣ２０：ＨＲＰＯ、Becton Dickinson）を用いて試験し、その後、ブロットを特別な抗受容体抗体を用いてタンパク質負荷に関して試験するために、第１の抗体を再度除去した。膜をストリッピング用緩衝液（６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、０．７５％２−メルカプトエタノール）を用いて５５℃で２０分間振盪し、第１の抗体をストリッピングにより除去した。その後、膜をＴＢＳＴで２回各２分間洗浄し、通常通りブロックし、インキュベートした。

結果を図１に示す。

４）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１は、内皮細胞増殖を阻害する。

ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を無血清下で２４時間培養した。その後、細胞を相応する化合物を用いて２時間、予めインキュベートし、引き続きＶＥＧＦ（ＭＡＥ８７）又はｂＦＧＦ（ＭＡＥ１０６、ＭＡＺ５１）を用いて、阻害剤の存在でさらに２４時間培養した。その後、細胞を^３Ｈ−チミジンを用いてインキュベートした。細胞質ＤＮＡ内に取り込まれた放射能の量を測定した。全ての実験を三重測定で実施した。

ＨＵＶＥ細胞を、１００μｌ／ウェル（１０^５細胞／ｍｌ）で９６ウェルで細胞培養プレート内に分散させ、一晩放置した。その後細胞を５０μｌ／ウェルの無血清培地を用いて２４時間枯渇させた。引き続き、種々の濃度の試験物質５０μｌを無血清培地（２％ＤＭＳＯ含有）内に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。試験化合物を含有する培地を除去し、ｂＦＧＦ（１２．５ｎｇ／ｍｌ）又はＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する新たな培地５０μｌと交換した。２％ＤＭＳＯを含有する無血清培地内の２倍に濃縮した試験物質の新たな希釈物を、５０μｌ／ウェルで細胞に添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は常に１％であった。２４時間後、^３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を添加し、細胞を更に４〜６時間インキュベートした。取り込まれた放射能を分析するために、細胞を３０分間トリプシンで処置し、Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６細胞（Ｔｏｍｔｅｃ）を用いて採取し、ガラス繊維膜フィルター上に固定した。固定化した放射能をＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションルミネッセンスカウンターを用いて定量化した。結果を図２に示す。

５）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１はＣＡＭアッセイにおいて血管新生を阻害する。

漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを、記載されたように(Wernertら)、受精５日後の鶏胚を用いて実施した。阻害剤１００μｇを伴ったメチルセルロース小プレート（直径２ｍｍ）をＣＡＭに施与した。７日目に評価を行った。ＭＡＥ１０６に関する代表的な結果を図３に示す。Ａ．負の制御Ｂ．ＭＡＥ１０６で処置した卵。負の制御が示す、血管の強度に枝分かれしたネットワークは、ＭＡＥ１０６で処置した卵において極めて発達不十分である。

６）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１は腫瘍細胞の増殖を阻害する。

ラットの腫瘍細胞株の細胞(Nestlら, 2001, Cancer Research 61: 1569-1577)を、１％ＤＭＳＯ（溶剤制御）、インドリノン２．５μＭ又は１０μＭの存在で２４時間培養した。トリチウムチミジンをインキュベーションの最後の４〜６時間の間に培地に添加した。細胞を採取し、ＤＮＡ中に取り込まれた放射能の量を定量化した。データを、ＤＭＳＯのみで処置した細胞の増殖に対する百分率で記載した（制御に対する％；図４参照）。ＭＡＺ５１は阻害剤として最も強度の効果を有していた。

７）ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１は内皮細胞及び腫瘍細胞における細胞自滅を誘発する。

ヒト内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）及びラット膵臓腫瘍細胞（１ＡＳ）を再懸濁させた（１０^５細胞／ｍｌ）。細胞懸濁液５０μｌを９６ウェルで細胞培養プレートに分散させ、３７℃で２４時間インキュベートした。その後細胞を所定の濃度の種々の阻害剤を用いて更に２４時間インキュベートした。化合物の副次的な細胞自滅効果(pro-apoptotische Effekt)を、ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｅｔｅｃｔｉｏｎＥＬＩＳＡ^ｐｌｕｓキット(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)を用いて、メーカーの記載に従って測定した。このキットは、活性な細胞死（細胞自滅）により遊離された、細胞質のヒストン随伴ＤＮＡ断片（モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソーム）の定性的及び定量的なインビトロ測定のための、測光による酵素免疫アッセイを有する。４０５ｎｍでの光学密度の測定により、誘発された細胞自滅の割合を定量化することができる。未処置の細胞に対する測定値を、阻害剤濃度に対してプロットした。結果を図５に示すが、これは、ＭＡＺ５１が内皮細胞のみならず腫瘍細胞においても細胞自滅の有効な活性化因子であることを示す。

ラットの腫瘍細胞株の細胞(Nestlら, 2001, Cancer Research 61: 1569-1577)を、１％ＤＭＳＯ（溶剤制御）、インドリノン２．５μＭ又は１０μＭの存在で２４時間培養した。細胞自滅を抗ＤＮＡペルオキシダーゼ抗体を用いて定量化した。ペルオキシダーゼにより触媒された色原体反応において生成された色素の量を４０５ｎｍで測光により測定し、細胞自滅に関連する細胞質のモノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソームの量と関連づけた。データを、溶剤制御の細胞に関する細胞自滅％（制御に対する％）で示す（図６）。ＭＡＺ５１は最も有効な細胞自滅誘導原である。

８）ＭＡＺ５１はインビボで、１ＡＳ及びＭＴ４５０のラットのガンの成長を阻害する。

１ＡＳ細胞（５×１０^５）を２つの群のＢＤＸラット（１群当たり８体のラット）に皮下注入した。引き続き、１つの群に、毎日１００μｌ／動物のＤＭＳＯを実験の終了まで注入した。別の群には、毎日１００μｌ／動物のＭＡＺ５１（ＤＭＳＯ中で１０ｍｇ／ｍｌ）（これは４〜５ｍｇ／ｋｇに相当する）を注入した。腫瘍体積を規則的に腫瘍細胞の注入後に測定した。図７に見て取れるように、ＭＡＺ５１を用いた処置により、ＡＳ１腫瘍のインビボでの成長は本質的に阻害される。

ＭＴ４５０のラットの乳ガン細胞をウィスターフルス（ＷｉｓｔａｒＦｕｒｔｈ）ラットに皮下注入した。１００％ＤＭＳＯ中のＭＡＺ５１又は溶剤制御（１００％ＤＭＳＯ）８ｍｇ／ｋｇ／日を用いた作用物質による治療を、腫瘍細胞を注入した翌日に開始した。ＭＡＺ５１又は溶剤のみを、毎日腹腔内注入した。各試験群は８体の動物を含んでいた。腫瘍を４〜５日おきに測定した。平均腫瘍体積を図８に示す。

表及び図の説明
第１表：種々の受容体チロシンキナーゼの活性化突然変異及びそれにより引き起こされる疾患に関する一覧。

第２表：血管新生に依存する疾患に関する一覧。

図１：ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１で処置したＰＡＥ細胞からのＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の免疫沈降（ｉ．ｐ．）のウェスタンブロット。（−）は制御であり（刺激されていない細胞）；（＋）は、相応する所定の阻害剤（ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６又はＭＡＺ５１）０．５μＭ、５μＭ又は５０μＭで処置したかまたは処置しない、成長因子により刺激された細胞である。免疫沈降に使用した抗体の複数のプローブ（１つのプローブ）は、抗ホスホチロシン抗体（抗ホスホ−Ｙ）、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体（抗ＶＥＧＦＲ−２）又は抗ＶＥＧＦＲ−３抗体（抗ＶＥＧＦＲ−３）のいずれかである。

図２：ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への（^３Ｈ）−チミジンの取り込み分の量と、使用した阻害剤（ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１）の濃度との関数。ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１による細胞増殖の阻害は、この場合投与量に依存する。

図３：漿尿膜（ＣＡＭ）内での血管新生の阻害。Ａ：擬似的に処置した細胞（制御）。Ｂ：Ｍａｅ１０６で処置したＣＡＭの細胞。

図４：ラットの腫瘍細胞株（ＡＳＭＬ、１ＡＳ、Ｇ、ＡＴ６．１、ＭＴＬＮ３、ＭＴＬＹ、ＮＭ０８１及びＭＴ４５０）への（^３Ｈ）−チミジンの取り込み分の測定値（％で）と、使用した阻害剤の濃度との関数。ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１による細胞増殖の阻害は投与量に依存する。

図５：ヌクレオソーム−ＥＬＩＳＡ試験（細胞死検出ＥＬＩＳＡ）。それぞれの細胞株の死細胞の広がりを（４０５ｎｍでの相対吸収として）阻害剤ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１及びＭＡＺ５１−２の使用に関して示す。ＭＡＺ５１は、ヒト内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）及びラットの膵臓の細胞株１ＡＳにおける細胞死を最も効果的に誘発する。

図６：ヌクレオソーム−ＥＬＩＳＡ試験（細胞死検出ＥＬＩＳＡ）。それぞれのラットの腫瘍細胞株の死細胞の広がり（％での細胞自滅）を、阻害剤ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１の使用に関して示す。ＭＡＥ８７、ＭＡＥ１０６及びＭＡＺ５１は一連のラットのガン細胞株における細胞死を誘発する。

図７：ＭＡＺ５１を用いた腫瘍細胞１ＡＳの処置に関して、腫瘍体積と、腫瘍細胞注入後の日数との関数を示す図。試験したラットにおいて、ＭＡＺ５１を用いた１ＡＳ腫瘍細胞の処置後、腫瘍の成長がインビボで阻害されることが示される。

図８：ＭＡＺ５１及びＤＭＳＯ溶液（負の制御）を用いた腫瘍細胞ＭＴ４５０の処置に関して、腫瘍体積と、腫瘍細胞注入後の日数との関数を示す図。試験したラットにおいて、ＭＡＺ５１を用いた処置後、ＭＴ４５０腫瘍細胞の腫瘍成長がインビボで阻害されることが示される。＋／−ＳＥは、バッチ当たりの、試験した８体のラットの平均値からの腫瘍体積の標準偏差を表す。

阻害剤で処置したＰＡＥ細胞からのＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３の免疫沈降（ｉ．ｐ．）のウェスタンブロットを示す図。

ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への（^３Ｈ）−チミジンの取り込み分の量と、使用した阻害剤の濃度との関数を示す図。

漿尿膜（ＣＡＭ）内での血管新生の阻害を示す図。

ラットの腫瘍細胞株への（^３Ｈ）−チミジンの取り込み分の測定値と、使用した阻害剤の濃度との関数を示す図。

ヌクレオソーム−ＥＬＩＳＡ試験において、それぞれの細胞株の死細胞の広がりを（４０５ｎｍでの相対吸収として）阻害剤の使用に関して示す図。

ヌクレオソーム−ＥＬＩＳＡ試験において、それぞれのラットの腫瘍細胞株の死細胞の広がり（％での細胞自滅）を、阻害剤の使用に関して示す図。

ＭＡＺ５１を用いた腫瘍細胞１ＡＳの処置に関して、腫瘍体積と、腫瘍細胞注入後の日数との関数を示す図。

ＭＡＺ５１及びＤＭＳＯ溶液（負の制御）を用いた腫瘍細胞ＭＴ４５０の処置に関して、腫瘍体積と、腫瘍細胞注入後の日数との関数を示す図。

Claims

一般構造式

の化合物
又は化合物ＩＩＩ）の塩
を含有する、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞成長因子受容体）の活性を阻害するための薬剤。
リンパ管新生を阻害するための、請求項１記載の薬剤。
リンパ管新生に依存する疾患及び／又はフィラリア症を治療するための、請求項１又は２記載の薬剤。
一般構造式

の化合物
又は化合物ＩＩＩ）の塩
を、１〜２０ｍｇ／被験者の体重ｋｇの濃度で含有する、請求項１から３までのいずれか１項記載の薬剤。