DE69223980T2

DE69223980T2 - Bindungstest unter benutzung eines markierten reagens

Info

Publication number: DE69223980T2
Application number: DE69223980T
Authority: DE
Inventors: Frederick Chu; Roger Ekins
Original assignee: Multilyte Ltd
Current assignee: Multilyte Ltd
Priority date: 1991-10-15
Filing date: 1992-10-15
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2012-10-16
Also published as: US5516635A; DE69223980D1; ES2112916T3; JP3097866B2; JPH07500906A; ATE161964T1; EP0608370A1; WO1993008472A1; EP0608370B1; AU2872092A; DK0608370T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Bindeassays unter Verwendung eines markierten Reagens. Bindeassay umfassen Immunassays zur Bestimmung von Konzentrationen von Antigenen in flüssigen Proben, und es ist auch möglich, die vorliegende Erfindung zur Bestimmung oder zum Nachweis anderer Analyten, einschließlich von DNA-Sequenzen, in flüssigen Proben heranzuziehen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für nichtkompetitive Sandwichassays, d.h. Assays, bei denen eine flüssige Probe, die ein Antigen oder einen anderen zu untersuchenden Analyten, wie z.B. ein Hormon, enthält, mit einem ersten Bindemittel (z.B. einem Antikörper) in Kontakt gebracht wird, das Bindungsstellen auf seinem Molekül aufweist, die für den Analyten spezifisch sind, wodurch ein Teil der Bindungsstellen auf dem ersten Bindemittel, die für die Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe repräsentativ sind, vom Analyten besetzt werden. Die teilweise Besetzung der Bindungsstellen wird dann mittels eines Rücktitrationsverfahrens bestimmt, das die Verwendung eines zweiten Bindematenals vorsieht, das sich an den gebundenen Analyten oder an die vom gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen, jedoch nicht an unbesetzte Bindungsstellen binden kann. Der Einfachheit halber wird das erste Bindemittel nachstehend als Einfangbindemittel und das zweite Bindematerial als Entwicklungsbindematerial bezeichnet.
Nichtkompetitive Assays sind von kompetitiven Assays zu unterscheiden, bei denen das Rücktitrationsverfahren die Verwendung eines Entwicklungsbindematerials vorsieht, das mit dem Analyten um die Bindungsstellen auf dem Einfangbindemittel konkurriert, z.B. eine markierte Version des Analyten oder eines anderen Materials, das sich an die unbesetzten Stellen auf dem Einfangbindemittel binden kann, obwohl die vorliegende Erfindung auch in solchen Assays angewandt werden kann. In jedem Fall wird das Ausmaß der Bindung des Entwicklungsbindematerials anhand der Markierung des Entwicklungsbindematerials (oder sowohl dieses Materials als auch den Einfangbindemittels), beispielsweise mittels eines Fluoreszenzmarkers, und durch Vergleichen der Stärke des Signals, das vom gebundenen markierten Produkt der Bindung des Analyten an das Einfangbindemittel und das Entwicklungsbindematerial ausgesendet wird (im Falle der unbekannten Probe) mit jenen Signalstärken, die mit entsprechenden Proben bekannter Analytenkonzentration erzielt werden, was zusammen eine Dosis-Response-Kurve ergibt. Eine Art eines nichtkompetitiven Sandwichassays umfaßt die Verwendung eines markierten Entwicklungsbindematerials und eines immobilisierten Einfangbindemittels, die markiert oder unmarkiert sein können.

Hintergrund der Erfindung

Es wird heute allgemein anerkannt, daß nichtkompetitive Sandwich-Immunassays im allgemeinen eine höhere Empfindlichkeit aufweisen als die herkömmlicheren kompetitiven Immunassays. Die weithin anerkannte Erklärung für diese höhere Empfindlichkeit ist die Verwendung relativ großer Mengen des immobilisierten Einfangbindemittels (üblicherweise ein Antikörpers auf einem festen Träger) und des markierten Entwicklungsbindematenals (auch häufig ein Antikörper). Durch Verwendung großer Mengen an Antikörpern, insbesondere Einfangantikörpern, wird die Reaktionsgeschwindigkeit zwischen Analyt und Einfangantikörper erhöht, was dem Massenwirkungsgesetz zufolge impliziert, daß in jedem gegebenen Zeitintervall eine größere Menge an Analyt auf dem Festphasen-Einfangantikörper eingefangen wird. Somit wird die Verwendung großer Mengen an Einfangantikörpern im allgemeinen als wesentlicher Beitrag zur Entwicklung nichtkompetitiver Immunassays betrachtet, die sehr hohe Empfindlichkeit mit relativ kurzen Inkubationszeiten kombinieren. (Siehe z.B. Hay et al., "American Thyroid Association Assessment of Current Free Thyroid Hormone and Thyrotropin Measurements and Guidenes for Future Clinical Assays" in Clinical Chemistry, Bd. 37, Nr. 11, (1991), S. 2002-2008.) Dieser Ansatz ist jedoch mit einigen Nachteilen verbunden. Beispielsweise führt er dazu, daß der Verbrauch von gegebenenfalls seltenen und in der Herstellung teuren Antikörpern sehr hoch ist. Es ist die Anwendung verschiedener Strategien vorgesehen, um die Gesamtfläche des festen Trägers zu maximieren, auf dem der Einfangantikörper abgelagert wird. Beispielsweise wurden poröse Clasmikrokügelchen als feste Träger in Sandwichassay-Systemen verwendet, wobei die Poren die der Antikörperbindung zur Verfügung stehende Oberfläche stark vergrößern.
Roger Ekins führte z.B. in WO-84/01031, WO-88/01058 und WO-89/01157 an, daß diese allgemeine Auffassung falsch ist und daß unter gewissen Umständen Assays entwickelt werden können, die eine sogar noch größere Empfindlichkeit aufweisen als jene, die unter den obigen Bedingungen erzielbar ist, wenn die unbekannte Probe und Standardproben, die den Analyten enthalten, mit einer so geringen Menge des Einfangbindemittels in Kontakt gebracht werden, daß nur ein unbedeutend geringer Anteil des Analyten an das Einfangbindemittel gebunden wird. (Dieser unbedeutend geringe Anteil macht üblicherweise weniger als 5% und im Idealfall 1-2% oder weniger der Gesamtmenge an Analyt in der Probe aus, wobei zu berücksichtigen ist, daß unvermeidliche Fehler bei der Analytenbestimmung, die durch begrenzte Genauigkeit beim Umgang mit Probe und Reagens, den Signalmessungen, der Standardisierung, durch Temperaturschwankungen und dergleichen an anderer Stelle in das Meßverfahren eingeführt werden, im allgemeinen in der Größenordnung von 10% des Analyten in der Probe liegen, obwohl manchmal die Bindung höherer Anteile des Analyten bis zu etwa 10% tolerierbar sein kann, wenn eine exakte Bestimmung weniger wichtig ist.) Nur wenn ein unbedeutend geringer Anteil der Gesamtmenge des Analyten gebunden wird, steht (im thermodynamischen Gleichgewicht) die Teilbesetzung F der Bindungsstellen auf dem Einfangbindemittel mit der Konzentration [A] des Analyten in der Probe über die Gleichung
in Beziehung, worin K die Affinitätskonstante des Einfangbindemittels für den Analyten (bei Gleichgewicht gemessen) und bei gegebener Temperatur und anderen gegebenen Bedingungen eine Konstante ist. Bevor sich das thermodynamische Gleichgewicht einstellt, besitzt die obige Gleichung ebenfalls annähernd Gültigkeit (sofern zum Zeitpunkt der Messung der Teilbesetzung nur ein unbedeutend geringer Anteil des Analyten in der Probe an das Einfangbindemittel gebunden wurde, gleichgültig, ob später, z.B. nach Erreichen des Gleichgewichts, eine höhere, signifikante Menge gebunden wird), wobei die einzige Änderung in diesem Fall darin besteht, daß in einer solchen Situation die Konstante K in der Gleichung die scheinbare Affinitätskonstante des Einfangbindemittels für den Analyten zum Zeitpunkt der Messung ist.
Von Roger Ekins wurde in WO-89/01157 usw. auch vorgeschlagen, ein solches Verfahren mit Probenvolumina in der Größenordnung von 1 ml oder weniger unter Verwendung eines Einfangbindemittels durchzuführen, das in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit Durchmessern von z.B. 1 mm² oder weniger auf einen festen Träger aufgebrachtwird.
EP-A-396.801 betrifft einen qualitativen Assay auf der Basis eines visuellen Verfahrens zum Nachweis von über einer Schwelenkonzentration vorhandenen Analyten mittels gefärbter Mikrokügelchen, um ein visuell nachweisbares Ergebnis zu liefern. In diesem Assay wird der zum Binden des Analyten verwendete Antikörper auf einer großen Fläche immobilisiert. In den Beispielen ist unter D1 von einer Nachweisgrenze von etwa 50 mU/l die Rede.
EP-A-360.088 beschreibt ein Assayreagens, umfassend einen mit einem Polymerteihen verbundenen Antikörper. Die Gegenwart des Polymerteuchens wird anhand des Absorptionsvermögens nachgewiesen, wobei das Polymer Strahlung mit einer Frequenz absorbiert, bei der das Monomer, das zu dessen Bildung verwendet wird, dies nicht tut.
EP-A-267.317 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Proteinen und Viren, deren Antikörper am Ende eines Tauchstabs immobilisiert werden. Nachdem sich das Zielprotein oder -virus an den Antikörper gebunden hat, wird seine Gegenwart durch In- Kontakt-Bringen des Tauchstabs mit an einem zweiten Antikörper konjugierten Mikrokügelchen nachgewiesen. Diese Mikrokügechen können sich an das gebundene Protein oder Virus binden.
EP-A-301.584 offenbart ein Nachweisreagens, wobei ein Antikörper an ein Latexteilchen gebunden ist, das einen Fluoreszenzfarbstoff enthält. Der Assay ist eine Variante eines Agglutinationsassays, bei dem sich mehrere Farbstoff enthaltende Mikrokügelchen an einen Analyten binden und von einzelnen ungebundenen Mikrokügelchen unterschieden werden können.
Bei einem derartigen System kann jedoch das Problem auftauchen, einen Marker bereitzustellen, der ein ausreichend starkes, aber empfindliches Signal liefert. Es wurden auch Zweifel über die mit Mikrospot-Assayformaten erzielbaren Empfindlichkeiten geäußert, da der Einsatz sehr geringer Mengen an Festphasen-Einfangbindemittel notwendigerweise lange Inkubationszeiten erfordert und zu Assays mit geringer Empfindlichkeit führt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelder haben festgestellt, daß in einem solchen System sehr gute Ergebnisse erzielbar sind, indem als Markierungssystem Mikrokügelchen mit einer Größe im µm- Bereich und vorzugsweise darunter eingesetzt werden, die einen Marker, vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung, tragen. Durch kombinierten Einsatz eines solchen Markers für das Entwicklungsbindematerial alleine oder für das Entwicklungsbindematerial und das Einfangbindemittel, und sehr geringer Mengen des Einfangbindemittels mit hoher Oberflächendichte auf einem festen Träger in Form eines Mikrospots mit einem Durchmesser von unter 1 mm² können nichtkompetitive Assaysysteme entwickelt werden, die ebenso schnell oder sogar noch schneller durchzuführen sind als herkömmliche Sandwichsysteme, die auf vergleichsweise großen Mengen Einfangbindemittel beruhen, und Empfindlichkeiten besitzen, die mit jenen dieser Systeme vergleichbar oder sogar deutlich höher sind. Dieses essentielle Entdeckung, die im Widerspruch zu derzeit anerkannten Ansichten über die Gestaltung hochempfindlicher Assays steht und völlig unerwartet ist, kann die Grundlage für die Entwicklung einer Vielzahl hochqualitativer Diagnosevorrichtungen im Miniaturformat bilden, die eine überaus hohe Empfindlichkeit besitzen und trotzdem nur relativ kurze Inkubations- und Meßzeiten erfordern.
Natürlich können die Mikrokügelchen auch für Markierungszwecke in einem kompetitiven Assaysystem unter Verwendung ebenso geringer Mengen an Einfangbindemittel eingesetzt werden, in solchen Systemen muß die Empfindlichkeitsgrenze in der Praxis nicht unbedingt die spezifische Aktivität der Markierung sein, und entsprechende oder deutliche Zunahmen der Empfindlichkeit aufgrund der Verwendung der Mikrokügelchen können daher nicht unbedingt erreicht oder selbst erwartet werden, obwohl eine Erhöhung der Schnelligkeit sehr wohl zu erwarten ist.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Bindeassayverfahren zur Bestimmung der Konzentration eines oder mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt; dabei kommen ein Einfangbindemittel, das Bindungsstellen besitzt, die für jeden Analyten, von dem erwartet wird, daß er in der Probe vorhanden ist, spezifisch sind, und ein Entwicklungsbindematerial zum Einsatz, das sich an gebundenen Analyten, an vom gebundenen Analyten besetzte Bindungsstellen des Einfangbindemittels oder an vom Analyten unbesetzte Bindungsstellen binden kann,
wobei das Einfangbindemittel für einen bestimmten Analyten in hoher Dichte in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit jeweils einer Fläche von weniger als 1 mm² auf einem Träger immobilisiert wird, und worin
markierte Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von weniger als 5 µm in einem solchen Verhältnis zum Entwicklungsbindematerial im Assay eingesetzt werden, daß die Stärke des Signals der Markierung repräsentativ für den Anteil der Besetzung der Bindungsstellen des Einfangbindemittels ist, wodurch die Konzentration des zu bestimmenden Analyten bestimmt werden kann.
In anderen (nachstehend beschriebenen) Ausführungsformen bietet die Erfindung ein Set zur Verwendung in einem Bindeassayverfahren sowie ein Bindeassayverfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung eines Analyten, umfassend eine einstrangige DNA- Sequenz in einer flüssigen Probe.

Ausführliche Offenbarung

Fluoreszierende Mikrokügelchen in µm-Bereich oder darunter sind etwa seit 1982 bekannt und von vielen Herstellerfirmen erhältlich, z.B. von Seradyn Inc. oder unter dem Markennamen Fluospheres von Molecular Probes Inc.. Geeignete Mikrokügelchen besitzen einen Durchmesser von im allgemeinen weniger als 5 µm, vorzugsweise höchstens 1 µm, noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,01 bis 0,5 µm, wobei es vorzuziehen ist, Kügelchen zu verwenden, die alle im wesentlichen die gleiche Standardgröße besitzen. Die Mikrokügelchen können aus jedem geeigneten Inertmaterial, wie z.B. einem Polymerlatex wie einem Polystyrol latex, bestehen, das auf seiner Oberfläche günstigerweise entweder mit negativ geladenen Gruppen, wie z.B. Sulfat, Carboxyl oder carboxylatmodifizierten Gruppen, oder mit positiv geladenen Gruppen, wie z.B. Amidingruppen, versehen ist. Die Gegenwart solcher geladener Gruppen auf der Oberfläche der Kügelchen ermöglicht, daß eine Vielzahl von Proteinen, z.B. IgG, Avidin/Streptavidin und BSA, in verschiedenen geeigneten Oberflächendichten passiv adsorbiert oder kovalent an die Oberflächen der Kügelchen gebunden werden können.
Obwohl die Mikrokügelchen Marker verschiedener Art tragen können, z.B. radioaktive, chemolumineszierende oder Enzymmarker, tragen sie vorzugsweise fluoreszierende Markierungen. Die fluoreszierenden und radioaktiven Markierungen sind vorzugsweise in den Mikrokügelchen enthalten, wo sie vor äußeren Einflüssen geschützt sind, können jedoch auch auf der Oberfläche der Kügelchen vorhanden sein (was bei Enzym- und Chemolumineszensmarkierungen im allgemeinen der Fall ist). jedes Mikrokügelchen enthält günstigerweise eine große Anzahl an Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen als Markierungen, z.B. bis zu 10 Millionen in Kügelchen mit einem Durchmesser von 1 µm, wobei in kleineren Kügelchen weniger vorhanden sind (z.B. 100 oder 1.000 bis 100.000 oder 1 Million), bis hinunter zu etwa 10 in sehr kleinen Kügelchen. Die Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle können so ausgewählt werden, daß sie Fluoreszenz des geeigneten Farbbereichs (Anregungs- und Emissionswellenlänge) liefern, die mit herkömmlichen Filtersets kompatibel ist; es können z.B. gelb/grüne, orangefarbene oder rote oder auch speziell abgestimmte Filtersets verwendet werden. Zu Fluoreszenzfarbstoffen zählen Cumarin, Fluorescein, Rhodamin und Texasrot. Die Fluoreszenzfarbstoff- Moleküle können längere Fluoreszenzdauer aufweisen, sodaß die Stärke des von ihnen ausgesandten Signals nach dem bekannten zeitaufgelösten Fluoreszenzverfahren nach dem Abklingen der Hintergrundinterferenzen bestimmbar ist, wie z.B. Lanthanidchelate -und -cryptate. Es sind auch Farbstoffe geeignet, die nur in nichtwäßrigen Medien fluoreszieren. Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe zur Verwendung in den Mikrokügelchen sind öllösliche Farbstoffe, um ihre Einarbeitung in das Innere der Mikrokügelchen zu vereinfachen. Derzeit werden gelb/grüne, orangefarbene und rote Fluospheres bevorzugt, die bei den 488, 568 und 647 nm Krypton/Argon-Mischgas-Laserlinien sehr wirkungsvoll angeregt werden.
Bei der Verwendung als Markierung für das Entwicklungsbindematerial oder für das Einfangbindemittel und das Entwicklungsbindematerial in den Assaysystemen der Erfindung kann das Entwicklungsbindematerial oder Avidin, das als "Universalmarker"-Reagens eingesetzt werden und jedes biotinylierte Bindematerial binden kann, oder auch das Einfangbindemittel physikalisch auf der Oberfläche der Mikrokügelchen adsorbiert sein. Es ist jedoch günstiger, wenn geeignet oberflächenmodifizierte Mikrokügelchen ausgewählt werden und das Entwicklungsbindematerial (z.B. Antikörper) oder das Einfangbindemittel (z.B. Antikörper) entweder direkt oder über eine Linkergruppierung, wie z.B. Carbodiimid-Aktivierung, kovalent an sie gebunden wird. Zur Verbindung der Mikrokügelchen mit dem Bindematerial kann das Bindematerial daher an hydrophobe, sulfatmodifizierte Mikrokügelchen adsorbiert oder kovalent an aldehyd- oder carboxylatmodifizierte, hydrophile Mikrokügelchen gebunden werden, wobei das letztere Verfahren über ein wasserlösliches Carbodiimid erfolgt. Wenn sowohl das Einfangbindemittel als auch das Entwicklungsbindematerial mit fluoreszierenden Mikrokügelchen markiert sind, werden natürlich unterschiedliche Farbstoffe in den zwei Mikrokügelchen-Sätzen eingesetzt, wobei das Signalstärke-Verhältnis dann wie in WO 88/01058 beschrieben bestimmt und als Vergleich herangezogen werden kann.
Es ist daher offensichtlich, daß die viele Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle enthaltenden Mikrokügelchen insofern ein Amplifikationssystem darstellen (wie auch Mikrokügelchen, die mehrere Moleküle einer Markierung anderer Art, z.B. eine radioaktive oder Chemolumineszenzmarkierung, tragen), als ein Molekül oder eine Einheit des Entwicklungsbindematerials zu einem Signal führt, das auf eine große Zahl an Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen oder eine beträchtliche Anzahl anderer Markermoleküle zurückzuführen ist. Ein derartiges Amplifikationssystem kann daher die Empfindlichkeit jener Assayverfahren deutlich steigern, bei denen der regulierende Faktor der Assayempfindlichkeit die Signalstärke ist, z.B. wenn nur eine sehr geringe Menge an Einfangbindemittel eingesetzt wird und daher auch die Menge an Entwicklungsbindematerial sehr gering ist.
Die Mikrokügelchen werden vornehmlich in Verbindung mit einem Assaysystem eingesetzt, bei dem das immobilisierte Material, üblicherweise das Einfangbindemittel (Einfangantikörper), auf einem festen Träger in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit einer Fläche von 1 mm² bis hinunter zu 100 µm² oder weniger und einem Durchmesser von z.B. 0,01 bis 1 mm abgelagert wird, obwohl es bei sehr kleinen Mikrospots notwendig sein kann, sehr kleine Mikrokügelchen oder weniger größere Mikrokügelchen einzusetzen. Die Oberflächendichte des Einfangbindemittels auf dem Mikrospot liegt günstigerweise im Bereich von 1.000 bis 100.000 Moleküle/µm², vorzugsweise 10.000 bis 50.000 Moleküle/µm² im Fall von Antikörpern. Für andere Bindemittel kann die Oberflächendichte in diesem Bereich, darüber oder darunter liegen, sollte allerdings vorzugsweise so hoch wie möglich sein, ohne die Bindung des Analyten sterisch zu hindern. Diese Mikrospots werden in Verbindung mit Probenvolumen von im allgemeinen 1 ml oder weniger, beispielsweise bis zu 50 oder 100 µl oder sogar noch weniger - je nach Größe des Mikrospots, eingesetzt, wobei das Ziel die Bedeckung des Mikrospots ist.
Das Mikrospotverfahren kann dazu dienen, unterschiedliche Analyten in der gleichen oder in verschiedenen flüssigen Proben in einem einzigen Vorgang zu bestimmen, indem verschiedene Einfangbindemittel auf unterschiedlichen Mikrospots, z.B. 10 oder mehr, beispielsweise bis zu 50 oder mehr, auf dem gleichen festen Träger und unter Verwendung verschiedener oder gleicher Entwicklungsbindematerialien, die mit den Mikrokügelchen für die unterschiedlichen Bindeassays markiert sind, immobilisiert werden. Die Markierungen (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe), die mit verschiedenen Bindeassays assoziiert sind, und/oder die Verfahren zur Messung der Signalstärken werden so gewählt, daß die Ergebnisse der diversen Assays differenziert werden können. Verfahren hierfür sind z.B. aus WO 88/01058 bekannt.
Um die mit der vorliegenden Erfindung erzielbaren Ergebnisse zu optimieren, sollten einige unterschiedliche Merkmale optimiert werden, z.B.
i) die Teilbesetzung des Einfangbindemittels durch den Analyten,
ii) die Größe der Affinitätskonstante des Einfangbindemittels für den Analyten zum Zeitpunkt der Messungen und - falls die Messungen vor Erreichung des Gleichgewichts durchzuführen sind - die Geschwindigkeit, mit der Gleichgewicht erreicht wird,
iii) die Oberflächendichte des Einfangbindemittels auf seinem Träger,
iv) die Größe der Mikrospots,
v) die Beschaffenheit des Trägers,
vi) das zur Messung des Signals verwendete Gerät
vii) die Behandlung der Mikrokügelchen, z.B. zum Blockieren nicht umgesetzter Stellen, und
viii) die Beschaffenheit der eingesetzten Pufferlösungen.
Betreffend Merkmal i) ist zu beachten, daß die Verwendung von zu viel Einfangbindemittel vermieden werden soll, um optimale Empfindlichkeit zu erzielen. Theoretisch kann gezeigt werden, daß (unter der Annahme, daß das Meßinstrument selbst null Rauschen erzeugt) das höchste Signal/Rausch-Verhältnis (R) erhalten wird, wenn die Menge an Einfangbindemittel unter 0,01/K fällt und gegen null geht, wobei K die Affinitätskonstante zwischen dem Einfangbindemittel und dem Analyten zum Zeitpunkt der Messung ist. Dieses Signal/Rausch-Verhältnis sei als R&sub0; definiert. (Man beachte, daß eine Menge an Einfangbindemittel von 0,01/K unter 1 % der Analyten moleküle in der Lösung bindet, der das Einfangbindemittel ausgesetzt wird.) Wenn die Fläche, auf der das Einfangbindemittel abgelagert wird, vergrößert wird (wobei die Obeflächendichte des Bindemittels konstant bleibt), nimmt die Menge an Bindemittel ebenfalls zu. Der Prozentsatz an insgesamt gebundenem Analyten steigt ebenfalls (wenn auch in geringerem proportionalem Ausmaß), das Signallrausch-Verhältnis sinkt allerdings. Wenn beispielsweise die Fläche 100fach vergrößert wird, sodaß die Menge an Bindemittel 1/K ist, steigt die Menge an gebundenem Analyten auf ≤50%, und das Signal/Rausch-Verhältnis sinkt auf die Größenordnung von R&sub0;/2.
Die Beziehung zwischen dem Verhältnis R und der Konzentration des Einfangbindemittels (d.h. die mit Bindemittel beschichtete Fläche) ist in Fig. 1 der beiliegenden Abbildungen dargestellt. Diese Figur ist eine grafische Darstellung des Signal/Rausch- Verhältnisses (die durchgehende Linie, worin die y-Achse der Prozentsatz jenes Wert ist, wenn die mit Bindemittel beschichtete Fläche und somit die Bindemittelkonzentration gegen null geht) und der Menge an gebundenem Analyten (die strichlierte Linie, worin die y-Achse der Prozentsatz des insgesamt im Medium vorhandenen Analyten ist, unter der Annahme, daß die Gesamtmenge des Analyten sehr gering ist, d.h. < 0,0001/K) als Funktionen der Gesamtmenge an Einfangbindemittel (in Einheiten von 1/K, auf der x-Achse) auf der beschichteten Fläche. Bei Vergrößerung der mit Einfangmittel beschichteten Fläche (und somit der Konzentration) nimmt klarerweise der Prozentsatz des insgesamt gebundenen Analyten zu, das Signal/Rausch-Verhältnis sinkt allerdings. Dieser Effekt ist grafisch in Fig. 2 der bei leigenden Abbildungen dargestellt, worin d der Durchmesser in mm der mit Einfangbindemittel beschichteten Fläche ist, [AB] die Konzentration von Bindemittel unter Annahme einer Oberflächendichte von 0,1/K pro mm² ist und sin das Signallrausch-Verhältnis ist, das als Prozentsatz jenes Werts ausgedrückt ist, der beobachtet wird, wenn die Oberfläche gegen null geht. Diese Figur soll weiters zeigen, daß bei Vergrößerung der beschichteten Fläche die Menge an gebundenem Analyten ebenfalls ansteigt, das Signal/Rausch-Verhältnis und somit die Empfindlichkeit aber sinken.
Obwohl jedoch das Signal/Rausch-Verhältnis R am höchsten ist, wenn die Bindemittelkonzentration weniger als 0,01/K beträgt, ist es klar, daß das Verhältnis immer noch annehmbar hoch sein kann, wenn die Menge an eingesetztem Einfangbindemittel 1/K entspricht oder diesen Wert übersteigt. Die Obergrenze der Menge an auf der Mikrospotfläche beschichtetem Bindemittel ist vorzugsweise 10/K. Dies impliziert eine zehnfach geringere Empfindlichkeit, als sie unter Verwendung einer 1000fach geringeren Menge an Bindemittel erzielbar ist, wobei zu betonen ist, daß die Erfindung zwar eine sehr hohe Empfindlichkeit bieten kann, sie aber auch für jene Fälle geeignet ist, wo eine niedrigere Empfindlichkeit als die maximal erreichbare annehmbar ist.
Bezüglich Faktor ii) ist folgendes zu unterstreichen: es mag zwar auf den ersten Blick besser erscheinen, ein Einfangbindemittel mit einem niedrigen Gleichgewichtswert von K einzusetzen, doch es stellt sich im allgemeinen heraus, daß es bei hochempfindlichen Assays zweckmäßiger ist, Bindemittel mit höheren K-Werten im Gleichgewicht zu verwenden, z.B. 10¹¹ - 10¹² oder mehr Liter/Mol, und (falls erforderlich oder gewünscht) die Messung vor Erreichung des Gleichgewichts vorzunehmen, sodaß zum Zeitpunkt der Messung nur ein unbedeutend geringer Anteil des Analyten gebunden wurde, wobei der tatsächliche Wert von K zu diesem Zeitpunkt der Messung möglicherweise deutlich niedriger sein kann, z.B. 10&sup8; - 10¹¹, obwohl ein beträchtlicher Teil des Analyten gebunden werden könnte, wenn die Messung bis zur Erreichung des Gleichgewichts verschoben werden würde. Höhere tatsächliche Werte von K können sich dann eher eignen, wenn die Analytenkonzentration niedrig ist (z.B. 10&sup6; Moleküle/ml), und tiefere tatsächliche Werte von K dann, wenn die Analytenkonzentration hoch ist (z.B. 10¹&sup4; Moleküle/ml). Günstigerweise liegt der tatsächliche Wert von K in der Größenordnung des Kehrwerts der in der Probe zu messenden Analytenkonzentration. Es ist vorzuziehen, ein solches Einfangbindemittel einzusetzen, daß mit den eingesetzten Mengen das Gleichgewicht innerhalb von 12 Stunden oder etwas weniger erzielt wird, die Messung aber innerhalb von 2 Stunden oder weniger vorzunehmen, lange bevor das Gleichgewicht erreicht ist. Diese frühe Messung vor Erreichung des Gleichgewichts ist besonders dann wichtig, wenn das Einfangbindemittel eine sehr hohe Affinitätskonstante für den Analyten besitzt, wie dies bei DNA-Sonden der Fall ist.
Betreffend Faktor iii) ist zu betonen, daß eine zu niedrige Oberflächendichte das Signal/Rausch-Verhältnis senkt, da die vom Einfangbindemittel besetzte und zur Bestimmung des Verhältnisses abgetastete Fläche zunimmt. Eine zu hohe Oberflächendichte kann hingegen sterische Hinderung zwischen benachbarten Einfangbindemittel-Molekülen hervorrufen, sodaß nicht alle Moleküle zur Bindung des Analyten zur Verfügung stehen. Vorversuche, die ermitteln sollen, ob sterische Hinderung ein Problem darstellt, können durchgeführt werden, indem Spots vanierender Bindemittel-Oberflächendichte gebildet, mit einem Marker wie z.B. ¹²&sup5;I markiert werden und gemessen wird, wie das Signal mit der Bindemittel-Oberflächendichte variiert, wobei das Optimum das höchste Signal ist. In der Vergangenheit wurden herkömmlicherweise Beschichtungen in der Größenordnung von 10 µg Einfangbindemittel (Antikörper) pro ml eingesetzt, für die vorliegende Erfindung können Werte von 100-200 µg Einfangbindemittel (Antikörper) pro ml geeigneter sein. Eine höhere Oberflächendichte besitzt auch den Vorteil, daß weniger Oberfläche für nicht-spezifische Bindung zur Verfügung steht, die ansonsten das Rauschen verstärken und das Signallrausch-Verhältnis reduzieren würde.
Zu Faktor v) ist auszuführen, daß der verwendete Träger selbst zum Rauschpegel beiträgt. Wenn der Pegel des Hintergrundrauschens ein Problem ist, kann es vorzuziehen sein, einen schwarzen Träger anstelle eines weißen zu verwenden, obwohl dies den Signalwert senken kann und einige schwarze Träger höhere Rauschpegel aufweisen als andere.
Bezüglich Faktor vi) ist es vorzuziehen, das Signal/Rausch-Verhältnis zu maximieren. Die Fläche, von der das Signal gemessen wird, ist günstigerweise klein und vorzugsweise auf die Fläche des Mikrospots oder einen Teil davon beschränkt. Das Messen des Signals aus einer größeren Fläche über den Mikrospot hinaus läßt den Rauschpegel ansteigen, ohne den Signalwert zu erhöhen, und senkt somit das Signal/Rausch-Verhältnis.
Somit kann es wünschenswert sein, die Beleuchtung zu bündeln und Messungen mittels eines Konfokal-Mikroskops oder eines anderen Geräts durchzuführen, das eine sehr präzise Beleuchtung erzielt.
Betreffend Faktor vii) ist es wünschenswert, daß nach der Adsorption oder kovalenten Bindung des Entwicklungsbindematerials oder Einfangbindemittels an die Mikrokügelchen die nicht umgesetzten Stellen auf den Mikrokügelchen blockiert werden, um ihre nicht-spezifische Bindung an andere biologische Moleküle oder den festen Träger für das Einfangbindemittel zu verhindern. Das Blockieren kann mit jedem nicht-intervenierenden Proteinmaterial erfolgen. Ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin, wird bevorzugt. Es stellte sich als wünschenswert heraus, nicht nur mit Rinderserumalbumin (BSA) oder Gleichwertigem, sondern auch mit einem Detergens, wie z.B. TWEEN-20 oder einem anderen nichtionogenen Detergens zu blockieren. Es wird angenommen, daß es einige Bindungsstellen auf den Mikrokügelchen gibt, die nicht durch BSA oder ein anderes Proteinmaterial alleine blockiert werden. Mit BSA alleine blockierte Mikrokügelchen scheinen nach wie vor Bindungsstellen zu besitzen, die sich an den festen Träger, z.B. die Kunststoffwände der Mikrotiternäpfe, in denen der Assay durchgeführt wird, oder an andere biologische oder nicht-biologische Moleküle binden können, die in anderen Komponenten des Systems vorhanden sind (z.B. in der flüssigen Probe), und die weiters zur nicht-spezifischen Bindung an das Einfangbindemittel fähig sind. Die Verwendung eines Detergens als zusätzliches Blockierungsmittel senkt die Anzahl solcher Bindungsstellen oder eliminiert sie zur Gänze. Das Detergens unterstützt auch die Entfernung von lose gebundenem Bindemittel oder -material oder anderer Proteine, die in den Speicher- und/oder Assaypuffer desorbieren und die Assays stören können. Nichtintervenierende Reaktanden können dazu dienen, aktivierte Gruppen auf der Oberfläche der Mikrokügelchen zu blockieren, z.B. inerte Amine, wie Ethanolamin, Glycin oder Lysin, zur Blockierung aktivierter Carboxylgruppen, jede Verbindung sollte allerdings auf Assay-Verträglichkeit überprüft werden.
Bezüglich Faktor viii) ist zu beachten, daß die Wahl der Bestandteile für den Assay- und den Waschpuffer die Empfindlichkeit der Ergebnisse beeinflussen kann. Mit TSH z.B. ergibt TRIS einen besseren Puffer als Phosphat. Es kann auch wünschenswert sein, daß der Puffer ein Detergens, wie z.B. TWEEN 40, enthält, um nichtspezifische Bindung zu verringern.
In anderen Belangen kann der Immunassay in bekannter Weise durchgeführt werden, wie z.B. in den früheren, hierin durch Verweise aufgenommenen Patentanmeldungen von Roger Ekins oder in der sonstigen einschlägigen Literatur beschrieben. Bei der Durchführung von Immunassays ist es vorzuziehen - wenn auch nicht entscheidend -, daß sowohl das Einfangbindemittel als auch das Entwicklungsbindematerial Antikörper sind. Monoklonale oder polyklonale Antikörper sind geeignet, und das Verfahren kann dazu verwendet werden, Analyten, wie z.B. Hormone, Nukleinsäuren, Proteine, Vitamine, Arzneimittel, Viren, Bakterien, Pestizide, Tumormarker oder andere Komponenten biologischer Proben, wie z.B. von Körperflüssigkeiten, zu untersuchen, wobei das Einfangbindemittel und das Entwicklungsbindematerial in geeigneter Weise gewählt werden, um den betreffenden Analyten zu binden. Der Analyt in einem Bindeassay kann eine Nukleotidsequenz sein, z.B. eine DNA-Nukleotidsequenz, in welchem Fall das Einfangbindemittel und das Entwicklungsbindematerial beide andere Nukleotidsequenzen sein können, die sich voneinander unterscheiden. Der Analyt kann nur ein Epitop für das Einfangbindemittel enthalten, oder das Epitop kann auf dem Analytenmolekül repliziert werden. Das polyklonale Entwicklungsbindematerial (bzw. der polyklonale Antikörper) kann mit einer Vielzahl von Epitopen auf dem Analyten oder dem Einfangbindemittel-Analytenkomplex reagieren, oder es kann ein Gemisch von zwei oder mehreren monoklonalen Entwicklungsbindematerial ien (Antikörpern) eingesetzt werden, die mit unterschiedlichen Epitopen reagieren.
Bei Verwendung für Nukleinsäure-(DNA-)Assays wird die DNA-Sonde, eine einstrangige Nukleotidsequenz, z.B. eine Oligonukleotidsequenz herkömmlicher Art, als Einfangbindemittel an einen festen Träger gebunden, der eine entsprechende einstrangige DNA- Sequenz erkennt, die den Analyten in einer flüssigen Probe darstellt; solche Sequenzen werden gebunden, um eine doppelstrangige Sequenz zu bilden. DNA-Sonden, die aus Oligonukleotidsequenzen bestehen, sind im Handel von einigen Firmen erhältlich, z.B. Clontech Laboratories Inc., oder sie können von Firmen wie z.B. British Biotechnology Products Ltd. im Auftrag synthetisiert und/oder modifiziert werden (z.B. mit Biotin oder Digoxigenin). Das Entwicklungsbindematerial kann entweder ein markierter Antikörper, der - im Gegensatz zu einstrangigen Sequenzen - die doppeistrangige Sequenz erkennt (siehe Fig. 3 der beiliegenden Abbildungen), oder eine andere DNA-Sequenz sein, die einen anderen Teil der DNA-Sequenz erkennt, die den Analyten darstellt, und markiert ist (siehe Fig. 4 der beiliegenden Abbildungen), wobei beide dieser Bindematerialien nicht-kompetitive Assays liefern. Bei kompetitiven Assays ist es möglich, ein markiertes Entwicklungsbindematerial zu verwenden, das unbesetzte Stellen des Einfangbindemittels erkennt, d.h. restliche DNA-Sonde, die nicht an Analyt gebunden ist (siehe Fig. 5 der beiliegenden Abbildungen). In jedem Fall wird die Markierung gemäß der Erfindung von eine Markierung tragenden Mikrokügelchen bereitgestellt, vorzugsweise Moleküle eines Fluoreszenzfarbstoffs, der in den Mikrokügelchen enthalten ist. In jeder der Fig. 3- 5 stellt A einen Mikrospot dar, B das Einfangbindemittel und M die Mikrokügelchen. In Fig. 3 ist ABDSD ein Antikörper gegen doppeistrangige DNA, und in Fig. 4 ist ABD Anti- Digoxigenin-Antikörper und D Digoxigenin. Hybridisierungsverfahren, die diese Vorgangsweise anwenden, sind bereits bekannt: siehe z.B. Guesdon J-L (1992) "Immunomatic Techniques Applied to the Specific Detection of Nucleic Acids", Jounal of Immunological Methods 150, 33-49; Mantero G, Zonaro A, Albertini A, Bertolo P & Primi. D. (1991), "DNA Enzyme Immunoassay: General Method for Detecting Products of Polymerase Chain Reaction", Clinical Chemistry 37/3, 422-429; Keller G.H., Huang D-F, Shih W-K & Manak M.M. (1990), "Detection of Hepatitis B Virus DNA in Serum by Polymerase Chain Reaction Amplification and Microtiter Sandwich Hybridization", Journal of Clinical Microbiology 28/6, 1411-1416; Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S, Stewart J, Hood L & Landegren U (1990), "Automated DNA Diagnostics Using an ELISA-based Oligonucleotide Ligation Assay", proceedings of the National Academy of Sciences 87, 8923-8927; Wolf S.F., Haines L., Fisch J., Kremsky J.N., Dougherty J.P. & Jacobs K. (1987), "Rapid Hydridization Kinetics of DNA Attached to Submicron Latex Particles", Nucleic Acids Research 15/7, 2911-2925.
Erfindungsgemäße DNA-Assays stellen daher eine Alternative zur allgemein bekannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Prüfen von DNA-Sequenzen dar. Das PCR- Verfahren ist mit bestimmten Nachteilen verbunden, z.B. Fehler aufgrund wiederholter Amplifikations-(d.h. Verdopplungs-)zyklen bei anfänglich sehr niedriger Konzentration der DNA-Sequenz. Die vorliegende Erfindung bietet ein alternatives Verstärkungsverfahren, in dem eine anfänglich sehr niedrige Konzentration der nachzuweisenden oder zu bestimmenden DNA-Sequenz in einem einzigen Schritt zu einem amplifizierten Signal führt, da sehr viele Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle im Mikrokügelchen enthalten sind, an dem ein Molekül des Entwicklungsbindematerials (Antikörper oder eine andere DNA-Sequenz) z.B. durch Adsorption oder direkte oder indirekte chemische Bindung befestigt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Bindeassayverfahren zum Nachweis eines Analyten bereitgestellt, umfassend eine einstrangige DNA-Sequenz in einer flüssigen Probe, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: In-Kontakt-Bringen der Probe in einem nicht-kompetitiven oder kompetitiven Verfahren mit einem immobilisierten Einfangbindemittel, das eine einstrangige Oligonukleotid-DNA-Sonde ist, die Analyt in der flüssigen Probe erkennen und sich daran binden kann, und mit einem markierten Entwicklungsbindematerial, das entweder ein Antikörper ist, der nur doppelstrangige DNA-Sequenzen, die von der Sonde und dem Analyten gebildet werden, erkennen und sich daran binden kann, oder eine Oligonukelotid-DNA-Sequenz ist, die zum Erkennen entweder eines anderen Teils des Analyten oder der Restsonde und zur Bindung daran fähig ist, wobei das Entwicklungsbindematerial, das mittels Mikrokügelchen, die eine Größe von weniger als 5 µm aufweisen und einen Marker tragen, markiert wird, und - nach der Entfernung nicht befestigten Entwicklungsbindematerials - das Nachweisen der Gegenwart des Analyten durch die Existenz oder Stärke eines Signais vom Marker, der am Entwicklungsbindematerial befestigt ist, das direkt oder indirekt an das immobilisierte Einfangbindemittel gebunden wurde.
Vorzugswiese ist der Marker eine Fluoreszenzmarkierung, z.B. in Form einer großen Anzahl (100 oder mehr) an Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen, die in Mikrokügelchen mit einer Größe von 0,01 bis 1 µm, z.B. 0,05-0,5 µm, enthalten sind. Es ist vorzuziehen, dieses Verfahren in Kombination mit dem bereits erwähnten Mikrospot-Verfahren anzuwenden, wobei das Einfangbindemittel als einer oder mehrere Mikrospots auf einem festen Träger bei bereits angeführten Oberflächendichten und Mikrospot-Größen immobilisiert wird, wobei gegebenenfalls unterschiedliche Einfangbindemittel auf unterschiedlichen Mikrospots auf dem gleichen Träger immobilisiert werden, sodaß eine Vielzahl unterschiedlicher DNA-Sequenzen in einem einzigen Vorgang unter Verwendung zweckmäßig differenzierter Entwicklungsbindematerialien und Signalnachweisoder Signalstärke-Meßverfahren nachgewiesen oder bestimmt werden können.
Die Vorgangsweisen zur Bildung einer einstrangigen DNA-Sonde und ihrer Immobilisierung auf einem festen Träger sind allgemein bekannt und in der Literatur beschrieben, z.B. bei Guesdon und in anderen obigen Veröffentlichungen, wobei zu diesem Zweck und zur Bildung, z.B. durch Kochen, der flüssigen Probe, die den nachzuweisenden Analyten enthält (einstrangige DNA-Sequenz, die vorhanden sein kann oder fehlen kann) Standardverfahren angewandt werden können. Die Bindung des Entwicklungsbindematenals an die Mikrokügelchen kann nach einem bekannten Verfahren zum Immobilisieren markerfreier fester Träger erfolgen (ein solches Verfahren wird z.B. in der obigen Veröffentlichung von Wolf et al. beschrieben); es gelten die üblichen Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von Kontamination usw. und anderer störender Einflüsse.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die vorliegende Erfindung ein Set zur Verwendung in einem Bindeassayverfahren, worin die Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines Einfangbindemittels, das Bindungsstellen aufweist, die für den Analyten spezifisch sind, und eines Entwicklungsbindematerials bestimmt wird, das sich an den gebundenen Analyten oder an die vom gebundenen Analyten besetzten Bindungsstellen auf dem Einfangbindemittel oder die auf dem Einfangbindemittel unbesetzt bleibenden Bindungsstellen binden kann, wobei eine zum Entwicklungsbindematerial relative Markierung eingesetzt wird, wobei die Stärke des mit der Markierung assoziierten Signals repräsentativ für den Anteil an Besetzung der Bindungsstellen auf dem Einfangbindemittel durch den Analyten ist, wobei das Set folgendes umfaßt: (a) einen festen Träger mit darauf immobilisiertem Einfangbindemittel, (b) ein Entwicklungsreagens, welches das Entwicklungsbindematerial enthält, das an die Oberfläche von einen Marker tragenden Mikrokügelchen adsorbiert oder direkt oder indirekt chemisch damit verbunden ist, und (c) Standards mit bekannten Mengen oder Konzentrationen des zu bestimmenden Analyten.
Vorzugsweise umfaßt das Entwicklungsreagens eine Pufferlösung, die das Entwicklungsmaterial enthält, das an die Mikrokügelchen gebunden ist, doch es ist auch möglich, das Reagens in gefriergetrockneter Form bereitzustellen. Ebenso können die Standards auch als Pufferlösungen bereitgestellt werden, die den Analyten in bekannten Konzentrationen oder in gefriergetrockneter Form mit Anweisungen zur richtigen Rekonstitution zur gelösten Form enthalten. Die Standards können in hormonfreiem Serum gebildet werden. Es kann drei oder mehrere, z.B. bis zu 12, Standards varuerender bekannter Analytenkonzentrationen geben, die die erwarteten Werte in den unbekannten Proben abdecken.
Vorzugsweise enthält das Entwicklungsreagens das Entwicklungsbindematerial, das an Mikrokügelchen, die eine Größe von weniger als 5 µm aufweisen und Moleküle eines fiuoreszierenden Farbstoffs enthalten, adsorbiert oder kovalent daran gebunden ist, wobei es vorzuziehen ist, daß das Einfangmittel in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit einer Größe von weniger als 1 mm² und einer Oberflächendichte von zumindest 1.000 Moleküle/µm² auf dem festen Träger immobilisiert ist. Unterschiedliche Einfangbindemittel können auf unterschiedlichen Mikrospots auf dem gleichen Träger immobilisiert sein, und es können unterschiedliche Standardsets bereitgestellt werden, sodaß eine Vielzahl von Assays für verschiedene Analyten unter Verwendung des gleichen festen Trägers in einem einzigen Vorgang entweder gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden kann.
Es folgt eine Beschreibung der Erfindung in den folgenden Beispielen, welche die Herstellung von markiertem Entwicklungsbindematerial (Beispiele 1-4) sowie Verfahren und Sets gemäß der Erfindung (Beispiele 5-12) veranschaulichen.
Alle Konzentrationsprozentsätze in den Beispielen beziehen sich auf das Gewicht.

Beispiel 1

Adsorption von Antikörper oder Avidin an hydrophobe Sulfat-Mikrokügelchen

1) 0,5 ml einer 2%-igen Feststoffsuspension tensidfreier, sulfataktivierter Mikrokügelchen aus Polymerlatex-Material ien in reinem Wasser, die Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle in den Mikrokügelchen (Fluospheres von Molecular Probes Inc.) mit einem Durchmesser von 0,08 oder 0,12 µm enthält, wurde zu 2 mg Entwicklungsbindematerial (Antikörper oder Avidin), das in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer gelöst war, bei pH 7,4 zugetropft. Die Suspension wurde über Nacht bei 4ºC gerührt.
2) Die Suspension wurde bei 20.000 U/min 30 min lang bei 10ºC zentrifugiert (die Zeit und Geschwindigkeit des Zentrifugierens variieren je nach Größe der Latex-Mikrokügelchen), um antikörper-konjugierte Latex-Mikrokügelchen von nicht-umgesetztem Antikörper abzutrennen. Der Antikörper- oder Avidin-Lösungsüberstand wurde zur Proteinabbestimmung gewonnen.
3) Das zentrifugierte Pellet wurde durch Ultraschallbehandlung in 1,0 ml von 0,1 M Phosphatpuffer dispergiert. Nach der Dispersion wurden die unbesetzten hydrophoben Stellen auf den Mikrokügelchen durch Zugabe von 1 ml 2%-igem (1 % Endwert) BSA blockiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Kügelchen wurden weiters durch Zugabe von 200 µl 5%-igem Tween-20 (etwa 0,5% Endkonz.) blockiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Der Schritt der Detergensinkubation diente auch dazu, lose gebundenen Antikörper oder lose gebundenes Avidin zu entfernen, der bzw. das im Lager- und/oder Assaypuffer desorbieren und die Assays dann beeinträchtigen könnte.
4) Das Präparat wurde wie oben zentrifugiert, und die Mikrokügelchen wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer erneut suspendiert.
5) Schritt 4 wurde zweimal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurden die Mikrokügelchen in 2 ml Phosphatpuffer dispergiert, der 0,2% BSA und 0,01% Natriumazid enthielt, und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2

Kovalente Bindung von Antikörper oder Avidin an mit Carboxylat modifizierte Latex-Mikrokügelchen nach einem Einstufenverfahren

1) 0,5 ml einer 2%-igen Feststoffsuspension in reinem Material aus mit Carboxylat modifizierten Polymerlatex-Mikrokügelchen, die Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle (Fluo- Spheres von Molecular Probes Inc.) enthielten und einen Durchmesser von 0,09 µm aufwiesen, wurden zu 0,5 ml 0,015 M Acetatpuffer (pH 5) zugetropft, der 2 mg Antikörper oder Avidin als Entwicklungsbindematerial enthielt. Die Suspension wurde 15 min lang bei Raumtemperatur inkubiert.
2) 4 mg EDAC [1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid] (Sigma Chemical Company) wurden dem Gemisch zugegeben und durchgewirbelt. Der pH-Wert wurde mit verdünnter NaOH auf 6,5 ± 0,2 eingestellt (in dieser Phase kann Agglomeration der Latex-Mikrokügelchen beobachtet werden, sie können aber durch vorsichtige Ultraschallbehandlung redispergiert werden) und das Reaktionsgemisch über Nacht vorsichtig bei 4ºC gerührt.
3) Das Reaktionsgernisch wurde 30 min lang bei 10ºC und 20.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Proteinbestimmung gewonnen.
4) Das zentrifugierte Pellet wurde durch Ultraschallbehandlung in 1,0 ml 0,1 M Phosphatpuffer dispergiert. Nach der Dispersion wurden die unbesetzten Stellen auf den Mikrokügelchen durch Zugabe von 1 ml 2%-igem (1 % Endkonz.) BSA blockiert und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Kügelchen wurden durch Zugabe von 200 µl 5%-igem Tween-20 (etwa 0,5% Endkonz.) blockiert und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
5) Das Präparat wurde wie oben zentrifugiert, und die Mikrokügelchen wurden in 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer resuspendiert.
6) Schritt 5 wurde zweimal wiederholt, und nach dem letzten Zentrifugieren wurden die an Antikörper oder Avidin gebundenen Mikrokügelchen in 2 ml Phosphatpuffer dispergiert, der 0,2% BSA und 0,01 % Natriumazid enthielt, und bei 4ºC gehalten.

Beispiel 3

Kovalente Bindung eines Antikörpers oder von Avidin an mit Carboxylat modifizierte Latex-Mikrokügelchen nach einem Zweistufenverfahren

1) 0,5 ml der Suspension von mit Carboxylat modifizierten Latex-Mikrokügelchen, die in Beispiel 2 verwendet wurden, wurde in ein 10 ml-Zentrifugenröhrchen gefüllt und 30 min lang bei 10ºC und 20.000 U/min zentrifugiert.
2) Das zentrifugierte Pellet wurde in 0,5 ml 0,02 M Phosphatpuffer, pH 4,5, resuspendiert und wie oben zentrifugiert.
3) Schritt 2 wurde wiederholt.
4) 0,5 ml einer 2%-igen Lösung von EDAC wurde zu den dispergierten Mikrokügelchen zugetropft (es kann zu diesem Zeitpunkt eine Agglomeration der Latex-Mikrokügelchen beobachtet werden, doch sie können durch vorsichtige Ultraschallbehandlung wieder dispergiert werden) und das Reaktionsgemisch 3 Stunden lang bei Raumtemperatur vorsichtigt gerührt und wie oben zentrifugiert.
5) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, resuspendiert und wie oben zentrifugiert.
6) Schritt 5 wurde zweimal wiederholt.
7) Das zentrifugierte Pellet wurde in 0,5 ml Boratpuffer resuspendiert, 2 mg Antikörper oder Avidin, gelöst in 0,5 ml des gleichen Puffers, zugetropft und vorsichtig über Nacht bei Raumtemperatur vermischt.
8) Die Suspension wurde wie oben zentrifugiert und der Überstand zur Proteinbestimmung aufgehoben.
9) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml 0,1 M Ethanolamin in Boratpuffer resuspendiert, 30 min lang bei Raumtemperatur vorsichtig vermischt und wie oben zentrifugiert.
10) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml 1%-igem BSA resuspendiert, 1 Stunde lang vorsichtig vermischt und wie oben zentrifugiert.
11) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml 0,5%-igem Tween-20 resuspendiert, 1 Stunde lang vorischtig vermischt und wie oben zentrifugiert.
12) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml 0,02 M Phosphatpuffer, pH 7,4, resuspendiert und wie oben zentrifugiert.
13) Das zentrifugierte Pellet wurde in 1 ml Phosphatpuffer resuspendiert, der 0,2% BSA und 0,01% Natriumazid enthielt, und auf 4ºC gehalten.

Beispiel 4a

Binden eines Gemisches von Antikörper und Avidin an Mikrokügelchen durch Adsorption oder kovalente Bindung

Die Verfahren zum Binden eines Gemisches von Antikörper und Avidin an Mikrokügelchen durch Adsorption oder kovalente Bindung waren im wesentlichen die gleichen wie jene, die in obigen Beispielen 1 bis 3 in Zusammenhang mit dem Binden von Antikörper oder Avidin beschrieben sind, außer daß die für die Reaktion verwendete Antikörperlösung auch eine geringe Menge Avidin enthielt.

Beispiel 4b

Markierung eines monoklonalen Anti-TSH-Antikörpers mit Texasrot

1) 1 mg monoklonale Anti-TSH-Antikörper wurde in 1 ml Carbonatpuffer (pH 9) gelöst.
2) 1 mg Texasrot (Molecular Probes Inc.) wurde in 250 µl N,N-Dimethylformamid (Sigma Chemical Company) gelöst, was eine Konzentration von 4 µg/µl ergab.
3) 10 µl des 4 µg/µl Texasrots wurden der Antikörperlösung zugegeben, durchgerührt und 2 Stunden lang auf Eis stehen gelassen (Farbstoff-Protein-Verhältnis (w/w) = 0,04).
4) Der an Texasrot gebundene Antikörper wurde auf einer PD10 Sephadex-Säule (Pharmacia) durch Eluieren mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, von nicht-umgesetztem und hydrolysiertem Farbstoff abgetrennt.
5) Natriumazid wurde dem markierten Antikörper (0,1%) als Konservierungsmittel zugegeben und das Präparat bei 4ºC gelagert.

Beispiel 4c

Markierung von Antikörper oder BSA mit Biotin

1) 2 mg Antikörper oder BSA wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer (pH 8,5) gelöst.
2) 2,2 mg N-Hydroxysuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanat (Vector Laboratories) wurden in 55 µl N,N-Dimethylformamid gelöst, was eine Konzentration von 40 µg/µl ergab.
3) 10 µl des 40 µg/µl Biotins wurden dem Antikörper oder der BSA-Lösung zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur geschüttelt (Biotin-Protein-Verhältnis (w/w) = 0,2).
4) Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 10 mg Glycin abgebrochen.
5) Das an Biotin gebundene IgG oder BSA wurde auf einer PD10 Sephadex-Säule (Pharmacia) durch Eluieren mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) von nicht-umgesetztem Biotin abgetrennt.
6) Natriumazid wurde dem konjugierten Präparat (0,1%) zugegeben, das bei 4ºC gelagert wurde.

Beispiel 5

Ultraempfindlicher zweistufiger Rücktitrations-TSH-Mikrospot-Sandwich-Immunassay unter Verwendung von an fluoreszierende Mikrokügelchen gebundenem Entwicklungsantikörper

Erster Schritt

1) In weiße Polystyrol-Mikrotiternäpfe (Microlite 1 von Dynatech Laboratories) wurde 1 µl oder weniger eines monoklonalen Anti-TSH-Einfangantikörpers in 0,1 M Phosphatpuffer (200 µg/ml; pH 7,4) eingetupft. Die Antikörpertröpfchen wurden sofort abgesaugt und die Näpfe mit 1% (w/v) BSA blockiert und ausgiebig mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Antikörper-Mikrospots wurden bis zur Verwendung im Puffer gehalten.
2) Nach Spülen mit 0,05 M/l Tris-HCl-Puffer mit pH 7.75 (Waschpuffer) wurden 200 µl von entweder Standard in Assaypuffer oder Probe jedem Napf zugegeben und 30 min bis mehrere Stunden lang (oder über Nacht bei 4ºC, wenn maximale Assayempfindlichkeit gewünscht wird) bei Raumtemperatur geschüttelt.
3) Die Näpfe wurden viermal mit Waschpuffer gewaschen.

Zweiter Schritt

1) Eine Aliquote des an Fluoreszenzfarbstoff gebundenen 200 µl Entwicklungsbindematerial-Antikörpers, die Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 µg (mit etwa 0,01 mg an Antikörper gebundenen Mikrokügelchen) in Assaypuffer enthielt, wurde jedem Napfzugegeben und 0,5 bis 1 Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt.
2) Die Näpfe wurden siebenmal mit dem Waschpuffer gewaschen, der 0,05% Tween-20 (w/v) enthielt, bis zur völligen Trockene abgesaugt und mit einem MRC-600 Laserabtast- Konfokal mikroskop (Bio-Rad Microscience) gescannt. Das aus jedem Antikörper-Mikrospot ausgesandte Signal wurde quantifiziert, und die Ergebnisse wurden mit den Dosis- Response-Standardkurven verglichen, um die TSH-Konzentrationen in unbekannten Proben zu ermitteln.
Die zur Anfertigung der Dosis-Response-Kurve herangezogenen Standards enthielten 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 und 30 µU TSH/ml im Assaypuffer.
Die Assaypuffer-Zusammensetzung war wie folgt:
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan 50 mM/l
Natriumchlorid 9,0 g/l
Rinderserumalbumin 5,0 g/l
Rinderglobul in 0,5 g/l
Tween 40 0,1 g/l
Natriumazid 0,5 g/l
HCl auf pH 7,75 bei 25ºC

Beispiel 6

Ein Assay auf schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH) erfolgte unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern, die als Einfang- und Entwicklungsantikörper gegen verschiedene Epitope auf dem TSH-Molekül gerichtet waren, sowie der vom National Institute for Biological Standards and Control bereitgestellten TSH-Standardproben. Der Einfangantikörper wurde durch passive Adsorption in Form von Mikrospots mit einem Durchmesser von etwa 0,5 mm auf Dynatech Microlite Mikrotiternäpfe aufgebracht, was eine Oberflächendichte von ewa 40.000 IgC-Molekülen/µm² ergab. Der Entwicklungsantikörper wurde an mit Carboxylat modifizierte Polystyrol latex-Fluospheres mit einem Durchmesser von 0,08 µm kovalent gebunden, die grün/gelben Fluoreszenzfarbstoff enthielten. Die TSH-Proben wurden in Mengen von etwa 200 µl in die Mikrotiternäpfe eingebracht.
Nach der Inkubation über Nacht wurden die erhaltenen Ergebnisse in Fig. 6 der beiliegenden Abbildungen aufgetragen; dabei handelt es sich um eine grafische Darstellung der Fluoreszenzintensität (y-Achse) in willkürlichen Einheiten über der TSH-Konzentration (x-Achse) in mU/Liter. Die Empfindlichkeit des Assays (auf der Grundlage von Messungen der Standardabweichung des Nuildosis-Bestimmung) betrug 0,002 mU/L. Es wurden die gleichen Standards und Assaypuffer verwendet wie in Beispiel 5.

Beispiel 7

Beispiel 6 wurde wiederholt, außer daß die gesamte Inkubationszeit auf 1 Stunde reduziert wurde (0,5 Stunden Inkubation der Probe mit Einfangantikörper, gefolgt von 0,5 Stunden Inkubation mit Entwicklungsantikörper) und die Größe der Mikrokügelchen auf einen Durchmesser von 0,12 µm erhöht wurde. Die Empfindlichkeit des Assays wurde dadurch gegenüber den Messungen der Standardabweichung der Nulldosis- Bestimmung auf das Zehnfache, d.h. 0,0002 mU/L, gesteigert. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 der beiliegenden Abbildungen, einer grafischen Darstellung mit den gleichen Achsen wie in Fig. 6, aufgetragen.

Beispiel 8

Einstufiger ultraempfindlicher TSH-Mikrospot-Sandwich-Immunassay unter Verwendung von an fluoreszierende Mikrokügelchen gebundenem Entwicklungsantikörper

1) In weiße Polystyrol-Mikrotiternäpfe (Microlite 1 von Dynatech Laboratories) wurde mit 1 µl oder weniger eines monoklonalen Anti-TSH-Einfangantikörpers in 0,1 M Phosphatpuffer (200 µg/l; pH 7,4) eingetupft. Die Antikörpertröpfchen wurden sofort abgesaugt und die Näpfe ml 1% (w/v) BSA blockiert und ausgiebig mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Antikörper-Mikrospots wurden bis zur Verwendung im Puffer gehalten.
2) Die Näpfe wurden mit dem in Beispiel 5 verwendeten Assaypuffer gespült und 100 µl Standard in Assaypuffer bzw. Probe sowie 100 µl von an Entwicklungsantikörper gebundenen Mikrokügelchen in jeden Napf eingebracht und 30 min lang (oder länger, falls maximale Assayempfindlich keit gewünscht wurde) bei Raumtemperatur geschüttelt.
3) Die Näpfe wurden siebenmal mit 0,05% Tween-20 (w/v) enthaltendem Waschpuffer gewaschen, bis zur völligen Trockene abgesaugt, mit dem Konfokal-Mikroskop wie in
Beispiel 5 gescannt und die Ergebnisse mit der Dosis-Response-Standardkurve verglichen, die mittels der Standards aus Beispiel 4 erhalten wurde, um die TSH-Konzentration in unbekannten Proben zu ermitteln.

Beispiel 9

Doppelt markierter, ultraempfindlicher, ein- oder zweistufiger Rücktitrations-TSH- Mikrospot-Sandwich-Immunassay unter Verwendung von an fluoreszierende Mikrokügechen gebundenem Entwicklungsantikörper

Die Arbeitsvorschriften für die doppelt markierten ein- oder zweistufigen Assays sind im wesentlichen die gleichen wie die oben für die einfach markierten Assays beschriebenen, außer daß der unmarkierte Einfangantikörper entweder mit Texasrot (Molecular Probes Inc.) markiert und direkt in weiße Mikrotiternäpfe von Dynatech Microlite eingebracht wird oder gemeinsam mit Avidin an Latex-Mikrokügelchen (Molecular Probes Inc.), die roten Fluoreszenzfarbstoff enthalten, gebunden werden kann, wobei sich die konjugierten Mikrokügelchen dann an einen mit Biotin markierten BSA-Mikrospot binden können, der zuvor in die Mikrotiternäpfe eingebracht worden war.

Beispiel 10

Es wurde ein doppelt markierter Assay durchgeführt. Der Entwickungsantikörper wurde an gelb/grüne Polystyrollatex-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,12 µm gebunden, wie in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben. Der Einfangantikörper wurde in einer Oberflächendichte von etwa 40.000 IgG-Molekülen/µm² über Biotin/Avidin indirekt in Dynatech Microlite-Mikrotiternäpfe eingebracht. Der Antikörper wurde zuerst gemeinsam mit Avidin an Poylstyrollatex-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 µm, die roten fluoreszierenden Farbstoff enthielten, gebunden, wobei die konjugierten Kügelchen anschließend an biotinylierte BSA-Mikrospots binden gelassen wurden, die mit denen die Mikrotiternäpfe zuvor beschichtet worden waren. Der gelb/grüne und der orange/rote Farbstoff wurden unter Verwendung der 488 und der 568 nm-Linie des Krypton/Argon-Mischgaslasers gescannt. Dies konnte entweder gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die Konzentration von Antigen (TSH) in der Versuchsprobe wurde erhalten, indem das Verhältnis der Fluoreszenzsignale der zwei Farbstoffe beobachtet und mit den Signalen aus den Standardproben korreliert wurde.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 8 der beiliegenden Abbildungen dargestellt, wobei diese Figur eine grafische Darstellung des Verhältnisses der beiden Fluoreszenzsignale (y-Achse) über der TSH-Konzentration (x-Achse) in mU/l ist. Die Empfindlichkeit des Assays (basierend auf den Messungen der Standardabweichung der Nulldosis- Bestimmung) betrug 0,0002 mU/l.

Beispiel 11

Einfach oder doppelt markierter, ultraempfindlicher ein- oder zweistufiger Rücktitrations-TSH-Mikrospot-Sandwich-Immunassay unter Verwendung von biotinyliertem Entwickungsantikörper und eines Universalreagens aus an Avidin gebundenen fluoreszierenden Mikrokügelchen

Im Gegensatz zu den in den Beispielen 5-10 beschriebenen Assaysystemen wurde in diesem Beispiel ein Universal-Markerreagens aus an Avidin gebundenen fluoreszierenden Mikrokügelchen eingesetzt, um den gebundenen Entwicklungsantikörper, der mit Biotin markiert worden war, indirekt zu markieren.
Obwohl dieses Assaysystem den zusätzlichen Schritt der Zugabe von Avidin-Mikrokügelchen nach Beendigung der immunologischen Reaktionen erfordert, überwiegen die Vorteile des Einsatzes eines "Universalmarkers" diesen unwesentlichen Nachteil. Das "Universalmarker"-System würde sich besonders in einem von Roger Ekins in WO 89/01157 beschriebenen Mikrospot-Multianalytensystem eignen; dies ist auf die stark verbesserte Assayempfindlichkeit zurückzuführen, die infolge der Reduktion nicht-spezifischer Bindung durch Verwendung eines einzigen universellen Avidin-Mikrokügelchen- Präparats und nicht einer großen Anzahl (entspricht der Anzahl gleichzeitig durchgeführter Assays) von an Entwicklungsantikörper gebundenen Mikrokügelchen-Präparaten, die ansonsten erforderlich wären, zu erwarten ist.

Beispiel 12

Mikrospot-DNA-Sequenzassay-Methodologien Nicht-kompetitive Methodologien (qualitative und quantitative Assays)

Beispiel 12a

Mikrospot-DNA-Sequenz-Sandwichassay unter Verwendung einer biotinyl ierten Festphasen-Einfang-DNA-Sonde und eines Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörpers, der an Fluoreszenzfarbstoff enthaltende Mikrokügelchen gebunden ist
1) In Microlite 1-Mikrotiternäpfe wurde durch einstündige Adsorption bei Raumtemperatur 1 µl oder weniger 100 µg/µl Avidin DX (Vector Laboraton es) eingetupft, 20 min lang mit 200 µl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, umfassend 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20, 0,5% BSA und 100 µg/ml Lachssperma-DNA, blockiert und mit 0,05% Tween 20 enthaltendem Tris-HCl gewaschen.
2) 5 bis 100 ng der biotinylierten Einfang-DNA-Sonde von Clontech Laboratories in 100 µl Tris EDTA wurden in die mit Avidin DX beschichteten Näpfen eingebracht, unter zweistündigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert und mit 0,05% Tween 20 enthaltendem Tris-HCl gewaschen.
3) in einer Modifikation der von Manero et al. (s.o.) beschriebenen Vorgangsweise wurden Proben folgendermaßen präpariert: Kochen von 0,5 ml-Aliquoten der unbekannten Proben über eine Zeitspanne von 10 min, rasches Abkühlen auf Eis, Verdünnen mit Hybridisierungspuffer, enthaltend: 1X SSC (150 mMol/l NaCl und 15 mMol Trinatriumcitrat pro Liter), 2X Denhardt-Lösung (0,4 g BSA, 0,4 g Ficol und 0,4 g Polyvinylpyrrolidon pro Liter), 10 mMol/l Tris-HCl, pH 7,5, und 1 mMol/l EDTA. Für einen quantitativen Assay wurden die gebildeten Proben oder gegebenenfalls auch Standards, die einstrangige Ziel-DNA in bekannter Menge und im gleichen Hybridisierungspuffer enthielten, den Näpfen zugegeben (den anderen Näpfen wurden für die qualitativen Tests positive und negative Vergleiche und nicht die Standards zugeführt), unter einstündigem Schütteln bei 50ºC inkubiert und mit PBS mit 0,05% Tween 20 gewaschen.
4) 200 µl Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper, der nach dem Verfahren aus Beispiel 3 an fluoreszierende Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 µg (Fluorospheres) und in PBS mit 0,5% BSA und 0,5% Tween 20 gebunden worden war, wurden zugegeben, unter Schütteln 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, mit PBS- Tween 20 gewaschen und wie in Beispiel 5 mit dem Konfokal-Mikroskop gescannt.

Beispiel 12b

Mikrospot-DNA-Sequenz-Sandwichassay unter Verwendung einer biotinylierten Festphasen-Einfang-DNA-Sonde, einer komplementären, aber nicht-überlappenden Fntwicklungs-DNA-Sonde, markiert mit Digoxigenin und Anti-Digoxigenin-Antikörper, gebunden an Fluoreszenzfarbstoff enthaltende Mikrokügelchen.
1) Die biotinylierten Avidin-Einfang-DNA-Sonden-Mikrospots wurden wie in Beispiel 12a gebildet.
2) Der Hybridisierungsschritt erfolgte wie in Beispiel 12a.
3) 5 bis 10 ng der komplementären, aber nicht-überlappenden, mit Digoxigenin markierten DNA-Sonde (beschrieben von Nickerson et al., s.o.) in 100 µl Hybridisierungspuffer wurden zugegeben, unter Schütteln bei 50ºC 1 Stunde lang inkubiert und mit PBS-Tween 20 gewaschen.
4) 200 µl der an Anti-Digoxigen in-Antikörper gebundenen fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von etwa 0,1 µg (Fluospheres) in PBS mit 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 wurden zugegeben, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert, mit PBS-Tween 20 gewaschen und mit dem Konfokal-Mikroskop gescannt.

Beispiele 12c-12e

Ein Mikrospot-DNA-Sequenz-Sandwichassay unter Verwendung einer unmarkierten Festphasen-Einfang-DNA-Sonde und entweder von Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper, gebunden an Fluoreszenzfarbstoff enthaltende Mikrokügelchen, oder einer komplementären, aber nicht-überlappenden, biotinylierten DNA-Entwicklungssonde und von an Avidin gebundenen Mikrokügelchen, die Fluoreszenzfarbstoff enthielten, oder einer komplementären, aber nicht-überlappenden Entwicklungs-DNA-Sonde, markiert mit Digoxigenin und Antidigoxigenin-Antikörper, gebunden an Fluoreszenzfarbstoff enthaltende Mikrokügelchen, kann in ähnlicher Weise mit entsprechenden Änderungen durchgeführt werden.

Kompetitive DNA-Sequenzassay-Methodologie (quantitativ und qualitativ)

Beispiel 12f

Mikrospot-DNA-Sequenzassay unter Verwendung einer biotinylierten Festphasen-Einfang-DNA-Sonde und eines kompetitiven Materials mit Ziel-DNA-Sequenz, markiert mit Fluoreszenzfarbstoff enthaltenden Mikrokügelchen.
1) Die biotinylierten Avidin-Einfang-DNA-Sonden-Mikrospots wurden wie in Beispiel 12a gebildet.
2) Proben wuden folgendermaßen präpariert: Kochen von 0,5 ml-Aliquoten der unbekannten Proben über eine Zeitspanne von 10 min, rasches Abkühlen auf Eis und Verdünnen mit Hybridisierungspuffer, umfassend: 1X SSC (150 mMol/l NaCl und 15 mMol Trinatriumcitrat pro Liter), 2X Denhardt-Lösung (0,4 g BSA, 0,4 g Ficol und 0,4 g Polyvinylpyrrolidon pro Liter), 10 mMol/l Tris-HCl, pH 7,5, und 1 mMol/l EDTA. Für einen quantitativen Assay wurden die präparierte Probe plus das kompetitive Material mit Ziel-DNA-Sequenzen, erzeugt durch Polymerase-Kettenreaktion und markiert mit fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 µm (Fluorospheres), die nach einem Verfahren hergestellt wurden, das gegenüber der in der obigen Publikation von Wolf et al. (Bindung von DNA an Latexteilchen) beschriebenen Vorgangsweise modifiziert worden war, oder Standards mit einstrangiger Ziel-DNA plus das kompetitive Material im gleichen Hybridisierungspuffer den Näpfen zugegeben (bei den qualitativen Assays wurden positive und negative Vergleiche plus das kompetitive Material anstelle der Standards mit dem kompetitiven Materials zugegeben), unter einstündigem Schütteln bei 50ºC inkubiert, mit Tris-HCl mit 0,05 Tween 20 gewaschen und wie in Beispiel 5 gescannt.
Wie bereits erwähnt, sind diese sehr hohen Empfindlichkeiten für nicht-kompetitive lmmunassays angesichts der derzeit geläufigen Fachmeinung über die Assaygestaltung unerwartet. Eine gewisse Zunahme der Empfindlichkeit ist in jedem Assayformat zu erwarten, sobald sich die Idee der Verwendung von Mikrokügelchen gemäß der Erfindung durchsetzt, da mehr Moleküle der an jedes Molekül des Entwicklungsbindematerials befestigten Markierung vorhanden sind, was zu einer wirkungsvollen Steigerung der spezifischen Aktivität der markierten Entwicklermoleküle führt. Es ist jedoch nicht zu erwarten, daß dieser Effekt alleine zu Assays führt, die sich so deutlich von herkömmlichen Vorstellungen auf dem Gebiet der Erfindung unterscheiden und insbesondere sehr geringe Mengen an Einfangbindemittel erfordern.
Es seien zwei weitere Erklärungen für diese unerwarteten Ergebnisse angeführt. Erstens: Durch Konzentrieren einer sehr geringen Anzahl an Einfangbindemittel-Molekülen in hoher Oberflächendichte auf einen sehr kleinen Bereich in Form eines Mikrospots können die Signal/Rausch-Verhältnisse, die in einer begrenzten Inkubationszeit erzielt werden, gegenüber herkömmlichen Assays verbessert werden, bei denen sehr große Mengen an Einfangantikörper über große Bereiche verteilt sind. Zweitens: Wenn Analytmoleküle zwischen zwei festen Oberflächen angeordnet sind, auf denen sich die Moleküle des Einfangbindemittels bzw. des Entwicklungsbindematerials befinden (d.h. die Mikrokügelchen und die Mikrotiternäpfe, in denen der Assay durchgeführt wird), können sich Bindungsstellen auf den Analytmolekülen an mehrere Entwicklungsbindemateriai-Moleküle binden, wenn der Analyt das gleiche Epitop enthält, das auf sei ner Oberfläche repliziert ist, wenn das Entwicklungsbindematerial ein polyklonaler Antikörper ist oder wenn mehr als ein monoklonaler Antikörper, der gegen unterschiedliche Epitope auf dem Analyt gerichtet ist, als Entwicklungsmaterial verwendet wird, wodurch die tatsächliche Affinität des Entwicklungsbindematerials steigt. Dies impliziert, daß die Oberflächendichte der Entwicklungsbindematerial-Moleküle auf den Mikrokügelchen wahrscheinlich eine wichtige Determinante der erzielten Empfindlichkeiten darstellt.

Claims

1. Bindeassayverfahren zur Bestimmung der Konzentration eines oder mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe

unter Verwendung eines Einfangbindemittels mit Bindungsstellen, die für jeden Analyten, von dem erwartet wird, daß er in der Probe vorhanden ist, spezifisch sind, und eines Entwicklungsbindematerials, das sich an gebundenen Analyten, an vom gebundenen Analyten besetzte Bindungsstellen des Einfangbindemittels oder an vom Analyten unbesetzt bleibende Bindungsstellen binden kann,

wobei das Einfangbindemittel für einen bestimmten Analyten in hoher Dichte in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit jeweils einer Fläche von weniger als 1 mm² auf einem Träger immobilisiert wird, und

worin markierte Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von weniger als 5 µm in einem solchen Verhältnis zum Entwicklungsbindematerial im Assay eingesetzt werden, daß die Stärke des Signals der Markierung repräsentativ für den Anteil der Besetzung der Bindungsstellen des Einfangbindemittels ist, wodurch die Konzentration des Analyten bestimmt werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das für einen bestimmten Analyten spezifische Einfangbindemittel in einer geringen Menge eingesetzt wird, die weniger als 5% des Analyten in der Probe bindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin weniger als 0,1V/K Mol eines für einen bestimmten Analyten spezifischen Einfangbindemittels eingesetzt werden, worin V das Probevolumen in Litern ist und K die effektive Affinitätskonstante des Einfangbindemittels für den Analyten unter den Assaybedingungen ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Einfangbindemittel in einer Dichte von mehr als 1.000 Molekülen/µm² immobilisiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Einfangbindemittel in einer Oberflächendichte von 10.000 bis 50.000 Molekülen/µm² immobilisiert ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikrospots eine Fläche zwischen 100 µm² und 1 mm² bedecken.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Konzentration mehrerer Analyten im gleichen Arbeitsschritt unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher Einfangbindemittel bestimmt wird, wobei die Einfangbindemittel Bindungsstellen besitzen, die für die Analyten in der Probe spezifisch sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin ein oder mehrere Entwicklungsbindematerial ien im Assay eingesetzt werden, wobei die Entwicklungsbindematerial ien und die markierten Mikrokügelchen zu einer derartigen Bindung aneinander fähig sind, daß die gleiche Markierung im Verhältnis zu den Entwicklungsbindematerialien verwendet wird, wobei die Mikrospots, die verschiedene Einfangbindemittel enthalten, durch ihre Position auf dem Träger voneinander unterscheidbar sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin eines der Mikrokügelchen und der Entwicklungsbindematerialien an Biotin und das andere an Avidin oder Streptavidin gebunden ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Markierung in den Mikrokügelchen enthalten oder an der Oberfläche der Mikrokügelchen gebunden ist.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Markierung eine Fluoreszenz-Markierung ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikrokügelchen blockiert sind, um ihre nichtspezifischen Wechselwirkungen mit anderen Materialien zu minimieren.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Einfangbindemittel und das Entwicklungsbindematerial Antikörper sind.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Einfangbindemittel ein Antigen ist, das zur Bindung an den Analyten fähig ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Analyt eine Nukleinsäuresequenz ist, das Einfangbindemittel eine Oligonukleotidsequenz ist, die zur Bindung des Analyten fähig ist, und das Entwicklungsbindematerial eine Oligonukleotidsequenz oder ein Antikörper ist, der den Analyten erkennen kann.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Träger aus HD- Polystyrol besteht.

17. Bindeassayverfahren zum Nachweis der Gegenwart einer oder mehrerer Ziel- Nukleinsäuresequenzen in einer flüssigen Probe

unter Verwendung eines oder mehrerer Einfangbindemittel, umfassend eine Oligonukleotidsequenz, die zur Hybridisierung an eine bestimmte Ziel-Nukleinsäuresequenz fähig ist, und eines Entwicklungsbindematerials, umfassend eine Oligonukleotidsequenz, die zur Bindung an die gebundene Ziel-Nukleinsäuresequenz fähig ist,

wobei das Einfangbindemittel für eine bestimmte Ziel-Nukleinsäuresequenz in hoher Dichte in Form eines oder mehrerer Mikrospots mit einer Fläche von jeweils weniger als 1 mm² immobilisiert ist, und

worin markierte Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von weniger als 5 µm im Assay in einem derartigen Verhältnis zum Entwicklungsbindematerial eingesetzt werden, daß das Signal der Markierung die Gegenwart der Ziel-Nukleinsäuresequenz anzeigt.

18. Set zur Bestimmung der Konzentration eines oder mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das Set folgendes umfaßt:

ein oder mehrere Einfangbindemittel, wobei jedes Einfangbindemittel Bindungsstellen aufweist, die für einen bestimmten Analyten, von dem erwartet wird, daß er in der Probe vorhanden ist, spezifisch sind, worin die Einfangbindemittel in hoher Dichte in Form eines oder mehrerer Mikrospots auf einem Träger immobilisiert sind, wobei jeder Mikrospot eine Fläche von weniger als 1 mm² bedeckt; und

ein oder mehrere Entwicklungsbindematerial ien, wobei jedes Entwicklungsbindematerial zur Bindung an einen bestimmten gebundenen Analyten, an von gebundenem Analyten besetzte Bindungsstellen eines bestimmten Einfangbindemittels oder an vom Analyten unbesetzt bleibende Bindungsstellen eines bestimmten Einfangbindemittels fähig ist;

worin markierte Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von weniger als 5 µm in einem derartigen Verhältnis zum Entwicklungsbindematerial im Assay eingesetzt werden, daß die Stärke des Signals der Markierung repräsentativ für den Anteil der Besetzung der Bindungsstellen eines bestimmten Einfangbindemittels ist, wodurch die Konzentration des Analyten bestimmt werden kann.

19. Set nach Anspruch 18, weiters umfassend Standards, die bekannte Mengen oder Konzentrationen von Analyt enthalten.