DE69106002T2

DE69106002T2 - Testverfahren und reagenziensatz dafür.

Info

Publication number: DE69106002T2
Application number: DE69106002T
Authority: DE
Inventors: Geir Olav N-0491 Oslo 4 Gogstad; Jostein N-1322 Hovik Holtlund
Original assignee: Nycomed Pharma AS
Current assignee: Axis Shield PoC AS
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1991-12-21
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-12-22
Also published as: FI932912A0; AU9093491A; GR3014996T3; WO1992011537A1; JPH06503886A; US5691207A; NO932320D0; DE69106002D1; CA2093415C; IE914536A1; ATE115729T1; AU648625B2; NO311112B1; CA2093415A1; JP3174573B2; US5650333A; EP0564494A1; EP0564494B1; FI106984B; FI932912A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einem wäßrigen Medium.
Die Detektion und/oder der Assay auf Analyten unter Verwendung von Immunoassaytechniken ist gut etabliert, insbesondere im Hinblick auf Proteine, wie Antigene und Antikörper, sowie Zucker, Lectine und Nucleinsäuren. Während viele geläufige Techniken sehr empfindlich sind, sind sie jedoch oft arbeitsaufwendig dahingehend, daß eine Anzahl von Stufen benötigt wird, von denen jede lange dauern kann. Es erwies sich jedoch als möglich, einige solche Assays zu vereinfachen, indem man eine der Komponenten des Assaysystems auf einem festen Träger immobilisiert, da dies die Entfernung von überschüssigen Reagentien erleichtert. Solche Assays sind normalerweise mit der Verwendung eines markierten Makromoleküls verbunden, das der Analyt selbst oder ein Bindungspartner für den Analyten sein kann, der einen geeigneten Marker, wie ein Radioisotop, einen Fluorophor oder ein Enzym, das eine charakteristische Reaktion ergibt, trägt.
Eine Vereinfachung, die vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung einer gefärbten Substanz, die an einen der Reaktanten des Immunoassays als ein sichtbarer Marker gebunden ist. Jedoch ergeben nur sehr wenige gefärbte Substanzen ein ausreichend intensives Signal. Die US 4313734 von Akzona Inc. beschreibt die Verwendung unter anderem von colloidalem Gold, wie einem gefärbten Material, wobei ausgeführt wird, daß die Goldteilchen eine Teilchengröße von mindestens 5 nm, bevorzugt 10 bis 100 nm, besitzen sollten.
Ein verbessertes Immunoassaysystem ist in der WO 89/06801 beschrieben, worin mindestens 75% der Goldteilchen einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm besitzen. Dies soll eine raschere Reaktion des Goldreagenses mit dem immobilisierten Reaktanten zusammen mit einer Zunahme der Farbintensität ergeben. Es wurde nun gefunden, daß eine noch weitere Erhöhung der Farbintensität erhalten werden kann, wenn die sehr kleinen Goldteilchen der WO 89/06801 zu größeren Teilchen (superaggregierte Goldproteincolloide) durch ein neues Aggregationsverfahren gebildet werden. Die superaggregierten Teilchen unterscheiden sich sehr von den bis heute in den Immunoassays verwendeten monolithischen Goldteilchen und erlauben die Analyse von Substanzen bei noch niedrigeren Konzentrationen als die bereits beeindruckend niedrigen Gehalte, die von den Systemen der WO 89/06801 ermöglicht wurden.
Kleine Goldteilchen werden auch als Marker in einem Blottingsystem verwendet, wie in der US 4775636 von Janssen Pharmaceutica N.V., beschrieben ist. Jedoch wird nicht vorgeschlagen, daß die Teilchen aggregiert sind; sie sind vielmehr einfach an die Komponente gebunden, die sichtbar gemacht werden soll.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe bereitgestellt, wobei ein markiertes Reagens, umfassend ein an eine Substanz mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den Analyten oder an einen spezifischen Bindungspartner dafür gebundenes GoldsoI auf einer festen Phase zur Immobilisierung in gebundener Form veranlaßt wird, wodurch ein Anzeichen auf das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe erhalten wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das markierte Reagens einen superaggregierten Komplex der Substanz oder des spezifischen Bindungspartners dafür und ein Goldsol umfaßt, wobei mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen.
In vielen Typen des Festphasenassays ist es vorteilhaft, ein Analogon des Analyten oder einen spezifischen für den Analyten an einen festen Träger zu koppeln, um die feste Phase bereitzustellen, auf der das markierte Reagens immobilisiert wird. Als ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur qualitativen Bestimmung oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt, wobei die Probe in einem wäßrigen Assaymedium mit (i) einem Analogon des Analyten oder einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten, welche auf einem festen Träger immobilisiert sind, und (ii) einem markierten Reagens, umfassend ein an ein Molekül mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung des Analyten oder eines spezifischen Bindungspartners dafür gebundenes Goldsol, und gegebenenfalls ein Enzym mit der Fähigkeit, eine charakteristische Reaktion zu ergeben, in Kontakt gebracht wird, wobei eine Menge des markierten Reagenses auf dem Träger immobilisiert wird, wobei die Betrachtung oder Bestimmung von dessen Farbe und/oder der Farbe, die von dem Enzym bei Exposition gegenüber einem Substrat dafür erzeugt wird, verwendet wird, um das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe anzuzeigen, wobei das markierte Reagens einen superaggregierten Komplex der Substanz oder des spezifischen Bindungspartners dafür und gegebenenfalls des Enzyms und ein Goldsol, worin mindestens 75 Gew.-% Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, umfaßt.
Die feste Phase, auf der das markierte Reagens immobilisiert ist, kann alternativ inert sein, und die gebundene Form des markierten Reagenses durch physikalisches Einfangen des letzteren immobilisieren, z.B. indem die gebundene Form des markierten Reagenses nicht durch die Poren in der festen Phase passieren kann, während das nicht-gebundene markierte Reagens durch solche Poren passieren kann.
Der hier verwendete Ausdruck "Analogon des Analyten" soll alle Teilchen bezeichnen, die spezifisch an einen spezifischen Bindungspartner für den Analyten, der bestimmt werden soll, binden können, und umfaßt somit eine weitere Menge des Analyten. Der mittlere Durchmesser eines Teilchens, das nicht vollständig kugelförmig sein kann, ist der Mittelwert der größten und kleinsten Durchmesser des Teilchens. Es ist bevorzugt, daß mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen, die den superaggregierten Komplex bilden, einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm besitzen, und es ist besonders bevorzugt, daß mindestens 80% der Goldteilchen unter dieser Grenze liegen. Eine untere Grenze für den mittleren Durchmesser der Teilchen ist zweckdienlicherweise 1 nm. Bestimmte Chargen des Produkts Colloidal Gold Sol G5 von Janssen Life Sciences Products, die zum Gebrauch als ein histologisches Färbemittel verkauft werden, erwiesen sich als nützlich. In einer spezifischen charge besaßen 85% der Teilchen einen Durchmesser von weniger als 5 nm, wobei der durchschnittliche Durchmesser 4,5 nm mit einer Gausschen Verteilung zwischen 1,1 und 7,6 nm betrug. Goldsole mit durchschnittlichen Durchmessern im Bereich von 2 bis 4 nm können zweckdienlicherweise durch leichte Modifikationen eines bekannten Verfahrens, z.B. Variation der Gerbsäurekonzentration in dem Verfahren von Slot und Geuze (Eur. J. Cell. Biol. 38, 87- 93, 1985), hergestellt werden. Es wurde gefunden, daß Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 4 bis 4,5 nm bevorzugt sind.
Die superaggregierten Komplexe können aus dem Goldsol und dem zu markierenden Reagens (Protein) durch Vermischen gewünschter Mengen an beiden in Lösung, Einstellen des pH- Werts auf 1 bis 5, bevorzugt 3 bis 4 und bevorzugter 3,5, durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Essigsäure, auf eine Endkonzentration von etwa 10 mmol/l und durch Gewinnen der so gebildeten makroskopischen Aggregate durch Filtration unter Waschen oder alternativ durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension gebildet werden. Die makroskopischen Aggregate werden in einem pH-neutralen Medium, welches beispielsweise 2 Gew.-% Rinderserumalbumin (BSA) enthält, mit einer fakultativen Ultraschallbehandlung resuspendiert. Die makroskopischen Aggregate verschwinden überraschenderweise rasch und hinterlassen eine Suspension aus stabilen superaggregierten Goldproteinkomplexen.
Superaggregierte colloide können auch mit einigen Proteinen bei einem neutralen pH-Wert gebildet werden, vorausgesetzt, die Colloide liegen in einem molaren Überschuß, bezogen auf das Protein, vor, und das verwendete Protein zeigt eine bestimmte Anzahl von positiv geladenen Gruppen (> 2) bei dem tatsächlich verwendeten pH. Jedoch ergibt ein saurer pH-Wert normalerweise die besten Ergebnisse.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten superaggregierten Komplexe besitzen zweckdienlicherweise eine Größe von 50 bis 5000 nm, bevorzugt 50 bis 500 nm und am bevorzugtesten 100 bis 200 nm. Die Anzahl der Goldsolteilchen pro Komplex hängt offensichtlich von der Teilchengröße und der Komplexgröße ab, aber ein Beispiel kann angegeben werden, bei dem 5 nm Teilchen 10 nm voneinander durch dazwischentretende Proteinmoleküle entfernt sind.
Unter solchen Umständen enthält ein 50 nm-Komplex etwa 15 Teilchen und ein 5000 nm-Komplex etwa 20 Millionen Teilchen. Es wurde beobachtet, daß ein 200 nm-Komplex etwa 1000 Teilchen enthält, was einem Abstand zwischen den Teilchen von 10 nm entspricht.
Die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlichen superaggregierten Goldkomplexe und die Verfahren zu deren Bildung sind neu und bilden als solche noch weitere Gesichtspunkte der Erfindung.
Im Gegensatz zu den vor stehend beschriebenen Verfahren ist der normale Weg der Durchführung einer Protein-Gold-Konjugation der Transfer des Proteins in ein salzarmes Medium mit einem pH-Wert in der Nähe des pI-Werts des Proteins. Normalerweise wird empfohlen, daß der pH-Wert eine pH-Einheit über dem pI-Wert liegt. Dabei besitzt das Protein ein Minimum an positiv geladenen chemischen Gruppen. Wenn diese Lösung zusammen mit Goldcolloiden, die vermutlich eine massive Oberflächenlokalisation von Elektronen besitzen, vermischt wird, werden nur wenige Bindungen zwischen dem Protein und dem Colloid gebildet. So wird die Bildung von Brücken zwischen einer Vielzahl an Proteinen und den Colloiden vermieden, und die Colloide werden in Lösung als einzelne Teilchen, die von den Proteinmolekülen bedeckt sind, gehalten.
Wenn der pH-Wert in der Proteinlösung erniedrigt wird, nimmt die Anzahl der positiv geladenen Gruppen auf jedem Proteinmolekül zu. So nimmt die Anzahl der positiven Ionenbindungen zwischen dem Protein und dem Colloid zu, was zur Bildung von Mehrfachbrücken und zur Bildung von makroskopischen Aggregaten führt. Dies gilt normalerweise als eine höchst ungünstige Situation, die vermieden werden soll. Jedoch nutzt die vorliegende Erfindung diesen Effekt aus. Wenn eine weitere Proteinzugabe erfolgt, lösen sich überraschenderweise die makroskopischen Aggregate auf und lassen eine Lösung mit gleichförmig geformten Superaggregaten von Protein und Goldcolloiden zurück. Da die Colloide durch die Proteinmoleküle auf Abstand gehalten werden, wird angenommen, daß die Oberfläche in jedem Superaggregat stark vergrößert ist. Da angenommen wird, daß die von den Metallcolloiden gebildete Farbe ein physikalisches Phänomen in Zusammenhang mit der Oberfläche der Colloide ist, wird die massive Erhöhung des Signals wahrscheinlich durch eine entsprechend starke Zunahme der gesamten Oberfläche pro superaggregiertem Komplex verursacht.
Zur Erläuterung der Verbesserungen, die durch die vorliegende Erfindung bewirkt werden, kann die Farbintensität unter Verwendung von superaggregierten Komplexen, die einen Bindungspartner für den auf einer festen Matrix immobilisierten Analyten enthalten, 5 bis 30 mal größer sein als die Farbe, die unter Verwendung eines 4 nm großen Gold-Antikörper-Konjugats gemäß der WO 89/06801 je nach dem genauen verwendeten System beobachtet wird.
Es ist möglich, superaggregierte Goldkomplexe zu bilden, die zwei oder mehrere Typen an Proteinmolekül enthalten, wodurch eine Anzahl von Optionen zur Erhöhung der Flexibilität und Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Assayverfahren gegeben wird. Eine Möglichkeit ist die Aggregierung der Substanz mit der Fähigkeit zur Bindung des Analyten (oder eines spezifischen Bindungspartners dafür) und eines Enzyms mit der Fähigkeit, eine charakteristische Reaktion zu erzeugen, in einen superaggregierten Komplex. Dies bietet die Möglichkeit, die Anwesenheit oder Menge des Analyten durch Betrachten oder Bestimmen der Farbe des Goldsols und/oder durch Exponieren des Enzyms gegenüber einem Substrat und Betrachten oder Bestimmen der Farbe, die von dem Enzym erzeugt wurde, zu bestimmen. Wenn die Farbe des Goldsols unter der meßbaren Nachweisgrenze liegt, kann das Enzym eine nachweisbare Farbe nach verlängerter Inkubation mit einem geeigneten Substrat ergeben. Beispiele für geeignete Enzyme sind alkalische Phosphatase und Peroxidasen, wie Meerettichperoxidase. Es wird angenommen, daß wenn die Farbe des Goldsols unter der Nachweisgrenze zur Bestimmung des Analyten liegt, dann das Goldsolsuperaggregat als eine besonders milde Form einer Protein-Protein- Vernetzung wirkt, die unter bestimmten Umständen, verglichen mit einer herkömmlichen kovalenten Vernetzung, Vorteile besitzt.
Alternativ kann ein superaggregierter Komplex, der zwei Substanzen mit der Fähigkeit, an verschiedene Zielmoleküle zu binden, enthält, gebildet werden, beispielsweise auf einer Seite ein Antikörper (Ab1) für den Analyten und auf der anderen Seite ein Antikörper (Ab2) für ein anderes Antigen. Sobald der Komplex über Ab1 an einen Analyten gebunden wird, der selbst direkt oder indirekt an einen festen Träger gebunden ist, dann verursacht die Exposition des Ganzen gegenüber einem weiteren superaggregierten Komplex, der das Antigen (Ag2) für den Antikörper Ab2 enthält, ein Cluster von zweiten Komplexen um den ersten Komplex und eine Erhöhung der Farbe des gesamten Goldsols. Das Verfahren könnte für weitere Stufen gegebenenfalls fortgesetzt werden; beispielsweise könnte der zweite Komplex zwei Antigene Ag2 und Ag3 enthalten, wobei das zuletzt genannte als Befestigungspunkt für einen noch weiteren Komplex, der einen Antikörper dafür (Ab3) enthält, dient.
Andere Rezeptor-Ligand-Paare können natürlich bei einem solchen Amplifikationssystem in Betracht gezogen werden, wie z.B. (Strept)Avidin und Biotin, Enzyme und Enzyminhibitoren, Lectine und Glykoproteine, Protein A und Immunglobuline usw.
Das System kann auch zur Bildung wachsender Komplexe aus Aggregaten durch gleichzeitige Zugabe von zwei Hybridaggregaten gebracht werden, wobei eines davon an einen immobilisierten Analytenrezeptor gebunden werden kann, und beide mehrfache Reaktiänsgruppen von jeweils mindestens zwei Typen tragen, wovon einer mit dem anderen Aggregat wechselwirkt. Das Ergebnis ist die Bildung eines Netzwerks aus Aggregaten, die auf dosisabhängige Art gebildet werden können, wenn das Material in ein Durchflußsystem, das den imnmobilisierten Analyten trägt, gegeben wird.
Goldcolloide, die mit einem Antikörper, der mit einem Analytenantigen reagiert, aggregiert sind, können nach Zugabe des Analyten agglutinieren. Die Reaktion kann langsam sein. Eine Amplifikation kann durch Bildung eines ersten Hybridaggregats basierend auf den Goldcolloiden und einem ersten Antikörper Ab1, der mit dem Analytenantigen Ag1 reagiert, und einem zweiten Antikörper Ab2 erzielt werden. Ein zweites Aggregat, das Mehrfachantigene Ag2 trägt und mit Ab2 reagiert, wird zugesetzt und wird die Agglutinationsreaktion beschleunigen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auf jedes beliebige Festphasensystem zum Nachweis oder zum Assay von Analyten angewendet werden. Die folgenden Assaytypen sind typisch:
1. Ein Sandwichassay, in dem die Komponente A an einen festen Träger gebunden ist. Die Testlösung mit dem Analyten B wird zugesetzt, wobei B an A bindet. Die goldmarkierte Komponente C wird zugesetzt, und da C an B bindet, wird das colloidale Gold immobilisiert und färbt den festen Träger.
Die Komponenten A, B und C gehören alle den Rezeptor- Liganden-Typen an, worin sowohl A als auch C mit B wechselwirkt, wohingegen A und C nicht direkt aneinander binden.
2. Ein Sandwichassay wie in 1, ausgenommen, daß die Testlösung mit dem Analyten B und die goldmarkierte Komponente C vermischt werden, und das Gemisch dem festen Träger zugesetzt wird, an den die Komponente A gebunden ist.
3. Ein kompetitiver Assay, in dem die Komponente A an einen festen Träger gebunden ist. Die Testlösung mit dem Analyten B wird mit einer bekannten Menge eines mit Gold markierten Analyten B vermischt und dem festen Träger zugesetzt. B und das goldmarkierte B konkurrieren bezüglich der Bindung an A, und eine Verringerung der Farbe des colloidalen Golds auf dem festen Träger zeigt zunehmende Mengen des Analyten B in der Testlösung an.
4. Ein kompetitiver Assay wie in 3, aber aufeinander-folgende Zugabe der Testlösung und des goldmarkierten B.
5. Ein Überschuß an der Komponente A wird mit dem colloidalen Gold markiert und mit der Testlösung, die eine unbekannte Menge an Analyt B enthält, vermischt. A und B koppeln dann. Das Gemisch wird auf einen porösen Träger gegeben, auf dem die Komponente B immobilisiert ist. Das verbleibende nicht-gebundene markierte A koppelt an das immobilisierte B auf dem festen Träger.
6. Der Analyt B wird mit der mit Gold markierten Komponente C gegebenenfalls zusammen mit einer oder mehreren Bindungspartnern für den Analyten B unter Bildung eines komplexen Aggregats umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird zur Diffusion durch ein inertes Filtermedium veranlaßt, dessen Poren zu klein sind, als daß das komplexe Aggregat hindurchpassieren könnte, aber groß genug sind, um der überschüssigen mit Gold markierten Komponente den Durchtritt zu erlauben.
Die feste Phase oder der Träger, auf dem das markierte Reagens immobilisiert wird, kann eine Anzahl von Formen annehmen, von denen die folgenden beispielhaft genannt werden:
- Ein Plastikstab, der gegebenenfalls mit Pads von jedem beliebigen porösen Material bedeckt ist. Der Stab kann in die Reaktionslösungen eingetaucht werden, um die verschiedenen Stufen eines Assays durchzuführen.
- Die Wand eines Reagensglases, eine Kavität in einer Mikrotiterplatte oder die Wand irgendeiner geeigneten Reaktionskammer.
- Ein poröses Material, zweckdienlicherweise eine Membran, in der die Reaktionslösung transversal hindurch oder lateral diffundieren kann. Im Falle der Verwendung des Filtrationsprinzips erlauben solche Materialien vorteilhafterweise einen Durchtritt der überschüssigen Reagentien und können zweckdienlicherweise mit einem Absorbens für solche überschüssigen Flüssigkeiten kombiniert werden.
- Kügelchen (einschließlich Mikrokügelchen), die durch Zentrifugation, Filtration oder, sofern die Kügelchen ferromagnetische Komponenten enthalten, Magnetismus, isoliert werden können.
Die Kopplung des Analytenanalogons oder spezifischen Bindungspartners für den Analyten, der getestet werden soll, an den Träger, kann durch kovalente, elektrostatische oder hydrophobe Mittel oder einer Kombination dieser Methoden erfolgen. Solche Methoden sind auf dem Fachgebiet gut etabliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Nachweis oder zum Test auf eine breite Vielzahl von Analyten verwendet werden, die beispielsweise aus den folgenden Ligand-Rezeptor- Paaren ausgewählt werden können: Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper, Hormon/Hormon-Rezeptor, Zucker/Lectin, Biotin/Avidin-(Streptavidin), Protein A/Immunglobulin, Enzym/Enzym-Cofaktor, Enzym/Enzym-Inhibitor und Nucleinsäurepaare (DNA-DNA, DNA-RNA oder RNA-DNA). Mindestens einer solcher Reaktionspartner kann an andere Moleküle gebunden sein oder mit diesen komplexiert sein. So können Biotin oder Avidin oder eine breite Vielzahl von Antikörpern an andere Moleküle gekoppelt sein, um ein Mittel zur Bestimmung des letzteren darzustellen. Beispielsweise kann eine spezifische Nucleinsäuresonde durch die Einführung von biotinylierten Nucleosidtriphosphaten markiert werden. Eine solche Sonde kann nach der Bindung an die Analyten- DNA oder -RNA dann durch die Verwendung von mit Goldsol markiertem Avidin oder Streptavidin nachgewiesen oder bestimmt werden.
Im allgemeinen ist, wenn der Analyt einer der vorstehend aufgeführten ist, ein Bindungspartner zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren die andere Komponente des Paares. In Sandwichsystemen, in denen der Analyt sowohl an den immobilisierten Bindungspartner und einen mit dem Goldsol markierten Bindungspartner bindet, können die Bindungspartner gleich oder verschieden sein. Bevorzugt sind die Bindungspartner jeweils ein Antikörperreagens, das gegen verschiedene in gutem Abstand vorhandene Determinanten des Analyten gerichtet ist.
Es ist zu verstehen, daß der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" folgendes umfaßt:
(a) Jede der verschiedenen Klassen oder Subklassen von Immunglobulinen, z.B. IgG, IgM, abgeleitet von jedem beliebigen der üblicherweise verwendeten Tiere;
(b) monoclonale Antikörper; und
(c) Fragmente von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, die eine Antigenbindungsstelle beibehalten, d.h. Fragmente ohne den Fc-Teil (z.B. Fab, Fab', F(ab'))&sub2;) oder die sogenannten "Halbmolekülfragmente",die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schwerkettigen Komponenten in dem intakten Antikörper verknüpfen, erhalten wurden.
Nachstehend ist eine nicht-erschöpfende Liste der Typen von Immunogenen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden können, aufgeführt. Proteine Nucleoproteine Serumproteine Coagulationsfaktoren Virale Produkte Pilzprodukte Albumin Bradykinin Glycoproteine Peptidhormone Komplementproteine Mikrobiocide Produkte Bakterielle Produkte Spezifische Immunogene Angiotensin Calcitonin Carcinoembryonales Antigen Chloriomamotropin Corticotropin Faktor VIII alpha-2-H-Globulin Follitropin Gastrin Glucagon Haptoglobin Immunglobuline (A, D, E, G, M) Insulin Kallidin Melanotropin Oxytocin Placenta-Lactogen Proangiotensin Somatotropin Secretin Somatostatin Thymopoietin Vasopress in alpha-1-Fetoprotein Creatininkinase-Isoenzyme Chorogonadotropin Erythropoietin Fibrinogen Fibrinabbau-Produkte Gastrinsulfat Gonadotropin Hepatitis B-Oberflächen-Antigen Menschliches C-reaktives Protein Lipotropin Myoglobin Pancreozymin Prathryin Prolactin Relaxin Somatomedin Thryrotropin Vasotocin alpha-2-H-Globulin
Besonders interessante Analyten zum Assay gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren sind Blutproteine, wie Fibrinabbauprodukte, z.B. D&sub2;, die durch Immunglobuline, wie IgG, gebunden werden; menschliches C-reaktives Protein; Creatininkinaseisoenzyme; und Myoglobin.
Die Analytlösung kann direkt verwendet werden oder kann beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung verdünnt werden. Das Goldsolpräparat kann auch in verschiedenen Verdünnungen unter Verwendung einer geeigneten Pufferlösung hergestellt werden, wobei die Verdünnungen so ausgewählt sind, daß eine Farbe mit der gewünschten Intensität (d.h. der optischen Dichte oder Reflexion) bei Beendigung des Assayverfahrens erhalten wird. Es kann zweckmäßig sein, den Träger zu waschen, um überschüssige Reagentien zu entfernen, beispielsweise mit einer Pufferlösung vor dem Assay, um die Hintergrundfarbe zu verringern.
Wenn der Assay auf der Gesamtmenge des Goldsols, das auf dem immobilisierten Träger zurückgehalten wurde, beruht, kann die Farbe durch ein Reflektometer, Densitometer oder eine ähnliche Vorrichtung abgeschätzt werden.
Der Träger, der zur Immobilisierung eines der Bindungspartner in dem Assay oder eines Analytenanalogons verwendet wird, kann beispielsweise Nitrocellulose, Papier oder mit Reagentien, wie Cyanbromid, aktiviertes Celluloseacetat und Nylon, das durch Einführen von tertiären Aminogruppen modifiziert wurde, sein. Solche Träger werden zweckdienlicherweise in Form von porösen Membranen verwendet.
In einem besonderen bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren ist der inerte Träger eine Membran, beispielsweise eine Nylonmembran, wie Hybond N (verkauft von Amersham International), die leicht Proteine adsorbiert und die Poren besitzt, die den Durchtritt von Flüssigkeit erlauben. Ein Absorbent-pad, wie Celluloseblottingpapier, wird vorteilhafterweise auf einer Seite der Membran aufgebracht, und ein flüssigkeitsundurchlässiges Blatt, bevorzugt weiß, wird über dem Pad angebracht. Ein ähnliches flüssigkeitsundurchlässiges Blatt wird über der anderen Seite der Membran angebracht, wobei ein Loch, z.B. etwa 3,5 mm weit, auf diesem Blatt vorgesehen ist, um das Aufbringen der Analytlösung und der Assayflüssigkeiten auf die Membran zu gestatten. Zuerst wird die Membran durch Aufbringen eines kleinen Volumens, z.B. etwa 2 ul, einer wäßrigen Lösung, die eine bekannte Menge eines Bindungspartners für den Analyten enthält, aktiviert, dann getrocknet, z.B. durch Trocknenlassen bei Raumtemperatur. Ein bekanntes Volumen der wäßrigen Lösung, die den Analyten enthält, beispielsweise etwa 25 ul, wird dann auf die Membran aufgebracht und dadurch in das Absörptionspad darunter passieren gelassen. Eine wäßrige Lösung, z.B. 25 ul, die eine bekannte Menge colloidaler Goldsolteilchen, die mit einem Bindungspartner für den Analyten markiert sind, der gleich oder verschieden von dem, der anfänglich auf die Membran aufgebracht wird, sein kann, enthält, wird dann aufgebracht und durch die Membran passieren gelassen.
Ein kleines Volumen Wasser oder Puffer kann gegebenenfalls aufgebracht werden, um das Goldsolreagens auszuwaschen und so die Hintergrundfarbe zu minimieren. Die Menge des auf der Membran immobilisierten Goldsols wird dann durch ein Reflektometer oder mit dem bloßen Auge durch Vergleich mit einer Farbskala bestimmt.
Bei dem vorstehend dargelegten Arbeitsverfahren (6) kann die Membran ein Blattmaterial der gewünschten Porosität sein, das sofern inert ist, als seine einzige Funktion eine Filterwirkung ist. Die Aggregation des Analyten mit der Komponente C kann durch Einschluß von zwei oder mehreren verschiedenen Bindungspartnern für den Analyten zur Bewirkung einer Form von Vernetzung, welche zu größeren Aggregaten führt, verstärkt werden. Alternativ kann die Komponente C den Bindungspartner für den Analyten immobilisiert auf Kügelchen, beispielsweise monodispersen Kügelchen, wie Dynospheres (Dynal A/S, Oslo, Norwegen), umfassen.
Die Erfindung umfaßt auch Kits zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend (a) eine feste Phase, auf der ein markiertes Reagens zur Immobilisierung veranlaßt wird, wodurch das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe angezeigt wird, und (b) ein markiertes Reagens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das markierte Reagens einen superaggregierten Komplex einer Substanz mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den Analyten oder einen spezifischen Bindungspartner dafür und eines Goldsols, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, umfaßt. Eine bevorzugte Form des Kits umfaßt (a) einen festen Träger zur Immobilisierung eines Analogons des Analyten oder eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten oder eines Komplexes des Analyten mit einem oder mehreren anderen Reagentien, (b) das Analogon des Analyten oder den Bindungspartner und (c) ein Reagens, umfassend einen superaggregierten Komplex aus einem Moleküls mit der Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den Analyten oder einen spezifischen Bindungspartner dafür und einem Goldsol, worin mindestens 75% der Teilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen. Wenn ein Enzym mit der Fähigkeit zur Erzeugung einer charakteristischen Reaktion in den superaggregierten Komplex aufgenommen wird, dann kann ein Vorrat des Enzymsubstrats auch in das Kit aufgenommen werden.
Gegebenenfalls kann die feste Phase, die in dem Kit enthalten ist, ein fester Träger sein, der bereit für den Kontakt mit dem Analyten durch den Verwender durch vorläufige Kopplung eines Analogons des Analyten oder eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten an den Träger ist. Für einige Assays kann ein solches Kit eine Standardmenge des Analyten, eine Standardmenge eines spezifischen Bindungspartners dafür und das Goldsolreagens umfassen.
Standardmengen des Analyten oder des spezifischen Bindungspartners oder des Reagenses können in der Form von wäßrigen Lösungen oder üblicherweise lyophilisierten Präparaten, die für die Verdünnung zur Zeit des Gebrauchs angepaßt sind, vorliegen. In einer Form des Assays kann der feste Träger eine inerte poröse Membran sein, die dazu dient, einen Komplex des Analyten und eines Bindungspartners in aggregierter Form zurückzuhalten, aber die Diffusion des Goldsolreagenses erlaubt, wie in dem vorstehenden Verfahren 6. In einem solchen System kann die Größe des Analytenkomplexes dadurch erhöht werden, daß man den Bindungspartner oder die Analoga des Analyten in Bindung an relativ große Teilchen, z.B. die vorstehend erwähnten Dynospheres, bereitstellt.
Während die vorstehende Diskussion und die folgenden Beispiele sich auf Rezeptor-Ligand-Assays konzentrieren, ist klar, daß die neuen superaggregierten Komplexe eine breite Vielzahl von anderen Verwendungen auf Gebieten besitzen, auf denen Goldcolloide Verwendung gefunden haben. So können die Aggregate bei Blottingtechniken verwendet werden, bei denen sie an einen Antikörper oder ein anderes Bindungsmaterial, das gegen eine Verbindung, die vermutlich in der Probe vorhanden ist, gerichtet ist, gebunden werden. Sie sind auch zum Anfärben von Gewebsschnitten für die Licht- oder Elektronenmikroskopie oder für andere Anfärbetechniken nützlich; bei der Zentrifugation können sie als Marker nützlich sein; und in Agglutinationsassays können sie die gegenwärtig verwendeten Latexteilchen ersetzen. Andere Anwendungen können bereitwillig von einem Fachmann ins Gesicht gefaßt werden, worin die superaggregierten Komplexe andere Typen von gegenwärtig verwendeten Teilchen ersetzen können.
Die folgenden Beispiele dienen nur der näheren Erläuterung:-

Beispiel 1

Das colloidale Gold mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4 nm wurde, wie von Mulphfordt (1982), Experientia 38, Seiten 1127-1128 beschrieben, hergestellt.
Ein monoclonaler Mausantikörper S4H9 gegen das D-dimere Fibrinabbauprodukt wurde durch übliche Hybridomatechnik entwickelt; der Antikörper wurde in Mausascites produziert und schließlich gereinigt. Vor Gebrauch wurde der gereinigte Antikörper gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml eingestellt.
Eine Suspension aus Goldcolloiden mit einer optischen Dichte von 40 bis 540 nm (abgeschätzt aus der Verdünnung der Colloidsuspension) wurde verwendet. Die Suspension wurde durch Zentrifugation, Entfernen von 90-95% des Überstands und Resuspension in destilliertem Wasser vor Gebrauch hergestellt. 25 ml dieser Lösung wurden mit Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von 10 mmol/l versetzt, wodurch ein pH-Wert von etwa 3,5 erzielt wurde, und anschließend wurden sofort 15 ml der dialysierten Lösung des Antikörpers 54H9 zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang gerührt. Makroskopische Aggregate waren sofort sichtbar. Nach 20 Minuten wurde die Suspension 10 Minuten lang bei 5000xg zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die sedimentierten Aggregate wurden in destilliertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 40 ml resuspendiert. 10 ml einer Lösung aus 10%igem Rinderserumalbumin (BSA) wurde zugesetzt. Die Suspension wurde auf Eis gekühlt und dann langsam etwa 15 Sekunden lang mit Ultraschall beschallt. Größere Volumina können bevorzugt in einem Durchflußsystem beschallt werden. Die Suspension wurde viermal auf ein Endvolumen von 200 ml verdünnt, über ein 0,22 um Filter steril filtriert, und schließlich auf 20 mmol/l NaCl eingestellt. Die Elektronenmikroskopie zeigte, daß die Colloide als Cluster mit Durchmessern von 100 bis 200 nm vorhanden waren (Fig. 1).
Die Suspension passierte durch die 0,22 um Filter, (=220 nm), wohingegen Filter mit Durchmessern von 100 nm und 50 nm die gefärbten Colloide vollständig zurückhielten.
Ein Standardkonjugat wurde unter Verwendung des Standardmarkierungsverfahrens für Antikörper, wie von Slot und Geuze (Eur. J. Cell. Biol 38 Seiten 87-93, 1985) beschrieben, hergestellt. Bei diesen Verfahren wurden keine Aggregate gebildet, da der pH-Wert in der Nähe des pI- Werts des Antikörpers während des Konjugationsverfahrens gehalten wurde. Das abgeschätzte Verhältnis zwischen Gold und Antikörper in den so erhaltenen Konjugaten betrug 1:1, und die Elektronenmikroskopie bestätigte, daß die Goldteilchen willkürlich in der Lösung verteilt waren (Fig. 2).
Die Konjugate wurden in der folgenden Testvorrichtung getestet:
Ein 1 x 1 cm großes Stück aus Nitrocellulosemembran mit einer Porengröße von 0,6 4m wurde unter einen Streifen aus weißem Polyvinylchlorid (PVC) mit einer Dicke von 0,28 mm und mit einem 3,5 mm Loch, das über der Membran zentral angeordnet war, gegeben. Die Membran wurde an das Plastik unter Verwendung eines doppelseitigen Klebestreifens geklebt. Der PVC-Streifen mit der daran befestigten Membran wurde dann auf ein 1 mm dickes Cellulosepapierpad auf die Fläche des Klebebands, die von der Membran nicht bedeckt war, befestigt. Die Vorrichtung wurde von unten durch einen weiteren PVC-Streifen mit einer Dicke von 0,40 mm, der an das Pad unter Verwendung von doppelseitigem Klebeband fixiert war, geschlossen. Diese Konstruktion ermöglicht die Passage von Flüssigkeit durch das Loch in dem oberen PVC-Streifen durch die Membran und die Anreicherung in dem Pad. Die Membran wurde durch Zugabe von 2 ul einer 3,0 mg/ml-Lösung des Antikörpers S4H9 aktiviert, und die Membran wurde vor Gebraucht trocknen gelassen.
25 ul einer Plasmaprobe, von der bekannt war, daß sie das D-Dimere enthielt, wurde auf die Membranoberfläche in parallele Löcher in der Testvorrichtung gegeben. Nach etwa 20 Sekunden war das Plasma durch die Membran und in das Pad passiert. 25 ul des Goldkonjugats der aggregierten Form und die 25 ul des Goldkonjugats der nicht-aggregierten Form wurden in jedes der zwei parallelen Löcher gegeben. Wenn die Flüssigkeit durch die Membran passiert war, wurde ein Tropfen 0,15 mol/l NaCl zugesetzt, um einen Überschuß des Konjugats auszuwaschen. Als Kontrolle wurde Plasma, das bekanntlich normale niedrige Gehalte an dem D-Dimeren enthielt, dem gleichen Verfahren unter Verwendung der zwei Konjugate unterworfen. Die Ergebnisse wurden instrumentell unter Verwendung eines Reflektometers (Color Eye, Macbeth), das mit einem IBM PC verbunden war, wobei ein Macbeth's Softwareprogramm verwendet wurde, abgelesen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die mit dem normalen Plasma mit einem niedrigen Gehalt des D-Dimeren gebildete Farbe eine gleiche niedrige Reflexion (< 0,18 bei 540 nm) ergab. Die mit dem nicht-aggregierten Konjugat gebildete Farbe war im allgemeinen schwach, wohingegen die mit dem aggregierten Konjugat gebildete Farbe etwa 10 mal stärker wie aus den Reflexionswerten beurteilt wurde, war. Die Ergebnisse zeigen, daß die neue Form der Konjugate ein Nettoergebnis ergab, das deutlich stärker war, als das mit den üblichen Konjugaten. Das Hintergrundsignal wurde durch die Aggregation nicht beeinflußt.
Ferner zeigt der Filtrationstest, daß die Größe der aggregierten Goldcolloide im Bereich von 100 bis 200 nm lag. Dies wurde durch Elektronenmikroskopie bestätigt.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die aggregierten Konjugate auch unter Verwendung eines einfacheren Verfahrens ohne Beschallung gebildet werden können.
Goldcolloide, Testvorrichtung und Antikörper wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Goldcolloidsuspension wurde bis zu der Stufe des Einstellens des pH- Werts auf 3,5 unter Verwendung von Essigsäure hergestellt. 25 ml der Colloidsuspension mit eingestelltem pH-Wert wurde zu 12,5 ml einer Lösung aus 1,5 mg/ml S4H9 gegeben. Nach 25 Minuten bei 20ºC wurde die Suspension mit einer Lösung von 10% BSA, welche auf pH 9,0 eingestellt war, versetzt. Die Endkonzentration an BSA betrug 0,2%. Die Suspension wurde dann auf 40 mmol/l Tris-HCI (pH 7,3) eingestellt. Wenn die Suspension über Nacht unter Rühren stehengelassen wurde, verschwanden die sichtbaren Aggregate und die Suspension lief durch ein steriles Filter mit einer Porengröße von 0,22 um, aber nicht ein Filter mit 100 nm. Die Elektronenmikroskopie zeigte, daß Aggregate gebildet wurden, obwohl nicht so dicht gepackt, wie bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Der Test gemäß dem Schema in Beispiel 1 zeigte, daß das Signal um etwa 5 mal, verglichen mit den üblichen nicht-aggregierten Konjugaten, erhöht war.

Beispiel 3

Das Verfahren in Beispiel 1 wurde mit der einzigen Ausnahme wiederholt, daß die Goldcolloidsuspension mit NaCl bis zu 5 mmol/l versetzt wurde, und 14 Tage lang bei 4ºC vor Gebrauch gehalten wurde. Dieses Verfahren läßt die Goldcolloide Aggregate auf eine deutlichere Weise bilden. Wenn die Konjugate gemäß dem Schema in Beispiel 1 getestet wurden, waren die Farbsignale etwa 30 mal so stark, wie die Signale, die unter Verwendung von nicht-aggregiertem Gold erhalten wurden. Der Hintergrundspiegel war geringfügig erhöht, was anzeigt, daß die gebildeten Aggregate größere Durchmesser zeigten.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird gezeigt, daß bestimmte Antikörper mit Goldcolloiden bei einem pH-Wert in der Nähe des neutralen Aggregate bilden können. Die Größe und die Intensität des Signals, die aus der Verwendung solcher Aggregate auftreten, können durch Variieren des Verhältnisses zwischen dem Protein und dem Gold in dem Konjugationsverfahren eingestellt werden.
Ein monoclonaler Mausantikörper mit der Bezeichnung 2D2, der gegenüber menschlichem Serumalbumin spezifisch ist, wurde unter Verwendung der gut bekannten Hybridomatechnologie entwickelt. Die Antikörperproduktion wurde unter Verwendung von Mausascitesflüssigkeitstechniken im Maßstab vergrößert, der Antikörper wurde gereinigt und gegen 2 mmol/l Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) dialysiert. Die Endkonzentration des Antikörpers betrug 1,0 mg/ml.
Die Goldcolloide wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die colloidale Suspension wurde auf eine optische Dichte von 40 bei 540 nm eingestellt.
Die Antikörper lösung und die Goldcolloidsuspension wurden in den folgenden Verhältnissen gemischt: 1+2, 1+2,2, 1+2,5, 1+3, 1+3,5.
Nach 25 Minuten bei 20ºC wurden die Lösungen mit einem gleichen Volumen 1%ige BSA-Lösung versetzt.
Die Konjugate wurden in Vorrichtungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Membranen wurden durch Zugabe von 2 ul einer 3,0 mg/ml-Lösung eines anderen monoclonalen Mausantikörpers (2D3) gegen menschliches Serumalbumin aktiviert. Die Membranen wurden vor Gebrauch trocknen gelassen.
Menschliche Urinproben mit einem Albuminzusatz von 0 (Kontrolle), 10, 25, 50, 100 bzw. 200 mg/l wurden in 0,15 mol/l NaCl in dem Verhältnis 1+20 verdünnt. 25 ul jeder Verdünnung wurden in fünf parallele Löcher in den Testvorrichtungen gegeben. Wenn die verdünnten Proben in die Membran eingesickert waren, wurde ein Tropfen von jedem der Konjugate in jedes Loch in jede der parallelen Reihen gegeben. Schließlich wurde ein Tropfen 0,15 mol/l NaCl zugesetzt, um die Membran zu waschen, und jedes Loch wurde reflektometrisch, wie in Beispiel 1 beschrieben, abgelesen.
Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt, welche zeigt, daß eine ausgeprägte Erhöhung in dem so erhaltenen Signal besteht, wenn die Menge des Antikörpers zunimmt. In keinem der Fälle konnten freie Antikörper (nicht konjugiert an Goldteilchen) in den Lösungen gefunden werden. Deshalb und wegen der relativen Zunahme der Reflexionswerte kann die Zunahme des Signals nicht durch eine erhöhte Anzahl an reagierenden Antikörpern als solche erklärt werden. Versuche mit 50 nm-Filtern zeigten auch, daß das Konjugat im Verhältnis 1+2 hauptsächlich durch das Filter zurückgehalten wurde, wohingegen das Konjugat im Verhältnis 1+3,5 frei passierte. So waren Antikörper mit einer erhöhten Fähigkeit, das Signal zu erhöhen, mit dem Antikörper 2D2 bei einem pH-Wert in der Nähe von neutral gebildet worden.

Beispiel 5

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde mit der einzigen Ausnahme wiederholt, daß der Antikörper durch einen monoclonalen Antikörper T11G8 gegen das C-reaktive Protein ersetzt wurde. Die Konzentration des Antikörpers, des Lösungsmittels für den Antikörper, das colloidale Gold und das vollständige Verfahren waren das gleiche wie in Beispiel 1. Der Filtrationstest zeigte die Passage durch 200 nm-Filter, aber nicht in 50 oder 100 nm-Filtern.
Zum Vergleich wurde ein Standardkonjugat hergestellt, in dem der pH-Wert bei 6,5 gehalten wurde, was nahe dem pI- Wert von T11G8 liegt. Dieses Konjugat dringt leicht durch einen 50 nm-Filter, was anzeigt, daß keine Aggregate gebildet wurden. Die Elektronenmikroskopie bestätigt dies, indem sie nur untergeordnete Clusterbildung von Goldcolloiden in dem abschließend erhaltenen Präparat zeigt.
Zwei Konjugate wurden in einer Vorrichtung, die der in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich ist, getestet. Die Membran wurde durch Zugabe von 2 ul einer 3,0 mg/ml-Lösung des monoclonalen Antikörpers G405 gegen das C-reaktive Protein aktiviert und vor Gebrauch getrocknet. 25 ul verdünnter Plasmaproben, von denen bekannt war, daß sie das C-reaktive Protein enthielten, wurden auf jedes Membranstück durch die Öffnung in der Plastikabdeckung gegeben, und anschließend wurden 25 ul der Konjugatlösung, die in jeweils einer der beiden Formen hergestellt war, zugesetzt, und weiterhin wurde ein Tropfen 0,15 mol/l Nacl zugesetzt, um die Hintergrundfarbe zu beseitigen.
Die Figur 4 zeigt die Ergebnisse, die durch stufenweise Verdünnungen von 1:50 bis 1:800 eines Plasmas, welches 32 mg/l CRP enthielt, erhalten wurden. Das Verdünnungsmittel war 0,15 mol/l NaCl. Wie die Figur zeigt, zeigen die beiden Konjugattypen eine beträchtlich unterschiedliche Färbungsintensität auf der Membran, wobei das aggregierte Konjugat zu mehr als 10-fach erhöhten Signalen führt.
Die beiden Konjugate wurden bei 4ºC für eine Zeitspanne von neun Monaten gehalten und regelmäßig getestet. Keines der Konjugate zeigte nach dieser Lagerzeit veränderte Eigenschaften, was anzeigt, daß die aggregierten Konjugate extrem stabil sind.

Beispiel 6

Der vorstehende Versuch wurde wiederholt, wobei der Antikörper T11G8 gegen ein gereinigtes Kaninchen-anti-Humanserumalbumin (anti-HSA) ersetzt wurde. Die so erhaltenen Konjugate wurden in einer Vorrichtung, die Membranen, die mit einem monoclonalen anti-HSA-Antikörper beschichtet waren, enthielt, nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 1 und 5, getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß bei Anwendung von verdünntem Urin, der bekanntlich Albumin enthält, das aggregierte Konjugat zu einem etwa 8 mal erhöhten Farbsignal, verglichen mit dem herkömmlichen nichtaggregierten Konjugat, führte.

Beispiel 7

Aggregierte Konjugate können auch unter Verwendung von anderen Proteinen als Antikörpern gebildet werden. Das Verfahren der Herstellung der Goldcolloide und der aggregierten Konjugate aus Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei dieses Mal der Antikörper durch Rinderserumalbumin ersetzt wurde. Die verwendete Albuminkonzentration betrug 1,5 mg/ml, wie bei den Antikörpern. Aggregate mit ähnlichen Filtereigenschaften wie die Antikörperaggregate wurden gebildet. Das Albumin-aggregierte colloidale Gold wurde elektronenmikroskopisch untersucht und zeigte eine willkürliche Verteilung der geclusterten Colloide, die ähnlich denjenigen, die in Beispiel 1 gebildet wurden, war.

Beispiel 8

Ein anderes von den Antikörpern verschiedenes Protein, das an colloidales Gold in einer aggregierten Form konjugiert werden kann, ist Protein A. Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 wurde verwendet, wobei eine Protein-A-Konzentration von 1,5 mg/ml, wie bei den anderen Proteinen, verwendet wurde. Das so erhaltene aggregierte Konjugat, ebenso wie ein herkömmliches nicht-aggregiertes, wurden in einer ähnlichen Vorrichtung, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Die Membran wurde mit einem monoclonalen IgG-Antikörper gegen Humanserumalbumin beschichtet. Da Protein A direkt mit den Immunglobulinen reagiert, zeigte die Zugabe von verschiedenen Verdünnungen der zwei Konjugate, daß nach Zugabe einer gleichen Menge des konjugierten Proteins A das aggregierte Konjugat ein Signal ergab, das etwa 12 mal stärker war, als das Signal, das mit dem herkömmlichen Konjugat erhalten wurde.

Beispiel 9

In diesem Beispiel wird die Bildung eines Hybridaggregats, das zwei verschiedene Proteine enthält, die zur Bindung bzw. Signalbildung verwendet werden können, gezeigt. Das Enzym alkalische Phosphatase (ALP) wird an Goldteilchen zusammen mit Kaninchen-anti-Maus-IgG cokonjugiert. Ein solches Konjugat erlaubt den Nachweis von Maus-IgGs entweder durch direkte Beobachtung der Goldfärbung oder durch Verwendung des Enzyms in einem ELISA.
Das Enzym (ALP) und der Antikörper wurden durch Gelfiltration über einer PD-10-Säule, die mit 10 mmol/l Essigsäure equilibriert worden war, entsalzt und anschließend in einem Massenverhältnis von 1,5:1 (Enzym:Antikörper) vermischt. Das Proteingemisch wurde dann an Goldcolloide in 10 mmol/l Essigsäure konjugiert, wobei die Summe der Massen der beiden Proteine das gleiche Protein: Gold-Verhältnis, wie in Beispiel 1 beschrieben, ergaben. Die superaggregierten präzipitierten Konjugate wurden passiv sedimentieren gelassen, beschallt und Rinderserumalbumin (BSA) blockiert und schließlich steril filtriert, wobei das ganze Verfahren etwa 1 Stunde benötigte.
Die Fig. 5 zeigt das Nachweispotential des so erhaltenen Hybridkonjugats. Verdünnungen des Konjugats wurden direkt auf Nitrocellulose mit einer gleichförmigen Verteilung über Kreise mit einem Durchmesser von 3,5 mm getüpfelt. Die Goldfärbungen wurden mit einem Reflektometer gemessen. Die Nitrocellulose wurde anschließend in eine Substratlösung für die alkalische Phosphatase, die Bromchlorindolylphosphat (BCIP) enthielt, überführt. Nach 30-minütiger Inkubation bei sanftem Schütteln wurde ein dunkles purpurfarbenes Produkt aus der Wirkung von ALP auf BCIP auf der Nitrocellulose ausgefällt. Die Figur 5 zeigt, daß eine weitere Zunahme der Empfindlichkeit auf das 10-fache gegenüber der, die mit der Goldfärbung beobachtet wurde, unter Verwendung dieser fakultativen Enzymaktivität erzielt wurde.
Fig. 6 zeigt den Nachweis des monoclonalen Maus-IgGs, das auf Nitrocellulose getüpfelt wurde, wobei zwei fakultative Anfügungen des Hybridkonjugats verwendet wurden. Eine Gesamtmenge von 0,1 bis 100 ng des Antikörpers, der in 100 ug/ml BSA verdünnt war, wurde auf die Nitrocellulose in einem doppelten Ansatz getüpfelt. Die Nitrocellulose wurde getrocknet, mit BSA blockiert und mit dem Konjugat in Gegenwart von 0,1% Tween 20 20 Minuten lang inkubiert. Einer der Blots wurde in die Enzymsubstrat(BCIP)lösung überführt und, wie vorstehend beschrieben, inkubiert. Die entwickelten Blots zeigen, daß 1 ng Antikörper unter Verwendung der Goldfärbung nachgewiesen werden konnte, während 0,1 ng unter Verwendung des Enzyms nachgewiesen wurde. Die Enzymfärbung scheint eine gesamte erhöhte Empfindlichkeit von etwa dem 15-fachen, verglichen mit der Goldfärbung, zu ergeben.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wird die Bildung eines Hybridsuperaggregats, welches colloidales Gold und zwei verschiedene Proteine enthält, von denen eines ein spezifischer Bindungspartner für den Analyten ist, und das zweite Protein nicht an der Reaktion teilnimmt oder nicht in der Probe oder den Reagentien auf anderen Wegen vorhanden ist, gezeigt. Dieses Hybridsuperaggregat kann verwendet werden, um die Empfindlichkeit des Assays durch Zugabe eines zweiten Superaggregats, das colloidales Gold und einen spezifischen Bindungspartner für das zweite Protein enthält, weiter zu erhöhen.
Nitrocellulosemembranen wurden mit dem monoclonalen Antikörper S4H9 (1mg/ml), der für das Fibrinabbauprodukt D-Dimer spezifisch ist, beschichtet, und die Nitrocellulose wurde in eine Testvorrichtung, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben. Präparate, enthaltend das D-Dimere in einem Konzentrationsbereich von 0-8 mg/l, aufgelöst in 0,1 mol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), enthaltend 50 mg/ml BSA, wurden aufgebracht (50 ul) und die Membran durchtreten gelassen. Die D-Dimermoleküle, die von dem immobilisierten Antikörper eingefangen wurden, wurden anschließend durch Aufbringen von 50 ul einer Lösung, enthaltend ein Superaggregat von 4 nm colloidalem Gold, S4H9 und Humanserumalbumin (HSA) sichtbar gemacht. Dieses Superaggregat wurde wie in Beispiel 1 mit einem 1:1 (Gew./Gew.)-Verhältnis zwischen S4H9 und HSA hergestellt. Die Membran wurde gewaschen, und die Signalstärke des colloidalen Goldes, das auf der Membran zurückgehalten wurde, wurde unter Verwendung eines Reflektometers gemessen. Ein zweiter superaggregierter Komplex aus colloidalem Gold und dem monoclonalen Antikörper 2D2 wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt. Dieses zweite Superaggregat wurde auf die Nitrocellulose aufgebracht, und das Aggregat wurde durch Bindungen zwischen dem HSA, das in dem ersten Superaggregat vorhanden ist, und dem Antikörper 2D2 in dem zweiten Aggregat immobilisiert. Die Membran wurde gewaschen, und das so erhaltene Signal wurde unter Verwendung eines Reflektometers gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß das nach der zweiten Stufe erhaltene Signal 4 mal so stark war, wie das nach der ersten Stufe erhaltene Signal.
Die Fig. 7 zeigt die Dosis-Antwort-Kurven, die mit zunehmenden Mengen des D-Dimeren in der Probe erhalten wurden.

Claims

1) Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, wobei ein markiertes Reagenz, umfassend ein Goldsol, das an eine Substanz mit der Fähigkeit, spezifisch an den Analyten oder einen spezifischen Bindungspartner dafür zu binden, gebunden ist, zur Immobilisierung in gebundener Form auf einer festen Phase veranlaßt wird, wodurch ein Hinweis auf das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe gegeben wird, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Reagenz einen superaggregierten Komplex aus der Substanz oder dem spezifischen Bindungspartner dafür und einem Goldsol, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, umfaßt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe in einem wässrigen Assaymedium mit (i) einem Analogon des Analyten oder einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten, welche auf dem festen Träger immobilisiert sind, und (ii) einem markierten Reagenz, umfassend einen superaggregierten Komplex nach Anspruch 1, in Kontakt gebracht wird, wobei eine Menge des markierten Reagenzes auf dem Träger immobilisiert wird, wodurch direkt oder indirekt eine Farbveränderung erzeugt wird, welche das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe anzeigt.

3) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 nm besitzen.

4) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin ein kompetitiver Assay durchgeführt wird.

5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin ein Sandwichassay durchgeführt wird.

6) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die feste Phase eine inerte Membran ist, die leicht Protein adsorbiert und die Poren, die den Durchtritt von Flüssigkeit erlauben, besitzt.

7) Verfahren nach Anspruch 1, worin der superaggregierte Komplex ein Hybridkomplex aus zwei oder mehreren Proteinen, einschließlich eines Enzyms mit der Fähigkeit, bei Exposition gegenüber einem Substrat dafür, eine charakteristische Reaktion zu erzeugen, ist.

8) Verfahren nach Anspruch 1, worin der superaggregierte Komplex ein Hybridkomplex aus zwei oder mehreren Proteinen ist, und eine Farbverstärkung durch Zugabe eines oder mehrerer weiterer superaggregierter Komplexe mit der Fähigkeit, an den ersten Hybridkomplex zu binden, erhalten wird.

9) Kit zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Testprobe, umfassend (a) eine feste Phase, auf der ein markiertes Reagenz zur Immobilisierung veranlaßt wird, wodurch ein Anzeichen für das Vorhandensein oder die Menge des Analyten in der Probe gegeben wird, und (b) ein markiertes Reagenz, dadurch gekennzeichnet, daß das markierte Reagenz einen superaggregierten Komplex aus einer Substanz, die spezifisch an den Analyten oder einen spezifischen Bindungspartner dafür bindet, und einem Goldsol, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen des Goldsols einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, umfaßt.

10) Kit nach Anspruch 9, worin der superaggregierte Komplex weiterhin ein Enzym mit der Fähigkeit, eine charakteristische Reaktion zu erzeugen, umfaßt, wobei das Kit weiterhin ein Substrat für dieses Enzym umfaßt.

11) Verfahren zur Herstellung eines superaggregierten Komplexes aus einem Protein und einem Goldsol, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, wobei man

(i) das Protein und das Goldsol bei einem pH-Wert, bei dem das Proteinmolekül mindestens zwei positiv geladene Gruppen besitzt, vermischt;

(ii) die so gebildeten makroskopischen Aggregate gewinnt;

(iii) die makroskopischen Aggregate in einem pH-neutralen Medium gegebenenfalls mit Ultraschallbehandlung resuspendiert, wodurch eine Suspension aus stabilen Superaggregierten Komplexen gebildet wird.

12) Verfahren nach Anspruch 11, worin der pH-Wert in Stufe (i) 1 bis 5 beträgt.

13) Superaggregierter Komplex aus einem Protein und einem Goldsol, worin mindestens 75 Gew.-% der Goldteilchen einen mittleren Durchmesser von weniger als 20 nm besitzen, erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 11 oder 12.