DE3136579C2

DE3136579C2 -

Info

Publication number: DE3136579C2
Application number: DE3136579A
Authority: DE
Inventors: William Corning N.Y. Us Hertl; Frank Burton Painted Post N.Y. Us Ward; Howard Hayyim Big Flats N.Y. Us Weetall
Original assignee: Amerlite Diagnostics Ltd
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Ltd
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-15
Publication date: 1993-02-18
Also published as: GB2085160B; FR2490826B1; FR2490826A1; JPS5786052A; DE3136579A1; GB2085160A; US4410633A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen immunologischen Analyse von freiem Thyroxim und von freiem 3, 5, 3′-Trÿodthyronin in einer den einen oder anderen dieser Stoffe enthaltenden Flüssigkeit, und zwar sowohl in freier als auch an Globulin und Präalbumin gebundener Form, nach Art einer Immunanalyse. Hierzu wird ein gekennzeichnetes Thyroxin oder 3, 5, 3′-Trÿodthyronin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat verwendet, welche mit dem in der Flüssigkeitsprobe vorhandenen, Thyroxin bindenden Globulin oder Präalbumin nicht wesentlich in Umsetzung bzw. Wechselwirkung treten.

Die Konzentrationsbestimmung freien Thyroxins in einer Flüssigkeit ist in vielen Fällen notwendig, so beispielsweise als Teil einer routinemäßigen hämatologischen Untersuchung von Blutserum oder Plasma in der Prophylaxie oder Behandlung zahlreicher Krankheiten und Störungen.

Thyroxin und 3, 5, 3′-Trÿodthyronin (auch kurz als Trÿodthyronin bezeichnet) sind Hormone der Schilddrüse mit tiefgreifendem Einfluß und den Metabolismus von Tier und Mensch. Trÿodthyronin zeigt stärkere Hormonwirkung, aber Thyroxin ist das Haupthormon des Kreislaufs. Die weitere Beschreibung an Hand von Thyroxin gilt auch für Trÿodthyronin.

Thyroxin wird in der Schilddrüse als Trÿodthyronin, ein Glycoprotein, gespeichert und wird durch Proteolyse frei. Im Blut wird Thyroxin weitgehend an Plasmaproteine gebunden, vorwiegend Thyroxin bindendes Globulin und Präalbumin. Eine kleine, begrenzte Menge ist frei, nicht gebunden und stellt das physiologisch aktive Thyroxin dar. Der Nachweis und die quantitative Analyse freien Thyroxins ist daher wesentlich für die Diagnose der Dysfunktion der Schilddrüse.

Ein Hauptproblem hierbei ist die geringe Thyroxinkonzentration im Humanserum. Der Normalbereich ist etwa 0,8-2,5 ng freies Thyroxin pro dl Serum (8-25 pg/ml), d. h. weniger als 1% des gesamten Thyroxingehalts im Serum. Die erforderliche Meßgenauigkeit liegt im Bereich von Trillionteilen (parts per Trillion).

Die Bestimmung erfolgte bisher meist in zeitraubender und arbeitsintensiver Weise durch Gleichgewichtsdialyse. Es sind zwei verschiedene Verfahren der Immunanalyse bekannt. Nach dem Zweirohr- oder Corning-Verfahren wird die Rate der Thyroxinumsetzung von den bindenden Proteinen zu den Thyroxinspezifischen Antikörpern gemessen. Diese weiter unten noch näher erläuterte Verfahren erfordert eine sorgfältige zeitliche Abstimmung der Antigenaufnahme durch die Antikörper in zweite getrennten Gefäßen. Das andere Verfahren verwendet nur ein Gefäß, in dem die Thyroxin-spezifischen Antikörper zusammen mit der Probe für eine genau bestimmte Zeitdauer inkubiert werden. Die Menge des vom Antikörper aufgenommenen Antigens steht zur ursprünglich vorhandenen freien Thyroxinmenge in Beziehung. Der Antikörper-Antigenkomplex wird von der Probe getrennt und mit radioaktiv gekennzeichnetem Thyroxin inkubiert, welches mit den nicht besetzten Bindestellen des Antikörpers eine Komplexbindung eingeht. Die von dem Komplex aufgenommene Radioaktivitätsmenge ist der Konzentration des in der Probe ursprünglich vorhandenen freien Thyroxins umgekehrt proportional.

Das erstgenannte Verfahren ist in der US-PS 40 46 870 näher beschrieben.

Aufgabe der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur raschen, empfindlichen und genauen quantitativen Analyse freien Thyroxins oder Trÿodthyronins, welche in freier und gebundener Form in einer Flüssigkeitsprobe vorliegen.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung in der Weise gelöst, daß die Probe mit einem gekennzeichneten Thyroxin-Meerrettich- Peroxidasekonjugat bzw. einem gekennzeichneten 3, 5, 3′-Trÿodthyronin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat, die mit dem in der Probe enthaltenen, thyroxinbindenden Globulin und Präalbumin nicht wesentlich in Umsetzung treten, sowie mit einem für Thyroxin bzw. 3, 5, 3′-Trÿodthyronin spezifischen, immobilisierten Antikörper gemischt, die Mischung inkubiert, die flüssige von der festen Phase getrennt und die Menge des gekennzeichneten Konjugats in beiden Phasen gemessen wird.

Weitere günstige Ausgestaltungen des Verfahrens der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß ein gekennzeichnetes Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat, welches mit dem ursprünglich vorhandenen thyroxinbindenden Globulin und Präalbumin nicht wesentlich in Umsetzung tritt, mit Erfolg in einer Immunanalyse zum des freien Thyroxins in der Flüssigkeitsprobe verwendet werden kann. Besonders geeignet ist das Konjugat für eine festphasige, enzymatische Immunanalyse, weil die Meerrettich-Peroxidase in dem Konjugat nach Komplexbildung mit immobilisiertem Antikörper ihre Aktivität im wesentlichen beibehält.

Hapten-Enzymkonjugate sind wohlbekannt, vgl. die US-PS 36 54 090, 37 91 932, 38 39 153, 38 50 752, 38 79 262, 40 16 043, 40 40 907 und Re. 26 129.

Die US-PS 38 39 153 beschreibt ein Verfahren der Immunanalyse mit Enzymen bei dem ein Hapten- (oder Antigen-) Enzymkonjugat und ein für das Hapten oder Antigen spezifischer Antikörper mit der zu untersuchenden Probe gemischt werden. Sodann wird ein unlöslicher Antikörper zugesetzt, welcher für den zuvor zugesetzten, lösbaren Antikörper spezifisch ist. Der entstehende unlösbar gemachte Antikörper-Antikörper-Hapten (oder Antigen)- Enzymkomplex wird dann von der Mischung getrennt und die Enzymaktivität beider getrennter Phasen wird bestimmt. Zu den Beispielen geeigneter Enzyme gehört auch Peroxidase, jedoch findet sich keine Lehre zur Bestimmung freien Thyroxins.

Die US-PS 38 50 752 beschreibt eine Immunanalyse zum Nachweis von Hapten, bei dem der zu untersuchenden Probe ein Hapten- Enzymkonjugat und ein für das Hapten spezifischer unlösbarer Antikörper zugesetzt werden. Der entstehende, unlösbar gemachte Antikörper-Hapten-Enzymkomplex wird dann von der Mischung getrennt und die Enzymaktivität beider Phasen bestimmt. Es findet sich hier aber ebenfalls eine Lehre zur Verwendung eines Thyroxin-Peroxidasekonjugats zur Bestimmung eines freien Haptens, insbesondere Thyroxins.

Die eine Verbesserung der Immunanalyse der US-PS 38 39 153 und 38 50 752 darstellende US-PS 38 79 262 bedingt eine andere Art der Kopplung von Hapten und Enzym von der zwischen dem Hapten und einem zur Erzeugung Hapten-spezifischer Antikörper in Tieren verwendeten immunogenen Stoff. Es fehlt eine Beschreibung eines Thyroxin-Peroxidasekonjugats zum Nachweis freien Thyroxins.

Die US-PS 40 40 907 betrifft Polyjodthyronin- oder Thyroxinkonjugate mit Enzymen, welche bei Verwendung in Immunanalysen eine erhebliche Änderung ihrer enzymatischen Aktivität erleiden.

Thyroxin-Peroxidasekonjugate werden von Schall u. a. in Clin. Chem., 24, 1801 (1978), Clin. Chem., 24, 1033 (1978) erwähnt. Zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Thyroxin in einem Serum wird eine Probe mit einer Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugatlösung, einem Hemmstoff (8-Anilin-1-Naphthalinsulfonsäure) und einem immobilisierten, für Thyroxin spezifischen Antikörper gemischt, inkubiert und zentrifugiert. Die feste Phase wird gewaschen und mit einer Substrat-Chromogenlösung versetzt. Hierauf wird die Absorption gemessen und der Gesamtgehalt an Thyroxin mit einer Standardkennlinie gemessen.

Nach Kleinhammer u. a., Clin. Chem., 24, 1033 (1978) waren erste Versuche zur Entwicklung einer anzymatischen Immunanalyse anormaler Thyroxin-bindender Globulinkonzentrationen (TBG) erfolglos, weil das Thyroxin--Meerrettich-Peroxidasekonjugat keine Bindung mit dem TBG einging. Es wurde einer Serumprobe eine bestimmte Thyroxinmenge im Überschuß zum ungebundenen TBG zugesetzt, um den nicht an TBG gebundenen Thyroxinüberschuß mit Hilfe von Thyroxin-Meerrettich- Peroxidase und mit einem Gefäßüberzug von Antikörpern spezifisch für Thyroxin zu messen. Nicht bestimmt wird freies Thyroxin. Anstelle des bevorzugten Thyroxinkonjugats konnte hierbei auch ein Trÿodthyronin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat verwendet werden, das ebenfalls keine Bindung mit dem TBG einging.

Weitere Verfahren der Immunanalyse zur Bestimmung des Gesamtgehalts an Thyroxin verwenden Malatdehydrogenase oder alkalische Phosphatase, siehe Finley und Williams, Ckin. Chem., 24, 165 (1978), Jaklitsch u. a., Clin. Chem., 21, 1011 (1975), Van Lente und Fink, Clin. Chem., 24, 387 (1978), Galen und Forman, Clin. Chem., 23, 119 (1977), und J-PS 77/10 80 017.

In den Zeichnungen zeigen:

Die Fig. 1 eine Standardkennlinie zum Nachweis freien Thyroxins mit auf partikelförmigem Träger immobilisierten Antikörpern;

die Fig. 2 und 3 als Schaubild die Bindungsaffinität des Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugats für Thyroxin bindendes Globulin bzw. PräalbumIn;

die Fig. 4 und 5 weitere Standardkennlinien zum Nachweis freien Thyroxins.

Im Folgenden wird ein Stoff als "immobilisiert" bezeichnet, wenn er in wäßriger Lösung im wesentlichen unlöslich ist.

Ein "Hapten-Meerrettich-Peroxidasekonjugat" und Abwandlungen desselben umfassen hier das Meerrettich-Peroxidasekonjugat sowohl von Thyroxin als auch von Trÿodthyronin.

In jedem Falle muß, gleichgültig welches Kennzeichen verwendet wird, das Hapten an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt werden. Ist das Kennzeichen nicht Meerrettich-Peroxidase als solche, so können die Hapten und die Meerrettich-Peroxidaseeinheiten einzeln oder beide, vor oder nach der Herstellung des Konjugats gekennzeichnet werden. Zur Herstellung des Konjugats werden nach bekannten Methoden Hapten an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt, und zuvor oder danach und wahlweise in das Konjugat ein nicht aus Meerrettich-Peroxidase bestehendes Kennzeichen eingeführt.

Zur Kopplung von Hapten mit Enzymen sei auf die US-PS 38 39 153, 38 50 752, 38 79 262 und 40 40 907 hingewiesen.

Die Kennzeichen können Enzyme oder nichtenzymatische Stoffe sein. Zu den enzymatischen Kennzeichen ist auch Meerrettich-Peroxidase zu rechnen, die ihre Enzymaktivität auch nach Kopplung an Hapten weitgehend beibehält. Andere Enzyme können ihrer Wirkung wegen von Interesse sein und werden nach bekannter Methode an das Hapten gekoppelt.

Als Nichtenzyme kommen alle bekannten Kennzeichen in Frage. Beispielsweise kann das Konjugat radioaktiv, chemisch luminescent, fluorescent oder in anderer bekannter Weise gekennzeichnet werden. Bei radioaktiver Kennzeichnung hängt das Kennzeichnungsverfahren weitgehend von dem verwendeten Isotop, z. B. H³, C¹⁴, S³⁵, I¹²⁵, I¹³¹ (besonders günstig die letzteren beiden) ab.

Beispiele fluorescenter Kennzeichen sind Fluoresceinisothiocyanat, Tetraäthylrhodamin. Fluorescamin und dergleichen. Auch hier hängt das Verfahren weitgehend von der Struktur des Kennzeichens ab. Meist kommt eine kovalente Bindung, oder eine Kopplung über ein Kopplungsmittel wie z. B. ein Polypeptid in Betracht.

Ähnliches gilt für die chemisch luminescenten Kennzeichen, wie z. B. Luminol, Luciferin, Lucigenin, Acridinin, Pyrogallol, Indol, Riboflavin, Lophin, Methylen blau, Siloxen und dergleichen.

In jedem Fall muß das Kennzeichen funktionstüchtig bleiben, ohne die Bindefähigkeit des Haptens an den Antihapten-Antikörper oder die mangelnde Wechselwirkung mit dem Konjugat zu ändern.

Die Komplexbildung des gekennzeichneten Hapten-Meerrettich- Peroxidasekonjugats mit dem für das Hapten spezifischen immobilisierten Antikörper erfolgt in bekannter Weise, wozu beide nur in wäßrigem Medium gemischt zu werden brauchen. Die für das Hapten spezifischen Antikörper werden in bekannter Weise hergestellt. Meist braucht das Serum nicht weiter verarbeitet zu werden, um gereinigte Antikörper zu erhalten. Der immobilisierte Antikörper kann unmittelbar aus dem Antiserum dargestellt werden. Dabei fallen auch, für das Verfahren der Erfindung nicht wesentliche immobilisierte Proteine, z. B. Globuline, an, eine besondere Reinheit ist also nicht Bedingung, wenn auch die Darstellung aus gereinigtem Antiserum einfacher ist.

Auch die Immobilisierung der Antikörper kann in bekannter Weise erfolgen. Meist ist weder die Art des Trägers noch das Immobilisierungsverfahren kritisch, solange schädliche Nebenwirkungen vermieden werden. Die Träger können organisch, anorganisch, porös, unporös, und von beliebiger Form sein. Möglich sind partikelförmige (feinpulverförmige bis zu grobkörnig), oder zusammenhängende Körper, Folien, Tabletten, Zylinder, Würfel oder komplexere Formen. Besonders häufig verwendet werden Partikel, oder Körper wie Reagenzgläser.

Beispiele geeigneter organischer Träger sind Polyester, wie Polyäthylenterephthalat, Polyamide, wie Nylon 6 oder 6,6, Polyacrylate wie Polymethacrylat, Polyacrylamide, Polyacryl- oder methacrylsäure, Polygalactursäure, Polyaspartinsäure, Äthylenmaleinanhydrid- Copolymere, Polyalefine, wie Polyäthylen-propylen, -buten, -butadiene, -polystyrole, -polyaminostyrole, Polyvinylchlorid, Polyvinylalcohol, Polyvinylidenchlorid, Cellulose, Agarosegele, Dextrangele, Polysaccharide, Polypeptide, Collagen, u. a. m.

Anorganische Träger lassen sich in kieselsäurehaltige und kieselsäurefreie Metalloxide einteilen, wie Glas, Kieselsäure, Wollastonit, Bentonit, Cordierit u. s . f., bzw. Aluminiumoxid, Spinell, Apatit, Nickeloxid, Titanoxid, Zirkoniumoxid u. a. m.

Bevorzugt werden kieselsäurehaltige Träger, besonders Kieselsäure und Glas. Günstig wegen größerer Beschickung pro Masseneinheit sind poröse Träger. Gegebenenfalls kann der Träger durch Ätzen, chemische Behandlung u. s. w. bearbeitet werden.

Besteht der Träger aus einem Reagenzrohr, so wird hierzu bevorzugt Kunststoff, z. B. Polyäthylen oder -propylen verwendet. Der Antikörper kann dann einen Überzug auf einem Teil, z. B. dem unteren Teil, der Innenfläche des Reagenzglases bilden.

Der Antikörper kann in bekannter Weise, z. B. durch Adsorption oder chemische Kopplung, immobilisiert werden, z. B. durch Behandlung mit o-Dianisidin nach US-PS 39 83 000, mit polymerem Isocyanat, US-PS 35 19 538, 36 52 761, 36 69 841 und dergleichen, vgl. auch US-PS 39 30 951 und 39 33 589, sowie US-PS 40 34 073, Weibel u. a., Biochem. Biophys. Res. Comm., 44, 347 (1971), und Weetall, Science, 166, 615 (1969).

Die Immunanalysen mit Enzym und ohne Enzym sind einander sehr ähnlich. Der Unterschied besteht hauptsächlich im Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Konjugats, je nach dem verwendeten Kennzeichen. Das Verfahren wird daher einheitlich beschrieben, wobei auf Konjugat ohne Rücksicht auf die Art des Kennzeichens Bezug genommen wird.

Als erster Schritt wird die Probe mit einem Konjugat, das mit dem vorhandenen, Thyroxin bindenden Globulin und Präalbumin nicht in Wechselwirkung tritt, und für das Hapten spezifischen Antikörper zusammengebracht.

Die Konjugatmenge ist an sich nicht kritisch, jedoch wird zweckmäßig eine molar etwa dem freien Hapten in der Probe äquivalente Menge verwendet.

Auch die Menge des immobilisierten Antikörpers ist nicht kritisch, solange nicht zuviel gebundenes Hapten von den bindenden Proteinen abgezogen wird. Die Menge muß zur Bindung einer freien Haptenmenge ausreichen, welche eine genaue, feinfühlige Messung ergibt. Sie hängt zumindest teilweise vom Titer des Antiserums und von dem Ausmaß der Antikörperimmobilisierung ab. Als freies Hapten wird nicht gebundenes, insbesondere nicht an die ursprünglich vorhandenen Proteine wie Thyroxin bindendes Globulin auch Präalbumin, mit der Fähigkeit zur Bindung oder Komplexbindung an Antihapten-Antikörper bezeichnet. Es schließt ursprünglich vorhandenes und später zugesetztes freies Hapten ein. Das "gekennzeichnete Hapten" ist demnach das als Konjugat anwesende Hapten.

Als zweiter Schritt des Verfahrens wird die erhaltene Mischung inkubiert, vorzugsweise für eine sich dem Gleichgewichtszustand nähernde Bindung ausreichende Zeitdauer. Meist erfolgt sie bei einer zwischen Zimmertemperatur und 40°C liegenden Temperatur. Die Inkubationsdauer ist an sich nicht kritisch. Meist ist eine Stunde bei 37°C genügend, aber längere oder kürzere Zeiten sind möglich.

Als dritter Verfahrensschritt wird die feste Phase von der Flüssigkeit getrennt. Das kann in beliebiger, bekannter Weise geschehen, z. B. durch Filtrieren, Zentrifugieren, und dergl.. Bei Verwendung eines Reagenzglases als Träger kann die flüssige Phase einfach abgegossen oder abgesaugt werden.

Die feste Phase besteht aus immobilisiertem Antikörper oder Antikörper-Haptenkomplex. Der Komplex enthält ursprünglich in der Probe vorhandenes Hapten und Hapten als Konjugat, die um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen der Antikörper miteinander in Wettbewerb treten. Werden die Mengen an Konjugat und immobilisierten Antikörpern konstant gehalten, so ist die als Konjugat anwesende Haptenmenge dem ursprünglich vorhandenen freien Hapten umgekehrt proportional.

Als vierter Schritt wird die Konjugatmenge einer der beiden Phasen, vorzugsweise der festen Phase, gemessen. Das Meßverfahren richtet sich nach der Art des Konjugats. Hierzu gehört die Korrelation der auf den immobilisierten Antikörpern vorhandenen Konjugatmengen mit einer Standardkennlinie, welche die Konjugatmenge mit der ursprünglich vorhandenen freien Haptenmenge in Beziehung setzt. Sie wird in bekannter Weise erstellt.

Der weiteren Erläuterung ohne Beschränkung dienen die folgenden Beispiele.

Beispiel 1 Nachweis freien Thyroxins in Humanseren durch enzymatische Immunprüfung mit Antikörpern auf partikelförmigem Träger

Es wurden Standardansätze freien Thyroxins in Seren enthaltend 0,5, 1, 2, 4 und 6 ng freies Thyroxin pro dl Serum hergestellt. Durch Immunisierung weißer Neuseeland-Kaninchen wurden Antithyroxin-Antikörper bereitet. Das enthaltene Antiserum hatte einen Titrierwert von 1 : 50 000.

Als Träger für die Immobilisierung der Antikörper wurde das Arylaminderivat silanisierten Glases geregelter Porengröße verwendet, dessen durchschnittliche Partikelgröße 1 µm und durchschnittliche Porenweite 550 Å betrug. Das immobilisierte Antiserum (IMA) wurde nach der Methode von Weetall und Filbert, vgl. Methods in Enzymology, herausgegeben von Jakoby und Wilchek, Bd. 34B, 1974, S. 59-72, mit einem Verhältnis von 0,5 g Glas pro ml Antiserum hergestellt. Hierzu wurde das Glas in 5% Salpetersäure gereinigt, gewaschen, und mit 10%iger Lösung von Gamma-Aminopropaltriäthoxysilan in destilliertem Wasser, pH 3,45, behandelt. Das silanisierte Glas wurde mit p-Nitrobenzoylchlorid in Chloroform, enthaltend 10% (v/v) Triäthylamin als Wasserstoffchlorid-Mitnehmer umgesetzt. Durch Behandlung des p-Nitrobenzoylaminoalkyl-Glasderivats mit 10%iger wäßriger Natriumdithionitlösung wurde die Nitrogruppe reduziert. Das Glasderivat wurde mit salpetriger Säure, - erzeugt in situ aus Salzsäure und Natriumnitrit - diazotisiert, das Produkt gewaschen und bei pH 8-9 dem Antiserum zugesetzt. Die erhaltene IMA wurde in einem Puffer erneut suspendiert. Diese IMA-Suspension enthielt 50 mg Glas pro ml und 50 µg IMA pro ml.

Das Konjugat bestand aus Thyroxin-Meerrettich-Peroxidase. Als Puffer diente 0,03 M Natriumphosphat, pH 7,4, enthaltend 0,1% Rinderserumeiweiß. Die Zusammensetzung der Enzymsubstratlösung war 0,033 M Zitronensäure, 0,066 M Natriumphosphat, 0,0065 M o-Phenylendiamindihydrochlorid. 0,0021 M Harnstoffsuperoxid, und der pH des Puffers betrug 0,5±0,1. Zur Unterbrechung der Farbentwicklung wurde 0,1% Natriumazid enthaltende 1 M Zitronensäure verwendet. Die IMA-Waschlösung enthielt 0,05% TWEEN 80 (Warenzeichen der Fa. Fisher Scientific Co., Pittsburgh, USA) in 0,85%iger wäßriger Natriumchloridlösung. Die Humanseren entstammten gynäkologischer Praxis und z. T. wurden sie von Metpath bezogen. Alle Proben wurden zunächst in bekannter Weise (z. B. durch Gleichgewichtsanalysen und Radioimmunprüfung) auf Gehalt an freiem und gesamten Thyroxin untersucht.

Je 20 µl der Thyroxin-Standardansätze in getrennten 12 × 75 mm messenden Reagenzgläsern aus Kunststoff wurden 0,1 mm Konjugat (etwa 200 pg. Thyroxin nach Radioimmunanalyse), und der erhaltenen Mischung 1 ml (etwa 50 µg) IMA zugesetzt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert, dann zentrifugiert. Die feste Phase wurde zweimal unter Zusatz von je 2 ml Waschlösung, Vortexbehandlung und 5 Minuten Zentrifugieren mit 3000 UpMin. gewaschen. Dem gewaschenen Feststoff wurden nach Zeitplan und unter Mischen 2 ml Enzymsubstratlösung zugesetzt. Nach genau 15 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur wurde die Farbentwicklung durch Zusatz von 1 ml Hemmlösung beendet. Für alle Lösungen wurde photometrisch die optische Dichte bei 455 nm bestimmt, und die Meßwerte als optische Dichte - freie Thyroxinkonzentration in ng/dl abgetragen. Wie die Fig. 1 zeigt sich die Analyse im Bereich von 0,5-6 ng/dl für kleine Änderungen der freien Thyroxinkonzentration sehr empfindlich.

Die Erstellung dieser Meßwerte für die Standardkennlinie wurde wiederholt, dabei aber der Thyroxinstandard durch Humanserum (doppelt) ersetzt. Die in jedem Falle erhaltene optische Dichte wurde mit der Standardkurve verglichen, um die freie Thyroxinkonzentration zu erhalten. Die erhaltenen Werte sind, zusammen mit den zuvor gemessenen freien Thyroxinwerten in der Tabelle I aufgezeichnet.

Tabelle I

Freie Thyroxinwerte in Humanseren (ng/dl)

Ein Maßstab für die Stärke der Bindung eines Antigens oder Haptens an einen Antikörper liefert der so definierte Wert der Gleichgewichts- oder Bindungskonstante:

worin K die Gleichgewichts- oder Bindungskonstante, (Ag/Ab) die Konzentration des Antigens- oder Hapten-Antikörper-Komplexes, (Ag) die Konzentration freien oder ungebundenen Antigens oder Haptens, und (Ab) die Konzentration des freien oder ungebundenen Antikörpers bezeichnet. Je größer der K-Wert, desto stärker ist die Antigenbindung an den Antikörper. Sind das gebundene und freie Antigen trennbar und die gebundenen Mengen meßbar, so läßt sich der K-Wert mit einem Schaubild nach Scatchard bestimmen, vgl. hierzu Day, Advanced Immunochemistry, 1972, S. 118ff. Diese Methode ist für festphasige Immunanalysen geeignet, weil das gebundene Antigen leicht von dem ungebundenen oder freien Antigen getrennt werden kann.

Für das Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat wurde der K-Wert folgendermaßen bestimmt. Eine Konjugatlösung wurde durch übliche Radioimmunanalyse auf den Gesamtgehalt an Thyroxin zur Konzentrationsbestimmung des Thyroxin-Meerrettich- Peroxidasekonjugats untersucht. Einem Abschnitt der Konjugatlösung wurde eine Menge des oben verwendeten, immobilisierten Antikörpers zugesetzt und die erhaltene Mischung inkubiert. Die feste Phase wurde abzentrifugiert und der Gesamtgehalt an Thyroxin der flüssigen Phase bestimmt. Der Konzentrationsunterschied stellt die Menge des durch den immobilisierten Antikörper komplexgebundenen Konjugats dar. Der festphasige immobilisierte Antikörper wurde nach dem vorstehend beschriebenen Kolorimetrieverfahren untersucht, um die auf der bekannten Menge des an den immobilisierten Antikörper gebundenen Konjugats beruhende optische Dichte zu bestimmen, so daß die gebundene Konjugatsmenge als optische Dichte ausgedrückt werden kann. Verschiedene Verdünnungen dieser Lösung wurden mehreren, gleiche IMA Menge enthaltenden Reagenzgläsern zugesetzt. Die erhaltenen Mischungen wurden 1 Stunde lang inkubiert und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und die Menge des an IMA gebundenen bzw. komplexgebundenen Konjugats nach dem bereits beschriebenen kolorimetrischen Verfahren bestimmt. Für jede Lösung wurde aus der gebundenen Menge und der bekannten zugesetzten Menge der Anteil des an IMA gebundenen Konjugats berechnet. Die Tabelle II enthält die für das Schaubild nach Scatchard benötigten Meßwerte.

Tabelle II

Die Werte der zweiten Spalte wurden auf der Ordinate, die der dritten Spalte auf der Abszisse abgetragen und ergeben eine lineare Kennlinie mit der Steigung K. Die Konstanten der Bindung und des nicht konjugierten Thyroxins (nicht gezeigt) waren:

Die unterschiedlichen K-Werte sind experimentell nicht erheblich. Die Angaben zeigen deutlich eine Affinität des Konjugats für spezifische immobilisierte Antikörper, selbst in Gegenwart Thyroxin bindendes Globulin enthaltende Seren, welche sich nicht wesentlich von der unkonjugierten Thyroxins für den gleichen Antikörper unterscheidet, wobei freies Thyroxin durch ein Hemmittel an der Bindung mit Thyroxin-bindendem Globulin gehindert wurde.

Die obigen K-Werte zeigen die fehlende Wechselwirkung des Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugats, wie auch das folgende Beispiel, welches gleichzeitig die TBG Bindungsmerkmale des Konjugats mit dem freien oder unkonjugierten Thyroxins zeigt. Eine gereinigte TBG-Lösung wurde doppelt in Kunststoffreagenzgläsern der Größe 12×75 mm in zwei Serien von je sechs Gläsern A und B zu je 100 µl Lösung verdünnt. Die sechs Gläser enthielten 10 µg, 1 µg, 100 ng, 10 ng, 1 ng und 0 TBG. Jedem Glas wurden 1 ml Puffer enthaltend 200 ng IMA, der Serie A, außerdem 100 µl mit ¹²⁵I gekennzeichnetes Thyroxin und der Serie B noch 100 µl Konjugat zugesetzt. Alle Gläser wurden bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert, zentrifugiert und die feste Phase wie oben zweimal gewaschen. Die Menge des in Serie A in der festen Phase enthaltenen Thyroxins wurde durch Messen der Gamma-Strahlung bestimmt, und die Angaben als Zählwerte pro Minute aufgezeichnet. Anhand einer Standardkennlinie wurden die Angaben zum gebundenen Thyroxinanteil in jedem Glas umgerechnet. Die Menge des in der festen Phase in Serie B enthaltenen Thyroxins wurde wie beschrieben kolorometrisch bestimmt. Anhand einer Standardkennlinie wurden die Angaben in den gebundenen Thyroxinanteil für jedes Glas umgerechnet.

Diese beiden Angabengruppen ergeben nach Normalisierung als B/Bmax (B=gebundenes Thyroxin) und Abtragung als Funktion der TBG Konzentration (Fig. 2) eine sehr geringe Wechselwirkung zwischen Konjugat und TBG im Vergleich zu unkonjugiertem Thyroxin.

Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, wobei aber die Antikörpersuspension aus 400 µm IMA in 0,5 ml Puffer bestand, die Gläser der Serie A weggelassen wurden, und statt TBG jedem Glas Thyroxin bindendes Präalbumin (TBPA) in Mengen von 1,28 mg/ml, 320 mg/ml, 160 µg/ml, 80 µg/ml und 0 µg/ml pro 25 ml TBPA-Lösung zugesetzt wurden, so daß die Gläser jeweils 32 mg, 16 mg, 8 mg, 4 mg, 2 mg und 0 mg TBPA enthielten.

Die Angaben zeigten nach Normalisierung und Abtragung als Funktion der TBPA Konzentration praktisch keine Wechselwirkung zwischen Konjugat und TBPA (Fig. 3).

Beispiel 2 Bestimmung freien Thyroxins in Humanseren durch Enzym-Immunanalyse mit Antikörpern, immobilisiert in Kunststoffreagenzgläsern

Die Immunanalyse nach Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch der auf partikelförmigem Träger immobilisierte Antikörper durch mit Anti-Thyroxin-Antikörpern beschichtete Kunststoffröhren ersetzt.

Dies erforderte das Abgießen der überstehenden flüssigen Phase, anstatt Entfernung durch Zentrifugieren.

Die Standardkennlinie wurde wie zuvor durch Abtragen der optischen Dichte und der freien Thyroxinkonzentration in ng/dl erstellt. Eine typische Standardkurve zeigt die Fig. 4.

Die Tabelle III verzeichnet die Analyse der Humanseren und die freien Thyroxinwerte.

Tabelle III

Beispiel 3

Nach Beispiel 1 wurde die Standardkennlinie erstellt, dabei aber das Thyroxin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat durch ein durch Perjodatoxidierung des Enzyms und Umsetzung mit ¹²⁵I-gekennzeichnetem Thyroxin (nach Nakane und Kawaoi, J. Histo-chem. Cytochem., 22, 1084 (1974) hergestelltes ¹²⁵I-Thyroxin- Meerrettich-Peroxidasekonjugat ersetzt. (Aktivität: der Peroxidase 1058 I. U./mg, des gekennzeichneten Thyroxins 600 µCi/µg.)

Die Amingruppen des Enzyms wurden durch Umsetzen von 10 mg Meerrettich-Peroxidase mit 1 mg Fluorescinisothiocyanat in 2 ml 0,3 M Natriumbicarbonatlösung, pH 8,1 bei Zimmertemperatur während 1 Stunde blockiert. Durch Natriumperjodat wurde die Konzentration auf 0,01 M eingestellt, und bei Zimmertemperatur 30 Minuten weiter umgesetzt. Dann wurden 1 ml 0,16 M Äthylenglykol in destilliertem Wasser zugesetzt. Die Umsetzungsmischung wurde mit 3 4 l Wechseln 0,01 M wäßriger Natriumkarbonatlösung, pH 9,5 dialysiert. Eine Lösung von 50 ng ¹²⁵I-Thyroxin in 1 ml 0,3 M Natriumkarbonatlösung, pH 8,1, wurde der dialysierten Mischung zugesetzt und die anfallende Lösung bei Zimmertemperatur 90 Minuten lang sanft gerührt. Sodann wurden 5 mg festes Natriumborhydrid zugesetzt und über Nacht bei 4°C weiter gerührt. Die so bereitete ¹²⁵I-Thyroxin-Meerrettich-Peroxidase wurde durch Kolonnenchromatographie isoliert und bei 4°C gelagert.

Ein Abschnitt des radioaktiv gekennzeichneten Konjugats (50 µl) einer Radioaktivität von 20 000 CPM wurde wie im Beispiel 1 mit je 20 µl Thyroxinstandardlösung gemischt, aber statt 30 Minuten 1 Stunde lang inkubiert. Wie zuvor die feste Phase zweimal gewaschen. Die Radioaktivität der festen Phase wurde während 1 Minute gezählt, und die Angaben als Funktion der freien Thyroxinkonzentration in µg/dl zur Erstellung einer Standardkennlinie abgetragen (Fig. 5).

Weitere Untersuchungen mit der Immunanalyse nach Beispiel 1 zeigen die erwartete Zeit- und Temperaturabhängigkeit der Standardkennlinie. Wird die komplexbildende Inkubation bei 37°C durchgeführt, so wird das Gleichgewicht nach etwa 1 Stunde, was bei Zimmertemperatur nach 90 Minuten noch nicht der Fall war.

Weitere Untersuchungen zeigten eine gute Korrelation (r=0,91) der Immunanalyse nach Beispiel 1 mit der Immunanalyse nach US-PS 40 46 870 bei Durchführung mit 54 Serenproben und einem linear-regressiven Rechenprogramm.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen immunologischen Analyse freien Thyroxins oder freien 3,5,3′-Trÿodthyroxins in einer dieses oder jenes oder diese sowohl frei als auch an Globulin und Präalbumin gebunden enthaltenen Flüssigkeitsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem gekennzeichneten Thyroxin-Meerrettich- Peroxidasekonjugat bzw. einem gekennzeichneten 3,5,3′- Trÿodthyronin-Meerrettich-Peroxidasekonjugat, die mit dem in der Probe enthaltenen, thyroxinbindenden Globulin und Präalbumin nicht wesentlich in Umsetzung treten sowie mit einem für Thyroxin bzw. 3,5,3′-Trÿodthyronin spezifischen, immobilisierten Antikörper gemischt, die Mischung inkubiert, die flüssige von der festen Phase getrennt und die Menge des gekennzeichneten Konjugats in beiden Phasen gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat radioaktiv gekennzeichnet ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat mit radioaktivem Jod, insbesondere I¹²⁵, gekennzeichnet ist.

4. Verfahren nach Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper auf einem anorganischen Träger immobilisiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem feinteiligen, partikelförmigen und vorzugsweise kieselsäurehaltigen Träger, insbesondere Glas, besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein dreidimensionaler Körper ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Reagenzglas ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenzglas aus Kunststoff besteht.

9. Verfahren nach Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper als Überzug auf der unteren Innenwand des Reagenzglases vorgesehen ist.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat fluorescent oder chemisch-luminescent oder enzymatisch gekennzeichnet ist.