DE69127618T2

DE69127618T2 - Verwendung eines Wirkstoffs zur Inhibierung von Tyrosinase

Info

Publication number: DE69127618T2
Application number: DE1991627618
Authority: DE
Inventors: Susumu Kobayashi; Hiroshi Miyakawa; Seiichi Shimamura; Mamoru Tomita
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1991-07-10
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2011-07-11
Also published as: DE69127618D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verwendung von enzymatischen Hydrolysaten von Milchproteinen. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Mittels zur Tyrosinase-Hemmung, das enzymatische Hydrolysate von Milchproteinen als wirksames Material für die Tyrosinase-Hemmung enthält.

Ausgangssituation

Tyrosinase ist als ein Enzym bekannt, das als ein Oxidationskatalysator für Tyrosin, andere einwertige Phenole oder entsprechende zweiwertige Orthophenole mit molekularem Sauerstoff wirken kann und das in Pflanzen weit verbreitet ist, wie beispielsweise Pilzen, Kartoffeln, Äpfeln sowie in tierischen Geweben. Ebenfalls ist bekannt, das Tyrosinase im Zusammenhang steht mit dem pHänomen des Dunkelwerdens an einer beschädigten Stelle von Pflanzengewebe und steht ebenfalls im Zusammenhang mit der Erzeugung von Melanin- Pigment in verschiedenen tierischen Geweben, speziell in epidermen Zellen (Editorial Committee of Encyclopedia Chimica, Encyclopedia Chimica, Bd. 5, S.976, Kyohritsu Shuppan; 1960).
Ebenfalls ist bekannt, daß die Pigmentierung von Melanin in epidermen Zellen oder Schleimhäuten der Addison'schen Krankheit die Folge einer Abnahme der Sekretion adrenaler Cortex-Hormone ist, die Melanotropin antagoni sieren, das wiederum die Tyrosinase-Aktivität fördert (Editorial Committee of Encyclopedia chimica, Encyclopedia Chimica, Bd. 1, S. 65, Kyohritsu Shuppan; 1960).
Daeeber hinaus sagt man, daß Tyrosinase ebenfalls im Zusammenhang mit dem Abbau des Frischezustands von Nahrungsmitteln steht.
Es wurde daher mit Nachdruck angestrebt, auf den technischen Gebieten der Pharmazeutik, der Kosmetik und der Lebensmittel Mittel für die Tyrosinase-Hemmung und zur Verhinderung und Therapie von Symptomen zu entwickeln, die sich aus unerwünschten Wirkungen der Aktivität der Tyrosinase ergeben. Speziell auf dem Gebiet der kosmetischen Industrie wurde mit Nachdruck nach Kosmetika oder Medikamenten für die äußerliche Anwendung zur wirksamen Tyrosinase-Hemmung gesucht und viele Produkte erfolgreich entwickelt, die Mittel zur Tyrosinase-Hemmung enthalten. Für die Tyrosinase- Hemmung sind zahlreiche Mittel bekannt, beispielsweise Cyctein, Glutathion und Vitamin C (Yutaka Mishima et al., "Fundamental Dennatology", S. 258, Asakiira Shoten; 1973), Kojisäure (Nikkei Sangyo News Paper, 24. Mai 1988), Arbutin (Kenichi Tomita, vorläufige Veröffentlichung für das 20. F.J. Seeinar, S. 21, Fragrance Journal Company, 14. März 1990), Produkte von Mikroorganismen, die zur Gattung Trichoderma gehören (Offenlegungsschrift JP-A-2(1990)-145189).
In der Offenlegungsschrift JP-A-58( 1983)-17763 wird die Nutzung alkalischer Hydrolysate von Seidenproteinen in Kosmetika als ein Mittel für die Tyrosinase-Hemmung offenbart.
Konventionelle Mittel zur Tyrosinase-Hemmung haben jedoch mehr oder weniger die Nachteile, daß es sich bei ihnen um unstabile Produkte handelt, daß sie eine übermäßige potentielle Funktion in bezug auf Melanozyten haben, die Melanin-Pigment erzeugen, und daß sie infolge der Schwierigkeit zur Erlangung ihrer Ausgangsmaterialien zu kostspielig sind und sie als Kosmetika oder Medikamente für die äußere Anwendung vom Standpunkt der Sicherheit, Konservierungsmöglichkeit, Zuverlässigkeit, Wirtschaftlichkeit usw. nicht verwendbar sind.
Andererseits wurden Milchproteine und ihre Hydrolysate in kosmetischen Produkten für verschiedene Aufgaben eingesetzt, wie beispielsweise Feuchthalten, Filmbilden (Offenlegungsschrift JP-A-60(1985)-258102, JP-A-62(1987)-185100, JP-A-1 (1989)- 269499), sowie in den Produkten der pharmazeutischen Industrie und Lebensmittelindustrie für die Aufgaben der Verbesserung der Bekömmlichkeit und Absorbierbarkeit, die Verbesserung der Nährwirkung und die Verhinderung oder Behandlung von Allergie.
Neuerlich wurde berichtet, daß in Milchprotein-Hydrolysaten enthaltende Peptide physiologische Eigenschaften besitzen, beispielsweise die Calcium-Absorption-fördernde Eigenschaft von β-Caseinphosphorpeptid und die Proliferationfördernde Eigenschaft von Bifidobakterien von K-Casein-Glykomakropeptid (Shokuhin Kogyo, Bd. 33, Nr.1, S.31, 1990).
Die WO-A-8 604 217 (K. GAURI) lehrt ein Verfahren zur Erzeugung eines Milchprotein-Hydrolysats mit einer analgetischen Wirkung, einer antiphlogistischen Wirkung, einer Antimutationswirkung und einer Antiglaukomwirkung. Die FR-A- 2 446 634 (SOCIETE D'ASSISTANCE POUR PRODUITS NESTLE S.A.) offenbart eine Zusammensetzung mit enzymatischen Hydrolysaten von Lactoalbumin, die über eine Wirkung zur Behandlung kutaner Nekrose verfügt, eine Wirkung auf die Gefäßwanddurchlässigkeit und eine Wirkung zur Erhöhung der Reißfestigkeit von Narbengewebe. Die EP-A-0 170 550 veröffentlicht ein Hydrolysat von Rindercasein, das über eine immunstimulierende Eigenschaft verfügt. Der "Merck-Index" (11. Ausgabe, 1989) offenbart, daß Caseinaminosäure, bei der es sich um ein Casein-Hydrolysat handelt, in mikrobiellen Assays verwendet wird sowie zur Herstellung von mikrobiologischen Medien.
Es wurde daher mit Nachdruck nach der Anwendung von Milchprotein-Hydrolysaten in funktionellen Lebensmitteln und Medikamenten geforscht, es war jedoch nicht bekannt, daß in Milchprotein-Hydrolysaten enthaltende Peptide über eine Wirkung der Tyrosinase-Hemmung verfügen.
Beispielsweise wird im Journal of Food Science, Bd. 50, Nr. 1, 1985, S. 111.. .115, geschlußfolgert, daß Casein-Hydrolysat und Rinderserumalbumin nicht die Aktivität von o-Dihydroxyphenolase hemmt, obgleich beobachtet wurde, daß ein hydrolysierter Casein-Typ die Dopachrom-Bildung durch Pilz-Tyrosinase für etwa 30 Minuten verzögert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben im Zusammenhang mit einem Mittel zur Tyrosinase-Hemmung Forschungsarbeiten ausgeführt, bei dem keines der in konventionellen Mitteln zur Tyrosinase-Hemmung festzustellenden Mängeln vorhanden sind und das für Nahrungsmittel und Medikamente verwendbar ist und stabil und sicher bei seiner Verwendung in derartigen Produkten ist, wobei überraschenderweise gefunden wurde, daß enzymatische Hydrolysate von Milchproteinen über eine Aktivität der Tyrosinase-Hemmung verfügen. Die vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entdeckung.
Es muß festgestellt werden, daß einige der Erfinder der vorliegenden Erfindung und auch andere im Zusammenhang mit einem Mittel zur Tyrosinase-Hemmung Erfindungen gemacht haben, welches aus Lactoferrin oder seinen Hydrolysaten besteht oder diese enthält, und es wurden vom Rechtschutzerwerber der vorliegenden Erfindung Anmeldungen für ein Patent in Japan angemeldet (JP-A-2(1990)-169636 und 2(1990)-1696537). Die erfindungsgemäßen Substanzen der vorliegenden Erfindung sind daher die Hydrolysate von Milchprotein, auschließend Lactoferrin, wobei jedoch bei der eigentlichen Ausführung der vorliegenden Erfindung ein Ausschluß von Lactoferrin aus dem Milchprotein als Ausgangsmaterial nicht erforderlich ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung von Hydrolysaten von Milchproteinen, ausschließend Lactoferrin, die als ein Mittel in Verfahren zur Tyrosinase- Hemmung entsprechend der Beschreibung in den hierin beigefügten Ansprüchen verwendbar ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Mit Ausnahme von Lactoferrin können alle auf dem Markt vertriebenen Milchproteine, wie beispielsweise Casein oder seine Fraktionen (z.B. α-Casein, β-Casein und K-Casein) und Molkenprotein oder seine Fraktionen (z.B. alpha-Lactalbumin, beta-Lactoglobulin) und eine Mischung davon (nachfolgend bezeichnet als Milchproteine) als Ausgangsmaterial für die Hydrolysate verwendet werden. Wie vorstehend bereits ausgeführt, ist die Aktivität der Tyrosinase-Hemmung von Lactoferrin und seinen Hydrolysaten bekannt. Der Ausschluß von Lactoferrin, das in den Milchproteinen enthalten ist, ist nicht erforderlich, wobei jedoch die Einbeziehung von Lactoferrin in die Milchproteine als Ausgangsmaterial der vorliegenden Erfindung nicht entscheidend ist. Sie können in Form einer wäßrigen Lösung in einer geeigneten Konzentration mit normalerweise 5 % ... 20 Gewichtsprozent (sofern nicht anders angegeben, gelten auch für die nachfolgenden Angaben Gewichtsprozent) einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen werden.
Die für die Hydrolyse zu verwendenden Enzyme sind nicht beschränkt. Beispielsweise lassen sich kommerzielle Proteasen verwenden, wie beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Subtilisin, Papain, Pepsin, Pankreatin, sowie von Hefen derivierte Carboxypeptidasen und von Milchsäurebakterien abgeleitete Peptidasen. Diese Enzyme können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die bevorzugte Kombination von Enzymen ist Pankreatin, kommerzielle Proteasen und Peptidasen, deriviert von Milchsäurebakterien.
Allgemein können die Enzyme in einer Menge von 0,1 ... 5,0 % bezogen auf die Menge des Proteins verwendet werden. Die Hydrolyse kann in einem pH-Bereich ausgeführt werden, der dem Optimum der pH-Werte der zu verwendenden Enzyme näher liegt, und bei einer Temperatur zwischen 15 ºC ... 25 ºC für 10 Minuten bis 24 Stunden.
Die Enzyme können nach einer ausreichenden Reaktionsdauer mit oder ohne Neutralisation des resultierenden Reaktionsgemisches durch Erhitzen desaktiviert werden, wobei das Reaktionsgemisch im Bedarfsfall gekühlt, filtriert, demineralisiert, eingeengt und/oder getrocknet werden kann, um die Hydrolysate in einer flüssigen Form oder in Pulverform zu erhalten.
Die Abbauraten der enzymatischen Hydrolysate werden angegeben als der prozentuale Anteil von Formol-Stickstoff zum Gesamt-Stickstoff, was mit Hilfe einer Formol- Titrationsmethode bestimmt wird (nachfolgend bezeichnet als "Abbaurate"). Die Abbaurate liegt zwischen 6 ... 50 % und vorzugsweise 8 ... 45 % in bezug auf die Wirkung der Tyrosinase-Hemmung, wobei eine verhältnismäßig höhere Abbaurate innerhalb dieses Bereichs bevorzugt wird, wenn eine Eliminierung der Antigenität des Proteins oder Peptids erforderlich wird. Schwierige typische Bedingungen für die Hydrolyse sind vorstehend aufgezeigt und können in bezug auf Kostenwirksarnkeit modifiziert werden. Speziell kann man sich für eine Kombination der Bedingungen unter Berücksichtigung der Temperatur, Zeit, Art und Menge der zu verwendenden Enzyme entscheiden.
Die erhaltenen Hydrolysate, die eine Mischung von Peptiden umfassen, verfügen über unterschiedliche relative Molekülmassen und sind äußerst stabil in bezug auf Erhitzen, Oxidation und pH-Änderung.
Die Hydrolysate in Form von Flüssigkeit oder Pulver können in den Verfahren der Tyrosinase-Hemmung als ein Mittel in der Form verwendet werden, wie sie vorliegen, oder können nach konventionellen Methoden zu Präparaten zubereitet werden, wie sie bei den Methoden zur Tyrosinase- Hemmung anwendbar sind. Beispielsweise können die Hydrolysate einem inerten Träger, Emulgiermittel, Suspensionsmittel zu gegeben werden, um Präparate zur Verwendung für die Tyrosinase-Hemmung zuzubereiten. Natürlich können den Zubereitungen beliebige andere Inhaltsstoffe von Kosmetika zugegeben werden, wie beispielsweise Alkohole, Duftstoffe und/oder Medikamente, einschließend konventionelle Mittel für die Tyrosinase-Hemmung.
Die wirksame Menge der Hydrolysate beträgt mehr als 0,05 % und vorzugsweise 0,1 % ... 0,5 %, womit 50 % oder mehr der Tyrosinase-Hemmrate erreicht werden.
Nachfolgend wird ein exemplifizierender Versuch beschrieben.

(Exemplifizierender Versuch)

Die Aufgabe dieses Versuchs besteht darin, die Aktivität für die Tyrosinase-Hemmung der enzymatischen Hydrolysate von Milchproteinen zu exemplifizieren, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.

(1) Herstellung von Proben

Es wurde eine 10%ige Casein-Lösung durch Auflösen von kommerziellem Casein in Leitungswasser hergestellt. Nachdem der pH-Wert der resultierenden Lösung mit Hilfe von 2M NaOH- Lösung auf 7,0 eingestellt wurde, wurde die Lösung durch Erhitzen für 10 Minuten bei 80 ºC und nachfolgendem Kühlen auf 37 ºC pasteurisiert. Zu einem Teil der gekühlten Lösung wurden jeweils Mischungen kommerzieller Protease, AMANO A (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) und SHOYU-ENZYME, das in unterschiedlichen Konzentrationen zwischen 0,1 ... 6 % Peptidase (von Tanabe Seiyaku) enthält, zugesetzt und die resultierenden Mischungen der enzymatischen Reaktion bei 37 ºC für eine unterschiedliche Zeitdauer von 5 Minuten bis 24 Stunden unterzogen. Die resultierenden Reaktionsgemische wurden jeweils für 10 Minuten bei 80 ºC zur Desaktivierung der Enzyme erhitzt und sodann lyophiliert, um dadurch verschiedene pulverförmige Casein-Hydrolysate mit unterschiedlichen Abbauraten zwischen 4 % und 50 % zu erhalten.

(2) Versuchsmethode

(2-1) Messung der Abbaurate

Mit Hilfe der Methode der Formol-Titration bzw. der Stickstoff-Bestimmung nach Kjeldahl wurden die Mengen an Formol- Stickstoff und Gesamt-Stickstoff in den Proben bestimmt. Die Abbauraten (D.-Rate) wurden unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:
D.-Rate (%) 100 x (Formol-Strickstoff/Gesamt-Stickstoff).
(2-2) Messung der Aktivität zur Tyrosinase-Hemmung

(2-2-1) Herstellung von Substratlösung

Es wurde eine 0,045%ige (Gewicht/Volumen) Substratlösung hergestellt, indem eine Menge L-Tyrosin (garantiert rein, von Wako Junyaku Kohgyo) in 0,1M Phosphat-Pufferlösung aufgelöst wurde.

(2-2-2) Herstellung von Enzymlösung

Es wurde eine 0,1%ige (Gewicht/Volumen) Enzymlösung hergestellt, indem eine Menge von Pilzen derivierte Tyrosinase (von Sigma, 3.000 Einheiten/mg) in 0,1M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) aufgelöst wurde.

(2-2-3) Herstellung von Kudfer-Ionenlösung

Es wurde eine 1%ige (Gewicht/Volumen) Kupfer-Ionenlösung hergestellt, indem eine Menge von Kupfersulfat (garantiert rein, von Wako Junyaku Kogyol) in gereinigtem Wasser aufgelöst wurde.

(2-2-4) Herstellung von Probelösungen

Probelösungen wurden durch Auflösen jeder der bereits entsprechend (1) vorstehend hergestellt Proben in 0,1 mmol Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) in unterschiedlichen Konzentrationen von 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 und 4,0 % hergestellt.

(2-2-5) Enzym-Reaktion

Die zuvor (2-2-1) hergestellte Substratlösung, jede der unter (2-2-4) hergestellten Probelösungen und die unter (2- 2-3) hergestellte Kupfer-Ionenlösung, die alle bei 37 ºC vorinkubiert wurden, wurden im Verhältnis von 0,9 ml:1 ml:0,02 ml gemischt. Zu jeder der resultierenden Mischungen wurden 0,08 ml der unter (2-2-2) hergestellten Enzymlösung, die bei 37 ºC vorinkubiert wurde, zugesetzt (bzw. 2,0 ml insgesamt), wonach die resultierenden Mischungen für 3 Minuten bei 37 ºC der enzymatischen Reaktion unterzogen wurden. Zu jeder der Reaktionsmischungen wurden 2 ml 30%ige Essigsäurelösung zugesetzt, um die enzymatische Reaktion anzuhalten, wonach das Absorptionsvermögen bei 640 nm der jeweiligen resultierenden Lösung mit Hilfe eines Spektrophotometers gemessen wurde. Die Werte wurden durch den Buchstaben B gekennzeichnet.
Als Kontrolle wurde das Absorptionsvermögen ((Extinktion)) bei 640 nm einer entsprechenden Mischung in der gleichen Weise gemessen, worin 1 ml der 0,1M Phosphat-Pufferlösung durch Probelösungen ersetzt wurden. Der Wert wird durch den Buchstaben A gekennzeichnet. Wenn die Mischungen für die Messung nicht klar genug waren, wurden entsprechende Mischungen, in denen jeweils die Enzym-Lösung durch 0,1M Phosphat-Pufferlösung ersetzt worden war, hergestellt und das Absorptionsvermögen aufgrund der Trübung nach den gleichen Verfahren gemessen. Die Werte werden durch den Buchstaben C gekennzeichnet. Unter Verwendung dieser Werte wurden die Tyrosinase-Hemmraten (%) mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
Hemmrate (%) = 100 x [1 - {(B-C)/ A}].

(3) Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt die Korrelation zwischen den Abbauraten der Hydrolysate und der Aktivität der Tyrosinase-Hemmung.
Die Tyrosinase-Hemmrate von Probe 2 mit einer 4%igen Abbaurate betrug lediglich 10 % bei einer 2%igen Konzentration der Hydrolysate. Probe 3 mit einer 6%igen Abbaurate zeigte eine 30%ige Hemmrate bei einer Konzentration der Hydrolysate von 0,1 %. Die höheren Hemmraten wurden mit der Erhöhung der Konzentration der Hydrolysate festgestellt, wobei eine Hemmrate von etwa 80 % bei einer Konzentration der Hydrolysate von 0,5 % und eine Hemmrate von 90 % bei einer Konzentration der Hydrolysate von 1 % erzielt wurden.
Jede der Proben 4 bis 10 mit der Abbaurate zwischen 8 bis 45 % zeigte etwa 40 % Abbaurate bei einer Konzentration der Proben von lediglich 0,05 %. Die Hemmrate nahm mit der Konzentration zu, und es wurden etwa 60 % oder mehr Hemmraten bei den Konzentrationen der Proben von 0,10 %, 0,25 % bzw. 0,5 % erreicht. Tabelle 1
Bemerkung: Tyrosinase-Hemmrate in %
Es werden nachfolgend typische Verfahren für die enzymatische Hydrolyse und einige Beispiele für das bessere Verständnis der vorliegenden Erfindung beschrieben. Es ist zu beachten, daß sämtliche Materialien außer Casein und Molkenprotein hoher Reinheit auf dem Markt vertrieben wurden und leicht verfügbar waren. Selbst wenn das Molkenprotein Lactoferrin enthielt, war dessen Gehalt vernachlässigbar gering.

[Typisches Verfahren 1]

Es wurden in 2.000 ml gereinigtem Wasser 300 g kommerzielles Casein suspendiert und der pH-Wert der Suspension danach mit iM Natriumhydroxid-Lösung zur vollständigen Auflösung des Caseins auf 8,0 eingestellt. Nachdem die Lösung für 10 Minuten bei 80 ºC pasteurisiert wurde, wurde die Lösung auf 40 ºC abgekühlt und 15 g PANCREATIN F (von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) zugesetzt und die Mischung für 5 Stunden zur enzymatischen Reaktion bei 40 ºC gehalten. Die Reaktionslösung wurde für 10 Minuten zur Desaktivierung des Enzyms bei 80 ºC erhitzt und danach lyophyliert, um dadurch etwa 280 g Casein-Hydrolysate zu erhalten. Die Abbaurate der resultierenden Hydrolysate betrug gemessen nach der gleichen Methode wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch 21 %.

[Typisches Verfahren 2]

In 2.000 ml gereinigtem Wasser wurden 200 g kommerzielle Casein suspendiert und sodann der pH-Wert der Suspension mit Hilfe von iM Natriumhydroxid-Lösung zum vollständigen Auflösen des Caseins auf 8,0 eingestellt. Nach dem Pasteurisieren der Lösung für 10 Minuten bei 80 ºC wurde sie auf 50 ºC gekühlt und 20 g PANCREATIN F (von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) und 20 g AMANO A (von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) und 5 g SAVORASE (von Imperial Biotechnology Ltd., von Milchsäurebakterien derivierte Peptidase) zugesetzt und die resultierende Mischung für 10 Stunden zur enzymatischen Reaktion bei 50 ºC gehalten. Die Reaktionslösung wurde für 10 Minuten bei 80 ºC zur Desaktivierung des Enzyms erhitzt und danach lyophiliert, um dadurch etwa 180 g Casein-Hydrolysate zu erhalten. Die Abbaurate der resultierenden Hydrolysate betrug gemessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch 40 %.

[Typisches Verfahren 3]

In 1.800 ml gereinigtem Wasser wurden 120 g hochreines, kommerzielles Molkenprotein, BYPRO (Warenzeichen von Bioisolate, Großbritannien, mit einer Reinheit von besser als 95 %) aufgelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit Hilfe von 1M Natriumhydroxid-Lösung auf 7,0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde für 10 Minuten bei 60 ºC pasteurisiert und auf 45 ºC gekühlt und danach mit 20 g AMANO A (von Zamano Phartnaceutical Co., Ltd.) versetzt. Das resultierende Gemisch wurde zur Hydrolyse für 2 Stunden bei 45 ºC gehalten. Die hydrolysierte Lösung wurde für 10 Minuten bei 80 ºC für Desaktivierung der Enzyme erhitzt und danach lyophiliert, wodurch etwa 110 g Molkenprotein-Hydrolysate erhalten wurden. Die Abbaurate der Hydrolysate betrug gemessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch 15 %.

[Typisches Verfahren 4]

In 200 ml gereinigtem Wasser wurden 20 g kommerzielles beta-Lactoglobulin (von Sigma, USA) aufgelöst und der pH- Wert der resultierenden Lösung mit Hilfe einer 1M Natriumhydroxid-Lösung auf 8,0 eingestellt. Nach dem Pasteurisieren für 10 Minuten bei 60 ºC wurde die Lösung auf 40 ºC gekühlt. Zur Lösung wurde 1 g PANCREATIN F (von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) zugesetzt und danach die resultierende Mischung für 1 Stunde bei 40 ºC der enzymatischen Hydrolyse unterzogen. Nach Desaktivierung des Enzyms durch Erhitzen der hydrolysierten Lösung für 10 Minuten bei 80 ºC wurde die Lösung lyophiliert, wodurch etwa 180 g beta- Lactoglobulin-Hydrolysate erhalten wurden. Die Abbaurate der Hydrolysate betrug gemessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierten Versuch 10 %.

Beispiel 1

Unter Verwendung von 100 g der im typischen Verfahren 1 hergestellten Casein-Hydrolysate wurden etwa 10000 g einer Zubereitung zur Tyrosinase-Hemmung, die zum Frischhalten von Lebensmitteln verwendbar ist, mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Casein-Hydrolysate 10 %
Glycin 80 %
Lysozym 10 %
Es wurde eine 20%ige wäßrige Lösung der erhaltenen Zubereitung einem Versuch der Tyrosinase-Hemmung unterworfen. Die Tyrosinase-Hemmrate der Lösung betrug nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch 96 %.

Beispiel 2

Unter Verwendung von 50 g der im typischen Verfahren 1 hergestellten Casein-Hydrolysate wurden etwa 1.000 g einer Zubereitung zur Tyrosinase-Hemmung, zum Aufhellen der Haut verwendbar ist, mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Casein-Hydrolysate 5,0 %
Natriumhyaluronat 0,1 %
Glyzerin 1,0 %
gereinigtes Wasser 93,9 %
Die Tyrosinase-Hemmrate der nach dem gleichen Verfahren getesteten Probe wie in den vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch betrug 98 %.

Beispiel 3

Unter Verwendung von 60 g der im typischen Verfahren 2 hergestellten Casein-Hydrolysate wurden etwa 2.000 g einer Zubereitung zur Tyrosinase-Hemmung, zum Aufhellen der Haut verwendbar ist, mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Casein-Hydrolysate 3,0 %
Propylenglykol 10,0 %
Oleylalkohol 0,1 %
Ethanol 5,0 %
gereinigtes Wasser 81,9 %
Die Tyrosinase-Hemmrate der Zubereitung betrug, geinessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch, 97 %.

Beispiel 4

Unter Verwendung von 40 g der im typischen Verfahren 3 hergestellten Molkenprotein-Hydrolysate wurden etwa 2.000 g einer Zubereitung zur Tyrosinase-Hemmung, zum Aufhellen der Haut verwendbar ist, mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Molkenprotein-Hydrolysate 3,0 %
Propylenglykol 10,0 %
Oleylalkohol 0,1 %
Ethanol 5,0 %
gereinigtes Wasser 81,9 %
Die Tyrosinase-Hemmrate der Zubereitung betrug, gemessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch, 97 %.

Beispiel 5

Unter Verwendung von 15 g der im typischen Verfahren 4 hergestellten beta-Lactoglobulin-Hydrolysate wurden etwa 1.000 g einer Zubereitung zur Tyrosinase-Hemmung, die zum Bleichen der Haut verwendbar sind, mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
beta-Lactoglobulin-Hydrolysate 1,5 %
Natriumhyaluronat 0,1 %
Glyzerin 3,0 %
gereinigtes Wasser 95,4 %
Die Tyrosinase-Hemmrate der Zubereitung betrug, gemessen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehend ausgeführten exemplifizierenden Versuch 98 %.

Wirkung der Erfindung

Die Wirkungen der vorliegenden Erfindung sind folgende:
1) Die Anwendung der Mittel und Zubereitungen zur Tyrosinase-Hemmung der vorliegenden Erfindung sind sicherer als konventionelle, da sie aus natürlich auftretenden Milchproteinen deriviert werden.
2) Die enzymatischen Hydrolysate von Milchproteinen der vorliegenden Erfindung sind gegenüber Erhitzen und Oxidation stabil und können für die Aktivität der Tyrosinase-Hemmung über lange Zeitdauer verwendet werden.
3) Das in dem Verfahren zur Tyrosinase-Hemmung der voriegenden Erfindung verwendete Mittel kann entweder in flüssiger oder in fester Form bereitgestellt werden, so daß es breite Anwendung findet.

Claims

1. In vitro-Verwendung eines Mittels zur Tyrosinase-Hemmung, umfassend mindestens 0,05 Gewichtsteile enzymatische Hydrolysate von Milchproteinen als ein wirksames Material, worin die Hydrolysate eine Abbaurate von 6 % 9.9 50 Gewichtsprozent haben, angeben als der prozentuale Anteil von Formol-Stickstoff zum Gesamt-Stickstoff.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Hydrolysate in einer Konzentration von 0,1... 0,5 Gewichtsprozent enthalten sind.

3. Verwendung nach einem der vorgenannte Ansprüche, wobei die Abbaurate 8 % 9.9 45 Gewichtsprozent beträgt.

4. Verwendung nach einem der vorgenannte Ansprüche, wobei die enzymatischen Hydrolysate hergestellt werden, indem Milchprotein, ausgewählt aus Casein, Weizenprotein, und eine Mischung davon, mit einer Kombination von Enzymen hydrolysiert werden, umfassend Protease, Pankreatin, Peptidase, deriviert von Milchsäurebakterien in einer Abbaurate von 8 %... 45 Gewichtsprozent.

5. Verwendung nach einem der vorgenannte Ansprüche, wobei die Verwendung für kosmetische Zwecke erfolgt.

6. Verwendung eines Mittels, umfassend mindestens 0,05 Gewichtsteile enzymatische Hydrolysate von Milchproteinen als ein wirksames Material, worin die Hydrolysate eine Abbaurate von 6 % ... 50 Gewichtsprozent haben, angeben als der prozentuale Anteil von Formol-Stickstoff zum Gesamt-Stickstoff, wobei die Verwendung des Mittels für die Herstellung eines Medikaments zur Tyrosinase-Hemmung erfolgt.

7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Hydrolysate in einer Konzentration von 0,01... 0,5 Gewichtsprozent enthalten sind.

8. Verwendung nach einem der vorgenannte Ansprüche 6 und 7, wobei die Abbaurate 0,1 ... 0,5 Gewichtsprozent beträgt.

9. Verwendung nach einem der vorgenannte Ansprüche 6 bis 8, wobei die enzymatischen Hydrolysate hergestellt werden, indem Milchprotein, ausgewählt aus Casein, Weizenprotein, und eine Mischung davon, mit einer Kombination von Enzymen hydrolysiert werden, umfassend Protease, Pankreatin, Peptidase, deriviert von Milchsäurebakterien in einer Abbaurate von 8 % ... 45 Gewichtsprozent.