DE69930424T2

DE69930424T2 - Anti-HER2 Antikörperzusammensetzung

Info

Publication number: DE69930424T2
Application number: DE69930424T
Authority: DE
Inventors: Carol D. Winters Basey; Greg S. Menlo Park Blank
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-03
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2019-05-04
Also published as: HK1055308A1; JP2016028060A; BR9910332A; AU760048B2; DK1075488T3; CN1626548A; DE69936946D1; DK1075488T4; IL173183A0; CN1626547A; ES2292682T3; ES2261589T3; PT1308455E; JP5133962B2; CN1305896C; US7531645B2; JP5836905B2; BRPI9910332B1; CN101333244B; KR101036414B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Proteinreinigung.
Beschreibung des Standes der Technik
Die großangelegte wirtschaftliche Reinigung von Proteinen wird zunehmend zu einem wichtigen Problem für die Biotechnologie-Industrie. Im Allgemeinen werden Proteine durch Zellkultur produziert, wobei entweder Säugetier- oder Bakterien-Zelllinien verwendet werden, die so durch Insertion eines rekombinanten Plasmids, das das Gen für dieses Protein enthält, so verändert sind, dass das Protein von Interesse produziert wird. Da die verwendeten Zelllinien lebende Organismen sind, müssen sie mit einem komplexen Wachstumsmedium ernährt werden, das Zucker, Aminosäuren und Wachstumsfaktoren enthält, üblicherweise bereitgestellt durch Tierserum-Präparate. Die Abtrennung des gewünschten Proteins vom Gemisch aus den Zellen zugeführten Verbindungen und aus den Nebenprodukten der Zellen selbst bis zu einer Reinheit, die für die Verwendung als Human-Therapeutikum ausreicht, stellt eine enorme Herausforderung dar.
Verfahren zur Reinigung von Proteinen aus Zelltrümmern sind zunächst vom Ort der Expression des Proteins abhängig. Bei manchen Proteinen ist es möglich zu bewirken, dass sie direkt aus der Zelle in die umgebenden Wachstumsmedien ausgeschieden werden; andere werden intrazellulär gebildet. Bei den letzteren Proteinen umfasst der erste Schritt eines Reinigungsverfahrens die Lyse der Zelle, die nach verschiedenen Verfahren erfolgen kann, einschließlich mechanischer Scherungs-, Osmoseschock- oder enzymatischer Behandlungen. Durch ein solches Aufbrechen wird der gesamte Inhalt der Zelle in das Homogenat freigesetzt und werden außerdem subzelluläre Fragmente erzeugt, die sich aufgrund ihrer geringen Größe nur schwer entfernen lassen. Diese werden im Allgemeinen durch Differenzierungszentrifugation oder durch Filtration entfernt. Das gleiche Problem entsteht, wenn auch in geringerem Ausmaß, bei direkt ausgeschiedenen Proteinen aufgrund des natürlichen Absterbens von Zellen und der Freisetzung von intrazellulären Wirtszellproteinen während des Proteinproduktionslaufs.
Sobald eine geklärte Lösung erhalten worden ist, die das Protein von Interesse enthält, wird üblicherweise versucht, es von den anderen von der Zelle produzierten Proteinen abzutrennen, indem eine Kombination unterschiedlicher Chromatographietechniken eingesetzt wird. Diese Techniken trennen Gemische aus Proteinen auf Basis ihrer Ladung, ihres Hydrophobiegrads oder ihrer Größe. Für jede dieser Techniken sind mehrere verschiedene Chromatographieharze verfügbar, die ein Maßschneidern des Reinigungsschemas für das jeweils betroffene Protein ermöglichen. Die Essenz jedes dieser Trennungsverfahren besteht darin, dass Proteine entweder dazu gebracht werden können, sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten eine lange Säule hinunter zu bewegen, wodurch eine physikalische Trennung erzielt wird, die zunimmt, je weiter sie die Säule hinunter wandern, oder dazu, selektiv am Trennmedium zu haften, wobei sie dann mit verschiedenen Lösungsmitteln differentiell eluiert werden. In manchen Fällen wird das gewünschte Protein von Verunreinigungen getrennt, wenn die Verunreinigungen spezifisch an der Säule haften, das Protein von Interesse hingegen nicht, d.h. das Protein von Interesse im "Durchfluss" enthalten ist.
Ionenaustauschchromatographie ist eine Chromatographietechnik, die üblicherweise für die Reinigung von Proteinen eingesetzt wird. Bei der Ionenaustauschchromatographie werden geladene Bereiche auf der Oberfläche des gelösten Stoffs durch entgegengesetzte Ladungen angezogen, die an eine Chromatographiematrix gebunden sind, vorausgesetzt, die Ionenstärke des umgebenden Puffers ist gering. Elution wird im Allgemeinen erreicht, indem die Ionenstärke (d.h. die Leitfähigkeit) des Puffers so erhöht wird, dass er mit dem gelösten Stoff um die geladenen Stellen der Ionenaustauschmatrix konkurriert. Änderung des pH und dadurch der Ladung des gelösten Stoffs ist eine weitere Methode, um Elution des gelösten Stoffs zu erzielen. Die Änderung der Leitfähigkeit oder des pH kann allmählich (Gradientenelution) oder stufenweise (Step-Elution) erfolgen. Bisher waren diese Änderungen progressiv; d.h. der pH oder die Leitfähigkeit werden in nur einer Richtung erhöht oder verringert.
Die WO 92/22653 (Genentech) offenbart Verfahren zur Herstellung humanisierter Antikörper, einschließlich Anti-HER2-Antikörper.
Die WO 96/33208 (Genentech) offenbart Verfahren zur Reinigung von Antikörpern (beispielsweise von nicht korrekt Disulfid-verbundenen Verunreinigungen) durch Hydrophobchromatographie bei niedrigem pH.
Tsai et al., Pharmaceutical Research Bd. 10, 11, 1580-1586 (1993), beschäftigen sich mit der isoelektrischen Heterogenität eines monoklonalen Anti-Mensch-CD18-Antikörpers ("h1B4"). Es wurde angenommen, dass die Ladungsheterogenität aus sequenzieller Desamidierung der Immunglobulinschwerkette resultierte.
Adachi et al., J. Chromatography A 763, 1-2, 57-63 (1997), befassen sich mit stationären Sulfopropylphasen in Ionenaustausch-HPLC. Die Arbeit erörtert die Verwendung solcher Phasen zur Trennung von Speziesvarianten von Cytochrom C sowie von menschlichem Wachstumshormon von seinen desamidierten Isoformen.
Moorhouse et al., J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 16, 593-603 (1997), erörtern die Verwendung von HPLC zur Analyse einer Ladungsheterogenität eines monoklonalen Anti-Human-CD20-Antikörpers ("IDEC-C2B8"). Die Arbeit erörtert Varianten, die aus Zyklisierung von Glutamin zu Pyroglutamat am Amino-Terminus der leichten und schweren Ketten und aus der Verarbeitung von Carboxy-terminalen Lysinresten der schweren Ketten entstehen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Hierin wird ein Ionenaustausch-Chromatographieverfahren offenbart, worin ein Polypeptid von Interesse an das Ionenaustauschmaterial mit einer anfänglichen Leitfähigkeit oder einem anfänglichen pH gebunden wird und dann das Ionenaustauschmaterial mit einem Zwischenpuffer mit einer anderen Leitfähigkeit oder einem anderen pH oder beidem gewaschen wird. An einem spezifischen Punkt nach dieser Zwischenwäsche und im Gegensatz zur Standardpraxis der Ionenaustauschchromatographie wird das Ionenaustauschmaterial mit einem Waschpuffer gewaschen, wobei die Änderung der Leitfähigkeit oder des pH oder beider vom Zwischenpuffer zum Waschpuffer entgegengesetzt zur Änderung der Leitfähigkeit oder des pH oder beider erfolgt, die in den vorherigen Schritten erzielt wurde. Erst nach dem Waschen mit dem Waschpuffer ist das Ionenaustauschmaterial dazu bereit, das Polypeptidmolekül von Interesse durch Anwendung des Elutionspuffers mit einer Leitfähigkeit oder einem pH oder beidem, die sich von der Leitfähigkeit oder dem pH oder beidem der in vorherigen Schritten verwendeten Puffer unterscheiden, zu eluieren.
Dieser neue Ansatz für Ionenaustauschchromatographie ist besonders nützlich in Situationen, wo ein Produktmolekül im vollen Produktionsumfang von einem sehr eng verwandten Verunreinigungsmolekül abgetrennt werden muss, wo sowohl Reinheit als auch hohe Ausbeute des Polypeptidprodukts gewünscht werden.
Demgemäß stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein Gemisch aus Anti-HER2-Antikörper wie in Anspruch 1 definiert umfasst. Diese kann durch ein Verfahren zur Reinigung eines Polypeptids, das ein Anti-HER2-Antikörper ist, aus einer Zusammensetzung, die ein Polypeptid und eine Verunreinigung umfasst, bereitgestellt werden, wobei das Verfahren die folgenden nacheinander durchgeführten Schritte umfasst:

(a) das Binden des Polypeptids an ein Ionenaustauschmaterial unter Verwendung eines Ladepuffers, worin der Ladepuffer eine erste Leitfähigkeit und einen ersten pH aufweist;
(b) das Waschen des Ionenaustauschmaterials mit einem Zwischenpuffer mit einer zweiten Leitfähigkeit und/oder einem zweiten pH, um die Verunreinigung aus dem Ionenaustauschmaterial zu eluieren;
(c) das Waschen des Ionenaustauschmaterials mit einem Waschpuffer, der eine dritte Leitfähigkeit und/oder einen dritten pH aufweist, worin die Änderung der Leitfähigkeit und/oder des pH vom Zwischenpuffer zum Waschpuffer entgegengesetzt zur Änderung der Leitfähigkeit und/oder des pH vom Ladepuffer zum Zwischenpuffer erfolgt; und
(d) das Waschen des Ionenaustauschmaterials mit einem Elutionspuffer mit einer vierten Leitfähigkeit und/oder einem vierten pH, um das Polypeptid aus dem Ionenaustauschmaterial zu eluieren. Die erste Leitfähigkeit und/oder der erste pH können mit der dritten Leitfähigkeit und/oder dem dritten pH gleich sein.

Wenn das Ionenaustauschmaterial ein Kationenaustauschharz umfasst, sind die Leitfähigkeit und/oder der pH des Zwischenpuffers vorzugsweise höher als die Leitfähigkeit und/oder der pH des Ladepuffers; die Leitfähigkeit und/oder der pH des Waschpuffers ist bzw. sind vorzugsweise geringer als die Leitfähigkeit und/oder der pH des Zwischenpuffers; und die Leitfähigkeit und/oder der pH des Elutionspuffers ist bzw. sind vorzugsweise höher als die Leitfähigkeit und/oder der pH des Zwischenpuffers. Vorzugsweise sind die Leitfähigkeit und/oder der pH des Waschpuffers etwa gleich hoch wie die Leitfähigkeit und/oder der pH des Ladepuffers.
Vorzugsweise wird Elution der Verunreinigung vom Polypeptid erreicht, indem die Leitfähigkeit des Zwischenpuffers bzw. des Elutionspuffers modifiziert wird, während der pH dieser Puffer etwa gleich gehalten wird.
Ebenfalls hierin offenbart wird ein Verfahren zur Reinigung eines Polypeptids aus einer Zusammensetzung, die das Polypeptid und eine Verunreinigung umfasst, wobei das Verfahren die folgenden nacheinander durchgeführten Schritte umfasst:

(a) das Binden des Polypeptids an ein Kationenaustauschmaterial unter Verwendung eines Ladepuffers, worin der Ladepuffer eine erste Leitfähigkeit und einen ersten pH aufweist;
(b) das Waschen des Kationenaustauschmaterials mit einem Zwischenpuffer mit einer zweiten Leitfähigkeit und/oder einem zweiten pH, die bzw. der höher als jene(r) des Ladepuffers ist bzw. sind, um die Verunreinigung aus dem Ionenaustauschmaterial zu eluieren;
(c) das Waschen des Kationenaustauschmaterials mit einem Waschpuffer, der eine dritte Leitfähigkeit und/oder einen dritten pH aufweist, die bzw. der niedriger als jene(r) des Zwischenpuffers ist bzw. sind; und
(d) das Waschen des Kationenaustauschmaterials mit einem Elutionspuffer mit einer vierten Leitfähigkeit und/oder einem vierten pH, die bzw. der höher als jene(r) des Zwischenpuffers ist bzw. sind, um das Polypeptid aus dem Ionenaustauschmaterial zu eluieren.

Außerdem wird hierin ein Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers aus einer Zusammensetzung offenbart, die den Antikörper und eine Verunreinigung umfasst, wobei das Verfahren das Laden der Zusammensetzung auf ein Kationenaustauschharz umfasst, wobei die Menge an Antikörper, die auf das Kationenaustauschharz geladen wird, etwa 20 mg bis etwa 35 mg des Antikörpers pro ml Kationenaustauschharz beträgt, und gegebenenfalls weiters das Eluieren des Antikörpers aus dem Kationenaustauschharz umfasst. Das Verfahren umfasst vorzugsweise weiters einen Zwischenwaschschritt zum Eluieren einer oder mehrerer Verunreinigungen aus dem Ionenaustauschharz. Dieser Zwischenwaschschritt geht dem Schritt des Eluierens des Antikörpers üblicherweise voraus.
In den Zusammensetzungen der Erfindung, wie in Anspruch 1 definiert, beträgt die Menge der sauren Variante(n) in der Zusammensetzung weniger als etwa 25 % und vorzugsweise weniger als etwa 20 % und liegt z.B. im Bereich von etwa 1 % bis etwa 18 %. Gegebenenfalls umfasst die Zusammensetzung weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Fließbild, das zeigt, wie Anionenaustauschchromatographie durchgeführt werden kann, indem die Leitfähigkeit geändert wird (beispielsweise auf die NaCl-Konzentrationen des nachstehenden Beispiels 1) oder indem der pH geändert wird (z.B. auf die im Fließbild gezeigten pH-Werte).
2 ist ein Fließbild, das zeigt, wie Anionenaustauschchromatographie durchgeführt werden kann, indem die Leitfähigkeit geändert wird (beispielsweise auf die NaCl-Konzentrationen des nachstehenden Beispiels 1) oder indem der pH geändert wird (z.B. auf die gezeigten pH-Werte).
3 ist die Kurve des Absorptionsvermögens aus einem Kationenaustauschchromatographiedurchgang aus Beispiel 1 im vollen Produktionsumfang. Punkte, an denen die Säule mit den verschiedenen hierin beschriebenen Puffern gewaschen wird, sind mit Pfeilen markiert.
4 stellt rekombinanten humanisierten monoklonalen Anti-HER2-Antikörper (rhu-MAb HER2) dar, der in jeder Chromatographiefraktion gewonnen wird (berechnet als Prozentsatz der Gesamtsumme aller Fraktionen der relevanten Chromatographie). Durchfluss, Waschschritte und Prepool-Fraktionen sind alles Ausfluss-Proben, die vom Beginn der Ladung bis zum Beginn des Poolings abgenommen werden. Die Pool-Fraktion ist die Fünf-Säulenvolumina-Ausfluss-Elutionsprobe beginnend am Wendepunkt der vorderen Brandenschulter. Die Regenerationsfraktion enthält Ausfluss, der vom Ende des Poolings bis zum Ende der Regeneration abgenommen wurde.
5 zeigt die mittels Carboxysulfon-Kationenaustausch-Hochdruck-Flüssigchromatographie (CSx-HPIEX) bewertete Qualität von rhuMAb HER2 in jeder Kationenaustauschchromatographiepoolprobe. Die Peaks a, b und l sind desamidierte Formen von rhuMAb HER2. Peak 3 ist ein nicht desamidierter rhuMAb HER2. Peak 4 ist eine Kombination aus C-terminales Lysin enthaltenden und Iso-Aspartat-Varianten von rhuMAb HER2.
6 zeigt die Profile des Absorptionsvermögens (280 nm) der 0,025 M-MES/0,070 M-NaCl-, pH 5,6, Wäsche für jede Chromatographie. Die Masse an rhuMAb HER2, die auf das Kationenaustauschharz aufgebracht wird, beeinflusst die Absorptionsvermögenswerte des Peaks am Scheitelpunkt sowie die Menge, die erforderlich ist, um den Scheitelpunkt zu erreichen. Aufgrund kleinerer Peaks, die bei dieser Wäsche auftreten (wie am besten bei der 30-mg/ml-Ladung zu sehen), ist der Scheitelpunkt als Absorptionsvermögenswerte von zumindest 0,5 Absorptionsvermögenseinheiten (AU) definiert.
Die 7A und 7B zeigen die Aminosäuresequenzen der humMAb4D5-8-Leichtkette (Seq.-ID Nr. 1) bzw. humMab4D5-8-Schwerkette (Seq.-ID Nr. 2).
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen
Die zu reinigende "Zusammensetzung" gemäß vorliegender Erfindung umfasst das Polypeptid von Interesse und eine oder mehrere Verunreinigungen. Die Zusammensetzung kann "teilweise gereinigt" (d.h. einem oder mehreren Reinigungsschritten, wie z.B. Protein-A-Chromatographie wie im nachstehenden Beispiel 1 unterzogen worden) sein oder direkt aus einer Wirtszelle oder einem Organismus erhalten werden, die bzw. der das Polypeptid produziert (z.B. kann die Zusammensetzung geerntete Zellkulturflüssigkeit umfassen).
Wie hierin verwendet bezeichnet "Polypeptid" einen Anti-HER2-Antikörper. Am meisten bevorzugt wird ein Antikörper voller Länge, der Human-HER2 bindet.
Eine "Verunreinigung" ist ein Material, die sich vom gewünschten Polypeptidprodukt unterscheidet. Die Verunreinigung kann eine Variante des gewünschten Polypeptids sein (beispielsweise eine desamidierte Variante oder eine Amino-Aspartat-Variante des gewünschten Polypeptids) oder ein anderes Polypeptid, eine Nucleinsäure, ein Endotoxin usw.
Eine "Variante" oder "Aminosäuresequenzvariante" eines Ausgangspolypeptids ist ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich von jener des Ausgangspolypeptids unterscheidet. Im Allgemeinen weist eine Variante zumindest 80%ige Sequenzidentität, vorzugsweise zumindest 90%ige Sequenzidentität, mehr bevorzugt zumindest 95%ige Sequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest 98%ige Sequenzidentität mit dem nativen Polypeptid auf. Die prozentuelle Sequenzidentität wird beispielsweise mit der Version von Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1382-1386 (1983), des von Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970), beschriebenen Algorithmus bestimmt, nachdem die Sequenzen so ausgerichtet worden sind, dass maximale Homologie erreicht wird. Aminosäuresequenzvarianten eines Polypeptids können hergestellt werden, indem entsprechende Nucleotidänderungen in DNA, die für das Polypeptid kodiert, eingeführt werden, oder auch durch Peptidsynthese. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen und/oder Insertionen und/oder Substitutionen eines oder mehrerer Reste innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids von Interesse. Es wird jede beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution vorgenommen, um das Endkonstrukt zu erhalten, mit der Maßgabe, dass das Endkonstrukt die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch post-translationale Prozesse des Polypeptids ändern, wie die Anzahl oder die Position der Glykosylierungsstellen ändern. Verfahren zur Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten von Polypeptiden werden beispielsweise in US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben, das ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Eine "saure Variante" ist eine Variante eines Polypeptids von Interesse, die stärker sauer (beispielsweise durch Kationenaustauschchromatographie ermittelt) ist als das Polypeptid von Interesse. Ein Beispiel für eine saure Variante ist eine desamidierte Variante.
Eine "desamidierte" Variante eines Polypeptidmoleküls ist ein Polypeptid, worin ein oder mehrere Asparaginrest(e) des ursprünglichen Polypeptids in Aspartat umgewandelt worden ist bzw. sind, d.h. die neutrale Amidseitenkette in einen Rest mit einem insgesamt sauren Charakter umgewandelt worden ist. Beim desamidierten humMAb4D5-Antikörper aus dem nachstehenden Beispiel ist Asn30 in CDR1 einer oder beider seiner V_L-Regionen in Aspartat umgewandelt. Der Begriff "desamidierte Human-DNase" wie hierin verwendet bezeichnet Human-DNase, die am Asparaginrest desamidiert ist, der an Position 74 in der Aminosäuresequenz von nativer reifer Human-DNase auftritt (US-Patent Nr. 5.279.823; ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen).
Der Begriff "Gemisch" wie hierin in Bezug auf eine Zusammensetzung verwendet, die einen Anti-HER2-Antikörper umfasst, bezeichnet das Vorhandensein sowohl des gewünschten Anti-HER2-Antikörpers als auch einer oder mehrerer saurer Varianten davon. Die sauren Varianten können vorwiegend desamidierten Anti-HER2-Antikörper mit geringeren Mengen anderer sauren Variante(n) umfassen. Es ist beispielsweise festgestellt worden, dass bei Anti-HER2-Antikörperpräparaten, die durch rekombi nante Expression erhalten wurden, nicht weniger als etwa 25 % des Anti-HER2-Antikörpers desamidiert sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid. Ein "rekombinantes Polypeptid" ist eines, das in einer Wirtszelle produziert wurde, die mit Nucleinsäure transformiert oder transfiziert worden ist, die für das Polypeptid kodiert, oder das Polypeptid als Ergebnis homologer Rekombination produziert. "Transformation" und "Transfektion" werden austauschbar verwendet, um das Verfahren das Einführens von Nucleinsäure in eine Zelle zu bezeichnen. Nach der Transformation oder Transfektion kann sich die Nucleinsäure in das Wirtszellengenom integrieren oder kann als extrachromosomales Element vorliegen. Die "Wirtszelle" umfasst eine Zelle in Zellkultur in vitro sowie eine Zelle innerhalb eines Wirtstiers. Verfahren zur rekombinanten Produktion von Polypeptiden werden beispielsweise in US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben, das ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Der Ausdruck "Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst konkret monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonaler Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente, so lange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
Der Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ist gegen ein "Antigen" von Interesse gerichtet. Vorzugsweise ist das Antigen ein biologisch wichtiges Polypeptid, und die Verabreichung des Antikörpers an ein Säugetier, das an einer Erkrankung oder Störung leidet, kann zu einem therapeutischen Nutzen bei diesem Säugetier führen. Es ist jedoch auch an gegen Nicht-Polypeptid-Antigene gerichtete Antikörper (wie Tumor-assoziierte Glykolipidantigene; siehe US-Patent 5.091.178) gedacht. Wenn das Antigen ein Polypeptid ist, kann es ein Transmembranmolekül (z.B. Rezeptor) oder Ligand sein, wie etwa ein Wachstumsfaktor. Beispiele für Antigene sind die oben erörterten Polypeptide. Bevorzugte Molekülziele für Antikörper, die in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen, sind CD-Polypeptide, wie CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 und CD34; Elemente der HER-Rezeptorfamilie, wie EGF-Rezeptor, HER2-, HER3- oder HER4-Rezeptor; Zelladhäsionsmoleküle, wie LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM und av/b3-Integrin, das entweder a- oder b-Untereinheiten davon umfasst (z.B. Anti-CD11a-, Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörper); Wachstumsfaktoren, wie VEGF; IgE; Blutgruppenantigene; flk2/flt3-Rezeptor; Fettleibigkeits-(OB-)Rezeptor; mpl-Rezeptor; CTLA-4; Polypeptid C usw. Lösliche Antigene oder Fragmente davon, die gegebenenfalls an andere Immunogene konjugiert sind, können als Immunogene zur Produktion von Antikörpern verwendet werden. Für Transmembranmoleküle, wie z.B. Rezeptoren, können Fragmente davon (z.B. die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors) als Immunogen verwendet werden. Alternativ dazu können Zellen, die das Transmembranmolekül exprimieren, als Immunogen verwendet werden. Derartige Zellen können von einer natürliche Quelle (z.B. Krebszelllinien) stammen oder Zellen sein, die durch rekombinante Techniken so transformiert worden sind, dass sie das Transmembranmolekül exprimieren.
Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wird, d.h., dass die einzelnen die Population umfassenden Antikörper bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen identisch sind, die in geringem Ausmaß auftreten können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzelne Antigen-Stelle gerichtet. Außerdem ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper enthalten, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Die Ergänzung "monoklonal" gibt an, dass der Antikörper das Merkmal aufweist, von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten worden ist, und ist nicht so zu verstehen, dass die Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erforderlich ist. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung durch das Hybridom-Verfahren hergestellt werden, das erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben worden ist, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.816.567). Gemäß einer weiteren Ausführungsform können "monoklonale Antikörper" aus Antikörper-Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Einsatz der in McCafferty et al., Nature, 348, 552-554 (1990), beschriebenen Techniken erzeugt werden. Clackson et al., Nature, 352, 624-628 (1991), und Marks et al., J. Mol Biol., 222, 581-597 (1991), beschrieben die Isolierung von Mäuse- bzw. Human-Antikörpern unter Einsatz von Phagenbibliotheken. Spätere Publikationen beschreiben die Produktion von Human-Antikörpern mit hoher Affinität (im nM-Bereich) durch Kettenshuffling (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783 (1992)), sowie die kombinatorische Infektion und in vivo-Rekombination als Strategie für die Konstruktion sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21, 2265-2266 (1993)). Somit sind diese Techniken praktikable Alternativen zu traditionellen monoklonalen Antikörper-Hybridomtechniken zum Isolieren monoklonaler Antikörper. Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu erzeugen, die fähig sind, nach der Immunisierung ein vollständiges Repertoire an Human-Antikörpern ohne endogene Immunglobulin-Produktion zu erzeugen. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-(J_H-)Gens in heterozygoten und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung von endogener Antikörper-Produktion führt. Der Transfer der Human-Keimlinien-Immunglobulingen-Anordnung bei solchen Keimlinien-mutierten Mäusen führt zur Produktion von Human-Antikörpern nach Antigen-Challenge. Siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993); und Duchosal et al., Nature 355, 258 (1992).
Die monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung umfassen spezifisch "heterozygote" bzw. "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Abschnitt der schweren und/oder der leichten Kette mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer bestimmten Spezies stammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, identisch oder dazu homolog ist, während der Rest der Kette(n) mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder dazu homolog ist, die von einer anderen Spezies stammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, wie z.B. Fragmenten derartiger Antikörper, so lange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
Der Begriff "hypervariable Region" wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigen-Bindung verantwortlich sind. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste von einer "Komplementarität bestimmenden Region" oder "CDR" (d.h. den Resten 24-34 (L1), 50-56 (L2) und 89-97 (L3) in der variablen Leichtketten-Domäne und 31-35 (H1), 50-65 (H2) und 95-102 (H3) in der variablen SchwerkettenDomäne; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) und/oder jene Reste von einer "hypervariablen Schleife" (d.h. die Reste 26-32 (L1), 50-52 (L2) und 91-96 (L3) in der variablen Leichtketten-Domäne und 26-32 (H1), 53-55 (H2) und 96-101 (H3) in der variablen Schwerketten-Domäne; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). "Rahmen"- oder "FR"-Reste sind die Reste variabler Domäne mit Ausnahme der Reste hypervariabler Region wie hierin definiert. Die CDR- und FR-Reste des rhuMAb HER2-Antikörpers des nachstehenden Beispiels (humAb4D5-8) werden von Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992), identifiziert.
"Humanisierte" Formen nichtmenschlicher (z.B. Mäuse-) Antikörper sind chimäre Antikörper, die einen minimalen Anteil an Sequenzen aus nichtmenschlichem Immunglobulin enthalten. Zumeist sind humanisierte Antikörper Human-Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste einer hypervariablen Region des Rezipienten durch Reste aus einer hypervariablen Region einer nicht menschlichen Spezies (Donor-Antikörper), wie z.B. einer Maus, einer Ratte oder eines Primaten mit Ausnahme des Menschen mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In einigen Fällen sind Fv-Rahmenregion-(FR-)Reste des Human-Immunglobulins durch entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch im Donor-Antikörper zu finden sind. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Antikörperleistungsfähigkeit weiter zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alles von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Schleifen mit jenen aus einem nichtmenschlichen Immunglobulin übereinstimmen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer Human-Immunglobulin-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines Human-Immunglobulins.
Die Wahl der variablen Human-Domänen, sowohl leicht als auch schwer, zur Verwendung bei der Herstellung der humanisierten Antikörper, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu verringern. Nach dem sogenannten "Best-fit"-Verfahren wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter variabler Human-Domänensequenz gescreent. Die Human-Sequenz, die jener des Nagetiers am nähesten kommt, wird dann als der Human-Rahmen (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)).
Bei einem weiteren Verfahren wird ein bestimmter Rahmen verwendet, der von der Konsenssequenz aller Human-Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten stammt. Es kann der gleiche Rahmen für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta of al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Weiters ist es wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und andere vorteilhafte biologische Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden gemäß einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper durch ein Verfahren der Analyse der parentalen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Einsatz dreidimensionaler Modelle der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein erhältlich, und Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sind damit vertraut. Es sind Computerprogramme erhältlich, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und aufzeigen. Die Untersuchung dieser Darstel lungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste beim Funktionieren der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste aus den Rezipienten- und Importsequenzen ausgewählt und kombiniert werden, so dass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das bzw. die Zielantigen(e) erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und wesentlich an der Beeinflussung der Antigen-Bindung beteiligt.
"Antikörperfragmente" enthalten einen Teil eines intakten Antikörpers, im Allgemeinen die Antigen-Bindungsstelle oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diakörper; lineare Antikörper, Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet sind. Herkömmlicherweise wurden diese Fragmente über proteolytische Digestion von intakten Antikörpern abgeleitet (siehe beispielsweise Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107-117 (1992), sowie Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Diese Fragmente können jedoch nun direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden. Beispielsweise können die Antikörperfragmente von den oben erörterten Antikörper-Phagenbibliotheken isoliert werden. Alternativ dazu können Fab'-SH-Fragmente direkt aus E.coli gewonnen und chemisch verbunden werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163-167(1992)). Gemäß einer anderen Ausführungsform wird das F(ab')₂ unter Verwendung eines Leucin-Zipper GCN4 gebildet, um das Zusammenbauen des F(ab')₂-Moleküls zu fördern. Gemäß einem weiteren Ansatz können F(ab')₂-Fragmente direkt aus rekombinanter Wirtszellenkultur isoliert werden. Weitere Techniken zur Erzeugung von Antikörperfragmenten sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar.
Gemäß anderer Ausführungsformen ist der gewählte Antikörper ein Einzelketten-Fv-Fragment (scFv). Siehe WO 93/16185. "Einzelketten-FV"- oder "sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Antikörperdomänen, wobei diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorhanden sind. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypep tid weiters einen Polypeptid-Linker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigen-Bindung zu bilden. Ein Überblick über sFv ist Plucthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", Band 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S.269-315 (1994), zu entnehmen.
Der Begriff "Diakörper" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindenden Stellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerketten-Domäne (V_H) enthalten, welche mit einer variablen Leichtketten-Domäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H und V_L) verbunden ist. Durch Verwendung eines Linkers der zu klein ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu erlauben, werden die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigen-bindende Stellen zu bilden. Diakörper werden beispielsweise in EP-A-404.097; WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993); ausführlicher beschrieben.
Der Ausdruck "lineare Antikörper" bezieht sich in dieser Anmeldung immer auf die von Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995), beschriebenen Antikörper. Kurz gesagt enthalten diese Antikörper ein Paar von Tandem-Fd-Segmenten (V_H-C_H1-C_H-C_H1), welche ein Paar von Antikörper-bindenden Regionen bilden. Lineare Antikörper können bispezifisch oder monospezifisch sein.
"Multispezifische Antikörper" weisen Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Epitope auf, wobei die Epitope üblicherweise von verschiedenen Antigenen stammen. Während derartige Moleküle normalerweise nur zwei Antigene binden (d.h. bispezifische Antikörper, BsAbs), umfasst der Begriff wie hierin verwendet Antikörper mit zusätzlichen Spezifitäten, wie trispezifische Antikörper. Beispiele für BsAbs sind jene, bei denen ein Arm gegen ein Tumorzellen-Antigen gerichtet ist und der andere Arm gegen ein zytotoxisches Triggermolekül gerichtet ist, wie Anti-FcγRI/anti-CD15, Anti-p185^HER2/FcγRIII (CD16), Anti-CD3/Anti-maligne B-Zelle (ID10), Anti-CD3/Anti-p185^HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Anti-Nierenzellenkarzinom, Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Anti-Grimmdarmkarzinom), Anti-CD3/Antimelanozytenstimulierendes Hormonanalog, Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3, Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, Anti-Nervenzellenadhäsionsmolekül (NCAM)/Anti-CD3, Anti-Folatbindungsprotein (FBP)/Anti-CD3, Anti-Pfannenkarzinom-assoziiertes Antigen (AMOC-31)/Anti-CD3; BsAbs mit einem Arm, der sich spezifisch an ein Tumor-Antigen bindet, und einem Arm, der sich an ein Toxin bindet, wie Anti-Saporin/Anti-Id-1, Anti-CD22/Anti-Saporin, Anti-CD7/Anti-Saporin, Anti-CD38/Anti-Saporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette, Anti-Interferon-α(IFN-α)/Anti-Hybridomidiotyp, Anti-CEA/Anti-Vincaalkaloid; BSAbs zur Umwandlung enzymaktivierter Prodrugs, wie Anti-CD30/Anti-Alkalische-Phosphatase (das die Umwandlung von Mitomycinphosphat-Prodrug in Mitomycinalkohol katalysiert); BsAbs, die als fibrinolytische Mittel verwendet werden können, Anti-Fibrin/Anti-Gewebeplasminogenaktivator (tPA), Anti-Fibrin/Anti-Urokinase-Plasminogenaktivator (uPa); BsAbs, um mit Immunkomplexen auf Zelloberflächenrezeptoren abzuzielen, wie Anti-niederdichtes-Lipoprotein- (LDL-)/Anti-Fc-Rezeptor (z.B. FcγRI oder Fcγ-RIII); BsAbs zur Verwendung bei der Therapie infektiöser Erkrankungen, wie Anti-CD3/Anti-Herpessimplexvirus (HSV); Anti-T-Zellenrezeptor:CD3-Komplex/Anti-Influenza, Anti-FcγR/Anti-HIV; BsAbs zur Tumordetektion in vitro oder in vivo, wie Anti-CEA/Anti-EOUBE, Anti-CEA/Anti-DPTA, Anti-p185^HER2/Anti-Hapten; BsAbs als Impfstoffadjuvans; und BsAbs als Diognosewerkzeuge, wie Anti-Kaninchen-IgG/Anti-Ferritin; Anti-Meerrettichperoxidase (HRP)/Anti-Hormon, Anti-Somatostatin/Anti-Substanz P, Anti-HRP/Anti-FITC, Anti-CEA/Anti-β-Galactosidase. Beispiele für trispezifische Antikörper sind Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37. Bispezifische Antikörper können als Antikörper voller Länge oder Antikörperfragmente hergestellt werden (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper).
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Die herkömmliche Herstellung bispezifischer Antikörper voller Länge basiert auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, worin die beiden Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein et al., Nature, 305, 537-539 (1983)). Aufgrund der Zufallssortierung von Immunglobulin- Schwer- und Leichtketten erzeugen diese Hybridome (Qudrome) ein potentielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist ziemlich mühevoll, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829 und von Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen Ansatz werden variable Antikörper-Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinierungsstellen) an Immunglobulin-Konstantdomänen-Sequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfassen. Vorzugsweise enthält die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle, die für Leichtketten-Bindung notwendig ist, die zumindest in einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen, und, falls gewünscht, die Immunglobulin-Leichtketten kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren inseriert und werden in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Das sorgt für große Flexibilität beim Einstellen der jeweiligen Anteile dieser drei Polypeptidfragmente bei Ausführungsformen, wo ungleiche Anteile der drei Polypeptidketten, die bei der Konstruktion verwendet werden, für die optimalen Ausbeuten sorgen. Es ist jedoch möglich, die Kodierungssequenz von zwei oder allen drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu inserieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Anteilen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Anteile keine besonders Bedeutung haben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das für eine zweite Bindungsspezifität sorgt) im anderen Arm. Es wurde festgestellt, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da das Vorhandensein einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für einen einfachen Trennungsweg sorgt. Dieser Ansatz wird in der WO 94/04690 offenbart. Weitere Details zur Erzeugung bispezifischer Antikörper sind beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986), zu entnehmen.
Gemäß einem weiteren Ansatz, der in der WO96/27011 beschrieben wird, kann die Schnittstelle zwischen einem Paar Antikörpermolekülen so durch genetisches Engineering verändert werden, dass der Prozentsatz der Heterodimere maximiert wird, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden. Die bevorzugte Schnittstelle umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer Antikörper-Konstantdomäne. Bei diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäure-Seitenketten von der Schnittstelle des ersten Antikörpermoleküls durch größere Seitenketten ersetzt (z.B. Tyrosin oder Tryptophan). Ausgleichende "Hohlräume" mit identischer oder ähnlicher Größe wie die große(n) Seitenkette(n) werden auf der Schnittstelle des zweiten Antikörpermoleküls erzeugt, indem große Aminosäure-Seitenketten durch kleinere ersetzt werden (z.B. Alanin oder Threonin). Das stellt einen Mechanismus bereit, um die Ausbeute an Heterodimer gegenüber anderen unerwünschten Endprodukten wie etwa Homodimeren zu erhöhen.
Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder "Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin gekoppelt sein und der andere an Biotin. Derartige Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um mit Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-A-4.676.980), und zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/200373 sowie EP-A-03089). Heterokonjugat-Antikörper können unter Einsatz aller zweckmäßigen Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind nach dem Stand der Technik bekannt und werden in US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Anzahl von Vernetzungstechniken offenbart.
Techniken zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Einsatz chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexierungsmittels Natriumarsenit reduziert, um Dithiole in der Umgebung zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivate umgewandelt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin wieder in das Fab'-Thiol umgewandelt und wird mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die erzeugten bispezifischen Antikörper können als Mittel für selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Vor kurzem gemachte Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli erleichtert, die chemisch gekoppelt werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Expression. Med. 175, 217-225 (1992), beschreiben die Herstellung eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt von E. coli ausgeschieden und direktem chemischem Koppeln in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden.
Verschiedene Techniken, um bispezifische Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur herzustellen und zu isolieren, sind ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise sind bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zippern erzeugt worden. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucin-Zipperpeptide von den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann re-oxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch für die Herstellung von Antikörper-Homodimeren eingesetzt werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Technologie hat einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereitgestellt. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V_H), die durch einen Linker, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den bei den Domänen auf derselben Kette zuzulassen, an die variable Leichtketten-Domäne (V_L) gebunden ist. Demgemäß sind die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments dazu gezwungen, sich mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Es ist noch eine weitere Strategie zur Herstellung bispezifischer Antikörper-Fragmente unter Verwendung von Einzelketten-Fv-(sFv-)Dimeren berichtet worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
Antikörper mit mehr als Zweiwertigkeit werden in Erwägung gezogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
Der Ausdruck "Ionenaustauschmaterial" bezieht sich auf eine Festphase, die negativ geladen ist (d.h. ein Kationenaustauschharz) oder positiv geladen ist (d.h. ein Anionenaustauschharz). Die Ladung kann bereitgestellt werden, indem ein oder mehrere geladene Liganden an die Festphase gebunden wird bzw. werden, beispielsweise durch kovalente Bindung. Alternativ dazu oder zusätzlich kann die Ladung eine der Festphase innewohnende Ladung sein (beispielsweise wie im Fall von Kieselgel, das eine negative Gesamtladung aufweist).
Mit "Festphase" ist eine nichtwässrige Matrix gemeint, an der ein oder mehrere geladene Liganden haften können. Die Festphase kann eine Reinigungssäule, eine diskontinuierliche Phase aus diskreten Teilchen, eine Membran oder ein Filter usw. sein. Beispiele für Materialien zur Bildung der Festphase sind Polysaccharide (wie z.B. Agarose und Cellulose), und andere mechanisch stabile Matrices, wie z.B. Silicamaterial (z.B. Glas mit regulierten Poren), Poly(styroldivinyl)benzol, Polyacrylamid-Keramikteilchen und Derivate von beliebigen der obigen.
"Kationenaustauschharz" bezeichnet eine Festphase, die negativ geladen ist und die daher freie Kationen zum Austausch mit Kationen in einer wässrigen Lösung aufweist, die über oder durch die Festphase hindurch geführt wird. Ein negativ geladener Ligand, der an die Festphase gebunden ist, um das Kationenaustauschharz zu bilden, kann beispielsweise ein Carboxylat oder Sulfonat sein. Im Handel erhältliche Kationenaustauschharze sind Carboxymethylcellulose, BAKERBOND ABX^TM, auf Agarose immobilisiertes Sulfopropyl (SP) (z.B. SP-SEPHAROSEFAST FLOW^TM oder SP-SEPNAROSE HIGH PERFORMANCE^TM von Pharmacia), sowie Sulfonylimmobilisierte Agarose (z.B. S-SEPHAROSE FAST FLOW^TM von Pharmacia).
Der Begriff "Anionenaustauschharz" wird hierin verwendet, um eine Festphase zu bezeichnen, die positiv geladen ist, z.B. eine oder mehrere positiv geladene Liganden aufweist, wie z.B. quaternäre Aminogruppen, die daran gebunden sind. Im Handel erhältliche Anionenaustauschharze sind DEAE-Cellulose, QAE-SEPHADEX^TM und FAST Q SEPHAROSE^TM (Pharmacia).
Ein "Puffer" ist eine Lösung, die Änderungen im pH durch die Wirkung ihrer Säure-Basen-Konjugatkomponenten widersteht. Verschiedene Puffer, die beispielsweise in Abhängigkeit vom gewünschten pH des Puffers eingesetzt werden können, werden in "Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems", D. Gueffroy (Hrsg.), Calbiochem Corporation (1975) beschrieben. Gemäß einer Ausführungsform weist der Puffer einen pH im Bereich von etwa 5 bis etwa 7 auf (z.B. wie im nachstehenden Beispiel 1). Beispiele für Puffer, die den pH in diesem Bereich regulieren, sind MES-, MOPS-, MOPSO-, Phosphat-, Acetat-, Zitrat-, Succinat- und Ammoniumpuffer, sowie Kombinationen davon.
Der "Ladepuffer" ist der, der verwendet wird, um die Zusammensetzung, die das Polypeptidmolekül von Interesse und eine oder mehrere Verunreinigungen umfasst, auf das Ionenaustauschharz zu laden. Der Ladepuffer hat eine solche Leitfähigkeit und/oder einen solchen pH, dass das Polypeptidmolekül von Interesse (und im Allgemeinen eine oder mehrere Verunreinigungen) an das Ionenaustauschharz gebunden ist/sind.
Der "Zwischenpuffer" wird verwendet, um eine oder mehrere Verunreingungen aus dem Ionenaustauschharz zu eluieren, bevor das Polypeptidmolekül von Interesse eluiert wird. Die Leitfähigkeit und/oder der pH des Zwischenpuffers ist bzw. sind so beschaffen, dass die Verunreinigung aus dem Ionenaustauschharz eluiert wird, aber keine signifikanten Mengen des Polypeptids von Interesse.
Der Begriff "Waschpuffer" bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf einen Puffer, der verwendet wird, um das Ionenaustauschharz zu waschen oder erneut zu äquilibrieren, bevor das Polypeptidmolekül von Interesse eluiert wird. Zweckmäßigerweise können der Waschpuffer und der Ladepuffer gleich sein, was aber nicht erforderlich ist.
Der "Elutionspuffer" wird verwendet, um das Polypeptid von Interesse aus der Festphase zu eluieren. Die Leitfähigkeit und/oder der pH ist bzw. sind so beschaffen, dass das Polypeptid von Interesse aus dem Ionenaustauschharz eluiert wird. Ein "Regenerationspuffer" kann verwendet werden, um das Ionenaustauschharz zu regenerieren, so dass es wiederverwendet werden kann. Der Regenerationspuffer hat eine Leitfähigkeit und/oder einen pH, wie sie erforderlich sind, um im Wesentlichen alle Verunreinigungen und das Polypeptid von Interesse aus dem Ionenaustauschharz zu entfernen.
Der Begriff "Leitfähigkeit" bezieht sich auf die Fähigkeit einer wässrigen Lösung, elektrischen Strom zwischen zwei Elektroden zu leiten. In Lösung fließt Strom durch Ionentransport. Daher hat die Lösung eine höhere Leitfähigkeit, wenn eine zunehmende Menge an Ionen in der wässrigen Lösung vorhanden ist. Die Messeinheit für die Leitfähigkeit ist mmhos (mS/cm) und sie kann unter Verwendung eines Leitfähigkeitsmessers gemessen werden, der beispielsweise von Orion verkauft wird. Die Leitfähigkeit einer Lösung kann geändert werden, indem die Ionenkonzentration darin verändert wird. Beispielsweise kann die Konzentration eines Puffermittels und/oder die Konzentration eines Salzes (z.B. NaCl oder KCl) in der Lösung geändert werden, um die gewünschte Leitfähigkeit zu erzielen. Vorzugsweise wird, wie im nachstehenden Beispiel, die Salzkonzentration der verschiedenen Puffer modifiziert, um die gewünschte Leitfähigkeit zu erzielen.
Mit "Reinigen" eines Polypeptids aus einer Zusammensetzung, die das Polypeptid und eine oder mehrere Verunreinigungen enthält, ist gemeint, dass der Reinheitsgrad des Polypeptids in der Zusammensetzung erhöht wird, indem zumindest eine Verunreinigung aus der Zusammensetzung (vollständig oder teilweise) beseitigt wird. Ein "Reinigungsschritt" kann Teil eines Gesamt-Reinigungsverfahrens sein, das eine "homogene" Zusammensetzung ergibt, womit hierin eine Zusammensetzung gemeint ist, die zumindest etwa 70 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorzugsweise zumindest etwa 80 Gew.-%, des Polypeptids von Interesse umfasst.
Wenn nicht anders angegeben bezeichnet der Begriff "HER2", wenn er gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird, Human-HER2-Protein, und "HER2" bezeichnet Human-HER2-Gen. Das Human-HER2-Gen und HER2-Protein werden beispielsweise von Semba et al., PNAS (USA) 82, 6497-6501 (1985), und von Yamamoto et al., Nature 319, 230-234 (1986), beschrieben (Genebank-Hinterlegungsnr. X03363).
Der Begriff "humMAb4D5-8" bezieht sich, wenn er hierin verwendet wird, auf einen humanisierten Anti-HER2-Antikörper, der die Leichtketten-Aminosäuresequenz von Seq.-ID-Nr.: 1 und die Schwerketten-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder Aminosäuresequenzvarianten davon umfasst, die die Fähigkeit beibehalten, HER2 zu binden und das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen, die HER2 überexprimieren (siehe US-Patent Nr. 5.677.171; hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen).
Mit "pl" oder "isoelektrischer Punkt" eines Polypeptids ist der pH gemeint, bei dem die positive Ladung des Polypeptids seine negative Ladung ausgleicht. Der pl kann aus der Nettoladung der Aminosäurereste des Polypeptids berechnet oder durch isoelektrisches Fokussieren bestimmt werden (beispielsweise unter Verwendung der CSx-Chromatographie wie im nachstehenden Beispiel).
Mit "Bindung" eines Moleküls an ein Ionenaustauschmaterial ist gemeint, dass das Molekül dem Ionenaustauschmaterial unter geeigneten Bedingungen (pH/Leitfähig keit) ausgesetzt wird, damit das Molekül aufgrund ionischer Wechselwirkungen zwischen dem Molekül und einer oder mehreren geladenen Gruppen des Ionenaustauschmaterials reversibel in oder auf dem Ionenaustauschmaterial immobilisiert wird.
Mit "Waschen" des Ionenaustauschmaterials ist gemeint, das ein geeigneter Puffer durch oder über das Ionenaustauschmaterial geleitet wird.
Mit "Eluieren" eines Moleküls (z.B. eines Polypeptids oder einer Verunreinigung) aus einem Ionenaustauschmaterial ist gemeint, dass das Molekül daraus entfernt wird, indem die Ionenstärke des Puffers verändert wird, der das Ionenaustauschmaterial umgibt, so dass der Puffer mit dem Molekül um die geladenen Stellen auf dem Ionenaustauschmaterial konkurriert.
"Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Zu denen, die Behandlung benötigen, gehören sowohl jene, die die Störung bereits aufweisen, als auch jene, bei denen die Störung verhindert werden soll. Eine "Störung" ist jeder Zustand, der durch die Behandlung mit dem wie hierin beschrieben gereinigten Polypeptid verbessert würde. Dazu gehören chronische und akute Störungen oder Erkrankungen einschließlich jener pathologischen Zustände, durch die das Säugetier für die fragliche Störung prädisponiert ist.
Das Wort "Markierung" bezieht sich, wenn es gemäß vorliegender Erfindung verwendet wird, auf eine detektierbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an das Polypeptid konjugiert ist. Die Markierung kann selbst detektierbar sein (z.B. Radioisoptopmarkierungen oder Fluoreszenzmarkierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Veränderungen einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren, die detektierbar ist.
Der Begriff "zytotoxisches Mittel" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Begriff soll radioaktive Isotope (z.B. ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y und ¹⁸⁶Re), Chemotherapiemittel und Toxine, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine mit Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierursprung oder Fragmente davon umfassen.
Ein "Chemotherapiemittel" ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für Chemotherapiemittel sind Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid ("Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitaxek (TAXOL^TM, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, New Jersey, USA) und Doxetaxel, Toxoter, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincristin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mtimycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstofflosts. Diese Definition umfasst auch hormonelle Mittel, die eine Regulierung oder Hemmung von Hormonwirkung auf Tumore bewirken, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Arten der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung wie in Anspruch 1 definiert bereit. Auch hierin offenbart wird ein Verfahren zur Reinigung eines Polypeptids aus einer Zusammensetzung (z.B. in wässriger Lösung) bereit, die das Polypeptid und eine oder mehrere Verunreinigungen umfasst. Bei der Zusammensetzung handelt es sich im Allgemeinen um eine, die aus der rekombinanten Produktion des Polypeptids resultiert, es kann aber auch eine sein, die aus der Produktion des Polypeptids durch Peptidsynthese (oder andere Synthesemittel) resultiert, oder das Polypeptid kann aus einer nativen Quelle des Polypeptids gereinigt werden. Das Polypeptid ist ein Antikörper, der das HER2-Antigen bindet.
Zur rekombinanten Produktion des Polypeptids wird eine Nucleinsäure, die dafür kodiert, isoliert und zur weiteren Klonierung (Amplifizierung der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert. DNA, die für das Polypeptid kodiert, lässt sich unter Einsatz herkömmlicher Verfahren leicht isolieren (z.B. wenn das Polypeptid ein Antikörper ist, unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten des Antikörpers kodieren). Es sind viele Vektoren verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz (wie beispielsweise in US-Patent Nr. 5.534.615 beschrieben, das hierin durch Verweis speziell aufgenommen ist).
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren gemäß vorliegender Erfindung sind die oben beschriebenen prokaryotischen, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck sind Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Seratia marcescans, und Shigella, sowie Bazillen, wie B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in der am 12. April 1989 veröffentlichten DD 266.710), Pseudomonas, wie P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E. coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), es eignen sich jedoch auch andere Stämme, wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325). Diese Beispiele dienen nicht der Einschränkung, sondern der Veranschaulichung.
Neben Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für die Polypeptid-kodierenden Vektoren. Saccharomyces ceraevisiae oder gemeine Backhefe ist der am häufigsten verwendete der niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Es ist jedoch auch eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und gemäß vorliegender Erfindung nützlich, wie z.B. Schizosaccharomycespombe; Kluyveromyces-Wirte, wie z.B. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa; Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis; und Fadenpilze, wie z.B. neurospora, Penicillium, Tolypocladium und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans und A. niger.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Polypeptid stammen von mehrzelligen Organismen. Beispiele für Zellen von Wirbellosen sind Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche baculovirale Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Moskito), Aedes albopictus (Miskito), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombys mori sind identifiziert worden. Eine Vielzahl viraler Stämme für die Transfektion sind allgemein erhältlich, beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können als Virus gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden, insbesondere für die Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen. Pflanzen-Zellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohnen, Petunien, Tomate und Tabak können ebenfalls als Wirte eingesetzt werden.
Allerdings war das Interesse an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbelzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routine-Verfahren geworden. Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszellenlinien sind mit SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); Human-Embryonierenlinie (293-Zellen oder 293-Zellen, die für das Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden; Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen von afrikanischen Meerkatzen (VERO-76, ATCC CRL-1587), Human-Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Human-Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); Human-Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Milchdrüsentumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen, und eine Human-Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- und Klonierungsvektoren zur Polypeptidproduktion transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die auf angemessene Weise modifiziert sind, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren oder die für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
Die Wirtszellen, die verwendet werden, um das Polypeptid gemäß vorliegender Erfindung zu produzieren, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie Ham's F10 (Sigma); Minimal Essential Medium ((Membran), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) eignen sich zum Kultivieren der Wirtszellen. Außerdem kann als Kulturmedium für die Wirtszellen jedes der in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.9237.762; 4.560.655; oder 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; oder US-Patent Re. 30.985 beschriebenen Medien verwendet werden. Alle diese Medien können nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleotiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. GENTAMYCIN^TM-Arzneimittel), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolekularen Bereich vorhanden sind), und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere erforderliche Ergänzungen können ebenfalls in angemessenen Konzentrationen enthalten sein, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor bei den zur Expression ausgewählten Wirtszellen eingesetzt wurden, und sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar.
Wenn Rekombinationstechniken eingesetzt werden, kann das Polypeptid intrazellulär produziert, in den periplasmatischen Raum oder direkt in das Medium ausgeschieden werden. Wenn das Polypeptid intrazellulär produziert wird, werden in einem ersten Schritt die teilchenförmigen Trümmer, entweder Wirtszellen oder lysierte Zellen (die beispielsweise aus Homogenisierung resultieren) entfernt, beispielsweise durch Zentrifugation oder Ultrafiltration. Wenn das Polypeptid in das Medium ausgeschieden wird, werden Überstände von derartigen Expressionssystemen im Allgemeinen zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters konzentriert, beispielsweise mit einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit.
Das Polypeptid wird dann einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen, einschließlich eines Ionenaustauschchromatographieverfahrens wie hierin offenbart. Beispiele für zusätzliche Reinigungsverfahren, die vor dem, während des oder nach dem Ionenaustauschchromatographieverfahren durchgeführt werden können, sind Fraktionierung durch Hydrophob-Chromatographie (z.B. auf Phenyl-Sepharose), Ethanol-Fällung, isoelektrisches Fokussieren, RP-HPLC, Chromatographie auf Kieselsäure, Chromatographie auf HEPARIN SEPHAROSE^TM, weitere Anionenaustausch-Chromatographie und/oder weitere Kationenaustausch-Chromatographie, Chromatofokussierung, SDS-PAGE, Ammoniumsulfat-Fällung, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie (beispielsweise unter Einsatz von Protein A, Protein G, eines Antikörpers, eines spezifischen Substrats, Liganden oder Antigens als Fänger-Reagens).
Ionenaustausch-Chromatographie wird wie hierin offenbart durchgeführt. Zunächst wird eine Entscheidung getroffen, ob ein Anionen- oder Kationen-Austauschharz einzusetzen ist. Im Allgemeinen kann für Polypeptide mit pl's von über etwa 7 ein Kationenaustauschharz verwendet werden, und für Polypeptide mit pl's von unter etwa 7 kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden.
Das Anionen- oder Kationenaustauschharz wird nach bekannten Verfahren hergestellt. Üblicherweise wird ein Äquilibrierungspuffer durch das Ionenaustauschharz geschickt, bevor die Zusammensetzung, die das Polypeptid und eine oder mehrere Verunreinigungen enthält, auf das Harz geladen wird. Zweckmäßigerweise ist der Äquilibrierungspuffer der gleiche wie der Ladepuffer, das ist aber nicht notwendig.
Die verschiedenen für die Chromatographie verwendeten Puffer hängen beispielsweise davon ab, ob ein Kationen- oder ein Anionenaustauschharz eingesetzt wird. Das wird deutlicher in den Fließbildern der 1 und 2 gezeigt.
Unter spezieller Bezugnahme auf 1, die exemplarische Schritte zeigt, die durchzuführen sind, wenn ein Kationenaustauschharz verwendet wird, werden der pH und/oder die Leitfähigkeit eines jeden Puffers in Bezug auf den vorhergehenden Puffer erhöht, mit Ausnahme des Waschpuffers, wenn die Leitfähigkeit und/oder der pH geringer ist bzw. sind als die Leitfähigkeit und/oder der pH des vorhergehenden Zwischenpuffers. Die wässrige Lösung, die das Polypeptid von Interesse und eine oder mehrere Verunreinigungen umfasst, wird unter Verwendung des Ladepuffers auf das Kationenaustauschharz geladen, der einen solchen pH und/oder eine solche Leitfähigkeit aufweist, dass sich das Polypeptid und die Verunreinigung an das Kationenaustauschharz binden. Wie im nachstehenden Beispiel kann der Ladepuffer eine erste niedrige Leitfähigkeit (beispielsweise von etwa 5,2 bis etwa 6,6 mmhos) aufweisen. Ein exemplarischer pH für den Ladepuffer kann etwa 5,0 betragen (siehe 1). Beispielsweise können von etwa 20 mg/ml bis etwa 35 mg/ml des Polypeptids (z.B. eines Antikörpers voller Länge) auf das Ionenaustauschharz geladen werden.
Das Kationenaustauschharz wird dann mit einem Zwischenpuffer gewaschen, der eine zweite Leitfähigkeit und/oder einen zweiten pH aufweist, um im Wesentlichen die Verunreinigung zu eluieren, nicht aber eine beträchtliche Menge des Polypeptids von Interesse. Das kann erreicht werden, indem die Leitfähigkeit oder der pH oder beide des Zwischenpuffers erhöht werden. Der Wechsel vom Ladepuffer zum Zwischenpuffer kann nach Wunsch stufenweise oder allmählich erfolgen. Im Beispiel gemäß vorliegender Erfindung wies der Zwischenpuffer eine höhere Leitfähigkeit auf als der Ladepuffer (d.h. die Leitfähigkeit des Zwischenpuffers lag im Bereich von etwa 7,3 bis etwa 8,4 mmhos). Alternativ dazu kann, wie in 1 gezeigt, der pH des Zwischenpuffers jenen des Ladepuffers in dieser Ausführungsform der Erfindung übersteigen, worin ein Kationenaustauschharz verwendet wird. Beispielsweise kann der Zwischenpuffer einen pH von etwa 5,4 aufweisen.
Nach dem Waschen mit dem Zwischenpuffer wird das Kationenaustauschharz mit dem Waschpuffer gewaschen oder erneut äquilibriert, der eine Leitfähigkeit und/oder einen pH aufweist, der bzw. die geringer als jene des Zwischenpuffers ist bzw. sind (d.h. die Leitfähigkeit oder der pH oder beides werden in zum vorherigen Schritt entgegengesetzte, d.h. umgekehrte Richtung geändert, anders als bei den Ionenaustauschchromatographieschritten in der Literatur). Im nachstehenden Beispiel wies der Waschpuffer etwa dieselbe Leitfähigkeit auf wie der Ladepuffer (d.h. lag im Bereich von etwa 5,2 bis etwa 6,6 mmhos), und seine Leitfähigkeit war daher geringer als jene des Zwischenpuffers. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Leitfähigkeit des Waschpuffers auf eine Leitfähigkeit geändert werden, die geringer oder größer als jene des Ladepuffers ist, mit der Maßgabe, dass die Leitfähigkeit des Waschpuffers geringer als jene des Zwischenpuffers ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der pH des Waschpuffers geringer als der pH des Zwischenpuffers sein (beispielsweise kann der pH des Waschpuffers etwa 5,0 betragen). Die Änderung der Leitfähigkeit und/oder des pH des Waschpuffers im Vergleich zum Zwischenpuffer kann durch stufenweise oder allmähliche Änderung eines oder beider dieser Parameter geändert werden.
Nach dem Waschschritt des vorhergehenden Absatzes wird das Kationenaustauschharz zum Eluieren des gewünschten Polypeptidmoleküls daraus vorbereitet. Dieses wird erzielt, indem ein Elutionspuffer verwendet wird, der einen solchen pH und/oder eine solche Leitfähigkeit aufweist, dass sich das gewünschte Polypeptid nicht mehr an das Kationenaustauschharz bindet und daher davon eluiert wird. Der pH und/oder die Leitfähigkeit des Elutionspuffers lag im Bereich von etwa 10,0 bis etwa 11,0 mmhos. Alternativ dazu oder zusätzlich kann der pH des Elutionspuffers in Bezug auf den Waschpuffer und den Zwischenpuffer erhöht werden (beispielsweise kann der pH des Elutionspuffers etwa 6,0 betragen). Die Veränderung der Leitfähigkeit und/oder des pH kann nach Wunsch stufenweise oder allmählich erfolgen. Somit wird das gewünschte Polypeptid aus dem Kationenaustausch in diesem Schritt des Verfahrens gewonnen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform umfasst das Ionenaustauschmaterial ein Anionenaustauschharz. Diese Ausführungsform der Erfindung ist herin in 2 dargestellt. Wie in dieser Figur dargestellt, sind die Veränderungen der Leitfähigkeit allgemein wie oben unter Bezugnahme auf das Kationenaustauschharz beschrieben. Die Richtung der Änderung des pH unterscheidet sich bei einem Anionenaustauschharz. Wenn beispielsweise Elution von Verunreinigung(en) und Polypeptid erreicht werden soll, indem der pH verändert wird, hat der Ladepuffer einen ersten pH, und der pH wird im Zwischenpuffer verringert, um die Verunreinigung oder Verunreinigungen zu eluieren. Im dritten Schritt wird die Säule mit dem Waschpuffer gewaschen/erneut äquilibriert, und die Veränderung der Leitfähigkeit oder des pH oder beides erfolgt in entgegengesetzte Richtung zu jener des vorherigen Schritts. Somit kann der pH im Waschpuffer im Vergleich zum Zwischenpuffer erhöht werden. Nach diesem Schritt wird das Polypeptid von Interesse aus dem Anionenaustauschharz unter Verwendung eines Elutionspuffers mit einer vierten Leitfähigkeit und/oder einem vierten pH eluiert. Wenn der pH verändert wird, liegt er normalerweise unter dem den pH des Ladepuffers, des Zwischenpuffers und des Waschpuffers. Die Veränderung des pH und/oder der Leitfähigkeit in aufeinander folgenden Puffern kann, wie oben erklärt, stufenweise oder allmählich erfolgen.
Gemäß einem bevorzugten Verfahren wird ein einzelner Parameter (d.h. entweder Leitfähigkeit oder pH) verändert, um Elution sowohl des Polypeptids als auch der Verunreinigung zu erreichen, während der andere Parameter (d.h. pH bzw. Leitfähigkeit) etwa konstant bleibt. Während sich beispielsweise die Leitfähigkeit der verschiedenen Puffer (Ladepuffer, Zwischenpuffer, Waschpuffer und/oder Elutionspuffer) unterscheiden können, können ihre pHs im Wesentlichen gleich sein.
Gemäß einer optionalen Ausführungsform des Verfahrens wird das Ionenaustauschharz nach der Elution des Polypeptids mit einem Regenerationspuffer regeneriert, so dass die Säule wiederverwendet werden kann. Im Allgemeinen sind die Leitfähigkeit und/oder der pH des Regenerationspuffers so beschaffen, dass im Wesentlichen alle Verunreinigungen und das Polypeptid von Interesse aus dem Ionenaustauschharz eluiert werden. Im Allgemeinen weist der Regenerationspuffer eine sehr hohe Leit fähigkeit auf, um Verunreinigungen und Polypeptid aus dem Ionenaustauschharz zu eluieren.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ist besonders geeignet, um ein Polypeptidmolekül von Interesse gegenüber zumindest einer Verunreinigung aufzulösen, wenn sich die Verunreinigung und das Polypeptidmoleküle von Interesse nur geringfügig in ihrer Ionenladung unterscheiden. Beispielsweise können die pl's des Polypeptids und der Verunreinigung nur "leicht unterschiedlich" sein, beispielsweise können sie sich um nur etwa 0,05 bis etwa 0,2 pl-Einheiten unterscheiden. Im nachstehenden Beispiel konnte dieses Verfahren eingesetzt werden, um einen Anti-HER2-Antikörper mit einem pl von 8,87 gegenüber einer einfach desamidierten Variante davon mit einem pl von 8,79 aufzulösen.
Das nach dem Ionenaustauschchromatographieverfahren gemäß vorliegender Erfindung erhaltene Polypeptid kann, falls erforderlich, zusätzlichen Reinigungsschritten unterzogen werden. Beispiele für weitere Reinigungsschritte sind oben erörtert worden.
Gegebenenfalls wird das Polypeptid nach Wunsch mit einem oder mehreren heterologen Molekülen konjugiert. Das heterologe Molekül kann beispielsweise eines sein, das die Serum-Halbwertszeit des Polypeptids erhöht (beispielsweise Polyethylenglykol, PEG), oder es kann eine Markierung sein (z.B. ein Enzym, eine Fluoreszenzmarkierung und/oder eine Radionuclid) oder ein zytotoxisches Molekül (z.B. ein Toxin, ein Chemotherapiemittel oder ein radioaktives Isotop usw.).
Eine therapeutische Formulierung, die das Polypeptid, gegebenenfalls mit einem heterologen Molekül konjugiert, umfasst, kann hergestellt werden, indem das Polypeptid mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.; 1980)) in Form lyophilisierter Formulierungen oder wässriger Lösungen gemischt wird. "Pharmazeutisch annehmbare" Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie Phosphat, Zitrat und andere organische Säuren; Oxidationshemmer, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsmittel (wie z.B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z.B. Methyl- oder Propylparaben; Brenzkatechin; Resorcin; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (unter etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosacharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Mannose oder Dextrine; Gelierungsmittel, wie z.B. EDTA; Zucker, wie z.B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; Metallkomplexe (z.B. Zn-Protein-Komplex); und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN^TM, PLURO-NICS^TM oder Polyethylenglykol (PEG): Der humMAb4D5-8-Antikörper von besonderem Interesse gemäß vorliegender Erfindung kann als lyophilisierte Formulierung hergestellt werden, beispielsweise wie in der WO97/04801 beschrieben, die ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Die Formulierung gemäß vorliegender Erfindung kann auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, wie für die jeweils behandelte Indikation erforderlich, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die einander nicht negativ beeinflussen. Derartige Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind. Beispielsweise können der Formulierung für einen Anti-HER2-Antikörper ein Chemotherapiemittel, wie z.B. Taxoid oder Tamoxifen, zugegeben werden.
Die Wirkstoffe können auch in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nano-Teilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auf., A. Osol (Hrsg.; 1980) offenbart.
Die zur Verabreichung in vivo zu verwendende Formulierung muss steril sein. Das lässt sich leicht durch Filtration mittels Sterilfiltrationsmembranen erreichen.
Es können Retard-Präparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retard-Präparate sind halbdurchlässige Matrices aus festen hydrophoben Polymeren, die die Polypeptidvariante enthalten, wobei die Matrices in Form von geformten Produkten vorliegen, beispielsweise als Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Retard-Matrices sind Polyester, Hydrogele (beispielsweise Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat), oder Poly(vinylakohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure mit γ-Ethyl-L-glutamat, nichtabbaubares Ethylen-Vinylacetat, abbbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. LUPRON DEPOT^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymeren und Leuprolidacetat bestehen), sowie Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure.
Das wie hierin offenbart gereinigte Polypeptid oder die Zusammensetzung, die das Polypeptid und den pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wird dann für verschiedene diagnostische, therapeutische oder andere Verwendungen eingesetzt, die für solche Polypeptide und Zusammensetzungen bekannt sind. Beispielsweise kann das Polypeptid verwendet werden, um eine Störung in einem Säugetier durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Polypeptids an das Säugetier zu behandeln.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Die Offenbarungen aller Zitate in der Beschreibung sind ausdrücklich durch Verweis hierin aufgenommen.
Beispiel 1
Human-IgG rhuMAb HER2 voller Länge (humAb4D5-8 in Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 89, 4285-4289 (1992), das die Aminosäuresequenz leichter Kette von Seq.-ID-Nr.: 1 und die Aminosäuresequenz schwerer Kette von Seq.-ID-Nr.: 2 umfasst), wurde rekombinant in CHO-Zellen produziert. Nach der Protein-Produktion und Ausscheiden in das Zellkulturmedium wurden die CHO-Zellen durch Tangentialströmungsfiltration (PROSTACK^TM) vom Zellkulturmedium abgetrennt. Dann wurde Protein-A-Chromatographie durchgeführt, indem das "Harvested Cell Culture Fluid" (HCCF; die geerntete Zellkulturflüssigkeit) von den CHO-Zellen direkt auf eine äquilibrierte PROSEP A^TM-Säule (Bioprocessing, Ltd.) aufgebracht wurde.
Nach Protein A-Chromatographie wurde Kationenaustauschchromatographie durchgeführt, indem eine Sulfopropyl-(SP-)SEPHAROSE FAST FLOW^TM-(SPSFF-)Säule (Pharmacia) verwendet wurde, um das gewünschte Anti-HER2-Antikörpermolekül weiter aufzutrennen. Der Chromatographievorgang wurde im Bindungs- und Elutionsmodus durchgeführt.
Die SPSFF-Säule wurde zur Beladung durch aufeinanderfolgende Wäschen mit Regenerationspuffer (0,025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6), gefolgt von Äquilibrierungspuffer (0,025 M MES/50 mM NaCl, pH 5,6) hergestellt. Die Säule wurde mit Protein-A-Pool beladen, eingestellt auf einen pH von 5,60 ± 0,05 und eine Leitfähigkeit von 5,8 ± 0,2 mmhos. Vor der Elution wurde die Säule in drei Schritten gewaschen: (1) Ladepuffer (0,025 M MES/50 mM NaCl, pH 5,6) für mindestens 1 Säulenvolumen; (2) Zwischenpuffer (0,025 M MES/70 mM NaCl, pH 5,6) bis ein Scheitelwert des 280-nm-Peaks erreicht war; und (3) Waschpuffer (0,025 M MES/50 mM NaCl, pH 5,6) für mindestens 1,2 Säulenvolumina. rhuMAb HER2 wurde dann von der Säule mit Elutionspuffer (0,025 M MES/95 mM NaCl, pH 5,6) eluiert. Das 280 nm-Elutionsprofil zeigt eine Schulter am Vorderrand (3). Am Wendepunkt dieser Schulter beginnt das Pooling und wird für weitere 5 Säulenvolumina fortgesetzt. Die Säule wurde dann mit Regenerationspuffer (0,025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6) regeneriert.
Materialien und Verfahren
Säulen- und Ladungsherstellung: Ein SPSFF-Säule in verringertem Maßstab wurde gepackt. Die Abmessungen waren: 27,0 ml Volumen, 1,0 cm Durchmesser und 34,5 cm Betthöhe. Der pH einer Aliquote von Protein-A-Pool wurde mit 1,5 M Tris-Base auf 5,6 titriert. Die Leitfähigkeit des Pools wurde durch Zugabe desselben Volumens an sterilem Wasser zur Injektion (SWFI) verringert.
Chromatographie: Die Chromatographie-Durchgänge für diese Untersuchung wurden mit Pharmacia's UNICORN^TM-FPLC-System durchgeführt. Das Äquilibrieren, die Ladung und die anfänglichen Waschschritte wurden mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 200 cm/h durchgeführt. Alle Chromatographieschritte wurden mit einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 100 cm/h durchgeführt. Die Abfolge der Chromatographieschritte ist in Tabelle 1 definiert. Insgesamt 6 Chromatographie-Durchgänge wurden mit Ladungsdichten von 15, 20, 25, 30, 35 und 40 mg rhuMAb HER2 pro ml SPSFF-Harz durchgeführt. Tabelle 1 – Chromatographieschritte¹

1. Die Äquilibrierung des Harzes wurde im manuellen Modus vorgenommen; die übrigen Schritte wurden mit einem Pharmacia Unicorn-Programm durchgeführt.
2. CV = Säulenvolumen bzw. -volumina

Gesamtprotein: Die Protein-Konzentration einer jeden Chromatographie-Fraktion (Durchfluss, Waschschritte, Elutions-Prepool, Elutionspool und Regeneration) wurden durch spektralphometrische Scans jeder Probe durchgeführt. Die Ergebnisse wurden eingesetzt, um die Produktgewinnungsausbeuten zu berechnen. Der Extinktionskoeffizient für rhuMAb HER2 ist 1,45. Es wurden die folgenden Berechnungen eingesetzt, um die Ergebnisse zu erhalten (4): Proteinkonzentration (mg/ml) = (280 nm/1,45) × Verdünnungsfaktor Proteinmasse (mg) in jeder Fraktion = Proteinkonzentration (mg/ml) × Fraktionsvolumen (ml) Ausbeute (%) = (Fraktionsmasse (mg)/Gesamtmasse (mg)) × 100
Bestimmung von rhuMAb HER2-Antikörpervarianten (Csx HPIEX); Die rhuMAb HER2 SPSFF-Chromatographiesäule löst Antikörpervarianten auf. Fraktionen von jeder der Untersuchungschromatographien wurden durch CSx-HPIEX-Chromatographie auf die relative Menge an Varianten-Antikörper getestet: Eine BAKERBOND WIDE-PORE^TM CSx-NPIEX-Säule (4,6 × 250 mm) wurde mit 1 ml/min bei 55 °C laufen gelassen. Die mobile Phase bestand einem tertiären Gradienten (Tabelle 2).
Tabelle 2 – Gradientenschema
Die Säule wird mit 1 ml/min bei 55 °C laufen gelassen.
Der A-Puffer war 0,025 M MES, pH 5,9; der B-Puffer war 1 M Ammoniumacetat, pH 7,0; und die C-Lösung war steriles Wasser zur Injektion. Die Säule wurde mit dem Anfangszustand des Gradienten (49 % A; 1 % B; und 50 % C) äquilibriert und 200 μl Probe, verdünnt mit SWFI, die < 300 μg Protein enthielt, wurde injiziert. Jedes resultierende Chromatogramm wurde integriert, um die prozentuelle Fläche jedes Peaks für jede Fraktion zu bestimmen (Tabelle 3 und 5).
Tabelle 3 – CSx-HPIEX-Analyse von rhuMAb HER2
Vergleich der Chromatogramme: Die Daten des Absorptionsvermögens (AU 280 nm) aus jeder Chromatographie-Datei wurden aus dem Unicorn ins ASCII-Format exportiert. Die Daten der 0,025 M MES/0,07 M NaCl, pH 5,6-Wäsche wurden ins Excel-Format übersetzt und in KALEIDAGRAPH^TM kopiert. Unter Einsatz von KALEIDA-GRAPH^TM wurden die Waschprofile übereinandergelegt (6) und miteinander verglichen.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Desamidierte und andere saure Varianten von rhuMAb HER2 wurden hergestellt, wenn der Antikörper durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wurde (siehe z.B. CSx-Peaks a, b und l in 5). Die desamidierten und anderen sauren Varianten bildeten etwa 25 % (berechnet als Fläche unter der integrierten Kurve oder dem durch CSx-Chromatographie erhaltenen Profil) der Zusammensetzung, die aus dem anfänglichen Protein-A-Chromatographieschritt erhalten wurde. Es wurde entdeckt, dass das Ionenaustauschverfahren gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden konnte, um die Menge an desamidierten und anderen sauren Varianten in de Anti-HER2-Zusammensetzung beträchtlich zu verringern, d.h. auf etwa 13 % oder weni ger (d.h. die Menge an sauren Varianten im Präparat, das Kationenaustauschchromatographie unterzogen wurde, wie hierin beschrieben, wurde um etwa 50 % oder mehr verringert).
3 zeigt eine Kurve des Absorptionsvermögens in einem Kationenaustauschsäulendurchgang, der wie oben beschrieben durchgeführt wurde. Dieses Verfahren löste eine desamidierte Variante von Anti-HER2-Antikörper auf, die sich nur geringfügig vom nicht desamidierten Anti-HER2-Antikörper unterschied. Die Zunahme der Leitfähigkeit von den Anfangszuständen bis zur Zwischenwäsche begann, den desamidierten Anti-HER2-Antikörper zu eluieren. Es wurde jedoch festgestellt, dass fortgesetztes Waschen bei dieser Leitfähigkeit nicht desamidierten Anti-HER2-Antikörper eluiert, was zu einem Verlust an Produkt führt. Es wurde beobachtet, das direktes Übergehen vom Zwischenpuffer auf den Elutionspuffer entweder zu einer inakzeptabel geringen Entfernung von desamidiertem Anti-HER2-Antikörper aus dem Produkt führte, wenn das Pooling früh begann, oder zu inakzeptabel niedrigen Ausbeuten an Anti-HER2-Antikörperprodukt, wenn das Pooling verzögert wurde, bis der desamidierte Anti-HER2-Antikörper verringert war. Es wurde entdeckt, dass durch das Zurückgehen auf anfänglich eingesetzte geringere Leitfähigkeit die Elution von desamidiertem Anti-HER2-Antikörper ohne nennenswerte Elution von Anti-HER2-Antikörperprodukt fortgesetzt wurde.
Die Auswirkungen von rhuMAb HER2-Ladung auf (a) die Puffer-Anforderungen, (b) die Produktgewinnung im Pool und (c) die Produktqualität im Pool wurde bewertet.
Bei Ladedichten von 15 mg/ml bis zu 35 mg/ml betrug die Produktausbeute im Elutionspool etwa 75 %. Bei der Ladedichte von 40 mg/ml fiel die Produktausbeute im Pool auf 65 % (4). Das verringerte Gewinnung im Pool wird weitgehend auf eine erhöhten Antikörper in den beiden Waschschritten (bei 70 mM NaCl bzw. 50 mM NaCl) zurückgeführt.
Die Qualität von rhMAb HER2 in allen Elutionspools ist äquivalent, wie durch CSx-HPIEX-Analyse ermittelt (5). Im Vergleich zum Ladematerial gibt es eine Anrei cherung des nicht desamidierten Antikörpers (Peak 3), keine Änderung der Menge an Iso-Asp¹⁰²- oder Lys⁴⁵⁰-Antikörper (Peak 4) und eine Reduktion der Menge an desamidiertem Asp³⁰-Antikörper (Peaks a, b, l und andere).
Die Qualität von rhuMab HER2 in diesen Kationenpools wird durch den Zwischenwaschschritt verbessert. Wenn die Masse an rhuMAb HER2, die an das Harz gebunden war, zunahm, musste der Zwischenpuffervolumsverbrauch den Scheitelwert der Verringerungen des 280 nm-Peaks erreichen. Das Puffervolumen, das für eine 40-mg/ml-Ladedichte erforderlich ist, beträgt etwa 2,5 Säulenvolumina. Das Puffervolumen, das für eine 15-mg/ml-Ladedichte erforderlich ist, beträgt etwa 15 Säulenvolumina. Die genaue Zunahme des Puffer-Bedarfs ist bei den stufenweisen 5-mg/ml-Änderungen zwischen diesen beiden Extremen nicht linear. Die größte Zunahme ist zwischen den Ladedichten von 20 mg/ml und 15 mg/ml festzustellen. Hier verdoppelt sich der Bedarf von 7,5 Säulenvolumina auf die zuvor erwähnten 15 Säulenvolumina Puffer. Wenn der Scheitelwert des Peaks bei Wäsche mit 70 mM NaCl erreicht wird, ist die Produktqualität jedoch für alle untersuchten Ladedichten äquivalent.
Durch diese Untersuchung wurde bestimmt, wie viel rhuMAb HER2 auf das SPSFF-Harz geladen werden kann. Zwischen den Bereichen von 15 und 40 mg Antikörper pro ml Harz gibt es keinen Unterschied in der Qualität von im Elutionspool gewonnenem rhuMAb HER2. Die Quantität an gewonnenem rhuMAb HER2 wird jedoch um etwa 10 % verringert, wenn das Harz mit mehr als 35 mg/ml beladen wird. Für eine beständige Ausbeute wird empfohlen, dass 35 mg/ml als Maximumladung für die Herstellung von rhuMAb HER2 festgelegt wird. Weiters wird aufgrund der beträchtlichen Zunahme des 70-mM-NaCl-Waschvolumenbedarfs zwischen 20 und 15 mg/ml empfohlen, dass 20 mg/ml als Minimalbeladung für die Herstellung von rhuMAb HER2 festgelegt werden.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus Anti-HER2-Antikörper und einer oder mehreren sauren Varianten davon, worin die Menge der sauren Variante(n) weniger als etwa 25 % beträgt, und worin die saure(n) Variante(n) vorwiegend desamidierte Varianten sind, worin ein oder mehrere Asparaginreste des Anti-HER2-Antikörpers desamidiert wurden, und worin der Anti-HER2-Antikörper humMAb4D5-8 ist, und worin in den desamidierten Varianten Asn30 in CDR1 einer der beiden oder beider V_L-Regionen von humMAb4D5-8 zu Aspartat geändert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Menge der sauren Variante(n) weniger als etwa 20 % beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Menge der sauren Variante(n) weniger als etwa 13 % beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin die Menge der sauren Variante(n) im Bereich von etwa 1 bis 18 % liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Anti-HER2-Antikörper die Leichtketten-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 1 und die Schwerketten-Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.