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CN102076355B - 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 Download PDF

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CN102076355B CN200980125167.8A CN200980125167A CN102076355B CN 102076355 B CN102076355 B CN 102076355B CN 200980125167 A CN200980125167 A CN 200980125167A CN 102076355 B CN102076355 B CN 102076355B
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Abstract

本发明涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白，制备方法，和具体而言涉及其在疾病预防、诊断和/或治疗中的用途。

Description

双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
相关申请参考
本申请是非临时性申请，要求于2008年4月29日提交的美国临时申请系列号61/125,834、于2008年7月8日提交的美国临时申请系列号61/134,283、于2008年10月23日提交的美国临时申请系列号61/197,191、以及于2008年11月12日提交的美国临时申请系列号61/199,009的优先权，其内容在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白、制备方法、和具体而言涉及其在诊断、预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病、癌症及其他疾病中的用途。
发明背景
工程改造的蛋白，例如能够结合2种或更多抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。
基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术(参见Milstein，C.和A.C.Cuello(1983)Nature，305(5934)：第537-40页)生产了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体(mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产品的存在和显著减少的产物得率意味着需要复杂的纯化程序。
双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来生产(参见，Staerz，U.D.，等人(1985)，Nature 314(6012)：第628-31页)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(参见Brennan，M.，等人(1985)，Science 229(4708)：第81-3页)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(参见Glennie，M.J.，等人(1987)，J Immunol 139(7)：第2367-75页)。但这种方法产生Fab’2片段，而不是全IgG分子。
已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(参见Kriangkum，J.，等人(2001)，Biomol Eng 18(2)：第31-40页)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的2个单链Fv(scFv)片段开始(参见Economides，A.N.，等人(2003)，Nat Med 9(1)：第47-52页)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的简单形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段和接头具有最高达63个残基的长度(参见Nakanishi，K.，等人(2001)，Annu Rev Immunol19：第423-74页)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠规程或哺乳动物表达系统的使用常规应用于生产可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对CD28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(参见Gracie，J.A.，等人(1999)，J Clin Invest.104(10)：第1393-401页)。在这个构建体中，2个scFv分子通过CH1接头进行连接，且得到最高达100mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有变化长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。少数研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung，B.P.，等人(2000)，J Immunol 164(12)：第6495-502页；Ito，A.，等人(2003)，J Immunol 170(9)：第4802-9页；Karni，A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125(1-2)：第134-40页)。在另一个近期研究中，包含长度为3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv谱(repertoire)噬菌体展示，用于富集以可溶和活性形式在细菌中生产的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv分子(参见Arndt，M.和J.Krauss(2003)，Methods Mol Biol207：第305-21页)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分子可以以活性形式在细菌中表达。
双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段生产双抗体(参见Peipp，M.和T.Valerius(2002)，Biochem Soc Trans 30(4)：第507-11页)。接头尺寸的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对促进2条多肽链的二聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来生产，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已生产了大量品种繁多的不同双特异性双抗体，并且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack，M.，等人(1995)，Proc NatlAcad Sci USA 92(15)：第7021-5页)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单个细胞内表达，所以可以生产无活性同二聚体连同活性异二聚体。这使另外纯化步骤的执行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的一种方法是结进孔(knob-into-hole)双抗体的生产(参见Holliger，P.，T.Prospero和G.Winter(1993)，Proc Natl AcadSci USA 90(14)：第6444-8.18页)。该方法对于针对HER2和CD3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用Trp交换Leu45将大结引入VH结构域内，且在抗HER2或抗CD3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的生产可以从经由亲本双抗体的72％增至经由结进孔双抗体的超过90％。重要的是，作为这些突变的结果生产得率只有轻微减少。然而，对于几种构建体观察到抗原结合活性的减少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异二聚分子的那些突变。此外，此类方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性增加、体内稳定性差、以及不希望有的药物代谢动力学。
单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(参见Holliger，P.和G.Winter(1997)，Cancer ImmunolImmunother 45(3-4)：第128-30页；Wu，A.M.，等人(1996)，Immunotechnology 2(1)：第21-36页)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约15个氨基酸残基。因此，分子量对应于单体单链双抗体(50-60kDa)的所有分子都是双特异性的。几项研究已证明双特异性单链双抗体在细菌中以可溶和活性形式表达，其中大多数纯化的分子呈现为单体(参见Holliger，P.和G.Winter(1997)，Cancer Immunol Immunother45(3-4)：第128-30页；Wu，A.M.，等人(1996)Immunotechnol.2(1)：第21-36页；Pluckthun，A.和P.Pack(1997)Immunotechnol.3(2)：第83-105页；Ridgway，J.B.，等人(1996)，Protein Engin.9(7)：第617-21页)。因此，单链双抗体组合了串联scFvs(所有单体都是双特异性的)和双抗体(在细菌中可溶性表达)的优点。
更近地，双抗体已与Fc融合以产生更Ig样的分子，称为双-双抗体(di-diabodies)(参见Lu，D.，等人(2004)，J Biol Chem 279(4)：第2856-65页)。此外，已描述了在IgG重链中包含2个Fab重复且能够结合4个抗原分子的多价抗体构建体(参见WO 0177342A1，和Miller，K.，等人(2003)，J Immunol 170(9)：第4854-61页)。
本领域需要能够结合2种或更多抗原的改良的多价结合蛋白。美国专利申请系列号11/507,050提供了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族，其被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)。本发明提供能够结合2种或更多抗原的另外的新结合蛋白。
发明概述
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价结合蛋白。本发明提供了能够以高亲和力结合2种或更多抗原的结合蛋白新家族。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多肽链的结合蛋白，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区和n是0或1。在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是重链可变结构域。在另一个实施方案中，重链可变结构域选自鼠重链可变结构域、人重链可变结构域、CDR嫁接的重链可变结构域、和人源化重链可变结构域。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合不同抗原。在另一个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，X1是接头，条件是X1不是CH1。例如，X1是选择下述的接头：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ IDNO：5)；RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQID NO：26)。在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区。
在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是轻链可变结构域。在一个实施方案中，轻链可变结构域选自鼠轻链可变结构域、人轻链可变结构域、CDR嫁接的轻链可变结构域、和人源化轻链可变结构域。在一个实施方案中，VD1和VD2能够结合相同抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2能够结合不同抗原。在一个实施方案中，C是轻链恒定结构域。在另一个实施方案中，X1是接头，条件是X1不是CL1。在一个实施方案中，X1是选择下述的接头：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ IDNO：5)；RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQID NO：26)。在一个实施方案中，结合蛋白不包含X2。
在一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含相同接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链包含不同接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含短(约6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含长(多于6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链包含短接头而可变轻链包含长接头。在另一个实施方案中，可变重链包含长接头而可变轻链包含短接头。
在一个实施方案中，此处公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含2条多肽链的结合蛋白，其中所述第一条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且所述第二条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。在具体实施方案中，双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含4条多肽链，其中首先2条多肽链分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且其次2条多肽链分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。此种双重可变结构域(DVD)蛋白具有4个抗原结合部位。
在另一个实施方案中，此处公开的结合蛋白能够结合一种或多种靶。在一个实施方案中，靶选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。在另一个实施方案中，结合蛋白能够调节一种或多种靶的生物学功能。在另一个实施方案中，结合蛋白能够中和一种或多种靶。本发明的结合蛋白能够结合选自淋巴因子、单核因子、多肽激素、受体或肿瘤标记的细胞因子。例如，本发明的DVD-Ig能够结合下述的两种或更多种：CD-20、CD-19、CD-80、CD-22、CD-40、CD-3、人表皮生长因子受体2(HER-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素样生长因子1，2(IGF1，2)、胰岛素样生长因子受体(IGF1R)、巨噬细胞刺激蛋白受体酪氨酸激酶(RON)、肝细胞生长因子(HGF)、间充质-上皮过渡因子(c-MET)、血管内皮生长因子(VEGF)、果蝇Delta同源物4(Drosophila Deltahomologue 4)(DLL4)、神经毡蛋白1(NRP1)、胎盘生长因子(PLGF)、v-erb-b2禽类成红细胞白血病病毒癌基因同源物3(ErbB3)(也见表2)。在具体实施方案中，结合蛋白能够结合选自下述的靶对：CD20和CD19；CD20和CD80；CD20和CD22；CD20和CD40；CD3和HER-2；CD-3和CD-19；EGFR和HER-2；EGFR和CD-3；EGFR和IGF1，2；EGFR和IGF1R；EGFR和RON；EGFR和HGF；EGFR和c-MET；HER-2和IGF1，2；HER-2和IGF1R；RON和HGF；VEGF和EGFR；VEGF和HER-2；VEGF和CD-20；VEGF和IGF1，2；VEGF和DLL4；VEGF和HGF；VEGF和RON；VEGF和NRP1；CD-20和CD3；DLL-4和PLGF；VEGF和PLGF；ErbB3和EGFR；ErbB3和HGF；HER-2和ErbB3；c-Met和ErB3；PLGF和HER-2；HER-2和HER-2。
在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-19的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.101的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQID NO.100和SEQ ID NO.102的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-19的结合蛋白包含SEQ ID NO.99的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.100的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-19的结合蛋白具有反向方向(reverseorientation)，并包含SEQ ID NO.101的DVD重链氨基酸序列和SEQ IDNO.102的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.105的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.106的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含SEQID NO.103的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.104的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.105的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.106的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-80的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.109的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.108和SEQ ID NO.110的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-80的结合蛋白包含SEQ ID NO.107的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.108的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-80的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.109的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.110的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-22的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.113的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.114的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-22的结合蛋白包含SEQ ID NO.111的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.112的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-22的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.113的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.114的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-40的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.117的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.118的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-40的结合蛋白包含SEQ ID NO.115的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.116的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-20和CD-40的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.117的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.118的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.121的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.120和SEQ ID NO.122的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.119的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.120的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.121的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.122的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和CD-19的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.123和SEQ ID NO.125的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.124和SEQ ID NO.126的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和CD-19的结合蛋白包含SEQID NO.123的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.124的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.1)和CD-19的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.125的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.126的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.127和SEQ ID NO.129的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.130的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.127的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.128的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.129的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.130的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.133的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.132和SEQ ID NO.136的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.131的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.132的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和CD-3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.133的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.134的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1，2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.135和SEQ ID NO.137的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.136和SEQ ID NO.138的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1，2的结合蛋白包含SEQ ID NO.135的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.136的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF 1，2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.137的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.138的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.139和SEQ ID NO.140的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.141和SEQ ID NO.142的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.139的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.140的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.141的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.142的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.143和SEQ ID NO.145的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.144和SEQ ID NO.146的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.143的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.144的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.145的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.146的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.147和SEQ ID NO.149的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.148和SEQ ID NO.150的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.147的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.148的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.149的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.150的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.151和SEQ ID NO.153的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.152和SEQ ID NO.154的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.151的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.152的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.153的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.154的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.157的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.158的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.155的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.156的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.157的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.158的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.159和SEQ ID NO.161的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.162的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.159的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.160的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.161的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.162的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.165的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.164和SEQ ID NO.166的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.163的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.164的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.165的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.166的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.169的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.168和SEQ ID NO.170的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.167的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.168的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.169的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.170的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.173的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.174的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.171的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.172的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.173的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.174的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.177的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.176和SEQ ID NO.178的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.175的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.176的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.177的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.178的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.179和SEQ ID NO.181的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.180和SEQ ID NO.182的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.179的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.180的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.181的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.182的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.183和SEQ ID NO.185的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.184和SEQ ID NO.186的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.183的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.184的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.185的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.186的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.187和SEQ ID NO.189的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.188和SEQ ID NO.190的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.187的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.188的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.189的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.190的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.191和SEQ ID NO.193的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.192和SEQ ID NO.194的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.191的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.192的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.193的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.194的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.195和SEQ ID NO.197的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.196和SEQ ID NO.198的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.195的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.196的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.197的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.198的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.199和SEQ ID NO.201的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.200和SEQ ID NO.201的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.199的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.200的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.201的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.202的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.203和SEQ ID NO.205的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.204和SEQ ID NO.206的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.203的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.204的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.205的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.206的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.207和SEQ ID NO.209的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.210的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白包含SEQ ID NO.207的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.208的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.209的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.210的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.211和SEQ ID NO.213的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.212和SEQ ID NO.214的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含SEQ ID NO.211的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.212的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF 1，2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.213的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.214的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF1R的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.215和SEQ ID NO.217的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.216和SEQ ID NO.218的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF1R的结合蛋白包含SEQ ID NO.215的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.216的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和IGF1R的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.217的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.218的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合RON(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.219和SEQ ID NO.221的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.220和SEQ ID NO.222的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合RON(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.219的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.220的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合RON(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.221的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.222的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.223和SEQ ID NO.225的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.224和SEQ ID NO.226的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.223的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.224的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和EGFR(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.225的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.226的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.227和SEQ ID NO.229的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.228和SEQ ID NO.230的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.227的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.228的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.229的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.230的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和CD-20的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.231和SEQ ID NO.233的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.232和SEQ ID NO.234的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和CD-20的结合蛋白包含SEQ ID NO.231的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.232的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和CD-20的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.233的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.234的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.235和SEQ ID NO.237的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.236和SEQ ID NO.238的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含SEQ ID NO.235的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.236的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.237的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.238的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.239和SEQ ID NO.241的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.240和SEQ ID NO.242的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.239的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.240的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.241的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.242的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.243和SEQ ID NO.245的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.244和SEQ ID NO.246的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.243的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.244的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.245的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.246的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.247和SEQ ID NO.249的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.248和SEQ ID NO.250的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.247的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.248的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.249的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.250的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.251和SEQ ID NO.253的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.252和SEQ ID NO.254的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.251的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.252的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.253的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.254的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.255和SEQ ID NO.257的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.256和SEQ ID NO.258的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.255的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.256的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.257的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.258的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.259和SEQ ID NO.261的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.260和SEQ ID NO.262的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.259的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.260的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.261的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.262的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和NRP1(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.263和SEQ ID NO.265的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.264和SEQ ID NO.266的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和NRP1(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.263的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.264的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和NRP1(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.265的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.266的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.267和SEQ ID NO.269的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.268和SEQ ID NO.270的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.267的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.268的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.269的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.270的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.271和SEQ ID NO.273的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.272和SEQ ID NO.274的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.271的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.272的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.273的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.274的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.275和SEQ ID NO.277的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.276和SEQ ID NO.278的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.275的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.276的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合RON(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.277的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.278的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.279和SEQ ID NO.281的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.280和SEQ ID NO.282的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.279的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.280的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HER-2(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.281的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.282的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.283和SEQ ID NO.285的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.284和SEQ ID NO.286的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和CD-3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.283的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.284的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和CD-3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.285的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.286的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1R的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.287和SEQ ID NO.289的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.288和SEQ ID NO.290的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1R的结合蛋白包含SEQ ID NO.287的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.288的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1R的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.289的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.290的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.291和SEQ ID NO.293的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.292和SEQ ID NO.294的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.291的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.292的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.293的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.294的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.295和SEQ ID NO.297的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.296和SEQ ID NO.298的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.295的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.296的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和RON(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.297的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.298的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.299和SEQ ID NO.301的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.300和SEQ ID NO.302的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.299的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.300的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和HGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.301的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.302的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.303和SEQ ID NO.305的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.304和SEQ ID NO.306的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白包含SEQ ID NO.303的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.304的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和c-MET的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.305的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.306的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.307和SEQ ID NO.309的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.308和SEQ ID NO.310的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.307的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.308的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.309的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.310的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合NRP1(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.311和SEQ ID NO.313的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.312和SEQ ID NO.314的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合NRP1(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.311的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.312的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合NRP1(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.313的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.314的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-20的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.315和SEQ ID NO.317的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.316和SEQ ID NO.318的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-20的结合蛋白包含SEQID NO.315的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.316的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-20的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.317的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.318的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.319和SEQ ID NO.321的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.320和SEQ ID NO.322的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.319的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.320的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和HER-2(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.321的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.322的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-19的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.323和SEQ ID NO.325的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.324和SEQ ID NO.326的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-19的结合蛋白包含SEQID NO.323的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.324的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和CD-19的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.325的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.326的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.327和SEQ ID NO.329的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.328和SEQ ID NO.330的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.327的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.328的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.329的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.330的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.331和SEQ ID NO.333的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.332和SEQ ID NO.334的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.331的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.332的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合CD-3(seq.2)和EGFR(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.333的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.334的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.335和SEQ ID NO.337的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.336和SEQ ID NO.338的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白包含SEQ ID NO.335的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.336的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和IGF1，2的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.337的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.338的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合DLL-4(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.339和SEQ ID NO.341的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.340和SEQ ID NO.342的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合DLL-4(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.339的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.340的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合DLL-4(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.341的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.342的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.343和SEQ ID NO.345的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.344和SEQ ID NO.346的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.343的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.344的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.345的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.346的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.347和SEQ ID NO.349的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.348和SEQ ID NO.350的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.347的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.348的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.349的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.350的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.351和SEQ ID NO.353的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.352和SEQ ID NO.354的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.351的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.352的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.353的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.354的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.355和SEQ ID NO.357的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.356和SEQ ID NO.358的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.355的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.356的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.357的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.358的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.359和SEQ ID NO.361的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.360和SEQ ID NO.362的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.359的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.360的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.361的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.362的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.363和SEQ ID NO.365的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.364和SEQ ID NO.366的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.363的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.364的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.365的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.366的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.367和SEQ ID NO.369的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.368和SEQ ID NO.370的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.367的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.368的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.369的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.370的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.371和SEQ ID NO.373的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.372和SEQ ID NO.374的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.371的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.372的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.373的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.374的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.375和SEQ ID NO.377的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.376和SEQ ID NO.378的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.375的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.376的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.377的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.378的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.379和SEQ ID NO.381的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.380和SEQ ID NO.382的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.379的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.380的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.381的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.382的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.383和SEQ ID NO.385的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.384和SEQ ID NO.386的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.383的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.384的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.385的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.386的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.387和SEQ ID NO.389的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.388和SEQ ID NO.390的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.387的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.388的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.389的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.390的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.391和SEQ ID NO.393的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.392和SEQ ID NO.394的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.391的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.392的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.393的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.394的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.395和SEQ ID NO.397的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.396和SEQ ID NO.398的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.395的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.396的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.397的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.398的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.399和SEQ ID NO.401的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.400和SEQ ID NO.402的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.399的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.400的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.401的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.402的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.403和SEQ ID NO.405的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.404和SEQ ID NO.406的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.403的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.404的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.405的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.406的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.407和SEQ ID NO.409的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.408和SEQ ID NO.410的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.407的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.408的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.409的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.410的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.411和SEQ ID NO.413的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.412和SEQ ID NO.414的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.411的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.412的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.413的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.414的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.415和SEQ ID NO.417的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.416和SEQ ID NO.418的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.415的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.416的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.417的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.418的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.419和SEQ ID NO.421的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.420和SEQ ID NO.422的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.419的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.420的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.421的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.422的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.423和SEQ ID NO.425的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.424和SEQ ID NO.426的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.423的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.424的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.425的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.426的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.427和SEQ ID NO.429的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.428和SEQ ID NO.430的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.427的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.428的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.429的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.430的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.431和SEQ ID NO.433的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.432和SEQ ID NO.434的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.431的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.432的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.433的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.434的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.435和SEQ ID NO.437的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.436和SEQ ID NO.438的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.435的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.436的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.437的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.438的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.439和SEQ ID NO.441的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.440和SEQ ID NO.442的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.439的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.440的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.441的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.442的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.443和SEQ ID NO.445的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.444和SEQ ID NO.446的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.443的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.444的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.445的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.446的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.447和SEQ ID NO.449的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.448和SEQ ID NO.450的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.447的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.448的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.449的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.450的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.451和SEQ ID NO.453的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.452和SEQ ID NO.454的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.451的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.452的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.453的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.454的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.455和SEQ ID NO.457的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.456和SEQ ID NO.458的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.455的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.456的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.457的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.458的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.459和SEQ ID NO.461的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.460和SEQ ID NO.462的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.459的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.460的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.461的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.462的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.463和SEQ ID NO.465的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.464和SEQ ID NO.466的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.463的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.464的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.465的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.466的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.467和SEQ ID NO.469的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.468和SEQ ID NO.470的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.467的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.468的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.469的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.470的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.471和SEQ ID NO.473的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.472和SEQ ID NO.474的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.471的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.472的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.473的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.474的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.475和SEQ ID NO.477的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.476和SEQ ID NO.478的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.475的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.476的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.477的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.478的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.479和SEQ ID NO.481的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.480和SEQ ID NO.482的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.479的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.480的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.481的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.482的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.483和SEQ ID NO.485的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.484和SEQ ID NO.486的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.483的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.484的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.485的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.486的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.487和SEQ ID NO.489的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.488和SEQ ID NO.490的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.487的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.488的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.489的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.490的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.491和SEQ ID NO.493的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.492和SEQ ID NO.494的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.491的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.492的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.493的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.494的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.495和SEQ ID NO.497的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.496和SEQ ID NO.498的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.495的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.496的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.497的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.498的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.499和SEQ ID NO.501的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.500和SEQ ID NO.502的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.499的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.500的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.501的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.502的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.503和SEQ ID NO.505的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.504和SEQ ID NO.506的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.503的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.504的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.505的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.506的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.507和SEQ ID NO.509的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.508和SEQ ID NO.510的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.507的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.508的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.509的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.510的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.511和SEQ ID NO.513的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.512和SEQ ID NO.514的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.511的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.512的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.513的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.514的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.515和SEQ ID NO.517的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.516和SEQ ID NO.518的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.515的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.516的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.517的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.517的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.519和SEQ ID NO.521的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.520和SEQ ID NO.522的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.519的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.520的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.521的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.522的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.523和SEQ ID NO.525的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.524和SEQ ID NO.526的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.523的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.524的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.525的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.526的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.527和SEQ ID NO.529的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.528和SEQ ID NO.530的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.527的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.528的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.529的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.530的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.531和SEQ ID NO.533的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.532和SEQ ID NO.534的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.531的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.532的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.533的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.534的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.535和SEQ ID NO.537的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.536和SEQ ID NO.538的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.535的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.536的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.537的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.538的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.539和SEQ ID NO.541的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.540和SEQ ID NO.542的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.539的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.540的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.541的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.542的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.543和SEQ ID NO.545的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.544和SEQ ID NO.546的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.543的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.544的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.545的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.546的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.547和SEQ ID NO.549的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.548和SEQ ID NO.550的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.547的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.548的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.549的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.550的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.551和SEQ ID NO.553的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.552和SEQ ID NO.554的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.551的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.552的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.553的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.554的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.555和SEQ ID NO.557的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.556和SEQ ID NO.558的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.555的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.556的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.557的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.558的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.559和SEQ ID NO.561的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.560和SEQ ID NO.562的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.559的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.560的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.561的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.562的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.563和SEQ ID NO.565的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.564和SEQ ID NO.566的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.563的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.564的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.565的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.566的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.567和SEQ ID NO.569的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.568和SEQ ID NO.570的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.567的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.568的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.569的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.570的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.571和SEQ ID NO.573的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.572和SEQ ID NO.574的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.571的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.572的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.573的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.574的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.575和SEQ ID NO.577的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.576和SEQ ID NO.578的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.575的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.576的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.577的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.578的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.579和SEQ ID NO.581的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.580和SEQ ID NO.582的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.579的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.580的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.581的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.582的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.583和SEQ ID NO.585的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.584和SEQ ID NO.586的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.583的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.584的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.585的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.586的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.587和SEQ ID NO.589的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.588和SEQ ID NO.590的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.587的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.588的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.589的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.590的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.591和SEQ ID NO.593的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.592和SEQ ID NO.594的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白包含SEQ ID NO.591的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.592的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和DLL-4(seq.4)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.593的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.594的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.595和SEQ ID NO.597的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.596和SEQ ID NO.598的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.595的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.596的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.597的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.598的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.599和SEQ ID NO.601的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.600和SEQ ID NO.602的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.599的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.600的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.601的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.602的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.603和SEQ ID NO.605的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.604和SEQ ID NO.606的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.603的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.604的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.605的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.606的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.607和SEQ ID NO.609的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.608和SEQ ID NO.610的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.607的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.608的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.609的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.610的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.611和SEQ ID NO.613的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.612和SEQ ID NO.614的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.611的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.612的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.613的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.614的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.615和SEQ ID NO.617的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.616和SEQ ID NO.618的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.615的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.616的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.617的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.618的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.619和SEQ ID NO.621的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.622和SEQ ID NO.624的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.619的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.620的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.621的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.622的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.623和SEQ ID NO.625的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.624和SEQ ID NO.626的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.623的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.624的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.625的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.626的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.627和SEQ ID NO.629的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.628和SEQ ID NO.630的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.627的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.628的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.629的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.630的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.631和SEQ ID NO.633的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.632和SEQ ID NO.634的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.631的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.632的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.633的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.634的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.635和SEQ ID NO.637的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.636和SEQ ID NO.638的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.635的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.636的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.637的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.638的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.639和SEQ ID NO.641的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.640和SEQ ID NO.642的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.639的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.640的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.641的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.642的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.643和SEQ ID NO.645的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.644和SEQ ID NO.646的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.643的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.644的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.645的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.646的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.647和SEQ ID NO.649的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.648和SEQ ID NO.650的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.647的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.648的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.649的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.650的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.651和SEQ ID NO.653的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.652和SEQ ID NO.654的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.651的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.652的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.653的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.654的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.655和SEQ ID NO.657的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.656和SEQ ID NO.658的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.655的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.656的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和ErbB3(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.657的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.658的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.659和SEQ ID NO.661的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.660和SEQ ID NO.662的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.659的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.660的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.661的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.662的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.663和SEQ ID NO.665的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.664和SEQ ID NO.666的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.663的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.664的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.665的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.666的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.667和SEQ ID NO.669的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.668和SEQ ID NO.670的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.667的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.668的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.669的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.670的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.671和SEQ ID NO.673的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.672和SEQ ID NO.674的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.671的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.672的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.673的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.674的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.675和SEQ ID NO.677的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.676和SEQ ID NO.678的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.675的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.676的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.677的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.678的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.679和SEQ ID NO.681的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.680和SEQ ID NO.682的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.679的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.680的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.681的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.682的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.683和SEQ ID NO.685的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.684和SEQ ID NO.686的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.683的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.684的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.685的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.686的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.687和SEQ ID NO.689的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.688和SEQ ID NO.690的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.687的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.688的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.689的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.690的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.691和SEQ ID NO.693的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.692和SEQ ID NO.694的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.691的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.692的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.693的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.694的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.695和SEQ ID NO.697的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.696和SEQ ID NO.698的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.695的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.696的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.697的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.698的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.699和SEQ ID NO.701的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.700和SEQ ID NO.702的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.699的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.700的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.701的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.702的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.703和SEQ ID NO.705的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.704和SEQ ID NO.706的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.703的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.704的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.705的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.706的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.707和SEQ ID NO.709的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.708和SEQ ID NO.710的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.707的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.708的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.709的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.710的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.711和SEQ ID NO.713的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.712和SEQ ID NO.714的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.711的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.712的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.713的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.714的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.715和SEQ ID NO.717的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.716和SEQ ID NO.718的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.715的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.716的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.717的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.718的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.719和SEQ ID NO.721的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.720和SEQ ID NO.722的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.719的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.720的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.721的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.722的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.723和SEQ ID NO.725的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.724和SEQ ID NO.726的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.723的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.724的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.725的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.726的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.727和SEQ ID NO.729的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.728和SEQ ID NO.730的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.727的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.728的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.729的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.730的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.731和SEQ ID NO.733的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.732和SEQ ID NO.734的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.731的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.732的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.733的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.734的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.735和SEQ ID NO.737的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.736和SEQ ID NO.738的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.735的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.736的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.737的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.738的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.739和SEQ ID NO.741的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.740和SEQ ID NO.742的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.739的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.740的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.741的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.742的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.743和SEQ ID NO.745的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.744和SEQ ID NO.746的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.743的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.744的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.745的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.746的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.747和SEQ ID NO.749的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.748和SEQ ID NO.750的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.747的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.748的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.749的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.750的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.751和SEQ ID NO.753的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.752和SEQ ID NO.754的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.751的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.752的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.753的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.754的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.755和SEQ ID NO.757的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.756和SEQ ID NO.758的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.755的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.756的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.757的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.758的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.759和SEQ ID NO.761的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.760和SEQ ID NO.762的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.759的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.760的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.761的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.762的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.763和SEQ ID NO.765的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.764和SEQ ID NO.766的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.763的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.764的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.765的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.766的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.767和SEQ ID NO.769的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.768和SEQ ID NO.770的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.767的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.768的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和PLGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.769的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.770的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.771和SEQ ID NO.773的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.772和SEQ ID NO.774的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.771的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.772的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.773的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.774的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.775和SEQ ID NO.777的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.776和SEQ ID NO.778的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.775的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.776的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.777的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.778的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.779和SEQ ID NO.781的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.780和SEQ ID NO.782的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.779的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.780的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.781的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.782的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.783和SEQ ID NO.785的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.784和SEQ ID NO.786的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.783的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.784的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.785的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.786的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.787和SEQ ID NO.789的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.788和SEQ ID NO.790的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.787的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.788的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.789的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.790的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.791和SEQ ID NO.793的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.792和SEQ ID NO.794的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.791的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.792的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.793的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.794的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.795和SEQ ID NO.797的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.796和SEQ ID NO.798的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.795的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.796的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.797的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.798的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.799和SEQ ID NO.801的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.800和SEQ ID NO.802的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.799的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.800的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.801的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.802的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.803和SEQ ID NO.805的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.804和SEQ ID NO.806的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.803的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.804的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.805的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.806的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.807和SEQ ID NO.809的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.808和SEQ ID NO.810的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.807的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.808的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.809的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.810的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.811和SEQ ID NO.813的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.812和SEQ ID NO.814的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.811的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.812的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.813的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.814的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.815和SEQ ID NO.817的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.816和SEQ ID NO.818的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白包含SEQ ID NO.815的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.816的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.817的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.818的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.819和SEQ ID NO.821的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.820和SEQ ID NO.822的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.819的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.820的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.821的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.822的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.823和SEQ ID NO.825的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.824和SEQ ID NO.826的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.823的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.824的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.825的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.826的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.827和SEQ ID NO.829的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.828和SEQ ID NO.830的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.827的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.828的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.829的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.830的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.831和SEQ ID NO.833的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.832和SEQ ID NO.834的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.831的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.832的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.833的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.834的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.835和SEQ ID NO.837的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.836和SEQ ID NO.838的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.835的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.836的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.837的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.838的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.839和SEQ ID NO.841的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.840和SEQ ID NO.842的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.839的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.840的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.841的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.842的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.843和SEQ ID NO.845的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.844和SEQ ID NO.846的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.843的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.844的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.845的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.846的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.847和SEQ ID NO.849的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.848和SEQ ID NO.850的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白包含SEQ ID NO.847的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.848的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ ID NO.849的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.850的DVD轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.851和SEQ ID NO.853的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.852和SEQ ID NO.854的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.851的DVD重链氨基酸序列和SEQ IDNO.852的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.853的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.854的DVD轻链氨基酸序列。
在第二个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.855和SEQ ID NO.857的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.856和SEQ ID NO.858的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.855的DVD重链氨基酸序列和SEQ IDNO.856的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.857的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.858的DVD轻链氨基酸序列。
在第三个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.859和SEQ ID NO.861的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.860和SEQ ID NO.862的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.859的DVD重链氨基酸序列和SEQ IDNO.860的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.861的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.862的DVD轻链氨基酸序列。
在第四个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO.863和SEQ ID NO.865的DVD重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO.864和SEQ ID NO.866的DVD轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白包含SEQ ID NO.863的DVD重链氨基酸序列和SEQ IDNO.864的DVD轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，能够结合HER-2(seq.1)和HER-2(seq.2)的结合蛋白具有反向方向，并包含SEQ IDNO.865的DVD重链氨基酸序列和SEQ ID NO.866的DVD轻链氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在一个实施方案中，Fc区不存在于结合蛋白中。
在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在一个实施方案中，(X2)n不存在于结合蛋白中。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一个和第二个多肽链，其中所述第一个多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二个多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在另一个实施方案中，结合蛋白包含两个第一个多肽链和两个第二个多肽链。在另一个实施方案中，(X2)n不存在于第二个多肽中。在另一个实施方案中，Fc区如果存在于第一个多肽中，则其选自天然序列Fc区和变体序列Fc区。在另一个实施方案中，Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白是能够结合两个抗原、包含四个多肽链的DVD-Ig，其中，第一个和第三个多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二个和第四个多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。
本发明提供通过预选择亲本抗体制备DVD-Ig结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法包含步骤a)获得能够结合第一个抗原的第一个亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得能够结合第二个抗原的第二个亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第一个和第三个多肽链，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；d)构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供生成具有所需特性的能够结合两个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包含步骤a)获得第一个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第一个抗原且具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；b)获得第二个亲本抗体或其抗原结合部分，其能够结合第二个抗原且具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性；c)构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第一个和第三个多肽链，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；d)构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第二个和第四个多肽链，其中VD1是从第一个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二个亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；e)表达所述第一个、第二个、第三个和第四个多肽链；从而生成具有所需特性的能够结合所述第一个和所述第二个抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。
在一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD1是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD1是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，在此公开的第一个和第二个多肽链的VD2是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。
在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是相同抗体。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分与第二个亲本抗体或其抗原结合部分是不同抗体。
在一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，而第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原。在具体实施方案中，第一个和第二个抗原是相同抗原。在另一个实施方案中，亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，第一个和第二个抗原是不同抗原。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，其结合能力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的能力。在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分结合第一个抗原，其结合亲和力不同于第二个亲本抗体或其抗原结合部分结合第二个抗原的亲和力。
在另一个实施方案中，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分选自人抗体、CDR嫁接的抗体(CDR graftedantibody)和人源化抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分选自Fab片段、F(ab’)2片段、包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补性决定区(CDR)、单链抗体和双抗体。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有至少一个由第一个亲本抗体或其抗原结合部分、或第二个亲本抗体或其抗原结合部分表现的所需特性。可替代的，第一个亲本抗体或其抗原结合部分和第二个亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一个由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性。在一个实施方案中，所需特性选自一个或多个抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、能力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用率、组织交叉反应性、以及直向同源抗原结合。在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。此处所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来看需要的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(1)经由细胞比二价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)，所述细胞表达抗体与之结合的抗原；(2)是激动剂抗体；和/或(3)诱导表达多价抗体能够与之结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，经由表达抗体与之结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展示这些特性中的一种或多种中的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的一种或多种，但如此处所述构建为多价结合蛋白时可以赋予这些特性。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或多种靶的结合速率(on rate)常数(Kon)选自：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；和至少约106M-1s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有的结合速率常数(Kon)为102M-1s-1至103M-1s-1；103M-1s-1至104M-1s-1；104M-1s-1至105M-1s-1；或105M-1s-1至106M-1s-1之间。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离速率(off rate)常数(Koff)选自：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；和至多约10-6s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离速率常数(Koff)为10-3s-1-10-4s-1；10-4s-1-10-5s-1；或10-5s-1-10-6s-1。
在另一个实施方案中，结合蛋白具有的对于一种或多种靶的解离常数(KD)选自：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；和至多10-13M。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有的对于其靶的解离常数(KD)为10-7M-10-8M；10-8M-10-9M；10-9M-10-10M；10-10-10-11M；10-11M-10-12M；或10-12-M10-13M。
在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是进一步包含选自下述的试剂的缀合物：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、和生物素。在另一个实施方案中，显像剂是选自下述的放射性标记：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、和153Sm。在另一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂选自抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素、和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是结晶结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，晶体是无载体的药学控释晶体。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白保留生物活性。
在另一个实施方案中，此处所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化模式。
本发明的一个方面涉及编码此处公开的任何一种结合蛋白的分离的核酸。进一步的实施方案提供包含此处公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等人，Nucleic Acids Research2002，第30卷，No.2)；pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT；pEFBOS(Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleic acids Research第18卷，No.17)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO，pEF6TOPO和pBJ。在一个实施方案中，该载体是在美国专利申请系列号61/021,282中公开的载体。
在另一个方面，宿主细胞用此处公开的载体转化。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CHO、COS；NS0、SP2、PER.C6或真菌细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)；或昆虫细胞例如Sf9。
在一个实施方案中，在单个重组宿主细胞中生产例如具有不同特异性的两个或更多个DVD-Ig。例如，已将抗体混合物的表达称为OligoclonicsTM，(Merus B.V.，荷兰)美国专利号7,262,028；7,429,486。
本发明的另一个方面提供了生产此处公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养同样在此处公开的任何一种宿主细胞。在一个实施方案中，通过这种方法生产的50％-75％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，通过这种方法生产的75％-90％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在具体实施方案中，生产的90％-95％的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂，所述制剂又包含如此处公开的结晶结合蛋白和成分，以及至少一种聚合载体。例如，聚合载体是选自下述的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖(polyeaccharides)、掺合物及其共聚物。例如，成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的此处公开的组合物的步骤。
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含如此处公开的结合蛋白和药学可接受的载体。在进一步的实施方案中，药物组合物包含用于治疗病症的至少一种另外的治疗剂。例如，另外的试剂选自：治疗剂，显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)；共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)；粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体)；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂；抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有病症的人受试者的方法，在所述病症中能够由此处公开的结合蛋白结合的一种或多种靶是有害的，所述方法包括给人受试者施用此处公开的结合蛋白，从而使得人受试者中的一种或多种靶的活性被抑制，并且多种症状之一减轻或达到治疗。例如，病症选自关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthopathy)、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病(spondyloarthopathy)、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合性结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、
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氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horncell)变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementiapugilistica)、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性(ateriosclerotic)疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿(lymphederma)、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性疾病、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-ThomasShi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FABALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemaphagocytic)综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(clinically isolated syndrome)(cis)、结膜炎、儿童期发病性精神病(childhood onset psychiatric disorder)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出(disk herniation)、盘脱垂(disk prolaps)、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征(GBS)、枯草热、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(keratojuntivitis sicca)、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯(Langerhan’s)细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌病、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病(PMR)、泵后综合征(post-pump syndrome)、原发性帕金森综合征、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎(spondilitis ankylosans)、Stevens-Johnson综合征(SJS)、全身性炎症应答综合征、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌(yersinia)和沙门氏菌(salmonella)相关的关节病。
在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)产生的实体瘤。
在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和/或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防此处所述肿瘤的转移。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括在如此处讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用此处公开的任何一种结合蛋白的步骤。在具体实施方案中，第二种试剂选自布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1βmAbs，抗IL-6或IL-6受体mAbs，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞发信号抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ。
在具体实施方案中，此处公开的药物组合物经由选自下述的至少一种模式给患者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
本发明的一个方面提供针对本发明的至少一种结合蛋白的至少一种抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子，例如但不限于，重或轻链的至少一个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其可以掺入本发明的结合蛋白内的任何部分。
附图简述
图1A是双重可变结构域(DVD)-Ig构建体的示意图示，且显示了从2种亲本抗体产生DVD-Ig的策略；
图1B是构建体DVD1-Ig、DVD2-Ig，以及来自杂交瘤克隆2D13.E3(抗-IL-1α)和13F5.G5(抗-IL-1β)的2种嵌合单特异性抗体的示意图示。
发明详述
本发明涉及能够结合2种或更多抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。具体而言，本发明涉及双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)、及其药物组合物、以及用于制备此类DVD-Igs的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包含了使用本发明的DVD-Igs在体外或体内检测特异性抗原的方法。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。
本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，此处使用“多肽”意在包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个连续或非线性多肽表位。可以使用本领域普通方法确定至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个邻接氨基酸，例如至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、或至少约20个邻接氨基酸。多肽变体如此处所述。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。蛋白还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得基本上不含天然结合的组分。
如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。
如本文使用的，“生物学活性”指分子的任一项或多项固有生物学特性(无论是如体内发现的那样天然存在的，还是通过重组方法提供或使成为可能的)。生物学特性包括但不限于结合受体；诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其他细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶促活性。生物学活性也包括Ig分子的活性。
如本文使用的，关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链-2条重(H)链和2条轻(L)链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此类突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域-CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fc区中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化来介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人，Nature；264：415-20；Thies等人，1999 J Mol Biol；293：67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责CH3二聚化的残基已得到鉴定(Dall’Acqua 1998Biochemistry 37：9266-73.)。因此，可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman1978 Ann Immunol 129：855-70；Biewenga等人，1983 Clin Exp Immunol51：395-400)。FcRn∶Ig Fc区的化学计量已测定为2∶1(West等人，2000 Biochemistry 39：9698-708)，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人，1994Eur J Immunol；24：542-548.)。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不利作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3b折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性完全取决于IgG Fc片段N-联聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，这样就可以生成合适的IgG1 Fc片段，从而生成具有大大增强的能力的完全重组的唾液酸化IgG1 Fc(Anthony，R.M.，等人(2008)Science 320：373-376)。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)，指保留与抗原特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2种或更多抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546，Winter等人，PCT公开WO 90/05144 A1，引入本文作为参考)，它包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。此种抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel eds.，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790页(ISBN 3-540-41354-5)。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata等人，ProteinEng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。
术语“多价结合蛋白”在本说明书自始至终用于指包含2种或更多抗原结合部位的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白经工程改造为具有3个或更多抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白。本发明的双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含2个或更多抗原结合部位，且是四价或多价结合蛋白。DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合部位。每个结合部位包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合部位总共6个涉及抗原结合的CDRs。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体，四源杂交瘤技术(参见Milstein，C.和A.C.Cuello，Nature，1983.305(5934)：第537-40页)，2种不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz，U.D.等人，Nature，1985.314(6012)：第628-31页)，或结进孔或在Fc区中引入突变的类似方法(参见Holliger，P.，T.Prospero和G.Winter，Proc Natl Acad Sci USA，1993.90(14)：第6444-8.18页)，从而导致其中只有一种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体结合其2个结合臂之一(1对HC/LC)上的一种抗原(或表位)，且结合其第二个臂(不同对的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。
如本文使用的，术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每一个中(一对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每种抗原是二价的。
结合蛋白的“功能性抗原结合部位”是能够结合靶抗原的结合部位。抗原结合部位的抗原结合亲和力不必与抗原结合部位由其衍生的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评估与抗原结合的抗体的多种方法中的任何一种测量的。此外，本文的多价抗体的每个抗原结合部位的抗原结合亲和力无需在量上相同。
术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的蛋白的一般术语，所述蛋白作为细胞间介质作用于另一种细胞群体。此类细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子、和常规的多肽激素。在细胞因子中包括的是生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β；米勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-α；血小板生长因子；胎盘生长因子；转化生长因子(TGFs)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-1和-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ集落刺激因子(CSFs)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-33；肿瘤坏死因子例如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。如本文使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。
术语“接头”用于指包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acaa.Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。示例性接头包括但不限于，AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ ID NO：5)；RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：26)。
“免疫球蛋白恒定结构域”指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何具体方法生产抗体。
如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
如本文使用的，术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分II C中进一步描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70；Azzazy H.和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35：425-445；GavilondoJ.V.和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.和Chames P.(2000)Immunology Today 21：371-378)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见Taylor，L.D.等人，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.和Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；LittleM.等人，(2000)Immunology Today 21：364-370)，或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系谱内非天然存在的序列。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDRs中具有一种或多种改变的抗体，与没有这些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序来产生。Marks等人，BidlTechnology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins等人，J.Mol.BioL 226：889-896(1992)以及如美国专利US6914128B1中所述的由活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置的选择性突变。
术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。
术语“CDR嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列用另一个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs(例如，CDR3)已用人CDR序列替换。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列以替换相应的非人CDR序列。术语“人源化抗体”也是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如此处使用的，在CDR上下文中的术语“基本上”指具有的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体的重和轻链可变区，或其抗原结合部分中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人，(1971)Ann.NY Acad，Sci.190：382-391和Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31-35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95-102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24-34，对于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置89-97。
如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的3个CDRs的组。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循此处所述系统之一，但仍将与KabatCDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDRs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDRs。
如本文使用的，术语“构架”或“构架序列”指减去CDRs的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统来决定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR′s。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。
如本文使用的，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变(参见，例如，Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001))。由本发明的各种实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体的基本氨基酸序列结构特征，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
如本文使用的，术语“中和”指当结合蛋白特异性结合抗原时，抵消抗原的生物学活性。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合细胞因子且使其生物学活性减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
术语“活性”包括活性例如DVD-Ig对于2种或更多抗原的结合特异性和亲和力。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子复杂混合物中识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。如果抗体交叉竞争(一个阻止另一个的结合或调谐作用)，则将抗体称为“结合相同表位”。另外，表位的结构性定义(重叠、类似、同一)是提供信息的，但是功能性定义往往更加相关，因为它们包含了结构性(结合)和功能性(调谐、竞争)参数。
如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指通过检测生物传感器矩阵内的蛋白浓度改变，例如使用BIAcore
Figure BPA00001281288900801
系统(BIAcore InternationalAB，a GE Healthcare company，Uppsala，瑞典和Piscataway，NJ)，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见
Figure BPA00001281288900802
U.，等人，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；
Figure BPA00001281288900803
U.，等人，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等人，(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Kon”意指结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。也将“Kon”称为“结合速率常数”或“ka”，如此处可互换使用的。该值指示抗体与其靶抗原的结合速率、或抗体与抗原之间的复合物形成速率，其由下列等式表示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Koff”意指结合蛋白(例如抗体)从例如抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数或“解离速率常数”。该值指示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间过去分离为游离抗体和抗原的解离速率，其表示为下列等式：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文使用的术语“KD”意指“平衡解离常数”，并指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)所获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数表示抗体对抗原的亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其他实验途径和仪器例如BIAcore
Figure BPA00001281288900811
(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcore International AB，a GEHealthcare company，Uppsala，瑞典获得的仪器)。另外，也可以使用可以从Sapidyne Instruments(Boise，Idaho)获得的KinExA(动态排阻测定(Kinetic Exclusion Assay))测定。
“标记”和“可检测标记”指附着在特异性结合配偶体例如抗体或分析物的部分，以例如使特定结合对的成员例如抗体和分析物之间的反应可以检测，而将这样标记的特异性结合配偶体例如抗体或分析物称为“可检测地标记的”。因而，如本文使用的术语“标记的结合蛋白”指具有标记掺入的蛋白，所述标记为结合蛋白的鉴定作准备。在一个实施方案中，标记是可检测标记，其可以产生能通过目视或仪器工具检测的信号，例如，掺入放射标记的氨基酸或使生物素化部分与多肽附着，所述生物素化(biotinyl)部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测。关于多肽的标记例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm)；色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域、附加表位)；和磁性试剂，例如钆螯合物。免疫测定一般采用的代表性标记实例包括产生光的部分，例如吖啶
Figure BPA00001281288900821
(acridinium)化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记如此处所述。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。使用“可检测地标记的”意指包含后一种类型的可检测标记。
术语“缀合物”指与第二化学部分，例如治疗或细胞毒性剂化学连接的结合蛋白例如抗体。术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。在一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。在免疫测定上下文中采用时，缀合抗体可以是用作检测抗体的可检测地标记的抗体。
如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式例如无定形固态或液体晶态。晶体由常规、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如，蛋白例如抗体)、或分子组合(assembly)(例如，抗原/抗体复合物)组成。这些三维排列根据本领域众所周知的特异性数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids andProteins，a Practical Approach，第2版，第20 1-16页，Oxford UniversityPress，New York，New York，(1999)。″
术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。
术语“分离的多核苷酸”应意指下述多核苷酸(例如，基因组的、cDNA、或合成来源的，或其某一组合)，由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之结合的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达载体，例如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。如本文使用的，术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。应当理解此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞啤酒糖酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，所述参考文献为了任何目的引入本文作为参考。
如本领域已知的，“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物(或生物祖先)内的转基因表达在该生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
术语“调节”和“调谐”可互换使用，且如本文使用的，指目的分子活性(例如，细胞因子的生物学活性)中的变化或改变。调谐可以是目的分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
相应地，术语“调节剂”是能够改造或改变目的分子活性或功能(例如，细胞因子的生物学活性)的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于，蛋白、肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或小有机分子。肽体在例如WO01/83525中描述。
术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，多肽、核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的减少的调节剂。具体目的拮抗剂包括阻断或调节抗原生物学或免疫活性的那些。抗原拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，蛋白、核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“有效量”指疗法的量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，预防病症进展，引起病症消退，预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种疗法(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗作用。
在本文中“患者”和“受试者”可以互换使用，以指动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、猴和黑猩猩)、非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼(llama)、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、鲸)、鸟(例如鸭或鹅)和鲨鱼。优选的，患者或受试者为人，例如对疾病、病症或状况进行治疗或评估的人，处于疾病、病症或状况危险中的人，患有疾病、病症或状况的人，和/或对疾病、病症或状况进行治疗的人。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于，来自生物(living thing)或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊膜液、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
“组分”、“多种组分”和“至少一种组分”一般指捕获抗体、检测或缀合抗体、对照、校准物(calibrator)、一系列校准物、灵敏度实验对象组(sensitivity panel)、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、终止液等，依照此处所述方法和其他本领域已知方法，其可以包括于用于测试样品(例如患者尿、血清或血浆样品)测定的试剂盒中。因此，在本公开内容上下文中，“至少一种组分”、“组分”和“多种组分”可以包括如上的多肽或其他分析物，例如包含分析物比如多肽的组合物，其任选地固定在固体支持物上，例如通过与抗分析物(抗多肽)抗体结合。一些组分可以在溶液中或者被冻干以重构用于测定。
“对照”指已知不是分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。此处可以互换使用“对照”、“阳性对照”和“校准物”，以指包含已知浓度分析物的组合物。“阳性对照”可用于确立测定性能特性，并且是试剂(例如分析物)完整性的有用指示物。
“预定截断(cutoff)”和“预定水平”一般指测定截断值，其用于通过将测定的结果与预定截断/水平比较，来评估诊断/预后/治疗功效结果，其中预定截断/水平已经与各种临床参数(例如疾病严重纯度、进展/非进展/改进等)联系或相关。虽然本公开内容可以提供示例性预定水平，但众所周知，截断值可能依赖于免疫测定的特性(例如采用的抗体等)而变化。另外，完全在本领域技术人员的一般能力内的是，基于此公开内容将此处的公开内容对其他免疫测定进行适应以获得关于那些其他免疫测定的免疫测定特异性截断值。尽管测定之间预定截断/水平的精确值可能不同，但此处所述的相关性(如果存在的话)应当是普遍适用的。
如在此处所述的诊断测定中所用的，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是将存在于测试样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物增溶的试剂。如此处进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了其它的之外，增溶分析物(例如目的多肽)可能引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的性(不要求分离步骤)或异质的(要求分离步骤)。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，从测试样品将任何沉淀的分析物结合蛋白取出。
在此处所述免疫测定和试剂盒上下文中，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照、和灵敏度实验对象组。为了确立校准(标准)曲线以内推(interpolation)分析物(例如抗体或分析物)的浓度，一般使用“校准物”或“标准”(例如，一种或多种，例如多种)。可替代的，可以使用接近预定阳性/阴性截断的单个校准物。可以共同使用多个校准物(即，多于一个校准物或不同量的校准物)，从而构成“灵敏度实验对象组”。
“风险”指特定事件目前或将来某时刻发生的可能性或概率。“风险分层”指已知临床风险因子的排列，它使得医师将患者划分为发展特定疾病、病症或状况的低、中、高或最高风险。
在特异性结合对(例如抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应片段))成员之间相互作用的上下文中，“特异的”和“特异性”指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语指抗体(或其抗原反应片段)特异性结合分析物(或其片段)而不对其他实体特异性结合的能力。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同的分子，它们通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了普通免疫测定的抗原和抗体特异性结合对，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物与受体分子、辅因子和酶、酶抑制物和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，无论是分离的还是重组产生的。
此处使用的“变体”指这样的多肽，该多肽通过氨基酸的添加(例如插入)、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同于给定多肽(例如IL-18、BNP、NGAL或HIV多肽或抗多肽抗体)，但保持该给定多肽生物学活性(例如变体IL-18可以与抗IL-18抗体竞争结合IL-18)。“氨基酸保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换，被本领域认可为一般涉及小改变。如本领域所理解的，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些小改变(见，例如Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982))。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以取代具有相似亲水指数的氨基酸，而仍然保持蛋白功能。一方面，取代具有亲水指数±2的氨基酸。也可以使用氨基酸亲水性来揭示将引起保持生物学功能的蛋白的取代。在肽的上下文中，考虑氨基酸的亲水性允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度(参见，例如，美国专利号4,554,101，其在此引用作为参考)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物学活性的肽，所述生物学活性例如免疫原性。一方面，用彼此具有±2以内的亲水性值的氨基酸来实施取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与那个观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸取代理解为取决于氨基酸、尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。“变体”也可用于描述已经经过不同加工(例如蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰)而仍然保持其生物学活性或抗原反应性(例如结合IL-18的能力)的多肽或其片段。除非另外与上下文相矛盾，此处使用“变体”意在包含变体的片段。
I.DVD结合蛋白的产生
本发明涉及能够结合一种或多种靶的双重可变结构域结合蛋白及其制备方法。在一个实施方案中，结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区且n是0或1。本发明的结合蛋白可以使用各种技术产生。本发明提供了产生结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法。
A.亲本单克隆抗体的产生
DVD结合蛋白的可变结构域可以从亲本抗体获得，包括能够结合目的抗原的多克隆和mAbs。这些抗体可以是天然存在的或可以通过重组技术产生。
mAbs可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或其组合。例如，mAbs可以使用杂交瘤技术来生产，包括本领域已知和例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988)；Hammerling，等人：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(所述参考文献整体引入作为参考)中教导的那些。如本文使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单个克隆，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生其的方法的抗体。如下文实施例1中讨论的，杂交瘤被选择、克隆和进一步筛选所需特性，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在具体实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中生产。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达能够结合特定抗原的抗体的人细胞融合。
重组mAbs也使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单个、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号5,627,052、PCT公开WO 92/02551和Babcock，J.S.等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848中所述。在这种方法中，鉴定分泌目的抗体的单个细胞，例如来源于免疫接种的动物的淋巴细胞，且通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对目的抗原的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外处理，例如通过体外亲和力成熟法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO00/56772中描述的那些。
单克隆抗体也通过用目的抗原免疫接种非人动物来生产，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598和6,130,364。还参见于1991年7月25日公开的WO 91/10741，于1994年2月3日公开的WO 94/02602，均于1996年10月31日公开的WO 96/34096和WO96/33735，于1998年4月23日公开的WO 98/16654，于1998年6月11日公开的WO 98/24893，于1998年11月12日公开的98/50433，于1999年9月10日公开的WO 99/45031，于1999年10月21日公开的WO99/53049，于2000年2月24日公开的WO 0009560，和于2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠生产全人抗体的成体样人谱，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％人抗体谱。参见Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green和Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，所述参考文献的公开内容在此引入作为参考。
体外方法也可以用于制备亲本抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域已知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，Ladner等人，美国专利号5,223,409；Kang等人，PCT公开号WO 92/18619；Dower等人，PCT公开号WO 91/17271；Winter等人，PCT公开号WO 92/20791；Markland等人，PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人，PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人，PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人，PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty等人，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Clackson等人，(1991)Nature352：624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)NucAcid Res 19：4133-4137；和Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982，US专利申请公开20030186374，和PCT公开号WO 97/29131，所述每个参考文献的内容都引入本文作为参考。
本发明的亲本抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或dsFv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下述参考文献中公开的那些：Brinkman等人，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 1879-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
如此处参考文献中所述，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，其中使用本领域已知的方法，例如下述参考文献中公开的那些：PCT公开WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；和Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；以及Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献整体引入作为参考)。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术例子包括下述参考文献中描述的那些：美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于亲本抗体的鉴定。如Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素-肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此类文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过此处所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过此处所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
在另一种方法中，亲本抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们显示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用于制备亲本抗体的酵母展示方法的例子包括在Wittrup等人，美国专利号6,699,658中公开的那些，所述专利引入本文作为参考。
此处所述抗体可以进一步进行修饰以产生CDR嫁接的和人源化的亲本抗体。CDR嫁接的亲本抗体包含来自人抗体的重和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区替换为能够结合目的抗原的鼠抗体的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而，在此种构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与最初鼠抗体越同源，使鼠CDRs与人构架组合将在CDRs中引入可减小亲和力的变形的可能性越小。因此，在一个实施方案中，选择替换除CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％的序列同一性。在一个实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70％的序列同一性。在具体实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75％的序列同一性。在另一个实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80％的序列同一性。用于生产此种抗体的方法是本领域已知的(参见EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，PNAS 91：969-973(1994))，和链改组(美国专利号5,565,352)；以及抗独特型抗体。
人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种的一个或多个互补性决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列在下述网站上公开，例如，
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Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)，其各自整体引入本文作为参考。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，例如改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，所述参考文献整体引入本文作为参考)。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基且从共有和输入序列组合，从而使得达到所需抗体特征，例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最重要地与影响抗原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988))，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)，Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公开WO 91/09967，PCT/：US98/16280，US96/18978，US91/09630，US91/05939，US94/01234，GB89/01334，GB91/01134，GB92/01755；WO90/14443，WO90/14424，WO90/14430，EP 229246，EP 592,106；EP 519,596，EP 239,400，美国专利号5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567，所述参考文献各自整体引入本文作为参考，包括其中引用的参考文献。
B.用于选择亲本单克隆抗体的标准
本发明的实施方案与选择亲本抗体有关，所述亲本抗体具有DVD-Ig分子中所需的至少一个或多个特性。在一个实施方案中，所需特性选自一个或多个抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、能力、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用率、组织交叉反应性、以及直向同源抗原结合。
B1.对抗原的亲和力
治疗性mAb的所需亲和力可以取决于抗原的特性以及所需的治疗终点。在一个实施方案中，在阻断细胞因子-细胞因子受体相互作用时，单克隆抗体具有较高的亲和力(Kd＝0.01-0.50pM)，因为此种细胞因子-细胞因子受体相互作用通常是高亲和力相互作用(例如＜pM-＜nM范围)。在此种情况下，mAb对其靶的亲和力应当等于或好于细胞因子(配体)对其受体的亲和力。另一方面，具有较低亲和力(＞nM范围)的mAb可能在清除循环的潜在致病性蛋白中具有治疗性效果，例如结合、隔绝和清除A-β淀粉状蛋白的循环种类的单克隆抗体。在其他情况下，通过位点定向诱变降低现有高亲和力mAb的亲和力、或使用对其靶具有较低亲和力的mAb可用于避免可能的副作用，例如，高亲和力mAb可能隔绝/中和所有其预期的靶，从而完全耗尽/消除靶向的蛋白的功能。在这种情境中，低亲和力mAb可以隔绝/中和负责疾病症状的部分靶(病理或超量产生的水平)，从而允许部分靶继续实施其一种或多种正常生理功能。因此，可能降低Kd来调整剂量和/或减少副作用。亲本mAb的亲和力可能在适当地靶向细胞表面分子来实现所需治疗结果中起到作用。例如，如果靶在癌细胞上以高密度表达、而在正常细胞上以低密度表达，那么较低亲和力mAb将在肿瘤细胞上结合比正常细胞上更多的靶，从而导致肿瘤细胞通过ADCC或CDC消除，且从而可以具有所需的治疗效果。因此，选择具有所需亲和力的mAb可以和可溶性和表面靶都有关。
通过受体与其配体相互作用后的发信号可以取决于受体-配体相互作用的亲和力。类似的，可以想到mAb对表面受体的亲和力可以决定细胞内发信号的特性以及该mAb是否递送了激动剂或拮抗剂信号。mAb介导的发信号的基于亲和力的特性可能对其副作用概况具有影响。因此，需要通过体外和体内实验谨慎确定治疗性单克隆抗体的所需亲和力和所需功能。
可以依赖于所需治疗结果实验性确定结合蛋白(例如抗体)的所需Kd。在一个实施方案中，选择对特定抗原的亲和力(Kd)等于或好于DVD-Ig对相同抗原的所需亲和力的亲本抗体。通过Biacore或其他类似技术评价抗原结合亲和力和动力学。在一个实施方案中，各个亲本抗体对其抗原具有的解离常数(Kd)选自：最多约10-7M、最多约10-8M、最多约10-9M、最多约10-10M、最多约10-11M、最多约10-12M、和最多约10-13M。获得VD1的第一个亲本抗体和获得VD2的第二个亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同亲和力(KD)。各个亲本抗体对抗原具有的结合速率常数(Kon)选自：至少约102M-1s-1、至少约103M-1s-1、至少约104M-1s-1、至少约105M-1s-1、和至少约106M-1s-1，如通过表面等离振子共振测定的。获得VD1的第一个亲本抗体和获得VD2的第二个亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同的结合速率常数(Kon)。在一个实施方案中，各个亲本抗体对抗原具有的解离速率常数(Koff)选自：最多约10-3s-1、最多约10-4s-1、最多约10-5s-1、和最多约10-6s-1，如通过表面等离振子共振测定的。获得VD1的第一个亲本抗体和获得VD2的第二个亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同的解离速率常数(Koff)。
B2.能力
亲本单克隆抗体的所需亲和力/能力将取决于所需的治疗结果。例如，对于受体-配体(R-L)相互作用，亲和力(kd)等于或好于R-L kd(pM范围)。对于致病性循环蛋白的简单清除，kd可以在低nM范围，例如清除循环A-β肽的各种种类。另外，kd也将取决于靶是否表达相同表位的多拷贝，例如靶向Aβ寡聚体中的构象表位的mAb。
当VD1和VD2结合相同抗原但是不同表位时，DVD-Ig将含有对相同抗原的4个结合部位，从而增加抗体亲抗原性以及由此的DVD-Ig的表观kd。在一个实施方案中，选择具有等于或低于DVD-Ig中所需的kd的亲本抗体。亲本mAb的亲和力考虑也取决于DVD-Ig是否含有四个或更多抗原结合部位(即，来自单个mAb的DVD-Ig)。在此情况下，表观kd将由于抗体亲抗原性而高于mAb。此种DVD-Ig可以用于交连表面受体、增加中和能力、增强病理蛋白的清除等。
在一个实施方案中，选择对特定抗原的中和能力等于或好于DVD-Ig对相同抗原的所需中和潜力的亲本抗体。可以通过靶依赖性生物测定评价中和能力，在所述靶依赖性生物测定中，适当类型的细胞对靶刺激应答产生可测量的信号(即，增殖或细胞因子产生)，而通过mAb的靶中和可以以剂量依赖的方式降低信号。
B3.生物学功能
单克隆抗体可以潜在地实施几种功能。这些功能中的一些列于表1中。这些功能可以通过体外测定(例如基于细胞的和生物化学测定)和体内动物模型来评价。
表1：治疗性抗体的一些潜在应用
Figure BPA00001281288900971
可以选择具有在此处在表1中的实例中所述的不同功能的mAb，来实现所需治疗结果。两个或更多选择的亲本单克隆抗体然后可以以DVD-Ig形式使用以实现在单个DVD-Ig分子中的两种不同功能。例如，可以通过选择中和特定细胞因子功能的亲本mAb、并选择增强病理蛋白的清除的亲本mAb，来产生DVD-Ig。类似的，我们可以选择识别两个不同细胞表面受体的两个亲本单克隆抗体，一个mAb具有对一个受体的激动剂功能，而另一个mAb具有对不同受体的拮抗剂功能。各自具有不同功能的这两个所选单克隆抗体可以用于构建单个DVD-Ig分子，该DVD-Ig分子将在单个分子中具有所选单克隆抗体的两个不同功能(激动剂和拮抗剂)。类似的，可以将各阻断各自的受体配体(例如EGF和IGF)结合的两个针对细胞表面受体的拮抗性单克隆抗体以DVD-Ig形式使用。相反的，可以选择拮抗性抗受体mAb(例如抗EGFR)和中和抗可溶性介质(例如抗-IGF1/2)mAb来制备DVD-Ig。
B4.表位识别
蛋白的不同区域可能实施不同功能。例如，细胞因子的特定区域与细胞因子受体相互作用，以致使受体活化，而可能需要该蛋白的其他区域来稳定细胞因子。在这个情况下，人们可以选择与细胞因子上的一个或多个受体相互作用区特异性结合的mAb，并由此阻断细胞因子-受体相互作用。在一些情况下，例如某些结合多个配体的趋化因子受体，可以选择结合与仅一个配体相互作用的表位(趋化因子受体上的区域)的mAb。在其他情况下，单克隆抗体可以与靶上的表位结合，该表位不直接负责该蛋白的生理功能，但是mAb与这些区域的结合可以干扰该蛋白的生理功能(位阻)或改变其构象，从而使得该蛋白不能起作用(针对具有多个配体的受体的mAb，其改变受体构象，从而没有一个配体可以结合)。不阻断细胞因子与其受体结合、但是阻断信号转导的抗细胞因子单克隆抗体也已经得到鉴定(例如125-2H、抗IL-18mAb)。
表位和mAb功能的实例包括但不限于阻断受体-配体(R-L)相互作用(结合R相互作用位点的中和mAb)；引起R结合减少或无R结合的位阻。Ab可以在除受体结合位点之外的位点结合靶，但是仍然通过引起构象改变和消除功能(例如Xolair)、与R结合但阻断发信号(125-2H)而干扰受体结合及靶的功能。
在一个实施方案中，亲本mAb需要靶向合适的表位以发挥最大功效。此种表位在DVD-Ig中应该是保守的。可以通过几种方法确定mAb的结合表位，包括共结晶、mAb-抗原复合物的有限蛋白酶解加上质谱肽作图(Legros V.等人，2000Protein Sci.9：1002-10)、噬菌体展示的肽文库(O′Connor KH等人，2005J Immunol Methods.299：21-35)、以及诱变(Wu C.等人，2003J Immunol 170：5571-7)。
B5.物理化学和药学特性：
使用抗体的治疗性处理经常要求施用高剂量，经常为几mg/kg(由于一般大分子量所致在质量基础上的低能力)。为了调整患者顺应性并充分解决慢性病治疗和门诊病人治疗，需要皮下(s.c.)或肌内(i.m.)施用治疗性mAbs。例如，皮下施用的最大所需体积是～1.0mL，且因此，需要＞100mg/mL的浓度来限制每剂的注射数。在一个实施方案中，以一剂施用治疗性抗体。然而，通过蛋白-蛋白相互作用(例如有可能增加免疫原性风险的聚集)和通过在加工和递送过程中的限制(例如粘度)限制了此种制剂的开发。因此，临床功效所要求的大量以及相关的开发约束，限制了对抗体制剂的潜力的充分开发以及以高剂量方案皮下施用。显而易见的是，蛋白分子和蛋白溶液的物理化学和药学特性是极为重要的，例如稳定性、可溶性和粘度特征。
B5.1.稳定性：
“稳定的”抗体制剂是其中抗体在贮存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。可以在选择的温度测量稳定性达选择的时间段。在一个实施方案中，制剂中的抗体在室温(约30℃)或在40℃稳定至少一个月，和/或在约2-8℃稳定至少1年至少2年。另外，在一个实施方案中，在冷冻(至例如-70℃)和融化制剂(此后称为“冻融循环”)后，该制剂是稳定的。在另一个实施方案中，“稳定的”制剂可以是这样的制剂，其中少于约10％和少于约5％的蛋白作为聚集体存在于该制剂中。
需要在各种温度下体外稳定达延长的时间段的DVD-Ig。人们可以通过快速筛选在升高的温度体外稳定(例如，在40℃稳定2-4周)的亲本mAbs实现这一点，且然后评价稳定性。在2-8℃贮存期间，蛋白显示出至少12个月例如至少24个月的稳定性。可以使用各种技术例如阳离子交换层析、大小排阻层析、SDS-PAGE、以及生物活性测试来评价稳定性(单体、完整分子的％)。关于可以采用以分析共价和构象修饰的分析技术的更全面列表，请见Jones，A.J.S.(1993)Analyticalmethods for the assessment of protein formulations and delivery systems.In：Cleland，J.L.；Langer，R.，编者；Formulation and delivery of peptides andproteins，第一版，Washington，ACS，22-45页；以及Pearlman，R.；Nguyen，T.H.(1990)Analysis of protein drugs.In：Lee，V.H.，编者；Peptide andprotein drug delivery，第一版，New York，Marcel Dekker，Inc.，247-301页。
异质性和聚集体制剂：抗体的稳定性可以是这样的，从而制剂在作为聚集体存在的GMP抗体材料中可以显示出少于约10％、以及在一个实施方案中少于约5％、在另一个实施方案中少于约2％、或在一个实施方案中在0.5％至1.5％范围内或更低。大小排阻层析是检测蛋白聚集体的灵敏、可重复并且非常坚固的方法。
除了低聚集体水平外，在一个实施方案中，抗体必须是化学稳定的。可以通过离子交换层析(例如阳离子或阴离子交换层析)、疏水作用层析、或其他方法例如等电聚焦或毛细管电泳确定化学稳定性。例如，抗体的化学稳定性可以是这样的，从而在2-8℃贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，在阳离子交换层析中代表未修饰的抗体的峰可增加不高于20％、在一个实施方案中不高于10％、或在另一个实施方案中不高于5％。
在一个实施方案中，亲本抗体显示结构的完整性；正确的二硫键形成，以及正确折叠：由于抗体二级或三级结构改变的化学不稳定性可以影响抗体活性。例如，通过抗体活性指示的稳定性可以是这样的，从而在2-8℃贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，抗体活性可降低不多于50％、在一个实施方案中不多于30％或甚至不多于10％、或在一个实施方案中不多于5％或1％。可以采用适合的抗原结合测定来确定抗体活性。
B5.2.可溶性：
mAb的“可溶性”与产生正确折叠的单体IgG相关。可以因此通过HPLC评价IgG的可溶性。例如，可溶的(单体的)IgG将引起HPLC层析仪上的单个峰，而不溶性(例如多体的和聚集的)将产生多个峰。本领域技术人员将因此能够使用常规HPLC技术检测IgG可溶性的升高或降低。对于可采用来分析可溶性的分析技术的更全面列表，(参见Jones，A.G.Dep.Chem.Biochem.Eng.，Univ.Coll.London，London，UK.编者：Shamlou，P.Ayazi.Process.Solid-Liq.Suspensions(1993)，93-117.Publisher：Butterworth-Heinemann，Oxford，UK and Pearlman，Rodney；Nguyen，Tue H，Advances in Parenteral Sciences(1990)，4(Pept.ProteinDrug Delivery)，247-301)。治疗性mAbs的可溶性对于制备为通常为足够给药所要求的高浓度是重要的。如此处所概括的，可能要求＞100mg/mL的可溶性来提供有效的抗体给药。例如，在研究早期，抗体可溶性应当不小于约5mg/mL，在一个实施方案中，在高级加工科学阶段不小于约25mg/mL，或者在一个实施方案中，不小于约100mg/mL，或者在一个实施方案中，不小于约150mg/mL。对本领域技术人员显而易见的是，蛋白分子的固有特性对于该蛋白溶液的物理化学特性，例如稳定性、可溶性、粘度，是重要的。然而，本领域技术人员将认识到，存在众多种可用作添加剂以有益的影响最终蛋白制剂特征的赋形剂。这些赋形剂可以包括：(i)液体溶剂、助溶剂(例如醇，如乙醇)；(ii)缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氨基酸缓冲液)；(iii)糖或糖醇(例如蔗糖、海藻糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡聚糖)；(iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、40、60、80、泊洛沙姆(poloxamers))；(v)等渗性改性剂(例如，盐，如NaCl，糖，糖醇)；以及(vi)其他(例如，防腐剂、螯合剂、抗氧化剂、螯合物质(例如EDTA)、可生物降解的聚合物、载体分子(例如HAS、PEGs)。
粘度是就抗体制造和抗体加工(例如渗滤/超滤)、罐装/封装(fill-finish)加工(泵送方面、过滤方面)和递送方面(可注射性、复杂的设备递送)而论高度重要的参数。低粘度使得抗体的液体溶液能够具有较高浓度。这使得相同剂量能够以较小的体积施用。小注射体积具有在注射感觉上较低疼痛的优点，而且该溶液没有必要是等渗的以降低患者在注射时的疼痛。抗体溶液的粘度可以是这样的，从而在剪切速率100(1/s)，抗体溶液粘度低于200mPas，在一个实施方案中低于125mPas，在另一个实施方案中低于70mPas，且在另一个实施方案中低于25mPas或甚至低于10mPas。
B5.3.生产效率
产生在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中有效表达的DVD-Ig，在一个实施方案中将需要两个本身在哺乳动物细胞中有效表达的亲本单克隆抗体。稳定哺乳动物系(即CHO)的生产得率应该高于约0.5g/L，在一个实施方案中高于约1g/L，且在另一个实施方案中在约2-5g/L范围内或更多(Kipriyanov SM，Little M.1999Mol Biotechnol.12：173-201；Carroll S，Al-Rubeai M.2004 Expert Opin Biol Ther.4：1821-9)。
抗体和Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中的生产受几个因素影响。经由整合强启动子、增强子和选择标记对表达载体的工程改造，可以最大化目的基因从整合的载体拷贝的转录。鉴定允许高水平基因转录的载体整合位点可以增加蛋白从载体的表达(Wurm等人，2004，NatureBiotechnology，2004，Vol/Iss/Pg.22/11(1393-1398))。另外，生产水平受抗体重和轻链的比率以及蛋白装配和分泌过程中各个步骤影响(Jiang等人，2006，Biotechnology Progress，Jan-Feb 2006，22卷，1期313-8页)。
B6.免疫原性
施用治疗性mAb可导致免疫反应的一定发生率(即，针对治疗性mAb的内源性抗体的形成)。应当在选择亲本单克隆抗体期间分析可能引起免疫原性的潜在元件，并且可以采取降低这种风险的步骤，以在DVD-Ig构建之前最优化亲本单克隆抗体。已经发现小鼠来源的抗体在患者具有高免疫原性。包含小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体的生成提供了降低治疗性抗体免疫原性的合理的下一步(Morrison和Schlom，1990)。可替代的，可以通过将鼠CDR序列转移入人抗体构架(重构/CDR嫁接/人源化)而降低免疫原性，如Riechmann等人，1988关于治疗性抗体所述。另一个方法称为“表面重建(resurfacing)”或“镶面(veneering)”，该方法从啮齿类动物可变轻和重结构域开始，仅仅将表面可及的构架氨基酸改变为人氨基酸，而CDR和隐蔽的氨基酸则保持来自亲本啮齿类动物抗体(Roguska等人，1996)。在另一类人源化中，代替嫁接整个CDR，一个技术仅嫁接“特异性决定区”(SDRs)，将所述“特异性决定区”定义为与抗体与其靶结合有关的CDR残基的亚群(Kashmiri等人，2005)。这使通过可利用的抗体-靶复合物三维结构的分析或抗体CDR残基的突变分析来确定哪些残基与靶相互作用而鉴定SDR成为必要。可替代的，与鼠、嵌合或人源化抗体相比，完全人抗体可能具有降低的免疫原性。
降低治疗性抗体免疫原性的另一个方法是消除预测有免疫原性的某些特定序列。在一个方法中，在第一代生物制剂已经在人中得到测试并发现具有不可接受的免疫原性后，可以对B细胞表位作图且然后改变，来避免免疫检测。另一个方法使用预测并去除可能的T细胞表位的方法。已经开发了计算方法来扫描并鉴定具有与MHC蛋白结合的潜力的生物学治疗剂肽序列(Desmet等人，2005)。可替代的，可以使用基于人树突细胞的方法来鉴定潜在的蛋白变应原中的CD4+T细胞表位(Stickler等人，2005；S.L.Morrison和J.Schlom，Important Adv.Oncol.(1990)，第3-18页；Riechmann，L.，Clark，M.，Waldmann，H.和Winter，G.″Reshaping human antibodies for therapy.″Nature(1988)332：323-327；Roguska-M-A，Pedersen-J-T，Henry-A-H，Searle-S-M，Roja-C-M，Avery-B，Hoffee-M，Cook-S，Lambert-J-M， Rees-A-R，Guild-B-C.Acomparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variabledomain resurfacing.Protein engineering，{Protein-Eng}，1996，第9卷，第895-904页；Kashmiri-Syed-V-S，De-Pascalis-Roberto，Gonzales-Noreen-R，Schlom-Jeffrey.SDR grafting--a new approach to antibody humanization.Methods(San Diego Calif.)，{Methods}，May 2005，第36卷，第1期，第25-34页；Desmet-Johan，Meersseman-Geert，Boutonnet-Nathalie，Pletinckx-Jurgen，De-Clercq-Krista，Debulpaep-Maja，Braeckman-Tessa，Lasters-Ignace.Anchor profiles of HLA-specific peptides：analysis by anovel affinity scoring method and experimental validation.Proteins，2005，第58卷，第53-69页；Stickler-M-M，Estell-D-A，Harding-F-A.CD4+T-cellepitope determination using unexposed human donor peripheral bloodmononuclear cells.Journal of immunotherapy 2000，第23卷，第654-60页)。
B7.体内功效
为了生成具有所需体内功效的DVD-Ig分子，当以组合给予时，生成并选择具有相似的所需体内功效的mAbs是重要的。然而，在一些情况下，DVD-Ig可能表现出两个单独mAbs的组合所不能实现的体内功效。例如，DVD-Ig可以使两个靶临近，从而引起两个单独mAbs的组合所不能实现的活性。此处在B3节中描述了额外的所需生物学功能。可以基于诸如药物代谢动力学t 1/2、组织分布、可溶的与细胞表面靶、以及靶浓度-可溶性/密度-表面的因素，选择具有DVD-Ig中所需特征的亲本抗体。
B8.体内组织分布
为了生成具有所需体内组织分布的DVD-Ig分子，在一个实施方案中，必须选择具有类似的所需体内组织分布概况的亲本mAbs。可替代的，基于双特异性靶向策略的机制，在其他时候，当以组合给予时，可能不要求选择具有类似的所需体内组织分布的亲本mAbs。例如，在一种DVD-Ig的情况中，其中，一个结合组分将DVD-Ig靶向特定位点，从而将第二个结合组分带到相同靶位点。例如，DVD-Ig的一个结合特异性可以靶向胰(胰岛细胞)，而另一个特异性可以将GLP1带到胰来诱导胰岛素。
B9.同种型：
为了生成具有所需特性的DVD-Ig分子，所需特性包括但不限于同种型、效应子功能和循环半衰期，在一个实施方案中，依赖于治疗效用和所需治疗终点选择具有适当的Fc效应子功能的亲本mAbs。有5种主要的重链种类或同种型，其中一些具有几个亚型，且这些决定了抗体分子的效应子功能。这些效应子功能存在于抗体分子的铰链区、CH2和CH3结构域。然而，抗体分子其他部分中的残基可能也对效应子具有作用。铰链区Fc效应子功能包括：(i)抗体依赖性细胞毒作用，(ii)补体(C1q)结合、活化和依赖补体的细胞毒性(CDC)，(iii)抗原-抗体复合物的吞噬作用/清除，以及(iv)在一些情况下的细胞因子释放。抗体分子的这些Fc-效应子功能是通过Fc区与一组种类特异性细胞表面受体的相互作用介导的。IgG1同种型的抗体是最活跃的，而IgG2和IgG4具有最小或没有效应子功能。IgG抗体的效应子功能是通过与三种结构上同源的细胞Fc受体型(及亚型)(FcgR1、FcgRII和FcgRIII)相互作用而介导的。可以通过在较低铰链区突变FcgR和C1q结合所需的特定氨基酸残基(例如L234A、L235A)来消除IgG1的这些效应子功能。Fc区、特别是CH2-CH3结构域中的氨基酸残基也决定了抗体分子的循环半衰期。该Fc功能通过Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合而介导，所述新生Fc受体负责抗体分子从酸性溶酶体再循环回到全身循环。
mAb是否应该具有活性或失活同种型将取决于抗体所需的治疗终点。同种型的使用以及所需治疗结果的一些实例罗列如下：
a)如果所需治疗终点是功能性中和可溶性细胞因子，则可以使用失活同种型；
b)如果所需结果是清除病理蛋白，则可以使用活性同种型；
c)如果所需结果是清除蛋白聚集体，则可以使用活性同种型；
d)如果所需结果是拮抗表面受体，则使用失活同种型(Tysabri，IgG4；OKT3，突变的IgG1)；
e)如果所需结果是清除靶细胞，则使用活性同种型(Herceptin，IgG1(并具有增强的效应子功能)；以及
f)如果所需结果是不进入CNS而将蛋白从循环清除，则可以使用IgM同种型(例如，清除循环Ab肽种类)。
可以通过各种本领域熟知的体外方法确定亲本mAb的Fc效应子功能。
如所讨论的，对同种型以及由此效应子功能的选择将取决于所需的治疗终点。万一需要简单中和循环靶，例如，阻断受体-配体相互作用，则可能不要求效应子功能。在此种情况下，需要消除效应子功能的抗体Fc区内的同种型或突变。在另一种以消除靶细胞为治疗终点的情况下，例如消除肿瘤细胞，需要增强效应子功能的Fc-区内的同种型或突变或去岩藻糖基化(Presta GL，Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656，2006；Satoh M.，Iida S.，Shitara K.Expert Opinion Biol.Ther.6：1161-1173，2006)。类似地，取决于治疗效用，可以通过经由在Fc区引入特定突变来调节抗体-FcRn相互作用，来降低/延长抗体分子循环半衰期(Dall’Acqua WF，Kiener PA，Wu H.J.Biol.Chem.281：23514-23524，2006；Petkova SB.，Akilesh S.，Sproule TJ.等人，Internat.Immunol.18：1759-1769，2006；Vaccaro C.，Bawdon R.，Wanjie S等人，PNAS103：18709-18714，2007)。
可能需要对于DVD-Ig证实影响正常治疗性mAb的不同效应子功能的各种残基的公开信息。在DVD-Ig形式中，有可能除了鉴定为调节单克隆抗体效应子功能的那些之外的额外的(不同的)Fc-区残基是重要的。
总体而言，关于哪个Fc效应子功能(同种型)对于最终DVD-Ig形式是关键的决定将取决于疾病指征、治疗靶、所需治疗终点和安全性考虑。示例性的合适的重链和轻链恒定区罗列如下，包括但不限于：
●IgG1-同种异型：G1mz
●IgG1突变体-A234、A235
●IgG2-同种异型：G2m(n-)
●Kappa-Km3
●Lambda
Fc受体和C1q研究：可以通过(例如L234A、L235A)铰链区突变来取消抗体与细胞膜上任何超表达的靶复合造成的不需要的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(CDC)的可能性。由于认为FcgR结合发生在IgG1铰链区上的重叠位点，所以预期存在于mAb的IgG1铰链区的取代的氨基酸导致mAb与人Fc受体(而非FcRn)的结合减少。mAb的这个特征可以导致比含有野生型IgG的抗体改善的安全性概况。可以通过流式细胞术实验使用细胞系(例如THP-1、K562)和表达FcgRIIb(或其他FcgRs)的工程改造的CHO细胞系确定mAb与人Fc受体的结合。与IgG1对照单克隆抗体相比，mAb显示与FcgRI和FcgRIIa结合降低，而与FcgRIIb的结合未受影响。由抗原/IgG免疫复合物引起的C1q结合和活化触发具有随后的炎症和/或免疫调节应答的经典补体级联系统。IgGs上的C1q结合位点被定位在IgG铰链区内的残基。通过C1q ELISA评价C1q与渐增浓度的mAb的结合。结果证明，如当与野生行对照IgG1的结合相比时所预期的，mAb不能与C1q结合。总体而言，L234A、L235A铰链区突变消除mAb与FcgRI、FcgRIIa和C1q的结合，但是不影响mAb与FcgRIIb的相互作用。该数据提示，具有突变Fc的mAb将在体内与抑制性FcgRIIb正常相互作用，但可能将不能与活化FcgRI和FcgRIIa受体或C1q相互作用。
人FcRn结合：新生受体(FcRn)负责IgG穿过胎盘的转运并控制IgG分子的分解代谢半衰期。可能需要增加抗体的终末半衰期来改善功效、降低施用的剂量或频率、或改善对靶的定位。另外，相反的作法可能是有利的，即，降低抗体的终末半衰期以降低全身暴露或改善靶对非靶结合比率。设计IgG与其补救受体FcRn之间的相互作用提供了增加或降低IgG终末半衰期的途径。循环中的蛋白(包括IgG)由某些细胞例如血管内皮细胞通过微胞饮作用在流体相吸收。IgG可以在内体中在微酸性条件下(pH 6.0-6.5)结合FcRn，并且可以再循环到细胞表面，在那里它在几乎中性条件下(pH 7.0-7.4)释放。FcRn80、16、17上Fc区结合位点的作图显示，在物种间保守的两个组氨酸残基His310和His435是造成这种相互作用的pH依赖性的原因。使用相展示技术，鉴定了增加与FcRn的结合并延长小鼠IgG半衰期的小鼠Fc区突变(见Victor，G.等人；Nature Biotechnology(1997)，15(7)，637-640)。在pH 6.0但不在pH 7.0增加人IgG对FcRn的结合亲和力的Fc区突变也已得到鉴定(见Dall′Acqua William F，等人，Journal of Immunology(2002)，169(9)，5171-80)。此外，在一种情况下，对于猕猴FcRn也观察到类似的pH依赖的结合增加(最高达27倍)，且与亲本IgG相比，这导致猕猴中血清半衰期的2倍增加(见Hinton，Paul R.等人，Journal of BiologicalChemistry(2004)，279(8)，6213-6216)。这些发现说明，通过设计Fc区与FcRn相互作用而延长抗体治疗剂的血浆半衰期是可行的。相反的，减弱与FcRn相互作用的Fc区突变可以缩短抗体半衰期。
B10.药物代谢动力学(PK)：
为了生成具有所需药物代谢动力学概况的DVD-Ig分子，在一个实施方案中，选择具有相似的所需药物代谢动力学概况的亲本mAbs。一个考虑是对单克隆抗体的免疫原性应答(即HAHA，人抗人抗体应答；HACA，人抗嵌合抗体应答)进一步使得这些治疗剂的药物代谢动力学变复杂。在一个实施方案中，使用免疫原性最小或没有免疫原性的单克隆抗体来构建DVD-Ig分子，从而使得结果产生的DVD-Ig也将具有最小免疫原性或没有免疫原性。决定mAb的PK的一些因素包括但不限于mAb的内在特性(VH氨基酸序列)、免疫原性、FcRn结合和Fc功能。
由于啮齿类动物中的PK概况与食蟹猴(cynomolgus monkey)和人中的单克隆抗体的PK概况良好相关(或接近地预测后者)，所以可以容易的在啮齿类动物中确定所选亲本单克隆抗体的PK概况。PK概况的确定如实施例部分1.2.2.3.A中所述。
选择具有所需PK特征(和这里讨论的其他所需功能特性)的亲本单克隆抗体后，构建DVD-Ig。由于DVD-Ig分子含有来自两个亲本单克隆抗体的两个抗原结合结构域，所以也评价DVD-Ig的PK特性。因此，在确定DVD-Ig的PK特性时，可以采用基于来自两个亲本单克隆抗体的两个抗原结合结构域的功能性确定PK概况的PK测定。可以如实施例1.2.2.3.A中所述确定DVD-Ig的PK概况。可以影响DVD-Ig的PK概况的其他因素包括抗原结合结构域(CDR)方向、接头大小、以及Fc/FcRn相互作用。可以通过评估下列参数而评价亲本抗体的PK特征：吸收、分布、代谢和排泄。
吸收：至今，治疗性单克隆抗体的施用是通过肠胃外途径(例如静脉内[IV]、皮下[SC]或肌内[IM])。mAb在SC或IM施用后从胞间隙吸收到体循环中主要是通过淋巴途径。血管外施用后，可饱和的系统前(presystemic)蛋白酶解降解可能导致可变的绝对生物利用率。通常，由于在较高剂量饱和的蛋白酶解能力，可以观察到伴随单克隆抗体剂量渐增的绝对生物利用率的增加。由于淋巴液缓慢引流到血管系统中，mAB的吸收过程通常是相当缓慢的，而且吸收的持续时间可以发生数小时至几天。单克隆抗体SC施用后的绝对生物利用率一般在50％至100％范围内。
分布：IV施用后，单克隆抗体通常遵循双相血清(或血浆)浓度-时间概况，从快速分布相开始，随后为缓慢消除相。一般，双指数(biexponential)药物代谢动力学模型最好地描述这类药物代谢动力学概况。mAb在中央室(central compartment)中的分布体积(Vc)通常等于或略大于血浆体积(2-3升)。因为血清(血浆)浓度-时间曲线的分布相受长吸收部分掩盖，所以血清(血浆)浓度对时间概况中的独特双相模式对于其他肠胃外施用途径例如IM或SC可能不明显。许多因素，包括物理化学特性、位点特异性和靶定向的受体介导的摄取、组织结合能力以及mAB剂量，可以影响mAb的生物分布。这些因素中的一些可以促成mAb生物分布中的非线性。
代谢和排泄：由于分子大小，完整的单克隆抗体不通过肾排泄到尿中。它们首先通过代谢(例如分解代谢)灭活。对于基于IgG的治疗性单克隆抗体，半衰期一般在数小时或1-2天到20天以上的范围内。mAb的消除可以受许多因素影响，包括但不限于对FcRn受体的亲和力、mAb的免疫原性、mAb的糖基化程度、mAb对蛋白酶解的易感性、以及受体介导的消除。
B11.人和tox物种(tox species)的组织交叉反应性模式：
相同的染色模式提示，可以在tox物种中评价潜在的人毒性。tox物种是不相关的毒性得到研究的那些动物。
选择符合两个标准的个别抗体。(1)适于抗体靶已知表达的组织染色。(2)来自相同器官的人和tox物种组织之间的类似的染色模式。
标准1：免疫接种和/或抗体选择一般采用重组或合成的抗原(蛋白、碳水化合物或其他分子)。与天然配对物的结合以及针对无关抗原的反筛选(counterscreen)通常是治疗性抗体筛选漏斗的部分。然而，针对众多抗原进行筛选经常是不现实的。因此，使用来自所有主要器官的人组织的组织交叉反应性研究用以排除抗体与任何无关抗原的不需要的结合。
标准2：使用人和tox物种组织的比较组织交叉反应性研究(食蟹猴、狗、可能的啮齿类动物及其他，测试与人研究中相同的36或37种组织)帮助验证tox物种的选择。在冷冻组织切片的典型组织交叉反应性研究中，治疗性抗体可显示对已知抗原的预期结合，和/或基于低水平相互作用的对组织的较低结合程度(非特异性结合、对相似抗原的低水平结合、基于低水平电荷的相互作用等)。在任何情况下，最相关的毒理学动物物种是与人和动物组织结合的一致性程度最高的动物物种。
组织交叉反应性研究遵循适当的规章指导方针，包括EC CPMPGuideline III/5271/94“Production and quality control of mAbs”以及1997US FDA/CBER“Points to Consider in the Manufacture and Testing ofMonoclonal Antibody Products for Human Use”。将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织冷冻切片(5μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。FDA的指导方针“Points to Consider in the Manufacture and Testing of MonoclonalAntibody Products for Human Use”。相关参考文献包括Clarke J 2004，Boon L.2002a，Boon L 2002b，Ryan A 1999。
组织交叉反应性研究经常以两个阶段完成，第一阶段包括来自一个人供体的32个组织(一般为：肾上腺、胃肠道、前列腺、膀胱、心脏、骨骼肌、血细胞、肾、皮肤、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾、小脑、淋巴结、睾丸、大脑皮质、卵巢、胸腺、结肠、胰、甲状腺、内皮、甲状旁腺、输尿管、眼、垂体、子宫、输卵管和胎盘)的冷冻切片。在第二阶段，用来自三个不相关成体的最多达38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、骨骼肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫)实施完整交叉反应性研究。一般在最低限度两个剂量水平上完成研究。
可以将治疗性抗体(即测试物品)和同种型匹配的对照生物素化用于抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)检测；其他检测方法可以包括对FITC(或以其他方式)标记的测试物品的第三抗体检测，或对未标记的测试物品用标记的抗人IgG进行预复合(precomplexing)。
简而言之，将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织的冷冻切片(约5μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。首先(在预复合检测系统的情况下)，将测试物品与生物素化的第二抗人IgG温育并使其发展为免疫复合物。将在2和10μg/mL的测试物品终浓度的免疫复合物添加到在物镜上的组织切片上，然后用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒使组织切片反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3，3’-二氨基联苯胺)4分钟进行组织染色。使用抗原-琼脂糖珠作为阳性对照组织切片。
基于正被讨论的靶抗原的已知表达，将任何特异性染色判断为预期的(例如，与抗原表达一致)或意外的反应性。将任何判断为特异性的染色关于强度和频率进行评分。抗原或血清竞争或阻断研究可以帮助进一步确定观察到的染色是特异性的还是非特异性的。
如果发现两个所选抗体符合选择标准-适当的组织染色，人和毒理学动物特定组织之间的匹配染色-则可以选择它们用于DVD-Ig生成。
对于最终DVD-Ig构建体必须重复组织交叉反应性研究，但是尽管这些研究遵循此处概括的相同规程，对它们进行评价是更复杂的，这是因为任何结合可以来自两个亲本抗体中的任何一种，而任何不清楚的结合需要用复杂的抗原竞争研究来确认。
显而易见的是，如果由于(1)缺乏意外的组织交叉反应性发现以及(2)对相应人和毒理学动物种类组织之间的组织交叉反应性发现的适当相似性选择两个亲本抗体，那么使用多特异性分子例如DVD-Ig的组织交叉反应性研究的复杂进行将得到大大简化。
B12.特异性和选择性：
为了生成具有所需特异性和选择性的DVD-Ig分子，人们需要生成并选择具有类似的所需特异性和选择性概况的亲本mAbs。
利用DVD-Ig的特异性和选择性的结合研究可以由于四个或更多结合位点(每个抗原各两个)而复杂化。简而言之，利用DVD-Ig使用ELISA、BIAcore、KinExA或其他相互作用研究的结合研究，需要监控一个、两个或更多个抗原对DVD-Ig分子的结合。虽然BIAcore技术可以分析多个抗原的顺序、独立结合，但更传统的方法包括ELISA或更现代的技术例如KinExA不可以。因此每个亲本抗体的仔细表征是关键的。在每个个别抗体已对特异性进行表征后，对DVD-Ig分子中个别结合位点的特异性保持的确认就大大简化了。
显而易见的是，如果两个亲本抗体在组合为DVD-Ig之前就对于特异性进行选择，那么确定DVD-Ig特异性的复杂进行就得到大大简化。
抗原-抗体相互作用研究可以采取许多形式，包括许多经典的蛋白蛋白相互作用研究，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、质谱分析法、化学交联、具有光散射的SEC、平衡透析、凝胶渗透、超滤、凝胶层析、大区分析型SEC、微量制备型超速离心(沉降平衡)、分光镜方法、滴定微量热、(在分析型超速离心机中)沉降平衡、(在分析型离心机中)沉降速度、表面等离振子共振(包括BIAcore)。相关参考文献包括“Current Protocols in Protein Science”，John E.Coligan，Ben M.Dunn，David W.Speicher，Paul T，Wingfield(编)，第3卷，第19和20章，JohnWiley & Sons Inc.出版，及其中包括的参考文献，以及“Current Protocolsin Immunology”，John E.Coligan，Barbara E.Bierer，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober(编)，John Wiley & Sons Inc出版，及其中包括的参考文献。
在全血中的细胞因子释放：可以通过细胞因子释放测定研究mAb与人血细胞的相互作用(Wing，M.G.Therapeutic Immunology(1995)，2(4)，183-190；“Current Protocols in Pharmacology”，S.J.Enna，MichaelWilliams，John W.Ferkany，Terry Kenakin，Paul Moser(编)John Wiley &Sons Inc出版；Madhusudan，S.Clinical Cancer Research(2004)，10(19)，6528-6534；Cox，J.Methods(2006)，38(4)，274-282；Choi，I.EuropeanJournal of Immunology(2001)，31(1)，94-106)。简而言之，将各种浓度的mAb与人全血温育24小时。测试的浓度应当包括广泛的范围，包括模拟患者典型血液水平的终浓度(包括但不限于100ng/ml-100μg/ml)。温育后，对上清液和细胞裂解物分析IL-1Rα、TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-8的存在。将对mAb生成的细胞因子浓度概况与阴性人IgG对照和阳性LPS或LPS对照产生的概况进行比较。mAb从细胞上清液和细胞裂解物展示的细胞因子概况与对照人IgG是可比较的。在一个实施方案中，单克隆抗体不和人血细胞相互作用以自发释放炎性细胞因子。
对DVD-Ig的细胞因子释放研究是复杂的，这是由于四个或更多结合位点，每个抗原各两个。简而言之，如此处所述的细胞因子释放研究测量完整DVD-Ig分子对全血细胞或其他细胞系统的作用，但是可以分析是该分子的哪一部分引起细胞因子释放。一旦细胞因子释放已得到检测，就必须确定DVD-Ig制剂的纯度，这是因为一些共纯化细胞组分可以独立地引起细胞因子释放。如果纯度不是问题，那么可能需要采用DVD-Ig片段化(包括但不限于去除Fc部分、分离结合位点等)、结合位点诱变或其他方法来去褶合(deconvolute)任何观察。显而易见的是，如果在组合为DVD-Ig之前对于缺乏细胞因子释放选择两个亲本抗体，那么这种复杂的进行就大大简化。
B13.与用于毒理学研究的其他物种的交叉反应性：
在一个实施方案中，选择对合适的tox物种(例如食蟹猴)有足够交叉反应性个别独抗体。亲本抗体需要结合直向同源物种靶(即食蟹猴)并引发适当的反应(调节、中和、活化)。在一个实施方案中，对直向同源物种靶的交叉反应性(亲和力/能力)应当在人靶的10倍之内。在实践中，对多个物种包括小鼠、大鼠、狗、猴(和其他非人灵长类动物)以及疾病模型物种(即用于哮喘模型的羊)评价亲本抗体。亲本单克隆抗体对tox物种的可接收的交叉反应性允许在相同物种中的进一步DVD-Ig-Ig毒理学研究。出于该原因，两个亲本单克隆抗体应当对共同的tox物种具有可接收的交叉反应性，从而允许在相同物种中的DVD-Ig毒理学研究。
亲本mAbs可以选自能够结合特定靶且本领域众所周知的各种mAbs。这些包括但不限于，抗TNF抗体(美国专利号6,258,562)，抗IL-12和/或抗IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128)；抗IL-18抗体(US2005/0147610 A1)，抗C5，抗CBL，抗CD147，抗gp120，抗VLA-4，抗CD11a，抗CD18，抗VEGF，抗CD40L，抗CD-40(例如，见WO2007124299)、抗Id，抗ICAM-1，抗CXCL13，抗CD2，抗EGFR，抗TGF-β2，抗HGF，抗cMet，抗DLL-4，抗NPR1，抗PLGF，抗ErbB3，抗E-选择蛋白，抗Fact VII，抗Her2/neu，抗F gp，抗CD11/18，抗CD 14，抗ICAM-3，抗RON，抗CD-19，抗CD80(例如，见WO2003039486，抗CD4，抗CD3，抗CD23，抗β2整联蛋白，抗α4β7，抗CD52，抗HLA DR，抗CD22(例如，见美国专利号5,789,554)，抗CD20，抗MIF，抗CD64(FcR)，抗TCRαβ，抗CD2，抗Hep B，抗CA 125，抗EpCAM，抗gp120，抗CMV，抗gpIIbIIIa，抗IgE，抗CD25，抗CD33，抗HLA，抗IGF1，2，抗IGFR，抗VNR整联蛋白，抗IL-1α、抗IL-1β，抗IL-1受体，抗IL-2受体，抗IL-4，抗IL-4受体，抗IL5，抗IL-5受体，抗IL-6，抗IL-8，抗IL-9，抗IL-13，抗IL-13受体，抗IL-17，和抗IL-23(参见Presta LG.2005 Selection，design，and engineering of therapeuticantibodies J Allergy Clin Immunol.116：731-6和http://www.path.cam.ac.uk/～mrc7/humanisation/antibodies.html)。
亲本mAbs还可以选自批准用于在临床试验，或临床用途开发中使用的各种治疗性抗体。此类治疗性抗体包括但不限于，利妥希玛(Rituxan
Figure BPA00001281288901131
IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5,736,137)，批准治疗非何杰金氏淋巴瘤的嵌合抗CD20抗体；HuMax-CD20，目前由Genmab开发中的抗CD20，在美国专利号5,500,362中描述的抗C20抗体，AME-133(Applied Molecular Evolution)，hA20(Immunomedics，Inc.)，HumaLYM(Intracel)，和PRO70769(PCT/US2003/040426，名称为“Immunoglobulin Variants and Uses Thereof”)，曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin
Figure BPA00001281288901132
Genentech)(参见例如美国专利号5,677,171)，批准治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(pertuzumab)(rhuMab-2C4，Omnitarg
Figure BPA00001281288901133
)，目前由Genentech开发中；在美国专利号4,753,894中描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux
Figure BPA00001281288901134
Imclone)(美国专利号4,943,533；PCT WO 96/40210)，在用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗EGFR抗体；ABX-EGF(美国专利号6,235,883)，目前由Abgenix-Immunex-Amgen开发中；HuMax-EGFr(U.S.Ser.No.10/172,317)，目前由Genmab开发中；425，EMD55900，EMD62000，和EMD72000(Merck KGaA)(美国专利号5,558,864；Murthy等人，1987，Arch Biochem Biophys.252(2)：549-60；Rodeck等人，1987，J CellBiochem.35(4)：315-20；Kettleborough等人，1991，Protein Eng.4(7)：773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045；Modjtahedi等人，1993，J.Cell Biophys.1993，22(1-3)：129-46；Modjtahedi等人，1993，Br J Cancer.1993，67(2)：247-53；Modjtahedi等人，1996，Br J Cancer，73(2)：228-35；Modjtahedi等人，2003，Int J Cancer，105(2)：273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences，Canada and Centro de Immunologia Molecular，Cuba(美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo等人，1997，Immunotechnology，3(1)：71-81)；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research，MemorialSloan-Kettering)(Jungbluth等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA.100(2)：639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX，NationalCancer Institute)(PCT WO 0162931A2)；和SC100(Scancell)(PCTWO 01/88138)；阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath
Figure BPA00001281288901135
Millenium)，目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化mAbs；莫罗莫那(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3
Figure BPA00001281288901136
)，由Ortho Biotech/Johnson& Johnson开发的抗CD3抗体，替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin
Figure BPA00001281288901141
)，由IDEC/Schering AG开发的抗CD20抗体，吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg
Figure BPA00001281288901142
)，由Celltech/Wyeth开发的抗CD33(p67蛋白)抗体，阿来塞普(alefacept)(Amevive
Figure BPA00001281288901143
)，由Biogen开发的抗LFA-3Fc融合物)，阿昔单抗(ReoPro
Figure BPA00001281288901144
)，由Centocor/Lilly开发，巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect)，由Novartis开发，帕利珠单抗(palivizumab)(Synagis
Figure BPA00001281288901146
)，由Medimmune开发，英夫单抗(Remicade
Figure BPA00001281288901147
)，由Centocor开发的抗TNFα抗体，阿达木单抗(adalimumab)(Humira)，由Abbott开发的抗TNFα抗体，Humicade
Figure BPA00001281288901149
由Celltech开发的抗TNFα抗体，戈利木单抗(golimumab)(CNTO-148)，由Centocor开发的完全人TNF抗体，依那西普(etanercept)(Enbrel
Figure BPA000012812889011410
)，由Immunex/Amgen开发的p75TNF受体Fc融合物，来那西普(lenercept)，早先由Roche开发的p55 TNF受体Fc融合物，ABX-CBL，由Abgenix开发中的抗CD147抗体，ABX-IL8，由Abgenix开发中的抗IL8抗体，ABX-MA1，由Abgenix开发中的抗MUC18抗体，Pemtumomab(R1549，90Y-muHMFG1)，由Antisoma开发的抗MUC1，Therex(R1550)，由Antisoma开发中的抗MUC1抗体，AngioMab(AS1405)，由Antisoma开发中，HuBC-1，由Antisoma开发中，由Antisoma开发中的Thioplatin(AS1407)，Antegren
Figure BPA000012812889011411
(那他珠单抗(natalizumab))，由Biogen开发中的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体，VLA-1mAb，由Biogen开发中的抗VLA-1整联蛋白抗体，LTBR mAb，由Biogen开发中的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体，CAT-152，由Cambridge Antibody Technology开发中的抗TGF-β2抗体，ABT 874(J695)，由Abbott开发中的抗IL-12p40抗体，CAT-192，由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发中的抗TGFβ1抗体，CAT-213，由Cambridge Antibody Technology开发中的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白1抗体，LymphoStat-B
Figure BPA000012812889011412
由Cambridge AntibodyTechnology和Human Genome Sciences，Inc.开发中的抗Blys抗体，TRAIL-R1mAb，由Cambridge Antibody Technology和Human GenomeSciences，Inc.开发中的抗TRAIL-R1抗体，Avastin
Figure BPA000012812889011413
贝伐单抗(bevacizumab)，rhuMAb-VEGF)，由Genentech开发中的抗VEGF抗体，由Genentech开发中的抗HER受体家族抗体，抗组织因子(ATF)，由Genentech开发中的抗组织因子抗体，Xolair
Figure BPA000012812889011414
(奥马佐单抗(omalizumab))，由Genentech开发中的抗IgE抗体，Raptiva
Figure BPA000012812889011415
(依法利珠单抗(efalizumab))，由Genentech和Xoma开发中的抗CD11a抗体，MLN-02抗体(以前为LDP-02)，由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发中，HuMax CD4，由Genmab开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Genmab和Amgen开发中的抗IL15抗体，HuMax-Inflam，由Genmab和Medarex开发中，HuMax-Cancer，由Genmab和Medarex和OxfordGcoSciences开发中的抗类肝素酶(heparanase)I抗体，HuMax-Lymphoma，由Genmab和Amgen开发中，HuMax-TAC，由Genmab开发中，IDEC-131，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD40L抗体，IDEC-151(克立昔单抗(clenoliximab))，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD4抗体，IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD80抗体，IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗CD23，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗巨噬细胞移动因子(MIF)抗体，BEC2，由Imclone开发中的抗独特型抗体，IMC-1C11，由Imclone开发中的抗KDR抗体，DC101，由Imclone开发中的抗flk-1抗体，由Imclone开发中的抗VE钙粘着蛋白抗体，CEA-Cide
Figure BPA00001281288901151
(拉贝珠单抗(labetuzumab))，由Immunomedics开发中的抗癌胚抗原(CEA)抗体，LymphoCide
Figure BPA00001281288901152
(依帕珠单抗(epratuzumab))，由Immunomedics开发中的抗CD22抗体，AFP-Cide，由Immunomedics开发中，MyelomaCide，由Immunomedics开发中，LkoCide，由Immunomedics开发中，ProstaCide，由Immunomedics开发中，MDX-010，由Medarex开发中的抗CTLA4抗体，MDX-060，由Medarex开发中的抗CD30抗体，由Medarex开发中的MDX-070，由Medarex开发中的MDX-018，Osidem
Figure BPA00001281288901153
(IDM-1)，以及由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发中的抗Her2抗体，HuMax
Figure BPA00001281288901154
-CD4，由Medarex和Genmab开发中的抗CD4抗体，HuMax-IL15，由Medarex和Genmab开发中的抗IL15抗体，CNTO 148，由Medarex和Centocor/J&J开发中的抗TNFα抗体，CNTO 1275，由Centocor/J&J开发中的抗细胞因子抗体，MOR101和MOR102，由MorphoSys开发中的抗细胞间粘附分子1(ICAM-1)(CD54)抗体，MOR201，由MorphoSys开发中的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体，Nuvion(维西珠单抗(visilizumab))，由Protein Design Labs开发中的抗CD3抗体，HuZAF
Figure BPA00001281288901156
由Protein Design Labs开发中的抗γ干扰素抗体，抗α5β1整联蛋白，由Protein Design Labs开发中，抗IL-12，由Protein Design Labs开发中，ING-1，由Xoma开发中的抗Ep-CAM抗体，Xolair
Figure BPA00001281288901161
(奥马佐单抗)，由Genentech和Novartis开发的人源化抗IgE抗体，和MLN01，由Xoma开发中的抗β2整联蛋白抗体，这个段落中所有此处引用的参考文献都特别引入本文作为参考。在另一个实施方案中，治疗剂包括KRN330(Kirin)；huA33抗体(A33，Ludwig Institute for CancerResearch)；CNTO 95(αV整联蛋白，Centocor)；MEDI-522(αVβ3整联蛋白，Medimmune)；volociximab(αVβ1整联蛋白，Biogen/PDL)；人mAb 216(B细胞糖基化表位，NCI)；BiTE MT103(双特异性CD19xCD3，Medimmune)；4G7xH22(双特异性B细胞xFcγR1，Medarex/MerckKGa)；rM28(双特异性CD28x MAPG，美国专利号EP1444268)；MDX447(EMD 82633)(双特异性CD64x EGFR，Medarex)；Catumaxomab(removab)(双特异性EpCAM x抗CD3，Trion/Fres)；Ertumaxomab(双特异性HER2/CD3，Fresenius Biotech)；oregovomab(OvaRex)(CA-125，ViRexx)；Rencarex
Figure BPA00001281288901162
(WX G250)(碳酸酐酶IX，Wilex)；CNTO 888(CCL2，Centocor)；TRC105(CD105(内皮糖蛋白)，Tracon)；BMS-663513(CD137激动剂，Brystol Myers Squibb)；MDX-1342(CD19，Medarex)；希普利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507)(CD2，Medimmune)；Ofatumumab(Humax-CD20)(CD20，Genmab)；利妥希玛(Rituxan)(CD20，Genentech)；veltuzumab(hA20)(CD20，Immunomedics)；依帕珠单抗(CD22，Amgen)；鲁昔单抗(lumiliximab)(IDEC 152)(CD23，Biogen)；莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)(CD3，Ortho)；HuM291(CD3 fc受体，PDL Biopharma)；HeFi-1，CD30，NCI)；MDX-060(CD30，Medarex)；MDX-1401(CD30，Medarex)；SGN-30(CD30，Seattle Genentics)；SGN-33(林妥珠单抗(Lintuzumab))(CD33，Seattle Genentics)；扎木单抗(Zanolimumab)(HuMax-CD4)(CD4，Genmab)；HCD122(CD40，Novartis)；SGN-40(CD40，Seattle Genentics)；Campath1h(阿来组单抗(Alemtuzumab))(CD52，Genzyme)；MDX-1411(CD70，Medarex)；hLL1(EPB-1)(CD74.38，Immunomedics)；加利昔单抗(Galiximab)(IDEC-144)(CD80，Biogen)；MT293(TRC093/D93)(切割的胶原，Tracon)；HuLuc63(CS1，PDLPharma)；ipilimumab(MDX-010)(CTLA4，Brystol Myers Squibb)；Tremelimumab(Ticilimumab，CP-675，2)(CTLA4，Pfizer)；HGS-ETR1(Mapatumumab)(DR4 TRAIL-R1激动剂，Human Genome Science/GlaxoSmith Kline)；AMG-655(DR5，Amgen)；Apomab(DR5，Genentech)；CS-1008(DR5，Daiichi Sankyo)；HGS-ETR2(来沙木单抗(lexatumumab))(DR5 TRAIL-R2激动剂，HGS)；西妥昔单抗(Erbitux)(EGFR，Imclone)；IMC-11F8，(EGFR，Imclone)；尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(EGFR，YM Bio)；帕尼单抗(Panitumumab)(Vectabix)(EGFR，Amgen)；扎鲁木单抗(Zalutumumab)(HuMaxEGFr)(EGFR，Genmab)；CDX-110(EGFRvIII，AVANT Immunotherapeutics)；阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)(Epcam，Merck)；依决洛单抗(edrecolomab)(Panorex，17-1A)(Epcam，Glaxo/Centocor)；MORAb-003(叶酸受体a，Morphotech)；KW-2871(神经节苷脂GD3，Kyowa)；MORAb-009(GP-9，Morphotech)；CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex)；曲妥珠单抗(Herceptin)(HER2，Celldex)；帕妥珠单抗(rhuMAb 2C4)(HER2(DI)，Genentech)；阿泊珠单抗(apolizumab)(HLA-DRβ链，PDL Pharma)；AMG-479(IGF-1R，Amgen)；抗IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche)；CP 751871(IGF1-R，Pfizer)；IMC-A12(IGF1-R，Imclone)；BIIB022(IGF-1R，Biogen)；Mik-β-1(IL-2Rb(CD122)，Hoffman LaRoche)；CNTO 328(IL6，Centocor)；抗KIR(1-7F9)(杀伤细胞Ig样受体(KIR)，Novo)；Hu3S193(Lewis(y)，Wyeth，Ludwig Institute of Cancer Research)；hCBE-11(LTβR，Biogen)；HuHMFG1(MUC1，Antisoma/NCI)；RAV12(N-联碳水化合物表位，Raven)；CAL(甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP)，University of California)；CT-011(PD1，CureTech)；MDX-1106(ono-4538)(PD1，Medarex/Ono)；MAb CT-011(PD1，Curetech)；IMC-3G3(PDGFRa，Imclone)；巴维昔单抗(bavituximab)(磷脂酰丝氨酸，Peregrine)；huJ591(PSMA，Cornell ResearchFoundation)；muJ591(PSMA，Cornell Research Foundation)；GC1008(TGFb(pan)抑制剂(IgG4)，Genzyme)；英夫单抗(Remicade)(TNFa，Centocor)；A27.15(运铁蛋白受体，Salk Institute，INSERN WO2005/111082)；E2.3(运铁蛋白受体，Salk Institute)；贝伐单抗(Avastin)(VEGF，Genentech)；HuMV833(VEGF，Tsukuba ResearchLab-WO/2000/034337，University of Texas)；IMC-18F1(VEGFR1，Imclone)；IMC-1121(VEGFR2，Imclone).
B.DVD分子的构建：
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子被这样设计，从而使得来自2种不同亲本单克隆抗体的2个不同轻链可变结构域(VL)通过重组DNA技术直接或经由短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域。类似地，重链包含串联连接的2个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区(图1A)。
可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过此处所述方法中的任何一种生成。在一个实施方案中，可变结构域是鼠重或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，可变结构域是CDR嫁接的或人源化的可变重或轻链结构域。在一个实施方案中，可变结构域是人重或轻链可变结构域。
在一个实施方案中，第一个和第二个可变结构域使用重组DNA技术直接互相连接。在另一个实施方案中，可变结构域经由接头序列进行连接。在一个实施方案中，连接2个可变结构域。3个或更多可变结构域也可以直接或经由接头序列进行连接。可变结构域可以结合相同抗原或可以结合不同抗原。本发明的DVD分子可以包括1个免疫球蛋白可变结构域和1个非免疫球蛋白可变结构域，例如受体的配体结合结构域，酶活性结构域。DVD分子也可以包含2个或更多非Ig结构域。
接头序列可以是单个氨基酸或多肽序列。在一个实施方案中，接头序列选自AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO：1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：2)；AKTTPKLGG(SEQ ID NO：3)；SAKTTPKLGG(SEQ ID NO：4)；SAKTTP(SEQ ID NO：5)；RADAAP(SEQ ID NO：6)；RADAAPTVS(SEQ ID NO：7)；RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO：8)；RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO：9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：10)；ADAAP(SEQ ID NO：11)；ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO：12)；TVAAP(SEQ ID NO：13)；TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO：14)；QPKAAP(SEQ ID NO：15)；QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO：16)；AKTTPP(SEQ ID NO：17)；AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO：18)；AKTTAP(SEQ ID NO：19)；AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO：20)；ASTKGP(SEQ ID NO：21)；ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO：22)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：23)；GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO：24)；GPAKELTPLKEAKVS(SEQ ID NO：25)；GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO：26)。接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键合。这种天然键合包含约10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。本发明的DVD Igs使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基，或11-12个氨基酸残基分别作为DVD-Igs轻链和重链中的接头来生成。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，因此可以充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，因此使可能由接头和接点引起的任何免疫原性大程度地降到最低。
其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可以来自Cκ或Cλ；且重链接头可以来源于任何同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列还可以来源于其他蛋白例如Ig样蛋白，(例如，TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列(例如，G4S重复)；铰链区衍生的序列；和来自其他蛋白的其他天然序列。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接的可变结构域连接。在一个实施方案中，包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，且包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接。在一个实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，DVD重链与Fc区进一步连接。Fc区可以是天然序列Fc区，或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区。
在另一个实施方案中，将2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽组合，以形成DVD-Ig分子。表2列出了用于治疗疾病(例如治疗癌症)的靶的示例性抗体的VH和VL区氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了以任何方向包含至少两个表2所列VH和/或VL区的DVD。
表2：用于生成DVD-Igs的抗体VH和VL区氨基酸序列表
Figure BPA00001281288901201
Figure BPA00001281288901221
Figure BPA00001281288901231
Figure BPA00001281288901241
Figure BPA00001281288901251
Figure BPA00001281288901271
能够结合特定靶的特异性DVD-Ig分子的详细描述及其制备方法，在下文实施例部分中提供。
C.DVD蛋白的生产
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD重和DNA轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的DVD蛋白，在真核细胞中表达DVD蛋白，例如哺乳动物宿主细胞，因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD蛋白。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2和PER.C6细胞。当编码DVD蛋白的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，DVD蛋白通过将宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许DVD蛋白在宿主细胞中表达，或DVD蛋白分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。DVD蛋白可以使用标准蛋白纯化法从培养基中回收。
在用于重组表达本发明的DVD蛋白的示例性系统中，编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，DVD重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD蛋白。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD蛋白。更进一步地，本发明提供了合成本发明的DVD蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的DVD蛋白被合成实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离DVD蛋白。
DVD-Ig的重要特征是它可以以与常规抗体相似的方式生产和纯化。DVD-Ig的生产导致具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要产物，而无恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰。生成“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其他先前描述的方法不导致单一的主要产物，而是导致装配的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白，和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的混合物的细胞内或分泌的生产。例如，基于由Miller和Presta(PCT公开WO2001/077342(A1)描述的设计，存在重和轻链的16种可能组合。因此只有6.25％的蛋白可能处于所需活性形式，而非与其他15个可能组合相比作为单一主要产物或单一原始产物。使用标准层析技术使所需完全活性形式的蛋白与无活性和部分活性形式的蛋白分离仍有待证实，所述标准层析技术一般在大规模制备中使用。
令人惊讶的是，本发明的“双重特异性多价全长结合蛋白”的设计导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，所述轻链和重链主要装配成所需“双重特异性多价全长结合蛋白”。
至少50％、至少75％且至少90％装配且表达的双重可变结构域免疫球蛋白分子是所需双重特异性四价蛋白。本发明的这个方面特别增强了本发明的商业效用。因此，本发明包括在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一主要产物的方法。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的50％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的75％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单个细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的90％，包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
II.衍生化的DVD结合蛋白：
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的结合蛋白用另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白)衍生化或连接。例如，本发明的标记的结合蛋白可以通过使本发明的结合蛋白与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药学试剂、和/或可以介导结合蛋白与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
本发明的结合蛋白可以由之衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。结合蛋白也可以用可检测酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当结合蛋白用可检测酶衍生化时，它通过添加酶用于生产可检测反应产物的另外的试剂进行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。结合蛋白也可以用生物素衍生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白以及包含此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶化后保留生物学活性。
本发明的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如WO 02072636中公开的方法来生产，所述文献引入本文作为参考。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白生产可以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可以酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子作用有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有最低限度的作用(R.Jefferis，Biotechnol.Prog.21(2005)，第11-16页)。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻(Co，M.S.等人，Mol.Immunol.(1993)30：1361-1367)，或导致对抗原的亲和力增加(Wallick，S.C.等人，Exp.Med.(1988)168：1099-1109；Wright，A.等人，EMBO J.(1991)10：27172723)。
本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O或N联糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知的技术来生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目的。
在另外一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分的糖基化得到修饰。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即该抗体缺乏糖基化)。糖基化可以进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以制备导致一个或多个可变区糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，以从而消除那个位点上的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法在PCT公开WO2003016466A2，以及美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述，所述文献各自整体引入本文作为参考。
此外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的本发明修饰的结合蛋白，例如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足(hypofucosylated)抗体(见Kanda，Yutaka等人，Journal of Biotechnology(2007)，130(3)，300-310.)，或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机器的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机器的细胞已在本领域得到描述，且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以从而生产具有改变的糖基化的抗体。参见，例如，Shields，R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740；Umana等人(1999)Nat.Biotech.17：176-1，以及欧洲专利号：EP1,176,195；PCT公开WO 03/035835；WO 99/54342 80，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
蛋白糖基化取决于目的蛋白的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于此种因素，蛋白糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在一个实施方案中，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
不同的蛋白糖基化可以导致不同的蛋白特征，这是本领域技术人员已知的。例如，与哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白的那种相比较，在微生物宿主例如酵母中生产，和利用酵母内源性途径糖基化的治疗蛋白的功效可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白从血流中快速清除。其他不利效应可以包括蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白或因子识别、抗原性、或变应原性中的变化。因此，从业者可能选择具有特定糖基化组成和模式的治疗蛋白，例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中生产的那种的糖基化组成和模式。
表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中生产的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞那种的蛋白糖基化(美国专利申请20040018590和20020137134以及PCT申请WO2005100584 A2)。
除了结合蛋白，本发明还涉及对本发明的此种结合蛋白特异的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体是识别独特决定簇的抗体，所述独特决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。抗Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫接种动物来制备。免疫接种的动物将识别，且对免疫接种抗体的独特型决定簇应答且产生抗Id抗体。显而易见的是，可能更容易对整合到DVD-Ig分子中的两个或更多亲本抗体生成抗独特型抗体；而且通过本领域公认的方法(例如BIAcore、ELISA)确认结合研究，以验证对各个亲本抗体的独特型特异的抗独特型抗体也识别DVD-Ig背景中的独特型(例如抗原结合部位)。对DVD-Ig的两个或更多个抗原结合部位中的每一个特异的抗独特型抗体为测量患者血清中人DVD-Ig的DVD-Ig浓度提供了理想试剂；可以使用“夹心测定ELISA形式”确立DVD-Ig浓度测定，其中，针对第一个抗原结合区域的抗体包被于固相(例如BIAcore芯片、ELISA板等)上，以冲洗缓冲液冲洗，与血清样品温育，另一个冲洗步骤以及最后与针对另一个抗原结合部位的另一个抗独特型抗体温育，其自身被酶促标记以用于定量结合反应。在一个实施方案中，对于具有多于两个不同的结合部位的DVD-Ig，针对两个最外部结合部位(距恒定区最远和最近)的抗独特型抗体将不仅有助于确定人血清中的DVD-Ig浓度，而且也证明体内分子的完整性。每个抗Id抗体也可以用作“免疫原”以在另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗抗Id抗体。
此外，本领域技术人员将理解，目的蛋白可以使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使得文库的成员宿主细胞生产具有变体糖基化模式的目的蛋白。从业者随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白。在一个实施方案中，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。
III.DVD-Ig的用途
已知其与2种或更多抗原结合的能力，本发明的结合蛋白可以用于检测抗原(例如，在生物样品中，例如血清或血浆)，其中使用常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。DVD-Ig用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白能够在体外和体内中和抗原活性。因此，此种DVD-Igs可以例如，在包含抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本发明的结合蛋白与其交叉反应的抗原的其他哺乳动物受试者中用于抑制抗原活性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少受试者中的抗原活性的方法，所述受试者患有其中抗原活性是有害的疾病或病症。本发明的结合蛋白可以施用于人受试者用于治疗目的。
如本文使用的，术语“其中抗原活性是有害的病症”预期包括疾病或其他病症，其中患有该病症的受试者中抗原的存在已显示或怀疑负责病症的病理生理学或是促进病症恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害的病症是其中抗原活性减少预期减轻病症症状和/或进展的病症。此种病症可以例如由患有病症的受试者生物学流体中抗原浓度的增加(例如受试者血清、血浆、滑液等中抗原浓度的增加)来证实。可以用本发明的结合蛋白治疗的病症的非限制性例子包括下文以及关于本发明抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。
本发明的DVD-Igs可以结合一种抗原或多种抗原。此种抗原包括但不限于，下述数据库中列出的靶，所述数据库引入本文作为参考。这些靶数据库包括下述列表：
治疗靶(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；
细胞因子和细胞因子受体(http://www.cytokinewebfacts.com/，http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi，和
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；
趋化因子(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；
趋化因子受体和GPCRs(http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html，http://www.gpcr.org/7tm/)；
嗅感受器(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；
受体(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；
癌症靶(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；
作为可能的抗体靶的分泌的蛋白(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；
蛋白激酶(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)，和
人CD标记(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(ZolaH，2005 CD molecules 2005：human cell differentiation molecules Blood，106：3123-6)。
DVD-Igs作为治疗剂以同时阻断2种不同靶以增强功效/安全性和/或增加患者覆盖度是有用的。此种靶可包括可溶性靶(TNF)和细胞表面受体靶(VEGFR和EGFR)。它还可以用于诱导肿瘤细胞和T细胞(Her2和CD3)之间改变方向的细胞毒性用于癌症治疗，或自体反应细胞或效应细胞之间改变方向的细胞毒性用于自身免疫病或移植，或任何靶细胞和效应细胞之间改变方向的细胞毒性以消除任何给定疾病中的致病细胞。
此外，当DVD-Ig设计成靶向相同受体上的2种不同表位时，它可以用于触发受体成簇和活化。这在制备激动性和拮抗性抗GPCR治疗剂中可能具有益处。在这种情况下，DVD-Ig可以用于靶向一种细胞上的2种不同表位(包括在两个环区以及细胞外结构域上的表位)用于成簇/发信号(2种细胞表面分子)或发信号(对于一种分子)。类似地，DVD-Ig分子可以设计成通过靶向CTLA-4细胞外结构域的2种不同表位(或相同表位的2个拷贝)，触发CTLA-4连接和负信号，从而导致免疫应答下调。CTLA-4是用于治疗性处理许多免疫学病症的临床上确认的靶。CTLA-4/B7相互作用通过减弱细胞周期进展、IL-2生产、和活化后的T细胞增殖负调节T细胞活化，且CTLA-4(CD152)衔接可以下调T细胞活化且促进免疫耐受性的诱导。然而，通过激动性抗体衔接CTLA-4减弱T细胞活化的策略仍是不成功的，这是因为CTLA-4活化需要连接。如通过晶体结构分析证实的(Stamper 2001 Nature 410：608)，CTLA-4/B7的分子相互作用为“歪斜拉链”排列。然而，目前可用的CTLA-4结合试剂没有一种具有连接性质，包括抗CTLA-4mAbs。已存在解决这个问题的几种尝试。在一种情况下，细胞膜结合的单链抗体被生成，且显著抑制小鼠中的同种异体排斥(Hwang 2002 JI 169：633)。在分开的情况下，针对CTLA-4的人工APC表面连接的单链抗体被生成且显示减弱T细胞应答(Griffin 2000 JI 164：4433)。在2种情况下，CTLA-4连接通过使膜结合的抗体紧密局限在人工系统中来完成。尽管这些实验提供了通过触发CTLA-4负发信号用于免疫下调的概念验证(proof-of-concept)，但这些报道中使用的试剂不适合于治疗用途。为此，CTLA-4连接可以通过使用DVD-Ig分子来达到，所述DVD-Ig分子靶向CTLA-4细胞外结构域的2种不同表位(或相同表位的2个拷贝)。基本原理是跨越IgG 2个结合位点的距离为约
Figure BPA00001281288901351
太大而不能有效连接CTLA-4(2个CTLA-4同二聚体之间
Figure BPA00001281288901352
)。然而，DVD-Ig上2个结合部位(1个臂)之间的距离短得多，也在
Figure BPA00001281288901353
范围中，从而允许CTLA-4的正确连接。
类似地，DVD-Ig可以靶向细胞表面受体复合物的2个不同成员(例如IL-12Rα和β)。此外，DVD-Ig可以靶向CR1和可溶蛋白/病原体，以驱动靶可溶蛋白/病原体的快速清除。
另外，本发明的DVD-Igs可以用于组织特异性递送(靶向组织标记和疾病介质用于增强局部PK，从而达到较高的功效和/或较低的毒性)，包括细胞内递送(靶向内在化受体和细胞内分子)，递送至脑内(靶向运铁蛋白受体和CNS疾病介质用于穿过血脑屏障)。DVD-Ig也可以充当载体蛋白，以经由与那种抗原的非中和表位结合将抗原递送至特定位置，并且也增加抗原的半衰期。此外，DVD-Ig可以设计成与植入患者内的医学设备物理连接，或靶向这些医学设备(参见Burke，Sandra E.；Kuntz，Richard E.；Schwartz，Lewis B.，Zotarolimus eluting stents.Advanced Drug Delivery Reviews(2006)，58(3)，437-446；Surfacecoatings for biological activation and functionalization of medical devices，Hildebrand，H.F.；Blanchemain，N.；Mayer，G.；Chai，F.；Lefebvre，M.；Boschin，F.，Surface and Coatings Technology(2006)，200(22-23)，6318-6324；Drug/device combinations for local drug therapies and infectionprophylaxis，Wu，Peng；Grainger，David W.，Biomaterials(2006)，27(11)，2450-2467；Mediation of the cytokine network in the implantationof orthopedic devices.，Marques，A.P.；Hunt，J.A.；Reis，Rui L.，Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine(2005)，377-397)。简言之，将合适的细胞类型导向医学植入物部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。可替代地，也提供了通过与设备偶联或靶向设备的DVD对设备植入后释放的介质(包括但不限于细胞因子)的抑制。例如，支架多年来已在介入性心脏病学中使用，以清除闭塞动脉且改善至心肌的血流。然而，常规裸金属支架已知在一些患者中引起再狭窄(治疗区域中动脉的再变窄)，且可以导致血凝块。近来，抗CD34抗体包被的支架已得到描述，它通过捕获在血液中各处循环的内皮祖细胞(EPC)来减少再狭窄且阻止血凝块发生。内皮细胞是血管衬里的细胞，允许血液平稳流动。EPCs与支架硬表面附着形成平滑层，所述平滑层不仅促进愈合而且还阻止再狭窄和血凝块，所述再狭窄和血块是以前与支架使用相关的并发症(Aoji等人，2005J Am Coll Cardiol.45(10)：1574-9)。除了改善需要支架的患者的结果外，还存在需要心血管旁路手术的患者的牵涉。例如，用抗EPC抗体包被的假体血管管道(人工动脉)将消除使用来自患者腿或臂的动脉用于旁路手术移植的需要。这将减少外科手术和麻醉时间，这依次将减少冠状动脉外科手术死亡。DVD-Ig以这样的方式设计，从而使得它与细胞表面标记(例如CD34)以及蛋白(或任何种类的表位，包括但不限于蛋白、脂质和多糖)结合，所述细胞表面标记以及蛋白已包被在植入的设备上以促进细胞募集。一般而言此种方法也可以应用于其他医学植入物。可替代地，DVD-Igs可以包被在医学设备上，并且在植入且从设备中释放所有DVDs后(或可能需要另外的新鲜DVD-Ig的任何其他需要，包括已装载的DVD-Ig的老化和变性)，设备可以通过给患者全身施用新鲜DVD-Ig进行再装载，其中DVD-Ig被设计成用一组结合位点与目的靶(细胞因子、细胞表面标记(例如CD34)等)结合，且用另一组与包被在设备上的靶(包括蛋白，任何种类的表位，包括但不限于脂质、多糖和聚合物)结合。这种技术具有扩展包被的植入物有用性的优点。
A.DVD-Igs在各种疾病中的用途
本发明的DVD-Ig分子也可用作治疗分子以治疗各种疾病。此种DVD分子可以结合与特定疾病有关的一种或多种靶。各种疾病中的此种靶的例子在下文描述。
1.人自身免疫和炎症应答
许多蛋白已普遍牵涉于自身免疫和炎症应答，包括C5、CCL1(I-309)、CCL11(嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR 1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、和RNF110(ZNF144)。在一个方面，提供了能够结合此处列出的一种或多种靶的DVD-Igs。
2.哮喘
变应性哮喘的特征在于存在嗜曙红细胞增多、杯形细胞组织转化、上皮细胞改变、气道高反应性(AHR)、和Th2和Th1细胞因子表达、以及血清IgE水平升高。目前已普遍接受气道炎症是成为哮喘发病机理基础的关键因素，涉及炎症细胞及其分泌的介质包括细胞因子和趋化因子的复杂相互影响，所述炎症细胞例如T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞。皮质类固醇是目前用于哮喘的最重要抗炎治疗，然而，它们的作用机理是非特异性的，且存在安全性关心，尤其是在青少年患者群体中。因此证明开发更特异性和靶向的治疗是有正当理由的。越来越多的证据表明小鼠中的IL-13模拟许多哮喘特征，包括AHR、粘液分泌过多和气道纤维化，不取决于嗜酸性炎症(Finotto等人，InternationalImmunology(2005)，17(8)，993-1007；Padilla等人，Journal of Immunology(2005)，174(12)，8097-8105)。
已暗示IL-13在引起与哮喘有关的病理应答中具有关键作用。开发抗IL-13mAb治疗以减少IL-13在肺中的作用是激动人心的新方法，它提供作为哮喘新治疗的相当大的希望。然而，差别免疫途径的其他介质也与哮喘发病机理有关，且除IL-13外，阻断这些介质可能提供另外的治疗利益。此种靶对包括但不限于，IL-13和促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)。TNF-α可以放大哮喘中的炎症应答且可能与疾病严重性关联(McDonnell等人，Progress in Respiratory Research(2001)，31(New Drugs for Asthma，Allergy and COPD)，247-250.)。这暗示阻断IL-13和TNF-α可能具有有益作用，特别是在严重气道疾病中。在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合靶IL-13和TNFα且用于治疗哮喘。
其中炎症和AHR两者可以被评估的动物模型例如OVA-诱导的哮喘小鼠模型，是本领域已知的且可以用于确定各种DVD-Ig分子治疗哮喘的能力。用于研究哮喘的动物模型在下述参考文献中公开：Coffman等人，Journal of Experimental Medicine(2005)，201(12)，1875-1879；Lloyd等人，Advances in Immunology(2001)，77，263-295；Boyce等人，Journalof Experimental Medicine(2005)，201(12)，1869-1873；和Snibson等人，Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology(2005)，35(2)，146-52。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见，Luster等人，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992)，7799-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001)，108(2)，250-257)。
基于此处公开的基本原理以及使用关于功效和安全性的相同评估模型，可以确定DVD-Ig分子可以结合且用于治疗哮喘的其他靶对。在一个实施方案中，此种靶包括但不限于，IL-13和IL-1β，因为IL-1β也牵涉于哮喘中的炎症应答；IL-13和与炎症有关的细胞因子和趋化因子，例如IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；以及IL-13和ADAM8。本发明还提供了能够结合选自下述的与哮喘有关的一种或多种靶的DVD-Igs：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、组胺和组胺受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNF、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR、和壳多糖酶。
3.类风湿性关节炎
全身性疾病类风湿性关节炎(RA)的特征在于关节滑膜中的慢性炎症反应，且伴随软骨变性和近关节骨侵蚀。包括TNF、趋化因子和生长因子的许多促炎细胞因子在患病关节中表达。给RA小鼠模型全身施用抗TNF抗体或sTNFR融合蛋白显示是抗炎和关节保护的。其中用静脉内施用的英夫单抗(嵌合型抗TNFmAb)(Harriman G，Harper LK，SchaibleTF.1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis usinginfliximab，an anti-TNFalpha treatment.Ann Rheum Dis 58 Suppl 1：I61-4)阻断RA患者的TNF活性的临床研究，已提供了下述证据：TNF调节IL-6、IL-8、MCP-1和VEGF生产，免疫和炎症细胞募集到关节内，血管发生，和基质金属蛋白酶1和3的血液水平减少。类风湿性关节炎中炎症途径的更佳理解已导致与类风湿性关节炎有关的其他治疗靶的鉴定。有希望的治疗例如白细胞介素-6拮抗剂(IL-6受体抗体MRA，由Chugai，Roche开发(见Nishimoto，Norihiro等人，Arthritis & Rheumatism  (2004)，50(6)，1761-1769)、CTLA4Ig(abatacept，Genovese Mc等人，2005 Abatacept forrheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition.NEngl J Med.353：1114-23.)，以及抗B细胞治疗(利妥希玛，Okamoto H，Kamatani N.2004 Rituximab for rheumatoid arthritis.N Engl J Med.351：1909)，在过去的一年中已在随机对照试验中进行测试。其他细胞因子已被鉴定且已显示在动物模型中是有利的，包括白细胞介素-15(治疗性抗体HuMax-IL 15，AMG 714见Baslund，Bo等人，Arthritis & Rheumatism(2005)，52(9)，2686-2692)、白细胞介素-17和白细胞介素-18，并且这些试剂的临床试验目前在进行中。组合抗TNF和另一种介质的双重特异性抗体疗法在增强临床功效和/或患者覆盖度方面具有很大的潜能。例如，阻断TNF和VEGF两者可以潜在地根除炎症和血管发生，所述炎症和血管发生都与RA的病理生理学有关。也预期了用特定DVD Igs阻断与RA有关的其他靶对，包括但不限于，TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-23；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-17；TNF和IL-15。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等人，Developments in biological standardization(1992)，77 99-102；Hart等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology(2001)，108(2)，250-257)。DVD Ig分子是否可用于治疗类风湿性关节炎可以使用临床前动物RA模型，例如胶原诱导的关节炎小鼠模型进行评估。其他有用的模型也是本领域众所周知的(参见Brand DD.，Comp Med.(2005)55(2)：114-22)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如，对人和小鼠TNF、人和小鼠IL-15等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠CIA模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两个(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等)。
4.SLE
SLE的免疫病理学标志是多克隆B细胞活化，这导致血球蛋白过多症、自身抗体产生和免疫复合物形成。基本异常似乎是由于广泛性T细胞调节异常，T细胞不能抑制禁忌B细胞克隆。此外，B和T细胞的相互作用通过几种细胞因子例如IL-10，以及共刺激分子例如CD40和CD40L、B7和CD28和CTLA-4得到促进，所述细胞因子和共刺激分子起始第二信号。这些相互作用连同免疫复合物和细胞凋亡材料的受损吞噬清除，使免疫应答与所产生的组织损害永存。下述靶可能与SLE有关且可以潜在地用于DVD-Ig方法用于治疗干预：B细胞靶向的治疗：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA、和NT5E.；共刺激信号：CTLA4或B7.1/B7.2；B细胞存活抑制：BlyS，BAFF；补体失活：C5；细胞因子调节：关键原理是任何组织中的净生物学应答是促炎或抗炎细胞因子局部水平之间平衡的结果(参见Sfikakis PP等人，2005 Curr Opin Rheumatol 17：550-7)。SLE被视为具有文件证明的血清IL-4、IL-6、IL-10升高的Th-2驱动的疾病。也预期了能够结合选自下述的一种或多种靶的DVD Igs：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α、和TNF-α。此处讨论的靶组合将增强关于SLE的治疗功效，所述治疗功效可以在许多狼疮临床前模型中进行测试(参见Peng SL(2004)Methods Mol Med.；102：227-72)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠CD20、人和小鼠干扰素α等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠狼疮模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两个(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等)。
5.多发性硬化
多发性硬化(MS)是具有主要未知病因的复杂人自身免疫型疾病。遍及神经系统的髓鞘碱性蛋白(MBP)的免疫学破坏是多发性硬化的主要病理学。MS是具有复杂病理学的疾病，所述病理学涉及经由CD4+和CD8+T细胞的浸润和中枢神经系统内的应答。细胞因子、活性氮种类和共刺激分子在CNS中的表达都已在MS中得到描述。主要考虑是促成自身免疫发展的免疫学机制。具体地，抗原表达、细胞因子和白细胞相互作用、以及帮助平衡/调节其他T细胞例如Th1和Th2细胞的调节性T细胞，是关于治疗靶鉴定的重要范围。
IL-12是由APC生产且促进Th1效应细胞分化的促炎细胞因子。IL-12在患有MS的患者的发展中的疾灶中以及受EAE影响的动物中产生。先前显示干扰IL-12途径有效阻止啮齿类动物中的EAE，且使用抗IL-12mAb体内中和IL-12p40在普通狨猴中在髓鞘诱导的EAE模型中具有有利作用。
TWEAK是TNF家族成员，在中枢神经系统(CNS)中组成型表达，取决于细胞类型具有促炎、增殖或细胞凋亡作用。它的受体Fn14由内皮细胞、反应性星形胶质细胞和神经元在CNS中表达。TWEAK和Fn14mRNA表达在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)期间在脊髓中增加。当小鼠在初始期(priming phase)后进行处理时，在C57BL/6小鼠中抗TWEAK抗体处理髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG)诱导的EAE导致疾病严重性减少和白细胞浸润。
本发明的一个方面涉及能够结合选自下述的一种或多种，例如2种靶的DVD Ig分子：IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52、和CCR2。一个实施方案包括双重特异性抗IL-12/TWEAK DVD Ig作为对MS治疗有利的治疗剂。
用于评估DVD分子治疗MS有用性的几种动物模型是本领域已知的(参见Steinman L等人，(2005)Trends Immunol.26(11)：565-71；Lublin FD.等人，(1985)Springer Semin Immunopathol.8(3)：197-208；Genain CP等人，(1997)J Mol Med.75(3)：187-97；Tuohy VK等人，(1999)J Exp Med.189(7)：1033-42；Owens T等人，(1995)NeurolClin.13(1)：51-73；和’t Hart BA等人，(2005)J Immunol 175(7)：4761-8。基于亲本抗体对人和动物物种直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠IL-12、人和小鼠TWEAK等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠EAE模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两个(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和能力、相似的半衰期等)。将同样的概念应用于其他非啮齿类动物物种中的动物模型，其中将选择“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig用于预期的药理学和可能的安全性研究。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人，Toxicology(1994)，92(1-3)，229-43；Descotes等人，Developmentsin biological standardization(1992)，77 99-102；Jones R.2000Rovelizumab(ICOS Corp).IDrugs.3(4)：442-6)。
6.脓毒病
脓毒病的病理生理学由革兰氏阴性生物(脂多糖[LPS]、脂质A、内毒素)和革兰氏阳性生物(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜组分起始。这些外膜组分能够与单核细胞表面上的CD14受体结合。由于近期描述的toll样受体，信号随后传递给细胞，从而导致促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1(IL-1)的最终生产。压倒性的炎症和免疫应答是脓毒性休克的基本特征，且在由脓毒病诱导的组织损伤、多器官衰竭和死亡发病机理中起重要作用。细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL-1)，已显示是脓毒性休克的关键介质。这些细胞因子对组织具有直接的毒性作用；它们还激活磷脂酶A2。这些及其他作用导致血小板活化因子浓度增加，促进氧化氮合酶活性，促进经由嗜中性粒细胞的组织浸润，和促进嗜中性粒细胞的活性。
脓毒病和脓毒性休克治疗仍是临床难题，且使用针对炎症应答的生物学反应调节剂(即抗TNF、抗MIF)的近期预期试验仅显示适度的临床利益。近期，兴趣已转向针对逆转伴随的免疫抑制时间段的治疗。实验动物和危急患病患者中的研究已证实淋巴器官和一些实质组织细胞凋亡增加促成这种免疫抑制、无反应性、和器官系统功能障碍。在脓毒病综合征期间，淋巴细胞的细胞凋亡可以由IL-2的不存在或由糖皮质激素、粒酶或所谓的‘死亡’细胞因子：肿瘤坏死因子α或Fas配体释放来触发。细胞凋亡经由胞质和/或线粒体胱天蛋白酶的自体活化而进展，所述自体活化可以受Bcl-2家族的促和抗细胞凋亡成员的影响。在实验动物中，使用细胞凋亡抑制剂的处理不仅可以阻止淋巴样细胞的细胞凋亡；它还改善结果。尽管在很大程度上由于与其施用和组织靶向相关的技术困难，使用抗细胞凋亡剂的临床试验仍然遥远，但淋巴细胞的细胞凋亡抑制代表关于脓毒性患者的吸引人的治疗靶。同样地，靶向炎症介质和细胞凋亡介质两者的双重特异性试剂可能具有附加利益。本发明的一个方面涉及能够结合选自下述的与脓毒病有关的一种或多种靶，在一个实施方案中为两种靶的DVD Ig：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll样受体、TLR-4、组织因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1、和TREM1。此种DVD Igs对于脓毒病的功效可以在本领域已知的临床前动物模型中进行评估(参见Buras JA等人，(2005)Nat Rev Drug Discov.4(10)：854-65和Calandra T等人，(2000)Nat Med.6(2)：164-70)。
7.神经障碍
7.1.神经变性疾病
慢性神经变性疾病通常是依赖年龄的疾病，其特征在于神经元功能的渐进性丧失(神经元细胞死亡、脱髓鞘)，活动度丧失和记忆丧失。成为慢性神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)基础的机制的新出现的知识显示了复杂的病因学，且多种因素已被识别为促进其发展和进展，例如年龄，升糖(glycemic)状态，淀粉状蛋白生产和多聚化，与其受体RAGE(关于AGE的受体)结合的晚期糖化终产物(AGE)积聚，脑氧化应激增加，脑血流量减少，神经炎症包括炎症细胞因子和趋化因子释放，神经元功能障碍和小胶质细胞活化。因此这些慢性神经变性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此种疾病的治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂(例如皮质类固醇、COX抑制剂)或试剂阻断炎症性过程，以阻止神经元丧失和/或突触功能。这些治疗不能阻止疾病进展。近期研究暗示更加靶向的治疗，例如针对可溶性A-b肽(包括A-b寡聚形式)的抗体，不仅帮助阻止疾病进展而且还帮助维持记忆。这些初步观察暗示靶向超过一种疾病介质(例如A-b和促炎细胞因子例如TNF)的特异疗法，可以提供比使用靶向单一疾病机制(例如单独的可溶性A-b)观察到的甚至更好的对慢性神经变性疾病的治疗功效(参见C.E.Shepherd等人，Neurobiol Aging.2005Oct 24；Nelson RB.，Curr Pharm Des.2005；11：3335；William L.Klein.；Neurochem Int.2002；41：345；Michelle C Janelsins等人，JNeuroinflammation.2005；2：23；Soloman B.，Curr Alzheimer Res.2004；1：149；Igor Klyubin等人，Nat Med.2005；11：556-61；Arancio O等人，EMBO Journal(2004)1-10；Bornemann KD等人，AmJ Pathol.2001；158：63；Deane R等人，Nat Med.2003；9：907-13；和Eliezer Masliah等人，Neuron.2005；46：857)。
本发明的DVD-Ig分子可以结合与慢性神经变性疾病例如阿尔茨海默病有关的一种或多种靶。此种靶包括但不限于，牵涉于AD发病机理的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如AGE(S100A，两性蛋白(amphoterin))、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MCP 1)、抑制神经再生的分子(例如Nogo，RGM A)、增强神经突生长的分子(神经营养蛋白)。DVD-Ig分子的功效可以在临床前动物模型中进行验证，例如超表达淀粉状前体蛋白或RAGE且发展阿尔茨海默氏病样症状的转基因小鼠。此外，可以构建DVD-Ig分子并在动物模型中测试功效，并且可以选择最佳的治疗DVD-Ig用于在人患者中测试。DVD-Ig分子也可以用于治疗其他神经变性疾病例如帕金森氏病。α-突触核蛋白(Synuclein)与帕金森氏病理学有关。能够靶向α-突触核蛋白和炎症介质例如TNF、IL-1、MCP-1的DVD-Ig可以证明是对于帕金森氏病的有效治疗，且在本发明中被预期。
7.2神经元再生和脊髓损伤
尽管病理学机制的知识增加，但脊髓损伤(SCI)仍是破坏性状况且代表特征在于高医学需要的医学适应症。大多数脊髓损伤是挫伤或压迫损伤，并且原发性损伤通常随后为继发性损伤机制(炎症介质例如细胞因子和趋化因子)，所述继发性损伤机制使最初损伤恶化且导致损害区域显著放大，有时超过10倍。SCI中的这些原发性和继发性机制非常类似于由其他方式例如中风引起的脑损伤中的那些。没有令人满意的治疗，且高剂量单次快速静脉注射甲基强的松龙(MP)是损伤后8小时窄时间窗内唯一使用的治疗。然而，这种治疗只预期阻止继发性损伤而不产生任何显著的功能恢复。它因为缺乏明确功效和严重的不利作用而受到猛烈批评，所述不利作用如具有后续感染的免疫抑制和严重组织病理学肌肉改变。没有批准刺激内源性再生潜能的其他药物、生物制剂或小分子，但近年来有希望的治疗原理和药物候选物已在SCI动物模型中显示功效。人SCI中的功能恢复缺乏在很大程度上由抑制神经突生长的因子引起，所述因子在损害部位处、在瘢痕组织中、在髓鞘质中以及损伤相关细胞上。此种因子是髓鞘相关蛋白NogoA、OMgp和MAG、RGMA、瘢痕相关CSPG(硫酸软骨素蛋白聚糖)和关于反应性星形胶质细胞的抑制因子(有时为脑信号蛋白和肝配蛋白)。然而，在损害部位处，不仅发现了生长抑制分子，而且还发现了神经突生长刺激因子，如神经营养蛋白、层粘连蛋白、L1等。神经突生长抑制和生长促进分子的这种总体可能解释了，阻断单一因子如NogoA或RGM A在啮齿类动物SCI模型中导致显著的功能恢复，因为抑制影响的减少可以使平衡从生长抑制转移到生长促进。然而，对于阻断单个神经突长出抑制分子观察到的恢复并不完全。为了达到更快速和更显著的恢复，可能需要阻断2种神经突长出抑制分子例如Nogo和RGM A，或阻断神经突长出抑制分子并增强神经突长出增强分子例如Nogo和神经营养蛋白的功能，或阻断神经突长出抑制分子例如Nogo和促炎分子例如TNF(参见McGee AW等人，Trends Neurosci.2003；26：193；Marco Domeniconi等人，J NeurolSci.2005；233：43；Milan Makwana1等人，FEBS J.2005；272：2628；Barry J.Dickson，Science.2002；298：1959；Felicia Yu HsuanTeng等人，J Neurosci Res.2005；79：273；Tara Karnezis等人，NatureNeuroscience 2004；7，736；Gang Xu等人，J.Neurochem.2004；91；1018)。
在一个方面，提供了能够结合下述靶对的DVD-Igs，所述靶对例如NgR和RGM A；NogoA和RGM A；MAG和RGM A；OMGp和RGM A；RGM A和RGM B；CSPGs和RGM A；聚集蛋白聚糖、中期因子、神经蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、磷酸聚糖、Te38和TNF-α；与促进树突和轴突萌发的抗体组合的Aβglobulomer-特异性抗体。树突病理学是非常早期的AD病征，且已知NOGO A限制树突生长。人们可以将此种ab类型与任何SCI候选(髓鞘蛋白)Ab组合。其他DVD-Ig靶可以包括NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp的任何组合。此外，靶还可以包括牵涉于神经突抑制的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、脑信号蛋白、肝配蛋白、可溶性A-b、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MIP 1a)、抑制神经再生的分子。抗nogo/抗RGM A或类似DVD-Ig分子的功效可以在脊髓损伤的临床前动物模型中进行验证。此外，可以构建这些DVD-Ig分子并在动物模型中测试功效，并且可以选择最佳的治疗DVD-Ig用于在人患者中测试。此外，可以构建靶向单个受体上的2个不同配体结合位点的DVD-Ig分子，所述受体例如结合3种配体Nogo、Ompg和MAG的Nogo受体，以及结合A-b和S100A的RAGE。此外，神经突长出抑制剂例如nogo和nogo受体，也在免疫学疾病如多发性硬化中阻止神经再生方面起作用。nogo-nogo受体相互作用的抑制已显示增强多发性硬化动物模型中的恢复。因此，可以阻断一种免疫介质例如细胞因子如IL-12和神经突长出抑制剂分子例如nogo或RGM功能的DVD-Ig分子，可以提供比阻断单独的免疫或神经突长出抑制剂分子更快和更大的功效。
8.肿瘤学病症
单克隆抗体治疗已显现为关于癌症的重要治疗方式(von Mehren M，等人，2003 Monoclonal antibody therapy for cancer.Annu Rev Med.；54：343-69)。抗体可以通过下述发挥抗肿瘤作用：诱导细胞凋亡、改变方向的细胞毒性、干扰配体-受体相互作用、或阻止对瘤表型关键的蛋白表达。此外，抗体可以靶向肿瘤微环境组分，干扰重要结构例如肿瘤相关脉管系统的形成。抗体还可以靶向其配体是生长因子的受体，例如表皮生长因子受体。抗体因此抑制刺激细胞生长的天然配体与靶向的肿瘤细胞结合。可替代地，抗体可以诱导抗独特型网络、补体介导的细胞毒性、或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。与单特异性治疗比较，靶向2种分开的肿瘤介质的双重特异性抗体的使用将可能产生附加利益。能够结合下述靶对以治疗肿瘤学疾病的DVD Igs也是预期的：IGF1和IGF2；IGF1/2和HER-2；VEGFR和EGFR；CD20和CD3；CD138和CD20；CD38和CD20；CD38和CD138；CD40和CD20；CD138和CD40；CD38和CD40；CD-20和CD-19；CD-20和EGFR；CD-20和CD-80；CD-20和CD-22；CD-3和HER-2；CD-3和CD-19；EGFR和HER-2；EGFR和CD-3；EGFR和IGF1，2；EGFR和IGF1R；EGFR和RON；EGFR和HGF；EGFR和c-MET；HER-2和IGF1，2；HER-2和IGF1R；RON和HGF；VEGF和EGFR；VEGF和HER-2；VEGF和CD-20；VEGF和IGF1，2；VEGF和DLL4；VEGF和HGF；VEGF和RON；VEGF和NRP1；CD20和CD3；VEGF和PLGF；DLL4和PLGF；ErbB3和EGFR；HGF和ErbB3，HER-2和ErbB3；c-Met和ErbB3；HER-2和PLGF；HER-2和HER-2。
在另一个实施方案中，本发明的DVD能够结合VEGF和磷脂酰丝氨酸；VEGF和ErbB3；VEGF和PLGF；VEGF和ROBO4；VEGF和BSG2；VEGF和CDCP1；VEGF和ANPEP；VEGF和c-MET；HER-2和ERB3；HER-2和BSG2；HER-2和CDCP1；HER-2和ANPEP；EGFR和CD64；EGFR和BSG2；EGFR和CDCP1；EGFR和ANPEP；IGF1R和PDGFR；IGF1R和VEGF；IGF1R和CD20；CD20和CD74；CD20和CD30；CD20和DR4；CD20和VEGFR2；CD20和CD52；CD20和CD4；HGF和c-MET；HGF和NRP1；HGF和磷脂酰丝氨酸；ErbB3和IGF1R；ErbB3和IGF1，2；c-Met和Her-2；c-Met和NRP1；c-Met和IGF1R；IGF1，2和PDGFR；IGF1，2和CD20；IGF1，2和IGF1R；IGF2和EGFR；IGF2和HER2；IGF2和CD20；IGF2和VEGF；IGF2和IGF1R；IGF1和IGF2；PDGFRa和VEGFR2；PDGFRa和PLGF；PDGFRa和VEGF；PDGFRa和c-Met；PDGFRa和EGFR；PDGFRb和VEGFR2；PDGFRb和c-Met；PDGFRb和EGFR；RON和c-Met；RON和MTSP1；RON和MSP；RON和CDCP1；VGFR1和PLGF；VGFR1和RON；VGFR1和EGFR；VEGFR2和PLGF；VEGFR2和NRP1；VEGFR2和RON；VEGFR2和DLL4；VEGFR2和EGFR；VEGFR2和ROBO4；VEGFR2和CD55；LPA和S1P；EPHB2和RON；CTLA4和VEGF；CD3和EPCAM；CD40和IL6；CD40和IGF；CD40和CD56；CD40和CD70；CD40和VEGFR1；CD40和DR5；CD40和DR4；CD40和APRIL；CD40和BCMA；CD40和RANKL；CD28和MAPG；CD80和CD40；CD80和CD30；CD80和CD33；CD80和CD74；CD80和CD2；CD80和CD3；CD80和CD19；CD80和CD4；CD80和CD52；CD80和VEGF；CD80和DR5；CD80和VEGFR2；CD22和CD20；CD22和CD80；CD22和CD40；CD22和CD23；CD22和CD33；CD22和CD74；CD22和CD19；CD22和DR5；CD22和DR4；CD22和VEGF；CD22和CD52；CD30和CD20；CD30和CD22；CD30和CD23；CD30和CD40；CD30和VEGF；CD30和CD74；CD30和CD19；CD30和DR5；CD30和DR4；CD30和VEGFR2；CD30和CD52；CD30和CD4；CD138和RANKL；CD33和FTL3；CD33和VEGF；CD33和VEGFR2；CD33和CD44；CD33和DR4；CD33和DR5；DR4和CD137；DR4和IGF1，2；DR4和IGF1R；DR4和DR5；DR5和CD40；DR5和CD137；DR5和CD20；DR5和EGFR；DR5和IGF1，2；DR5和IGFR，DR5和HER-2，EGFR和DLL4。其他靶组合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一个或多个成员。与肿瘤学疾病有关的、DVD Igs可以结合的其他靶(一种或多种)包括但不限于，选自下述的那些：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-钙粘着蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶胶蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整联蛋白)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、SERPINB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(血小板反应蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、BPAG1(网蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(密蛋白-7)、CLU(簇蛋白)、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整联蛋白)、ITGB4(b4整联蛋白)、KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金属硫蛋白-III)、MUC1(粘蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4、和TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、CD64、DLL4、PLGF、CTLA4、磷脂酰丝氨酸、ROBO4、CD80、CD22、CD40、CD23、CD28、CD80、CD55、CD38、CD70、CD74、CD30、CD138、CD56、CD33、CD2、CD137、DR4、DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、VEGFR1、MTSP1、MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、EpCAM、PGE2、NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、MAPG、FLT3、PDGFR-α、PDGFR-β、ROR1、PSMA、PSCA、SCD1和CD59。
IV.药物组合物
本发明还提供了包含本发明的结合蛋白，和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的结合蛋白的药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病症诊断、检测或监控，病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善和/或研究。在具体实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含本发明的一种或多种结合蛋白，以及除本发明结合蛋白外用于治疗病症的一种或多种预防或治疗剂。在一个实施方案中，预防或治疗剂已知在病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的结合蛋白可以掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的结合蛋白和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在一些实施方案中，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存期限或效力。
各种递送系统是已知的，且可以用于施用本发明的一种或多种抗体或本发明的一种或多种抗体与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含雾化剂的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT公开号WO92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，所述专利各自整体引入本文作为参考。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白、组合疗法、或本发明的组合物使用Alkermes AIR
Figure BPA00001281288901531
肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)来施用。在具体实施方案中，本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在一个实施方案中，可以将抗体偶联的碳纳米管(carbonnanotubes)(CNT)与肿瘤细胞在体外的特异性结合、随后为用近红外(NIR)光对其高特异性切除用于靶向肿瘤细胞。例如，可以将生物素化极性脂质用于制备稳定的、生物相容的、非细胞毒性的CNT分散体，然后将所述CNT分散体附着在一个或两个不同的neutralite抗生物素蛋白衍生的DVD-Igs，所述DVD-Igs针对一个或多个肿瘤抗原(例如CD22)(Chakravarty，P.等人，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：8697-8702。
在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，Tissuel)、或胶原基质。在一个实施方案中，有效量的本发明拮抗剂的一种或多种抗体局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，有效量的本发明的一种或多种抗体，与有效量的除本发明结合蛋白外的一种或多种疗法(例如，一种或多种预防或治疗剂)组合，局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵以达到控释或持续释放(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明疗法的控释或持续释放(参见例如，Medical Applications of ControlledRelease，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分(参见，例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页(1984))。
控释系统在Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开WO91/05548，PCT公开WO96/20698，Ning等人，1996，″IntratumoralRadioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using aSustained-Release Gel，″Radiotherapy & Oncology 39：179-189，Song等人，1995，″Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，″PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50：372-397，Cleek等人，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，和Lam等人，1997，″Microencapsulation of RecombinantHumanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，″Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。
在具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用，从而使得其成为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或直接注射，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框样肽连接施用(参见，例如，Joliot等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：1864-1868)。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical DosageForms，第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。在一个实施方案中，对于不可喷雾的局部剂型，使用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，在一个实施方案中，与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如氟利昂)在混合物中包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式常规递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(由例如明胶组成)，用于在吸入器或吹入器中使用。
如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊(gelcaps)、溶液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，所述专利各自整体引入本文作为参考。在具体实施方案中，本发明的结合蛋白、组合疗法、和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR
Figure BPA00001281288901571
肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)来施用。
本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过单次快速静脉注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂容器中)呈递。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以为粉末形式用于在使用前用合适的载体(例如，无菌无致热原水)构建。
本发明的方法可以另外包括配制为积存(depot)制剂的组合物的施用。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如安瓿或囊剂，其指示活性剂的量。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是注射时，可以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
特别地，本发明还提供了包装在密封容器中的本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或囊剂，其指示活性剂的量。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩剂提供，且可以重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg、或至少100mg。冷冻干燥的本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在其原容器中贮存于2℃-8℃，并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用，例如5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内。在可替代的实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。在一个实施方案中，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃-8℃。
本发明的结合蛋白可以掺入适用于肠胃外施用的药物组合物内。在一个实施方案中，抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250mg/ml结合蛋白的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH 5.0-7.0(最佳pH 6.0)。其他合适的缓冲液包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰浓度0-300mM(对于液体剂型最佳150mM)的溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50mM L-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0-0.05％聚山梨醇酯80(最佳0.005-0.01％)包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。制备为可注射溶液用于肠胃外施用、包含本发明的结合蛋白的药物组合物可以进一步包含用作佐剂的试剂，例如用于增加治疗蛋白(例如，抗体)吸收、或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，例如Hylenex(重组人透明质酸酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善肠胃外施用，特别是皮下施用后的人生物利用率。它还允许具有较少疼痛和不适的更大注射部位体积(即大于1ml)，和最低限度的注射部位反应发生率。(参见引入本文作为参考的WO2004078140和US2006104968)
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。选择的形式取决于预期施用方式和治疗应用。一般的组合物为可注射或可输注溶液形式，例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。所选施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物一般必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)与此处列举的一种成分或成分组合一起掺入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来自此处列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，制备方法是由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如利用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管对于许多治疗应用，在一个实施方案中，施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员应当理解的，施用途径和/或模式将依所需结果而变。在某些实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在某些实施方案中，本发明的结合蛋白可以例如，与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(和若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafel)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用材料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发明的结合蛋白与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂可用于与本发明的结合蛋白一起治疗病症。例如，本发明的结合蛋白可以与结合其他靶的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此种组合疗法可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，结合蛋白与本领域已知的半衰期延长载体连接。此种载体包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种载体在例如美国申请系列号09/428,082和公开的PCT申请号WO 99/25044中描述，所述专利为了任何目的在此引入作为参考。
在具体实施方案中，施用编码本发明的结合蛋白或本发明的另一种预防或治疗剂的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理、或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生产其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
本领域可用的任何关于基因治疗的方法可以根据本发明使用。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，Clinical Pharmacy12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；May，1993，TIBTECH 11(5)：155-215。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；和Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY(1990)。各种基因治疗方法的详细描述在引入本文作为参考的US20050042664 A1中公开。
本发明的结合蛋白可用于治疗其中由结合蛋白识别的靶是有害的各种疾病。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/RoyalFree疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷病综合征、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合性结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、
Figure BPA00001281288901621
氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、
Figure BPA00001281288901622
氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症例如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(MencelDejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥。(参见Peritt等人PCT公开号WO2002097048A2，Leonard等人，PCT公开号WO9524918A1和Salfeld等人，PCT公开号WO00/56772A1)。
本发明的结合蛋白可以用于治疗患有自身免疫性疾病的人，所述自身免疫性疾病特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性关节炎、脊椎炎、变态反应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗类风湿性关节炎、Crohn氏病、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和牛皮癣。
在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤例如白血病和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)产生的实体瘤。
在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和/或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防此处所述肿瘤的转移。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以与这样的试剂组合，所述试剂包括但不限于抗瘤剂、放射治疗、化学疗法例如DNA烷化剂、顺铂、碳铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫素、阿霉素、吉西他滨、吉西他宾(gemzar)、蒽环霉素(anthracyclines)、亚得里亚霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、依立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、激酶抑制剂和siRNAs。
本发明的结合蛋白也可以与各种疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用。
本发明的结合蛋白可以单独或组合使用以治疗此种疾病。应当理解结合蛋白可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外的试剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解将包括在本发明内的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以执行其预期功能的话。
治疗自身免疫和炎性疾病的组合是非类固醇消炎药，也称为NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其他组合是皮质类固醇，包括强的松龙；当与本发明的DVD Igs组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本发明的抗体或抗体部分可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括下述：细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA。
治疗剂的组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰；例子包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，阿达木单抗(ADALIMUMAB)、(PCT公开号WO 97/29131)、CA2(RemicadeTM)、CDP 571、和可溶性p55或p75TNF受体，其衍生物(p75TNFR1gG(EnbrelTM)或p55TNFR1gG(Lenercept)，以及TNFα转换酶(TACE)抑制剂；类似地由于相同原因IL-1抑制剂(白细胞介素-1转换酶抑制剂，IL-1RA等)可以是有效的。其他组合包括白细胞介素11。另外一种组合包括自身免疫应答的关键参与物(player)，所述关键参与物与IL-12功能平行作用，依赖于IL-12功能或与IL-12功能一致；特别是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体，或IL-18结合蛋白。已显示IL-12和IL-18具有重叠但不同的功能，且针对二者的拮抗剂组合可能是最有效的。另外一种组合是非耗尽性抗CD4抑制剂。另外一种组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM和p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和美苏帕玛(Mesopram)。组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
也可以与结合蛋白组合使用以治疗类风湿性关节炎的非限制性的另外试剂包括但不限于，下述：非类固醇消炎药(NSAIDs)；细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合抗TNFα抗体；Centocor)；75kdTNFR-IgG/依那西普(75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)；55kdTNF-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(非耗尽性灵长类动物源化(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline；参见，例如Arthritis& Rheumatism(1995)第38卷，S185)；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1993)第36卷，1223)；抗Tac(人源化抗IL-2Rα；Protein Design Labs/Roche)；IL-4(抗炎细胞因子DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10，抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动性抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素(Kineret
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/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart and Circulatory Physiology(1995)第268卷，第37-42页)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如，Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；MK-966(COX-2抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S81)；伊落前列素(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S82)；氨甲蝶呤；沙立度胺(参见例如，Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)和沙立度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟洛米(抗炎和细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)；氨甲环酸(纤溶酶原活化抑制剂；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S284)；T-614(细胞因子抑制剂；参见例如，Arthritis& Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；前列腺素E1(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S282)；替尼达普(非类固醇消炎药；参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S280)；萘普生(非类固醇消炎药；参见例如，Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)；美洛昔康(非类固醇消炎药)；布洛芬(非类固醇消炎药)；吡罗昔康(非类固醇消炎药)；扶他林(非类固醇消炎药)；吲哚美辛(非类固醇消炎药)；柳氮磺吡啶(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；硫唑嘌呤(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S281)；ICE抑制剂(白细胞介素-1β转换酶抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇消炎药(例如，SB203580)；TNF-转变酶抑制剂；抗-IL-12抗体；抗-IL-18抗体；白细胞介素-11(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S296)；白细胞介素-13(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S308)；白细胞介素-17抑制剂(参见例如，Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，No.9(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；强的松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗-IL2R抗体；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如，DeLuca等人(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21：759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；氨甲蝶呤；bcl-2抑制剂(见Bruncko，Milan等人，Journal ofMedicinal Chemistry(2007)，50(4)，641-662)；抗病毒剂；和免疫调谐剂。
在一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分与下述试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫单抗；来氟洛米；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希玛；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18BP；IL-12/13；抗IL 18；抗IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美苏帕玛。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性例子包括下述：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β mAbs；抗-IL-6mAbs；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或其拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制物、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)以及bcl-2抑制剂。
其中结合蛋白可以组合用于Crohn氏病的治疗剂的例子包括下述：TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体，阿达木单抗(ADALIMUMAB)(PCT公开号WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑制剂和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇组合，例如布地奈德和地塞米松。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞发信号抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与IL-11组合。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰素γ。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性例子包括下述：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α(AlfaWassermann/J&J)，干扰素β1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙二醇化干扰素(Peginterferon)α2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或其拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的结合蛋白可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)和bcl-2抑制剂。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于多发性硬化的治疗剂的例子包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；考帕松，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1抑制剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，以及针对CD40配体和CD80的抗体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如阿来组单抗、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、盐酸扎利罗登(xaliproden hydrochloride)、4-氨基吡定、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗、辛纳必醇(sinnabidol)、a-免疫因子(a-immunokine)NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体被囊化的米托蒽醌)、THC.CBD  (大麻素激动剂)、MBP-8298、美苏帕玛(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrap 1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂和IL-4激动剂。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于心绞痛的治疗剂的非限制性例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫
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硝酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸普萘洛尔、卡维地洛、赖诺普利、螺内酯、氢氯噻嗪、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝(ezetimibe)、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢氯噻嗪、非洛地平、卡托普利、富马酸比索洛尔。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于强直性脊柱炎的治疗剂的非限制性例子包括下述：布洛芬、扶他林和米索前列醇、萘普生、美洛昔康、吲哚美辛、扶他林、塞来昔布、洛芬昔布、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、米诺环素、强的松、依那西普、英夫单抗。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于哮喘的治疗剂的非限制性例子包括下述：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐(sameterol xinafoate)、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星、盐酸西替立嗪、糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯福林/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于COPD的治疗剂的非限制性例子包括下述：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵(tiotropium bromide)、(R，R)-福莫特罗、TgAAT、西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于HCV的治疗剂的非限制性例子包括下述：干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-αcon1、干扰素-α-n1、聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、三氮唑核苷、聚乙二醇干扰素α-2b+三氮唑核苷、熊脱氧胆酸、甘草酸、胸腺法新、马克胺(Maxamine)、VX-497以及通过干扰下述靶用于治疗HCV的任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解旋酶、HCV IRES(内部核糖体进入位点)。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于特发性肺纤维化的治疗剂的非限制性例子包括下述：强的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、秋水仙碱、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干扰素、甲基强的松龙琥珀酸钠(sod succ)、劳拉西泮、呋塞米、赖诺普利、硝酸甘油、螺内酯、环磷酰胺、异丙托溴铵、放线菌素d、阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氟沙星、硫酸间羟异丙肾上腺素、硫酸吗啡、盐酸羟可酮、氯化钾、曲安缩松、无水他克莫司、钙、干扰素-α、氨甲蝶呤、霉酚酸酯、干扰素-γ-1β。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于心肌梗死的治疗剂的非限制性例子包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、酒石酸美托洛尔、依诺肝素钠、肝素钠、重硫酸氯吡格雷、卡维地洛、阿替洛尔、硫酸吗啡、琥珀酸美托洛尔、华法林钠、赖诺普利、单硝酸异山梨酯、地高辛、呋塞米、斯伐他汀、雷米普利、替尼普酶、马来酸依那普利、托拉塞米(torsemide)、瑞替普酶、氯沙坦钾、盐酸喹那普利/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普利拉、盐酸胺碘酮、盐酸替罗非班一水合物、盐酸地尔硫
Figure BPA00001281288901741
卡托普利、依贝沙坦、缬沙坦、盐酸普萘洛尔、福辛普利钠、盐酸利多卡因、表非替得、头孢唑啉钠、硫酸阿托品、氨基己酸、螺内酯、干扰素、盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠、盐酸多巴酚丁胺、阿普唑仑、普伐他丁钠、阿托伐他汀钙、盐酸咪达唑、盐酸哌替啶、单硝酸异山梨酯、肾上腺素、盐酸多巴胺、比伐卢定、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、依泽替米贝/斯伐他汀、阿伐麦布(avasimibe)、卡立泊来德(cariporide)。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于牛皮癣的治疗剂的非限制性例子包括下述：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他索、他佐罗汀、氨甲蝶呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素、hc/次五倍子酸铋(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫单抗、环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于牛皮癣性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括下述：氨甲蝶呤、依那西普、洛芬昔布、塞来昔布、叶酸、柳氮磺吡啶、萘普生、来氟洛米、乙酸甲基强的松龙、吲哚美辛、硫酸羟氯喹、强的松、舒林酸、增强型二丙酸倍他米松、英夫单抗、氨甲蝶呤、叶酸盐、曲安缩松、扶他林、二甲基亚砜、吡罗昔康、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、美洛昔康、甲基强的松龙、萘普酮、托美汀钠、卡泊三醇、环孢菌素、双氯酚酸钠/米索前列醇、氟轻松、硫酸葡糖胺、硫代苹果酸金钠、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、布洛芬、利塞膦酸钠、磺胺嘧啶、硫鸟嘌呤、伐地考昔、阿来塞普、依法利珠单抗和bcl-2抑制剂。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于再狭窄的治疗剂的非限制性例子包括下述：西罗莫司、紫杉醇、依维莫司(everolimus)、他克莫司、Zotarolimus、扑热息痛。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于坐骨神经痛的治疗剂的非限制性例子包括下述：重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、洛芬昔布、盐酸环苯扎林、甲基强的松龙、萘普生、布洛芬、盐酸羟可酮/扑热息痛、塞来昔布、伐地考昔、乙酸甲基强的松龙、强的松、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸曲马多/扑热息痛、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫、盐酸利多卡因、双氯酚酸钠、加巴喷丁、地塞米松、卡立普多、酮咯酸氨基丁三酸醇盐、吲哚美辛、扑热息痛、地西泮、萘普酮、盐酸羟可酮、盐酸替扎尼定、双氯酚酸钠/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、asa/oxycod/羟可酮ter、布洛芬/二氢可待因酮bit、盐酸曲马多、依托度酸、盐酸丙氧芬、盐酸阿米替林、卡立普多/磷酸可待因/asa、硫酸吗啡、多种维生素、甲氧萘丙酸钠、柠檬酸奥芬那君、替马西泮。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于SLE(狼疮)的治疗剂的例子包括下述：NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲蝶呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如Cellcept。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、依木兰，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成、生产或作用的试剂，例如胱天蛋白酶抑制剂，如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的结合蛋白还可以与T细胞发信号抑制剂一起使用，例如酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗体，抗PD-1家族抗体。本发明的结合蛋白可以与IL-11或抗细胞因子抗体组合，例如芬突利珠单抗(fonotolizumab)(抗IFNg抗体)，或抗受体受体抗体，例如抗IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂一起使用：LJP 394(阿贝莫司(abetimus))，耗尽或灭活B细胞的试剂，例如利妥希玛(抗CD20抗体)，淋弗斯特(lymphostat)-B(抗BlyS抗体)，TNF拮抗剂，例如，抗TNF抗体，阿达木单抗(PCT公开号WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的超表达导致狼疮样表型(见Marquina，Regina等人，Journal of Immunology(2004)，172(11)，7177-7185)，因此预期抑制具有治疗性作用。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的结合蛋白。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据下述因素而变，例如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及结合蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用快速灌注方式，几个分份剂量可以随着时间过去而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用的，单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)配合这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。
关于本发明的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20mg/kg，例如1-10mg/kg。应当指出剂量值可以依待减轻的状况类型和严重性而变。应进一步理解对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当随着时间过去进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不希望限制要求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明方法的其他合适修改和适应是明显的，且无需背离本发明或本文公开的实施方案的范围使用合适的等同方案即可进行。尽管本发明目前已得到详细描述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望限制本发明。
V.诊断
此处公开内容也提供诊断应用。这进一步阐明如下。
I.测定方法
本公开内容也提供了使用如此处所述的至少一个DVD-Ig确定测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的方法。可以将本领域已知的任何合适的测定用于该方法。例子包括但不限于免疫测定，例如夹心免疫测定(例如单克隆、多克隆和/或DVD-Ig夹心免疫测定或其任何变化(例如单克隆/DVD-Ig、DVD-Ig/多克隆等)，包括放射性同位素检测(放射性免疫测定(RIA))和酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如Quantikine ELISA测定，R&D Systems，Minneapolis，MN)))、竞争性抑制免疫测定(例如正向和反向)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶多重免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均质化学发光测定等。在基于SELDI的免疫测定中，将特异性结合目的分析物(或其片段)的捕获试剂附着于质谱分析法探针的表面，例如预活化的蛋白芯片阵列。然后将分析物(或其片段)特异性捕获在生物芯片上，并通过质谱分析法检测捕获的分析物(或其片段)。可替代的，可以将分析物(或其片段)从捕获试剂洗脱并通过传统MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或通过SELDI检测。化学发光微粒免疫测定，具体为采用ARCHITECT
Figure BPA00001281288901781
自动化分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)的那种，是优选免疫测定的例子。
在本公开内容的实践中，使用本领域众所周知的用于采集、处理和加工尿、血液、血清和血浆以及其他体液的方法，例如，当采用此如处所述的DVD-Ig作为免疫诊断试剂和/或用于分析物免疫测定试剂盒时。测试样品可以除目的分析物之外包含另外的部分，例如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白、肽、多肽、寡核苷酸和/或多核苷酸。例如，样品可以是从受试者获得的全血样品。将测试样品特别是全血在如此处所述的免疫测定之前进行处理(例如，用预处理试剂)可能是必需的或需要的。即使在预处理不是必需的(例如大多数尿样品)的情况中，也任选可以进行预处理(例如，作为商业平台上制度的部分)。
预处理试剂可以是适用于本发明的免疫测定和试剂盒的任何试剂。预处理任选包含：(a)一种或多种溶剂(例如甲醇和乙二醇)，和任选的盐，(b)一种或多种溶剂和盐，以及任选的去污剂，(c)去污剂，或(d)去污剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，且可以采用此种预处理，例如，用于在Abbott TDx、AxSYM
Figure BPA00001281288901791
、和ARCHITECT
Figure BPA00001281288901792
分析仪(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)上的测定的那种，如文献所述(参见，例如，Yatscoff等人，Abbott TDx Monoclonal Antibody AssayEvaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood，Clin.Chem.36：1969-1973(1990)，以及Wallemacq等人，Evaluation of the New AxSYMCyclosporine Assay：Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood andEMIT Cyclosporine Assays，Clin.Chem.45：432-435(1999))，和/或可通过商业途径获得的。另外，可以如Abbott的美国专利号5,135,875、欧洲专利公开号0 471 293、于2006年12月29日提交的美国临时专利申请60/878,017、以及美国专利申请公开号2008/0020401(对于其就预处理而论的教导全文引用作为参考)中所述完成预处理。预处理试剂可以是异质试剂或均质试剂。
使用异质预处理试剂时，预处理试剂沉淀样品中存在的分析物结合蛋白(例如，可以结合分析物或其片段的蛋白)。此种预处理步骤包括通过向样品添加预处理试剂将形成的混合物上清液从沉淀的分析物结合蛋白分离，来去除任何分析物结合蛋白。在此种测定中，将不存在任何结合蛋白的混合物上清液用于测定中，直接进行到抗体捕获步骤。
使用均质预处理试剂时，没有此种分离步骤。将测试样品和预处理试剂的全部混合物与标记的对于分析物(或其片段)特异性的结合配偶体例如标记的抗分析物抗体(或其抗原反应性片段)接触。在由第一个特异性结合配偶体捕获之前或期间，这种测定中采用的预处理试剂一般在预处理的测试样品混合物中得到稀释。尽管有此种稀释，但一定量的预处理试剂在捕获期间依然存在(或保留)于测试样品混合物中。根据本发明，标记的特异性结合配偶体可以是DVD-Ig(或其片段、变体或变体的片段)。
在异质形式中，从受试者获得样品后，制备第一个混合物。该混合物含有在分析物(或其片段)方面进行评估的测试样品和第一个特异性结合配偶体，其中第一个特异性结合配偶体和测试样品中含有的任何分析物形成第一个特异性结合配偶体-分析物复合物。优选的，第一个特异性结合配偶体是抗分析物抗体或其片段。第一个特异性结合配偶体可以是如此处所述的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)。添加测试样品和第一个特异性结合配偶体以形成混合物的顺序并不关键。优选的，将第一个特异性结合配偶体固定化在固相上。在免疫测定中使用(用于第一个特异性结合配偶体，以及任选第二个特异性结合配偶体)的固相可以是本领域已知的任何固相，例如但不限于磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘(disk)和芯片。
形成含有第一个特异性结合配偶体-分析物复合物的混合物后，使用本领域已知的任何技术将任何未结合的分析物从复合物去除。例如，可以通过洗涤将未结合的分析物去除。然而，理想地，第一个特异性结合配偶体以多于任何分析物的量存在于测试样品中，从而存在于测试样品中的所有分析物由第一个特异性结合配偶体结合。
去除任何未结合的分析物后，将第二个特异性结合配偶体加入混合物以形成第一个特异性结合配偶体-分析物-第二个特异性结合配偶体复合物。第二个特异性结合配偶体优选是与分析物上表位结合的抗分析物抗体，所述表位不同于第一个特异性结合配偶体结合的分析物上表位。此外，也是优选的，第二个特异性结合配偶体用如上所述的可检测标记进行标记有或含有如上所述的可检测标记。第二个特异性结合配偶体可以是如此处所述的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)。
可以使用本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，可检测标记可以是放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C、32P、和33P)、酶促标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(例如吖啶
Figure BPA00001281288901801
酯(acridinium esters)、硫酯、或磺胺；鲁米诺、异氨基苯二酰肼、菲啶
Figure BPA00001281288901802
酯(phenanthridinium esters)等)、荧光标记(例如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如硫化锌封端的(capped)硒化镉)、温度测量标记、或免疫-聚合酶链反应标记。标记、标记程序和标记的检测的介绍见于Polak和Van Noorden，Introduction toImmunocytochemistry，第二版，Springer Verlag，N.Y.(1997)，以及Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(1996)，其是由Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon出版的组合手册和目录。荧光标记可用于FPIA(参见，例如，美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093、和5,352,803，在此全文引用作为参考)。吖啶
Figure BPA00001281288901811
化合物可以在均质或异质化学发光测定中用作可检测标记(参见，例如，Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.16：1324-1328(2006)；Adamczyk等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.4：2313-2317(2004)；Adamczyk等人，Biorg.Med.Chem.Lett.14：3917-3921(2004)；以及Adamczyk等人，Org.Lett.5：3779-3782(2003))。
优选的吖啶
Figure BPA00001281288901812
化合物是吖啶
Figure BPA00001281288901813
-9-羧酰胺。在Mattingly，J.Biolumin.Chemilumin.6：107-114(1991)；Adamczyk等人，J.Org.Chem.63：5636-5639(1998)；Adamczyk等人，Tetrahedron 55：10899-10914(1999)；Adamczyk等人，Org.Lett.1：779-781(1999)；Adamczyk等人，Bioconjugate Chem.11：714-724(2000)；Mattingly等人，In LuminescenceBiotechnology：Instruments and Applications；Dyke，K.V.Ed.；CRC Press：Boca Raton，第77-105页(2002)；Adamczyk等人，Org.Lett.5：3779-3782(2003)；以及美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699(每个均对于其就所述内容而论的教导全文引用作为参考)中描述了制备吖啶
Figure BPA00001281288901814
-9-羧酰胺的方法。另一个优选吖啶
Figure BPA00001281288901815
化合物是吖啶
Figure BPA00001281288901816
-9-羧酸芳基酯。吖啶
Figure BPA00001281288901817
-9-羧酸芳基酯的一个例子是10-甲基-9-(苯氧羰基)吖啶氟磺酸盐(可获自Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)。在McCapra等人，Photochem.Photobiol.4：1111-21(1965)；Razavi等人，Luminescence 15：245-249(2000)；Razavi等人，Luminescence 15：239-244(2000)；以及美国专利号5,241,070(每个均对于其就所述内容而论的教导全文引用作为参考)中描述了制备吖啶
Figure BPA00001281288901819
-9-羧酸芳基酯的方法。在US 2008-0248493阐述了关于吖啶
Figure BPA000012812889018110
-9-羧酸芳基酯及其用途的其他细节。
可以依照Adamczyk等人，Anal.Chim.Acta 579(1)：61-67(2006)中所述的方法实施化学发光测定(例如，使用如上所述的吖啶或其他化学发光剂)。虽然可以使用任何合适的测定形式，但微量培养板化学发光分析仪(Mithras LB-940，Berthold Technologies U.S.A.，LLC，Oak Ridge，TN)使小体积的多样品快速测定成为可能。
添加测试样品和特异性结合配偶体以形成化学发光测定的混合物的顺序并不关键。如果第一个特异性结合配偶体用化学发光剂例如吖啶
Figure BPA000012812889018112
化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一个特异性结合配偶体-分析物复合物。可替代的，如果使用第二个特异性结合配偶体，而且第二个特异性结合配偶体用化学发光剂例如吖啶
Figure BPA00001281288901821
化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一个特异性结合配偶体-分析物-第二个特异性结合配偶体复合物。无论标记与否，任何未结合特异性结合配偶体都可以使用本领域已知的任何技术例如洗涤从混合物去除。
可以在添加上述吖啶
Figure BPA00001281288901822
化合物之前、同时或之后，在混合物中原位生成过氧化氢、或为混合物提供或补充过氧化氢(例如，过氧化氢的来源为已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其他溶液)。可以以许多方法原位生成过氧化氢，如对于本领域技术人员显而易见的。
在同时或随后将至少一种碱性溶液添加到样品之后，生成了指示分析物存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱，并且具有高于或等于10、优选大于或等于12的pH。碱性溶液的例子包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙、和碳酸氢钙。加入样品的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。根据使用的碱性溶液的浓度，本领域技术人员可以容易的确定加入样品的碱性溶液的量。
可以使用本领域技术人员已知的常规技术检测生成的化学发光信号。基于生成的信号强度，可以定量样品中分析物的量。具体而言，样品中分析物的量与生成的信号强度成比例。可以通过将生成的光的量与关于分析物的标准曲线进行比较或通过与参考标准进行比较定量存在的分析物的量。可以使用连续稀释或已知浓度的分析物溶液，通过质谱分析法、重量分析方法和其他本领域已知技术生成标准曲线。尽管上文重点描述了使用吖啶
Figure BPA00001281288901823
化合物作为化学发光剂，但本领域普通技术人员可以容易使该描述适应于其他化学发光剂的使用。
通常可以使用本领域已知的任何形式进行分析物免疫测定，例如，但不限于夹心形式。具体而言，在一种免疫测定形式中，采用至少两种抗体来分离和定量样品中的分析物例如人分析物，或其片段。更具体而言，至少两种抗体结合分析物(或其片段)上的不同表位形成免疫复合物，将其称为“夹心”。通常，在免疫测定中，可以将一个或多个抗体用于捕获测试样品中的分析物(或其片段)(通常将这些抗体称为“捕获”抗体)，并且可以将一个或多个抗体用于将可检测的(即可定量的)标记结合到夹心(常常将这些抗体称为“检测抗体”或“缀合物”)。因此，在夹心免疫测定形式的背景中，如此处所述的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)可用作捕获抗体、检测抗体或二者。例如，一种具有可以结合分析物(或其片段)上第一个表位的结构域的DVD-Ig可用作捕获抗体，和/或另一种具有可以结合分析物(或其片段)上第二个表位的结构域的DVD-Ig可用作检测抗体。在这点上，具有可以结合分析物(或其片段)上第一个表位的第一个结构域以及可以结合分析物(或其片段)上第二个表位的第二个结构域的DVD-Ig可用作捕获抗体和/或检测抗体。可替代的，一种具有可以结合第一个分析物(或其片段)上表位的第一个结构域以及可以结合第二个分析物(或其片段)上表位的第二个结构域的DVD-Ig可用作捕获抗体和/或检测抗体，以检测并任选定量两种或更多种分析物。在分析物可以以多于一种形式(例如单体形式和二聚体/多聚体形式，其可以为同聚体的或异聚体的)存在于样品中的情况下，一种具有可以结合仅暴露于单体形式上的表位的结构域的DVD-Ig、以及另一种具有可以结合二聚体/多聚体形式不同部分上的表位的结构域的DVD-Ig，可用作捕获抗体和/或检测抗体，从而使对给定分析物的不同形式的检测和任选的定量成为可能。另外，采用在单个DVD-Ig内和/或在DVD-Igs之间具有不同亲和力的DVD-Igs可以提供抗体亲抗原性优势。在如此处所述的免疫测定的背景中，在DVD-Ig结构中整合一个或多个接头一般可能是有益的或需要的。当存在时，最佳的是，接头应该具有足够的长度和结构灵活性，以使得能够通过内部结构域结合表位并通过外部结构域结合另一个表位。在这点上，如果DVD-Ig可以结合两个不同的分析物，且一个分析物大于另一个，则理想的是由外部结构域结合较大的分析物。
一般而言，可以将对于(例如怀疑含有)分析物(或其片段)进行测试的样品与至少一个捕获抗体(或多个抗体)和至少一个检测抗体(其可以是第二个检测抗体或第三个检测抗体或甚至连续编号的抗体，例如在捕获和/或检测抗体包含多个抗体时)同时或序贯且以任何顺序接触。例如，可以将测试样品首先与至少一个捕获抗体、且然后(序贯)与至少一个检测抗体接触。可替代的，将测试样品首先与至少一个检测抗体、且然后(序贯)与至少一个捕获抗体接触。在另一个替代形式中，可以将测试样品同时与捕获抗体和检测抗体接触。
在夹心测定形式中，首先使怀疑含有分析物(或其片段)的样品在允许形成第一个抗体/分析物复合物的条件下与至少一个第一个捕获抗体接触。如果使用多于一个捕获抗体，则形成包含两个或更多个捕获抗体的第一个捕获抗体/分析物复合物。在夹心测定中，以测试样品中预期的分析物(或其片段)的最大量的摩尔过量的量使用抗体，即，优选至少一个捕获抗体。例如，可以使用约5μg到约1mg抗体/mL缓冲液(例如，微粒包被缓冲液)。
竞争性抑制免疫测定包含序贯和经典形式，所述竞争性抑制免疫测定常用于测量小分析物，这是因为要求仅由一个抗体结合。在序贯竞争性抑制免疫测定中，将针对目的分析物的捕获抗体包被在微量滴定板的孔或其他固体支持物上。当将含有目的分析物的样品添加到孔中时，目的分析物与捕获抗体结合。洗涤后，将已知量的标记的(例如，生物素或辣根过氧化物酶(HRP))分析物添加到孔中。酶促标记的底物是生成信号所必需的。合适的HRP底物的例子是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)。洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且其与样品中的分析物量成反比。在经典竞争性抑制免疫测定中，将针对目的分析物的抗体包被在固体支持物(例如微量滴定板的孔)上。然而，与序贯竞争性抑制免疫测定不同，将样品和标记的分析物同时添加到孔中。样品中的任何分析物与标记的分析物竞争结合捕获抗体。洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且其与样品中的分析物量成反比。
任选地，在测试样品与至少一个捕获抗体(例如，第一个捕获抗体)接触之前，将所述至少一个捕获抗体结合在固体支持物上，这促进第一个抗体/分析物(或其片段)复合物从测试样品的分离。捕获抗体结合的基质可以是促进捕获抗体-分析物复合物从样品分离的任何合适的固体支持物或固相。
例子包括板(例如微量滴定板)的孔、试管、多孔凝胶(例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶)、聚合物膜(例如，聚丙烯酰胺)、珠(例如，聚苯乙烯珠或磁珠)、过滤器/膜(例如硝化纤维素或尼龙)的条、微粒(例如胶乳粒子、可磁化微粒(例如具有氧化铁或三氧化二铬核以及均聚或杂聚涂层且半径约1-10微米的微粒)。基质可以包含合适的多孔材料，所述多孔材料具有合适的表面亲和力以结合抗原以及足够的孔隙率以允许检测抗体接近。尽管可以使用水合状态下的胶状材料，但一般优选微孔性材料。厚度约0.01至约0.5mm、优选约0.1mm的片形式的此种多孔基质是优选的。尽管孔径可以有相当大的变化，但优选孔径为约0.025至约15微米、更优选约0.15至约15微米。可以通过引起抗体与基质的共价键合的化学方法活化此种基质的表面。一般通过疏水性力吸附，产生抗原或抗体与基质的不可逆结合；可替代的，可以使用化学偶联剂或其他方法将抗体与基质共价结合，如果此种结合不干扰抗体结合分析物的能力的话。可替代的，可以将抗体与微粒结合，其中微粒已经预先用链霉抗生物素蛋白(例如DYNAL
Figure BPA00001281288901851
Magnetic Beads，Invitrogen，Carlsbad，CA)或生物素(例如，使用Power-BindTM-SA-MP链霉抗生物素蛋白包被的微粒(Seradyn，Indianapolis，IN))或抗物种特异性单克隆抗体包被。如果需要，则可以将基质衍生化以允许与抗体上的各种官能团的反应性。此种衍生化要求使用某些偶联剂，其例子包括但不限于马来酐、N-羟基琥珀酰亚胺、以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。如果需要，则可以将一个或多个捕获试剂(例如各自对一种或多种分析物特异的抗体(或其片段))附着在固相上不同的物理或可访问的位置(例如，生物芯片构型(参见，例如美国专利号6,225,047；国际专利申请公开号WO 99/51773；美国专利号6,329,209；国际专利申请公开号WO 00/56934，以及美国专利号5,242,828)。如果将捕获试剂附着在作为固体支持物的质谱分析法探针上，则可以通过激光解吸电离质谱分析法检测与探针结合的分析物的量。可替代的，单个柱可以填充不同的珠，其用一个或多个捕获试剂衍生化，从而在单个位置捕获分析物(参见，抗体衍生的、基于珠的技术，例如Luminex的xMAP技术(Austin，TX))。
使对于分析物(或其片段)进行测定的测试样品与至少一个捕获抗体(例如第一个捕获抗体)接触后，温育混合物以允许第一个抗体(或多个抗体)-分析物(或其片段)复合物的形成。温育可以在约4.5至约10.0的pH、约2℃至约45℃温度下实施至少约一(1)分钟至约十八(18)小时的时间段，优选约1至约24分钟，最优选约4至约18分钟。可以在一个步骤(指将测试样品、至少一个捕获抗体合至少一个检测抗体都序贯或同时加入反应容器)或多于一个步骤(例如两个步骤、三个步骤等)中进行此处所述的免疫测定。
形成(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)复合物后，然后在允许形成(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/第二个检测抗体复合物的条件下，将该复合物与至少一个检测抗体接触。尽管为了清楚起见说明为“第二个”抗体(例如第二个检测抗体)，但事实上，在将多个抗体用于捕获和/或检测时，至少一个检测抗体可以是第二个、第三个、第四个等用于该免疫测定的抗体。如果将捕获抗体/分析物(或其片段)复合物与多于一个检测抗体接触，则形成(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(多个)检测抗体复合物。与捕获抗体(例如第一个捕获抗体)一样，当使至少一个(例如第二个或任意后来的)检测抗体与捕获抗体/分析物(或其片段)复合物接触时，要求在与上述条件类似的条件下温育一段时间，以形成(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二个或多个)检测抗体复合物。优选的，至少一个检测抗体含有可检测标记。可检测标记可以在形成(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二个或多个)检测抗体复合物之前、同时、或之后与至少一个检测抗体(例如第二个检测抗体)结合。可以使用本领域已知的任何可检测标记(见上述讨论，包括Polak和VanNoorden(1997)以及Haugland(1996)参考文献)。
可以将可检测标记直接或通过偶联剂与抗体结合。可以使用的偶联剂的例子是EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，氢氯化物)，其可以通过商业途径从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO获得。本领域已知其他可以使用的偶联剂。本领域已知将可检测标记与抗体结合的方法。另外，可以采购或合成许多可检测标记，其已经含有促进可检测标记与抗体偶联的末端基团，例如CPSP-吖啶
Figure BPA00001281288901861
酯(即，9-[N-甲苯磺酰基-N-(3-羧丙基)]-10-(3-磺丙基)吖啶
Figure BPA00001281288901862
羧酰胺)或SPSP-吖啶
Figure BPA00001281288901863
酯(即N10-(3-磺丙基)-N-(3-磺丙基)-吖啶-9-羧酰胺)。
(第一个或多个)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二个或多个)检测抗体复合物可以但不必须在对标记定量之前从测试样品的剩余物中分离。例如，如果至少一个捕获抗体(例如第一个捕获抗体)与固体支持物(例如孔或珠)结合，则可以通过去除(测试样品的)流体与固体支持物的接触而实现分离。可替代的，如果至少第一个捕获抗体与固体支持物结合，则其可以同时与含有分析物的样品和至少一个第二个检测抗体接触，以形成第一个(多个)抗体/分析物/第二个(多个)抗体复合物，随后去除流体(测试样品)与固体支持物的接触。如果至少一个第一个捕获抗体没有与固体支持物结合，则不需要为了定量标记的量而将(第一个或多个)捕获抗体/分析物/(第二个或多个)检测抗体复合物从测试样品去除。
形成标记的捕获抗体/分析物/检测抗体复合物(例如第一个捕获抗体/分析物/第二个检测抗体复合物)后，使用本领域已知技术对复合物中标记的量进行定量。例如，如果使用酶促标记，则标记的复合物与对于标记的底物反应，这给出可定量的反应，例如显色。如果标记是放射性标记，则使用适当的工具例如闪烁计数器定量标记。如果标记是荧光标记，则通过用一种颜色的光(称为“激发波长”)刺激标记，并用检测标记响应刺激而发射的另一种光(称为“发射波长”)，来定量标记。如果标记是化学发光标记，则通过目视或通过使用发光计、X光胶片、高速照相胶片、CCD照相机等检测发射的光而定量标记。一旦已对复合物中的标记的量进行了定量，就可以通过适当的方法确定测试样品中分析物或其片段的浓度，例如通过使用标准曲线，所述标准曲线是利用已知浓度分析物或其片段的连续稀释生成的。除了使用分析物或其片段的连续稀释，可以通过质量分析法、质谱分析法或其他本领域已知技术生成标准曲线。
在采用ARCHITECT
Figure BPA00001281288901871
分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应为约6.0+/-0.2，微粒包被缓冲液应维持于约室温(即，从约17至约27℃)，微粒包被缓冲液pH应为约6.5+/-0.2，且微粒稀释剂pH应为约7.8+/-0.2。固体优选为少于约0.2％，例如少于约0.15％、少于约0.14％、少于约0.13％、少于约0.12％，或少于约0.11％，例如约0.10％。
FPIAs基于竞争性结合免疫测定原理。当由线性偏振光激发时，荧光标记的化合物将发射具有一定偏振程度的荧光，该程度与其旋转速度成反比。当通过线性偏振光激发荧光标记的示踪物-抗体复合物时，发射的光保持高度偏振化，这是因为荧光团受光吸收时间和光发射时间之间旋转的限制。当“游离”示踪化合物(即，没有与抗体结合的化合物)由线性偏振光激发时，其旋转远快于在竞争性结合免疫测定中产生的相应的示踪物-抗体缀合物。FPIAs比RIAs有优势，这是因为没有要求特殊处理和处置的放射性物质。另外，FPIAs是可容易地且快速执行的均质测定。
考虑到上述情况，提供了确定测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的方法。该方法包含通过如下测定对测试样品测定分析物(或其片段)，所述测定(i)采用(i’)至少一个抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、以及可结合分析物的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，以及(ii’)至少一个可检测标记，以及(ii)包含将测试样品中由可检测标记生成的、作为分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每个校准物通过分析物浓度而不同于其他校准物。
该方法可包括(i)将测试样品与对于分析物(或其片段)的至少一个第一个特异性结合配偶体接触，所述至少一个第一个特异性结合配偶体选自抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、以及可结合分析物的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，从而形成第一个特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物，(ii)将第一个特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物与对于分析物(或其片段)的至少一个第二个特异性结合配偶体接触，所述至少一个第二个特异性结合配偶体选自可检测地标记的抗分析物抗体、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体片段、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体的片段、以及可检测地标记的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，从而形成第一个特异性结合配偶体/分析物(或其片段)/第二个特异性结合配偶体复合物，以及(iii)通过检测或测量(ii)中形成的第一个特异性结合配偶体/分析物(或其片段)/第二个特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号，确定测试样品中分析物的存在、量或浓度。这样的方法可以是优选的，在该方法中，对于分析物(或其片段)的至少一个第一个特异性结合配偶体和/或对于分析物(或其片段)的至少一个第二个特异性结合配偶体是如此处所述的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)。
可替代的，该方法可包括将测试样品与对于分析物(或其片段)的至少一个第一个特异性结合配偶体接触，所述至少一个第一个特异性结合配偶体选自抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、以及DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，并同时或以任何顺序序贯将测试样品与至少一个第二个特异性结合配偶体接触，所述至少一个第二个特异性结合配偶体可以与分析物(或其片段)竞争结合至少一个第一个特异性结合配偶体，并选自可检测地标记的分析物、可结合第一个特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物片段、可结合第一个特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物变体、以及可结合第一个特异性结合配偶体的可检测地标记的分析物变体的片段。存在于测试样品中的任何分析物(或其片段)以及至少一个第二个特异性结合配偶体彼此竞争，以分别形成第一个特异性结合配偶体/分析物(或其片段)复合物和第一个特异性结合配偶体/第二个特异性结合配偶体复合物。该方法另外包括通过检测或测量(ii)中形成的第一个特异性结合配偶体/第二个特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号，确定测试样品中分析物的存在、量或浓度，其中第一个特异性结合配偶体/第二个特异性结合配偶体复合物中由可检测标记生成的信号与测试样品中分析物的量或浓度成反比。
上面的方法可以另外包括对从其获得测试样品的患者诊断、预后、或评估治疗性/预防性处理的功效。如果方法进一步包括对从其获得测试样品的患者评估治疗性/预防性处理的功效，则方法任选另外包括根据需要修改患者的治疗性/预防性处理以改善功效。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统。
关于测定方法(及其试剂盒)，可能采用可通过商业途径获得的抗分析物抗体或如文献所述制备抗分析物的方法。各种抗体的商业供应包括但不限于Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)、GenWayBiotech，Inc.(San Diego，CA)、和R&D Systems(RDS；Minneapolis，MN)。
通常，可以采用预定水平作为基准点，针对所述基准点对测定测试样品的分析物或其片段后所获结果进行评估，例如，用于检测疾病或疾病风险。通常，在进行这种比较中，通过将具体测定运行足够次数且在适当的条件下获得预定水平，从而获得分析物的存在、量或浓度与疾病、病症或状况的特定阶段或终点、或与具体临床标记之间的联系或关联。一般，使用参考受试者(或受试者群体)获得预定水平。测量的分析物可以包括其片段、其降解产物、和/或其酶切产物。
具体而言，关于用于监控疾病进展和/或治疗的预定水平，分析物或其片段的量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或有利改变的)、或“不利的”(或“不利改变的”)。术语“升高的”或“增加的”指测试样品中的量或浓度高于一般或正常水平或范围(例如预定水平)、或高于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“降低的”或“减少的”指测试样品中的量或浓度低于一般或正常水平或范围(例如预定水平)、或低于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“改变的”指样品中的量或浓度比起一般或正常水平或范围(例如预定水平)来、或比起另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)来改变(增加或减少)。
根据标准实践定义关于分析物的一般或正常水平或范围。因为分析物水平在一些情况下将会非常低，所以当与一般或正常水平或范围、或参考水平或范围相比，存在不能由实验误差或样品差异解释的任何净变化时，可以考虑出现了所谓的变化水平或变化。因此，在特定样品中测量的水平将与来自所谓的正常受试者的类似样品中确定的水平或水平范围进行比较。在此背景中，分别地，“正常受试者”是例如没有可检测的疾病的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是例如没有表现可检测疾病的那些。另外，已知不会在大多数人群中常规发现高水平分析物，可以将“正常受试者”认为是分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是表现出分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的那些。“表观正常受试者”是其中的分析物尚未进行评估或当前正在进行评估的受试者。当分析物正常不可检测(例如，正常水平是零，或在正常群体的约25至约75百分位范围内)，但是在测试样品中可检测时候，以及当分析物以高于正常水平存在于测试样品中时，称该分析物水平是“升高的”。因此，除了别的以外，公开内容提供了筛选患有特定疾病、病症或状况或处于患有特定疾病、病症或状况的风险中的受试者的方法。测定方法也涉及其他标记的测定等。
因此，此处所述方法也可用于确定受试者是否患有给定疾病、病症或状况或处于发展给定疾病、病症或状况的风险中。具体的，此种方法可以包括步骤：
(a)确定来自受试者的测试样品中分析物(或其片段)的浓度或量(例如使用此处所述方法或本领域已知方法)；并
(b)将步骤(a)中确定的分析物(或其片段)的浓度或量与预定水平比较，其中，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，则将该受试者确定为未患有给定疾病、病症或状况或没有给定疾病、病症或状况的风险。然而，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是不利的，则将该受试者确定为患有给定疾病、病症或状况或具有给定疾病、病症或状况的风险。
另外，此处提供了监控受试者中疾病进展的方法。最佳的，该方法包括步骤：
(a)确定来自受试者的测试样品中分析物的浓度或量；
(b)确定来自受试者的较晚测试样品中分析物的浓度或量；并
(c)将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较，其中，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的浓度或量是无变化的或是不利的，则确定受试者中的疾病继续、进展或恶化。比较而言，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的分析物的浓度或量是有利的，则确定受试者中的疾病停止、消退或改善。
任选地，方法另外包括例如将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量与预定水平进行比较。另外，如果比较显示，例如步骤(b)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平不利地改变，则方法任选包括用一种或多种药物组合物对受试者治疗一段时间。
另外，方法可用于在接收用一种或多种药物组合物治疗的受试者中监控治疗。具体而言，此种方法涉及提供对受试者施用一种或多种药物组合物之前来自受试者的第一个测试样品。接下来，确定来自受试者的第一个测试样品中分析物的浓度或量(例如，使用此处所述或本领域已知的方法)。确定分析物的浓度或量后，任选将分析物的浓度或量与预定水平进行比较。如果在第一个测试样品中确定的分析物的浓度或量低于预定水平，则不对该受试者用一种或多种药物组合物治疗。然而，如果在第一个测试样品中确定的分析物的浓度或量高于预定水平，则用一种或多种药物组合物对该受试者治疗一段时间。本领域技术人员可以确定用一种或多种药物组合物对该受试者治疗的时间段(例如该时间段可以从七(7)天到约两年，优选从约十四(14)天到约一(1)年)。
在用一种或多种药物组合物治疗过程期间，然后从受试者获得第二个和后续的测试样品。从受试者获得所述测试样品的测试样品数目和时间并不关键。例如，第二个测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后七(7)天获得，第三个测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后两(2)周获得，第四个测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后三(3)周获得，第五个测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后四(4)周获得等。
从受试者获得每个第二个或后续测试样品后，确定第二个或后续测试样品中分析物的浓度或量(例如，使用此处所述或本领域已知的方法)。然后将第二个和后续测试样品每一个中确定的分析物的浓度或量与第一个测试样品(例如，最初任选与预定水平进行比较的测试样品)中确定的分析物的浓度或量进行比较。如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中确定的分析物的浓度或量是有利的，则确定受试者中的疾病停止、消退或改善，且应当对受试者继续施用步骤(b)的一种或药物组合物。然而，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中确定的浓度或量无变化或是不利的，则确定受试者中的疾病继续、进展或恶化，且应当用更高浓度的步骤(b)中对受试者施用的一种或多种药物组合物治疗受试者，或者应当用不同于步骤(b)中对受试者施用的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者。具体而言，可以用下述一种或多种药物组合物治疗受试者，所述一种或多种药物组合物不同于受试者以前为了减少或降低所述受试者分析物水平而接收的一种或多种药物组合物。
通常，对于可能进行重复测试的测定(例如，监控疾病进展和/或对治疗的反应)，在已从受试者获得第一个测试样品后及时在一段时间获得第二个或后续的测试样品。具体而言，可以在已从受试者获得第一个测试样品后的数分钟、数小时、数天、数周或数年获得来自受试者的第二个测试样品。例如，可以在从受试者获得第一个测试样品后的如下时间段从受试者获得第二个测试样品：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年。
当用于监控疾病进展时，上述测定可用于在遭受急性状况的受试者中监控疾病进展。急性状况，也称为病危护理状况，指涉及例如心血管系统或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学状况。一般，病危护理状况指那些需要在基于医院的机构(hospital-based setting)(包括但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心、或其他急救护理机构)中的急性医学干预或通过随行医务人员或其他现场医学人员(field-based medical personnel)管理的那些状况。对于病危护理状况，通常在较短的时间范围内进行重复监控，所述较短的时间范围即数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，而最初的测定同样一般在较短的时间范围(例如疾病或状况发作约数分钟、数小时或数天)之内完成。
测定也可用于在遭受慢性或非急性状况的受试者中监控疾病进展。非病危护理或非急性状况指除了涉及例如心血管系统和/或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学状况之外的状况。一般，非急性状况包括具有长期或慢性持续时间的那些。对于非急性状况，通常在较长的时间范围内进行重复监控，例如数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年)，而初始测定同样通常在较长时间范围内完成，例如疾病或状况发作的约数小时、数天、数月或数年。
另外，可以使用从受试者获得的第一个测试样品实施上述测定，其中第一个测试样品获得自一个来源，例如尿、血清或血浆。任选地，然后可以使用从受试者获得的第二个测试样品重复上述测定，其中所述第二个测试样品获得自另一个来源。例如，如果从尿获得第一个测试样品，则可以从血清或血浆获得第二个测试样品。可以比较从使用第一个测试样品和第二个测试样品的测定获得的结果。可以将该比较用于评估受试者中的疾病或状况状态。
此外，本公开内容也涉及确定倾向于或罹患给定疾病、病症或状况的受试者是否会从治疗受益的方法。具体而言，公开内容涉及分析物配对物(analyte companion)诊断方法和产品。因此，如此处所述的“监控受试者中疾病治疗”的方法另外也最理想地包含选择或鉴定用于治疗的候选人。
因此，在具体实施方案中，公开内容也提供了确定患有给定疾病、病症或状况或处于患有给定疾病、病症或状况的风险中的受试者是否是用于治疗的候选人的方法。通常，受试者是经历过给定疾病、病症或状况的一些症状的人，或是实际上已诊断为患有给定疾病、病症或状况或处于患有给定疾病、病症或状况的风险中的人，和/或显示此处所述分析物或其片段的不利浓度或量的人。
该方法任选包括如此处所述的测定，其中在用一种或多种药物组合物(例如，特别是用与涉及分析物的作用机制相关的药物)、用免疫抑制治疗、或通过免疫吸收治疗进行治疗之前和之后评估分析物，或其中在此种治疗后评估分析物，并将分析物的浓度或量与预定水平进行比较。治疗后观察到的不利的分析物浓度或量，证实受试者不会受益于接收进一步或继续治疗，而治疗后观察到的有利的分析物浓度或量，证实受试者会受益于接收进一步或继续治疗。这种证实帮助管理临床研究和提供改进的患者护理。
当然，尽管此处的某些实施方案在用于评估如此处所述的给定疾病、病症或状况是有益的，但测定和试剂盒可用于评估其他疾病、病症和状况中的分析物。该测定方法也可涉及其他标记的测定等。
该测定方法也可用于鉴定改善给定疾病、病症或状况的化合物。例如，可以将表达分析物的细胞与候选化合物接触。可以使用此处所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的分析物表达水平与对照细胞中的进行比较。
II.试剂盒
也提供了对于测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度测定测试样品的试剂盒。试剂盒包含至少一个测定测试样品的分析物(或其片段)的组分、以及测定测试样品的分析物(或其片段)的说明书。至少一个测定测试样品的分析物(或其片段)的组分可以包括含有抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)的组合物，其任选固定化在固相上。
试剂盒可以包含至少一个通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的分析物的组分、以及通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的分析物的说明书。例如，试剂盒可以包含至少一个对于分析物的特异性结合配偶体，例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其可以结合分析物的片段、其可以结合分析物的变体、或可以结合分析物的变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。可替代的或另外的，试剂盒可以包含可检测地标记的分析物(或其可以结合抗分析物、单克隆/多克隆抗体或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)的片段)，其可以与测试样品中的任何分析物竞争结合抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其可以结合分析物的片段、或其可以结合分析物的变体、或可以结合分析物的变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可以固定化在固体支持物上。试剂盒可以包含校准物或对照，例如分离的或纯化的分析物。试剂盒可以包含至少一个容器(例如易于用第一个特异性结合配偶体包被的管、微量滴定板或条)来实施测定，和/或缓冲液(例如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一个可作为浓溶液、可检测标记(例如酶促标记)的底物溶液、或终止液提供。优选地，试剂盒包含所有组分，即，实施该测定所必需的试剂、标准、缓冲液、稀释剂等。说明书可以是纸形式或计算机可读形式，例如盘，CD、DVD等。
任何抗体(例如抗分析物抗体或抗分析物DVD-Ig)或示踪物可以含有如此处所述的可检测标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团、化学发光标记等，或试剂盒可以包括进行可检测标记的试剂。可以将抗体、校准物和/或对照在分开的容器中提供，或预先分配到合适的测定形式中，例如到微量滴定板中。
任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如灵敏度实验对象组(sensitivity panels)、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备为本领域所熟知，并在关于多种免疫诊断产品的插页中得到描述。灵敏度实验对象组成员任选用于确立测定性能特征，并另外任选地是免疫测定试剂盒试剂完整性以及测定标准化的有用指示。
试剂盒也可以任选包括进行诊断性测定或促进质量控制评价所需的其他试剂，例如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、酶底物、检测试剂等。其他组分，例如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如预处理试剂)也可包含在试剂盒中。试剂盒可以额外包括一个或多个其他对照。可以将试剂盒的一个或多个组分冻干，在那种情况下，试剂盒可以另外包含适于冻干的组分重构的试剂。
任选将试剂盒的各种组分按需提供在合适的容器(例如微量滴定板)中。试剂盒可以另外包括保持或贮存样品的容器(例如尿样品的容器或药液筒)。适当时，试剂盒任选也可以含有反应容器、混合容器和促进制备试剂或测试样品的其他组分。试剂盒也可以包括帮助获得测试样品的一个或多个仪器，例如注射器、移液管、镊、量勺(measured spoon)等。
如果可检测标记是至少一个吖啶
Figure BPA00001281288901971
化合物，则试剂盒可以包含至少一个吖啶-9-羧酰胺、至少一个吖啶
Figure BPA00001281288901973
-9-羧酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一个吖啶
Figure BPA00001281288901974
化合物，则试剂盒也可以包含过氧化氢的来源，例如缓冲液、溶液、和/或至少一种碱性溶液。如果需要，则试剂盒可以含有固相，例如磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘或芯片。
III.试剂盒及方法的适应
通过如此处所述的测定(例如免疫测定)确定测试样品中分析物的存在、量或浓度的试剂盒(或其组分)及方法，可以进行适应以用于多种自动化和半自动化系统(包括其中固相包含微粒的那些)，如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述、以及例如由Abbott Laboratories(Abbott Park，IL)作为ARCHITECT
Figure BPA00001281288901975
商业销售的。
自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如ELISA)相比，之间的一些差异包括附着第一个特异性结合配偶体(例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、其变体、或其变体的片段)的基质；任一方式，夹心形成和分析物反应性可以受到影响)、捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的长度和时间控制。尽管非自动化形式(例如ELISA)可能要求与样品和捕获试剂相对较长的温育时间(例如约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如ARCHITECT
Figure BPA00001281288901976
，Abbott Laboratories)可能具有相对较短的温育时间(例如对ARCHITECT
Figure BPA00001281288901977
约18分钟)。类似地，尽管非自动化形式(例如ELISA)可以温育检测抗体(例如缀合试剂)相对较长的温育时间(例如约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如ARCHITECT)可能具有相对较短的温育时间(例如对ARCHITECT
Figure BPA00001281288901979
约4分钟)。
可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于AxSYM
Figure BPA000012812889019710
、IMx
Figure BPA000012812889019711
(参见，例如，美国专利号5,294,404，在此引用全文作为参考)、PRISM
Figure BPA000012812889019712
、EIA(珠)、和QuantumTM II，以及其他平台。另外，可以用其他形式例如在电化学或其他手提式或现场即时(point-of-care)测定系统中采用该测定、试剂盒和试剂盒组分。本公开内容例如适用于实施夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care(i-STAT
Figure BPA00001281288901981
，Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。在例如美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、美国专利申请公开号2004/0018577、美国专利申请公开号2005/0054078、和美国专利申请公开号2006/0160164中描述了在一次性使用测试设备中的免疫传感器及其加工和操作方法，在此对所述文献关于所述内容的教导全文引用作为参考。
具体而言，关于分析物测定对I-STAT
Figure BPA00001281288901982
系统的适应，优选下述构型。用一对金电流分析工作电极和一个银-氯化银参考电极制造微制作硅芯片。在一个工作电极上，将具有固定化的抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、其变体、或其变体的片段)的聚苯乙烯珠(0.2mm直径)，与电极上形成图案的聚乙烯醇聚合物涂层粘附。将该芯片以适于免疫测定的流体学形式装配到I-STAT
Figure BPA00001281288901983
药液筒中。在药液筒样品保持室壁的部分上，有含有对于分析物的特异性结合配偶体的层，其中对于分析物的特异性结合配偶体是例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或可以结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或可以结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。在药液筒流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸的含水试剂。
在操作中，将怀疑含有分析物的样品添加到测试药液筒的保持室，并将药液筒插入I-STAT
Figure BPA00001281288901984
阅读器。在对于分析物的特异性结合配偶体溶解到样品中后，药液筒中的泵元件迫使样品进入含有芯片的管道。在此将其振荡以促进形成夹心。在测定的倒数第二个步骤，将流体挤出袋并进入管道，以将样品从芯片洗掉且进入废物室中。在测定的最终步骤，碱性磷酸酶标记与对氨基苯酚磷酸反应，以切割磷酸基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极成为电化学氧化的。根据测量的电流，阅读器能够通过嵌入式算法和工厂确定的校准曲线计算样品中分析物的量。
当然，此处所述方法和试剂盒必须包括实施免疫测定的其他试剂和方法。例如，包括各种缓冲液，例如本领域已知的和/或易于制备或被最优化以应用的，例如用于洗涤，如缀合稀释剂、微粒稀释剂、和/或校准物稀释剂。示例性缀合稀释剂是用于某些试剂盒中的ARCHITECT缀合稀释剂(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)，并含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、盐、蛋白封阻剂、抗微生物剂、和去污剂。示例性校准物稀释剂是用于某些试剂盒中的ARCHITECT人校准物稀释剂(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)，其包含的缓冲液含有MES、其他盐、蛋白封阻剂、和抗微生物剂。另外，如2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142,048中所述，例如在I-Stat药液筒形式中，使用与信号抗体链接的核酸序列作为信号放大器，可以获得改善的信号生成。
实施例
实施例1：DVD-Ig的设计、构建和分析
实施例1.1：用于鉴定和表征亲本抗体和DVD-Ig的测定
除非另外指出，下列测定用于全部实施例以鉴定和表征亲本抗体和DVD-Ig。
实施例1.1.1：用于确定亲本抗体和DVD-Ig对其一种或多种靶抗原的结合及亲和力的测定
实施例1.1.1A：直接结合ELISA(Direct Bind ELISA)
如下实施酶联免疫吸附测定以筛选结合所需靶抗原的抗体。将Highbind ELISA板(Corning Costar#3369，Acton，MA)用100μL/孔的在磷酸缓冲盐水(10X PBS，Abbott Bioresearch Center，Media Prep#MPS-073，Worcester，MA)中的10μg/ml的所需靶抗原(R&D Systems，Minneapolis，MN)或所需靶抗原细胞外结构域/FC融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)或单克隆小鼠抗多组氨酸抗体(R&D Systems #MAB050，Minneapolis，MN)于4℃包被过夜。将板用含有0.02％Tween20的PBS洗涤四次。通过添加300μL/孔封闭溶液(脱脂奶粉，各个零售供应商，在PBS中稀释到2％)将板在室温下封闭1/2小时。封闭后将板用含有0.02％Tween 20的PBS洗涤四次。
可替代的，将每孔一百微升的10μg/ml的组氨酸(His)标签的所需靶抗原(R&D Systems，Minneapolis，MN)添加到如上所述用单克隆小鼠抗多组氨酸抗体包被的ELISA板，并于室温温育1小时。用含有0.02％Tween 20的PBS将孔洗涤四次。
将如上所述在封闭溶液中稀释的一百微升抗体或DVD-Ig制剂添加到如上所述制备的所需靶抗原板或所需靶抗原/FC融合物板或抗多组氨酸抗体/His标签的所需靶抗原板，并于室温温育1小时。用含有0.02％Tween 20的PBS将孔洗涤四次。
将一百微升10ng/mL的山羊抗人IgG-FC特异性HRP缀合的抗体(Southern Biotech#2040-05，Birmingham，AL)添加到所需靶抗原板或抗多组氨酸抗体/组氨酸标签的所需靶抗原板的各个孔。可替代的，将一百微升10ng/mL的山羊抗人IgG-κ轻链特异性HRP缀合的抗体(Southern Biotech#2060-05 Birmingham，AL)添加到所需靶抗原/FC融合物板的各个孔，并于室温温育1小时。用含有0.02％Tween 20的PBS将板洗涤四次。
将一百微升增强的TMB溶液(Neogen Corp.#308177，K Blue，Lexington，KY)加入各孔，并于室温温育10分钟。通过添加50μL 1N硫酸终止反应。将板在450nm波长分光光度地读数。
表3含有用于直接结合测定中的抗原列表。
表4含有直接结合ELISA测定中测试的那些抗体和DVD-Ig构建体的结合数据，表示为按nM计的EC50。
在直接结合ELISA中，有时没有观察到结合，可能是因为当包被到塑性表面时靶抗原上的抗体结合部位被“掩蔽”，或抗原“变形”。DVD-Ig不能结合其靶可能也是因为直接结合ELISA形式施加于DVD-Ig上的空间限制。在直接结合ELISA形式中没有结合的亲本抗体和DVD-Igs在其他ELISA形式(例如FACS、Biacore或生物测定)中结合靶抗原。也可以通过调整DVD-Ig两个可变结构域之间的接头长度来恢复DVD-Ig的不结合，如前文所示。
表3：用于直接结合ELISA的抗原
Figure BPA00001281288902011
ECD＝细胞外结构域
/FC嵌合体＝抗原/IgG FC结构域融合蛋白
表4：亲本抗体和DVD-Ig构建体的直接结合ELISA
Figure BPA00001281288902021
所有DVD-Ig构建体的结合得到保持，并且与亲本抗体的那种是可比较的。所有N末端可变结构域以及DVD-Ig构建体DVD009、DVD016、DVD018、DVD022、DVD024、DVD035、DVD37、DVD043、DVD044、DVD49、DVD257、DVD258和DVD259的C末端可变结构域都以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
表5和6含有三个VEGF亲本抗体和96个DVD-Ig构建体的VEGF直接结合ELISA数据，所述DVD-Ig构建体具有衍生自亲本VEGF参考抗体(Ref.Ab.)AB014-VEGF(seq.1)、AB071-VEGF(seq.2)和AB070-VEGF(seq.3)可变结构域的C末端(C-末端)或N末端(N-末端)可变结构域。将这些可变结构域与四个DLL-4可变结构域配对，所述四个DLL-4可变结构域衍生自四个DLL-4Ref.Ab.(AB015-DLL-4(seq.1)、AB069-DLL-4(seq.2)、AB073-DLL-4(seq.3)、和AB072-DLL-4(seq.4)。DVD-Ig可变结构域由两个接头长度连接(重链(HC接头)和/或轻链(LC接头)中的短和长，从而产生四个可能的接头组合：短-短、长-长、短-长和长-短。这5个因素(3个VEGF序列x2个方向x2个HC接头x2个LC接头x4个DLL-4序列)的组合导致96个DVDs的全析因实验。
表5：具有各种VEGF序列、方向和接头长度组合的96个DVD构建体与VEGF的直接结合ELISA
Figure BPA00001281288902051
  DVD456   VEGF(Seq.3)   N-末端   长   短   DLL4(seq.2)   1.63   AB070   1.11
  DVD461   VEGF(Seq.3)   C-末端   短   长   DLL4(seq.2)   10.44   AB070   1.11
  DVD462   VEGF(Seq.3)   N-末端   短   长   DLL4(seq.2)   8.00   AB070   1.11
  DVD511   VEGF(Seq.1)   C-末端   短   短   DLL4(seq.3)   35.11   AB014   0.75
  DVD512   VEGF(Seq.1)   N-末端   短   短   DLL4(seq.3)   0.71   AB014   0.75
  DVD517   VEGF(Seq.1)   C-末端   长   长   DLL4(seq.3)   9.78   AB014   0.75
  DVD518   VEGF(Seq.1)   N-末端   长   长   DLL4(seq.3)   162.44   AB014   0.75
  DVD523   VEGF(Seq.1)   C-末端   长   短   DLL4(seq.3)   9.67   AB014   0.49
  DVD524   VEGF(Seq.1)   N-末端   长   短   DLL4(seq.3)   0.30   AB014   0.49
  DVD529   VEGF(Seq.1)   C-末端   短   长   DLL4(seq.3)   2.64   AB014   0.49
  DVD530   VEGF(Seq.1)   N-末端   短   长   DLL4(seq.3)   0.79   AB014   0.49
  DVD515   VEGF(Seq.2)   C-末端   短   短   DLL4(seq.3)   3015.10   AB071   35.19
  DVD516   VEGF(Seq.2)   N-末端   短   短   DLL4(seq.3)   24.65   AB071   35.19
  DVD521   VEGF(Seq.2)   C-末端   长   长   DLL4(seq.3)   654.85   AB071   35.19
  DVD522   VEGF(Seq.2)   N-末端   长   长   DLL4(seq.3)   23.53   AB071   35.19
  DVD527   VEGF(Seq.2)   C-末端   长   短   DLL4(seq.3)   2380.25   AB071   52.97
  DVD528   VEGF(Seq.2)   N-末端   长   短   DLL4(seq.3)   27.69   AB071   52.97
  DVD533   VEGF(Seq.2)   C-末端   短   长   DLL4(seq.3)   1260.61   AB071   52.97
  DVD534   VEGF(Seq.2)   N-末端   短   长   DLL4(seq.3)   23.61   AB071   52.97
  DVD513   VEGF(Seq.3)   C-末端   短   短   DLL4(seq.3)   58.54   AB070   0.97
  DVD514   VEGF(Seq.3)   N-末端   短   短   DLL4(seq.3)   67.41   AB070   0.97
  DVD519   VEGF(Seq.3)   C-末端   长   长   DLL4(seq.3)   77.17   AB070   0.97
  DVD520   VEGF(Seq.3)   N-末端   长   长   DLL4(seq.3)   247.74   AB070   0.97
  DVD525   VEGF(Seq.3)   C-末端   长   短   DLL4(seq.3)   21.79   AB070   1.42
  DVD526   VEGF(Seq.3)   N-末端   长   短   DLL4(seq.3)   96.22   AB070   1.42
  DVD531   VEGF(Seq.3)   C-末端   短   长   DLL4(seq.3)   60.39   AB070   1.42
  DVD532   VEGF(Seq.3)   N-末端   短   长   DLL4(seq.3)   28.91   AB070   1.42
  DVD487   VEGF(Seq.1)   C-末端   短   短   DLL4(seq.4)   39.78   AB014   1.61
  DVD488   VEGF(Seq.1)   N-末端   短   短   DLL4(seq.4)   4.98   AB014   1.61
  DVD493   VEGF(Seq.1)   C-末端   长   长   DLL4(seq.4)   2.26   AB014   1.61
  DVD494   VEGF(Seq.1)   N-末端   长   长   DLL4(seq.4)   712.21   AB014   1.61
  DVD499   VEGF(Seq.1)   C-末端   长   短   DLL4(seq.4)   5.07   AB014   1.41
  DVD500   VEGF(Seq.1)   N-末端   长   短   DLL4(seq.4)   5.28   AB014   1.41
  DVD505   VEGF(Seq.1)   C-末端   短   长   DLL4(seq.4)   1.27   AB014   1.41
  DVD506   VEGF(Seq.1)   N-末端   短   长   DLL4(seq.4)   1.84   AB014   1.41
  DVD491   VEGF(Seq.2)   C-末端   短   短   DLL4(seq.4)   1249.97   AB071   45.67
  DVD492   VEGF(Seq.2)   N-末端   短   短   DLL4(seq.4)   8.42   AB071   45.67
  DVD497   VEGF(Seq.2)   C-末端   长   长   DLL4(seq.4)   858.21   AB071   45.67
  DVD498   VEGF(Seq.2)   N-末端   长   长   DLL4(seq.4)   30.61   AB071   45.67
  DVD503   VEGF(Seq.2)   C-末端   长   短   DLL4(seq.4)   429.96   AB071   37.84
  DVD504   VEGF(Seq.2)   N-末端   长   短   DLL4(seq.4)   16.74   AB071   37.84
  DVD509   VEGF(Seq.2)   C-末端   短   长   DLL4(seq.4)   121.28   AB071   37.84
  DVD510   VEGF(Seq.2)   N-末端   短   长   DLL4(seq.4)   23.89   AB071   37.84
  DVD489   VEGF(Seq.3)   C-末端   短   短   DLL4(seq.4)   180.95   AB070   2.80
  DVD490   VEGF(Seq.3)   N-末端   短   短   DLL4(seq.4)   6.70   AB070   2.80
  DVD495   VEGF(Seq.3)   C-末端   长   长   DLL4(seq.4)   69.95   AB070   2.80
  DVD496   VEGF(Seq.3)   N-末端   长   长   DLL4(seq.4)   107.87   AB070   2.80
  DVD501   VEGF(Seq.3)   C-末端   长   短   DLL4(seq.4)   45.16   AB070   2.44
  DVD502   VEGF(Seq.3)   N-末端   长   短   DLL4(seq.4)   3.25   AB070   2.44
  DVD507   VEGF(Seq.3)   C-末端   短   长   DLL4(seq.4)   34.85   AB070   2.44
  DVD508   VEGF(Seq.3)   N-末端   短   长   DLL4(seq.4)   7.88   AB070   2.44
所有DVD-Ig构建体对VEGF的结合得到保持，并且与亲本抗体的那种是可比较的。所有N末端可变结构域以与亲本抗体类似的高亲和力结合。与亲本抗体相比，重链和轻链中接头长度的一些特定组合改进了C末端结构域的结合亲和力。具体而言，轻链中具有长接头的C末端结构域的亲和力比短接头有统计学显著性(p＝0.019)提高。
表6：具有各种DLL4序列、方向和接头长度组合的96个DVD-Ig构建体与DLL的直接结合ELISA
Figure BPA00001281288902071
Figure BPA00001281288902081
Figure BPA00001281288902091
所有DVD-Ig构建体与DLL4的结合得到保持，并且与亲本抗体的那种是可比较的。所有N末端可变结构域以与亲本抗体类似的高亲和力结合。与亲本抗体相比，重链和轻链中接头长度的一些特定组合改进了C末端结构域的结合亲和力。具体而言，轻链和/或重链中具有长接头的C末端结构域的亲和力比轻和重链中都有短接头有提高的趋势。
实施例1.1.1.B：捕获ELISA-VEGF
将ELISA板(Nunc，MaxiSorp，Rochester，NY)与抗人Fc抗体(PBS中5μg/ml，Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)在4℃温育过夜。将板用在洗涤缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)中洗涤三次，并在封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS)在25℃封闭1小时。将孔洗涤三次，且将各个抗体或DVD-Ig在含0.1％BSA的PBS中的连续稀释物添加到孔，并在25℃温育1小时。将孔洗涤三次，然后将生物素化的VEGF(2nM)添加到板并于25℃温育1小时。将孔三次，然后与链霉抗生物素蛋白-HRP(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD)在25℃温育1小时。将孔洗涤三次，每孔添加100μl ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。显色后用1N HCl终止反应，并测量450nM的吸光度。VEGF捕获ELISA数据示于表7。
实施例1.1.1.C：IgG-Fc捕获ELISA-RON
将96孔Nunc-Immuno板用在PBS(Gibco#10010-023 fromInvitrogen，Grand Island，NY)中的2μg/mL山羊抗人IgG Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch#109-055-098，West Grove，PA，50μL/孔)包被，并在4℃温育过夜。将板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)洗涤三次，且随后用100uL/孔的封闭缓冲液(PBS，2％BSA)在室温封闭一小时。将板洗涤三次，且与50μL/孔的1μg/mL合适的抗体或DVD-Ig溶液在室温温育1小时。一小时温育后，将板洗涤三次，且与50μL/孔组氨酸标签的重组RON蛋白(R&D Systems#1947-MS，Minneapolis，MN，1000nM至0nM终剂量范围)于室温温育一小时。将板洗涤三次，且添加50μL/孔兔抗组氨酸标签-HRP抗体(Abcam ab1187，Cambridge，MA，以1∶10,000在2％BSA/PBS溶液中稀释)，并将板在室温温育一小时。最后洗涤后，添加50μl/孔的TMB底物(Pierce#34028，Rockford，IL)，且五分钟后用50μl/孔的2N H2SO4终止反应。在450nm读取吸光度(Spectra Max Plus plate reader，Molecnlar Devices，Sunnyvale，CA)。在GraphPad Prism 4.03中计算EC50s。RON捕获ELISA数据示于表7。
实施例1.1.1.D：捕获ELISA-IGF1，2
将96孔Nunc-Immuno板用在D-PBS(Gibco#14190，San Diego，CA)中的5μg/mL抗人IgG抗体(Fcγ片段特异的，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，#109-005-098，100μL/孔)包被，并在4℃温育过夜。将ELISA板在洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)中洗涤三次，随后用200μL/孔的封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA)在25℃封闭一小时。然后将板洗涤并与100μL/孔的抗体或DVD-Ig(在封闭缓冲液中0.01μg/mL-100μg/mL)在37℃温育一小时。然后将板洗涤三次，并与生物素标记的人IGF1或IGF2(在封闭缓冲液中0.02nM-100nM剂量范围，100μL/孔)在37℃温育1小时。将板洗涤三次，并与缀合了HRP的链霉抗生物素蛋白(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD，以1∶10,000在封闭缓冲液中稀释，100μL/孔)在25℃温育1小时。最后洗涤后，将板与100μL/孔ELISA底物(1-Step Ultra TMB-ELISA，Pierce#340280，Rockford，IL)温育。五分钟后用100μl/孔的2N H2SO4在25℃终止反应，并在450nm读取吸光度。IGF1，2捕获ELISA数据示于表7。
实施例1.1.1.E：捕获ELISA-DLL4
将96孔Nunc-Immuno板(#439454，Rochester，NY)用在D-PBS(Gibco#14190，Grand Island，NY)中的5μg/mL抗人IgG抗体(Fc片段特异的，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，#109-005-098，100μL/孔)包被，并在4℃温育过夜。将ELISA板用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)洗涤三次，随后用200μL/孔的封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA，1mM CaCl2，0.05％Tween 20)在25℃封闭一小时。将板洗涤三次并与100μL/孔的DLL4抗体(在封闭缓冲液中0.0001-100nM，10倍连续稀释)在25℃温育1小时，然后再次洗涤三次。将含有捕获的DLL4 Ab的板与生物素标记的人DLL4细胞外结构域(在封闭缓冲液中10nM，100μL/孔)在25℃温育1小时，洗涤三次，并与缀合了HRP的链霉抗生物素蛋白(KPL#474-3000C，洗涤三次，并与缀合了HRP的链霉抗生物素蛋白(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD，以1∶10,000在封闭缓冲液中稀释，100μL/孔)在25℃温育1小时。最后洗涤后，将板与100μL/孔ELISA底物(1-Step Ultra TMB-ELISA，Pierce#340280，Rockford，IL)温育。2分钟后用100μl/孔的2N H2SO4在25℃终止反应，并在450nm读取吸光度。DLL4捕获ELISA数据示于表7。
实施例1.1.1.F：捕获ELISA-ErbB3或EGFR
将96孔ELISA板用33nM浓度的山羊抗人IgG Fc(JacksonImmunoresearch，PA)包被，并在4℃温育过夜。将板用含有0.05％Tween20的PBS洗涤三次，并用200μL/孔的1％BSA/PBS在室温封闭1小时。将50μL的5nM DVD-Ig或抗体添加到各个孔，并于室温温育1小时。将板洗涤，然后与50μL/孔各种浓度的生物素化ErbB3或生物素化EGFR于室温温育1小时。将板再次洗涤，然后与50μL/孔的链霉抗生物素蛋白-缀合的HRP(KPL#474-3000，Protein Research Products，MD)温育，且在室温温育1小时。将孔洗涤三次，且向每个孔添加100μlULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。显色后，用1N HCl终止反应，并在450nM测量吸光度。
表7含有亲本抗体和DVD-Ig构建体在VEGF、RON、EGFR、IGFR、IGF-1，2、HER-2、DLL4、和ErbB3中的亲和力，表示为按nM计的EC50。
表7：亲本抗体和DVD-Ig构建体的VEGF、RON、EGFR、ErbB3、IGFR、IGF-1，2、DLL4和HER-2抗原捕获ELISA
Figure BPA00001281288902121
Figure BPA00001281288902131
所有DVD-Ig构建体与可溶性抗原的结合都得到保持，并且与亲本抗体的那种是可比较的。所有N末端可变结构域以及DVD-Ig构建体DVD022、DVD038、DVD043、DVD048、DVD50和DVD260的C末端可变结构域都以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
实施例1.1.1.G：使用BIACORE技术的亲和力确定
表8：用于Biacore分析的试剂
  测定   抗原   供应商名称   供应商   目录#
  DLL4   DLL4   DLLECDHis标签   R&D   1506-D4-050
  EGFR   EGFR   EGFRECD   R&D   1095-ER
  HER-2   HER-2/FC   ErbB2/FC嵌合体-His标签   R&D   1129-ER-050
  HGF   HGF   HGF   R&D   294-HG-025
  IGF1   IGF1   IGF-I   R&D   291-G1-050
  IGF2   IGF2   IGF-2   R&D   292-G2-050
  IGF1R   IGF1R   IGF1R ECD   R&D   391-GR-050
  NRP1   NRP1   神经毡蛋白-1Npn-1-His标签   R&D   3870-N1-025
  P1GF   P1GF   胎盘GF   R&D   264-PG-050
  RON   RON   MSP受体ECD-His标签   R&D   1947-MS-050
  VEGF   VEGF   VEGF   R&D   293-VE-010
  ErbB3   ErbB3   ErbB3/FC嵌合体-His标签   R&D   348-RB
ECD＝细胞外结构域
/FC＝抗原/IgG FC结构域融合蛋白
BIACORE方法：
BIACORE测定(Biacore，Inc，Piscataway，NJ)用结合速率和解离速率常数的动力学测量来确定抗体或DVD-Ig的亲和力。抗体或DVD-Ig与靶抗原(例如，纯化的重组靶抗原)的结合通过基于表面等离振子共振的测量，用Biacore
Figure BPA00001281288902141
1000或3000仪器(Biacore
Figure BPA00001281288902142
AB，Uppsala，瑞典)使用流动HBS-EP(10mM HEPES[pH 7.4]，150mM NaCl，3mMEDTA，和0.005％表面活性剂P20)于25℃进行测定。所有化学药品都得自Biacore
Figure BPA00001281288902143
AB(Uppsala，瑞典)或否则来自如文中所述的不同来源。例如，使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明书和25μg/ml时的程序，将在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释的约5000RU山羊抗小鼠IgG，(Fcγ)，片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc，Rockford，IL)直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动室1和3中不含山羊抗小鼠IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1∶1 Langmuir结合模型的速率方程式同时对所有8次注射(使用总体拟合分析)的结合和解离相拟合。纯化的抗体或DVD-Ig在HEPES缓冲盐水中进行稀释，以用于在山羊抗小鼠IgG特异性反应表面上捕获。将作为配体捕获的抗体或DVD-Ig(25μg/ml)以5μl/分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon(M-1s-1)和koff(s-1)在25μl/分钟的连续流速下进行测定。通过在10-200nM的不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过下式由动力学速率常数来计算抗体或DVD-Igs和靶抗原之间反应的平衡解离常数(M)：KD＝koff/kon。将结合作为为时间的函数进行记录且计算动力学速率常数。在该测定中，可以测量快达106M-1s-1的结合速率和慢至10-6s-1的解离速率。
表9：亲本抗体和DVD构建体的BIACORE分析
Figure BPA00001281288902161
Figure BPA00001281288902171
通过Biacore技术表征的所有DVD-Ig构建体的结合得到保持，并与亲本抗体的那种是可比较的。所有N末端可变结构域以及DVD-Ig构建体DVD022、DVD016、DVD042、DVD044、DVD043、DVD038、DVD049、DVD260、DVD299、和DVD305的C末端可变结构域都以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
实施例1.1.2：用于确定亲本抗体和DVD-Ig功能活性的测定
实施例1.1.2.A：细胞因子生物测定
通过确定抗体或DVD-Ig的抑制潜力分析抗细胞因子或抗生长因子亲本抗体或含有抗细胞因子或抗生长因子序列的DVD-Ig抑制或中和靶细胞因子或生长因子生物活性的能力。例如，可以使用抗IL-4抗体抑制IL-4介导的IgE生产的能力。例如，通过菲科帕克(Ficoll-paque)密度离心，随后通过磁性分离分别从外周血血沉棕黄层分离人幼稚B细胞，所述磁性分离使用对人sIgD FITC标记的山羊F(ab)2抗体特异的MACS珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)，然后使用抗FITC MACS珠。将磁性分选的幼稚B细胞在XV15中调整到每毫升3x105个细胞，并以6x6阵列在板中央以100μl每孔置于(plate out)96孔板中，在37℃于5％CO2存在下培养10天期间，由填充PBS的孔包围。每个待测抗体制备一个板，由未诱导和诱导的对照以及抗体滴定的五倍重复各三孔组成，所述抗体滴定从7μg/ml开始并3倍稀释低至29ng/ml终浓度，以50μl四倍浓缩的预稀释物(pre-dilution)添加。为了诱导IgE生产，将50μl中终浓度各为20ng/ml的rhIL-4加上0.5μg/ml的抗CD40单克隆抗体(Novartis，Basel，瑞士)添加到各孔，并在培养时间段结束时通过标准夹心ELISA方法确定IgE浓度。
实施例1.1.2.B：细胞因子释放测定
亲本抗体或DVD-Ig引起细胞因子释放的能力得到分析。通过静脉穿刺术从三个健康供体取外周血到肝素化vacutainer管中。用RPMI-1640培养基将全血1∶5稀释，并将其以0.5mL每孔置于24孔组织培养板中。将抗细胞因子抗体(例如抗IL-4)稀释到RPMI-1640中，并以0.5mL/孔置于板中，以得到终浓度200、100、50、10和1μg/mL。全血在培养板中的最终稀度为1∶10。将LPS和PHA以2μg/mL和5μg/mL的终浓度添加到单独孔中，作为细胞因子释放的阳性对照。使用多克隆人IgG作为阴性对照抗体。一式两份进行实验。将板于37℃在5％CO2下温育。24小时后，将孔内容物转移到试管中，并于1200rpm旋转5分钟。收集无细胞上清液并冷冻用于细胞因子测定。用0.5mL裂解溶液裂解留在板上和管中的细胞，置于-20℃并解冻。添加0.5mL培养基(以使体积与无细胞上清液样品水平相同)，且收集细胞制剂并冷冻用于细胞因子测定。通过ELISA分析无细胞上清液和细胞裂解液的细胞因子水平，例如IL-8、IL-6、IL-1β、IL-1RA、或TNF-α的水平。
实施例1.1.2.C：细胞因子交叉反应性研究
针对目的细胞因子的抗细胞因子亲本抗体或DVD-Ig与其他细胞因子交叉反应的能力得到分析。将亲本抗体或DVD-Ig固定化在Biacore生物传感器基质上。通过首先用100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和400mM N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)活化基质上的羧基，经由游离氨基将抗人Fc mAb共价连接到葡聚糖基质上。将约50μL稀释在乙酸钠(pH4.5)中、浓度为25μg/mL的各抗体或DVD-Ig制剂穿过活化的生物传感器进行注射，且蛋白上的游离氨基直接与活化的羧基结合。一般，固定5000共振单位(Resonance Units)(RU’s)。通过注射1M乙醇胺来灭活未反应的基质EDC酯。使用标准氨基偶联试剂盒通过固定化人IgG1/K制备第二个流动室(flow cell)作为参考标准。使用CM生物传感器芯片实施SPR测量。将所有将在生物传感器表面上分析的抗原稀释在含有0.01％P20的HBS-EP运行缓冲液中。
为了检查细胞因子结合特异性，将过量的目的细胞因子(100nM，例如可溶性人重组体)穿过抗细胞因子亲本抗体或DVD-Ig固定化的生物传感器表面进行注射(5分钟接触时间)。在注射目的细胞因子之前以及紧随其后，HBS-EP缓冲液单独流过每个流动室。用基线和对应于完成细胞因子注射后约30秒的时刻之间的信号净差额代表最终结合值。再次，测量以共振单位计的应答。在观察到结合事件的情况下，在注射下一个样品之前，使用10mM HCl将生物传感器基质再生，否则将运行缓冲液注射在基质上。同时也将人细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-22、IL-23、IL-27、TNF-α、TNF-β、和IFN-γ)注射在固定化的小鼠IgG1/K参考表面上，以记录任何非特异性结合背景。通过制备参考和反应表面，Biacore可以自动从反应表面数据减去参考表面数据，以消除大部分折射率改变和注射噪声。因此，可能确定归因于抗细胞因子抗体或DVD-Ig结合反应的真实结合应答。
当将目的细胞因子穿过固定化的抗细胞因子抗体进行注射时，观察到显著结合。10mM HCl再生完全去除所有非共价结合的蛋白。传感图(sensorgram)检查说明，固定化的抗细胞因子抗体或DVD-Ig与可溶性细胞因子的结合是强烈且坚固的。对目的细胞因子确认预期结果后，对单独各个抗体或DVD-Ig测试剩余重组人细胞因子实验对象组。为各注射循环记录抗细胞因子抗体或DVD-Ig结合的或未结合的细胞因子的量。使用来自三个独立实验的结果来确定各抗体或DVD-Ig的特异性概况。选择对目的细胞因子具有预期的结合、且不结合任何其他细胞因子的抗体或DVD-Ig。
实施例1.1.2.D：组织交叉反应性
以三个阶段完成组织交叉反应性研究，第一阶段包括32个组织的冷冻切片，第二阶段包括最高达38个组织，且第三阶段包括如下所述来自三个不相关成体的额外组织。一般在两个剂量水平完成研究。
第1阶段：将人组织冷冻切片(约5μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的一个人供体的32个组织(一般为：肾上腺、胃肠道、前列腺、膀胱、心脏、骨骼肌、血细胞、肾、皮肤、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾、小脑、淋巴结、睾丸、大脑皮质、卵巢、胸腺、结肠、胰、甲状腺、内皮、甲状旁腺、输尿管、眼、垂体、子宫、输卵管和胎盘))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
第2阶段：将人组织冷冻切片(约5μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的3个不相关成体的38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、骨骼肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
第3阶段：将食蟹猴组织冷冻切片(约5μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的3个不相关成体猴的38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、骨骼肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白-生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
将抗体或DVD-Ig与第二生物素化的抗人IgG温育，并发展为免疫复合物。将终浓度为2和10μg/mL抗体或DVD-Ig的免疫复合物添加至物镜上的组织切片上，然后使组织切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3，3′-二氨基联苯胺)4分钟用于组织染色。使用抗原-琼脂糖珠作为阳性对照组织切片。靶抗原和人血清封闭研究作为额外对照。将终浓度为2和10μg/mL抗体或DVD-Ig的免疫复合物与靶抗原(终浓度100μg/ml)或人血清(终浓度10％)预温育30分钟，然后添加至物镜上的组织切片上，然后使组织切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3，3′-二氨基联苯胺)4分钟用于组织染色。
基于正被讨论的靶抗原的已知表达，将任何特异性染色判断为预期的(例如，与抗原表达一致)或非预期的反应性。对任何判断为特异性的染色关于强度和频率打分。将第二阶段(人组织)和第三阶段(食蟹猴组织)之间的组织染色判断为类似或不同的。
实施例1.1.2.E：通过VEGF亲本抗体和DVD-Ig构建体的HUVEC增殖/存活抑制
在铺平板用于测定之前，将正常人脐血管内皮细胞或HUVEC(2-6代)维持在补加了EGM-2 SingleQuots(Lonza-Clonetics，Walkersville，MD，#CC-4176)的EBM-2(Lonza-Clonetics，Walkersville，MD)中。将HUVEC细胞以10,000细胞/孔在无生长因子含0.1％FBS的(100μl)EMB-2中铺平板到胶原包被的黑色96孔板上。次日，将培养基用无生长因子的0.1％FBS置换。次日，将培养基用100μl的EMB-2(无生长因子或血清)置换，并在添加VEGF和抗体/DVD-Igs之前温育4小时。将抗VEGF单克隆抗体或DVD-Igs(终浓度67nM、6.7nM和0.67nM)在含0.1％BSA的EMB-2中稀释且与重组人VEGF165(50ng/ml)在50μl中于25℃预温育1小时。然后将抗体/DVD-Ig和VEGF混合物添加到细胞(50μl)，并将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育72小时。通过根据制造商说明书使用ATPlite试剂盒(Perkin Elmer，Waltham，MA)评估ATP水平，间接测量细胞存活/增殖。表10提供了说明HUVEC增殖/存存活抑制的数据。
表10：通过VEGF亲本抗体和DVD-Ig构建体的HUVEC增殖/存活抑制
Figure BPA00001281288902221
含有来自AB014的VDs的所有DVD-Igs抑制VEGF引起的HUVEC细胞增殖。DVD044、DVD048、DVD040 DVD050在67nM的DVD-Igs浓度将HUVEC细胞增殖抑制＞90％。
实施例1.1.2.F：IGF1，2单克隆抗体或DVD-Igs在体外的肿瘤细胞生长抑制作用
将稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中的IGF1，2单克隆抗体或DVD-Igs 20μL添加到人肿瘤细胞，终浓度为200μL中0.01μg/mL-100μg/mL。将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育三天。根据制造商说明书(Promega，Madison，WI)使用MTS试剂定量各孔中的活细胞数目以确定肿瘤生长抑制百分比。使用未经抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有细胞的孔视为为显示100％抑制。
表11：使用IGF1R和IGF1，2亲本抗体和DVD-Ig构建体的H929，IGFR系增殖抑制测定
Figure BPA00001281288902231
在N末端或C末端位置含有来自AB033、AB004、AB011、或AB010的VD的所有DVD-Igs都在A431细胞增殖测定中显示抑制。
实施例1.1.2.G：EGFR单克隆抗体或DVD-Igs在体外的生长抑制作用
将稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中的EGFR单克隆抗体或DVD-Igs 20μL添加到人肿瘤细胞，终浓度为180μL中0.01μg/mL-100μg/mL。将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育三天。根据制造商说明书(Promega，Madison，WI)使用MTS试剂定量各孔中的活细胞数目以确定肿瘤生长抑制百分比。使用未经抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有细胞的孔视为显示100％抑制。
表12：使用EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体的A431，EGFR细胞系增殖抑制测定
Figure BPA00001281288902241
在N末端或C末端位置含有来自AB033、AB004、AB011、AB010、AB014的VDs的所有DVD-Igs在A431细胞增殖测定中显示抑制。
表13：使用EGFR、IGF1R和IGF1，2亲本抗体和DVD-Ig构建体的GEO，EGFR/IGF1R细胞系增殖抑制测定
在N末端或C末端位置含有来自AB033、AB004、AB011、AB010、AB014的VDs的所有DVD-Igs在GEO细胞增殖测定中显示抑制。
实施例1.1.2.H：HER2亲本抗体或DVD-Ig构建体在体外的肿瘤细胞生长抑制作用
将稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中的HER2单克隆抗体或DVD-Igs 20μL添加到HER2表达性人肿瘤细胞(BT474)，终浓度为0.01μg/mL-100μg/mL(180μL)。将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育三天。根据制造商说明书(Promega，Madison，WI)使用MTS试剂定量各孔中的活细胞数目以确定肿瘤生长抑制百分比。使用未经抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有细胞的孔视为显示100％抑制。
表14：使用抗Her-2亲本抗体和DVD-Ig构建体的BT474，Erb2(Her-2)细胞系增殖抑制测定
在N末端或C末端位置含有来自AB004的VD的所有DVD-Igs在BT474细胞增殖测定中显示抑制。
实施例1.1.2.I：DLL4亲本抗体和DVD-Ig构建体对Eahy.926细胞中重组DLL4依赖的Svegfr1(Sflt1)增加的抑制
将96孔组织培养板用100μl/孔人DLL4细胞外结构域以在D-PBS(Gibco#14190，Grand Island，NY)中5μg/ml包被，并在4℃温育过夜。将板用D-PBS洗涤一次，并在抗体或DVD-Igs不存在或存在下接种4000个EA.hy926细胞/孔。四天后，使用CyQUANT细胞增殖测定试剂盒(Invitrogen，#C35007，Eugene，OR)测量细胞增殖。按照制造商建议(R&D Systems #DVR100B，Minneapolis，MN)通过ELISA试剂盒检测条件培养基中的sVEGFR1表达。将sVEGFR1水平标准化为通过CyQUANT测定确定的RFU，以解释细胞增殖中的差异。
表15：DLL4亲本抗体或DVD-Ig构建体对Eahy.926细胞中DLL4依赖的Svegfr1(Sflt1)增加的抑制
Figure BPA00001281288902271
在N末端或C末端位置含有来自AB015的VD的DVD-Igs显示对DLL4诱导的sFLT从Eahy.926细胞释放的剂量依赖的抑制。
实施例1.1.2.J：亲本或DVD-Ig抗体在体外的杀肿瘤作用
可以对结合肿瘤细胞上靶抗原的亲本抗体或DVD-Ig分析杀肿瘤活性。简而言之，将亲本抗体或DVD-Ig稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中，且以终浓度0.01μg/mL-100μg/mL添加到人肿瘤细胞200μL。将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育三天。根据制造商说明书(Promega，Madison，WI)使用MTS试剂定量各孔中的活细胞数目以确定肿瘤生长抑制百分比。使用未经抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有细胞的孔视为显示100％抑制。
为了评估凋亡，通过下列规程确定胱天蛋白酶-3活化：将96孔板中经抗体处理的细胞于室温在120μl 1x裂解缓冲液(1.67mM Hepes，pH 7.4，7mM KCl，0.83mM MgCl2，0.11mM EDTA，0.11mM EGTA，0.57％CHAPS，1mM DTT，1x蛋白酶抑制剂混合物片剂；无EDTA；Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)中伴随振荡裂解20分钟。细胞裂解后，添加80μl胱天蛋白酶-3反应缓冲液(48mM Hepes，pH 7.5，252mM蔗糖，0.1％CHAPS，4mM DTT，和20μM Ac-DEVD-AMC底物；BiomolResearch Labs，Inc.，Plymouth Meeting，PA)，并将板在37℃温育2小时。使用下列设置在1420 VICTOR Multilabel Counter(Perkin Elmer LifeSciences，Downers Grove，IL)上阅读板：激发＝360/40，发射＝460/40。来自抗体处理的细胞相对于同种型抗体对照处理的细胞的荧光单位的增加是凋亡的指示。
实施例1.1.2.K：HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体对U87-MG肿瘤细胞增殖的抑制
将U87-MG人神经胶质瘤细胞在补加了5％胎牛血清的RPMI培养基中以2,000个细胞/孔、100μl铺平板于96孔板中，并于37℃、5％CO2温育过夜。次日用抗体或DVD-Igs的连续稀释(0.013nM至133nM剂量范围)处理细胞，并在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育5天。通过根据制造商说明书使用ATPlite试剂盒(Perkin Elmer，Waltham，MA)评估ATP水平，间接测量细胞存活/增殖。
表16：通过抗HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体的U87-MG肿瘤增殖抑制
Figure BPA00001281288902281
在C末端位置或N末端位置含有来自AB012的VD的DVD-Igs抑制U87-MG肿瘤细胞增殖。
实施例1.1.2.L：RON亲本抗体和DVD-Ig构建体在体外对RON与MSP1相互作用的抑制
将96孔板用50μl/孔的抗MSPα链抗体(R&D Systems#MAB352，Minneapolis，MN，2μg/mL)包被，并将板于4℃温育过夜。将板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)中洗涤三次，然后用100ul/孔的封闭缓冲液(含2％BSA的PBS)于25℃封闭1小时。然后将板洗涤三次，并与50μl/孔的10nM重组人MSP1溶液(R&D Systems#352-MS，Minneapolis，MN)于25℃温育1小时。在板温育期间，将待测抗体的连续10倍稀释物(0nM至1000nM剂量范围)与10nM重组His-RON部分ECD(R&D Systems#1947-MS，Minneapolis，MN)于25℃预温育1小时。将与重组人MSP1温育的板洗涤三次，并一式三份地添加50μl/孔的抗体/His-RON复合物。于25℃温育一小时之后，然后将板洗涤，并添加50μl/孔的TMB底物(Pierce#34028，Rockford，IL)，且于25℃温育五分钟。五分钟后用50μl/孔的2N H2SO4终止反应。在450nm(SpectraMax Plus plate reader，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取吸光度。在GraphPad Prism 4.03中计算EC50s。结果提供于下表17中。
实施例1.1.2.M：VEGF亲本抗体和DVD-Ig构建体阻止VEGF165与VEGFR1相互作用
将ELISA板(Nunc，MaxiSorp，Rochester，NY)与含有重组VEGFR1细胞外结构域-Fc融合蛋白(5μg/ml，R&D systems，Minneapolis，MN)的100μl PBS于4℃温育过夜。将板在洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)中洗涤三次，并在封闭缓冲液(含1％BSA的PBS)中于25℃封闭1小时。将各抗体/DVD-Ig在含0.1％BSA的PBS中的连续稀释物与50μl的2nM生物素化的VEGF于25℃温育1小时。然后将抗体/DVD-Ig-生物素化的VEGF混合物(100μl)添加到VEGFR1-Fc包被的孔中，并于25℃温育10分钟。将孔洗涤三次，然后与100μl链霉抗生物素蛋白-HRP(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD)于25℃温育1小时。将孔洗涤三次，且每孔添加100μl的ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。显色后用1N HCl终止反应，并测量450nM处的吸光度。结果提供于下表17。
实施例1.1.2.N：DLL4亲本抗体和DVD-Ig构建体在体外对DLL4与Notch-1相互作用的抑制
将96孔Nunc-Immuno板(Nunc，#439454，Rochester，NY)用16nM人Notch-1(R&D Systems#3647-TK，Minneapolis，MN，100μl/孔，在D-PBS中)包被，并于4℃温育过夜。用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween20)将板洗涤一次，并以200μl/孔的封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA，1mM CaCl2，0.05％Tween 20)于25℃封闭1小时。封闭时，将300μl生物素标记的人DLL4细胞外结构域(14nM)与抗体或DVD-Ig(3.4pM-66nM，在封闭缓冲液中的3倍连续稀释)于25℃混合1小时。将测定板在封闭后洗涤，并与DLL4抗体或DVD-Ig混合物温育(100μl/孔，于25℃，1小时)。再次将板洗涤，并在25℃添加100μl/孔的与HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD，1∶10,000稀释在封闭缓冲液中)进行1小时。最终洗涤后，将板用100μl/孔的底物(1-Step Ultra TMB-ELISA，Pierce#340280，Rockford，IL)显色，且在25℃温育10-20分钟后，使用100μl/孔的2N H2SO4终止反应，并在450nm读取吸光度。结果提供于下表17。
实施例1.1.2.O：HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体对HGF与c-Met相互作用的抑制
将ELISA板(Nunc，MaxiSorp)用100μl/孔的重组人HGF(PBS中的2μg/ml HGF，R&D systems)于4℃包被过夜。将各抗体/DVD-Ig的连续稀释物和2nM可溶性c-Met Fc融合物(R&D systems)(50μl)共温育，并添加到HGF包被的孔中。用生物素化的抗c-Met(BAF358，R&DSystems)和100μl链霉抗生物素蛋白-HRP(KPL)检测c-Met结合。将孔在PBST(含0.05％Tween 20的PBS)中洗涤三次，且每孔添加100μl的ULTRA-TMB ELISA(Pierce)。显色后用1N HCl终止反应，并测量450nM处的吸光度。通过计算与最大信号(对照抗体或无抗体添加)相比的百分比抑制而对数据进行评价，并计算IC50值。
下表含有亲本抗体和DVD-Ig构建体在上述配体-受体结合竞争ELISA测定中，关于RON、VEGF、DLL4和HGF的亲和力数据，表示为按nM计的IC50。
表17：与RON、VEGF DLL4、以及HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体的配体-受体相互作用的体外抑制
Figure BPA00001281288902311
在N末端或C末端位置含有来自AB005、AB015、AB015、AB012的VD的所有DVD-Igs表现出配体对其各自受体的抑制。DVD-Ig的N末端结构域对配体-受体相互作用的封闭和亲本抗体一样。
实施例1.1.2.P：亲本抗体或DVD-Ig构建体在体外对IGF诱导的IGFR磷酸化的抑制
将人癌细胞以40,000细胞/孔在180μl无血清培养基(DMEM+0.1％BSA)中铺平板到96孔板，并于37℃、5％CO2温育过夜。将Costar EIA板(Lowell，MA)用100μl/孔的IGFR捕获Ab(R&D Systems，目录号MAB391，Minneapolis，MN，4μg/ml终浓度)包被并于室温振荡温育过夜。次日，洗涤IGFR抗体包被的ELISA板(用PBST＝在PBS中的0.05％Tween 20，pH 7.2-7.4，三次)，并添加200μl封闭溶液(1％BSA，在PBS中的0.05％NaN3，pH 7.2-7.4)以在震荡器上于室温封闭2小时。将人肿瘤细胞与抗体或DVD-Igs和IGF配体共温育。将稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中的IGF1，2单克隆抗体或DVD-Igs以0.01μg/mL-100μg/mL的终浓度添加到人癌细胞。同时将生长因子(IGF1和IGF2)以1-100ng/mL(200μL)的浓度添加到细胞，并将细胞在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育1小时。将细胞在120μl/孔的冷细胞提取缓冲液(10mM Tris，pH 7.4，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM NaF，1mM原钒酸钠，1％Triton X-100，10％甘油，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解，并于4℃伴随振荡温育20分钟。将细胞裂解物(100μl)添加至ELISA板，并于4℃伴随温和振荡温育过夜。次日，将ELISA板洗涤，并添加100μl/孔的pTyr-HRP检测Ab(p-IGF1R ELISA试剂盒，R&D System#DYC1770，Minneapolis，MN)，且将板在25℃于暗处温育2小时。根据制造商说明书将板显色以确定磷酸-IGF1R。结果示于表18和19。
表18：由抗IGF1，2亲本抗体或DVD-Ig构建体对通过IGF1的IGF1R磷酸化的抑制
在N末端或C末端位置含有来自AB010的VD的DVD-Igs表现出对IGF1诱导的IGF1R受体磷酸化的抑制。DVD-Ig N末端位置中的AB010 VD对受体磷酸化的封闭和亲本抗体AB010一样。
表19：由抗IGF1，2亲本抗体或DVD-Ig构建体对通过IGF2的IGF1R磷酸化的抑制
在N末端或C末端位置含有来自AB010的VD的DVD-Igs表现出对IGF2诱导的IGF1R受体磷酸化的抑制。DVD-Ig N末端位置中的AB010 VD对受体磷酸化的封闭和亲本抗体AB010一样。
实施例1.1.2.Q：HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体对HGF介导的Akt磷酸化的抑制
将H1299非小细胞肺肿瘤细胞以20,000细胞/孔(总体积100μl)铺平板在96孔板上，并于37℃、5％CO2血清饥饿18小时。将抗HGF单克隆抗体或DVD-Igs(终浓度67nM、6.7nM和0.67nM)稀释到含有0.1％BSA的Dulbecco氏极限必需培养基中，并与50μl重组人HGF(50ng/ml)在25℃预温育1小时。然后将这些抗体/DVD-Ig和HGF混合物(50μl)添加到细胞，并将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育约15分钟。然后通过向各孔添加等体积的7.6％甲醛将细胞固定，并将板在25℃温育15分钟。固定后，在含有0.1％Triton X-100的PBS中将细胞洗涤五次。然后用每孔150μl的LI-COR Odyssey Blocking Buffer(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)处理细胞，并以中等振荡在室温温育90分钟。取出封闭缓冲液，并将细胞与稀释在封闭缓冲液中的第一抗体(1∶300稀释Phospho Ser473-Akt，Cell Signaling Technology#4060，Boston，MA)在4℃温育过夜。然后用含0.1％Tween 20的PBS将孔洗涤五次，并然后与第二抗体(抗兔IRDyeTM 680CW LI-COR(Li-CorBiosciences，Lincoln，NE)于含0.2％Tween 20的1xPBS中的1∶400稀释)于25℃温育1小时。用含0.1％Tween 20的PBS将细胞洗涤5次，并用Odyssey红外成像系统成像。
表20：HGF亲本抗体和DVD-Ig构建体对HGF介导的Akt磷酸化的抑制
Figure BPA00001281288902341
在N末端或C末端位置含有来自AB012的VD的DVD-Igs表现出对HGF诱导的Akt磷酸化的良好抑制。DVD-Ig N末端位置中的AB012VD对Akt磷酸化的封闭和亲本抗体AB012一样。
实施例1.1.2.R：VEGF亲本抗体和DVD-Ig构建体对VEGFR2(KDR)磷酸化的抑制
将表达人VEGFR2(KDR)的NIH3T3细胞以20,000个细胞/孔(100μl)在补加了10％FBS的DMEM中铺平板在96孔板。次日，将细胞用DMEM洗涤两次，并在无FBS的DMEM中血清饥饿三小时。将稀释在含0.1％BSA的DMEM中的抗VEGF亲本抗体或DVD-Igs(终浓度67nM、6.7nM和0.67nM)与重组人VEGF165(50ng/ml)在25℃预温育1小时。然后将这些抗体/DVD-Ig和VEGF混合物添加到细胞，并将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育10分钟。将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并通过添加100μl/孔补加了0.1％NP40的细胞裂解缓冲液(Cell Signaling，Boston，MA)将细胞裂解。合并一式两份的样品，将170μl添加到预先以抗VEGFR2抗体(R&D systems，AF357，Minneapolis，MN)包被的ELISA板孔中，并在25℃伴随温和振荡温育两小时。用洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)将孔洗涤五次，并与50μl生物素化的抗磷酸酪氨酸抗体(4G10；Millipore，Billerica，MA)的1∶2000稀释物于25℃温育1小时。用含0.05％Tween 20的PBS将孔洗涤五次，然后与链霉抗生物素蛋白-HRP(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD)在25℃温育1小时。用链霉抗生物素蛋白-HRP(KPL#474-3000，Gaithersburg，MD))将孔洗涤三次。用含0.05％Tween 20的PBS将孔洗涤三次，并每孔添加100μl的ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford，IL)。显色后用1N HCl终止反应，并测量450nM处的吸光度。结果示于表21。
表21：VEGF亲本抗体或DVD-Ig构建体对VEGFR2(KDR)磷酸化的抑制
在N末端或C末端位置含有来自AB014的VD的DVD-Igs表现出对VEGF诱导的KDR磷酸化的良好抑制。DVD-Ig N末端位置中的AB014 VD对KDR磷酸化的封闭和亲本抗体AB014一样。
实施例1.1.2.S：EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体在体外对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制
将稀释于D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)中的EGFR单克隆抗体或DVD-Igs以终浓度0.01μg/mL-100μg/mL(180μL)添加到人癌细胞。将板在湿润的5％CO2气氛中于37℃温育1小时。将生长因子(EGF)以终浓度1-100ng/mL(20μL)添加到细胞进行5-15分钟以刺激受体(EGFR)自身磷酸化。使用没有抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有生长因子刺激的孔视为表现100％抑制。通过与细胞提取缓冲液(10mM Tris，pH 7.4，100mM NaCl，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM NaF，1mM原钒酸钠，1％Triton X-100，10％甘油，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂混合物)温育制备细胞裂解物。根据制造商说明书使用来自R&D Systems的p-EGFR ELISA试剂盒(#DYC1095，Minneapolis，MN)确定这些细胞裂解物中的磷酸EGFR。结果示于表22和23。
表22：抗EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制
Figure BPA00001281288902361
在N末端或C末端位置含有来自AB033的VD的DVD-Igs表现出对EGF诱导的EGFR磷酸化的良好抑制。DVD-Ig(DVD015、DVD021)N末端位置中的AB033VD对EGFR磷酸化的封闭和亲本抗体AB033一样。
表23：抗EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体对EGF诱导的EGFR磷酸化的抑制
Figure BPA00001281288902362
在N末端或C末端位置含有来自AB033的VD的DVD-Igs表现出对EGF诱导的EGFR磷酸化的良好抑制。DVD-Ig(DVD023)N末端位置中的AB033VD对EGFR磷酸化的封闭和亲本抗体AB033一样。
实施例1.1.2.T：亲本RON抗体和DVD-Ig构建体在体外对MSP1诱导的ERK1/2和AKT磷酸化的抑制
将在10％FBS/极限必需培养基中生长的分会合DU145结肠肿瘤细胞进行胰蛋白酶消化，并接种在6孔组织培养板中(0.25x106细胞/2ml终体积)，并在37℃、5％CO2中温育18-24小时。温育后，将细胞用1X D-PBS洗涤两次，并在无血清培养基中饥饿过夜。次日将细胞与900μl含有1μM单克隆抗体或DVD-Igs的无血清培养基于37℃温育1小时。抗体温育后，用13nM MSP1(37℃，30分钟)处理细胞。用冰冷的D-PBS将细胞洗涤两次，并将细胞收获在150μl细胞提取缓冲液(Biosource International，Carlsbad，CA)中，所述150μl细胞提取缓冲液含有100μl HALT
Figure BPA00001281288902371
磷酸酶抑制剂混合物(Thermo Scientific，Rockford，IL)、一个Complete
Figure BPA00001281288902372
无EDTA蛋白酶抑制剂片剂(1片/10ml，RocheDiagnostic，Mannheim，德国)、和PMSF。将细胞裂解物伴随间歇涡旋在冰上温育30分钟，通过离心(10分钟，14,000RPM，4℃)预先澄清(pre-cleared)，并进行加工以用于蛋白印迹分析。通过SDS-PAGE在4-12％NuPage Bis-Tris凝胶上以1X MOPS运行缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离共15μg细胞裂解物。将蛋白转移到硝化纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，并在TBS-T(1X TBS/0.1％Tween 20)中的5％脱脂乳中于室温封闭1小时。封闭后，将膜与兔多克隆磷酸-p44/42MAPK(Thr202/Tyr204)抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)或兔单克隆磷酸-AKT(Ser473)抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)的1∶1000稀释物在4℃温育过夜。将印迹洗涤三次(1X TBS-T，15分钟)，并与抗兔IgG、HRP缀合的第二山羊抗体(Jackson Immunoresearch，WestGrove，PA)在5％脱脂乳/TBS-T溶液中的1∶5000稀释物在室温温育1小时。将印迹洗涤三次(1X TBS-T，15分钟)，且通过与SuperSignal WestDura Luminol/Enhancer Solution(Millipore，Temecula，CA)的5分钟温育活化过氧化物酶缀合的第二抗体，并用发光成像分析仪LAS-3000(FUJIFilm，Tokyo，日本)检测并定量化学发光。使用MultiGauge软件(FUJIFilm，Tokyo，日本)确定带强度，并对各带定量总化学发光信号。为了确定ERK1/2和AKT总水平，用1X Reblot Plus Strong Solution
Figure BPA00001281288902374
(Thermo Scientific，Rockford，IL)将膜剥离(stripped)15分钟，并用兔多克隆p44/42 MAPK抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)或兔单克隆AKT抗体(Cell Signaling，Danvers，MA)的1∶1000稀释物重探测，并如上文关于磷酸抗体所述进行加工。分别将Ph-ERK和ph-Akt水平标准化为总ERK或总Akt。
表24：RON亲本抗体或DVD-Ig构建体对MSP1诱导的ERK1/2磷酸化的抑制
Figure BPA00001281288902381
在N末端位置含有来自AB005的VD的DVD-Igs表现出对MSP1诱导的ERK1/2磷酸化的出色抑制。DVD024和DVD033的抑制概况与亲本抗体AB005的抑制概况相似。
实施例1.1.2.U：DVD-Ig对人癌皮下胁腹异种移植物(HumanCarcinoma Subcutaneous Flank Xenografts)生长的功效
使A-431人鳞状细胞癌细胞在组织培养瓶中体外生长至99％生存力、85％会合。在研究第0日将1x106个人肿瘤细胞(1∶1matrigel)皮下注射到19-25克SCID雌性小鼠(Charles Rivers Labs，Wilmmgton，MA)右胁腹。将小鼠按大小匹配到平均肿瘤体积约200至320mm3的小鼠组后，开始施用人IgG对照或DVD-Ig(IP，QD，3x/周)。从肿瘤细胞注射后约10天开始，每周测量肿瘤两次。
相对于仅接受对照IgG的动物中的肿瘤，在施用EGFR+IGF1/2DVD Ig的动物中，观察到肿瘤体积减小。对于两个不同的EGFR+IGF1/2DVD Ig构建体，在3周给药阶段结束四天后测量的％TGIs是69和64。
实施例1.1.2.V：如通过流式细胞术评估的单克隆抗体与人肿瘤细胞系表面的结合
从组织培养瓶收获超表达目的细胞表面抗原的稳定细胞系或人肿瘤细胞系，并重悬浮在含有5％胎牛血清的磷酸缓冲盐水(PBS)中(PBS/FBS)。染色前，将人肿瘤细胞与(100μl)在PBS/FCS中5μg/ml的人IgG于冰上温育。将1-5x105个细胞与在PBS/FBS中的抗体或DVD-Ig(2μg/mL)在冰上温育30-60分钟。将细胞洗涤两次，并添加100μl的F(ab’)2山羊抗人IgG、Fcγ-藻红蛋白(在PBS中的1∶200稀释物)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，目录号109-116-170)。冰上30分钟温育后，将细胞洗涤两次，并重悬浮在PBS/FBS中。使用BectonDickinson FACSCalibur(Becton Dickinson，San Jose，CA)测量荧光。
表25显示DVD-Ig构建体的FACS数据。几何平均值是n个荧光信号相乘乘积(a1xa2xa3…an)的n次方根。用对数变换的(log-transformed)数据，使用几何平均值将数据分布的权重标准化。下表含有亲本抗体和DVD-Ig构建体的FACS几何平均值。
表25：DVD-Ig构建体的荧光激活细胞分选术
Figure BPA00001281288902401
Figure BPA00001281288902411
所有DVDs都显示与其细胞表面靶结合。DVDs的N末端结构域对其细胞表面上靶的结合与亲本抗体一样、或好于亲本抗体。可以通过调节接头长度恢复或改进结合。
实施例1.1.2.W：如通过流式细胞术评估的亲本EGFR抗体和DVD-Ig构建体与人肿瘤细胞系表面的结合
从组织培养瓶收获超表达细胞表面EGFR的稳定细胞系或人肿瘤细胞系，并重悬浮在含有1％胎牛血清的Dulbecco氏磷酸缓冲盐水液(DPBS)中(DPBS/FCS)。将1-5x105个细胞与在DPBS/FCS中的100μl抗体或DVD-Igs(10ug/mL)于冰上温育30-60分钟。将细胞洗涤两次，并添加50μl山羊抗人IgG-藻红蛋白(在DPBS/BSA中的1∶50稀释物)(Southern Biotech Associates，Birmingham，AL目录号2040-09)。冰上30-45分钟温育后，将细胞洗涤两次，并重悬浮于125uL/孔在DPBS/FCS中的1％甲醛中。使用Becton Dickinson LSRII(BectonDickinson，San Jose，CA)测量荧光。
表26：通过FACS，抗EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体对A431，EGFR细胞系的结合亲和力
Figure BPA00001281288902421
所有DVDs都与其细胞表面靶结合。DVDs的N末端结构域对其细胞表面上靶的结合与亲本抗体一样。
表27：通过FACS，抗EGFR亲本抗体和DVD-Ig构建体对BAFvar3细胞系的结合亲和力
所有DVDs都与其细胞表面靶结合。DVDs的N末端结构域对其细胞表面上靶的结合与亲本抗体一样。
实施例1.2：针对目的人抗原的亲本单克隆抗体的生成
如下所述获得能够结合和中和目的人抗原及其变体的亲本小鼠mAbs：
实施例1.2.A：用目的人抗原免疫接种小鼠
在第1天时，将与完全弗氏佐剂或Immunoeasy佐剂(Qiagen，Valencia，CA)混合的20微克重组纯化的人抗原(例如IGF1，2)皮下注射到5只6-8周龄的Balb/C、5只C57B/6小鼠和5只AJ小鼠中。在第24、38和49天时，将与不完全弗氏佐剂或Immunoeasy佐剂混合的20微克重组纯化的人抗原变体皮下注射到相同小鼠中。在第84天或第112天或第144天时，用1μg重组纯化的目的人抗原静脉内注射小鼠。
实施例1.2.B：杂交瘤的生成
根据Kohler，G.和Milstein(1975)Nature，256：495所述确立的方法将从实施例1.2.A所述免疫接种的小鼠获得的脾细胞与SP2/O-Ag-14细胞以5∶1的比率融合以生成杂交瘤。将融合产物以2.5x106个脾细胞/孔的密度铺平板在96-孔板中含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤的选择培养基中。融合后7-10天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。通过ELISA就针对目的抗原的抗体的存在测试来自含有杂交瘤集落的每个孔的上清液(如实施例1.1.1.A中所述)。然后就活性测试展示抗原特异性活性的上清液(如实施例1.1.2的测定中所述)，例如，在生物测定中中和目的抗原的能力，如在实施例1.1.2.I中所述的那种)。
实施例1.2.C：针对目的人靶抗原的亲本单克隆抗体的鉴定和表征
实施例1.2.C.1：分析亲本单克隆抗体中和活性
就亲本抗体的存在测定杂交瘤上清液，所述亲本抗体结合目的抗原，根据实施例1.2.A和1.2.B生成，且也能够结合目的抗原的变体(“抗原变体”)。然后测试在两个测定中抗体阳性的上清液的抗原中和能力，例如在实施例1.1.2.I的细胞因子生物测定中。通过有限稀释按比例增加和克隆生产抗体的杂交瘤，所述抗体在生物测定中的IC50值小于1000pM，在一个实施方案中，小于100pM。将杂交瘤细胞扩增(expand)到含有10％低IgG胎牛血清(Hyclone#SH30151，Logan，UT)的培养基中。平均起来，如Harlow，E.和Lane，D.1988“Antibodies：A LaboratoryManual”所述，通过A蛋白亲和层析收获、浓缩和纯化250mL每种杂交瘤上清液(衍生自克隆群体)。例如，使用如实施例1.1.2.I所述的细胞因子生物测定，测定纯化的mAbs抑制其靶抗原的活性的能力。
实施例1.2.C.2：分析亲本单克隆抗体与目的食蟹猴靶抗原的交叉反应性
为了测定此处描述的选择的mAbs是否识别目的食蟹猴抗原，如本文所述(实施例1.1.1.G)使用重组食蟹猴靶抗原进行BIACORE分析。此外，也可以在细胞因子生物测定中测量mAbs针对重组目的食蟹猴抗原的中和能力(实施例1.1.2.I)。选择具有良好食蟹猴交叉反应性(在一个实施方案中，在关于人抗原的5-倍反应性内)的mAbs用于进一步的表征。
实施例1.2.D：确定每个鼠抗-人单克隆抗体的可变区的氨基酸序列
如下所述进行重组抗-人小鼠mAbs的cDNAs分离、表达和表征。对于每个氨基酸序列确定，遵从生产商的说明书通过离心分离约1x106个杂交瘤细胞，且进行加工以用Trizol(Gibco BRL/Invitrogen，Carlsbad，CA.)分离总RNA。根据生产商的说明书，使用SuperScript第一链合成系统(First-Strand Synthesis System)(Invitrogen，Carlsbad，CA)使总RNA进行第一链DNA合成。将寡脱氧胸苷酸用于引发第一链合成以选择聚腺苷酸+(poly(A)+)RNA。然后用设计用于扩增鼠免疫球蛋白可变区的引物(Ig-Primer Sets，Novagen，Madison，WI)通过PCR扩增第一链cDNA产物。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物、切割、纯化然后用TOPO克隆试剂盒亚克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并转化到TOP10化学制成的感受态(chemically competent)大肠杆菌(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。在转化体上进行集落PCR以鉴定含有插入片段的克隆。使用QIAprep小量制备试剂盒(Miniprep kit)(Qiagen，Valencia，CA)从含有插入片段的克隆分离质粒DNA。使用M13正向和M13反向引物(Fermentas Life Sciences，Hanover MD)在两条链上对质粒中的插入片段进行测序，以确定可变重链和可变轻链DNA序列。鉴定mAbs的可变重链和可变轻链序列。在一个实施方案中，关于用于下一步开发(人源化)的引导(lead)mAbs实验对象组的选择标准包括下述：
■除CH2中的标准N-联糖基化位点(NXS)外，抗体不含任何N-联糖基化位点
■除了每个抗体中的正常半胱氨酸外，抗体不含任何额外的半胱氨酸
■将抗体序列与关于VH和VL的最接近的人种系序列进行比对，且应检查任何稀有氨基酸在其他天然人抗体中的发生(occurrence)
■如果不影响抗体的活性的话将N-末端谷胺酰胺(Q)改变为谷氨酸(E)。这将减少由于Q环化造成的异质性
■通过质谱分光光度法证实有效信号序列切割。这可以用COS细胞或293细胞材料进行
■检查蛋白序列的Asn脱酰胺风险，这将导致活性的丧失
■抗体具有低的聚集水平
■抗体具有＞5-10mg/ml的溶解度(在研究阶段)；＞25mg/ml
■抗体具有通过动态光散射(Dynamic Light Scattering)(DLS)确定的正常大小(5-6nm)
■抗体具有低电荷异质性
■抗体缺乏细胞因子释放(参见实施例1.1.2.B)
■抗体对预期的细胞因子具有特异性(参见实施例1.1.2.C)
■抗体缺乏预料不到的组织交叉反应性(参见实施例1.1.2.D)
■抗体在人和食蟹猴组织交叉反应性之间具有相似性(参见实施例1.1.2.D)
实施例1.2.2：重组人源化亲本抗体
实施例1.2.2.1：重组嵌合抗人亲本抗体的构建和表达
通过在细菌中的同源重组，将编码鼠抗-人亲本mAbs的重链恒定区的DNA用编码含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段替换。这些突变是在位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸的改变和在位置235的亮氨酸至丙氨酸的改变(Lund等人，1991，J.Immunol.，147：2657)。每个这些抗体的轻链恒定区被人κ恒定区替换。通过连接到pBOS表达质粒中的嵌合重链和轻链cDNAs的共转染在COS细胞中瞬时表达全长嵌合抗体(Mizushima和Nagata，Nucleic Acids Research1990，Vol 18，pg 5322)。通过A蛋白琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。将抗体中和且透析到PBS中。
将编码嵌合mAb的重链cDNA与其嵌合轻链cDNA共转染到(两者都连接到pBOS载体中)COS细胞中。通过A蛋白琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。将抗体中和且透析到PBS中。
然后测试纯化的嵌合抗-人亲本mAbs的结合能力(通过Biacore)和功能活性，例如，抑制细胞因子诱导的IgE生产，如实施例1.1.1.G和1.1.2.B所述。选择维持亲本杂交瘤mAbs的活性的嵌合mAbs用于进一步的开发。
实施例1.2.2.2：人源化抗人亲本抗体的构建和表达
实施例1.2.2.2.A：人抗体构架的选择
使用Vector NTI软件，将每个鼠可变重链和可变轻链基因序列分别与44个人免疫球蛋白种系可变重链或46个种系可变轻链序列(得自在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html的NCBI Ig Blast网站)进行比对。
人源化基于氨基酸序列同源性、CDR簇分析、表达的人抗体中的使用频率和关于人抗体晶体结构的可用信息。考虑对抗体结合、VH-VL配对和其他因素的可能作用，在鼠和人构架残基不同的地方将鼠残基突变为人残基，有少许例外。基于人种系抗体序列或其亚组的分析设计另外的人源化策略，所述人种系抗体序列或其亚组与鼠抗体可变区的实际氨基酸序列具有高程度的同源性，即，序列相似性。
将同源性建模用于鉴定对于鼠抗体序列独特的残基，预测所述残基对于抗体结合部位CDRs的结构是至关重要的。同源性建模是计算方法，由此生成蛋白的近似三维坐标。初始坐标的来源和其进一步改善的指导是第二个蛋白，即参考蛋白，所述参考蛋白的三维坐标是已知的，且其序列与第一个蛋白的序列相关。两个蛋白序列中的关系用于生成参考蛋白和需要其坐标的蛋白，即靶蛋白之间的对应性。参考和靶蛋白的一级序列进行比对，其中两个蛋白相同部分的坐标直接从参考蛋白转移到靶蛋白。两个蛋白的错配部分，例如来自残基突变、插入或缺失的坐标从一般的结构模版构建，且能量进行改善以确保与已经转移的模型坐标的一致性。这个计算的蛋白结构可进一步改善或直接用于建模研究中。模型结构的质量由参考和靶蛋白相关的观点的正确性和构建序列比对的精确性确定。
对于鼠mAbs，使用BLAST搜索和目视检查的组合来鉴定适当的参考结构。参考和靶氨基酸序列之间25％的序列同一性被认为是尝试履行同源性建模所必需的最低限度。手工构建序列比对，且使用程序Jackal生成模型坐标(参见Petrey，D.等人(2003)Proteins 53(Suppl.6)：430-435)。
选择的抗体的鼠和人构架区的一级序列共享相当大同一性。不同的残基位置是用于在人源化序列中包括鼠残基以维持鼠抗体观察到的结合能力的候选物。手工构建在人和鼠序列之间不同的构架残基列表。表28显示了选择用于这个研究的构架序列。
表28：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
Figure BPA00001281288902471
给定构架残基将影响抗体的结合性质的可能性依赖于其与CDR残基的接近度。因此，使用模型结构，在鼠和人序列之间不同的残基根据其离CDRs中任何原子的距离分级。落在任何CDR原子的内的那些残基被鉴定为最重要的，且被推荐为用于在人源化抗体中保持鼠残基(即，回复突变)的候选物。
使用寡核苷酸构建在计算机芯片上(In silico)构建的人源化抗体。对于每个可变区cDNA，设计各60-80个核苷酸的6个寡核苷酸以在每个寡核苷酸的5’和/或3’末端相互重叠20个核苷酸。在退火反应中，组合所有6个寡核苷酸，煮沸，且在dNTPs的存在下退火。添加DNA聚合酶I，大(克列诺(Klenow))片段(New England Biolabs#M0210，Beverley，MA.)以补平重叠寡核苷酸之间的约40bp缺口。使用两个最外面的引物进行PCR以扩增整个可变区基因，所述两个最外面的引物含有与修饰的pBOS载体中的多克隆位点互补的突出端序列(Mizushima，S.和Nagata，S.(1990)Nucleic Acids Res.18：17)。在琼脂糖凝胶上分离源自每个cDNA组合(assembly)的PCR产物，且切除和纯化对应于预测的可变区cDNA大小的条带。通过在细菌中的同源重组将重可变区符合读框地插入编码含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。这些突变是在位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸的改变和在位置235的亮氨酸至丙氨酸的改变(Lund等人，1991，J.Immunol.，147：2657)。通过同源重组将轻链可变区与人κ恒定区一起符合读框地插入。分离细菌集落且提取质粒DNA。对cDNA插入片段进行整体测序。将对应于每个抗体的正确人源化重链和轻链共转染到COS细胞中以瞬时生产全长人源化抗-人抗体。通过A蛋白琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。中和抗体并将其透析到PBS中。
实施例1.2.2.3：人源化抗体的表征
例如，使用如实施例1.1.2.A中所述的细胞因子生物测定测定纯化的人源化抗体抑制功能活性的能力。使用如实施例1.1.1.B中所述的表面等离振子共振(Biacore
Figure BPA00001281288902481
)测量测定人源化抗体与重组人抗原的结合亲和力。对来自生物测定的IC50值和人源化抗体的亲和力进行分级。选择完全维持亲本杂交瘤mAbs的活性的人源化mAbs作为用于进一步开发的候选物。对顶部的2-3个最好的人源化mAbs进行进一步的表征。
实施例1.2.2.3.A：人源化抗体的药物代谢动力学分析
在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中执行药物代谢动力学研究。用单剂4mg/kg mAb对雄性和雌性大鼠和食蟹猴进行静脉内或皮下给药，且使用抗原捕获ELISA分析样品，并且通过非区室(noncompartmental)分析测定药物代谢动力学参数。简言之，用山羊抗生物素抗体(5mg/ml，4℃，过夜)包被ELISA板，用Superblock(Pierce)封闭，且在室温与在10％Superblock TTBS中50ng/ml的生物素化的人抗原温育2小时。连续稀释血清样品(0.5％血清，10％Superblock，在TTBS中)，且于室温在板上温育30分钟。使用HRP-标记的山羊抗人抗体执行检测，且使用4参数逻辑拟合(logistic fit)借助标准曲线测定浓度。使用WinNonlin软件(Pharsight Corporation，Mountain View，CA)通过非区室模型测定关于药物代谢动力学参数的值。选择具有良好药物代谢动力学概况的人源化mAbs(T1/2为8-13天或更好，具有低清除率和卓越的生物利用率50-100％)。
实施例1.2.2.3.B：人源化单克隆抗体的物理化学和体外稳定性分析
大小排阻层析
用水将抗体稀释到2.5mg/mL，且使用TSK gel G3000 SWXL柱(Tosoh Bioscience，cat#k5539-05k)在Shimadzu HPLC系统上对20mL进行分析。用211mM硫酸铵，92mM磷酸钠，pH 7.0，以0.3mL/分钟的流速从柱洗脱样品。HPLC系统操作条件如下：
流动相：211mM Na2SO4，92mM Na2HPO4*7H2O，pH 7.0
梯度：等度
流速：0.3mL/分钟
监测器波长：280nm
自动进样器冷却器温度：4℃
柱烘箱温度：环境
运行时间：50分钟
表29含有如通过上述规程测定的表示为百分比单体的亲本抗体和DVD-Ig构建体的纯度数据(预期分子量的非聚集蛋白)。
表29：如通过大小排阻层析测定的亲本抗体和DVD-Ig构建体的纯度
Figure BPA00001281288902501
Figure BPA00001281288902511
DVD-Igs显示卓越的SEC概况，其中大多数DVD-Ig显示＞90％的单体。这个DVD-Ig概况类似于关于亲本抗体观察到的那种。
SDS-PAGE
通过在还原和非还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析抗体。将阿达木单抗批次AFP04C用作对照。对于还原条件，将样品与具有100mM DTT的2X tris甘氨酸SDS-PAGE样品缓冲液(Invitrogen，cat#LC2676，lot#1323208)1∶1混合，并于60℃加热30分钟。对于非还原条件，将样品与样品缓冲液1∶1混合，并于100℃加热5分钟。将还原的样品(10mg/泳道)加样到12％预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，cat#EC6005box，lot#6111021)上，且将非还原样品(10mg/泳道)加样到8％-16％预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，cat#EC6045box，lot#6111021)上。SeeBlue Plus 2(Invitrogen，cat#LC5925，lot#1351542)用作分子量标记。凝胶在XCell SureLock mini cell凝胶盒(gel box)(Invitrogen，cat#EI0001)中运行，且通过首先应用75的电压以将样品堆积在凝胶中，随后应用125的恒定电压直至染料前沿到达凝胶的底部来分离蛋白。使用的运行缓冲液为1X tris甘氨酸SDS缓冲液，其从10X tris甘氨酸SDS缓冲液(ABC，MPS-79-080106))制备。凝胶用胶态蓝染色剂(Invitrogen cat#46-7015，46-7016)染色过夜，且用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪(型号1680，S/N DASX003641)扫描染色的凝胶。
沉降速度分析
将抗体加样到3个标准二区碳环氧类树脂中心杯(two-sector carbonepon centerpieces)的每一个的样品室中。这些中心杯具有1.2cm光程长度，且由蓝宝石窗口制造。使用PBS作为参考缓冲液，且各室含有140μL。使用4孔(AN-60Ti)转子在Beckman ProteomeLab XL-I分析型超速离心机(serial#PL106C01)中同时检查所有样品。
运行条件是编了程序的，且使用ProteomeLab(v5.6)进行离心机控制。分析前允许样品和转子热平衡一小时(20.0±0.1℃)。在3000rpm实施正确的细胞加样的确认，并对各室记录单个扫描。沉降速度条件如下：
样品室体积：420mL
参考室体积：420mL
温度：20℃
转子速度：35,000rpm
时间：8:00小时
UV波长：280nm
径向阶大小(Radial Step Size)：0.003cm
数据收集：每阶一个数据点，无信号平均。
扫描总数：100
完整抗体的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析分子完整抗体的分子量测量。用水将各抗体稀释到约1mg/mL。使用具有蛋白microtrap(Michrom Bioresources，Inc，cat#004/25109/03)的1100HPLC(Agilent)系统脱盐，并将5mg样品导入API Qstar pulsar i质谱仪(Applied Biosystems)。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A(在HPLC水中的0.08％FA，0.02％TFA)和流动相B(在乙腈中的0.08％FA和0.02％TFA)在50mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏(kvolts)喷射电压以2000至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
抗体轻和重链的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析抗体轻链(LC)、重链(HC)和去糖基化HC的分子量测量。用水将抗体稀释到1mg/mL，并用终浓度10mM的DTT在37℃将样品还原为LC和HC进行30分钟。为了将抗体去糖基化，将100mg抗体与2mL的PNGase F、5mL的10％N-辛基葡糖苷以总体积100mL在37℃温育过夜。去糖基化后，用终浓度10mM的DTT将样品在37℃还原30分钟。使用具有C4柱(Vydac，目录号214TP5115，S/N060206537204069)的Agilent 1100HPLC系统脱盐并将样品(5mg)导入API Qstar pulsar i质谱仪(Applied Biosystems)。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A(在HPLC水中的0.08％FA，0.02％TFA)和流动相B(在乙腈中的0.08％FA和0.02％TFA)在50mL/分钟流速下运行梯度。在4.5千伏喷射电压以800至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
肽作图
用75mM碳酸氢铵中的6M盐酸胍的终浓度在室温将抗体变性15分钟。变性的样品用10mM DTT的终浓度于37℃还原60分钟，随后用50mM碘乙酸(IAA)在黑暗中烷化30分钟。烷化后，将样品于4℃针对4升10mM碳酸氢铵透析过夜。将透析的样品用10mM碳酸氢铵，pH 7.8稀释到1mg/mL，且100mg抗体用胰蛋白酶(Promega，cat#V5111)或Lys-C(Roche，cat#11 047 825 001)以1∶20(w/w)胰蛋白酶/Lys-C∶抗体比率于37℃消化4小时。用1mL的1N HCl猝灭消化。对于利用质谱仪检测的肽作图，利用Agilent 1100HPLC系统在C18柱(Vydac，cat#218TP51，S/N NE9606 10.3.5)上通过反相高效液相层析(RPHPLC)分离40mL消化物。利用使用流动相A(在HPLC等级水中的0.02％TFA和0.08％FA)和流动相B(在乙腈中的0.02％TFA和0.08％FA)的梯度在50mL/分钟的流速运行肽分离。API QSTAR Pulsari质谱仪以正模式在4.5千伏(kvolt)喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。
二硫键作图
为了使抗体变性，将100mL抗体与300mL溶于100mM碳酸氢铵中的8M盐酸胍混合。检查pH以确保它在7和8之间，且在6M盐酸胍的终浓度于室温使样品变性15分钟。用Milli-Q水将一部分变性的样品(100mL)稀释到600mL，以给出1M的最终盐酸胍浓度。将样品(220mg)用胰蛋白酶(Promega，cat#V5111，lot#22265901)或Lys-C(Roche，cat#11047825001，lot#12808000)以1∶50胰蛋白酶或1∶50Lys-C∶抗体(w/w)比率(4.4mg酶∶220mg样品)于37℃消化约16小时。将另外5mg胰蛋白酶或Lys-C添加到样品，且允许消化于37℃进行另外2小时。通过向每一种样品添加1mL TFA终止消化。使用在Agilent 1100 HPLC系统上的C18柱(Vydac，cat#218TP51 S/NNE020630-4-1A)通过RPHPLC分离消化的样品。在50mL/分钟的流速利用与用于肽作图的相同的梯度运行分离，其中使用流动相A(在HPLC等级水中的0.02％TFA和0.08％FA)和流动相B(在乙腈中的0.02％TFA和0.08％FA)。HPLC操作条件与对于肽作图使用的那些相同。APIQSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。通过匹配肽的观察到的MWs与通过二硫键连接的胰蛋白酶消化或Lys-C肽的预测MWs来指派二硫键。
游离巯基的确定
用于定量抗体中游离半胱氨酸的方法基于Ellman氏试剂，5，5
Figure BPA00001281288902541
-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与巯基(SH)的反应，其产生特有的生色产物5-硫代-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。该反应以下式阐明：
Figure BPA00001281288902542
使用Cary 50分光光度计在412nm测量TNB-的吸光度。使用2巯基乙醇(b-ME)稀释物作为游离SH标准绘制吸光度曲线，且通过样品在412nm的吸光度确定蛋白中的游离巯基浓度。
通过用HPLC等级水将14.2M b-ME连续稀释到终浓度0.142mM而制备b-ME标准原液。然后制备各浓度的一式三份的标准。使用amiconultra 10,000MWCO离心滤器(Millipore，cat#UFC801096，lot#L3KN5251)将抗体浓缩到10mg/mL，且将缓冲液改为用于阿达木单抗的配制缓冲液(5.57mM磷酸二氢钠，8.69mM磷酸氢二钠，106.69mM NaCl，1.07mM柠檬酸钠，6.45mM柠檬酸，66.68mM甘露糖醇，pH 5.2，0.1％(w/v)Tween)。将样品于室温在摇床上混合20分钟。然后将180mL的100mM Tris缓冲液，pH 8.1添加到各样品和标准，随后添加300mL在10mM磷酸缓冲液，pH 8.1中的2mM DTNB。彻底混合后，在Cary 50分光光度计上测量样品和标准于412nm的吸收。通过绘制游离SH量和b-ME标准的OD412nm获得标准曲线。减去空白值后，基于该曲线计算样品的游离SH含量。
弱阳离子交换层析
用10mM磷酸钠，pH 6.0将抗体稀释到1mg/mL。使用具有WCX-10ProPac分析型柱(Dionex，目录号054993，S/N 02722)的Shimadzu HPLC系统分析电荷异质性。在80％流动相A(10mM磷酸钠，pH 6.0)和20％流动相B(10mM磷酸钠，500mM NaCl，pH 6.0)中将样品加样在柱上，并以1.0mL/分钟的流速洗脱。
寡糖概况分析
用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记试剂衍生化PNGase F处理抗体后释放的寡糖。通过正相高效液相层析(NPHPLC)分离荧光标记的寡糖，并基于与已知标准的保留时间比较对寡糖的不同形式进行表征。
首先用PNGaseF消化抗体，以从重链Fc部分切割N-联寡糖。将抗体(200mg)与2mL PNGase F和3mL 10％N-辛基葡糖苷一起置于500mLEppendorf管中。加入磷酸缓冲盐水，以使终体积达到60mL。将样品在设定为700RPM的Eppendorf恒温混合器(thermomixer)中于37℃温育过夜。阿达木单抗批次AFP04C也以PNGase F消化作为对照。
PNGase F处理后，将样品在设定为750RPM的Eppendorf恒温混合器中于95℃温育5分钟，以沉淀出蛋白，然后将样品置于在10,000RPM的Eppendorf离心机中2分钟以离心沉淀的蛋白。将含有寡糖的上清液转移到500mL Eppendorf管中并在speed-vac中于65℃干燥。
使用从Prozyme(目录号GKK-404，lot#132026)采购的2AB标记试剂盒将寡糖用2AB标记。根据制造商说明书制备标记试剂。将乙酸(150mL，试剂盒中提供)添加到DMSO小瓶(试剂盒中提供)，并通过上下移液溶液几次而混合。将乙酸/DMSO混合物(100mL)转移到2-AB染料小瓶中(紧在使用前)，并混合直至染料完全溶解。然后将染料溶液添加到还原剂小瓶(试剂盒中提供)中，并充分混合(标记试剂)。将标记试剂(5mL)添加到各个干燥的寡糖样品小瓶，并充分混合。将反应小瓶置于设定为65℃和700-800RPM的Eppendorf恒温混合器中反应2小时。
标记反应后，使用来自Prozyme(目录号GKI-4726)的GlycoClean S药液筒去除过量的荧光染料。添加样品前，用1mL milli-Q水洗涤药液筒，随后为1mL 30％乙酸溶液的5ishes。紧在添加样品前，将1mL的乙腈(Burdick and Jackson，目录号AH015-4)添加到药液筒。
所有乙腈通过药液筒后，将样品点样在新鲜洗涤的盘中央，并允许其吸附到盘上10分钟。用1mL乙腈洗涤盘，随后为1mL的96％乙腈的5ishes。将药液筒置于1.5mL Eppendorf管之上，并用3ishes(每ish 400mL)milli Q水洗脱2-AB标记的寡糖。
使用与Shimadzu HPLC系统连接的Glycosep N HPLC(目录号GKI-4728)柱分离寡糖。Shimadzu HPLC系统由系统控制器、脱气装置、二元泵、带有样品冷却器的自动进样器、以及荧光探测器组成。
在升高的温度的稳定性
使用Amicon超速离心滤器的抗体缓冲液是5.57mM磷酸二氢钠、8.69mM磷酸氢二钠、106.69mM NaCl、1.07mM柠檬酸钠、6.45mM柠檬酸、66.68mM甘露糖醇、0.1％(w/v)Tween，pH 5.2；或10mM组氨酸、10mM甲硫氨酸、4％甘露糖醇，pH 5.9。用合适的缓冲液将抗体终浓度调整为2mg/mL。然后将抗体过滤灭菌，并在无菌条件下制备0.25mL等分试样。将等分试样在-80℃、5℃、25℃、或40℃放置1、2或3周。温育时间段结束时，通过大小排阻层析和SDS-PAGE分析样品。
在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析稳定性样品。使用的程序与此处所述相同。用胶态蓝染色剂(Invitrogen目录号46-7015，46-7016)将凝胶染色过夜，并用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用EpsonExpression扫描仪(型号1680，S/N DASX003641)将染色的凝胶扫描。为了获得更高灵敏度，使用银染色试剂盒(Owl Scientific)将相同凝胶银染色，且使用制造商提供的推荐程序。
实施例1.2.2.3.C：人源化单克隆抗体自身或与化学疗法组合对人癌异种移植物的生长的功效
使人癌细胞在组织培养瓶中体外生长至99％生存力、85％会合。将19-25克SCID雌性或雄性小鼠(Charles Rivers Labs)做耳标记并剃毛。在研究第0日将0.2ml的2x106个人肿瘤细胞(1∶1matrigel)皮下接种到小鼠右胁腹。将小鼠按大小匹配到单独的平均肿瘤体积约150至200mm3的小鼠笼中后，开始施用(IP，Q3D/周)载体(PBS)、人源化抗体、和/或化学疗法。在接种后约10天开始每周两次通过一对卡尺测量肿瘤，并根据式V＝L×W2/2(V：体积，mm3；L：长度，mm；W：宽度，mm)计算肿瘤体积。相对于仅接受载体或同种型对照mAb的动物的肿瘤，在以mAb单独或与化学疗法组合处理的动物中，观察到肿瘤体积的减小。
实施例1.2.2.3.D：基于FACS的改变方向的细胞毒性(rCTL)测定
通过负选择富集柱(R&D Systems，Minneapolis，MN；目录号HTCC-525)从预先冷冻的分离的外周血单核细胞(PBMC)中分离人CD3+T细胞。将T细胞在瓶(通气口盖，Corning，Acton，MA)中刺激4天，并在具有L-谷氨酰胺、55mM β-ME、青霉素/链霉素、10％FBS的完全RPMI 1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中在30U/mL IL-2(Roche)中培养，所述瓶用在D-PBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的10μg/mL抗-CD3(OKT-3，eBioscience，Inc.，San Diego，CA)和2μg/mL抗-CD28(CD28.2，eBioscience，Inc.，San Diego，CA)包被。然后在用于测定前，将T细胞在30U/mL IL-2中静止过夜。根据制造商说明书用PKH26(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)标记DoHH2或Raji靶细胞。在rCTL测定全过程中使用含有L-谷氨酰胺和10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI1640培养基(无苯酚，Invitrogen，Carlsbad，CA)。(见Dreier等人，(2002)Int J Cancer 100：690)。
将效应T细胞(E)和靶(T)分别以105和104个细胞/孔的细胞终浓度铺平板到96孔板(Costar#3799，Acton，MA)，以产生10∶1的E∶T比。将DVD-Ig分子稀释，以获得浓度依赖的滴定曲线。过夜温育后，将细胞沉淀，并在重悬浮到含有在D-PBS中的0.1％BSA(Invitrogen，Carlsbad，CA)、0.1％叠氮化钠和0.5μg/mL碘化丙锭(BD)的FACS缓冲液中前，用D-PBS洗涤一次。在FACS Canto II machine(BectonDickinson，San Jose，CA)上收集FACS数据，并用Flowjo(Treestar)分析。计算DVD-Ig处理的样品中百分比活靶除以百分比总靶(对照，无处理)，以确定百分比比裂解。在Prism(Graphpad)中计算IC50。
在改变方向的毒性测定中对CD3/CD19 DVD-Ig(AB序列IDs，AB002+AB006；实施例2.7)测试肿瘤细胞杀伤。该DVD-Ig表现出IC50＝5.0pM的体外肿瘤杀伤。CD3/CD20 DVD-Ig也测试了改变方向的毒性，并表现出IC50＝325pM的体外肿瘤杀伤。该CD3/CD20 DVD-Ig的序列公开于美国专利申请系列号20070071675中。
实施例1.4：DVD-Ig的生成
能够结合两个抗原的DVD-Ig分子使用如本文所述选择的两个亲本单克隆抗体进行构建，所述两个亲本单克隆抗体的一个针对人抗原A，而另一个针对人抗原B。
实施例1.4.1：具有两种接头长度的DVD-Ig的生成
使用含有μl Fc的恒定区，其具有在234和235的突变以消除ADCC/CDC效应子功能。生成了4个不同的抗-A/B DVD-Ig构建体：2个具有短接头，且2个具有长接头，各处于两个不同的结构域方向：VA-VB-C和VB-VA-C(参见表30)。衍生自人Cl/Ck或CH1结构域的N-末端序列的接头序列如下：
对于DVDAB构建体：
轻链(如果抗-A具有λ的话)：短接头：QPKAAP；长接头：QPKAAPSVTLFPP
轻链(如果抗-A具有κ的话)：短接头：TVAAP；长接头：TVAAPSVFIFPP
重链(γ1)：短接头：ASTKGP；长接头：ASTKGPSVFPLAP
对于DVDBA构建体：
轻链(如果抗-B具有λ的话)：短接头：QPKAAP；长接头：QPKAAPSVTLFPP
轻链(如果抗-B具有κ的话)：短接头：TVAAP；长接头：TVAAPSVFIFPP
重链(γ1)：短接头：ASTKGP；长接头：ASTKGPSVFPLAP
将重链和轻链构建体亚克隆到pBOS表达载体中，并在COS细胞中表达，随后通过A蛋白层析进行纯化。将纯化的材料实施SDS-PAGE和SEC分析。
表30描述了用于表达每个抗-A/B DVD-Ig蛋白的重链和轻链构建体。
表30：抗-A/B DVD-Ig构建体
  DVD-Ig蛋白   重链构建体   轻链构建体
  DVDABSL   DVDABHC-SL   DVDABLC-SL
  DVDABLL   DVDABHC-LL   DVDABLC-LL
  DVDBASL   DVDBAHC-SL   DVDBALC-SL
  DVDBALL   DVDBAHC-LL   DVDBALC-LL
实施例1.4.2：关于DVDABSL和DVDABLL的DNA构建体的分子克隆
为了生成重链构建体DVDABHC-LL和DVDABHC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将A抗体的VH结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将B抗体的VH结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Sal I双重消化的pBOS-hCγ1，z non-a哺乳动物表达载体(Abbott)中。
为了生成轻链构建体DVDABLC-LL和DVDABLC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将A抗体的VL结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将B抗体的VL结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体(Abbott)中。类似的方法已用于生成如下文所述的DVDBASL和DVDBALL：
实施例1.4.3：关于DVDBASL和DVDBALL的DNA构建体的分子克隆
为了生成重链构建体DVDBAHC-LL和DVDBAHC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体B的VH结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体A的VH结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Sal I双重消化的pBOS-hCγ1，z non-a哺乳动物表达载体(Abbott)中。
为了生成轻链构建体DVDBALC-LL和DVDBALC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体B的VL结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有关于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体A的VL结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到SrfI和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体(Abbott)中。
实施例1.4.4：另外的DVD-Ig的构建和表达
实施例1.4.4.1：DVD-Ig载体构建体的制备
关于用于整合入DVD-Ig中的识别特定抗原或其表位的特定抗体的亲本抗体氨基酸序列可以通过如上文所述制备杂交瘤获得，或者可以通过对已知的抗体蛋白或核酸进行测序获得。此外，可以从文献中获得已知的序列。序列可以用于使用标准DNA合成或扩增技术合成核酸，以及使用标准重组DNA技术将所需抗体片段装配到表达载体中，以用于在细胞中表达。
例如，从氨基酸序列确定核酸密码子，且通过Blue HeronBiotechnology，Inc.(www.blueheronbio.com)Bothell，WA USA合成寡核苷酸DNA。将寡核苷酸装配成300-2,000碱基对的双链DNA片段，克隆进质粒载体，且进行序列验证。使用酶促过程装配克隆的片段以得到完整基因，且亚克隆到表达载体中。(参见7,306,914；7,297,541；7,279,159；7,150,969；20080115243；20080102475；20080081379；20080075690；20080063780；20080050506；20080038777；20080022422；20070289033；20070287170；20070254338；20070243194；20070225227；20070207171；20070150976；20070135620；20070128190；20070104722；20070092484；20070037196；20070028321；20060172404；20060162026；20060153791；20030215458；20030157643)。
将一组pHybE载体(US专利申请系列号61/021,282)用于亲本抗体和DVD-Ig克隆。衍生自pJP183；pHybE-hCg1，z，non-a V2的V1用于克隆具有野生型恒定区的抗体和DVD重链。衍生自pJP191；pHybE-hCk V2的V2用于克隆具有κ恒定区的抗体和DVD轻链。衍生自pJP192；pHybE-hCl V2的V3用于克隆具有λ恒定区的抗体和DVDs轻链。由λ信号肽和κ恒定区构建的V4用于克隆具有λ-κ杂种V结构域的DVD轻链。由κ信号肽和λ恒定区构建的V5用于克隆具有κ-λ杂种V结构域的DVD轻链。衍生自pJP183；pHybE-hCg1，z，non-a V2的V7用于克隆具有(234，235AA)突变恒定区的抗体和DVD重链。
参考表31，许多载体用于克隆亲本抗体和DVD-Ig VH和VL链。
表31：用于克隆亲本抗体和DVD-Igs的载体
  ID   重链载体   轻链载体
  AB001   V1   V2
  AB002   V1   V2
  AB003   V1   V2
  AB004   V1   V2
  AB005   V1   V2
  AB006   V1   V2
  AB007   V1   V3
  AB008   V1   V2
  AB009   V1   V2
  AB010   V1   V3
  AB011   V1   V2
  AB012   V1   V2
  AB013   V1   V2
  AB014   V1   V2
  AB015   V1   V2
  AB016   V1   V2
  AB033   V1   V2
  AB034   V1   V2
  AB035   V1   V2
  AB039   V1   V2
  AB047   V1   V2
  AB062   V1   V2
  AB063   V1   V2
  AB067   V7   V3
  AB069   V1   V2
  AB070   V1   V2
  AB071   V7   V2
  AB072   V1   V2
  AB073   V1   V3
  AB074   V1   V2
  AB075   V1   V3
Figure BPA00001281288902631
Figure BPA00001281288902641
Figure BPA00001281288902651
Figure BPA00001281288902671
Figure BPA00001281288902691
Figure BPA00001281288902711
实施例1.4.4.2：在293细胞中的转染和表达
将DVD-Ig载体构建体转染入293细胞中用于DVD-Ig蛋白的生产。使用的293瞬时转染程序是在Durocher等人，(2002)Nucleic Acids Res.30(2)：E9和Pham等人，(2005)Biotech.Bioengineering 90(3)：332-44中公开的方法的修改形式。在转染中使用的试剂包括：
●于设定在130rpm、37℃和5％CO2的湿润培养箱中在一次性锥形瓶中培养的HEK 293-6E细胞(稳定表达EBNA1的人胚肾细胞系；从National Research Council Canada获得)。
●培养基：FreeStyle 293表达培养基(Expression Medium)(Invitrogen 12338-018)加25μg/mL遗传霉素(G418)(Invitrogen10131-027)和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen 24040-032)。
●转染培养基：FreeStyle 293表达培养基加10mM HEPES(Invitrogen 15630-080)。
●聚乙烯亚胺(PEI)原液：1mg/mL无菌贮存液，pH 7.0，用线性25kDa PEI(Polysciences)制备，且于小于-15℃贮存。
●胰化蛋白胨饲料培养基(Tryptone Feed Medium)：在FreeStyle 293表达培养基中的5％w/v无菌胰化蛋白胨N1(Organotechnie，19554)原液。
用于转染的细胞制备：在转染前约2-4小时，通过离心收获HEK293-6E细胞，且以约1百万活细胞/mL的细胞密度重悬浮于培养基中。对于每次转染，将40mL细胞悬浮液转移到一次性的250-mL锥形瓶中，并温育2-4小时。
转染：将转染培养基和PEI原液预加温到室温(RT)。对以每次转染，在5mL转染培养基中组合25μg质粒DNA和50μg聚乙烯亚胺(PEI)，并在RT温育15-20分钟以允许形成DNA:PEI复合物。对于BR3-Ig转染，每次转染使用25μg BR3-Ig质粒。将各5-mL DNA:PEI复合物混合物添加到先前制备的40-mL培养物中，并回到设置在130rpm、37℃和5％CO2的湿润培养箱。20-28小时后，将5mL胰化蛋白胨饲料培养基添加到每个转染，并继续培养6天。
表32含有在293细胞中表示为毫克/升的亲本抗体或DVD-Ig构建体的得率数据。
表32：293细胞中亲本抗体和DVD-Ig构建体就得率而论的瞬时表达
Figure BPA00001281288902721
Figure BPA00001281288902731
所有DVDs都在293细胞中表达良好。DVDs可在A蛋白柱上容易地纯化。在大多数情况下，可以容易地从293细胞上清液获得＞5mg/L纯化的DVD-Ig。
实施例1.4.5：A/B DVD-Igs的表征和引导选择
在Biacore上针对A蛋白和B蛋白分析抗-A/B DVD-Igs的结合亲和力。通过在Biacore上的多重结合研究检查DVD-Ig的四价性质。同时，分别通过如本文所述的生物测定评估DVD-Igs对于A蛋白和B蛋白的中和能力。将最佳地保持原始亲本mAbs的亲和力和能力的DVD-Ig分子选择用于对于每一个mAb的如本文所述的深入物理化学和生物分析(大鼠PK)表征。基于分析的收集，将最终的引导DVD-Ig推进到CHO稳定细胞系开发中，且将CHO-衍生的材料应用于在食蟹猴中的稳定性、药物代谢动力学和功效研究以及处方设计活动中。
实施例2：双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)的生成和表征
通过根据实施例1.4.4.1合成编码DVD-Ig可变重链和DVD-Ig可变轻链序列的多核苷酸片段并将片段克隆到pHybC-D2载体中，来生成使用具有已知氨基酸序列的亲本抗体的双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)。如实施例1.4.4.2所述，将DVD-Ig构建体克隆进293细胞中并在其中表达。根据标准方法纯化DVD-Ig蛋白。根据所示的实施例1.1.1和1.1.2中所述的方法测定功能特征。下面提供了本发明的DVD-Igs的DVD-Ig VH和VL链。
实施例2.1：CD-20和CD-19 DVD-Igs的生成
表33
Figure BPA00001281288902751
实施例2.2：CD-20和CD-3(seq.1)DVD-Igs的生成
表34
Figure BPA00001281288902761
实施例2.3：CD-20和CD-80 DVD-Igs的生成
表35
Figure BPA00001281288902771
实施例2.4：CD-20和CD-22 DVD-Igs的生成
表36
Figure BPA00001281288902781
实施例2.5：CD-20和CD-40 DVD-Igs的生成
表37
Figure BPA00001281288902791
实施例2.6：CD-3(seq.1)和HER-2(seq.1)DVD-Igs的生成
表38
Figure BPA00001281288902801
实施例2.7：CD-3(seq.1)和CD-19 DVD-Igs的生成
表39
Figure BPA00001281288902811
实施例2.8：EGFR(seq.2)和HER-2(seq.1)DVD-Igs的生成
表40
Figure BPA00001281288902821
实施例2.9：EGFR(seq.2)和CD-3(seq.1)DVD-Igs的生成
表41
Figure BPA00001281288902831
实施例2.10：EGFR(seq.2)和IGF1，2DVD-Igs的生成
表42
实施例2.11：具有接头组1的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)DVD-Igs的生成
表43
实施例2.12：具有接头组2的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)DVD-Igs的生成
表44
Figure BPA00001281288902861
实施例2.13：具有接头组3的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)DVD-Igs的生成
表45
Figure BPA00001281288902871
实施例2.14：具有接头组4的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.1)DVD-Igs的生成
表46
Figure BPA00001281288902881
实施例2.15：具有接头组1的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)DVD-Igs的生成
表47
Figure BPA00001281288902891
实施例2.16：具有接头组2的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)DVD-Igs的生成
表48
实施例2.17：具有接头组3的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)DVD-Igs的生成
表49
Figure BPA00001281288902911
实施例2.18：具有接头组4的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.2)DVD-Igs的生成
表50
实施例2.19：具有接头组1的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)DVD-Igs的生成
表51
Figure BPA00001281288902931
实施例2.20：具有接头组2的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)DVD-Igs的生成
表52
实施例2.21：具有接头组3的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)DVD-Igs的生成
表53
Figure BPA00001281288902951
实施例2.22：具有接头组4的EGFR(seq.2)和IGF1R(seq.3)DVD-Igs的生成
表54
Figure BPA00001281288902961
实施例2.23：具有接头组1的EGFR(seq.2)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表55
Figure BPA00001281288902971
实施例2.24：具有接头组2的EGFR(seq.2)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表56
Figure BPA00001281288902981
实施例2.25：具有接头组3的EGFR(seq.2)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表57
Figure BPA00001281288902991
实施例2.26：具有接头组4的EGFR(seq.2)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表58
实施例2.27：EGFR(seq.2)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表59
实施例2.28：EGFR(seq.2)和c-MET DVD-Igs的生成
表60
Figure BPA00001281288903021
实施例2.29：HER-2(seq.1)和IGF1，2 DVD-Igs的生成
表61
Figure BPA00001281288903031
实施例2.30：HER-2(seq.1)和IGF1R DVD-Igs的生成
表62
实施例2.31：RON(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表63
实施例2.32：VEGF(seq.1)和EGFR(seq.2)DVD-Igs的生成
表64
实施例2.33：VEGF(seq.1)和HER-2(seq.1)DVD-Igs的生成
表65
Figure BPA00001281288903071
实施例2.34：VEGF(seq.1)和CD-20 DVD-Igs的生成
表66
Figure BPA00001281288903081
实施例2.35：VEGF(seq.1)和IGF1，2 DVD-Igs的生成
表67
Figure BPA00001281288903091
实施例2.36：VEGF(seq.1)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表68
Figure BPA00001281288903101
实施例2.37：具有接头组1的VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表69
Figure BPA00001281288903111
实施例2.38：具有接头组2的VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表70
实施例2.39：具有接头组3的VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表71
Figure BPA00001281288903131
实施例2.40：具有接头组4的VEGF(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表72
Figure BPA00001281288903141
实施例2.41：VEGF(seq.1)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表73
Figure BPA00001281288903151
实施例2.42：VEGF(seq.1)和NRP1(seq.1)DVD-Igs的生成
表74
Figure BPA00001281288903161
实施例2.43：HGF(seq.1)和RON(seq.2)DVD-Igs的生成
表75
Figure BPA00001281288903171
实施例2.44：EGFR(seq.2)和RON(seq.2)DVD-Igs的生成
表76
Figure BPA00001281288903181
实施例2.45：VEGF(seq.1)和RON(seq.2)DVD-Igs的生成
表77
Figure BPA00001281288903191
实施例2.46：EGFR(seq.1)和HER-2(seq.1)DVD-Igs的生成
表78
实施例2.47：EGFR(seq.1)和CD3(seq.1)DVD-Igs的生成
表79
Figure BPA00001281288903211
实施例2.48：EGFR(seq.1)和IGF1R DVD-Igs的生成
表80
Figure BPA00001281288903221
实施例2.49：EGFR(seq.1)和RON(seq.1)DVD-Igs的生成
表81
实施例2.50：EGFR(seq.1)和RON(seq.2)DVD-Igs的生成
表82
Figure BPA00001281288903241
实施例2.51：EGFR(seq.1)和HGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表83
Figure BPA00001281288903251
实施例2.52：EGFR(seq.1)和c-MET DVD-Igs的生成
表84
实施例2.53：EGFR(seq.1)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表85
Figure BPA00001281288903271
实施例2.54：NRP1(seq.2)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表86
Figure BPA00001281288903281
实施例2.55：CD3(seq.2)和CD-20 DVD-Igs的生成
表87
Figure BPA00001281288903291
实施例2.56：CD-3(seq.2)和HER-2(seq.1)DVD-Igs的生成
表88
Figure BPA00001281288903301
实施例2.57：CD-3(seq.2)和CD-19 DVD-Igs的生成
表89
Figure BPA00001281288903311
实施例2.58：CD-3(seq.2)和EGFR(seq.2)DVD-Igs的生成
表90
Figure BPA00001281288903321
实施例2.59：CD-3(seq.2)和EGFR(seq.1)DVD-Igs的生成
表91
Figure BPA00001281288903331
实施例2.60：EGFR(seq.1)和IGF1，2 DVD-Igs的生成
表92
实施例2.61：DLL-4(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表93
Figure BPA00001281288903351
实施例2.62：具有接头组1的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表94
实施例2.63：具有接头组2的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表95
Figure BPA00001281288903371
实施例2.64：具有接头组3的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表96
实施例2.65：具有接头组4的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表97
实施例2.66：具有接头组1的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表98
实施例2.67：具有接头组2的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表99
Figure BPA00001281288903411
实施例2.68：具有接头组3的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表100
Figure BPA00001281288903421
实施例2.69：具有接头组4的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表101
Figure BPA00001281288903431
实施例2.70：EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表102
Figure BPA00001281288903441
实施例2.71：HGF(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表103
Figure BPA00001281288903451
实施例2.72：具有接头组1的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表104
Figure BPA00001281288903461
实施例2.73：具有接头组2的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表105
Figure BPA00001281288903471
实施例2.74：具有接头组3的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表106
Figure BPA00001281288903481
实施例2.75：具有接头组4的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表107
实施例2.76：EGFR(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表108
Figure BPA00001281288903501
实施例2.77：HGF(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表109
Figure BPA00001281288903511
实施例2.78：具有接头组1的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表110
Figure BPA00001281288903521
实施例2.79：具有接头组2的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表111
Figure BPA00001281288903531
实施例2.80：具有接头组3的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表112
Figure BPA00001281288903541
实施例2.81：具有接头组4的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表113
Figure BPA00001281288903551
实施例2.82：具有接头组1的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表114
Figure BPA00001281288903561
实施例2.83：具有接头组2的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表115
Figure BPA00001281288903571
实施例2.84：具有接头组3的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表116
Figure BPA00001281288903581
实施例2.85：具有接头组4的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表117
Figure BPA00001281288903591
实施例2.86：具有接头组1的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表118
Figure BPA00001281288903601
实施例2.87：具有接头组2的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表119
Figure BPA00001281288903611
实施例2.88：具有接头组3的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表120
Figure BPA00001281288903621
实施例2.89：具有接头组4的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.2)DVD-Igs的生成
表121
Figure BPA00001281288903631
实施例2.90：具有接头组1的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表122
Figure BPA00001281288903641
实施例2.91：具有接头组2的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表123
实施例2.92：具有接头组3的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表125
Figure BPA00001281288903661
实施例2.93：具有接头组4的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表126
Figure BPA00001281288903671
实施例2.94：具有接头组1的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表127
Figure BPA00001281288903681
实施例2.95：具有接头组2的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表128
Figure BPA00001281288903691
实施例2.96：具有接头组3的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表129
Figure BPA00001281288903701
实施例2.97：具有接头组4的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表130
Figure BPA00001281288903711
实施例2.98：具有接头组1的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表131
Figure BPA00001281288903721
实施例2.99：具有接头组2的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表132
Figure BPA00001281288903731
实施例2.100：具有接头组3的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.1)DVD-Igs的生成
表133
实施例2.101：具有接头组1的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表134
Figure BPA00001281288903751
实施例2.102：具有接头组2的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表135
实施例2.103：具有接头组3的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表136
Figure BPA00001281288903771
实施例2.104：具有接头组4的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表137
Figure BPA00001281288903781
实施例2.105：具有接头组1的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表138
实施例2.106：具有接头组2的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表139
实施例2.107：具有接头组3的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表140
Figure BPA00001281288903811
实施例2.108：具有接头组4的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表141
Figure BPA00001281288903821
实施例2.109：具有接头组1的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表142
Figure BPA00001281288903831
实施例2.110：具有接头组2的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表143
Figure BPA00001281288903841
实施例2.111：具有接头组3的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表144
Figure BPA00001281288903851
实施例2.112：具有接头组4的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.3)DVD-Igs的生成
表145
Figure BPA00001281288903861
实施例2.113：具有接头组1的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表146
实施例2.114：具有接头组2的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表147
Figure BPA00001281288903881
实施例2.115：具有接头组3的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表148
Figure BPA00001281288903891
实施例2.116：具有接头组4的VEGF(seq.1)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表149
Figure BPA00001281288903901
实施例2.117：具有接头组1的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表150
实施例2.118：具有接头组2的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表151
实施例2.119：具有接头组3的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表152
Figure BPA00001281288903931
实施例2.120：具有接头组4的VEGF(seq.2)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表153
实施例2.121：具有接头组1的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表154
Figure BPA00001281288903951
实施例2.122：具有接头组2的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表155
实施例2.123：具有接头组3的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表156
Figure BPA00001281288903971
实施例2.124：具有接头组4的VEGF(seq.3)和DLL4(seq.4)DVD-Igs的生成
表157
Figure BPA00001281288903981
实施例2.125：具有接头组1的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表158
Figure BPA00001281288903991
实施例2.126：具有接头组2的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表159
Figure BPA00001281288904001
实施例2.127：具有接头组3的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表160
实施例2.128：具有接头组4的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.1)DVD-Igs的生成
表161
Figure BPA00001281288904021
实施例2.129：具有接头组1的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表162
Figure BPA00001281288904031
实施例2.130：具有接头组2的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表163
Figure BPA00001281288904041
实施例2.131：具有接头组3的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表164
Figure BPA00001281288904051
实施例2.132：具有接头组4的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.2)DVD-Igs的生成
表165
Figure BPA00001281288904061
实施例2.133：具有接头组1的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表166
Figure BPA00001281288904071
实施例2.134：具有接头组2的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表167
Figure BPA00001281288904081
实施例2.135：具有接头组3的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表168
实施例2.136：具有接头组4的EGFR(seq.2)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表169
Figure BPA00001281288904101
实施例2.137：具有接头组1的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表170
实施例2.138：具有接头组2的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表171
Figure BPA00001281288904121
实施例2.139：具有接头组3的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表172
Figure BPA00001281288904131
实施例2.140：具有接头组4的HER2(seq.1)和ErbB3(seq.3)DVD-Igs的生成
表173
Figure BPA00001281288904141
实施例2.141：具有接头组1的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表174
Figure BPA00001281288904151
实施例2.142：具有接头组2的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表175
实施例2.143：具有接头组3的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表176
Figure BPA00001281288904171
实施例2.144：具有接头组4的VEGF(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表177
Figure BPA00001281288904181
实施例2.145：具有接头组1的VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表178
实施例2.146：具有接头组2的VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表179
Figure BPA00001281288904201
实施例2.147：具有接头组3的VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表180
Figure BPA00001281288904211
实施例2.148：具有接头组4的VEGF(seq.2)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表181
Figure BPA00001281288904221
实施例2.149：具有接头组1的VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表182
实施例2.150：具有接头组2的VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表183
Figure BPA00001281288904241
实施例2.151：具有接头组3的VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表184
Figure BPA00001281288904251
实施例2.152：具有接头组4的VEGF(seq.3)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表185
实施例2.153：具有接头组1的HER2(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表186
Figure BPA00001281288904271
实施例2.154：具有接头组2的HER2(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表187
Figure BPA00001281288904281
实施例2.155：具有接头组3的HER2(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表188
Figure BPA00001281288904291
实施例2.156：具有接头组4的HER2(seq.1)和PLGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表189
Figure BPA00001281288904301
实施例2.157：具有接头组1的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表191
Figure BPA00001281288904311
实施例2.158：具有接头组2的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表192
Figure BPA00001281288904321
实施例2.159：具有接头组3的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表193
Figure BPA00001281288904331
实施例2.160：具有接头组4的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表194
Figure BPA00001281288904341
实施例2.161：具有接头组1的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表195
实施例2.162：具有接头组2的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表196
Figure BPA00001281288904361
实施例2.163：具有接头组3的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表197
Figure BPA00001281288904371
实施例2.164：具有接头组4的PLGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表198
Figure BPA00001281288904381
实施例2.165：具有接头组1的HER2(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表199
实施例2.166：具有接头组2的HER2(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表200
Figure BPA00001281288904401
实施例2.167：具有接头组3的HER2(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表201
Figure BPA00001281288904411
实施例2.168：具有接头组4的HER2(seq.1)和PLGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表202
Figure BPA00001281288904421
实施例2.169：具有接头组1的HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表203
Figure BPA00001281288904431
实施例2.170：具有接头组2的HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表204
实施例2.171：具有接头组3的HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表205
Figure BPA00001281288904451
实施例2.172：具有接头组4的HGF(seq.1)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表206
实施例2.173：具有接头组1的HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表207
Figure BPA00001281288904471
实施例2.174：具有接头组2的HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表208
Figure BPA00001281288904481
实施例2.175：具有接头组3的HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表209
Figure BPA00001281288904491
实施例2.176：具有接头组4的HGF(seq.1)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表210
Figure BPA00001281288904501
实施例2.177：具有接头组1的HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表211
Figure BPA00001281288904511
实施例2.178：具有接头组2的HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表212
Figure BPA00001281288904521
实施例2.179：具有接头组3的HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表213
Figure BPA00001281288904531
实施例2.180：具有接头组4的HGF(seq.2)和VEGF(seq.1)DVD-Igs的生成
表214
实施例2.181：具有接头组1的HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表215
Figure BPA00001281288904551
实施例2.182：具有接头组2的HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表216
Figure BPA00001281288904561
实施例2.183：具有接头组3的HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表217
Figure BPA00001281288904571
实施例2.184：具有接头组4的HGF(seq.2)和VEGF(seq.2)DVD-Igs的生成
表218
实施例2.185：具有接头组1的HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表219
Figure BPA00001281288904591
实施例2.186：具有接头组2的HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表220
Figure BPA00001281288904601
实施例2.187：具有接头组3的HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表221
Figure BPA00001281288904611
实施例2.188：具有接头组4的HGF(seq.2)和VEGF(seq.3)DVD-Igs的生成
表222
Figure BPA00001281288904621
实施例2.189：具有接头组1的HER2(seq.1)和HER2(seq.2)DVD-Igs的生成
表223
Figure BPA00001281288904631
实施例2.190：具有接头组2的HER2(seq.1)和HER2(seq.2)DVD-Igs的生成
表224
Figure BPA00001281288904641
实施例2.191具有接头组3的HER2(seq.1)和HER2(seq.2)DVD-Igs的生成
表225
Figure BPA00001281288904651
实施例2.192：具有接头组4的HER2(seq.1)和HER2(seq.2)DVD-Igs的生成
表226
Figure BPA00001281288904661
实施例2.193：用于克隆亲本抗体和DVD-Ig序列的克隆载体序列
表226
Figure BPA00001281288904662
Figure BPA00001281288904681
Figure BPA00001281288904691
Figure BPA00001281288904701
Figure BPA00001281288904711
Figure BPA00001281288904721
Figure BPA00001281288904731
Figure BPA00001281288904741
Figure BPA00001281288904761
Figure BPA00001281288904781
Figure BPA00001281288904791
本发明将分子生物学和药物递送领域中众所周知的技术整体并入作为参考。这些技术包括，但不限于，在下述出版物中描述的技术：
Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Ausubel，F.M.et al.eds.，Short Protocols In Molecular Biology(4th Ed.1999)John Wiley &Sons，NY.(ISBN 0-471-32938-X).
Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen and Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；
Giege，R.and Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a PracticalApproach，2nd ea.，pp.201-16，Oxford University Press，New York，New York，(1999)；
Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，vol.2，pp.115-138(1984)；
Hammerling，et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981；
Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；
Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)and(1991)；
Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；
Kontermann and Dubel eds.，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp.(ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；
Lu and Weiner eds.，Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis(2001)BioTechniques Press.Westborough，MA.298pp.(ISBN 1-881299-21-X).
Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.(1974)；
Old，R.W.& S.B.Primrose，Principles of Gene Manipulation：An Introduction To Genetic  Engineering(3d Ed.1985)Blackwell Scientific Publications，Boston.Studies in Microbiology；V.2：409pp.(ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook，J.et al.eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978
Winnacker，E.L.From Genes To Clones：Introduction To Gene Technology(1987)VCHPublishers，NY(translated by Horst Ibelgaufts).634pp.(ISBN 0-89573-614-4).
引入作为参考
可能在本申请自始至终引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容都在此明确地整体引入作为参考，其中引用的参考文献也如此。除非另外指出，本发明的实践将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学常规技术。
等同方案
本发明在不背离其精神或基本特征的情况下可以以其他具体形式具体化。前述实施方案因此在所有方面被视为是示例性的，而不是限制此处所述的本发明。本发明的范围因而由所附的权利要求而不是由前述说明书指出，且在权利要求的等价含义和范围内的所有改变因而预期包含在其中。

Claims (21)

1.一种包含第一个和第二个多肽链的结合蛋白，所述第一个和第二个多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一个可变结构域；
VD2是第二个可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n是0或1；
其中第一个和第二个多肽链上的VD1结构域形成第一个功能性靶结合位点，且第一个和第二个多肽链上的VD2结构域形成第二个功能性靶结合位点，且其中所述结合蛋白能够结合VEGF和DLL4，其中：
(a)形成对于VEGF的功能性靶结合位点的可变结构域包含
来自SEQ ID NO：53的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：54的CDRs1-3，
来自SEQ ID NO：77的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：78的CDRs1-3，或
来自SEQ ID NO：79的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：80的CDRs1-3，
且所述结合蛋白能够以最多约28.25nM的EC50结合VEGF，如通过直接结合ELISA所测量的；
和/或
(b)形成对于DLL4的功能性靶结合位点的可变结构域包含
来自SEQ ID NO：55的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：56的CDRs1-3，
来自SEQ ID NO：75的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：76的CDRs1-3，
来自SEQ ID NO：81的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：82的CDRs1-3，或
来自SEQ ID NO：83的CDRs1-3和来自SEQ ID NO：84的CDRs1-3，
且所述结合蛋白能够以最多约2.12nM的EC50结合DLL4，如通过直接结合ELISA所测量的。
2.一种包含第一个和第二个多肽链的结合蛋白，所述第一个和第二个多肽链各自独立地包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一个可变结构域；
VD2是第二个可变结构域；
C是恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n是0或1；
其中第一个和第二个多肽链上的VD1结构域形成第一个功能性靶结合位点，且第一个和第二个多肽链上的VD2结构域形成第二个功能性靶结合位点，且其中所述结合蛋白能够结合VEGF和DLL4，其中：
(a)形成对于VEGF的功能性靶结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO：53、54和77-80的序列，且所述结合蛋白能够以最多约28.25nM的EC50结合VEGF，如通过直接结合ELISA所测量的；
和
(b)形成对于DLL4的功能性靶结合位点的可变结构域包含选自SEQ ID NO：55、56、75、76和81-84的序列，且所述结合蛋白能够以最多约2.12nM的EC50结合DLL4，如通过直接结合ELISA所测量的。
3.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述第一个多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一个重链可变结构域；
VD2是第二个重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n是0或1；且
其中所述第二个多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中
VD1是第一个轻链可变结构域；
VD2是第二个轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
n对于(X1)n是0或1；且
n对于(X2)n是0；
其中第一个和第二个多肽链上的VD1结构域形成第一个功能性靶结合位点，且第一个和第二个多肽链上的VD2结构域形成第二个功能性靶结合位点。
4.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合VEGF和DLL4，其中：
(a)形成对于VEGF的功能性靶结合位点的可变结构域包含
SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54，
SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78，或
SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：80；
和
(b)形成对于DLL4的功能性靶结合位点的可变结构域包含
SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，
SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76，
SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：82，或
SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84。
5.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个第一个多肽链和两个第二个多肽链，从而形成4个功能性结合位点。
6.根据权利要求1的结合蛋白，其中
(a)X1是SEQ ID NOs1-26的任一种；
(b)X1不是CH1或CL；
(c)所述Fc区是变体序列Fc区；
(d)所述Fc区是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc区；和/或
(e)所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
7.一种能够结合VEGF和DLL4的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含下述的任意一种：
DVD043(包含SEQ ID NOs：239和240)，
DVD044(包含SEQ ID NOs：241和242)，
DVD441(包含SEQ ID NOs：407和408)，
DVD442(包含SEQ ID NOs：409和410)，
DVD447(包含SEQ ID NOs：411和412)，
DVD448(包含SEQ ID NOs：413和414)，
DVD453(包含SEQ ID NOs：415和416)，
DVD454(包含SEQ ID NOs：417和418)，
DVD459(包含SEQ ID NOs：419和420)，
DVD460(包含SEQ ID NOs：421和422)，
DVD443(包含SEQ ID NOs：423和424)，
DVD444(包含SEQ ID NOs：425和426)，
DVD449(包含SEQ ID NOs：427和428)，
DVD450(包含SEQ ID NOs：429和430)，
DVD455(包含SEQ ID NOs：431和432)，
DVD456(包含SEQ ID NOs：433和434)，
DVD461(包含SEQ ID NOs：435和436)，
DVD462(包含SEQ ID NOs：437和438)，
DVD445(包含SEQ ID NOs：439和440)，
DVD446(包含SEQ ID NOs：441和442)，
DVD451(包含SEQ ID NOs：443和444)，
DVD452(包含SEQ ID NOs：445和446)，
DVD457(包含SEQ ID NOs：447和448)，
DVD458(包含SEQ ID NOs：449和450)，
DVD463(包含SEQ ID NOs：451和452)，
DVD464(包含SEQ ID NOs：453和454)，
DVD465(包含SEQ ID NOs：455和456)，
DVD466(包含SEQ ID NOs：457和458)，
DVD471(包含SEQ ID NOs：459和460)，
DVD472(包含SEQ ID NOs：461和462)，
DVD477(包含SEQ ID NOs：463和464)，
DVD478(包含SEQ ID NOs：465和466)，
DVD483(包含SEQ ID NOs：467和468)，
DVD484(包含SEQ ID NOs：469和470)，
DVD467(包含SEQ ID NOs：471和472)，
DVD468(包含SEQ ID NOs：473和474)，
DVD473(包含SEQ ID NOs：475和476)，
DVD474(包含SEQ ID NOs：477和478)，
DVD479(包含SEQ ID NOs：479和480)，
DVD480(包含SEQ ID NOs：481和482)，
DVD485(包含SEQ ID NOs：483和484)，
DVD486(包含SEQ ID NOs：485和486)，
DVD469(包含SEQ ID NOs：487和488)，
DVD470(包含SEQ ID NOs：489和490)，
DVD475(包含SEQ ID NOs：491和492)，
DVD476(包含SEQ ID NOs：493和494)，
DVD481(包含SEQ ID NOs：495和496)，
DVD482(包含SEQ ID NOs：497和498)，
DVD487(包含SEQ ID NOs：499和500)，
DVD488(包含SEQ ID NOs：501和502)，
DVD493(包含SEQ ID NOs：503和504)，
DVD494(包含SEQ ID NOs：505和506)，
DVD499(包含SEQ ID NOs：507和508)，
DVD500(包含SEQ ID NOs：509和510)，
DVD505(包含SEQ ID NOs：511和512)，
DVD506(包含SEQ ID NOs：513和514)，
DVD489(包含SEQ ID NOs：515和516)，
DVD490(包含SEQ ID NOs：517和518)，
DVD495(包含SEQ ID NOs：519和520)，
DVD496(包含SEQ ID NOs：521和522)，
DVD501(包含SEQ ID NOs：523和524)，
DVD502(包含SEQ ID NOs：525和526)，
DVD507(包含SEQ ID NOs：527和528)，
DVD508(包含SEQ ID NOs：529和530)，
DVD491(包含SEQ ID NOs：531和532)，
DVD492(包含SEQ ID NOs：533和534)，
DVD497(包含SEQ ID NOs：535和536)，
DVD498(包含SEQ ID NOs：537和538)，
DVD503(包含SEQ ID NOs：539和540)，
DVD504(包含SEQ ID NOs：541和542)，
DVD509(包含SEQ ID NOs：543和544)，
DVD510(包含SEQ ID NOs：545和546)，
DVD511(包含SEQ ID NOs：547和548)，
DVD512(包含SEQ ID NOs：549和550)，
DVD517(包含SEQ ID NOs：551和552)，
DVD518(包含SEQ ID NOs：553和554)，
DVD523(包含SEQ ID NOs：555和556)，
DVD524(包含SEQ ID NOs：557和558)，
DVD529(包含SEQ ID NOs：559和560)，
DVD530(包含SEQ ID NOs：561和562)，
DVD513(包含SEQ ID NOs：563和564)，
DVD514(包含SEQ ID NOs：565和566)，
DVD519(包含SEQ ID NOs：567和568)，
DVD520(包含SEQ ID NOs：569和570)，
DVD525(包含SEQ ID NOs：571和572)，
DVD526(包含SEQ ID NOs：573和574)，
DVD531(包含SEQ ID NOs：575和576)，
DVD532(包含SEQ ID NOs：577和578)，
DVD515(包含SEQ ID NOs：579和580)，
DVD516(包含SEQ ID NOs：581和582)，
DVD521(包含SEQ ID NOs：583和584)，
DVD522(包含SEQ ID NOs：585和586)，
DVD527(包含SEQ ID NOs：587和588)，
DVD528(包含SEQ ID NOs：589和590)，
DVD533(包含SEQ ID NOs：591和592)，和
DVD534(包含SEQ ID NOs：593和594)。
8.包含根据权利要求1-7任一项的结合蛋白的结合蛋白缀合物，所述结合蛋白缀合物另外包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂，其中所述显像剂任选是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记、或生物素，其中所述放射性标记任选是3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm，或
其中所述治疗剂或细胞毒性剂任选是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环类、毒素或细胞凋亡剂。
9.分离的核酸，其编码根据权利要求1-7任一项的结合蛋白氨基酸序列。
10.载体，其含有根据权利要求9的分离的核酸，其中所述载体任选是pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1TOPO、pEF6TOPO、pBJ或pHybE。
11.分离的宿主细胞，其含有根据权利要求10的载体，其中所述宿主细胞任选是原核细胞、大肠杆菌(Escherichia coli)、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、Sf9细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、CHO细胞或COS细胞。
12.产生结合蛋白的方法，包括在足以生产结合蛋白的条件下，在培养基中培养根据权利要求11所述的宿主细胞。
13.药物组合物，包含根据权利要求1-7任一项的结合蛋白、以及药学可接受的载体。
14.根据权利要求13的药物组合物，另外包含至少一种另外的治疗剂，其中所述另外的治疗剂任选是：显像剂，细胞毒性剂，血管发生抑制剂，激酶抑制剂，共刺激分子阻断剂，粘附分子阻断剂，抗细胞因子抗体或其功能片段，氨甲蝶呤，环孢菌素，雷帕霉素，FK506，可检测标记或报道分子，TNF拮抗剂，抗风湿剂，肌肉弛缓剂，麻醉药，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，促红细胞生成素，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子，或细胞因子拮抗剂。
15.根据权利要求1-7任一项的结合蛋白在制备用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述病症是关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合征、慢性疲乏综合征、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合征、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头、斑秃、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、
Figure FSB00001114076100081
氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合征、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、氏综合征、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍、抑郁、精神分裂症、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛、疼痛、癌症、肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰癌、卵巢癌、前列腺癌、直肠癌、造血恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合征、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合征、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合征、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合征/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、流行性感冒a、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合征、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合征/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合征(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合征)、灌注后综合征、泵后综合征、MI心切开术后综合征、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合征、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合征、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或Fab ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合征、Wernicke-Korsakoff综合征、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合征、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、过敏反应、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合征(cis)、儿童期发病性精神病、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合征(GBS)、Hughes综合征、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合征、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合征、多肌炎、风湿性多肌病(PMR)、原发性帕金森综合征、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合征(SJS)、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、血管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、湿黄斑变性或伤口愈合。
17.根据权利要求15的用途，其中所述药物配制用于肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、或经皮施用。
18.通过免疫测定确定测试样品中至少一种靶或其片段的存在、量或浓度的体外方法，
其中所述免疫测定包含将测试样品与至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记接触，
其中所述至少一种结合蛋白包含根据权利要求1-7任一项的结合蛋白。
19.根据权利要求18的方法，进一步包含：
(a)将测试样品与至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白结合靶或其片段上的表位，从而形成第一个复合物；
(b)将所述复合物与至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记结合所述结合蛋白或所述靶或其片段上未由所述结合蛋白结合的表位以形成第二个复合物；以及
(c)基于在第二个复合物中由可检测标记生成的信号检测测试样品中靶或其片段的存在、量或浓度，其中靶或其片段的存在、量或浓度与由可检测标记生成的信号直接相关。
20.根据权利要求18的方法，进一步包含：
(a)将测试样品与至少一种结合蛋白接触，其中所述结合蛋白结合靶或其片段上的表位，从而形成第一个复合物；
(b)将所述复合物与至少一种可检测标记接触，其中所述可检测标记与靶或其片段竞争结合所述结合蛋白，从而形成第二个复合物；以及
(c)基于在第二个复合物中由可检测标记生成的信号检测测试样品中靶或其片段的存在、量或浓度，其中靶或其片段的存在、量或浓度与由可检测标记生成的信号间接相关。
21.测定体外测试样品中靶或其片段的存在、量或浓度的试剂盒，
所述试剂盒包含(a)用于测定测试样品的靶或其片段的说明书和(b)至少一种结合蛋白，包含根据权利要求1-7任一项的结合蛋白。
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