DE69929310T2

DE69929310T2 - Tumorassoziierte antigenderivate der mage-familie, nukleinsäuresequenzen die dafür kodieren, zur herstellung von fusionsproteinen und zusammensetzungen zur impfung

Info

Publication number: DE69929310T2
Application number: DE69929310T
Authority: DE
Inventors: Teresa Smithkline Beecham Biolog.Sa Cabezon Silva; Joseph Smithkline Beecham Biological Cohen; Moncef Smithkline Beecham Biological Slaoui; Carlota Smithkline Beecham Biol.Sa Vinals Bassols
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: HK1093522A1; PT1659178E; JP4768121B2; NO328507B1; CA2584482C; ATE315088T1; NO20091665L; JP2009201510A; PL342852A1; CY1111672T1; ATE513042T1; CY1111831T1; KR100824105B1; HUP0102639A3; US20100209444A1; AR018064A1; DK1053325T3; KR20060067977A; CZ298364B6; SA99200126B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinderivate, die ein Tumorassoziiertes Antigen umfassen und Anwendung in der Krebsimpfstofftherapie finden. Insbesondere schließen die Derivate der Erfindung chemisch modifizierte Proteine ein, die ein durch die Familie der MAGE-Gene (z.B. MAGE-3, MAGE-1) codiertes Antigen umfassen, worin das Derivat derivatisierte Thiolreste umfaßt. Ebenfalls werden Verfahren zur Reinigung von MAGE-Proteinen und zur Formulierung von Impfstoffen zur Behandlung einer Reihe von Krebstypen beschrieben, die ohne Beschränkung Melanom, Brust-, Blasen-, Lungen-, NSCLC-, Kopf- und Schuppenzell-Karzinom, Dickdarmkarzinom und Ösophagus-Karzinom einschließen.
Durch die Familie der MAGE-Gene codierte Antigene werden hauptsächlich auf Melanomzellen (einschließlich bösartiger Melanome) und einigen anderen Krebstypen exprimiert, die NSCLC (Nicht-Kleinzell-Lungenkrebs), Kopf- und Hals-Schuppenzellkarzinom, Blasen-Übergangszell-Karzinom und Ösophagus-Karzinom einschließen, aber nicht auf normalen Geweben ausgenommen im Hoden und der Plazenta nachweisbar sind (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 wird in 69 % der Melanome exprimiert (Gaugler 1994) und kann auch in 44 % der NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48 % der Kopf- und Hals-Schuppenzell-Karzinome, 34 % der Blasen-Übergangszell-Karzinome, 57 % der Ösophagus-Karzinome, 32 % der Dickdarmkrebse und 24 % der Brustkrebse nachgewiesen werden (Van Pel, 1995; Inoue, 1995; Fujie, 1997; Nishimura, 1997). Krebstypen, die MAGE-Proteine exprimieren, sind als MAGE-assoziierte Tumoren bekannt.
Die Immunogenität von humanen Melanomzellen wurde elegant in Experimenten unter Verwendung gemischter Kulturen aus Melanomzellen und autologen Lymphozyten gezeigt. Diese Kulturen erzeugen häufig spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die ausschließlich die autologen Melanomzellen lysieren können, aber weder autologe Fibroblasten noch autologe EBV-transformierte B-Lymphozyten (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Verschiedene der auf autologen Melanomzellen durch diese CTL-Klone erkannte Antigene sind jetzt identifiziert, einschließlich derjenigen der MAGE-Familie.
Das erste Antigen, das durch seine Erkennung durch spezifische CTLS auf autologen Melanomzellen definiert werden konnte, wird als MZ2-E bezeichnet (Van den Eynde, 1989) und wird durch das Gen MAGE-1 codiert (van der Bruggen, 1991). Gegen MZ2-E gerichtete CTLs erkennen und lysieren MZ2-E-positive Melanomzellen aus autologen sowie aus anderen Patienten, vorausgesetzt diese Zellen besitzen das HLA.A1-Allel.
Das MAGE-1-Gen gehört zu einer Familie von 12 eng verwandten Genen, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12, die sich auf dem Chromosom X befinden und miteinander 64 bis 85 % Homologie in ihrer codierenden Sequenz teilen (De Plaen, 1994). Diese sind manchmal als MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11 und MAGE A12 bekannt (die MAGE-A-Familie). Zwei andere Gruppen von Proteinen sind auch Teil der MAGE-Familie, obwohl sie entfernter verwandt sind. Dieses sind die die MAGE-B- und MAGE-C-Gruppe. Die MAGE-B-Familie schließt MAGE B1 (auch als MAGE Xp1 und DAM10 bekannt), MAGE B2 (auch als MAGE Xp2 und DAM6 bekannt), MAGE B3 und MAGE B4 ein. Die MAGE-C-Familie schließt derzeit MAGE C1 und MAGE C2 ein. In allgemeinen Begriffen kann ein MAGE-Protein so definiert werden, daß es eine Kernsequenzsignatur enthält, die sich hin zum C-terminalen Ende des Proteins befindet (zum Beispiel in Bezug auf MAGE A1, einem Protein mit 309 Aminosäuren, entspricht die Kernsignatur den Aminosäuren 195-279).
Das Consensus-Muster der Kernsignatur wird daher wie folgt beschrieben, worin x eine beliebige Aminosäure darstellt, Reste mit kleinen Buchstaben konserviert sind (konservative Varianten erlaubt) und Reste mit großen Buchstaben perfekt konserviert sind.
Kernsequenzsignatur
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVP xsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
Konservative Substitutionen sind allgemein bekannt und werden allgemein als standardmäßige Bewertungsmatrizen in Computerprogrammen zur Sequenzangleichung eingestellt. Diese Programme schließen PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", in "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (Hrsg.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington) und Blosum 62 ein (Steven Henikoft und Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915–10919).
In allgemeinen Begriffen sind Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen konservative Substitutionen, aber Substitutionen zwischen Gruppen werden als nicht-konserviert betrachtet. Die Gruppen sind:

i) Aspartat/Asparagin/Glutamat/Glutamin
ii) Serin/Threonin
iii) Lysin/Arginin
iv) Phenylalanin/Tyrosin/Tryptophan
v) Leucin/Isoleucin/Valin/Methionin
vi) Glycin/Alanin

Im allgemeinen und im Zusammenhang dieser Erfindung wird ein MAGE-Protein circa 50 % identisch in dieser Kernregion mit den Aminosäuren 195 bis 279 von MAGE A1 sein.
Verschiedene CTL-Epitope wurden auf dem MAGE-3-Protein identifiziert. Ein solches Epitop, MAGE-3.A1, ist eine Nonapeptidsequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 168 und 176 des MAGE-3-Proteins befindet, das ein für CTLs spezifisches Epitop darstellt, wenn es in Verbindung mit dem MHC-Klasse I-Molekül HLA.A1 angeboten wird. Kürzlich wurden zwei zusätzliche CTL-Epitope auf der Peptidsequenz des MAGE-3-Proteins durch ihre Fähigkeit identifiziert, eine CTL-Reaktion in einer gemischten Kultur aus Melanomzellen und autologen Lymphozyten hervorzurufen. Diese zwei Epitope haben spezifische Bindungsmotive für die HLA.A2- (Van der Bruggen, 1994) bzw. HLA.B44-Allele (Herman, 1996).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Tumor-assoziiertes Antigenderivat aus der MAGE-Familie bereit, worin das Derivat derivatisierte Thiolreste umfaßt. Solche Derivate sind geeignet zur Verwendung in therapeutischen Impfstofformulierungen, die geeignet zur Behandlung einer Reihe von Tumortypen sind. Die derivatisierten Thiole sind bevorzugt carboxyamidiert oder carboxymethyliert.
Protein D ist ein Oberflächenprotein des Gram-negativen Bakteriums Hämophilus influenza B (WO 91/18926). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Antigenderivat einen aus Protein D stammenden Fusionspartner, worin das Protein D-Derivat ungefähr das erste Drittel des Proteins umfaßt, insbesondere ungefähr die ersten 100–110 N-terminalen Aminosäuren. Die Proteine können chemisch konjugiert sein, aber werden bevorzugt als rekombinante Fusionsproteine exprimiert, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich zum nicht-fusionierten Protein erlaubt. Daher kann der Fusionspartner bei der Bereitstellung von T-Helfer-Epitopen assistieren (immunologischer Fusionspartner), bevorzugt durch Menschen erkannten T-Helfer-Epitopen, oder bei der Expression des Protein assistieren (Expressionsverstärker) in höheren Ausbeuten als das native rekombinante Protein. Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein expressionsverstärkender Partner sein.
Bevorzugt ist das Protein D-Derivat lipidiert. Bevorzugt sind die ersten 109 Reste des Lipoprotein D-Fusionspartners am N-Terminus eingeschlossen, um das betreffende Impfstoff-Antigen mit zusätzlichen exogenen T-Zell-Epitopen zu versehen und die Expressionsstärke in E. coli zu erhöhen (und somit auch als Expressionsverstärker zu wirken). Der Lipidschwanz stellt eine optimale Darstellung des Antigens für Antigen-präsentierende Zellen sicher.
Andere Fusionspartner schließen das Nicht-Strukturprotein aus dem Influenzavirus, NS1 (Hämagglutinin), ein. Typischerweise werden die 81 N-terminalen Aminosäuren verwendet, obwohl unterschiedliche Fragmente verwendet werden können, vorausgesetzt sie schließen T-Helfer-Epitope ein.
In einer anderen Ausführungsform ist der immunologische Fusionspartner das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, die eine N-Acetyl-L-Alanin-Amidase synthetisieren, Amidase LytA (codiert durch das LytA-Gen {Gene, 43 (1986) S. 265–272}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycangerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder einigen Cholin-Analoga wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von C-LytA-exprimierenden Plasmiden aus E. coli ausgenutzt, die nützlich zur Expression von Fusionsproteinen sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Amino-Terminus enthalten, wurde beschrieben (Biotechnology: 10 (1992) S. 795–798). Wie hier verwendet nutzt eine bevorzugte Ausführungsform den im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefundenen Repeat-Teil des LytA-Moleküls. Eine besonders bevorzugte Form beinhaltet die Reste 188–305.
Die oben angegebenen Fusionspartner sind auch vorteilhaft in der Unterstützung der Expression. Insbesondere werden solche Fusionen in höheren Erträgen als native rekombinante MAGE-Proteine exprimiert.
Es wurde durch die vorliegenden Erfinder gezeigt, daß solche Konstrukte in einer klinischen Umgebung Melanome behandeln können. In einem Fall wurde ein Patient mit Melanom der Stufe IV von Metastasen nach zwei Dosen von Lipo D 1/3 MAGE 3 His-Protein ohne Hilfsstoff geklärt.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in der Ausführungsform Fusionsproteine bereit, die ein Tumor-assoziiertes Antigenderivat aus der MAGE-Familie umfassen, worin das Derivat derivatisierte Thiolreste umfaßt, gebunden an einen immunologischen Fusionspartner. Der immunologische Fusionspartner ist Protein D oder ein Fragment (Derivat) davon, das das erste Drittel von Protein D umfaßt, bevorzugt Lipoprotein D. Die MAGE-Proteine sind bevorzugt MAGE A1 oder MAGE A3. Der Lipoprotein D-Teil umfaßt bevorzugt das erste Drittel von Lipoprotein D.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden bevorzugt in E. coli exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine mit einem Affinitätsmarker exprimiert, wie zum Beispiel einem Histidinschwanz, der 5 bis 9 und vorzugsweise 6 Histidinreste umfaßt. Diese sind vorteilhaft bei der Unterstützung der Reinigung.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleinsäure bereit, die die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung codiert. Solche Sequenzen können in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert und zur DNA/RNA-Impfung verwendet oder in einem geeigneten Wirt exprimiert werden. Mikrobielle Vektoren, die die Nukleinsäure exprimieren, können als Impfstoffe verwendet werden. Solche Vektoren schließen zum Beispiel Pockenvirus, Adenovirus, Alphavirus, Listeria und Monarphage ein.
Eine DNA-Sequenz, die die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung codiert, kann unter Verwendung von standardmäßigen DNA-Synthesetechniken synthetisiert werden, z.B. durch enzymatische Ligation wie beschrieben von D.M. Robert et al., Biochemistry, 1985, 24, 5090–5098, durch chemische Synthese, durch enzymatische Polymerisation in vitro oder durch PCR-Technik unter Verwendung zum Beispiel einer hitzestabilen Polymerase oder durch eine Kombination dieser Techniken.
Die enzymatische Polymerisation von DNA kann in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase wie DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) in einem geeigneten Puffer, der die Nukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP nach Bedarf enthält, bei einer Temperatur von 10–37°C, allgemein in einem Volumen von 50 μl oder weniger durchgeführt werden. Die enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann unter Verwendung einer DNA-Ligase wie T4 DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer durchgeführt werden, wie z.B. 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl₂, 0,01 M Dithiothreit, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, bei einer Temperatur von 4°C bis Umgebungstemperatur, allgemein in einem Volumen von 50 ml oder weniger. Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder von DNA-Fragmenten kann durch herkömm liche Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von Festphasentechniken durchgeführt werden, wie sie beschrieben werden in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments – A Laboratory Manual" (Hrsg. H.G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), oder in anderen wissenschaftlichen Veröffentlichungen, z.B. M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat und R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat und W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci und M;.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci und MH. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus und H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539 und H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Das Verfahren der Erfindung kann durch herkömmliche rekombinante Techniken durchgeführt werden, wie sie beschrieben werden in Maniatis et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982–1989.
Insbesondere kann das Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

i) Herstellen eines vervielfältigbaren oder integrierenden Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle ein DNA-Polymer exprimieren kann, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Protein oder ein immunogenes Derivat davon codiert;
ii) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor;
iii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers zur Erzeugung des Proteins erlauben; und
iv) Gewinnen des Proteins.

Der Begriff "Transformieren" wird hier zur Bezeichnung der Einführung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle verwendet. Dies kann zum Beispiel durch Transformation, Transfektion oder Infektion mit einem geeigneten Plasmid oder viralen Vektor z.B. unter Verwendung herkömmlicher Techniken erreicht werden, wie sie beschrieben werden in Genetic Engineering; Hrsg. S.M. Kingsman und A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1988. Der Begriff "transformiert" oder "Transformante" wird nachfolgend auf die resultierende Wirtszelle zutreffen, die das interessierende Fremdgen enthält und exprimiert.
Die Expressionsvektoren sind neu und bilden auch einen Teil der Erfindung.
Die vervielfältigbaren Expressionsvektoren können erfindungsgemäß durch Spalten eines Vektors, der mit der Wirtszelle kompatible ist, zur Bereitstellung eines linearen DNA-Segments mit einem intakten Replicon und Kombinieren des linearen Segments mit einem oder mehreren DNA-Molekülen, die zusammen mit dem linearen Segment das gewünschte Produkt codieren, wie z.B. mit dem DNA-Polymer, das das Protein der Erfindung codiert, oder einem Derivat davon, unter ligierenden Bedingungen hergestellt werden.
So kann das DNA-Polymer während der Konstruktion des Vektors nach Wunsch vorgeformt oder geformt werden.
Die Wahl des Vektors wird zum Teil durch die Wirtszelle bestimmt werden, die prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann, aber bevorzugt E. coli- oder CHO-Zellen ist. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren ein.
Die Herstellung des vervielfältigbaren Expressionsvektors kann herkömmlich mit geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA durch Verfahren durchgeführt werden, die z.B. in Maniatis et al. (s.o.) beschrieben werden.
Die rekombinante Wirtszelle wird erfindungsgemäß durch Transformieren einer Wirtszelle mit einem vervielfältigbaren Expressionsvektor der Erfindung unter transformierenden Bedingungen hergestellt. Geeignete transformierende Bedingungen sind herkömmlich und werden z.B. beschrieben in Maniatis et al. (s.o.) oder "DNA Cloning", Bd. II, D.M. Glover Hrsg., IRL Press Ltd., 1985.
Die Wahl der transformierenden Bedingungen wird durch die Wirtszelle bestimmt. So kann ein bakterieller Wirt wie E. coli mit einer Lösung aus CaCl₂ (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) oder mit einer Lösung, die eine Mischung aus RbCl, MnCl₂, Kaliumacetat und Glycerin umfaßt, und dann mit 3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure, RbCl und Glycerin behandelt werden. Säugetierzellen in Kultur können durch Calcium-Ko-präzipitation der Vektor-DNA auf die Zellen transformiert werden. Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine mit einem vervielfältigbaren Expressionsvektor der Erfindung transformierte Wirtszelle.
Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers erlauben, wird herkömmlich durchgeführt, z.B. wie beschrieben in Maniatis et al. und "DNA Cloning" (s.o.). So wird vorzugsweise die Zelle mit Nährmittel versorgt und bei einer Temperatur von unter 50°C kultiviert.
Das Produkt wird durch herkömmliche Verfahren gemäß Wirtszelle und gemäß Lokalisierung des Expressionsprodukts (intrazellulär oder in das Kulturmedium oder in das Zellperiplasma sezerniert) gewonnen. So kann die Wirtszelle, wenn sie bakteriell ist wie z.B. E. coli, zum Beispiel physikalisch, chemisch oder enzymatisch lysiert und das Proteinprodukt aus dem resultierenden Lysat isoliert werden. Wenn die Wirtszelle aus Säugetier ist, kann das Produkt allgemein aus dem Nährmedium oder aus zellfreien Extrakten isoliert werden. Herkömmliche Proteinisolierungstechniken schließen die selektive Präzipitation, Adsorptionschromatografie und Affinitätschromatografie, einschließlich einer Affinitätssäule mit monoklonalem Antikörper, ein.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden entweder löslich in einer flüssigen Form oder in lyophilisierter Form bereitgestellt.
Es wird allgemein erwartet, daß jede humane Dosis 1 bis 1.000 μg Protein und vorzugsweise 30-300 μg umfassen wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein Protein der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt. Eine bevorzugte Impfstoffzusammensetzung umfaßt wenigstens Lipoprotein D – MAGE-3. Ein solcher Impfstoff kann gegebenenfalls ein oder mehrere andere Tumor-assoziierte Antigene enthalten. Zum Beispiel andere Mitglieder, die zu den MAGE- und GAGE-Familien gehören. Geeignete andere Tumor-assoziierte Antigene schließen MAGE-1, GAGE-1 oder Tyrosinaseproteine ein.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. Powell M.F. & Newman M.J.), 1995, Plenum Press, New York). Die Verkapselung innerhalb von Liposomen wird von Fullerton beschrieben, US-PS 4,235,877.
Die erfindungsgemäßen Proteine werden bevorzugt in der Impfstofformulierung der Erfindung mit Hilfsstoffen versetzt. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat ein, aber können auch ein Salz von Calcium, Eisen oder Zink sein oder können eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen sein. Andere bekannte Hilfsstoffe schließen CpG-haltige Oligonukleotide ein. Die Oligonukleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß das CpG-Dinukleotid unmethyliert ist. Solche Oligonukleotide sind allgemein bekannt und werden z.B. in WO 96/02555 beschrieben.
In der Formulierung der Erfindung ist es bevorzugt, daß die Hilfsstoffzusammensetzung eine Immunreaktion vorzugsweise vom TH1-Typ induziert. Geeignete Hilfsstoffsysteme schließen z.B. eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz ein. CpG-Oligonukleotide induzieren ebenfalls vorzugsweise eine TH1-Reaktion.
Ein gesteigertes System beinhaltet die Kombination aus einem Monophosphoryllipid A und einem Saponinderivat, insbesondere die Kombination aus QS21 und 3D-MPL, offenbart in WO 94/00153, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, worin das QS21 mit Cholesterin gedämpft ist, offenbart in WO 96/33739.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
Entsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff bereitgestellt, der ein Protein der vorliegenden Erfindung umfaßt, besonders bevorzugt ein Lipoprotein D (oder Derivat davon) – MAGE-3, mit einem Monophosphoryllipid A oder Derivat davon als Hilfsstoff versetzt.
Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich ein Saponin, besonders bevorzugt QS21.
Bevorzugt umfaßt die Formulierung zusätzlich eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstofformulierung bereit, umfassend das Vermischen eines erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten wie 3D-MPL.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung eines rekombinant erzeugten MAGE-Proteins oder einer MAGE-Fusion wie hier beschrieben bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt das Solubilisieren des Proteins, zum Beispiel in einem starken chaotropen Mittel (wie z.B. Harnstoff, Guanidiumhydrochlorid) oder in einem zwitterionischen Detergens, z.B. Empigen BB (n-Dodecyl-N,N-dimethylglycin), das Reduzieren der intra- und intermolekularen Disulfidbindungen des Proteins, das Blockieren der resultierenden Thiole zur Verhinderung einer erneuten oxidativen Kupplung und das Unterwerfen des Proteins einem oder mehreren chromatografischen Schritten.
Bevorzugt ist das blockierende Mittel ein Alkylierungsmittel. Solche blockierenden Mittel schließen ohne Beschränkung alpha-Halogensäuren oder alpha-Halogenamide ein, z.B. Iodessigsäure und Iodacetamid, was zur Carboxymethylierung oder Carboxyamidierung (Carbamidomethylierung) des Proteins führt. Andere blockierende Mittel können verwendet werden und werden in der Literatur beschrieben (siehe z.B. "The Protein", Bd. II, Hrsg. H. Neurath, R.L. Hill und C.L. Boeder, Academic Press, 1976, oder "Chemical Reagents for Protein Modification", Bd. I, Hrsg. R.L. Lundblad und C.M. Noyes, CRC Press, 1985). Typische Beispiele für solche anderen blockierenden Mittel schließen N-Ethylmaleimid, Chloracetylphosphat, O-Methylisoharnstoff und Acrylnitril ein. Die Verwendung des blockierenden Mittels ist vorteilhaft, da es die Aggregation des Produkts verhindert und Stabilität für die spätere Reinigung sicherstellt.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die blockierenden Mittel ausgewählt, um ein stabiles kovalentes und irreversibles Derivat zu induzieren (z.B. alpha-Halogensäuren oder alpha-Halogenamide). Jedoch können andere blockierende Mittel ausgewählt werden, so daß nach der Reinigung das blockierende Mittel entfernt werden kann, um das nicht-derivatisierte Protein freizusetzen.
MAGE-Proteine mit derivatisierten freien Thiolresten sind neu und bilden einen Aspekt der Erfindung. Insbesondere sind carboxyamidierte und carboxymethylierte Derivate eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Proteine der vorliegenden Erfindung mit einem Affinitätsmarker wie CLytA oder einem Polyhistidinschwanz versehen. In solchen Fällen wird das Protein nach dem Blockierungsschritt bevorzugt einer Affinitätschromatografie unterworfen. Für diejenigen Proteine mit einem Polyhistidinschwanz kann eine immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatografie (IMAC) durchgeführt werden. Das Metallion kann jedes geeignete Ion sein, zum Beispiel Zink, Nickel, Eisen, Magnesium oder Kupfer, aber ist bevorzugt Zink oder Nickel. Bevorzugt enthält der IMAC-Puffer ein zwitterionisches Detergens wie Empigen BB (nachfolgend Empigen), da dies zu geringeren Mengen an Endotoxin im Endprodukt führt.
Falls das Protein mit einem CLytA-Teil erzeugt wird, kann das Protein durch Ausnutzen seiner Affinität zu Cholin oder Cholin-Analoga wie DEAE gereinigt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Proteine mit einem Polyhistidinschwanz und einem CLytA-Teil versehen. Diese können in einem einfachen zweistufigen affinitätschromatografischen Reinigungsprotokoll gereinigt werden.
Die Erfindung wird weiter unter Verweis auf die folgenden Beispiele mit Bezug auf die Figuren beschrieben, worin gilt:
1: LPD-MAGE-3-His
2: Konstruktion des Expressionsvektors pRIT14586
3: Konstruktion von Plasmid pRIT14477, das das Fusionsprotein Prot.D 1/3-MAGE-3-His-Schwanz exprimiert
4: Western-Blot-Analyse von LPD-MAGE-3-His-Protein; Anti-MAGE-3-monoklonalen Antikörpern Mab32 und Mab54
5: Immunogenität von MAGE-3 in Mäusen (C57BL6); Lymphproliferation an Milzzellen
6: Immunogenität von MAGE-3 in Mäusen (C57BL6); Lymphproliferation an Lymphknotenzellen
7: Immunogenität von MAGE-3 in Mäusen (BalbC); Lymphproliferation an Milzzellen
8: Immunogenität von MAGE-3 in Mäusen (BalbC); Lymphproliferation an Lymphknotenzellen der Kniekehle
9: Anti-MAGE-3-Antikörper im Serum von Mäusen, die mit LipoD-MAGE-3-His in SBAS2 immunisiert wurden oder nicht
10: Unterklassen-spezifische Antikörperreaktionen in BalbC-Mäusen
11: Unterklassen-spezifische Antikörperreaktionen in C57BL/6-Mäusen
12: Fusionsprotein NS1-MAGE-3-His
13: Konstruktion von Plasmid pRIT14426
14: Plasmidkarte von pRIT14426
15: Fusionsprotein CLytA-MAGE-1-His
16: Konstruktion von Plasmid pRIT14613
17: Konstruktion von Plasmid pRIT14614
18: Fusionsprotein CLytA-MAGE-3-His
19: Konstruktion von Plasmid pRIT14646
Beispiel I
Herstellung des rekombinanten E. coli-Stammes, der das Fusionsprotein Lipoprotein D-MAGE-3-His (LPD 1/3-MAGE-3-His oder LpD-MAGE-3-His) exprimiert
1. Das E. coli-Expressionssystem:
Für die Herstellung von Lipoprotein D wurde die Protein D codierende DNA in den Expressionsvektor pMG81 kloniert. Dieses Plasmid nutzt Signale als Lambda-Phagen-DNA, um die Transkription und Translation von inserierten Fremdgenen anzutreiben. Der Vektor enthält den Lambda-PL-Promotor PL, Operator OL und zwei Nutzorte (NutL und NutR), um transkriptionelle Polaritätswirkungen abzulassen, wenn N-Protein bereitgestellt wird (Gross et al., Mol. & Cell. Biol., 1985, 5:1015). Vektoren, die den PL-Promotor enthalten, werden in einen lysogenen E. coli-Wirt eingeführt, um die Plasmid-DNA zu stabilisieren. Lysogene Wirtsstämme enthalten Vervielfältigungs-mangelhafte Lambda-Phagen-DNA, die in das Genom integriert ist (Shatzman et al., 1983, "Experimental Manipulation of Gene Expression", Inouya (Hrsg.), S. 1–14, Academic Press NY). Die Lambda-Phagen-DNA richtet die Synthese des cI-Repressorproteins aus, das an den OL-Repressor des Vektors bindet und die Bindung von RNA-Polymerase an den PL-Promotor und dadurch die Transkription des inserierten Gens verhindert. Das cI-Gen des Expressionsstammes AR58 enthält eine temperaturempfindliche Mutation, so daß die PL-gerichtete Transkription durch Temperaturverschiebung reguliert werden kann, d.h. eine Zunahme der Kulturtemperatur inaktiviert den Repressor, und die Synthese des Fremdproteins wird eingeleitet. Dieses Expressionssystem erlaubt die kontrollierte Synthese von Fremdproteinen, speziell von denjenigen, die toxisch für die Zell sein können (Shimataka & Rosenberg, 1981, Nature, 292:128).
2. Der E. coli-Stamm AR58:
Der lysogene E. coli-Stamm AR58, der zur Herstellung des LPD-MAGE-3-His-Proteins verwendet wird, ist ein Derivat des NIH E. coli K12 Standardstammes N99 (F-su-gal K2, LacZ- thr-). Er enthält einen defekten lysogenen Lambda-Phagen (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Der Phänotyp Kil- verhindert das Abschalten der makromolekularen Synthese des Wirtes. Die cI857-Mutation überträgt eine temperaturempfindliche Schädigung auf den cI-Repressor. Die DH1-Deletion entfernt das rechte Operon des Lambda-Phagen und die bio-, uvr3- und chlA-Orte des Wirtes. Der AR58-Stamm wurde durch Transduktion von N99 mit einem zuvor auf einem SA500-Derivat gezüchteten P-Lambda-Phagen-Vorrat erzeugt (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). Die Einführung des defekten Lysogens in N99 wurde mit Tetracyclin aufgrund der Gegenwart eines TN10-Transposons selektiert, das für Tetracyclinresistenz im benachbarten galE-Gen codiert. N99 und SA500 sind E. coli K12-Stämme, die aus dem Labor von Dr. Martin Rosenberg an den National Institutes of Health stammt.
3. Konstruktion des zur Expression des rekombinanten Proteins LPD-MAGE-3-His geschaffenen Vektors:
Die Überlegung war es, MAGE-3 als Fusionsprotein unter Verwendung des N-terminalen Drittels des lipidierten Protein D als Fusionspartner, verbun den am N-Terminus von MAGE-3, und einer Sequenz aus mehreren Histidinresten (His-Schwanz), plaziert an seinem C-Terminus, zu exprimieren.
Protein D ist ein Lipoprotein (ein Immunglobulin D-bindendes Protein mit 42 kDa, das auf der Oberfläche des Gram-negativen Bakteriums Hämophilus influenzae exponiert ist). Das Protein wird als Vorstufe mit einer Signalsequenz mit 18 Aminosäureresten synthetisiert, enthaltend eine Consensus-Sequenz für bakterielles Lipoprotein (WO 91/18926).
Wenn die Signalsequenz eines Lipoproteins während der Sezernierung verarbeitet wird, wird das Cys (an Position 19 im Vorläufermolekül) der Amino-terminale Rest und wird gleichzeitig durch kovalente Anbindung sowohl estergebundener als auch amidgebundener Fettsäuren modifiziert.
Die an den Amino-terminalen Cysteinrest gebundenen Fettsäuren fungieren dann als Membrananker.
Das Plasmid, das das Fusionsprotein exprimiert, wurde zur Expression eines Vorläuferproteins geschaffen, das die Signalsequenz mit 18 Aminosäuren und die ersten 109 Reste des gereiften Protein D, zwei unabhängige Aminosäuren (Met und Asp), die Aminosäurereste 2 bis 314 aus MAGE-3 und zwei Gly-Reste, die als Gelenkregion fungieren, um die anschließenden sieben His-Reste freizulegen, enthält.
Der rekombinante Stamm erzeugt somit das gereifte lipidierte Fusionsprotein mit His-Schwanz und 432 Aminosäuren Länge (siehe 1), wobei die Aminosäuresequenz in ID NO: 1 beschrieben ist und die codierende Sequenz in ID NO: 2 beschrieben ist.
4. Klonierungsstrategie für die Erzeugung des LPD-MAGE-3-His-Fusionsproteins (Vektor pRIT14477):
Ein cDNA-Plasmid (von Dr. Thierry Boon vom Ludwig Institute), das die codierende Sequenz für das MAGE-3-Gen enthält (B. Gaugler et al., 1994), und der Vektor pRIT14586, der den N-terminalen Teil der Lipo-D-1/3-codierenden Sequenz enthält (hergestellt wie in 2 umrissen), wurden verwendet. Die Klonierungsstrategie schloß die folgenden Schritte ein (3).

a) PCR-Amplifikation der in der Plasmid-cDNA MAGE-3 dargestellten Sequenzen unter Verwendung des Oligonukleotids sense: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct und des Oligonukleotids antisense: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa; diese Amplifikation führt zu den folgenden Modifikationen am N-Terminus: Wechsel der ersten fünf Codonen zu E. coli-Codonenverwendung, Austausch des Pro-Codons gegen ein Asp-Codon in Position 1, Installation eines NcoI-Ortes am 5'-Ende und schließlich Addition von zwei Gly-Codonen und den 7 His-Codonen gefolgt von einem XbaI-Ort am C-Terminus.
b) Klonierung des oben amplifizierten Fragments in den TA-Klonierungsvektor von Invitrogen und Herstellung des intermediären Vektors pRIT14647.
c) Ausschneiden des NcoI-XbaI-Fragments aus Plasmid pRIT14647 und Klonieren in den Vektor pRIT14586.
d) Transformation des Wirtsstammes AR58.
e) Selektion und Charakterisierung der Transformanten des E. coli-Stammes, die das Plasmid pRIT14477 enthalten und das LPD-MAGE-3-His-Fusionsprotein exprimieren.

Beispiel II
Herstellung von LPD1/3-MAGE-3-His-Antigen
1. Züchtung und Induktion des bakteriellen Stammes – Expression von LDP1/3-MAGE-3-His:
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14477, wurden in 2 l-Kolben gezüchtet, die jeweils 400 ml LY12-Medium enthielten, ergänzt mit Hefeextrakt (6,4 g/l) und Kanamycinsulfat (50 mg/l). Nach Inkubation auf einem Schütteltisch bei 30°C für 8 ± 1 h wurde eine kleine Probe aus jedem Kolben zur mikroskopischen Untersuchung entfernt. Der Inhalt der zwei Kolben wurde vereinigt, um das Inokulum für den 20 l-Fermenter bereitzustellen.
Das Inokulum (ca. 800 ml) wurde in einen vorsterilisierten 20 l-Fermenter (Gesamtvolumen) gegeben, der 7 l Medium enthielt, ergänzt mit 50 mg/l Kanamycinsulfat. Der pH wurde durch periodische Zugabe von NH₄OH (25 % V/V) auf 6,8 eingestellt und gehalten, und die Temperatur wurde auf 30°C eingestellt und gehalten. Die Belüftungsrate wurde auf 12 l Luft/min eingestellt und gehalten, und der gelöste Sauerstoffdruck wurde auf 50 % der Sättigung durch Prozeßsteuerung der Rührgeschwindigkeit gehalten. Der Überdruck im Fermenter wurde auf 500 g/cm² (0,5 bar) gehalten.
Die Zulauf-Kultivierung wurde durch kontrollierte Zugabe einer Kohlenstoffutterlösung durchgeführt. Die Futterlösung wurde mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0,04 ml/min zugegeben und exponentiell während der ersten 42 Stunden erhöht, um eine Wachstumsgeschwindigkeit von 0,1 h^–1 zu halten.
Nach 42 Stunden wurde die Temperatur im Fermenter schnell auf 39°C erhöht, und die Zufuhrgeschwindigkeit wurde konstant auf 0,005 ml/g DWC/min während der Induktionsphase für weitere 22–23 Stunden gehalten, wobei wäh rend dieser Zeit die intrazelluläre Expression von LPD-MAGE-3-His eine maximale Höhe erreichte.
Teilmengen (15 ml) der Bouillon wurden in regelmäßigen Intervallen während der Wachstums/Induktionsphasen und am Ende der Fermentation entnommen, um die Kinetik des mikrobiellen Wachstums und der intrazellulären Produktexpression zu verfolgen und um zusätzlich Proben für mikrobielle Identifizierungs/Reinheitsuntersuchungen zu liefern.
Am Ende der Fermentation war die optische Dichte der Kultur zwischen 80 und 120 (entsprechend einer Zellkonzentration zwischen 48 und 72 g DCW/l), und das Gesamtflüssigkeitsvolumen betrugt circa 12 l. Die Kultur wurde schnell auf 6 bis 10°C abgekühlt, und die Zellen von ECK32 wurden von der Kulturbouillon durch Zentrifugieren mit 5.000 x g bei 4°C für 30 min getrennt. Die auf konzentrierten Zellen von ECK32 wurden schnell in Kunststoffbeuteln gelagert und unmittelbar auf –80°C eingefroren.
2. Extraktion des Proteins:
Die eingefrorenen konzentrierten Zellen von ECK32 wurden auf 4°C aufgetaut, bevor sie in einem Zellaufschlußpuffer auf eine optische Enddichte von 60 resuspendiert wurden (entsprechend einer Zellkonzentration von circa 36 g DCW/l).
Die Zellen wurden durch zwei Durchläufe durch einen Hochdruckhomogenisator (1.000 bar) aufgeschlossen. Die aufgebrochene Zellsuspension wurde zentrifugiert (x 10.000 g bei 4°C für 30 min), und die Pelletfraktion wurde zweimal mit Triton X100 (1 % G/V) + EDTA (1 mM) gewaschen, gefolgt von einer Spülung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) + Tween 20 (0,1 % V/V) und schließlich einer Spülung mit PBS. Zwischen jeder Waschstufe wurde die Suspension mit 10.000 x g für 30 min bei 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Pelletfraktion zurückbehalten.
Beispiel III
Charakterisierung des Fusionsproteins Lipo D – MAGE-3
1. Reinigung:
LPD-MAGE-3-His wurde aus dem Zellhomogenat unter Verwendung einer Sequenz von nachfolgend beschriebenen Schritten gereinigt:

a) Solubilisierung der gewaschenen Pelletfraktion aus dem Zellaufschluß,
b) chemische Reduktion von Intra- und Interproteindisulfidbindungen, gefolgt von Blockieren von Thiolgruppen zur Verhinderung der oxidativen erneuten Kupplung,
c) Mikrofiltration der Reaktionsmischung zur Entfernung von teilchenförmigen Stoffen und Reduktion von Endotoxinen,
d) Einfangen und primäre Reinigung von LPD-MAGE-3-His durch Ausnutzen der Affinitätswechselwirkung zwischen dem Polyhistidinschwanz und Zinkbeladener komplexierender Sepharose,
e) Entfernung von verunreinigenden Proteinen durch Anionenaustauscherchromatografie.

Das gereinigte LPD-MAGE-3-His wurde einer Anzahl von Aufbereitungsstufen unterworfen:

f) Pufferaustausch/Harnstoffentfernung durch Größenausschlußchromatographie unter Verwendung von Superdex 75,
g) Filtration im Prozeß,
h) Pufferaustausch/Entsalzung durch Größenausschlußchromatografie unter Verwendung von Sephadex G25.

Jeder dieser Schritte wird nachfolgend in größerem Detail beschrieben:
1.1) Solubilisierung des Zellhomogenat-Pellets
Die Pelletfraktion aus der letzten Waschstufe (wie oben beschrieben) wurde über Nacht in 800 ml einer Lösung aus Guanidinhydrochlorid (6 M) und Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) bei 4°C resolubilisiert.
1.2) Reduktion und Carboxymethylierung
Das solubilisierte Material (eine blaßgelbe, trübe Suspension) wurde mit Argon gespült, um etwaigen verbleibenden Sauerstoff auszutreiben, und eine Vorratslösung aus 2-Mercaptoethanol (14 M) wurde auf eine Endkonzentration von 4,3 M hinzugegeben (was 0,44 ml 2-Mercaptoethanol pro ml Lösung entsprach).
Die resultierende Lösung wurde aufgeteilt und in zwei Glaskolben überführt, die beide auf 95°C in einem Wasserbad erwärmt wurden. Nach 15 Minuten bei 95°C wurden die Kolben aus dem Wasserbad entfernt und abkühlen gelassen, worauf der Inhalt in einem mit Folie bedeckten Becherglas (5 l) vereinigt wurde, auf Eis gestellt wurde und festes Iodacetamid unter kräftigem Vermischen auf eine Endkonzentration von 6 M hinzugegeben wurde (was 1,11 g Iodacetamid pro ml Lösung entsprach). Die Mischung wurde auf Eis im Dunkeln für 1 Stunde gehalten, um eine vollständige Solubilisierung von Iodacetamid sicherzustellen, bevor sie durch Zugabe von circa 1 l Natriumhydroxid (5 M) auf einen End-pH von 7,5–7,8 neutralisiert wurde (unter Beibehalten des kräftigen Vermischens und fortgesetzter pH-Überwachung).
Die resultierende Mischung wurde auf Eis im Dunkeln für weitere 30 Minuten gehalten, worauf der pH erneut auf pH 7,5–7,8 eingestellt wurde.
1.3) Mikrofiltration
Die Mischung wurde in einer Amicon Proflux M12-Einheit mit tangentiellem Fluß, ausgerüstet mit einer Minikros-Hohlfaserkartusche (Ref. Nr. M22M-600-01N; Fläche 5.600 cm², 0,2 μm), mikrofiltriert. Das Permeat wurde für die anschließende chromatografische Reinigung zurückbehalten.
1.4) Metall-(Zn²⁺)-Chelatchromatografie (IMAC)
Metallchelatchromatografie wurde mit komplexierender Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 17-0575-01) durchgeführt, gepackt in einer BPG 100/500-Säule (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 18-1103-01). Die Abmessungen des gepackten Bettes waren: Durchmesser 10 cm; Querschnittsfläche 79 cm²; Betthöhe 19 cm; gepacktes Volumen 1,500 ml. Die leere Säule wurde mit Natriumhydroxid (0,5 M) desinfiziert und dann mit gereinigtem Wasser gewaschen.
Der Träger (geliefert in 20 % V/V Ethanol) wurde mit gereinigtem Wasser (8 l) an einem Büchner-Trichter (unter Vakuum) gewaschen und mit Zink beladen, indem wenigstens 15 l einer Lösung von ZnCl₂ (0,1 M) hindurchgeleitet wurden. Überschüssiges Zink wurde durch Waschen des Träger mit 10 l gereinigtem Wasser entfernt, bis der pH der ausfließenden Flüssigkeit den pH der ZnCl₂-Lösung (pH 5,0) erreichte. Der Träger wurde dann mit 4 l einer Lösung äquilibriert, die Guanidinhydrochlorid (6 M) und Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) enthielt.
Das Permeat aus der Mikrofiltration, das LPD-MAGE-3-His enthielt, wurde mit dem Träger vermischt (diskontinuierliche Bindung), bevor die BPG-Säule mit der Lösung, die Guanidinhydrochlorid (6 M) und Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) enthielt, beladen und gepackt wurde.
Die nächsten Stufen der Metallchelatchromatografie wurden bei einer Elutionsmittel-Fließgeschwindigkeit von 60 ml/min durchgeführt. Die Säule wurde zuerst mit der Lösung gewaschen, die Guanidinhydrochlorid (6 M) und Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) enthielt, und dann mit der Lösung, die Harnstoff (6 M) und Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) enthielt, bis das Säulen-Elutionsmittel keine Extinktion bei OD_280nm (Basislinie) erreichte.
Die halbgereinigte LPD-MAGE-3-His-Proteinfraktion wurde mit 2 Säulenvolumina einer Lösung eluiert, die Harnstoff (6 M), Natriumphosphat (0,1 M, pH 7,0) und Imidazol (0,5 M) enthielt. Die Leitfähigkeit dieser Fraktion betrug circa 16 mS/cm.
1.5) Anionenaustauscherchromatografie
Vor dem Fortsetzen der Anionenaustauscherchromatografie wurde die Leitfähigkeit der halbgereinigten LPD-MAGE-3-His-Proteinfraktion auf circa 4 mS/cm durch Verdünnung mit einer Lösung reduziert, die Harnstoff (6 M) und Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) enthielt.
Anionenaustauscherchromatografie wurde unter Verwendung von Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 17-0510-01) durchgeführt, gepackt in einer BPG 200/500-Säule (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 18-1103-11). Die Abmessungen des gepackten Bettes waren: Durchmesser 10 cm; Querschnittsfläche 314 cm²; Betthöhe 9 cm; gepacktes Volumen 2.900 ml.
Die Säule wurde gepackt (mit 20 % V/V Ethanol) und mit 9 l gereinigtem Wasser bei einer Elutionsmittel-Fließgeschwindigkeit von 70 ml/min gewaschen. Die gepackte Säule wurde mit 3 l Natriumhydroxid (0,5 M) desinfiziert, mit 30 l gereinigtem Wasser gewaschen und dann mit 6 l einer Lösung äquilibriert, die Harnstoff (6 M) und Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) enthielt. Das verdünnte, halbgereinigte LPD-MAGE-3-His wurde auf die Säule geladen und dann mit 9 leiner Lösung gewaschen, die Harnstoff (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) und Tween (0,1 %) enthielt, bis die Extinktion (280 nm) des Elutionsmittels auf Null abfiel.
Ein weiterer Waschschritt wurde mit 6 l einer Lösung durchgeführt, die Harnstoff (6 M) und Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) enthielt.
Das gereinigte LPD-MAGE-3-His wurde aus der Säule mit einer Lösung eluiert, die Harnstoff (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) und NaCl (0,25 M) enthielt.
1.6) Größenausschlußchromatografie
Die Entfernung von Harnstoff aus gereinigtem LPD-MAGE-3-His und der Pufferaustausch wurden beide durch Größenausschlußchromatografie erreicht. Diese wurden unter Verwendung von Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 17-1044-01) durchgeführt, gepackt in einer XK 50/100-Säule (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 18-8753-01). Die Abmessungen des gepackten Bettes waren: Durchmesser 5 cm; Querschnittsfläche 19,6 cm²; Betthöhe 90 cm; gepacktes Volumen 1.800 ml.
Die Säule wurde in Ethanol (20 %ig) gepackt und mit 5 l gereinigtem Wasser mit einer ausströmenden Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min gewaschen. Die Säule wurde mit 2 l Natriumhydroxid (0,5 M) desinfiziert, mit 5 l gereinigtem Wasser gewaschen und dann mit 5 l phosphatgepufferter Kochsalzlösung äquilibriert, die Tween 80 (0,1 % V/V) enthielt.
Die gereinigte LPD-MAGE-3-His-Fraktion (maximal 500 ml/entsalzender Durchlauf) wurde auf die Säule mit einer Elutionsmittel-Fließgeschwindig keit von 20 ml/min geladen. Das entsalzte gereinigte LPD-MAGE-3-His wurde aus der Säule mit 3 l PBS eluiert, das Tween 80 (0,1 % V/V) enthielt.
Die LPD-MAGE-3-His enthaltende Fraktion eluierte im Leervolumen der Säule.
1.7) Filtration während des Prozesses
Das Volumen von LPD-MAGE-3-His aus der Größenausschlußchromatografie wurde durch eine 0,22 μm-Membran in einem Abzug mit laminarem Fluß (Klasse 10.000) filtriert. Das filtrierte Volumen wurde auf –80°C eingefroren und bis zum Entsalzungsschritt gelagert.
1.8) Entsalzende Chromatografie
Da die Osmolalität des Endvolumens weniger als 400 mOsm sein sollte, war ein weiterer Pufferaustauschschritt erforderlich, um die Salzkonzentration zu reduzieren. Dies wurde durch einen entsalzenden chromatografischen Schritt unter Verwendung von Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 17-0033-02) durchgeführt, gepackt in einer BPG 100/950-Säule (Pharmacia Biotechnology Katalog-Nr. 18-1103-03). Die Abmessungen des gepackten Bettes waren: Durchmesser 10 cm; Querschnittsfläche 78,6 cm²; Betthöhe 85 cm; gepacktes Volumen 6.500 ml.
Das Sephadex G25 wurde mit 7 l gereinigtem Wasser hydratisiert und über Nacht bei 4°C quellen gelassen. Das Gel wurde dann in die Säule mit reinem Wasser mit einer Elutionsmittel-Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min gepackt.
Die Säule wurde mit 6 l Natriumhydroxid (0,5 M) desinfiziert und dann mit 10 l einer Lösung äquilibriert, die Natriumphosphat (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) und Tween 80 (0,1 % V/V) enthielt.
Die gereinigte LPD-MAGE-3-His-Fraktion (maximal 1.500 ml/Entsalzungsschritt) wurde auf die Säule mit einer Elutionsmittel-Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min geladen. Die entsalzte gereinigte LPD-MAGE-3-His-Fraktion eluierte im Leervolumen der Säule, wurde durch eine 0,22 μm-Membran steril filtriert und bei –80°C gelagert.
Das fertige Protein in der Masse wird auf +4°C aufgetaut, bevor es in Teilmengen in Fläschchen aufgeteilt und in einem Lactose-Exzipienten (3,2 %) gefriergetrocknet wird.
2. Analyse an Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen:
Das gereinigte LPD-MAGE-3-His-Antigen wurde durch SDS-PAGE an einem 12,5 %igen Acrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen analysiert.
Die Proteinbeladung betrug 50 μg für die Coomassie Blue-Anfärbung und 5 μg für die Silbernitrat-Anfärbung. Die klinische Charge 96K19 und die Pilotcharge 96J22 wurden analysiert. Eine Hauptbande, die einem Molekulargewicht von 60 kDa entsprach, wurde visualisiert. Zwei zusätzliche Nebenbanden mit circa 45 kDa und 35 kDa wurden ebenfalls beobachtet.
3. Western-Blot-Analyse:
Die durch SDS-PAGE-Analyse des LPD-MAGE-3-His-Proteins dargestellten Peptide wurden durch Western-Blot unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern der Maus identifiziert. Diese Antikörper wurden inhäusig unter Verwendung einer gereinigten Zubereitung des MAGE-3-His-Proteins entwickelt (dieses Protein enthält nicht den LPD-Teil von LPD-MAGE-3-His).
Zwei monoklonale Antikörperzubereitungen (Mab22 und Mab54) wurden auf Basis ihrer Eignung für die Western-Blot-Analyse ausgewählt und im Identitätstest für die Chargenfreigabe verwendet. 4 zeigt die für die Chargen 96K19 und 96J22 nach Anfärbung mit Mabs 32 und 54 erhaltenen Bandmuster. Sechshundert (600) ng Protein wurden an einem 12,5 %igen SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nylonmembran überführt, mit Mabs 32 und 54 (60 μg/ml) umgesetzt und mit an Peroxidase gekoppelten Anti-Maus-Antikörpern dargestellt.
Die durch SDS-PAGE nachgewiesenen 60 kDa- und 30 kDa-Peptide werden durch beide Mabs aufgedeckt.
Beispiel IV
1. Impfstoffherstellung unter Verwendung von LPD-MAGE-3-His-Protein
Der in diesen Experimenten verwendete Impfstoff wird aus einer rekombinanten DNA hergestellt, die ein Lipoprotein D 1/3-MAGE-3-His codiert, exprimiert in E. coli aus dem Stamm AR58, entweder mit Hilfsstoff versetzt oder nicht. Als Hilfsstoff umfaßt die Formulierung eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) und QS21 in einer Öl/Wasser-Emulsion. Das Hilfsstoffsystem SBAS2 wurde zuvor in WO 95/17210 beschrieben.
3D-MPL: ist ein aus dem Lipopolysaccharid (LPS) des Gram-negativen Bakteriums Salmonella minnesota stammendes Immunstimulans. MPL wurde desacyliert, und ihm fehlt eine Phosphatgruppe an der Lipid A-Einheit. Diese chemische Behandlung reduziert dramatisch die Toxizität, während die immunstimulierenden Eigenschaften bewahrt werden (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry stellt her und liefert MPL an SB-Biologicals. Bei SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben gezeigt, daß 3D-MPL, das mit verschiedenen Trägern kombiniert wird, sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunität vom TH1-Typ stark steigert.
QS21: ist ein natürliches, aus der Rinde des südamerikanischen Baumes Quillaja saponaria Molina extrahiertes Saponinmolekül. Eine zur Trennung der individuellen Saponine aus den Rohextrakten der Rinde entwickelte Reinigungstechnik erlaubte die Isolierung des besonderen Saponins QS21, das ein Triterpenglycosid ist, das im Vergleich zur Stammkomponente eine stärkere Hilfsstoffaktivität und geringere Toxizität zeigt. Es wurde gezeigt, daß das QS21 MHC Klasse I-beschränkte CTLs gegen mehrere Untereinheiten-Ags aktiviert sowie die Ag-spezifische Lymphozytenproliferation stimuliert (Kensil, 1992). Aquila (vormals Cambridge Biotech Corporation) stellt QS21 her und liefert es an SB-Biologicals.
Bei SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben eine eindeutige synergistische Wirkung von Kombinationen aus MPL und QS21 zur Induktion sowohl humoraler als auch zellulärer Immunreaktionen vom TH1-Typ gezeigt.
Die Öl/Wasser-Emulsion ist aus einer organischen Phase, die aus 2 Ölen hergestellt wird (ein Tocopherol und Squalen), und einer wäßrigen Phase aus PBS zusammengesetzt, die Tween 80 als Emulgator enthält. Die Emulsion umfaßte 5 % Squalen, 5 % Tocopherol, 0,4 % Tween 80 und besaß eine durchschnittliche Teilchengröße von 180 nm und ist als SB62 bekannt (siehe WO 95/17210).
Bei SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben nachgewiesen, daß die Zugabe dieser O/W-Emulsion zu 3D-MPL/QS21 (SBAS2) die immunstimulierenden Eigenschaften des letzteren gegen verschiedene Untereinheiten-Antigene weiter erhöht.
2. Herstellung von Emulsion SB62 (2-faches Konzentrat)
Tween 80 wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, um eine 2 %ige Lösung in PBS zu ergeben. Um 100 ml einer 2-fach konzentrierten Emulsion zu ergeben, werden 5 g DL-alpha-Tocopherol und 5 ml Squalen verwirbelt, um sie sorgfältig zu vermischen. 90 ml der PBS/Tween-Lösung werden hinzugegeben und sorgfältig vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritze geleitet und schließlich unter Verwendung einer M110S Microfluidics-Vorrichtung mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von circa 180 nm.
3. Herstellung von Lipoprot. D1/3-MAGE-3-His QS21/3D-MPL-Öl-in-Wasser-(SBAS2)-Formulierung
Der Hilfsstoff wird als Kombination aus MPL und QS21 in einer Öl/Wasser-Emulsion formuliert. Diese Zubereitung wird in 0,7 ml-Fläschchen zum Vermischen mit dem lyophilisierten Antigen überführt (die Fläschchen enthalten 30 bis 300 μg Antigen).
Die Zusammensetzung des Hilfsstoffverdünnungsmittels für den lyophilisierten Impfstoff ist wie folgt:
Der fertige Impfstoff wird nach Rekonstituierung der lyophilisierten LPD-MAGE-3-His-Zubereitung mit dem Hilfsstoff oder mit PBS allein erhalten.
Die Hilfsstoffkontrollen ohne Antigen wurden durch Austauschen des Proteins gegen PBS hergestellt.
4. Impfstoff-Antigen: Fusionsprotein Lipoprotein D1/3-MAGE-3-His
Lipoprotein D ist ein auf der Oberfläche der Gram-negativen Bakterien Hämophilus influenzae freiliegendes Lipoprotein.
Der Einschluß der ersten 109 Reste des gereiften Protein D als Fusionspartner wird aufgenommen, um das Impfstoff-Antigen mit T-Zell-Epitopen zu versehen. Neben der LPD-Einheit enthält das Protein zwei Aminosäuren ohne Bezug (Met und Asp), Aminosäurereste 2 bis 314 aus MAGE-3 und zwei Gly-Reste, die als Gelenkregion fungieren, um die anschließenden sieben His-Reste freizulegen.
Beispiel V
1. Immunigenität von LPD-MAGE-3-His in Mäusen und Affen
Zur Untersuchung der Antigenität und Immunogenität des humanen MAGE-3-Proteins wurde der Testimpfstoff in 2 unterschiedliche Mäusestämme (C57BL/6 und Balb/C) injiziert, die in ihrem genetischen Hintergrund und MHC-Allelen variieren. Für beide Mäusestämme wurden potentielle Peptidmotive MHC Klasse I und MHC Klasse II theoretisch für den MAGE-Teil des LPD-MAGE-3-His-Fusionsproteins vorhergesagt.
a) Immunisierungsprotokoll:
5 Mäusen aus jedem Stamm wurden zweimal in 2-wöchigen Intervallen in die Fußsohle 5 μg LPD-MAGE-3-His injiziert, formuliert oder nicht in SBAS2 mit 1/10 der in den humanen Einstellungen verwendeten Konzentration.
b) Proliferationstest:
Lymphozyten wurden durch Zerdrücken der Milz oder der Lymphknoten der Kniekehle aus den Mäusen 2 Wochen nach der letzten Injektion präpariert. 2 × 10⁵ Zellen wurden in dreifacher Ausführung in Platten mit 96 Vertiefungen plaziert, und die Zellen wurden in vitro für 72 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen (1-0,1 μg/ml) von His-MAGE-3 als solches oder aufgetragen auf Latex-Mikroperlen restimuliert.
Eine erhöhte MAGE-3-spezifische lymphproliferative Aktivität wurde sowohl in den Milzzellen (siehe 5 und 7) als auch in den Lymphknotenzellen (siehe 6 und 8) aus C57BL/6- oder Balb/C-Mäusen beobachtet, denen das LPD-MAGE-3-His-Protein injiziert worden war, verglichen mit der lymphproliferativen Reaktion von Mäusen, die die SBAS-2-Formulierung allein oder PBS erhalten hatten.
Außerdem wurde eine signifikant höhere proliferative Reaktion bei Lymphozyten aus Mäusen erhalten, die mit LPD-MAGE-3-His im Hilfsstoff SBAS2 immunisiert worden waren (siehe 6 und 8).
c) Schlußfolgerung:
LPD-MAGE-3-His ist immunogen in Mäusen, und diese Immunogenität kann durch Verwendung der SBAS2-Hilfsstofformulierung erhöht werden.
2. Antikörperreaktion
a) Immunisierungsprotokoll:
Balb/C- oder C57BL/6-Mäuse wurden durch 2 Injektionen in den Fußballen in 2-wöchigen Intervallen mit entweder PBS oder SBAS2 oder 5 μG LPD-MAGE-3-His oder 5 μG LPD-MAGE-3-His + SBAS2 immunisiert.
Drei und fünf Tiere wurden in den Kontrollgruppen bzw. in den untersuchten Gruppen verwendet.
b) Indirektes ELISA:
Zwei Wochen nach der zweiten Injektion wurden individuelle Seren entnommen und einem indirekten ELISA unterworfen.
2 μG/ml von gereinigtem His-MAGE-3 wurden als beschichtetes Antigen verwendet. Nach Sättigung während 1 Stunde bei 37°C in PBS + 1 % Serum aus neugeborenem Kalb wurden die Seren seriell (beginnend mit 1/1000) im Sättigungspuffer verdünnt und über Nacht bei 4°C oder für 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Waschen in PBS/Tween 20, 0,1 %, wurden biotinylierte Ziege-anti-Maus-Voll-IgG (1/1000) oder Ziege-anti-Maus-IgG1-, -IgG2a-, -IgG2b-Antiseren (1/5000) als zweite Antikörper verwendet. Nach 90 Minuten Inkubation bei 37°C wurde Peroxidase-gekoppeltes Streptavidin hinzugegeben, und TMB (Tetramethylbenzidinperoxid) wurde als Substrat verwendet. Nach 10 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von H₂SO₄ 0,5 M blockiert, und der OD-Wert wurde bestimmt.
c) Ergebnisse:
9 vergleicht zwischen den unterschiedlichen Gruppen von Mäusen (N = 5/Gruppe) den relativen mittleren Mittelpunkttiter der Seren, der aus der mittleren Verdünnung besteht, die zum Erreichen des Mittelpunktes der Kurven benötigt wird.
Diese Ergebnisse zeigen, daß in beiden untersuchten Mäusestämmen eine schwache Ab-Reaktion nach 2 Injektionen von LPD-MAGE-3-His allein hervorgerufen wird, aber daß höhere Anti-MAGE-3-Ab-Konzentrationen erzeugt werden, wenn LPD-MAGE-3-His in Gegenwart von SBAS2 injiziert wird. So sind nur 2 Injektionen von LPD-MAGE-3-His + SBAS2 in einem 2-wöchigen Intervall ausreichend, um die hohe beobachtete Ab-Reaktion zu erzeugen.
Die in den Balb/C-Mäusen beobachtete bessere Ab-Reaktion im Vergleich zu der in den C57BL/6-Mäusen erhaltenen Reaktion kann durch Unterschiede in den Haplotypen oder im Hintergrund zwischen diesen 2 Stämmen erklärt werden, obwohl der in den C57BL/6-Mäusen erreichte Ab-Titer auch höher nach Injektionen von LPD-MAGE-3-His + SBAS2 als nach den Injektionen mit LPD-MAGE-3-His allein ist.
Die Ig-Unterklassen-spezifischen Anti-MAGE-3-Reaktionen nach Impfungen in den unterschiedlichen Gruppen von Mäusen sind in den 10 und 11 ersichtlich, die einen Vergleich der mittleren Mittelpunktverdünnung der Seren liefern.
Weder IgA noch IgM wurden in irgendeiner der Serumproben selbst aus den Mäusen nachgewiesen, die mit LPD-MAGE-3-His im Hilfsstoff SBAS2 geimpft waren.
Im Gegensatz war der IgG-Gesamtspiegel geringfügig höher in den Seren aus Mäusen, die mit LPD-MAGE-3-His allein geimpft waren, und signifikant erhöht in den Seren aus Tieren, denen LPD-MAGE-3-His in SBAS2 injiziert worden war.
Die Analyse der unterschiedlichen IgG-Unterklassenkonzentrationen zeigt, daß eine gemischte Ab-Reaktion in den Mäusen induziert wurde, da die Spiegel aller untersuchten IgG-Unterklassen (IgG1, IgG2a, IgG2b) höher in den mit dem mit Hilfsstoff versetzten Ag geimpften Mäusen als in den Mäusen waren, denen Ag oder Hilfsstoff allein injiziert worden war.
Die Natur dieser gemischten Ab-Reaktion nach Impfung mit LipoD-MAGE-3 in Gegenwart von SBAS2 scheint jedoch vom Mausstamm abzuhängen, da IgG1 und IgG2b vorherrschend in den Seren von Balb/C- bzw. C57BL/6-Mäusen gefunden wurden.
3. Immunigenität von Lipoprotein D1/3-MAGE-3-His + SBAS2-Hilfsstoff in Rhesusaffen
Drei Gruppen von fünf Rhesusaffen (Macaca mulatta) wurden ausgewählt. RTS, S und gp120 wurden als Positivkontrolle verwendet.
Gruppen:
Gruppe 1

rechtes Bein: RTS, S/SBAS2
linkes Bein: GP120/SBAS2

Gruppe 2

rechtes Bein: RTS, S/SB26T
linkes Bein: GP120/SB26T

Gruppe 3

rechtes Bein: LipoD1/3-MAGE-3-His/SBAS2

Die Tiere erhielten Impfstoff am Tag 0 und wurden am Tag 28 und 84 aufgefrischt mit Blutabnahme, um ihre Antikörperreaktion auf sowohl die MAGE-3- als auch Protein D-Komponente zu bestimmen. Die Impfstoffe wurden intramuskulär als Bolusinjektion (0,5 ml) in den hinteren Teil des rechten Beins verabreicht.
Kleine Blutproben wurde alle 14 Tage entnommen. Nicht-heparinisierte Blutproben von 3 ml wurden aus der Oberschenkelvene entnommen, für wenigstens 1 Stunde gerinnen gelassen und bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit 2.500 U/min zentrifugiert.
Serum wurde entfernt, bei –20°C eingefroren und zur Bestimmung der Antikörperspiegel durch spezifisches ELISA versendet.
Mikroplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb Nunc) wurden entweder mit 5 μg His-MAGE-3 oder Protein D über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach 1 Stunde Sättigung bei 37°C mit PBS NCS 1 % wurden serielle Verdünnungen der Kaninchenseren für 1 h 30 bei 37°C (beginnend mit 1/10) hinzugegeben, und nach 3 Spülungen in PBS Tween wurde biotinyliertes Anti-Kaninchen-Serum (Amersham Referenz RPN 1004 Charge 88) hinzugegeben (1/5000). Die Platten wurden gewaschen, und Peroxidase-gekoppeltes Streptavidin (1/5000) wurde für 30 Minuten bei 37°C hinzugegeben. Nach Waschen wurden 50 μl TMB (BioRad) für 7 Minuten hinzugegeben, die Reaktion wurde mit H₂SO₄ 0,2 M beendet, und der OD-Wert wurde bei 450 nm gemessen. Mittelpunktverdünnungen wurden durch SoftmaxPro berechnet.
Antikörperreaktion
Kleine Blutproben wurden alle 14 Tage entnommen, um die Kinetik der Antikörperreaktion auf MAGE-3 durch ELISA zu verfolgen. Die Ergebnisse zeigen, daß nach einer Injektion von LPD1/3-MAGE-3-His + SBAS2 der MAGE-3-spezifische Ig-Gesamttiter gering war, und eine klare Auffrischung wurde in 3 von 5 Tieren nach einer zweiten und dritten Injektion von LipoD1/3-MAGE-3 + Hilfsstoff in den gleichen Affen beobachtet. Die schlecht reagierenden Tiere blieben negativ selbst nach 3 Injektionen. 28 Tage nach II oder nach III waren die Antikörpertiter auf die Basisspiegel zurückgekehrt. Die Unterklasse dieser Antikörper wurde als vorherrschend IgG und nicht IgM bestimmt. Der Wechsel zu IgG legt nahe, daß eine T-Helferreaktion ausgelöst wurde. Die Protein D-spezifische Antikörperreaktion, obwohl sie schwächer ist, ist genau parallel zur MAGE-3-Antikörperreaktion.
Beispiel VI
1. LPD-MAGE-1-His
In einer analogen Weise wurde LPD-MAGE-1-His hergestellt. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen sind in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellt. Das resultierende Protein wurde in analoger Weise zum LPD-MAGE-3-His-Protein gereinigt. Kurz gesagt wurde die Zellkultur homogenisiert und mit 4 M Guanidin-HCl und 0,5 M beta-Mercaptoethanol in Gegenwart von 0,5 % Empigen-Detergens behandelt. Das Produkt wurde filtriert und das Permeat mit 0,6 M Iodacetamid behandelt. Die carboxyamidierten Fraktionen wurden einer IMAC-Chromatographie (Zinkchelat-Sepharose FF) unterworfen. Die Säule wurde zuerst äquilibriert und mit einer Lösung gewaschen, die 4 M Guanidin·HCl und Natriumphosphat (20 mM, pH 7,5) und 0,5 % Empigen enthielt, dann wurde die Säule mit einer Lösung gewaschen, die 4 M Harnstoff in Natriumphosphat (20 mM, pH 7,5) und 0,5 % Empigen-Puffer enthielt. Das Protein wurde im gleichen Puffer eluiert, aber mit zunehmenden Konzentrationen an Imidazol (20 mM, 400 mM und 500 mM).
Das Eluat wurde mit 4 M Harnstoff verdünnt. Die Q-Sepharosesäule wurde äquilibriert und mit 4 M Harnstoff in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) in Gegenwart von 0,5 % Empigen gewaschen. Eine zweite Spülung wurde im gleichen Puffer durchgeführt, aber ohne Detergens. Das Protein eluierte im gleichen Puffer, aber mit zunehmendem Imidazol (150 mM, 400 mM, 1 M). Das Eluat wurde ultrafiltriert.
Beispiel VII
Konstruktion des Expressionsplasmids pRIT14426 und Transformation des Wirtsstammes AR58 zur Erzeugung von NS1-MAGE-3-His
Proteinkonstruktion:
Die Konstruktion des Fusionsproteins NS1-MAGE-3-His zur Expression in E. coli wird in 12 beschrieben.
Die Primärstruktur des resultierenden Proteins hat die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Sequenz.
Die codierende Sequenz (SEQ ID NO: 6), die der obigen Proteinkonstruktion entspricht, wurde unter die Kontrolle von λpL-Promotor in einem E. coli-Expressionsplasmid gestellt.
Die Klonierungsstrategie zur Erzeugung von NS1-MAGE-3-His-Fusionsgrotein:
Das Ausgangsmaterial war ein von Dr. Thierry Boon vom Ludwig Institute erhaltenes cDNA-Plasmid, das die codierende Sequenz für das MAGE-3-Gen und den Vektor PMG81 enthielt, der die 81 Aminosäuren aus der NS1-(Nicht-Strukturprotein)-codierenden Region aus Influenza enthält.
Die in 13 umrissene Klonierungsstrategie schloß die folgenden Schritte ein:

a) PCR-Amplifikation der in der Plasmid-cDNA von MAGE-3 dargestellten Sequenzen unter Verwendung des Oligonukleotids sense: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct und des Oligonukleotids antisense: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa. Diese Amplifikation führt zu den folgenden Modifikationen am N-Terminus: Veränderung der ersten fünf Codonen zur E. coli-Codonenverwendung, Austausch des Pro-Codons gegen ein Asp-Codon in Position 1, Einbau eines NcoI-Ortes am 5'-Ende und schließlich Addition der 2 Gly-Codonen und der 7 His-Codonen gefolgt von einem XbaI-Ort am C-Terminus.
b) Klonierung des oben amplifizierten Fragments in den TA-Klonierungsvektor von Invitrogen und Herstellung des intermediären Vektors pRIT14647.
c) Ausschneiden des NcoI-XbaI-Fragments aus Plasmid pRIT14647 und Klonieren in den Vektor pRIT PMG81.
d) Transformation des Wirtsstammes AR58.
e) Selektion und Charakterisierung der Transformanten aus dem E. coli-Stamm, die das Plasmid pRIT14426 enthalten (siehe 14), das das NS1-MAGE-3-His-Fusionsprotein exprimiert.

Charakterisierung des rekombinanten NS1-MAGE-3-His (pRIT14426):
Bakterien wurden auf LB-Medium gezüchtet, das mit 50 μg/ml Kanamycin bei 30°C ergänzt war. Als die Kultur einen OD-Wert von 0,3 (bei 620 nm) erreicht hatte, wurde eine Wärmeinduktion durch Erhöhen der Temperatur auf 42°C erreicht.
Nach 4 Stunden Induktion wurden die Zellen geerntet, in PBS resuspendiert und (durch Aufschließen) durch dreimaliges Pressen in der French-Presse lysiert. Nach Zentrifugieren (60 Minuten mit 100.000 g) wurden der Pelletüberstand und der Gesamtextrakt durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurde in Coomassie B1-angefärbten Gelen visualisiert, wo das Fusionsprotein circa 1 % der Gesamtproteine aus E. coli darstellte. Das rekombinante Protein erschien als einzelne Bande mit einem scheinbaren MG von 44,9 k. Das Fusionsprotein wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von monoklonalen Anti-NS1-Antikörpern identifiziert.
Beispiel VIII
Reinigung von NS1-MAGE-3-His (E. coli) zur Kaninchen/Mäuse-Immunisierung
Reinigungsschema:
Das folgende Reinigungsschema wurde zur Reinigung des Antigens verwendet:
Bakterielle Zellen (23 g) wurden in 203 ml eines Puffers mit 50 mM PO₄, pH 7, durch Rannie (Homogenisator) lysiert, und das Lysat wurde in einem JA 20-Rotor mit 15.000 U/min während 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
b. Antigensolubilisierung
1/3 des Pellets wurden über Nacht bei 4°C in 34 ml von 100 mM PO₄, 6 M Gu·HCl pH 7 resolubilisiert. Nach Zentrifugieren in einem JA 20-Rotor mit 15.000 U/min für 30 Minuten wurde das Pellet verworfen und der Überstand weiter durch IMAC gereinigt.
c. Affinitätschromatografie: Ni²⁺-NTA-Agarose (Qiagen)

Säulenvolumen: 15 ml (16 mm × 7,5 cm)
Packpuffer: 0,1 M PO₄, 6 M Gu·HCl pH 7
Probenpuffer: ebenso
Waschpuffer: 0,1 M PO₄, 6 M Gu·HCl pH 7 0,1 M PO₄, 6 M Harnstoff pH 7
Elution: Imidazolgradient (0250 mM) in 0,1 M PO₄-Puffer pH 7, ergänzt mit 6 M Harnstoff.
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min

a. Auf konzentrieren
Antigen-positive Fraktionen des IMAC-Eluats (160 ml) wurden vereinigt und auf 5 ml in einer gerührten Amicon-Zelle an einer Filtron-Membran (Typ Omega, Kante 10.000) auf konzentriert. Die Reinheit in dieser Stufe ist circa 70 %, abgeschätzt durch SDS-PAGE.
b. Präparative Elektrophorese (Prep Cell Biorad)
2,4 ml der aufkonzentrierten Probe wurden in 0,8 ml reduzierendem Probenpuffer gekocht und auf ein 10 %iges Acrylamidgel geladen. Das Antigen wurde in einem Tris-Glycin-Puffer pH 8,3 eluiert, ergänzt mit 4 % SDS, und NS1-MAGE-3-His-positive Fraktionen wurden vereinigt.
a. TCA-Fällung
Das Antigen wurde TCA-ausgefällt, und nach Zentrifugieren in einem JA 20-Rotor mit 15.000 U/min für 20 Minuten wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in PBS-Puffer pH 7,4 resolubilisiert.
Das Protein ist in PBS nach Gefrieren/Auftauen löslich, zeigt keinen Abbau nach Lagerung für 3 Stunden bei 37°C und hat ein scheinbares Molekulargewicht von circa 50.000 Dalton gemäß Bestimmung durch SDS (12,5 % PAGE).
Beispiel IX
Herstellung des E. coli-Stammes, der ein Fusionsprotein CLytA-MAGE-1-His-Schwanz exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids pRIT14613 und Transformation des Wirtsstammes AR58
Proteinkonstruktion:
Die Konstruktion des Fusionsproteins CLytA-MAGE-1-His zur Expression in E. coli wird in 15 beschrieben.
Die Primärstruktur des resultierenden Proteins hat die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Sequenz.
Die codierende Sequenz (siehe SEQ ID NO: 8), die der obigen Proteinkonstruktion entspricht, wurde unter die Kontrolle von λPL-Promotor in einem E. coli-Expressionsplasmid gestellt.
Klonierung:
Das Ausgangsmaterial war der Vektor PCUZ1, der die 117 C-terminalen Codonen der LytA-codierenden Region aus Streptococcus pneumoniae enthält, und der Vektor pRIT14518, in den wir zuvor die MAGE-1-Gen-cDNA aus einem Plasmid subkloniert haben, das von Dr. Thierry Boon vom Ludwig Institute erhalten wurde.
Die Klonierungsstrategie der Expression von CLytA-MAGE-1-His-Protein (siehe Übersicht in 16) schloß die folgenden Schritte ein:
2. Herstellung des CLytA-MAGE-1-His-codierenden Sequenzmoduls

a) Der erste Schritt war eine PCR-Amplifikation, um die CLytA-Sequenzen mit den NdeI-AflIII-Restriktionsorten zu flankieren. Die PCR-Amplifikation erfolgte unter Verwendung des Plasmids PCUZ1 als Matrize und als Primer des Oligonukleotids sense: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac und des Oligonukleotids antisense: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Dies führt zur Amplifikation einer 378 Nukleotide langen CLytA-Sequenz.
b) Der zweite Schritt war die Bindung der CLytA-Sequenzen an die MAGE-1-His-Sequenzen, um die codierende Sequenz für das Fusionsprotein zu erzeugen. Dieser Schritt schloß das Ausschneiden eines NdeI-AflIII-CLytA-Fragments und die Insertion in den Vektor pRIT14518 ein, der zuvor durch Restriktionsenzyme NdeI und NcoI (kompatibel mit NcoI und AflIII) geöffnet worden war, und führte zum Plasmid pRIT14613.
c) Transformation des Wirtsstammes AR58
d) Selektion und Charakterisierung der Transformante aus E. coli (KAN-resistent), die das Plasmid pRIT14613 enthält (siehe 16).

1. Charakterisierung des rekombinanten Proteins CLytA-MAGE-1-His (pRIT14613)
Bakterien wurden bei 30°C of LB-Medium gezüchtet, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war. Als die Kultur einen OD-Wert von 0,3 (bei 620 nm) erreicht hatte, wurde die Wärmeinduktion durch Erhöhen der Temperatur auf 38°C erreicht.
Nach 4 Stunden Induktion wurden Zellen geerntet, in PBS resuspendiert und durch einen Schuß lysiert (durch Aufschluß). Nach Zentrifugieren wurden Pelletüberstand und Gesamtextrakt durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden in Coomassie B1-angefärbten Gelen visualisiert, wo das Fusionsprotein circa 1 % der Gesamtproteine aus E. coli darstellte. Das rekombinante Protein erschien als einzelne Bande mit einem scheinbaren MG von circa 49 kD. Das Fusionsprotein wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Anti-MAGE-1-Antikörpern identifiziert.
Rekonstituierung der Expressionseinheit, die aus dem langen λPL-Promotor (nützlich zur Nalidixinsäure-Induktion) und der CLytA-MAGE-1-codierenden Sequenz pRIT14614 zusammengesetzt ist:
Ein EcoRI-NCO1-Restriktionsfragment, das den langen PL-Promotor und einen Teil der bei 30°C -Sequenzen enthielt, wurde aus Plasmid pRIT DVA6 hergestellt und zwischen die EcoRI-NCO1-Orte von Plasmid pRIT14613 inseriert.
Das rekombinante Plasmid pRIT14614 wurde erhalten.
Das rekombinante Plasmid pRIT14614 (siehe 17), das das Fusionsprotein CLytA-MAGE-1-His codiert, wurde zur Transformation von E. coli AR120 verwendet. Ein KAN-resistenter Teststamm wurde selektiert und charakterisiert.
Charakterisierung des rekombinanten Proteins:
Bakterien wurden auf LB-Medium, ergänzt mit 50 mg/ml Kanamycin, bei 30°C gezüchtet. Als die Kultur einen OD-Wert von 400 (bei 620 nm) erreicht hatte, wurde Nalidixinsäure auf eine Endkonzentration von 60 mg/ml hinzugegeben.
Nach 4 Stunden Induktion wurden die Zellen geerntet, in PBS resuspendiert und durch Aufschluß (Aufschluß CLS vom Typ "ein Schuß") lysiert. Nach Zentrifugieren wurden Pelletüberstand und Gesamtextrakt durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden in Coomassie Blue-angefärbten Gelen visualisiert, wo das Fusionsprotein circa 1 % der gesamten E. coli-Proteine darstellte. Das Fusionsprotein wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-anti-MAGE-1-Antikörpern identifiziert. Das rekombinante Protein erschien als einzelne Bande mit einem scheinbaren MG von circa 49 kD.
Beispiel X
CLytA-MAGE-3-His
A: Rekombinantes Tumorabstossungsantigen: Ein Fusionsprotein CLytA-MAGE-3-His, worin der CLytA-Fusionspartner zur Expression eines löslichen Proteins führt, wirkt als Affinitätsmarker und stellt einen nützlichen T-Helfer bereit.
Herstellung des E. coli-Stammes, der ein Fusionsprotein CLytA-MAGE-3-His-Schwanz exprimiert.
Konstruktion des Expressionsplasmids pRIT14646 und Transformation des Wirtsstammes AR120:
Proteinkonstruktion:
Die Konstruktion des in E. coli zu exprimierenden Fusionsproteins CLytA-MAGE-3-His wird in 18 beschrieben.
Die Primärstruktur des resultierenden Proteins hat die in SEQ ID NO: 9 beschriebene Sequenz und die codierende Sequenz in SEQ ID NO: 10.
Die codierende Sequenz, die der obigen Proteinkonstruktion entsprach, wurde unter die Kontrolle des λPL-Promotors in einem E. coli-Expressionsplasmid gestellt.
Klonierung:
Das Ausgangsmaterial war der Vektor PCUZ1, der die 117 C-terminalen Codonen aus der LytA-codierenden Region aus Streptococcus pneumoniae enthält, beschrieben in Gene 43, 1986, S. 265–272, und der Vektor pRIT14426, in den wir zuvor die MAGE-3-Gen-cDNA aus einem von Dr. Thierry Boon vom Ludwig Institute erhaltenen Plasmid subklonierten.
Die Klonierungsstrategie zur Expression des CLytA-MAGE-3-His-Proteins (siehe Übersicht in 19) schloß die folgenden Schritte ein:
1. Herstellung des CLytA-MAGE-3-His-codierenden Sequenzmoduls

1.1 Der erste Schritt war eine PCR-Amplifikation zur Flankierung der CLytA-Sequenzen mit den AflII- und AflIII-Restriktionsorten. Die PCR-Amplifikation erfolgte unter Verwendung des Plasmids PCUZ1 als Matrize und als Primer des Oligonukleotids sense: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac und des Oligonukleotids antisense: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Dies führt zur Amplifikation einer 427 Nukleotide langen CLytA-Sequenz. Das obige amplifizierte Fragment wurde in den TA-Klonierungsvektor von Invitrogen kloniert, um den intermediären Vektor pRIT14661 zu erhalten.
1.2 Der zweite Schritt war die Verbindung von CLytA-Sequenzen mit den MAGE-3-His-Sequenzen, um die codierende Sequenz für das Fusionsprotein zu erzeugen. Dieser Schritt schloß das Ausschneiden einer AflII-AflIII-CLytA-Fragments und die Insertion in den Vektor pRIT14426 ein, der zuvor durch AflII- und NcoI-Restriktionsenzyme (NcoI- und AflII-kompatibel) geöffnet wurde, und führte zum Plasmid pRIT14662.

2. Rekonstituierung der Expressionseinheit, die aus dem langen λPL-Promotor (nützlich zur Nalidixinsäure-Induktion) und der CLytA-MAGE-3-codierenden Sequenz zusammengesetzt ist
Ein BglII-XbaI-Restriktionsfragment, das den kurzen PL-Promotor und die CLytA-MAGE-3-His-codierenden Sequenzen enthielt, wurde aus Plasmid pRIT14662 hergestellt und zwischen die BglII-XbaI-Orte von Plasmid TCM67 (ein pBR322-Derivat, das die Resistenz gegen Ampicillin und den langen λPL-Promotor enthält, beschrieben in der internationalen Anmeldung PCT/EP92/01827) inseriert. Das Plasmid pRIT14607 wurde erhalten.
Das rekombinante Plasmid pRIT14607, das das Fusionsprotein CLytA-MAGE-3-His codiert, wurde zur Transformation von E. coli AR120 verwendet (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:88). Ein ampicillinresistenter Teststamm wurde selektiert und charakterisiert.
3. Herstellung von Plasmid pRIT14646
Schließlich wurde ein Plasmid konstruiert (pRIT14646), das ähnlich pRIT14607 war, aber die Kanamycin-Selektion besaß.
Charakterisierung des rekombinanten Proteins:
Bakterien wurden auf LB-Medium, das mit 50 mg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Als die Kultur einen OD-Wert von 400 (bei 600 nm) erreicht hatte, wurde Nalidixinsäure auf eine Endkonzentration von 60?g/ml hinzugegeben.
Nach 4 Stunden Induktion wurden die Zellen geerntet, in PBS resuspendiert und durch Aufschluß (Aufschluß CLS vom Typ "ein Schuß") lysiert. Nach Zentrifugieren wurden der Pelletüberstand und der Gesamtextrakt durch SDS-PAGE analysiert. Proteine wurden in Coomassie Blue-angefärbten Gelen visualisiert, wo das Fusionsprotein circa 1 % der gesamten E. coli-Proteine darstellte. Das Fusionsprotein wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-anti-MAGE-3-Antikörpern identifiziert. Das rekombinante Protein erschien als einzelne Bande mit einem scheinbaren MG von circa 58 kD.
Beispiel XI
Reinigung des rekombinanten Proteins CLytA-MAGE-3-His
Die rekombinanten Bakterien AR120 (pRIT14646) wurden in einem 20 l-Fermenter unter Zulaufbedingungen bei 30°C gezüchtet. Die Expression des rekombinanten Proteins wurde durch Zugabe von Nalidixinsäure in einer Endkonzentration von 60?g/ml induziert. Die Zellen wurden am Ende der Fermentation geerntet und auf 60 OD/600 durch zwei Passagen durch einen French-Presse-Disruptor (20.000 psi) lysiert. Die lysierten Zellen wurden für 20 min mit 15.000 g bei 4°C pelletisiert. Der Überstand, der das rekombinante Protein enthielt, wurde auf Ionenaustauscher-DEAE-Sepharose CL6B-Harz (Pharmacia) geladen, das in 0,3 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, Puffer A, voräquilibriert worden war. Nach einer Säulenspülung mit Puffer A wurde Fusionsprotein durch 2 % Cholin in Puffer A eluiert. Positive Antigenfraktionen gemäß Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-MAGE-3-Antikörpers wurden vereinigt. DEAE-eluiertes Antigen wurde auf 0,5 % Empigen BB (ein zwitterionisches Detergens) und auf 0,5 M NaCl eingestellt, bevor es auf eine Ionenmetallaffinitätschromatografiesäule geladen wurde, die in 0,5 % Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM Phosphatpuffer pH 7,6 (Puffer B) voräquilibriert worden war.
Die IMAC-Säule wurde mit Puffer B gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm die Basislinie erreichte. Eine zweite Spülung in Puffer B ohne Empigen BB (Puffer C) zur Eliminierung des Detergens wurde vor der Antigenelution durch einen Imidazolgradienten mit 0-250 mM Imidazol in Puffer C durchgeführt.
0,090–0,250 M Imidazolfraktionen wurden vereinigt und an einer 10 kDa Filtron-Omega-Membran vor der Dialyse gegen PBS-Puffer auf konzentriert.
Schlußfolgerung:
Wir haben gezeigt, daß das fusionierte Protein LPD-MAGE-3-His immunogen in Mäusen ist, und daß diese Immunogenität (die proliferative Reaktion und Antikörperreaktion) durch Verwendung des oben beschriebenen Hilfsstoffs weiter erhöht werden kann. Die Reinigung kann durch Derivatisierung der Thiole gesteigert werden, die Disulfidbindungen bilden.
Wir haben auch gezeigt, daß eine bessere Antikörperreaktion durch die Impfung mit dem LPD-MAGE-3-His in Gegenwart des Hilfsstoffs ausgelöst wurde. Der im Serum von C57BL/6 gefundene vorherrschende Isotyp ist IgG2b, was nahelegt, daß eine Immunreaktion vom TH1-Typ hervorgerufen wurde.
In der humanen klinischen Umgebung wurde ein Patient, der mit LPD-MAGE-3-His in einer Formulierung ohne Hilfsstoff behandelt wurde, von Melanom geklärt.
Literaturstellen:

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Tumor-assoziiertes Antigenderivat aus der MAGE-Familie, worin das Derivat derivatisierte Thiolreste umfaßt.
Antigen gemäß Anspruch 1, worin die derivatisierten freien Thiole carboxyamidiert oder carboxymethyliert sind.
Antigen gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Antigen einen Fusionspartner umfaßt, der aus Protein D oder einem Derivat von Protein D, das ungefähr das erste Drittel von Protein D umfaßt, ausgewählt ist.
Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Antigen einen Affinitätsmarker umfaßt.
Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Protein D oder das Derivat davon lipidiert ist.
Antigen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das MAGE-Protein aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1 und MAGE C2.
Nukleinsäuresequenz, die ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6 codiert.
Vektor, der eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 7 umfaßt.
Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 7 oder einem Vektor gemäß Anspruch 8 transformiert ist.
Impfstoff, der ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 7 enthält.
Impfstoff gemäß Anspruch 10, der zusätzlich einen Hilfsstoff und/oder ein immunstimulatorisches Cytokin oder Chemokin umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 10 oder 11, worin das Protein in einem Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionsträger vorhanden ist.
Impfstoff gemäß Anspruch 11 oder 12, worin der Hilfsstoff 3D-MPL, QS21 oder ein CpG-Oligonukleotid umfaßt.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, der zusätzlich ein oder mehrere andere Antigene umfaßt.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Antigens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 7 zur Herstellung eines Impfstoffs zur immuntherapeutischen Behandlung eines Patienten, der an Melanomen oder anderen MAGE-assoziierten Tumoren leidet.
Verfahren zur Reinigung eines MAGE-Proteins oder einer MAGE-Fusion davon, worin die MAGE-Fusion einen immunologischen Fusionspartner enthält, der T-Helfer-Epitope bereitstellt, umfassend das Reduzieren der Disulfidbindungen, Blockieren der resultierenden freien Thiolgruppe mit einer blockierenden Gruppe und Unterwerfen des resultierenden Derivats einem oder mehreren chromatografischen Reinigungsschritten.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, umfassend die Schritte aus Reinigen eines MAGE-Proteins oder einer MAGE-Fusion davon, worin die MAGE-Fusion einen immunologischen Fusionspartner enthält, der T-Helfer-Epitope bereitstellt, durch das Verfahren gemäß Anspruch 17 und Formulieren des resultierenden Proteins als Impfstoff.