JP2002502604A - Mageファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用 - Google Patents
Mageファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用Info
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Abstract
Description
関する。特に、本発明の誘導体は、Tヘルパーエピトープを供する免疫学的融合
パートナー、例えばヘモフィルス・インフルエンゼ(Haempophilus influenzae
)BからのプロテインDの脂質化型に連結したMAGE遺伝子のファミリー(例
えばMAGE−3,MAGE−1)によりコードされた抗原を含む融合タンパク
質;抗原のジスルフィド架橋が還元されて生じたチオールがブロッキングされて
いる化学的に改変されたMAGEタンパク質、及びアフィニティータグが供され
及び/又はジスルフィド架橋形成を防ぐよう遺伝子改変された遺伝子的に改変さ
れたMAGEタンパク質を含む。MAGEタンパク質を精製するため及び所定範
囲の癌、例えば黒色腫、乳癌、膀胱癌、肺癌、NSCLC、頭部の癌及び扁平上
皮癌、結腸癌及び食道癌を治療するためのワクチンを調剤するための方法も記載
される。
黒色腫細胞及びNSCLC(非小細胞肺癌)を含むいくつかの他の癌、頭部及び
首扁平上皮癌、膀胱移行上皮癌及び食道癌で主に発現されるが、精巣及び胎盤を
除く正常な組織では検出できない(Gaugler, 1994; Weyhants, 1994; Patard 19
95)。MAGE−3は黒色腫の69%で発現され(Gaugler, 1994 )、NSCL
Cの44%(Yoshimatsu 1988 )、頭部及び首扁平上皮癌の48%、膀胱移行上
皮癌の34%、食道癌の57%、直腸癌の32%、及び乳癌の24%(Van Pel,
1995; Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura 1997)においても検出されている
。MAGEタンパク質を発現する癌はMAGE関連腫瘍として知られている。
用いる実験においてエレガントに証明されている。これらの培養物は自己由来黒
色腫細胞を排他的に溶解することができるが、自己由来繊維芽細胞も自己由来E
BV形質転換リンパ球も溶解することができない特定の細胞毒性Tリンパ球(C
TL)をしばしば作り出す(Knuth, 1984; Anichini, 1987 )。これらのCTL
クローンにより自己由来黒色腫細胞上で認識される抗原のいくつかは、MAGE
ファミリーのものを含めて現在、同定されている。
初の抗原はMZ2−Eと呼ばれ(Van den Eynde, 1989 )、遺伝子MAGE−1
によってコードされる(Van der Bruggen, 1991 )。MZ2−Eに対するCTL
は、これらの細胞がHLA.A1対立遺伝子を有することを条件に自己由来及び
他の患者からのMZ2−E陽性黒色腫細胞を認識し、溶解する。
互いに64〜85%の相同性を有する12の密接に関連した遺伝子、MAGE1
,MAGE2,MAGE3,MAGE4,MAGE5,MAGE6,MAGE7
,MAGE8,MAGE9,MAGE10,MAGE11,MAGE12のファ
ミリーに属する。これらは時折、MAGE A1,MAGE A2,MAGE
A3,MAGE A4,MAGE A5,MAGE A6,MAGE A7,M
AGE A8,MAGE A9,MAGE A10,MAGE A11,MAG
E A12(MAGE Aファミリー)として知られる。他の2つのグループの
タンパク質もMAGEファミリーの一部である。但しより遠い関係にある。これ
らはMAGE B及びMAGE Cグループである。MAGE Bファミリーは
、(MAGE Xp1及びDAM10としても知られる)MAGE B1,(M
AGE Xp2及びDAM6としても知られる)MAGE B2,MAGE B
3及びMAGE B4を含む。MAGE Cファミリーは、現在、MAGE C
1及びMAGE C2を含む。一般的に、MAGEタンパク質はそのタンパク質
のC末端に対して位置したコア配列のサインを含むとして定義することができる
(例えばMAGE A1の309アミノ酸タンパク質に関して、コアのサインは
アミノ酸195〜279に相当する)。
アミノ酸を指し、小文字の残基は保存され(保存性変異を許容する)、大文字の
残基は完全に保存される。 コア配列のサイン LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLx
YxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv 保存性置換は公知であり、一般に配列アラインメントプログラムにおいてデフ
ォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、
PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in pro
teins", In“Atlas of Protein sequence and structure" 5 (3) M.O. Dayhoft
(ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及
びBlosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992),“Amino acid s
ubstitution matricies from protein blocks"), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89
(Biochemistry): 10915-10919 がある。
は非保存性であると考えられる。グループは次の通りである: i)アスパラテート/アスパラギン/グルタメート/グルタミン ii)セリン/トレオニン iii) リシン/アルギニン iv)フェニルアラニン/チロシン/トリプトファン v)ロイシン/イソロイシン/バリン/メチオニン vi)グリシン/アラニン 一般に及び本発明の文脈において、MAGEタンパク質はMAGE A1のア
ミノ酸195〜279と、そのコア領域において約50%、同一であろう。
1つのこのようなエピトープであるMAGE−3.A1はMHCクラスI分子H
LA.A1と会合して提示される時にCTLに特異的なエピトープを構成するM
AGE−3タンパク質のアミノ酸168〜176の間に位置したノナペプチドで
ある。現在、2つの更なるCTLエピトープが、黒色腫細胞及び自己由来リンパ
球の混合培養物中でCTL応答を開始する能力によりMAGE−3タンパク質の
ペプチド配列上で同定されている。これら2つのエピトープはHLA.A2(Va
n der Bruggen, 1994 )及びHLA.B44(Herman, 1996)対立遺伝子の各々
についての特定の結合モチーフを有する。
の腫瘍型の治療のために適した治療用ワクチン製剤に用いるために好適である。 本発明の一実施形態において、本誘導体は異種のパートナーに連結したMAG
Eタンパク質ファミリーからの抗原を含む融合タンパク質である。そのタンパク
質は化学的にコンジュゲートされ得るが、好ましくは非融合タンパク質と比べて
増加したレベルが発現系で生産されるのを許容する組換え融合として発現される
。これにより、融合パートナーは、Tヘルパーエピトープ(免疫学的融合パート
ナー)、好ましくはヒトにより認識されるTヘルパーエピトープを供するのを補
助し、又はネイティブ組換えタンパク質より高収率でタンパク質を発現するのを
補助し得る(発現エンハンサー)。好ましくは融合パートナーは、免疫学的融合
パートナー及び発現増強パートナーの両方であろう。
モフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenza )Bの表面タンパク質で
あるプロテインDから得られる(WO91/18926)。好ましくは、プロテ
インD誘導体は、そのタンパク質のおおよそ最初の1/3、特におおよそ最初の
N末端100〜110アミノ酸を含む。好ましくは、プロテインD誘導体は脂質
化される。好ましくは、リポプロテインD融合パートナーの最初の109残基が
N末端上に含まれ、更なる外来T細胞エピトープと共にワクチン候補抗原を供し
、大腸菌内で発現レベルを増加させる(これにより発現エンハンサーとしても機
能する)。脂質のテールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。
S1(ヘマグルチニン)がある。典型的には、N末端81アミノ酸が利用される
。但しそれらがTヘルパーエピトープを含む限り異なるフラグメントを用いるこ
とができる。 別の実施形態において、免疫学的融合パートナーはLYTAとして知られるタ
ンパク質である。好ましくはその分子のC末端部分が用いられる。LYTAは、
ペプチドグリカン骨格内の特定の結合を特異的に分解するオートリシンである(
lytA遺伝子によりコードされる(Gene, 43 (1986) ページ265 〜272 ))N
−アセチル−L−アラニンアミダーゼ、アミダーゼLYTAを合成するストレプ
トコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)から得られる。LYT
Aタンパク質のC末端ドメインはコリンに対する又はDEAEのような特定のコ
リンアナログに対するアフィニティーの原因である。この特性は融合タンパク質
の発現のために役立つ大腸菌C−LYTA発現プラスミドの開発のために活用さ
れている。アミノ末端にC−LYTAフラグメントを含むハイブリッドタンパク
質の精製は記述されている(Biotechnolosy: 10, (1992) ページ795 〜798 )。
本明細書に用いる場合、好ましい実施形態は残基178で始まるC末端中に見い
出されるLyta分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基188〜
305を組み込む。
のような融合体はネイティブの組換えMAGEタンパク質より高収率で発現され
る。 臨床セッティングにおけるこのような構成物は、本発明者により黒色腫を治療
することができることが示されている。1つの場合、段階IVの黒色腫はアジュバ
ントを添加しないlipo P 1/3 MAGE 3 His タンパク質の2回の投与後に転移物を
取り除いた。
たMAGEファミリーからの腫瘍関連抗原を含む融合タンパク質を供する。好ま
しくは、その免疫学的融合パートナーはプロテインD又はそのフラグメント、最
も好ましくはリポプロテインDである。MAGEタンパク質は好ましくはMAG
E A1又はMAGE A3である。リポプロテインD部分は好ましくはリポプ
ロテインDの最初の1/3を含む。
おいて、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば5〜9、好ましくは6のヒ
スチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助す
るのに有利である。 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は
好適な発現ベクターに挿入してDNA/RNAワクチン接種のために用い又は好
適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワク
チンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイ
ルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモメルファージ(mo
narphage)がある。
て、例えばD.M.Robertら(Biochemistry 1985, 24, 5090-5098)により記載され
る酵素連結法により、化学合成により、試験管内酵素重合により、もしくは例え
ば熱安定性ポリメラーゼを利用するPCR技術により、又はこれらの技術の組合
せにより合成することができる。
0μL又はそれ未満の容量で、ヌクレオチドトリホスフェートdATP,dCT
P,dGTP及びdTTPを含む好適な緩衝液中で、DNAポリメラーゼI(ク
レノウフラグメント)のようなDNAポリメラーゼを用いて試験管内で行うこと
ができる。DNAフラグメントの酵素による連結は、4℃〜環境温度の温度で、
一般に50ml又はそれ未満の容量で、好適な緩衝液、例えば0.05M Tri
s(pH7.4)、0.01M MgCl2 、0.01Mジチオトレイトール、1
mMスペルミジン、1mM ATP及び0.1mg/mlウシ血清アルブミン中で、T4
DNAリガーゼのようなDNAリガーゼを用いて行うことができる。DNAポ
リマー又はフラグメントの化学合成は、‘Chemical and Enzymatic Synthesis o
f Gene Fragments-A Laboratory Manual’(ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verla
g Chemie, Weinheim (1982) に、又は他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Ma
tthes, M.Singh, B.S.Sproat、及びR.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982
, 10, 6243; B.S.Sproat、及びW.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24,
5771; M.D.Matteucci 及びM.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 71
9; M.D.Matteucci及びM.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Soci
ety, 1981, 103, 3185; S.P.Adams ら、Journal of the American Chemical Soc
iety, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus、及びH.Koester, N
ucleic Acids Research, 1984, 12, 4539;並びにH.W.D.Matthes ら., EMBO Jour
nal, 1984, 3, 801 に記載される方法のような固相技術を用いて、慣用的なホス
ホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミジト化学により行うことができ
る。
d Spring Harbor, 1982-1989に記載されるような慣用的な組換え技術により行う
ことができる。 特に、その方法は、 i)本タンパク質又はその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含
むDNAポリマーを宿主内で発現することができる複製可能又は組込み可能発現
ベクターを調製し; ii)該ベクターで宿主細胞を形質転換し; iii) 該形質転換された宿主細胞を、前記DNAポリマーの発現が前記タンパ
ク質を生産することができる条件下で培養し;そして iv)該タンパク質を回収すること を含み得る。
とを意味する。これは、例えば、好適なプラスミド又はウイルスで、例えばGene
tic Engineering: Eds. S.M.Kingsman及びA.J.Kingsman: Blackwell Scientific
Publications; Oxford, England, 1988に記載されるような慣用的な技術を用い
て、形質転換、トランスフェクション又は感染により達成することができる。用
語“形質転換された”又は“形質転換体”は、以後、関心の外来遺伝子を含みか
つそれを発現する生じた宿主細胞に適用するであろう。
リコンを有する直鎖DNAセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、そ
の直鎖セグメントと一緒に要求される産物をコードする1又は複数のDNA分子
、例えば本発明のタンパク質をコードするDNAポリマー又はその誘導体と、連
結条件下で組み合わせることにより本発明に従って調製することができる。
製の間に形成することができる。 ベクターの選択は、部分的に宿主細胞により決定されよう。それは原核生物で
も真核生物であってもよいが、好ましくは大腸菌又はCHO細胞である。適切な
ベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換えウイルス
がある。
より、DNAの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができ
る。 組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複
製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件
は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning" Vol.II, D.M.Glo
ver ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
な細菌宿主細胞は、CaCl2 の溶液で(Cohen ら、Proc.Nat.Acad.Sci., 1973
, 69, 2110)又はRbCl,MnCl2 、酢酸カリウム、及びグリセロールの混
合物を含む溶液で、そして次に3−〔N−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸
、RbCl及びグリセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は
、ベクターDNAの細胞へのカルシウム同時沈降により形質転換することができ
る。本発明は、本発明の複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも広
げられる。
することは、便利には、例えば上述のManiatisら及び“DNA Cloning"に記載され
るように行われる。これにより、好ましくは細胞には栄養素が補給され、50℃
未満の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って及び(細胞内又は培養培地にもしくは細胞内ペ
リプラズムに分泌された)発現産物の局在化に従って、慣用的な方法により回収
される。これにより、宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは例えば
物理的に、化学的に又は酵素的に溶解し、生じたライゼートからタンパク質産物
を単離することができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、その産物は一般
に、栄養培地から又は無細胞抽出液から単離することができる。慣用的なタンパ
ク質単離技術には、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル
抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
30〜300μgを含むであろうと予想される。 本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含む医薬組
成物も供する。好ましいワクチン組成物は、少くともリポプロテインD−MAG
E−3を含む。このようなワクチンは、任意に、1又は複数の他の腫瘍関連抗原
を含み得る。例えばMAGE及びGAGEファミリーに属する他のメンバーがあ
る。好適な他の腫瘍関連抗原には、MAGE−1,GAGE−1又はチロシナー
ゼタンパク質がある。
pproach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J) (1995) Plenum Press New York )
に記載される。リポソームでのカプセル化は、Fullerton の米国特許4,235
,877に記載される。 本発明のタンパク質は、好ましくは、本発明のワクチン調製物中にアジュバン
トが添加される。好適なアジュバントアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウ
ムゲル(アルム)又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の
塩であってもよく、またアシル化チロシン又はアシル化糖、カチオンに又はアニ
オンに誘導化したポリサッカライド又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であっ
てもよい。他の周知のアジュバントには、CpG含有オリゴヌクレオチドがある
。そのオリゴヌクレオチドは、CpGジヌクレオチドがメチル化されていないこ
とを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えばWO96
/02555に記載される。
誘導することが好ましい。好適なアジュバントシステムには、例えばモノホスホ
リル脂質A、好ましくは3−de−O−アシル化モノホスホリル脂質A(3D−
MPL)の、アルミニウム塩との組合せがある。CpGオリゴヌクレオチドもT
H1応答を優先的に誘導する。
にWO94/00153に開示されるQS21及び3D−MPLの組合せ、又は
WO96/33739に開示されるQS21がコレステロールでクエンチされて
いるより少い反応原性の組成物に関する。 水中油エマルション中のQS21,3D−MPL及びトコフェロールに関する
特に能力のあるアジュバントはWO95/17210に記載され、好ましい製剤
である。
がアジュバントとして添加された。本発明のタンパク質、より好ましくはリポプ
ロテインD(又はその誘導体)を含むワクチンを供する。 好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはQS21を更に含む
。
発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば3D−MPLを一緒に本発明のタ
ンパク質を混合することを含むワクチン製剤を製造するための方法も供する。 本発明の一態様において、組換え生産されたMAGE−タンパク質を精製する
ための方法を供する。その方法は、そのタンパク質を、例えば強カオトロピック
剤(例えば尿素、塩酸グアニジウム)に、又は両性イオン界面活性剤、例えば(
Empigen BB−n−ドデシル−N,N−ジメチルグリシン)に可溶化し、そのタン
パク質の分子内及び分子間ジスルフィド結合を還元し、生じたチオールをブロッ
キングして酸化的再カップリングを防止し、そしてそのタンパク質を1又は複数
のクロマトグラフィーステップにかけることを含む。
剤には、これらに限らないが、α−ハロゲン酸(haloacids )又はα−ハロゲン
アミド(haloamides)がある。例えば、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドはタ
ンパク質をカルボキシメチル化又はカルボキシアミド化(カルバミドメチル化)
させる。他のブロッキング剤を用いることができ、これらは文献に記載されてい
る(例えばThe Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Aca
demic press 1976, or Chemical Reagents for Protein modification Vol I ed
s. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985 を参照のこと)。このような他
のブロッキング剤の典型例には、N−エチルマレイミド、クロロアセチルホスフ
ェート、O−メチルイソウレア及びアクリロニトリルがある。ブロッキング剤の
使用は、それが産物の凝集を防ぎ、後の精製のための安定性を確実にするので有
利である。
的な誘導体(例えばα−ハロ酸又はα−ハロアミド)を誘導するように選択され
る。しかしながら、ブロッキング剤は、精製の後に、そのブロッキング剤が除去
されて非誘導化タンパク質を遊離し得るように選択してもよい。 誘導化遊離チオール残基を有するMAGEタンパク質は新規であり本発明の一
態様を形成する。特に、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化誘導体は本
発明の好ましい実施形態である。
ータグ、例えばCLYTA又はポリヒスチジンテールが供される。このような場
合、ブロッキングステップ後のタンパク質は、好ましくはアフィニティークロマ
トグラフィーにかけられる。ポリヒスチジンテールを有するこれらのタンパク質
のために、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を
行うことができる。金属イオンは、いずれかの適切なイオン、例えば亜鉛、ニッ
ケル、鉄、マグネシウム又は銅であり得るが、好ましくは亜鉛又はニッケルであ
る。好ましくは、IMAC緩衝液は、最終産物中に低レベルのエンドトキシンを
生ずるので、Empigen BB(以後、Empigen)のような両性イオ
ン界面活性剤を含む。
ン又はコリンアナログ、例えばDEAEへのアフィニティーを利用することによ
り精製することができる。本発明の一実施形態において、タンパク質には、ポリ
ヒスチジンテール及びClyta部分が供される。これらは簡単な2ステップの
アフィニティークロマトグラフィー精製スケジュールで精製することができる。
MAGE−3−His又はLpD MAGE−3−His)を発現する組換え大
腸菌株の調製 1.大腸菌発現系: リポプロテインDの生産のため、プロテインDをコードするDNAを発現ベク
ターpMG81にクローン化した。このプラスミドはラムダファージDNAから
のシグナルを利用して挿入された外来遺伝子の転写及び翻訳を駆動する。そのベ
クターは、ラムダPLプロモーターPL、オペレーターOL及びNプロテインを
供した時に転写極性効果を緩和するための2つの利用部位(Nu+L及びNu+
R)を含む(Gross ら、1985, Mol. & Cell.Biol. 5; 1015 )。PLプロモータ
ーを含むベクターはプラスミドDNAを安定化するため大腸菌溶原性宿主に導入
される。溶原性宿主株は、ゲノム内に挿入された複製欠損ラムダファージDNA
を含む(Shatzmanら、1983; In Experimental Manipulation of Gene Expressio
n. Inouya (ed) pp 1 〜14, Academic Press NY )。ラムダファージDNAはベ
クターのOLリプレッサーに結合し、RNAポリメラーゼのPLプロモーターへ
の結合を防ぎ、それにより挿入された遺伝子の転写を防ぐcIリプレッサータン
パク質の合成を指示する。発現株AR58のcI遺伝子は、PLに指示された転
写が温度変化により制御され得るように、即ち培養温度の増加がリプレッサーを
不活性化して外来タンパク質の合成が始まるように、温度感受性変異を含む。こ
の発現系は、外来タンパク質、特に細胞に対して毒性であり得るものの合成を制
御する(Shimataka & Rosenberg, 1981, Nature 292: 128)。
性大腸菌株は標準的なNIH大腸菌K12株N99の誘導体(F-Su-galK2, lacZ
-thr- )である。それは、欠損した溶原性ラムダファージを含む(galE::TN10,
1Kil-cI857 DH1)のKil−表現型は宿主高分子合成の遮断を防ぐ。cI857
変異は、温度感受性障害をcIリプレッサーに与える。DH1欠失は、ラムダフ
ァージの右オペロン及び宿主のbio,uvr3、及びchlA座を除去する。
AR58株は、SA500誘導体(galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1)で先に増殖さ
せたPラムダファージストックでのN99の導入により作り出した。N99への
欠損溶原の導入は、隣接galE遺伝子中にテトラサイクリン耐性をコードする
TN10トランスポゾンの存在によりテトラサイクリンで選択した。N99及び
SA500は、National Institute of HealthのDr.Martin Rosenberg's labora
toryから得た大腸菌K12株である。
したベクターの作製 原理は、MAGE−3のN末端に連結した融合パートナーとして脂質化プロテ
インDのN末端1/3及びC末端に位置したいくつかのヒスチジン残基の配列(
Hisテール)を用いて融合タンパク質としてMAGE3を発現させることであ
った。
ルエンゼの表面上に露出した42kDa イムノグロブリンD結合タンパク質)。そ
のタンパク質は、細菌のリポタンパク質についての共通配列を含む、18アミノ
酸残基シグナル配列を有する前駆体として合成される(WO91/18926)
。
の位置19の)Cysがアミノ末端残基になり、同時に、エステル結合及びアミ
ド結合脂肪酸の両方の共有結合により改変される。 次に、アミノ末端システイン残基に結合した脂肪酸は膜アンカーとして機能す
る。
されたプロテインDの最初の109残基、2つの無関係なアミノ酸(Met及び
Asp)、MAGE−3のアミノ酸残基2〜314、後に7つのHis残基に露
出されるヒンジ領域をして機能する2つのGly残基を含む前駆タンパク質を発
現するようデザインした。
ールを有する融合タンパク質を作り出す(図1)。ここでそのアミノ酸配列は配
列番号:1に記載され、コーディング配列は配列番号:2に記載される。 4.LPD−MAGE−3−His融合タンパク質の形成のためのクローニン
グストラテジー(ベクターpRIT14477): (Ludwig InstituteからのDr Thierry Boon から頂いた)MAGE−3遺伝子
(Gaugler B ら、1994)のためのコーディング配列を含むcDNAプラスミド、
及び(図2に概説するように調製した)Lipo−D−1/3コーディング配列
のN末端部分を含むベクターPRIT14586を用いた。そのクローニングス
トラテジーは以下のステップを含む(図3)。
ag cac tgc aag cct及びオリゴヌクレオチドアンチセンス:5′gcg tct aga tt
a atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いてプ
ラスミドcDNA MAGE3内に供される配列のPCR増幅;この増幅は、N
末端に以下の改変を導く:最初の5つのコドンの、大腸菌コドン使用への変化、
位置1におけるProコドンのAspコドンによる置換、5′末端でのNcoI
部位の設置及び2つのGlyコドン及び7つのHisコドン、その後のXbaI
部位の、C末端での最後の付加。
へのクローニング及び中間体ベクターpRIT14647の調製。 c)プラスミドpRIT14647からのNcoI XbaIフラグメントの
切り出し、及びベクターpRIT14586へのクローニング。 d)宿主株AR58の形質転換。
IT14477を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション 実施例II: LPD1/3−MAGE−3−His抗原の調製: 1.細菌株の増殖及び誘導−LPD1/3−MAGE−3−Hisの発現: プラスミドpRIT14477で形質転換したAR58の細胞を、各々イース
トエキス(6.4g/L)及びカナマイシンスルフェート(50mg/L)を補給
したLY12培地400mLを含む2リッターフラスコ内で増殖させた。振とうテ
ーブル上で、30℃で8+/−1時間、インキュベートした後、顕微鏡検査のた
め各々のフラスコから少量のサンプルを除去した。2つのフラスコの内容物をプ
ールして20リッター発酵槽のための接種物を供した。
した7リッターの培地を含む予め滅菌した20リッター(全量)発酵槽に加えた
。そのpHを、NH4 OH(25%v/v)の周期的な添加により6.8に調節し
、維持して、その温度を30℃に調節し、維持した。エレーション速度を分当り
12リッターに調節し、維持して、溶解した酸素圧を撹拌速度のフィードバック
制御により50%の飽和に維持した。発酵槽における過圧は500g/cm2 (0
.5bar )に維持した。
養を行った。供給溶液は最初に0.04mL/分の速度で加え、0.1h-1の増殖
速度を維持するように最初の42時間の間、指数関数的に増加させた。 42時間後に、発酵槽中の温度を39℃に迅速に増加させ、供給速度を、LP
D−MAGE−3−Hisの細胞内発現が最大レベルに達する期間である更なる
22〜23時間、誘導期の間、0.005mL/g DCW/分の一定値に維持した。
で採取し、発酵の終りに微生物増殖の速度及び細胞内産物発現を追跡し、更に、
微生物の同定/純度テストのためのサンブルを供した。 発酵の終りに、その培養物の光学密度は(48〜72gの DCW/Lの細胞濃度
に相当する)80〜120であり、全液体量は約12リッターであった。その培
養物を迅速に6〜10℃に冷却し、ECK32の細胞を、5000×gで4℃で
30分の遠心により培養液から分離した。ECK32の濃縮細胞を迅速にプラス
チックバッグに保存し、直ちに−80℃に凍結した。
濁して(約36gの DCW/Lの細胞濃度に相当する)60の最終的な光学密度に
した。 その細胞を高圧ホモジナイザー(1000bar )に2回、通すことにより破壊
した。その破壊した細胞懸濁液を遠心し(×10,000g、4℃、30分)、
そのペレット画分をTriton X100(1%w/v)+EDTA(1mM)
で2回、洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液(PBS)+Tween20(0.1%
v/v)で洗い、そして最後にPBSで洗った。各々の洗浄段階の間に、懸濁液
を×10,000gで30分、4℃で遠心し、その上清を捨てて、ペレット画分
を保持した。
モジネートから精製した: a)細胞破壊物からの洗浄したペレット画分の可溶化。
物再カップリングを防ぐためのチオール基のブロッキング。 c)粒子の除去及びエンドトキシンの削減のための反応混合物の精密ろ過。 d)ポリヒスチジンテールと亜鉛装填Chelating Sepharose との間のアフィニ
ティー相互作用の利用によるLPD−MAGE−3−Hisの捕獲及び最初の精
製。
液交換/尿素除去。 g)製造過程のろ過。
緩衝液交換/脱塩。 これらのステップの各々を以下により詳細に記載する。 1.1)細胞ホモジネートペレットの可溶化 (上述の)最終洗浄段階からのペレット画分を、塩酸グアニジン(6M)及び
リン酸ナトリウム(0.1M、pH7.0)の溶液800mL中で4℃で一晩、再び
可溶化した。
を一掃し、2−メルカプトエタノールの保存溶液(14M)を加えて4.3Mの
最終濃度(溶液1mL当り0.44mLの2−メルカプトエタノールに相当)を供し
た。
5℃に加熱した。95℃で15分後に、そのフラスコを水浴から除去し、冷却し
て、その内容物を氷の中においたホイルでおおったビーカー(5L)にプールし
、そして固体のヨードアセトアミドを激しく混合しながら加えて6Mの最終濃度
(溶液1mL当り1.11gのヨードアセトアミドに相当)を供した。その混合物
を1時間、暗所で氷上に保持し、ヨードアセトアミドの完全な可溶化を確実にし
、その後、約1Lの水酸化ナトリウム(5M)を加えることにより中和して(激
しい混合を維持してpHのモニターを続けて)、7.5〜7.8の最終pHを供した
。
5〜7.8に調節した。 1.3)精密ろ過 その混合物を、Minikros中空繊維カートリッジ(ret. No M22M-600-01N;面積
5,600cm2 、0.2μm)を備えたAmicon Proflux M12接線フロー(tangen
ital-flow )ユニット内で精密ろ過した。その透過液を後のクロマトグラフィー
精製のために保持した。
cia Biotechnology Cat No.18-1103-01 )に充填したChelating Sepharose FF (
Pharmacia Biotechnology Cat. No.17-0575-01)で行った。充填したベッドの寸
法は、直径10cm;断面積79cm2 ;ベッドの高さ19cm;充填容量1, 500
mLであった。空のカラムを水酸化ナトリウム(0.5M)で浄化して精製水で洗
った。
上で精製水(8リッター)で洗い、少くとも15リッターのZnCl2 の溶液(
0.1M)を流すことにより亜鉛で荷電させた。その支持体を、流出液のpHがZ
nCl2 溶液のpH(pH5.0)に達するまで、10Lの精製水で洗うことにより
除去した。次にその支持体を、塩酸グアニジン(6M)及びリン酸ナトリウム(
0.1M、pH7.0)を含む溶液4リッターで平衡化した。
(バッチ結合)、次にそのBPGカラムに塩酸グアニジン(6M)及びリン酸ナ
トリウム(0.1M、pH7.0)を含む溶液をロードし、充填した。 金属キレートクロマトグラフィーの次の段階は、60mL/分の溶出流速で行っ
た。カラムを洗い、最初に塩酸グアニジン(6M)及びリン酸ナトリウム(0.
1M、pH7.0)を含む溶液で、次に尿素(6M)及びリン酸ナトリウム(0.
1M、pH7.0)を含む溶液で、カラム溶出液がOD280nm で0の吸光度に達す
る(ベースライン)まで洗った。
ン酸ナトリウム(0.1M、pH7.0)及びイミダゾール(0.5M)を含む溶
液2カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約16mS/cmであった
。 1.5)アニオン交換クロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なLPD−MAGE−
3−Hisタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素(6M)及びTris−H
Cl(20mM、pH8.0)を含む溶液で希釈することにより約4mS/cmに減少さ
せた。
cia Biotechnology Cat.No.18-1103-11 )に充填したQ-Sepharose FF (Pharmaci
a Biotechnology, Cat No.17-0510-01)を用いた行った。充填したベッドの寸法
は、直径10cm;断面積314cm2 ;ベッドの高さ9cm;充填容量2,900mL
であった。
0mL/分の溶出流速で洗った。その充填したカラムを3Lの水酸化ナトリウム(
0.5M)で浄化し、30Lの精製水で洗い、次に6Lの尿素(6M)及びTr
is−HCl(20mM、pH8.0)を含む溶液で平衡化した。希釈した半精製し
たLPD−MAGE−3−Hisをそのカラムに充填し、次に尿素(6M)、T
ris−HCl(20mM、pH8.0)、EDTA(1mM)及びTween(0.
1%)を含む9Lの溶液で、その溶出液の吸光度(280nm)が0になるまで洗
った。
0)を含む6リッターの溶液で行った。 精製したLPD−MAGE−3−Hisを、尿素(6M)、Tris−HCl
(20mM、pH8.0)及びNaCl(0.25M)を含む溶液でカラムから溶出
した。
両方とも、サイズ排除クロマトグラフィーにより行った。これは、XK 50/
100カラム(Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-8753-01 )に充填したSupe
rdex 75 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-1044-01)を用いて行った。充填
したベッドの寸法は、直径5cm;断面積19.6cm2 ;ベッドの高さ90cm;充
填容量1,800mLであった。
/分の溶出速度で洗浄した。そのカラムを2リッターの水酸化ナトリウム(0.
5M)で浄化し、5リッターの精製水で洗い、次にTween80(0.1%v
/v)を含む5リッターのリン酸緩衝塩類溶液で平衡化した。 その精製したLPD−MAGE−3−His画分(脱塩ラン当り最大500mL
)を20mL/分の溶出流速でカラムに充填した。その脱塩した精製LPD−MA
GE−3−Hisを、Tween80(0.1%v/v)を含む3リッターのP
BSでカラムから溶出した。
、層流フード中0.22μm膜(クラス10.000)を介してろ過した。その
ろ過したバルクは−80℃に凍結し、脱塩ステップまで保存した。
度を減少させるために更なる緩衝液交換が必要とされた。これは、BPG 10
0/950カラム(Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-03 )に充填した
Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-0033-02 )を用いて脱塩ク
ロマトグラフィーにより行った。充填したベッドの寸法は直径10cm;断面積7
8.6cm2 ;ベッドの高さ85cm;充填容量6,500mLであった。
そのゲルを純水で100mL/分の溶出流速でカラムにつめた。 そのカラムを6リッターの水酸化ナトリウム(0.5M)で浄化し、次にリン
酸ナトリウム(10mM、pH6.8)、NaCl(20mM)及びTween80(
0.1%v/v)を含む10リッターの溶液で平衡化した。
mL)を100mL/分の溶出流速でカラムに流した。カラムのボイド容量で溶出し
た脱塩精製したLPD−MAGE−3−His画分を0.22μm膜を介して滅
菌ろ過し、−80℃で保存した。 最終的なバルクタンパク質を+4℃に解凍した後、容器に分取してラクトース
賦形剤中に凍結乾燥した。
で還元条件下でSDS−PAGEにより分析した。 タンパク質充填量はクーマシーブルー染色について50μg及び硝酸銀染色に
ついて5μgであった。臨床用lot 96K19及びパイロットlot 96
J22を分析した。60kDa の分子量に相当する1つの主要バンドを可視化した
。約45kDa 及び35kDa の2つのマイナーな更なるバンドも見られた。
れるペプチドを、マウスモノクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロットによ
り同定した。これらの抗体は、MAGE−3−Hisタンパク質(このタンパク
質はLPD−MAGE−3−HisのLPD部分を含まない)の精製した調製物
を用いて企業内で開発した。
ンブロット分析のための適合性に基づいて選択し、lotリリースのための同一
性テストに用いた。図4は、Mab32及び54で染色した後のlot 96K
19及び96J22について得られたバンドパターンを示す。600ngのタンパ
ク質が12.5% SDS−PAGEで分離され、それをナイロン膜に移し、M
ab32及び54(60μg/ml)と反応させ、ペルオキシダーゼに連結させた
抗マウス抗体で表した。
Mabにより表した。 実施例IV: 1.LPD−MAGE−3−Hisタンパク質を用いるワクチン調製物: これらの実験に用いたワクチンは、アジュバントを加えた又は加えなかった、
株AR58からの大腸菌で発現されたリポプロテインD1/3−MAGE−3−
Hisをコードする組換えDNAから作り出す。アジュバントとして、その製剤
は、油/水エマルション中、3de−O−アシル化モノホスホリル脂質A(3D
−MPL)及びQS21の混合物を含む。アジュバントシステムSBAS2は、
先にWO95/17210に記載されている。
シル化されており、脂質A成分上のホスフェート基を欠く。この化学的処理は、
免疫刺激特性を保存しながら、毒性を劇的に減少させる(Ribi, 1986)。Ribi I
mmunochemistryはMPLを製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。Smith Kl
ine Beecham Biologicals で行った実験は、種々のビヒクルと組合わせた3D−
MPLは、体液性免疫及び細胞性免疫のTH1型の両方を強力に増強することを
示した。
れた天然のサポニン分子である。樹皮の粗抽出液から個々のサポニンを分離する
ために開発した精製技術は、親構成物と比べて強いアジュバント活性及び低い毒
性を示すトリテルペングリコシドである特定のサポニンQS21の単離を許容し
た。QS21はMHCクラスI制限CTLをいくつかのサブユニットAgsに活
性化し、及びAg特異的リンパ球増殖を刺激することが示されている(Kensil,
1992)。Aquila(正式にはCambridge Biotech Corporation )はQS21
を製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。
性免疫応答の両方の誘導におけるMPL及びQS21の組合せの明らかな相乗効
果を証明した。 油/水エマルションは、2種の油(トコフェロール及びスクアレン)から構成
される有機相、及び乳化剤としてTween80を含むPBSの水性相から構成
される。そのエマルションは、5%のスクアレン、5%のトコフェロール、0.
4%のTween80を含み、180nmの平均粒径を有し、SB62として知ら
れる(WO95/17210を参照のこと)。
(SBAS2)へのO/Wエマルションの添加が種々のサブユニット抗原に対す
る後者の免疫刺激特性を更に増加させる。 2.エマルションSB62(2倍濃縮物)の調製: Tween80をリン酸緩衝塩類溶液(PBS)に溶かしてPBS中2%溶液
を供する。100mLの2倍濃縮エマルションを供するために、5gのDL−α−
トコフェロール及び5mLのスクアレンをボルテキシングして完全に混合する。9
0mLのPBS/Tween溶液を加え、完全に混合する。次に生じたエマルショ
ンをシリンジに通して、M110Sマイクロフルーディクスマシンを用いること
により最終的にミクロな液体にする。得られた油滴は約180nmの大きさを有す
る。
L水中油(SBAS2)製剤の調製 アジュバントを油/水エマルション中で、MPL及びQS21の組合せとして
調剤する。この調製物を0.7mlの容器に入れて、凍結乾燥した抗原(容器は3
0〜300μgの抗原を含む)と混合する。
アジュバントで又はPBSのみで再構成した後に得られる。 抗原を含まないアジュバント対照は、タンパク質をPBSで置換することによ
り調製した。 4.ワクチン抗原:融合タンパク質リポプロテインD1/3−MAGE−3−
His: リポプロテインDはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に
露出したリポタンパク質である。
T細胞エピトープを有するワクチン抗原を供する。LPD成分の他に、タンパク
質は、2つの無関係なアミノ酸(Met及びAsp)、Mage−3のアミノ酸
残基2〜314、次の7つのヒスチジン残基を露出するためのヒンジ領域として
機能する2つのGly残基を含む。
クチンを、遺伝的バックグラウンド及びMHC対立遺伝子が異なる2つの異なる
マウス株(C57BL/6及びBalb/c)に注入した。両方のマウス株につ
いて、潜在的なMHCクラスI及びMHCクラスIIペプチドモチーフは、LPD
−MAGE−3−His融合タンパク質のMAGE部分のためのものであると理
論的に予測された。
調剤した5μgのLPD−MAGE−3−His又はそれのないものを、足のひ
らに、2週間間隔で2回、注入した。 b)増殖アッセイ: リンパ球を、最後の注入後2週間に、マウスからの脾臓又は膝窩リンパ節を破
壊することにより調製した。2×105 細胞を96ウェルプレートに3回重複し
て入れ、細胞を試験管内で72時間、それ自体で又はラテックスマイクロビーズ
上にコートした異なる濃度(1〜0.1μg/ml)のHis−Mage3で再刺
激した。
、LPD−MAGE−3−Hisタンパク質を注入したC57BL/6又はBa
lb/cマウスのいずれかからの脾臓細胞(図5及び7を参照のこと)及びリン
パ節細胞(図6及び8を参照のこと)の両方で、MAGE−3特異的リンパ球増
殖活性の増加が観察された。
たマウスからのリンパ球で、かなり高い増殖応答が得られた(図6及び8を参照
のこと)。 c)結論 LPD−MAGE−3−Hisはマウスにおいて免疫原性であり、この免疫原
性は、SBAS2アジュバント製剤の使用により増加させることができる。
μGのLPD−MAGE−3−His、又は5μGのLPD−MAGE−3−H
is+SBAS2のいずれかで、2週間間隔で足のひら内注入により2回、免疫
化した。
S+1%新生ウシ血清中で、37℃で1時間の飽和の後、その血清を飽和緩衝液
中で逐次的に希釈(1/1000で開始)し、4℃で一晩、又は37℃で90分
、インキュベートした。PBS/Tween20、0.1%で洗った後、ビオチ
ニル化ヤギ抗マウス全IgG(1/1000)又はヤギ抗マウスIgG1,Ig
G2a,IgG2b抗血清(1/5000)を二次抗体として用いた。37℃で
90分のインキュベーションの後、ペルオキシダーゼに連結したストレプトアビ
ジンを加え、TMB(テトラメチルベンジジンペルオキシド)を基質として用い
た。10分後、その反応をH2 SO4 0.5Mを加えることによりブロックし
、そのO.D.を測定した。
するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較
する。 これらの結果は、テストした両方のマウス株においてLPD−MAGE−3−
Hisのみの2回の注入の後に弱いAb応答がマウントされるが、LPD−MA
GE−3−HisをSBAS2の存在下で注入した時にはより高い抗MAGE−
3 Ab濃度が形成されることを示す。これにより、2週間隔でのLPD−MA
GE−3−Hisの2回の注入のみで観察される高いAb応答を作り出すのに十
分である。
るより優れたAb応答は、たとえC57BL/6マウスで達成されるAbタイタ
ーが、LPD−MAGE−3−Hisのみの注入後よりLPD−MAGE−3−
His+SBAS2の注入後でより高いとしても、ハプロタイプの差又はこれら
2つの株の間のバックグラウンドの差によって説明することができる。
AGE−3応答は、図10及び11で見ることができ、これらは、血清の平均中
点希釈の比較を供する。 アジュバントSBAS2中のLPD−MAGE−3−Hisをワクチン接種し
たマウスからでさえ、血清サンプルのいずれにおいてもIgAもIgMも検出さ
れなかった。
接種したマウスからの血清中で少し高く、SBAS2中のLPD−MAGE−3
−Hisを注入した動物の血清においてかなり増加した。 異なるIgGサブクラス濃度の分析は、テストした全てのIgGサブクラス(
IgG1,IgG2a,IgG2b)のレベルが、Ag又はアジュバントのみを
注入したマウスにおいてのものよりアジュバントを加えたAgをワクチン接種し
たマウスにおいて高かったので、混合されたAb応答がマウスにおいて誘導され
たことを示す。
ン接種後のこの混合されたAb応答の性質は、IgG1及びIgG2bがBal
b/c及びC57BL/6マウス各々の血清中に主に見い出されるので、マウス
株に依存するようである。 3.アカゲザルにおけるリポプロテインD1/3 MAGE3−His+SB
AS2アジュバントの免疫原性 5匹のアカゲザル(Macaca Mulatta)の3つのグループを選択した。RTS,
S及びgp120を陽性対照として用いた。
3及びプロテインD成分の両方に対する抗体応答を決定するために採血した。ワ
クチンを、右足の後部にボーラス注入(0.5ml)で筋内に投与した。
ルを大腿静脈から収集し、少くとも1時間、凝固させ、室温で10分、2500
rpm で遠心した。 血清を除去して−20℃で凍結し、特異的ELISAによる抗体レベルの測定
のために用いた。
Mage 3又はプロテインDでコートした。PBS NCS 1%での37℃
での1時間の飽和の後、ウサギ血清の連続希釈物を37℃で1時間30分、(1
/10で始めて)加え、PBS Tweenで3回、洗った後、抗ビオチニル化
血清(Amersham ref RPN 1004. lot 88 )を加えた(1/5000)。プレート
を洗い、ペルオキシダーゼ連結ストレプトアビジン(1/5000)を37℃で
30分、加えた。洗浄後、50μlのTMB(BioRad)を7分、加え、その反応
をH2 SO4 で停止させ、ODを450nmで測定した。中点希釈をSoftmaxProに
より計算した。
日毎に少量の血液サンプルを採取した。結果は、LPD1/3 Mage3 H
is+SBAS2の1回の注入後に、Mage3特異的全Igタイターが低くな
ることを示し、同じサルでのLipoD1/3 Mage3+アジュバントの2
回目及び3回目の注入後に、5の動物のうち3つで見られた。少い応答のものは
、3回の注入後でさえ陰性であり続けた。II後28日又はIII 後に、抗体タイタ
ーは基底レベルに戻った。抗体のサブクラスはIgMでなく主要なIgGとして
決定した。IgGへのスイッチは、Tヘルパー応答が誘発されていることを示唆
する。プロテインD特異的抗体応答は、弱いか、Mage3抗体応答と正確に平
行している。
配列を配列番号:3及び4に示す。得られたタンパク質は、LPD−MAGE−
3−Hisタンパク質と同様に精製した。要約すると、細胞培養物をホモジナイ
ズし、0.5% Empigen界面活性剤の存在下で4MグアニジンHCl及
び0.5M β−メルカプトエタノールで処理した。その産物をろ過し、浸透物
を0.6Mヨードアセトアミドで処理した。そのカルボキシアミド化画分をIM
AC(亜鉛キレート−セファロースFF)クロマトグラフィーにかけた。そのカ
ラムを平衡化し、4Mグアニジン、HCl及びリン酸ナトリウム(20mM、pH7
.5)及び0.5% Empigenを含む溶液で洗い、次にそのカラムをリン
酸ナトリウム(20mM、pH7.5)0.5% Empigen緩衝液中4M尿素
を含む溶液で洗った。タンパク質を同じ緩衝液であるが、イミダゾールの濃度を
増加させて(20mM,400mM及び500mM)溶出した。
Empigenの存在下で20mMリン酸緩衝液(pH7.5)中4M尿素で洗っ
た。界面活性剤を含まない同じ緩衝液で2回目の洗浄を行った。同じ緩衝液であ
るがイミダゾールの濃度を増加させて(150mM,400mM,1M)タンパク質
を溶出した。その溶出液を限外ろ過した。
を生産するための宿主株AR58の形質転換: タンパク質デザイン: 大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質NS1,MAGE−3−Hisのデ
ザインを図12に示す。
腸菌発現プラスミド中のλpLプロモーターの制御下においた。 NS1 −MAGE−3−His融合タンパク質の形成のためのクローニングス
トラテジー 出発材料は、MAGE−3遺伝子のためのコーディング配列を含む、Ludwig I
nstituteからのDr.Tierry Boonから受け取ったcDNAプラスミド、及びインフ
ルエンザからのNS1 (非構造タンパク質)コーディング領域の81aaを含む
ベクターPMG81であった。
ag cac tgc aag cct、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス:5′gcg tct aga
tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いて
、プラスミドcDNA MAGE−3内に供される配列のPCR増幅。
ドン使用への変化、位置1におけるProコドンのAspコドンでの置換、5′
末端でのNcoI部位の導入及び2つのGlyコドン及び7つのHisコドン、
次のXbaI部位のC末端での最後の付加。 b)先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのTAクローニングベクター
へのクローニング及び中間体ベクターpRIT14647の調製。
切り出し及びベクターpRIT PMG81へのクローニング。 d)宿主株AR58の形質転換。 e)NS1−MAGE3−His融合タンパク質を発現するプラスミドpRI
T14426(図14を参照)を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタ
リゼーション。
ゼーション 細菌を、50μg/mlのカナマイシンを補給したLB培地で、30℃で増殖さ
せた。その培養がOD=0.3(620nm)に達した時に、温度を42℃に上げ
ることにより熱誘導を行った。
、通すことにより(分解により)溶解した。遠心(100,000gで60分)
の後、ペレット上清及び全抽出液をSDS−PAGEにより分析した。タンパク
質をクーマシーB1染色したゲルにおいて可視化し、ここでその融合タンパク質
は全大腸菌タンパク質の約1%を表した。組換えタンパク質は、44.9Kの見
掛けMWで単一バンドとして現れた。その融合タンパク質は、抗NS1モノクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。
。 精製スキーム: 抗原を精製するために以下の精製スキームを用いた: 細胞の溶解+遠心 ↓ 抗原可溶化+遠心 ↓ Ni2 +NTAアガロース ↓ 濃縮 ↓ Prep cell ↓ TCA沈殿及びPBS可溶化 a.溶解 細菌細胞(23g)をRannie(ホモジナイザー)により203mLの50
mM PO4 pH7緩衝液に溶かし、そのライゼートを30分、15,000rpm
でJA20ローターで遠心した。
℃でO/Nに再び可溶化した。JA20ローターで15,000rpm で30分の
遠心の後、ペレットを捨てて、上清をIMACにより更に精製した。
) カラム容量:15mL(16mm×7.5cm) パッキング緩衝液:0.1M PO4 −6M GuHCl pH7 サンプル緩衝液:同上 洗浄緩衝液:0.1M PO4 −6M GuHCl pH7 0.1M PO4 −6M尿素 pH7 溶出:6M尿素を補給した0.1M PO4 緩衝液 pH7中のイミダゾール勾
配(0→250mM)。
Omega型カットオフ10,000)でAmicon撹拌セル内で5mLに濃縮
した。この段階の純度はSDS−PAGEにより評価して約70%である。
アクリルアミドゲルに充填した。その抗原を、4% SDSを補給したTris
−Glycine緩衝液 pH8.3中に溶出し、Ns1 −MAGE3 His陽
性画分をプールした。
心した後、上清を捨てた。そのペレットをPBS緩衝液 pH7.4に再び溶かし
た。 そのタンパク質は、凍結/解凍後にPBSに可溶性であり、37℃で3時間、
保存した後にいずれの分解も示さず、そしてSDS(12.5% PAGE)に
より測定して約50,000ダルトンの見掛け分子量を有する。
の調製 1.発現プラスミドpRIT14613の作製及び宿主株AR58の形質転換
: タンパク質デザイン: 大腸菌内で発現させる融合タンパク質Clyta−Mage−1−Hisのデ
ザインを図15に示す。
のこと)を大腸菌発現プラスミド中のλpLプロモーターの制御下においた。 クローニング: 出発材料は、ストレプトコッカス・ニューモニエからのLytAコーディング
領域の117C末端コドンを含むベクターPCUZ1、及び我々が、Ludwig Ins
tituteからDr.Thierry Boon から頂いたプラスミドからの先にサブクローニング
したMAGE−1遺伝子cDNAを有するベクターpRIT14518であった
。
トラテジー(図16の概説を参照のこと)は以下のステップを含む: 2.CLYTA−Mage−1−Hisコーディング配列モジュールの調製: a)最初のステップは、CLYTA配列をNdeI−AflIII 制限部位に隣
接させることを予定したPCR増幅であった。そのPCR増幅は、プラスミドP
CUZ1テンプレート及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス:5′tt
a aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca ga
c 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス:5′GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG
CCT GTC TGC CAG を用いて行った。これは、378ヌクレオチド長のCLYTA
配列の増幅を導く。
て融合タンパク質のためのコーディング配列を作ることであった。このステップ
はNdeI−AflIII 制限フラグメントの切り出し及びNdeI及びNcoI
により先に開裂したベクターpRIT14518(NcoI及びAflIII に適
合)への挿入を含み、プラスミドpRIT14613を作り出す。
選択及びキャラクタリゼーション(図16を参照)。 1.組換えタンパク質CLYTA−MAGE−1−His(pRIT1461
3)のキャラクタリゼーション: 細菌を、30℃で50μg/mlカナマイシンを補給したLB培地で増殖させた
。その培養物がOD=0.3(620nm)に達した時に、温度を38℃に上げる
ことにより熱誘導を行った。
one shot)により(分解により)溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出
物をSDS−PAGEにより分析した。タンパク質をクーマシーB1染色したゲ
ルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約1%を示し
た。組換えタンパク質は約49kDの見掛けMWの単一バンドとして現れた。融合
タンパク質を、抗Mage−1ポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロッ
トにより同定した。
Mage−1コーディング配列pRIT14614により構成される発現ユニッ
トの再構成: 長いPLプロモーター及びCLYTA配列の一部を含むEcoRI−NCO1 制限フラグメントをプラスミドpRIT DVA6から調製し、プラスミドpR
IT14613のEcoRI−NCO1 部位の間に挿入した。
ミドpRIT14614(図17を参照)を用いて大腸菌AR120を形質転換
した。Kan耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。 組換えタンパク質のキャラクタリゼーション: 細菌を50mg/mlのカナマイシンを補給したLB培地で30℃で増殖させた。
その培養物がOD=400(620nm)に達した時に、ナリジクス酸を60mg/
mlの最終濃度まで加えた。
tion)(分解CLS“ワン・ショット”型)により溶解した。遠心後、ペレット
上清及び全抽出物をSDS−PAGEにより分析した。タンパク質をクーマシー
ブルー染色したゲルで可視化した。ここで、その融合タンパク質は全大腸菌タン
パク質の約1%を示した。その融合タンパク質をウサギ抗Mage−1ポリクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質
は約49kDの見掛けMWの単一バンドとして現れた。
発現を導く融合タンパク質CLYTA−Mage−3−Hisはアフィニティー
タグとして機能し、有用なT−ヘルパーを供する。
調製 発現プラスミドpRIT14646の作製及び宿主株AR120の形質転換: タンパク質デザイン: 大腸菌内で発現させる融合タンパク質Clyta−Mage−3−Hisのデ
ザインを図18に示す。
0に記載のコーディング配列を有する。 上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列を大腸菌発現プラスミ
ド内のλpLプロモーターの制御下においた。 クローニング: 出発材料は、Gene 43 (1986) p 265-272に記載されるストレプトコッカス・ニ
ューモニエからのLytAコーディング領域の117C末端コドンを含むベクタ
ーPCUZ1、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Tierry Boonから頂いたプ
ラスミドからのMAGE−3遺伝子cDNAを先にサブクローニングしたベクタ
ーpRIT14426であった。
トラテジー(図19の概説を参照のこと)は以下のステップを含む。 1.CLYTA−MAGE−3−Hisコーディング配列モジュールの調製: 1.1.最初のステップはAflII及びAflIII 制限部位にCLYTAを隣
接させることを予定したPCR増幅であった。PCR増幅は、テンプレートとし
てプラスミドZ1及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス:5′tta aa
c cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、
及びオリゴヌクレオチドアンチセンス:5′ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca
att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、427ヌクレオチド長
CLYTA配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenのTAク
ローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターpRIT14661を得
た。
結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作り出すことであった。この
ステップは、AflII−AflIII フラグメントの切り出し及びAflII及びN
coI(NcoI及びAflII適合)制限酵素により先に開裂したベクターpR
IT14426に挿入することを含み、プラスミドpRIT14662を作り出
した。
TA−Mage−3コーディング配列により構成される発現ユニットの再構成 短いpLプロモーター及びCLYTA−Mage−3−Hisコーディング配
列を含むBglII−XbaI制限フラグメントをプラスミドpRIT14662
から調製し、プラスミドTCM67(国際出願PCT/EP92/01827に
記載される、アンピシリンに対する耐性、及び長いλpLプロモーターを含むr
BR322誘導体)のBglII−XbaI部位の間に挿入した。プラスミドpR
IT14607を得た。
ミドpRIT14607を用いて大腸菌AR120(Mottら、1985, Proc.Natl.
Acad.Sci, 82: 88)を形質転換した。アンピシリン耐性候補株を選択し、キャラ
クタライズした。 3.プラスミドpRIT14646の調製: 最後に、pRIT14607 に類似するがカナマイシン選択を有するプラスミ
ドを作製した(pRIT14646)。
その培養物がOD=400(600nm)に達した時に、ナリジクス酸を60g/
mlの最終濃度まで加えた。 4時間の誘導の後、細胞を収集し、PBSに懸濁し、分解(分解CLS“ワン
・ショット”型)により溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をSD
S−PAGEにより分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色したゲルで
可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約1%を示した。
その融合タンパク質は、ウサギ抗Mage−3ポリクローナル抗体を用いてウェ
スタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約58kDの見掛けMW
の単一バンドとして表れた。
件下で20リッター発酵槽中で増殖させた。組換えタンパク質の発現は、ナリジ
クス酸を60g/mlの最終濃度まで加えることにより誘導した。発酵の終りに細
胞を収集し、フレンチプレス破砕機(20,000psi )に2回、通すことによ
り60 OD/600に溶解した。溶解した細胞を4℃で15,000gで20
分、ペレット化した。組換えタンパク質を含む上清を、0.3M NaCl、2
0mM Tris HCl pH7.6(緩衝液A)で予め平衡化した交換DEAE Sep
harose CL6B 樹脂(Pharmacia )に充填した。緩衝液Aでのカラム洗浄の後、融
合タンパク質を緩衝液A中2%コリンにより溶出した。抗Mage−3抗体を用
いてウェスタン・ブロット分析により表した陽性抗原画分をプールした。DEA
Eで溶出した抗原を0.5% Empigen BB(両性イオン界面活性剤)
に及び0.5M NaClにし、次に0.5% Empigen BB、0.5
M NaCl、50mMリン酸緩衝液 pH7.6(緩衝液B)で予め平衡化したIo
n Metal Affinityクロマトグラフィーカラムに充填した。
った。界面活性剤を除去するためのEmpigen BBを含まない緩衝液B(
緩衝液C)での第2の洗浄を行い、次に抗原を緩衝液C中のイミダゾール勾配0
〜250mMにより溶出した。 0.090〜0.250Mイミダゾール画分をプールし、10kDa Filt
ronオメガ膜で濃縮し、次にPBS緩衝液に対して透析した。
性であること、及びこの免疫原性(増殖性応答及び抗体応答)は、上述のアジュ
バントの使用により更に増加させることができることを証明した。精製は、ジス
ルフィド結合を形成するチオールを誘導化することにより増強することができる
。
ン接種によりより優れた抗体応答が誘発されることも証明した。C57BL/6
の血清中に見い出される主要なアイソタイプがIgG2bであることは、TH1
型免疫応答が生じたことを示唆する。 ヒトにおいてアジュバントを加えない製剤中のLPD−MAGE3−Hisで
患者を臨床的に処置すると、黒色腫を除去した。
載の方法によりMAGEタンパク質又はその誘導体を精製し、そして得られたタ
ンパク質をワクチンとして調剤することを含む方法。
おいて、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば5〜9、好ましくは6のヒ
スチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助す
るのに有利である。 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は
好適な発現ベクターに挿入してDNA/RNAワクチン接種のために用い又は好
適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワク
チンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイ
ルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモナルファージ(mo
narphage)がある。
より、DNAの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができ
る。 組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複
製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件
は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning″ Vol.II, D.M.Gl
over ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
がアジュバントとして添加された、本発明のタンパク質、より好ましくはリポプ
ロテインD(又はその誘導体)−MAGE−3を含むワクチンを供する。 好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはQS21を更に含む
。
ン酸ナトリウム(0.1M、pH7.0)及びイミダゾール(0.5M)を含む溶
液2カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約16mS/cmであった
。 1.5)アニオン交換クロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なLPD−MAGE−
3−Hisタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素(6M)及びTris−H
Cl(20mM、pH8.0)を含む溶液で希釈することにより約4mS/cmに減少さ
せた。
トラテジー(図19の概説を参照のこと)は以下のステップを含む。 1.CLYTA−MAGE−3−Hisコーディング配列モジュールの調製: 1.1.最初のステップはAflII及びAflIII 制限部位にCLYTAを隣
接させることを予定したPCR増幅であった。PCR増幅は、テンプレートとし
てプラスミドPCUZ1及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス:5′
tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca
gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス:5′ccc aca tgt cca gac tgc tg
g cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、427ヌクレオ
チド長CLYTA配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenの
TAクローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターpRIT1466
1を得た。
Claims (20)
- 【請求項1】 MAGEファミリーからの腫瘍関連抗原誘導体。
- 【請求項2】 前記誘導体が免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサー
パートナーに連結したMAGEタンパク質であることを特徴とする請求項1に記
載の抗原。 - 【請求項3】 前記誘導体がアフィニティータグを含むことを特徴とする請
求項1又は2に記載の抗原。 - 【請求項4】 誘導化遊離チオールを含む請求項1〜3のいずれかに記載の
抗原。 - 【請求項5】 カルボキシアミド誘導体又はカルボキシメチル化誘導体であ
る請求項4に記載の抗原。 - 【請求項6】 前記融合パートナーがヘモフィルス・インフルエンゼ(Heam
ophilus influenzae)BからのプロテインDもしくはそのフラグメント、インフ
ルエンザからのNS1タンパク質もしくはそのフラグメント、又はストレプトコ
ッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)からのLytaもしくはそ
のフラグメントであることを特徴とする請求項2,3,4又は5に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項7】 前記融合パートナーがヘモフィルス・インフルエンゼBから
のプロテインD又はそのフラグメントの脂質化型であることを特徴とする請求項
2,3,4又は5に記載のタンパク質。 - 【請求項8】 前記MAGEタンパク質が、MAGE A1,MAGE A
2,MAGE A3,MAGE A4,MAGE A5,MAGE A6,MA
GE A7,MAGE A8,MAGE A9,MAGE A10,MAGE
A11,MAGE A12,MAGE B1,MAGE B2,MAGE B3
及びMAGE B4,MAGE C1,MAGE C2、からなる群から選択さ
れることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のタンパク質。 - 【請求項9】 請求項1〜8のいずれかに記載のタンパク質をコードする核
酸配列。 - 【請求項10】 請求項9に記載の核酸を含むベクター。
- 【請求項11】 請求項10に記載のベクターで形質転換された宿主。
- 【請求項12】 請求項1〜8のいずれかに記載のタンパク質又は請求項9
に記載の核酸を含むワクチン。 - 【請求項13】 アジュバント、及び/又は免疫刺激性サイトカイン又はケ
モカインを更に含む請求項12に記載のワクチン。 - 【請求項14】 前記タンパク質が水中油又は油中水エマルションビヒクル
中に供されることを特徴とする請求項12又は13に記載の方法。 - 【請求項15】 前記アジュバントが、3D−MPL,QS21又はCpG
オリゴヌクレオチドを含む請求項13又は14に記載のワクチン。 - 【請求項16】 1又は複数の抗原を更に含む請求項12〜15のいずれか
に記載のワクチン。 - 【請求項17】 医学に用いるための請求項12〜16のいずれかに記載の
ワクチン。 - 【請求項18】 黒色腫又は他のMAGE関連腫瘍を患う患者を免疫療法的
に治療するためのワクチンの製造のための請求項1〜8のいずれかに記載のタン
パク質又は請求項9に記載の核酸の使用。 - 【請求項19】 MAGEタンパク質又はその誘導体を精製するための方法
であって、ジスルフィド結合を還元し、得られた遊離チオール基をブロッキング
基でブロッキングし、そして得られた誘導体を1又は複数のクロマトグラフィー
精製ステップにかけることを含む方法。 - 【請求項20】 ワクチンを製造するための方法であって、請求項19に記
載の方法によりMAGEタンパク質又はその誘導体を精製し、そして得られたタ
ンパク質をワクチンとして調剤することを含む方法。
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