DE69835776T2

DE69835776T2 - Gerät und Verfahren zur Mikroskopie unter Verwendung räumlich modulierten Lichtes

Info

Publication number: DE69835776T2
Application number: DE69835776T
Authority: DE
Inventors: E. Calum Vancouver MacAulay
Original assignee: Individual
Current assignee: Motic China Group Co Ltd Xiamen Cn
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: US7755832B2; US20070188856A1; EP1207414B1; US6483641B1; WO1999022262A1; EP1207414A1; EP1207415B1; US20080316571A1; JP2001521205A; JP4372996B2; ATE220465T1; EP1027624B1; DE69806496T2; EP1207415A1; DE69835776D1; CA2307315C; EP1027624A1; US20040047030A1; AU9617598A; CA2307315A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Vergrößerung von Bildern von Objekten und insbesondere Mikroskope und das Gebiet von Mikroskopie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mikroskopie wird verwendet, um vergrößerte Darstellungen von sowohl dynamischen als auch stationären Objekten oder Proben zu erzeugen. Es gibt viele unterschiedliche Modi von Mikroskopie, wie z.B. Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Reflexions- oder Auflichtmikroskopie und konfokale Mikroskopie. Sämtliche dieser Formen von Mikroskopie geben Beleuchtungslicht auf eine gesteuerte Weise zur Probe und sammeln so viel von dem die gewünschte Information über die Probe enthaltenden Licht wie möglich. Typischerweise wird dies erreicht, indem man Köhlerbeleuchtung bei jeglicher von Reflexionsmikroskopie, Durchlichtmikroskopie oder Auflichtfluoreszenzmikroskopie verwendet. Beide von diesen Verfahren verwenden geeignet angeordnete Blenden und Linsen, um sowohl die Größe der numerischen Apertur (Beleuchtungskonus) als auch die Größe des beleuchteten Bereichs der Probe zu steuern. Bei der Köhlerbeleuchtung werden Blenden an mindestens zwei Stellen angeordnet. Erstens wird eine Blende in der konjugierten Bildebene der Probe angeordnet, eine Stelle, die eine Steuerung der Größe des beleuchteten Bereichs der Probe ermöglicht. Zweitens wird eine Blende in der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse(n) angeordnet (diese Stelle ist auch eine konjugierte Bildebene der Aperturblende der Kondensorlinse(n)), eine Stelle, die eine Steuerung des Winkels (der Winkel) des die Probe beleuchtenden Lichts ermöglicht. Typischerweise kann jegliche von den Blenden eine einfache Irisblende sein (z.B. für Hellfeldmikroskopie und Auflichtbeleuchtungsfluoreszenzmikroskopie), aber die Blenden können auch komplexer sein (z.B. bei der Dunkelfeldmikroskopie, wo die Blenden herausgeschnittene Ringe von unterschiedlichen Durchmessern umfassen können).
Ein Beispiel für ein Mikroskop, das die Köhlerbeleuchtung verwendet, ist in 1 dargelegt. In der Figur umfasst ein Mikroskop 2 eine Lichtquelle 4, die eine Mehrzahl von Lichtstrahlen emittiert, die in erste Lichtstrahlen 6, zweite Lichtstrahlen 8 und dritte Lichtstrahlen 10 unterteilt worden sind. Die Lichtstrahlen werden entlang einem Beleuchtungsstrahlengang 3 von der Lichtquelle 4 durch eine Lichtquellenlinse 12, eine einstellbare Irisfeldblende 14 und Kondensorlinsen 16 durchgelassen. Eine einstellbare Irisaperturblende (Kondensor) 18 kann zwischen eintrittsseitigen und austrittsseitigen Kondensorlinsen 16 angeordnet sein. Das Licht trifft dann eine Probe 20 oder trifft auf diese auf und setzt dann seinen Weg fort, um durch Objektivlinsen 22 hindurch zu treten, welche Objektivlinsen eine Aperturblende (Objektiv) 24 umfassen können, die zwischen den Objektivlinsen 22 im Abstand angeordnet ist, und dann setzen die Lichtstrahlen ihren Weg zu einem Lichtdetektor 26 fort. Wie oben erwähnt, kann der Beleuchtungswinkel der Probe gesteuert werden, indem man das Licht moduliert, während es durch konjugierte Bildebenen der Aperturblende der Objektivlinse hindurch tritt, welche Ebenen z.B. bei der Lichtquelle 4 und der eintrittsseitigen Aperturblende 18 in 1 gefunden werden können, während die Stelle und/oder der Bereich einer Beleuchtung der Probe gesteuert werden kann, indem man Licht moduliert, während es durch eine konjugierte Bildebene der Probe hindurch tritt, welche Ebene der einstellbaren Irisfeldblende 14 in 1 entspricht.
Eine bevorzugte Form von Mikroskopie ist konfokale Mikroskopie, bei der diskrete Aperturflecken in der Objektebene des Mikroskops beleuchtet werden, von welcher Durch-, Reflexions- oder Fluoreszenzlicht dann durch konjugierte Aperturen in der Bildebene zur Beobachtung weitergeleitet wird. In einigen Ausführungsformen kann konfokale Mikroskopie zu einer räumlichen Auflösung führen, die etwa 1,3 mal besser ist als die beste Auflösung, die durch herkömmliche Lichtmikroskopie erhältlich ist. Siehe z.B. das US-Patent No. 5,587,832. Außerdem kann konfokale Mikroskopie die Interferenz von streuendem defokussiertem Licht von einer beobachteten Probe über oder unter der Brennebene verringern und kann eine optische Schnittanfertigung von Gewebe sowie eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion des Gewebes ermöglichen. Die Technik kann einzelne Zellen und lebendes Gewebe ohne Anfärben wirkungsvoll auflösen. Konfokale Mikroskopie kann durchgeführt werden, indem man eine mechanische Translationsbewegung der Probe mit fester Optik verwendet oder indem man eine feste Probe und Abtaststrahlen verwendet, die durch spezielle rotierende Lochscheiben gehandhabt werden. Siehe das US-Patent No. 4,802,748, das US-Patent No. 5,067,805, das US-Patent No. 5,099,363, das US-Patent No. 5,162,941. Solche Scheiben umfassen typischerweise eine Mehrzahl von Aperturen, aber es wird jeweils nur eine einzige Apertur für ein konfokales Abtasten verwendet. Noch andere bekannte konfokale Abtastsysteme haben einen Laserstrahl, der mit rotierenden Spiegeln gerastert wird, um eine Probe abzutasten, oder einen Laserstrahl verwendet, der einen Schlitz statt eines Flecks abtastet; ein solches Schlitzabtasten erhöht die Abbildungsgeschwindigkeit, verschlechtert aber geringfügig die Auflösung. Siehe das US-Patent No. 5,587,832.
Die DE-A-31 08 389 offenbart ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff der Ansprüche 1, 2 und 19. Dieses Mikroskop umfasst ein Helligkeitssteuersystem, bei dem die Helligkeitsbedingungen vorgewählt werden können, indem man eine elektronische Steuerschaltung verwendet. Das Objekt, das untersucht wird, wird auf einen Objekttisch angeordnet. Ein Kondensorlinsensystem lenkt den Strahl von der Lichtquelle zum Objekt. Eine elektrisch gesteuerte Lichtdurchlasseinheit wird in den Pfad des Strahls von der Lichtquelle durch das Kondensorlinsensystem hindurch angeordnet. Eine Oberfläche der Einheit wird mit einem elektro-optischen Material unter rechtem Winkel zum Pfad des Lichts bedeckt. Die Elektroden sind an gegenüberliegenden Oberflächen angebracht. Verschiedene Muster zum Anregen des elektro-optischen Materials werden bereitgestellt. Die Elektroden werden selektiv gesteuert.
JP-A-03 134608 (Patent Abstracts of Japan Vol. 015, No. 349 (P-1247)) offenbart einen Scan-Mechanismus mit einem einzigen Beleuchtungsstrahlengang, der Probenbeleuchtungslicht durch eine Blendenreihe schafft, wenn die Beleuchtung als ein kleiner Lichtpunkt P auf eine Probe zusammengeführt wird und das Bild des Lichtstromes des durchgelassenen Lichtes an einem Punkt Q auf einem Flüssigkristallfeld gebildet wird, dann eine der Blenden aufeinanderfolgend und selektiv geöffnet wird und das Licht auf eine Lichtempfangsfläche eines Photodetektors fallen gelassen wird, um ein Signal S zu erzeugen, das die Helligkeit des Punktbildes Q anzeigt. Auf diese Weise wird die Position des Punktbildes Q zweidimensional bewegt, wenn der Lichtpunkt P zweidimensional abgetastet wird.
Bei herkömmlichen konfokalen Mikroskopen kann es lange dauern, um Bilder für gewisse Anwendungen zu erfassen, und es kann sogar noch länger dauern, wenn die Abtastzeilendichte ansteigt und die Aperturtrennung abnimmt. Außerdem ist es schwierig, die Perimeter des konfokalen Mikroskops in handelsüblichen Systemen praktisch einzustellen und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wird geopfert, um die Abbildungsgeschwindigkeit zu erhöhen. Außerdem kann eine richtige Ausrichtung von herkömmlichen konfokalen Systemen kritisch und schwierig aufrechtzuerhalten sein. Außerdem sind Systeme auf Laser-Basis zwar kostspieliger als Weißlichtsysteme, aber solche Lasersysteme bieten keine Auswahl von Beleuchtungswellenlängen und können auch zu Fototoxizität und einer schnellen Fotoausbleichung führe
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht in einem Mikroskop und in einem Verfahren zum Projizieren eines ausgewählten Bildes in eine Bildebene der Probe des Mikroskops.
Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 angegebene Mikroskop und durch das in Anspruch 17 angegebene Verfahren gelöst.
Bevorzugte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Vorteile der Erfindung bestehen insbesondere darin, dass der Winkel der Beleuchtung einer Probe einfach und schnell gesteuert werden kann und dass die Lichtmenge, die die Probe erreicht, einfach und leicht gesteuert werden kann, einschließlich sowohl der Änderung der absoluten Lichtmenge als auch der Stelle auf der Probe, auf die die Lichtmenge auftrifft.
Die vorliegende Erfindung stellt Mikroskope bereit, wie in Anspruch 1 definiert.
In bestimmten Ausführungsformen ist der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator in sowohl dem ersten Beleuchtungsstrahlengang als auch dem zweiten Beleuchtungsstrahlengang angeordnet, und ein erster Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays liefert Beleuchtungslicht zur Probe, und ein zweiter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays befindet sich in einem Ein/Aus-Zustand, entsprechend dem ausgewählten Bild.
In weiteren Ausführungsformen, in denen die Mikroskope weiter einen Lichtdetektor umfassen, der austrittsseitig von der Probe in einem Detektionsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die vom Lichtdetektor bereitgestellt werden, variiert der Kontroller selektiv den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, um die auf ausgewählte Flecken der Probe auftreffende Lichtintensität zu variieren und dadurch die Intensität von Licht zu variieren, das von den ausgewählten Flecken der Probe ausgeht und auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Projizieren eines ausgewählten Bildes in eine Bildebene einer Probe eines Mikroskops, wie in Anspruch 15 definiert. Abhängige Ansprüche definieren zusätzliche Ausführungsformen.
In anderen Ausführungsformen, in denen das Mikroskop weiter einen Lichtdetektor umfasst, der ein Detektionsarray umfasst, umfassen die Verfahren weiter: selektives Variieren des Ein/Aus-Zustands von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, um die auf ausgewählte Flecken der Probe auftreffende Lichtintensität zu variieren und dadurch die Intensität von Licht zu variieren, das von den ausgewählten Flecken der Probe ausgeht und auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft.
Die Mikroskope weisen signifikante Vorteile beim Steuern des Lichts auf, das mit einer Probe in Berührung kommt und/oder das ausgehend von einer Probe detektiert wird. Die Steuerung umfasst eine verbesserte selektive Steuerung des Beleuchtungswinkels, der Lichtmenge und der Stelle von Licht, das die Probe und/oder den Detektor erreicht. Die Vorteile werden erhalten, indem einer oder mehrere räumliche Lichtmodulatoren in den Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengang des Mikroskops an einer oder beiden der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse und der konjugierten Bildebene der Probe platziert werden.
Die Mikroskope umfassen einen räumlichen Lichtmodulator, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst, wobei der räumliche Lichtmodulator in einem Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende einer Objektivlinse angeordnet ist, um einen eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen.
Die Mikroskope steuern selektiv den Beleuchtungswinkel einer Probe und den Detektionswinkel von Licht, das von der Probe ausgeht, wobei der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator mit einem Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert, um einen gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel der Probe auszuwählen, und wobei ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend dem gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel eingeschaltet ist. Die Mikroskope steuern selektiv eine Lichtmenge, die eine Probe erreicht, wobei die Menge kleiner als sämtliches Licht ist, das durch eine Lichtquelle emittiert wird, die an einem Anfang des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet ist, wobei der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator mit einem Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert, um eine gewünschte Beleuchtungsmenge auszuwählen, und wobei ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend der gewünschten Beleuchtungsmenge eingeschaltet ist.
Die Mikroskope können Durchlicht- oder Reflexionsmikroskope sein. Die Mikroskope können eine Linse umfassen, die im Beleuchtungsstrahlengang zwischen einer Lichtquelle und dem räumlichen Lichtmodulator angeordnet ist, wobei die Lichtquelle an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist, die eintrittsseitig von dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator angeordnet ist. Die Mikroskope können weiter einen zweiten räumlichen Lichtmodulator umfassen, der in einem Detektionsstrahlengang angeordnet ist, der an einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist und mit einem zweiten Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des zweiten räumlichen Lichtmodulators steuert. Vorzugsweise ist der erste Modulatorkontroller mit dem zweiten Modulatorkontroller funktional verbunden, so dass der zweite Lichtmodulator das Licht im Detektionsstrahlengang selektiv steuert, um dem gewünschten Winkel zu entsprechen, der durch den ersten Modulatorkontroller ausgewählt ist; die verschiedenen Kontroller, die hierin erörtert sind, können separate Kontroller sein oder können ein einziger Kontroller sein.
Die Mikroskope können Dunkelfeldmikroskopie bereitstellen, wobei der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator mit einem ersten Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert, um ein gewünschtes Muster zur Dunkelfeldmikroskopie auszuwählen, und ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend dem gewünschten Muster zur Dunkelfeldmikroskopie eingeschaltet ist und ein zweiter räumlicher Lichtmodulator in einem Detektionsstrahlengang angeordnet ist, der an einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist und mit einem zweiten Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des zweiten räumlichen Lichtmodulators steuert, um ein komplementäres Muster der einzelnen Lichtdurchlasspixel des zweiten räumlichen Lichtmodulators auszuwählen, um das Muster von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des ersten räumlichen Lichtmodulators zu ergänzen, die eingeschaltet sind, wodurch ein komplementäres Muster der einzelnen Lichtdurchlasspixel des zweiten räumlichen Lichtmodulators bereitgestellt wird, die eingeschaltet sind.
Die Mikroskope können zwischen Dunkelfeldmikroskopie und Hellfeldmikroskopie wechseln. Dies kann z.B. erzielt werden, wobei der erste Modulatorkontroller und der zweite Modulatorkontroller die Durchlasseigenschaften des ersten und zweiten räumlichen Lichtmodulators steuern, um zwischen Hellfeldmikroskopie und mindestens einem gewünschten Muster zur Dunkelfeldmikroskopie zu schalten. Für diese und andere Ausführungsformen, die ein Durchlaufen eines Zyklus oder ein Verfahren umfassen, führen die Mikroskope vorzugsweise das Verfahren oder den Zyklus aus, um z.B. zwischen Dunkelfeldmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mit einer Zyklus- oder Verfahrenszeit von weniger als die Zeit hin- und her zu wechseln, die für den Detektor, wie z.B. ein menschliches Auge oder eine Videokamera, benötigt wird, um ein Bild zu erfassen, z.B. weniger als etwa 0,03 Sekunden, wodurch ein Echtzeitbetrachten bereitgestellt wird, wenn gewünscht. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wechseln die Mikroskope zwischen Dunkelfeldmikroskopie und Hellfeldmikroskopie ohne Neufokussieren hin und her.
Die Mikroskope umfassen einen Lichtdetektor, der an einem austrittsseitigen Ende eines Detektionsstrahlengangs angeordnet ist, wobei der Lichtdetektor ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst. In einigen Modifikationen entspricht das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln dem Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln in dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator und ist damit ausgerichtet, und das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln ist mit einem Detektorkontroller funktional verbunden, und das Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im räumlichen Lichtmodulator ist mit dem Modulatorkontroller verbunden, so dass der Modulatorkontroller Computer-implementierte Programmierung enthält, die eine Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe auswählt, und der Detektorkontroller enthält Computer-implementierte Programmierung, die die Änderungen in einer Intensität im Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln entsprechend der Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkeln detektiert und daraus ein dreidimensionales Bild der Probe bestimmt. In anderen Modifikationen, die mit den vorhergehenden Modifikationen kombiniert werden können, wählt der Modulatorkontroller eine Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe aus, um eine Mehrzahl von Bildern der Probe bei einer entsprechenden Mehrzahl von unterschiedlichen Tiefen in der Probe bereitzustellen, und ein Rekonstruktionskontroller umfasst Computer-implementierte Programmierung, die die unterschiedlichen Bilder tomographisch rekonstruiert, um ein dreidimensionales Bild der Probe bereitzustellen.
Der Modulatorkontroller kann die Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe auswählen, so dass die Mehrzahl von Bildern der Probe bei einer entsprechenden Mehrzahl von unterschiedlichen Tiefen erhalten werden, ohne dass die Probe, eine Kondensorlinse oder eine Objektivlinse bewegt werden.
Der Lichtdetektor kann ein Ladungsspeicherbauelement, ein Ladungsinjektionsbauelement, eine Videokamera sein, und die Mikroskope können ein oder mehrere Fotovervielfacher und/oder Okulare sein, die an einem austrittsseitigen Ende des Detektionsstrahlengangs angeordnet sind. Der räumliche Lichtmodulator kann z.B. ein digitales Mikrospiegelbauelement, Mikroverschlussblende oder ein Flüssigkristallbauelement sein.
Die Mikroskope können eine variable Feldirisblende umfassen, wobei die Mikroskope einen räumlichen Lichtmodulator umfassen, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, um einen eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen und der mit einem Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert, um eine Mehrzahl von gewünschten Feldirisblendeneinstellungen auszuwählen. Die einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays können entsprechend der gewünschten Feldirisblendeneinstellung im Ein/Aus-Zustand sein.
Die Mikroskope können eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität zu einer Probe liefern, wobei die Mikroskope umfassen: einen räumlichen Lichtmodulator, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, um einen eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen, und einen Lichtdetektor, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und austrittsseitig von dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, und der Licht direkt von dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator empfängt, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die vom Lichtdetektor bereitgestellt werden, wobei der mindestens eine Kontroller den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators selektiv variiert, um ungleichförmige Lichtintensitäten zu kompensieren, die durch den Lichtdetektor detektiert werden, wodurch eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität geliefert wird, die zur Probe durchgelassen wird.
Die Mikroskope können die Intensität von Licht, das von einer Probe ausgeht, zu einem Lichtdetektor variieren, wobei die Mikroskope umfassen: einen räumlichen Lichtmodulator, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, um einen eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen, und den Lichtdetektor, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und austrittsseitig von der Probe in einem Detektionsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die vom Lichtdetektor bereitgestellt werden, wobei der Kontroller den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators selektiv variiert, um die auf ausgewählte Flecken der Probe auftreffende Lichtintensität zu variieren und dadurch die Intensität von Licht zu variieren, das von den ausgewählten Flecken der Probe ausgeht und auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft.
Der Kontroller kann den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators selektiv variieren, so dass, wenn die Lichtintensität, die auf ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft, größer als oder gleich einem Schwellenwert ist, der anzeigt, dass die Lichtintensität benachbarte Pixel signifikant nachteilig beeinträchtigt, dann mindestens ein entsprechendes Pixel im eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator für eine
Zeit ausgeschaltet wird, die ausreicht, um die Lichtintensität, die auf das Pixel des Lichtdetektors auftrifft, unter den Schwellenwert zu verringern. In weiteren Ausführungsformen variiert der Kontroller selektiv den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, so dass die Lichtintensität, die auf das Detektionsarray von Pixeln des Lichtdetektors auftrifft, über das Detektionsarray gleichförmig ist, und bestimmt der Kontroller die Lichtintensitätseigenschaften der Probe, indem eine Zeit bestimmt wird, in der einzelne Pixel im Beleuchtungsarray des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators ein- oder ausgeschaltet sind.
Die Mikroskope können weiter einen zweiten räumlichen Lichtmodulator umfassen, der im Detektionsstrahlengang angeordnet ist, der an einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist und mit einem zweiten Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des zweiten räumlichen Lichtmodulators steuert. In anderen Ausführungsformen können die Mikroskope ein konfokales Mikroskop sein. Das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln kann dem Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln in dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator entsprechen und mit ihm ausgerichtet sein. Der mindestens eine Kontroller enthält Computer-implementierte Programmierung, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert, um mindestens einen Beleuchtungsfleck zur Probe zu liefern, indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind, und das Detektionsarray detektiert selektiv den Beleuchtungsfleck. Der mindestens eine Kontroller kann bewirken, dass der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator gleichzeitig eine Mehrzahl der Beleuchtungsflecken bildet und sequenzielle komplementäre Muster der Flecken bereitstellt.
Der mindestens eine Kontroller kann bewirken, dass der Lichtdetektor nur Licht detektiert, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators, das eingeschaltet ist, ausgerichtet ist und ihm entspricht. Der mindestens eine Kontroller kann auch bewirken, dass der Lichtdetektor Licht detektiert, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators ausgerichtet ist, das eingeschaltet ist, und Licht detektiert, das auf mindestens ein Detektionspixel auftrifft, das benachbart zum mittigen Detektionspixel ist, und der Kontroller enthält Computer-implementierte Programmierung, die die Daten zusammenstellt, die durch das mindestens eine benachbarte Detektionspixel bereitgestellt werden, und kombiniert sie mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stellt die Computer-implementierte Programmierung die Daten zusammen, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und kombiniert sie mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, so dass die Rückweisung der Nicht-im-Fokus-Information des Mikroskops verbessert wird, im Vergleich mit dem Fokus ohne die Daten von den benachbarten Detektionspixeln, und/oder stellt die Daten zusammen, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und kombiniert sie mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, um die Lichtabsorptionseigenschaften der Probe zu bestimmen.
Die Mikroskope können einen ersten räumlichen Lichtmodulator umfassen, der ein erstes Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst, wobei der erste räumliche Lichtmodulator in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende einer Objektivlinse angeordnet ist, um einen ersten eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator und einen zweiten räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen, der ein zweites Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und im Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, um einen zweiten eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen. Die Mikroskope können weiter einen dritten räumlichen Lichtmodulator, der an der austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist, umfassen, und/oder es ist ein vierter räumlicher Lichtmodulator im Detektionsstrahlengang angeordnet und an der austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet, sowie auch gewünschte Detektoren und/oder Kontroller.
Die Mikroskope können konfokale Eigenschaften bereitstellen und den Beleuchtungswinkel einer Probe und den Detektionswinkel von Licht, das von der Probe ausgeht, selektiv steuern, wobei die Computer-implementierte Programmierung, die Durchlasseigenschaften des ersten räumlichen Lichtmodulators steuert, einen gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel der Probe auswählt, und wobei ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel des ersten räumlichen Lichtmodulators entsprechend dem gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel eingeschaltet ist, und wobei die Computer-implementierte Programmierung, die Durchlasseigenschaften des zweiten räumlichen Lichtmodulators steuert, mindestens einen Beleuchtungsfleck zur Probe liefert, indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des zweiten räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind und die Detektionspixel des Detektionsarrays positioniert sind, um den Beleuchtungsfleck selektiv zu detektieren.
Die Computer-implementierte Programmierung kann bewirken, dass das Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im ersten räumlichen Lichtmodulator eine Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe bereitstellt und dass das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln Änderungen in einer Intensität im Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln entsprechend der Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln detektiert, und daraus ein dreidimensionales Bild der Probe bestimmen. Die Computer-implementierte Programmierung kann auch bewirken, dass das Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im ersten räumlichen Lichtmodulator eine Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe bereitstellt, um eine Mehrzahl von Bildern der Probe an einer entsprechenden Mehrzahl von unterschiedlichen Tiefen in der Probe bereitzustellen, und rekonstruiert dann die unterschiedlichen Bilder, um ein dreidimensionales Bild der Probe bereitzustellen. Diese Ausführungsformen werden vorzugsweise ohne Bewegen der Probe, einer Kondensorlinse oder einer Objektivlinse bewerkstelligt und können auch eine Dunkelfeldmikroskopie selektiv bereitstellen, indem bewirkt wird, dass das Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im ersten räumlichen Lichtmodulator ein gewünschtes Muster zur Dunkelfeldmikroskopie bereitstellt, und ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend dem gewünschten Muster zur Dunkelfeldmikroskopie ist eingeschaltet, und ein komplementäres Muster der einzelnen Lichtdurchlasspixel des dritten räumlichen Lichtmodulators ist eingeschaltet. Die Mikroskope können zwischen Dunkelfeldmikroskopie und Hellfeldmikroskopie ohne Neufokussieren wechseln.
Die Computer-implementierte Programmierung kann auch bewirken, dass der Lichtdetektor nur Licht detektiert, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des zweiten räumlichen Lichtmodulators, das eingeschaltet ist, ausgerichtet ist und ihm entspricht, und kann die Daten zusammenstellen, die durch das mindestens eine benachbarte Detektionspixel bereitgestellt werden, und sie mit den Daten kombinieren, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden. Folglich kann die Computer-implementierte Programmierung die Daten zusammenstellen, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und sie mit den Daten kombinieren, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, so dass der Fokus des Mikroskops verbessert wird, im Vergleich mit dem Fokus ohne die Daten von den benachbarten Detektionspixeln.
Die Mikroskope können auch zeitverzögerte Fluoreszenzdetektion bereitstellen, wobei die Computer-implementierte Programmierung bewirkt, dass mindestens einer von den räumlichen Lichtmodulatoren die Probe für eine Zeit beleuchtet, die ausreicht, um eine Fluoreszenz in der Probe zu induzieren, und dann die Beleuchtung der Probe aufhören lässt und dann bewirkt, dass der Detektor damit beginnt, eine Fluoreszenz zu detektieren, die von der Probe ausgeht.
Die Mikroskope können eine Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation umfassen, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende einer Objektivlinse angeordnet ist, welche Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation eine Einrichtung zum selektiven Steuern eines gewünschten Beleuchtungswinkels einer Probe umfassen kann, wobei die Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation mit einer Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators funktional verbunden ist, um den gewünschten Beleuchtungswinkel der Probe auszuwählen. Die Mikroskope können eine variable Feldirisblende umfassen, wobei die Mikroskope eine Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation umfassen, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, wobei die umfassende Einrichtung zur räumliche Lichtmodulation mit einer Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators und zum Auswählen einer Mehrzahl von gewünschten Feldirisblendeneinstellungen funktional verbunden ist.
Die Mikroskope können ein ausgewähltes Bild in die Bildebene einer Probe projizieren, wobei das Mikroskop eine Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation umfasst, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, wobei die Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation mit mindestens einer Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation und zur Projektion des ausgewählten Bilds in die Bildebene der Probe funktional verbunden ist, wobei das Mikroskop weiter einen zweiten Beleuchtungsstrahlengang umfasst, der Beleuchtungslicht zur Probe bereitstellt.
Die Mikroskope können eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität zu einer Probe liefern, wobei das Mikroskop umfasst: eine Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, und eine Einrichtung zur Detektion von Licht, die austrittsseitig von der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist und die Licht direkt von der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation empfängt, wobei die Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation und die Einrichtung zur Detektion von Licht mit mindestens einer Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation funktional verbunden sind und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die durch die Einrichtung zur Detektion von Licht bereitgestellt werden, wobei die Computereinrichtung die Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation selektiv steuert, um ungleichförmige Lichtintensitäten zu kompensieren, die durch den Lichtdetektor detektiert werden, wodurch eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität geliefert wird, die zur Probe durchgelassen wird. Die Mikroskope können die Intensität von Licht, das von einer Probe ausgeht, zu einer Einrichtung zur Detektion von Licht variieren, wobei das Mikroskop umfasst: eine Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, und eine Einrichtung zur Detektion von Licht, die austrittsseitig von der Probe in einem Detektionsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, wobei die Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation und die Einrichtung zur Detektion von Licht mit mindestens einer Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation funktional verbunden sind und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die durch die Einrichtung zur Detektion von Licht bereitgestellt werden, wobei die Computereinrichtung die Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation selektiv steuert, um die auf ausgewählte Flecken der Probe auftreffende Lichtintensität zu variieren und dadurch die Intensität von Licht zu variieren, das von den ausgewählten Flecken der Probe ausgeht und auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft.
Die Computereinrichtung kann die Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation selektiv variieren, so dass, wenn die Lichtintensität, die auf ein Pixel der Einrichtung zur Detektion von Licht auftrifft, größer als oder gleich einem Schwellenwert ist, der anzeigt, dass die Lichtintensität benachbarte Pixel signifikant nachteilig beeinflusst, dann die Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation für eine Zeit variiert werden, die ausreicht, um die Lichtintensität, die auf das Pixel der Einrichtung zur Detektion von Licht auftrifft, unter den Schwellenwert zu verringern. Die Computereinrichtung kann auch die Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation selektiv variieren, so dass die Lichtintensität, die auf die Einrichtung zur Detektion von Licht auftrifft, gleichförmig über der Einrichtung zur Detektion von Licht ist, und die Computereinrichtung bestimmt die Lichtintensitätseigenschaften der Probe, indem eine Variation der Durchlasseigenschaften der Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation bestimmt wird. Die Mikroskope können weiter eine zweite Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation umfassen, die im Detektionsstrahlengang an einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist und mit einer zweiten Computereinrichtung zum Steuern von Durchlasseigenschaften der zweiten Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation funktional verbunden ist.
Die Mikroskope können umfassen: eine erste Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende einer Objektivlinse angeordnet ist, und eine zweite Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die im Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist. Die Mikroskope können weiter umfassen: eine dritte Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die an einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist, eine vierte Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation, die im Detektionsstrahlengang angeordnet ist und an der austrittsseitigen konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, oder eine Einrichtung zur Detektion von Licht, die an einem austrittsseitigen Ende des Detektionsstrahlengangs angeordnet ist. Sämtliche Einrichtungen zur räumlichen Lichtmodulation und die Einrichtungen zur Detektion von Licht können mit mindestens einer Computereinrichtung zum Steuern der Lichtdurchlass- oder Detektionseigenschaften von der mindestens einen Einrichtung zur räumlichen Lichtmodulation und der Einrichtung zur Detektion von Licht funktional verbunden sein.
In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiter ein selektives Steuern eines Beleuchtungswinkels einer Probe und eines Detektionswinkels von Licht, das von der Probe ausgeht, indem ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend dem gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel eingeschaltet wird. In anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiter ein selektives Steuern der Lichtmenge, die eine Probe erreicht, wobei die Menge kleiner als sämtliches Licht ist, das von der Lichtquelle emittiert wird, die an einem Anfang des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet ist, wobei die Verfahren umfassen: Auswählen einer gewünschten Beleuchtungsmenge, indem ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel entsprechend der gewünschten Beleuchtungsmenge eingeschaltet wird. In weiteren Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiter Dunkelfeldmikroskopie, und die Verfahren umfassen weiter: In-Betrieb-nehmen eines ausgewählten Teils der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays entsprechend einem gewünschten Muster zur Dunkelfeldmikroskopie, und In-Betrieb-nehmen eines ausgewählten Teils des zweiten Arrays entsprechend einem komplementären Muster, das das gewünschte Muster des Beleuchtungsarrays ergänzt. Die Verfahren können weiter ein Wechseln zwischen Dunkelfeldmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mit oder ohne Neufokussieren umfassen.
In den Fällen, in denen der räumliche Lichtmodulator mit einem Modulatorkontroller, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert, verbunden ist, und das Mikroskop weiter einen Lichtdetektor umfasst, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und an einem austrittsseitigen Ende eines Detektionsstrahlengangs angeordnet ist, wobei der Lichtdetektor mit einem Detektorkontroller funktional verbunden ist, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die Detektionseigenschaften des Detektionsarrays steuert, und umfassen die Verfahren weiter: Auswählen einer Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe, und Detektieren der Änderungen in einer Intensität im Detektionsarray entsprechend der Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln, und daraus Bestimmen eines dreidimensionalen Bilds der Probe. Alternativ können die Verfahren weiter umfassen: Auswählen einer Mehrzahl von gewünschten Beleuchtungswinkeln der Probe, um eine Mehrzahl von Bildern der Probe an einer entsprechenden Mehrzahl von unterschiedlichen Tiefen in der Probe bereitzustellen, und tomografisches Rekonstruieren der unterschiedlichen Bilder, um ein dreidimensionales Bild der Probe bereitzustellen. Vorzugsweise werden das Auswählen und das Rekonstruieren ohne Bewegen der Probe, einer Kondensorlinse oder einer Objektivlinse ausgeführt.
Die Verfahren können umfassen: Variieren einer Feldirisblende in einem Mikroskop, wobei das Mikroskop einen räumlichen Lichtmodulator umfasst, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, wobei der räumliche Lichtmodulator mit einem Modulatorkontroller funktional verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert, wobei die Verfahren umfassen: Auswählen einer gewünschten Feldirisblendeneinstellung, indem die einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays auf einen Ein/Aus-Zustand entsprechend der gewünschten Feldirisblendeneinstellung gesetzt werden, und dann Ändern der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays zu einem unterschiedlichen Ein/Aus-Zustand, entsprechend einer unterschiedlichen gewünschten Feldirisblendeneinstellung, wodurch die Feldirisblende variiert wird.
Die Verfahren können eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität zu einer Probe in einem Mikroskop liefern, wobei das Mikroskop umfasst: einen räumlichen Lichtmodulator, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, und einen Lichtdetektor, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und austrittsseitig von dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, und der Licht direkt von dem eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator empfängt, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die vom Lichtdetektor bereitgestellt werden, wobei die Verfahren umfassen: Variieren des Ein/Aus-Zustands von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, um ungleichförmige Lichtintensitäten zu kompensieren, die durch den Lichtdetektor detektiert werden, wodurch eine gleichförmige Beleuchtungslichtintensität geliefert wird, die zur Probe durchgelassen wird.
Die Verfahren können zum Variieren der Intensität von Licht, das von einer Probe ausgeht, zu einem Lichtdetektor in einem Mikroskop verwendet werden, wobei das Mikroskop umfasst: einen räumlichen Lichtmodulator, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, und einen Lichtdetektor, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und austrittsseitig von der Probe in einem Detektionsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten zusammenstellt, die vom Lichtdetektor bereitgestellt werden, wobei die Verfahren umfassen: Variieren eines Ein/Aus-Zustands von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, um die auf ausgewählte Flecken der Probe auftreffende Lichtintensität zu variieren, und dadurch Variieren der Intensität von Licht, das von den ausgewählten Flecken der Probe ausgeht, und Auftreffen auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors. Die Verfahren können weiter umfassen: selektives Variieren des Ein/Aus-Zustands von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, so dass, wenn die Lichtintensität, die auf ein Pixel des Lichtdetektors auftrifft, größer als oder gleich einem Schwellenwert ist, der anzeigt, dass die Lichtintensität benachbarte Pixel signifikant nachteilig beeinflusst, dann Ausschalten von mindestens einem entsprechenden Pixel im räumlichen Lichtmodulator für eine Zeit, die ausreicht, um die Lichtintensität, die auf das Pixel des Lichtdetektors auftrifft, unter den Schwellenwert zu verringern. Die Verfahren können auch umfassen: selektives Variieren des Ein/Aus-Zustands von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators, so dass die Lichtintensität, die auf das Detektionsarray von Pixeln des Lichtdetektors auftrifft, über das Detektionsarray gleichförmig ist, und Bestimmen der Lichtintensitätseigenschaften der Probe, indem eine Zeit bestimmt wird, die einzelne Pixel im Beleuchtungsarray des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators ein- oder ausgeschaltet sind.
Wenn das Mikroskop ein konfokales Mikroskop ist, umfassen die Verfahren weiter: Liefern von mindestens einem Beleuchtungsfleck zur Probe, indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind, und dann das Detektionsarray den Beleuchtungsfleck selektiv detektiert. Vorzugsweise bildet der räumliche Lichtmodulator gleichzeitig eine Mehrzahl der Beleuchtungsflecken und liefert sequenzielle komplementäre Muster der Flecken. Die Verfahren können weiter umfassen: Detektieren von Licht, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators ausgerichtet ist, das eingeschaltet ist, und Detektieren von Licht, das auf mindestens ein Detektionspixel benachbart zu dem mittigen Detektionspixel auftrifft, und Zusammenstellen der Daten, die durch das mindestens eine benachbarte Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden. Die Verfahren können weiter umfassen: Zusammenstellen der Daten, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, so dass die Rückweisung der Nicht-im-Fokus-Information des Mikroskops verbessert wird, im Vergleich mit dem Fokus ohne die Daten von den benachbarten Detektionspixeln, oder die Verfahren können umfassen: Zusammenstellen der Daten, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, und daraus Bestimmen der Lichtabsorptionseigenschaften der Probe.
Die Verfahren können Echtzeit-Direktsicht-Konfokalmikroskopie bereitstellen.
In anderen Aspekten liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zur konfokalen Mikroskopie, die eine Verwendung eines Mikroskops umfassen, das umfasst: einen ersten räumlichen Lichtmodulator, der ein erstes Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst, wobei der erste räumliche Lichtmodulator in einem Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Aperturblende einer Objektivlinse angeordnet ist, um einen ersten eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen, einen zweiten räumlichen Lichtmodulator, der ein zweites Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln umfasst und im Beleuchtungsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene einer Probe angeordnet ist, um einen zweiten eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator bereitzustellen, und einen Lichtdetektor, der an einem austrittsseitigen Ende des Detektionsstrahlengangs angeordnet ist, wobei der Lichtdetektor ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst, wobei die räumlichen Lichtmodulatoren und der Lichtdetektor mit mindestens einem Kontroller funktional verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die die Lichtdurchlass- oder Detektionseigenschaften der räumlichen Lichtmodulatoren und des Lichtdetektors steuert, wobei die Verfahren umfassen: Auswählen eines gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkels, indem ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel des ersten Beleuchtungsarrays entsprechend dem gewünschten Beleuchtungs- und Detektionswinkel eingeschaltet wird, und Auswählen eines gewünschten Beleuchtungsflecks, indem ein ausgewählter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel des zweiten Beleuchtungsarrays entsprechend dem gewünschten Beleuchtungsfleck eingeschaltet wird, so dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des zweiten Beleuchtungsarrays eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind und die Detektionspixel des Detektionsarrays positioniert sind, um den Beleuchtungsfleck selektiv zu detektieren. Solche Verfahren können weiter eine 3-D-Abbildung mit oder ohne Bewegen der Probe, einer Kondensorlinse oder einer Objektivlinse bereitstellen.
In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung umfassen die Verfahren eine zeitverzögerte Fluoreszenzdetektion, wobei die Verfahren umfassen: Beleuchten der Probe für eine Zeit, die ausreicht, um eine Fluoreszenz in der Probe zu induzieren, Aufhören mit Beleuchten der Probe, und dann Detektieren von Fluoreszenz, die von der Probe ausgeht.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung und angefügten Zeichnungen ersichtlich. Zusätzlich werden verschiedene Bezüge hierin dargelegt, die bestimmte Vorrichtungen und Verfahren (z.B. räumliche Lichtmodulatoren usw.) in größerer Einzelheit beschreiben; alle solche Bezüge sind in ihrer Gesamtheit durch Bezug hierin aufgenommen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt eine schematische Ansicht und eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines herkömmlichen Durchlichtmikroskops dar, das Köhlerbeleuchtung verwendet.
2A stellt eine schematische Ansicht einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung dar, wie sie in den Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
2A stellt eine detaillierte schematische Draufsicht auf einen räumlichen Lichtmodulator dar, der eine digitale Mikrospiegelvorrichtung ist.
2C stellt eine schematische Ansicht einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung dar, die Licht als verschiedene Funktionen der Zeit durchlässt.
3 stellt eine schematische Ansicht und eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines Mikroskops gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, das einen räumlichen Lichtmodulator umfasst, um die Feldblende zu ersetzen.
Die 4A-4I stellen eine Abtastteilsequenz eines Objekts dar, wobei ein räumlicher Lichtmodulator mit sequenziellen komplementären Mustern einer Mehrzahl von Beleuchtungsflecken verwendet wird.
5 stellt eine schematische Ansicht und eine auseinandergezogene schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform eines Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung dar, bei dem ein räumlicher Lichtmodulator eintrittsseitig von oder vor einem dichroitischen Spiegel positioniert ist.
6 stellt eine schematische Ansicht eines Bereichs eines in Pixel aufgeteilten Lichtdetektors zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung dar, die ein Beispiel für den Bereich des Detektors darstellt, der durch einen der Spiegel des räumlichen Lichtmodulators beleuchtet wird.
7A stellt eine schematische Ansicht eines räumlichen Lichtmodulators dar, bei dem mehrere benachbarte Pixel "ein" geschaltet sind, um einen Beleuchtungsfleck von einer gewünschten Größe zu definieren.
7B stellt eine schematische Ansicht eines räumlichen Lichtmodulators dar, bei dem mehrere benachbarte Pixel schnell ein- und ausgeschaltet werden, so dass, wenn man eine Zeitmittelung vornimmt, die Spiegel teilweise ein oder teilweise aus sind, um einen Beleuchtungsfleck mit Gaussprofil zu definieren.
8 stellt eine schematische Ansicht eines Mikroskops gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, das zwei räumliche Lichtmodulatoren verwendet.
9 stellt eine schematische Ansicht eines Mikroskops gemäß noch einer weiteren Ausführungsform dar, das für eine Köhlerbeleuchtung, bei der räumliche Lichtmodulatoren die Kondensorapertur- und Objektivaperturblende in ihrer konjugierten Bildebene ersetzen, der Probe aufgestellt ist.
10 ist eine schematische Ansicht und eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines Mikroskop gemäß noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, das vier digitale Mikrospiegelvorrichtungen aufweist, um die Lichtdurchlasscharakteristiken der konjugierten Bildebene der Probe und der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse zu steuern.
11 veranschaulicht einer Art und Weise, in der ein Mikroskop der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um sphärische Aberrationseffekte einer Linse durch Bilder der Probe an einer Mehrzahl von unterschiedlichen Tiefen zu korrigieren, wobei die Probe ausgewählte Beleuchtungs- und Detektionsausrichtungen von ausgewählten z-Positionen verwendet und die Bilder in ein zusammengesetztes Bild kombiniert werden.
12 ist ein Zeitsteuerungsdiagramm, das eine Art und Weise darstellt, in der der Ein/Aus-Zustand eines Paars von räumlichen Lichtmodulatoren koordiniert werden kann, um eine zeitverzögerte Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen.
13 gibt eine schematische Ansicht und eine auseinandergezogene schematische Ansicht eines Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wieder, bei der das Mikroskop dem Mikroskop in 10 ähnelt, außer dass das Mikroskop zur Reflexionsmikroskopie verwendet wird, und zwei räumliche Lichtmodulatoren eine räumliche Lichtmodulation in jedem von dem Beleuchtungsstrahlengang und dem Detektionsstrahlengang bereitstellen, wodurch funktional vier räumliche Lichtmodulatoren im Strahlengang bereitgestellt werden.
14 gibt eine schematische Ansicht eines Mikroskops gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wieder, bei der das Mikroskop den Mikroskopen ähnelt, die in den 10 und 13 dargelegt sind, wobei das Mikroskop zur Reflexionsmikroskopie verwendet wird und eine Gesamtanzahl von vier räumlichen Lichtmodulatoren im Beleuchtungsstrahlengang und im Detektionsstrahlengang eingefügt sind.
Die Figuren und die Beschreibung stellen verschiedene Möglichkeiten dar, einen räumlichen Lichtmodulator zu verwenden. Sie stellen die Weise nicht explizite dar, auf die die Probe beleuchtet wird.
Die vorliegenden Mikroskope weisen signifikante Vorteile beim Steuern des Lichtes auf, das die Probe trifft. Die Mikroskope haben auch Vorteile in Bezug zum Steuern des Lichtes, das einen Lichtdetektor trifft, wie z.B. das Auge des Benutzers oder eine Videokamera. Die verbesserte Steuerung umfasst eine verbesserte selektive Steuerung des Beleuchtungswinkels, der Menge an Licht und der Stelle des Lichts, das die Probe und/oder den Detektor erreicht, so dass das die Probe erreichende Licht eine oder mehrere gewünschte Eigenschaften umfasst. Die vorliegende Erfindung liefert diese Vorteile, indem sie einen oder mehrere räumliche Lichtmodulatoren im Beleuchtungs- und/oder Detektionsstrahlengang des Mikroskops an einer oder beiden von der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse und der konjugierten Bildebene der Probe anordnet.
Definitionen
Ein "räumlicher Lichtmodulator" (SLM) ist eine Vorrichtung, die imstande ist, Licht selektiv zu modulieren. In der vorliegenden Erfindung sind räumliche Lichtmodulatoren im Strahlengang eines Mikroskops angeordnet. Typischerweise umfasst der räumliche Lichtmodulator ein Array von einzelnen Lichtdurchlasspixeln, die eine Mehrzahl von Flecken sind, die Durchlasseigenschaften haben, so dass sie entweder das Licht entlang dem Strahlengang durchlassen oder weiterleiten, oder das Licht blockieren und verhindern, dass es seinen Weg entlang dem Strahlengang fortsetzt (z.B. indem das Licht absorbiert wird oder indem es aus dem Strahlengang reflektiert wird). Solche in Pixel aufgeteilte Arrays sind im Stand der Technik wohlbekannt, die auch als Mehrmuster-Aperturarray bezeichnet worden sind und durch ein Array von ferroelektrischen Flüssigkristall-Vorrichtungen, durch eine digitale Mikrospiegelvorrichtung oder durch elektrostatische Mikroverschlussblenden gebildet werden können. Siehe das US-Patent No. 5,587,832; R.Vuelleumier, Novel Electromechanical Microshutter Display Device, Proc. Eurodisplay '84, Display Research Conference September 1984. Digitale Mikrospiegelvorrichtungen können von Texas Instruments, Inc., Dallas, Texas, USA, bezogen werden.
Der "Beleuchtungsstrahlengang" ist der Strahlengang von einer Lichtquelle bis zu einer Probe, während ein "Detektionsstrahlengang" der Strahlengang für von einer Probe ausgehendem Licht zu einem Detektor ist. Von einer Probe ausgehendes Licht umfasst Licht, das von einer Probe reflektiert wird, durch eine Probe durchgelassen wird oder in der Probe erzeugt wird, z.B. Fluoreszenzlicht, das in einer Probe entsprechend einer Anregung mit einer geeigneten Lichtwellenlänge (typischerweise UV- oder Blau-Licht) erzeugt wird.
Eine "konjugierte Bildebene einer Aperfurblende der Objektivlinse" ist eine Ebene in entweder dem Beleuchtungs- oder Detektionsstrahlengang, wo ein Bild der Aperturblende der Objektivlinse erzeugt wird. Typischerweise enthält diese Bildebene auch eine Neuerzeugung des Bildes der Lichtquelle, die in der vorliegenden Erfindung jegliche Lichtquelle sein kann, wie z.B. eine Weißlichtquelle, eine Lichtbogenquelle oder ein Laser. Die konjugierten Bildebenen der Aperturblende der Objektivlinse definieren Stellen, die den Winkel von Beleuchtungslicht steuern, das schließlich auf eine Probe auftrifft, sowie den Winkel von Detektionslicht, das von einer Probe ausgeht (der "Beleuchtungswinkel" und "Detektionswinkel" beziehen sich auf den Winkel des Lichts, das entweder auf eine Probe auftrifft oder von einer solchen ausgeht).
Eine "konjugierte Bildebene der Probe" ist eine Ebene in entweder dem Beleuchtungsstrahlengang oder dem Detektionsstrahlengang, in der ein Bild der Probe wiedererzeugt wird. Der Lichtdetektor(en) ist typischerweise an einem solchen Ort im Detektionsstrahlengang angeordnet. Die konjugierten Bildebenen der Probe definieren Stellen, die die Größe und Stelle von Flecken auf der Probe steuern können, die beleuchtet und/oder detektier werden (abhängig davon, ob sich die konjugierte Ebene im Beleuchtungsstrahlengang oder im Detektionsstrahlengang befindet). Die Bildebene der Probe ist die Ebene, in der die Probe angeordnet ist, obwohl die Bildebene der Probe größer oder kleiner sein kann als die Größe der tatsächlichen Probe, wenn entweder eine Mehrzahl von Strahlengängen bereitgestellt werden oder wenn der Beleuchtungsbereich größer oder kleiner als die Größe der Probe ist.
Ein "Kontroller" ist eine Vorrichtung, die imstande ist, einen räumlichen Lichtmodulator, einen Detektor oder andere Elemente der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung zu steuern. Z.B. kann der Kontroller Durchlasseigenschaften der Pixel in einem räumlichen Lichtmodulator steuern, den Ein/Aus-Zustand von Pixeln eines in Pixel aufgeteilten Lichtdetektors (wie z.B. ein Ladungsspeicherbauelement (CCD-Element) oder Ladungsinjektionsbauelement (CID-Element)) steuern und/oder vom Detektor erhaltene Daten zusammenstellen, einschließlich einer Verwendung solcher Daten zur Herstellung oder Rekonstruktion von Bildern oder als Rückkopplung zur Steuerung eines eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators. Typischerweise ist ein Kontroller ein Computer oder eine andere Vorrichtung, die eine zentrale Einheit (CPU) umfasst. Kontroller sind im Stand der Technik wohlbekannt und eine Auswahl eines wünschenswerten Kontrollers für einen besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich des Standes der Technik hinsichtlich der vorliegenden Offenbarung.
"Eintrittsseitig" und "austrittsseitig" werden in ihrem herkömmlichen Sinn verwendet, wobei eintrittsseitig anzeigt, dass sich eine gegebene Vorrichtung näher an einer Lichtquelle befindet, während austrittsseitig anzeigt, dass sich ein gegebenes Objekt weiter von einer Lichtquelle weg befindet.
Die in dieser Anmeldung dargelegten Begriffe sollen in den Ansprüchen nicht so interpretiert werden, dass sie eine "Mittel-plus-Funktion"-Beziehung anzeigen, außer das Wort "Mittel" wird speziell in den Ansprüchen angeführt. Dies trifft auch auf den Begriff "Schritt" für Prozess- oder Verfahrensansprüche zu.
Andere Begriffe und Ausdrücke in dieser Anmeldung sind entsprechend den obigen Definitionen und in anderen Teilen dieser Anmeldung definiert.
Die Figuren
Indem man sich den Figuren zuwendet, gibt 1 ein bekanntes Mikroskop vom Köhlerbeleuchtungstyp wieder, und sie wurde oben erörtert.
2A gibt eine schematische Ansicht eines räumlichen Lichtmodulators, in diesem Fall einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung, bei Gebrauch in einem Mikroskop wieder, gemäß der vorliegenden Erfindung. In 2A richtet eine Lichtquelle 4 Licht auf Mikrospiegel 42 einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung, welche Mikrospiegel in sowohl Seitenansicht als auch Draufsicht dargestellt sind. Wenn sich ein Mikrospiegel in der "Ein"-Stellung befindet, wird das Licht von der Lichtquelle 4 entlang einem Beleuchtungsstrahlengang 3 durch eine Projektivlinse 30 hindurch und in eine Bildebene 40 reflektiert. Wenn sich ein spezieller Mikrospiegel, der ein einzelnes Lichtdurchlasspixel ist, in der "Aus"-Stellung befindet, dann wird das Licht von der Lichtquelle 4 zu einem Strahlstopp 37 reflektiert. Folglich ist der Ein/Aus-Zustand der einzelnen Lichtdurchlasspixel dadurch festgesetzt, ob das Pixel Licht entlang dem gewünschten Strahlengang durchlässt oder nicht. Der Ein/Aus-Zustand der Pixel kann sich sehr schnell ändern oder alternieren. Beispielsweise durchlaufen in einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung die Spiegel einen Zyklus von ein nach aus nach ein (oder umgekehrt) in weniger Zeit als durch das menschliche Auge beobachtet werden kann, z.B. in weniger als etwa 0,3 Sekunden, und sogar so schnell wie etwa 20 Mikrosekunden.
2B gibt eine detaillierte schematische Draufsicht auf eine digitale Mikrospiegelvorrichtung 34 wieder, bei der einzelne Mikrospiegel 46 oben auf Spiegelständern 48 angeordnet sind. In der wiedergegebenen Ausführungsform gibt es einen Spalt von etwa 1 μm zwischen den Spiegeln, und die Spiegel sind etwa 16 μm mal 16 μm. Andere Formen und Größen von Spiegeln sind auch möglich.
2C gibt eine schematische Darstellung eines räumlichen Lichtmodulators der vorliegenden Erfindung im Gebrauch wieder. Insbesondere reflektiert die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34 eine Mehrzahl von Lichtstrahlen entlang dem Beleuchtungspfad 3 zur Projektivlinse 30 und in die Bildebene 40. In einer mittigen Spalte der digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34 weist jeder der digitalen Mikrospiegel einen verschiedenen Prozentsatz der Zeit auf, in der der Spiegel ein- statt ausgeschaltet ist. Z.B. ist der oberste Mikrospiegel in der Figur 100% der Zeit eingeschaltet, während der unterste Mikrospiegel in der Spalte in der Figur 100% der Zeit ausgeschaltet ist, während die vier Spiegel zwischen den beiden einen Ein/Aus-Zustand aufweisen, der zwischen 100% ein- und 100% ausgeschaltet ist. Folglich weist jeder von den Lichtstrahlen aus der mittigen Spalte eine unterschiedliche Videofeldzeit 50 auf, welche Videofeldzeit der Ein- und Auszeitdauer für den speziellen Mikrospiegel entspricht.
3 gibt eine schematische Zeichnung eines Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung wieder, das einen räumlichen Lichtmodulator in einer eintrittsseitigen konjugierten Bildebene der Probe aufweist. Ein solches Mikroskop ist eine von den Ausführungsformen hierin, die eine dynamische Beleuchtungssteuerung erlaubt. Die Lichtquelle 4 emittiert erste Lichtstrahlen 6, zweite Lichtstrahlen 8 und dritte Lichtstrahlen 10 entlang dem Beleuchtungsstrahlengang 3 in Richtung auf die Probe 20. Die Lichtstrahlen treten zuerst durch ein Filter 36 hindurch, reflektieren dann weg von einem dichroitischen Spiegel 38 (der dichroitische Spiegel 38 und das Filter 36 werden in einem Blocksatz aus dichroitische Spiegel und Filter 28 gehalten) und durch eine Projektivlinse 30 hindurch, gefolgt von einer Reflexion weg von einem einfachen Spiegel 32 auf einen räumlichen Lichtmodulator, der in der Figur eine digitale Mikrospiegelvorrichtung 34 ist. Wie in der Figur wiedergegeben, sind sämtliche einzelnen Lichtdurchlasspixel (d.h. Mikrospiegel in der Figur) eingeschaltet, und folglich werden sämtliche Lichtstrahlen 6, 8, 10 zum Objektivlinsensatz 22 und zur Probe 20 durchgelassen. Das Licht wird dann weg von der Probe reflektiert, zurück durch die Objektivlinse 22 hindurch, weg von der digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34 und dem einfachen Spiegel 32, und es wird dann durch die Projektivlinse 30 durchgelassen. Das Licht setzt dann seinen Weg vorbei am dichroitischen Spiegel 38, Filter 36 und schließlich zum Lichtdetektor 26 fort. Das Licht wird von der Probe zum Lichtdetektor 26 entlang dem Detektionsstrahlengang 5 durchgelassen. In 3 ist die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34 in einer konjugierten Bildebene der Probe in jedem von dem Beleuchtungsstrahlengang 3 und dem Detektionsstrahlengang 5 angeordnet. Folglich dient eine einzige digitale Mikrospiegelvorrichtung sowohl als erster räumlicher Lichtmodulator als auch zweiter räumlicher Lichtmodulator, von denen sich einer eintrittsseitig von der Probe befindet und von denen sich einer austrittsseitig von der Probe befindet. Der Lichtdetektor 26 kann jeglicher Lichtdetektor sein, wie er im Stand der Technik wohlbekannt ist, z.B. ein Ladungsspeicherbauelement (CCD-Element), ein Ladungsinjektionsbauelement (CID-Element), eine Videokamera, ein Fotovervielfacher oder ein menschliches Auge (in welchen Fall der Lichtdetektor vorzugsweise ein Okular für das Auge umfasst). Wenn gewünscht, ist es möglich, eine Mehrzahl von verschiedenen Lichtdetektoren entweder in einer Reihen- oder in einer Nachbarbeziehung oder in irgendeiner anderen gewünschten Beziehung zu verwenden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Lichtdetektor ein CCD-Element oder ein CID-Element oder ein anderer Lichtdetektor, der ein Array von einzelnen Detektionspixeln umfasst, das eine Mehrzahl von Flecken anzeigt, typischerweise in derselben Größenordnung auf derselben Seite wie die Pixel im räumlichen Lichtmodulator.
In bevorzugten Ausführungsformen entspricht das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln im Lichtdetektor 26 dem Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im räumlichen Lichtmodulator und ist damit ausgerichtet. Demgemäß weist das Detektionsarray eine äquivalente Anzahl von Pixeln auf, von denen jedes mit den Pixeln des räumlichen Lichtmodulatorarrays ausgerichtet ist, oder es sind Gruppen von solchen Pixeln miteinander ausgerichtet. In gewissen Ausführungsformen kann diese Ausrichtung bewerkstelligt werden, indem man eine einzige digitale Mikrospiegelvorrichtung an einer gewünschten konjugierten Bildebene in sowohl dem Beleuchtungsstrahlengang als auch dem Detektionsstrahlengang verwendet, z.B. wie in 3 wiedergegeben.
Weil die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34 an einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, kann sie sowohl die Menge an Licht als auch die Stelle des Lichts steuern, das die Probe erreicht. Wenn gewünscht, ist es folglich möglich, ein einzelnes Pixel der digitalen Mikrospiegelvorrichtung zu beleuchten, das wiederum ein einzelnes entsprechendes Pixel der Probe beleuchtet, und dann gleichzeitig dieses selbe Pixel der Probe zu detektieren und die Information von diesem Pixel zum Lichtdetektor 26 weiterzuleiten.
3 gibt ein Reflexionsmikroskop wieder, was bedeutet, dass das Licht weg von der Probe reflektiert, aber sie könnte auch ein Durchlichtmikroskop darstellen, was bedeuten würde, dass das Licht durch die Probe hindurchtreten würde, wenn ein separater zweiter räumlicher Lichtmodulator im Detektionsstrahlengang verwendet würde (oder wenn geeignete Spiegel oder andere Vorrichtungen dazu dienen würden, den Detektionsstrahlen gang zurück zu einer einzigen digitalen Mikrospiegelvorrichtung zu richten). 5 gibt eine schematische Ansicht eines Mikroskops wieder, das dem Mikroskop ähnelt, das in 3 dargelegt ist, außer dass der räumliche Lichtmodulator nur im Beleuchtungsstrahlengang und nicht im Detektionsstrahlengang angeordnet ist.
Vorzugsweise wird das (die) Muster im räumlichen Lichtmodulator(en) über ein funktionales Verbinden des räumlichen Lichtmodulators mit einem Kontroller, vorzugsweise einem PC-Computer, bewerkstelligt, der jedes von den einzelnen Lichtdurchlasspixeln im Array einzeln steuert. Weiter vorzugsweise, steuert der Kontroller einen einzelnen Spiegel als einzelnes Pixel, aber wenn gewünscht, kann der Kontroller eine Mehrzahl von Spiegeln als einzelnes Pixel steuern, z.B. könnte jedes einzelne Lichtdurchlasspixel eine Gruppierung von unmittelbar benachbarten Spiegeln sein, wie z.B. in den 7A und 7B dargelegt. Insbesondere gibt 7 schematisch zwei unterschiedliche Ausführungsformen zur Beleuchtung wieder, die die Verwendung von benachbarten Spiegeln als einzelnes Pixel umfassen. In 7a wird eine Mehrzahl von einzelnen Mikrospiegeln des räumlichen Lichtmodulators als Gruppe eingeschaltet. 7B gibt einen ähnlichen Beleuchtungsfleck wieder, außer dass unterschiedliche Mikrospiegel (oder Mikroverschlussblenden oder andere ausgewählte Pixelkomponenten) unterschiedliche Ein/Aus-Zustände aufweisen und so ein Gauss-Beleuchtungsprofil bereitstellen; andere Beleuchtungsprofile sind auch möglich. In einer bevorzugten Ausführungsform ist für diese und andere Merkmale der vorliegenden Erfindung, die sich auf das aktive Einschalten und Ausschalten von einzelnen Lichtpixeln des räumlichen Lichtmodulators beziehen, die Zykluszeit des gegebenen Ereignisses kleiner als die Zeit, die für das menschliche Auge benötigt wird, um die Änderung zu detektieren, typischerweise kleiner als etwa 0,3 Sekunden.
Mikroskope, wie z.B. diejenigen, die in den 3 und 5 wiedergegeben sind, die einen räumlichen Lichtmodulator in einer konjugierten Bildebene der Probe umfassen, die sich eintrittsseitig von der Probe befindet, können auch eine variable Feldirisblende bereitstellen. Wie hierin verwendet, bezeichnet eine variable Feldirisblende eine Irisblende, bei der der Beleuchtungsfleck größer ist als eine Größe, die zum Gebrauch für konfokale Mikroskopie geeignet ist. Die Feldirisblende kann variiert werden, indem man ein Muster in dem Array des räumlichen Lichtmodulators ändert, das verschiedenen Feldirisblendeneinstellungen entspricht. Wo das Mikroskop einen Lichtdetektor umfasst, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst, kann zusätzlich und insbesondere das Mikroskop den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators selektiv und steuerbar variieren, um die Lichtintensität zu variieren, die auf ausgewählte Flecke der Probe auftrifft. Folglich kann nicht nur ein 100%iger ein- oder 100%iger ausgeschalteter Zustand für eine variable Feldirisblende erreicht werden, die Lichtintensität von einzelnen Pixeln kann reduziert oder erhöht werden, wie gewünscht, ähnlich zu der Pixelveränderlichkeit, die in den 2C und 7B wiedergegeben ist.
In einer Ausführungsform zum Variieren der Intensität des auf die ausgewählten Flecken auftreffenden Lichts, die eine gleichförmige Lichtintensität über eine Probe liefert, wird das Licht von der Lichtquelle 4, das "Aus"-Pixel im Array des räumlichen Lichtmodulators, wie z.B. der digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34, trifft, zu einem Lichtdetektor durchgelassen, vorzugsweise einem in Pixel aufgeteilten Lichtdetektor, der z.B. am Ort eines Strahlstopps 37 in 3 angeordnet ist. Es wird bevorzugt, dass der Lichtdetektor Licht direkt vom räumlichen Lichtmodulator empfängt, was bedeutet, dass das Licht nicht durch die Probe hindurchgeht oder von ihr weg reflektiert wird. Obwohl es weniger bevorzugt wird, kann das Licht durch zwischen dem räumlichen Lichtmodulator und dem Lichtdetektor liegende Linsen, Filter usw. hindurchgehen. Weil der Strahlstopp 37 vorzugsweise an der Bildebene der Probe angeordnet ist und Licht direkt vom räumlichen Lichtmodulator empfängt, kann der räumliche Lichtmodulator alle Pixel "aus"-geschaltet aufweisen, und folglich wird sämtliches Licht von der Lichtquelle zum Detektor durchgelassen, der am Strahlstopp 37 angeordnet ist. Der Detektor kann dann unterschiedliche Intensitätsgrade im von der Lichtquelle 4 ausgehenden Licht differenzieren und dann die variierenden Intensitäten über ein schnelles Alternieren zwischen dem Ein- und Aus-Zustand kompensieren, um ein gleichförmiges Licht zur Probe 20 zu liefern (der am Strahlstopp 37 angeordnete Lichtdetektor könnte auch in einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet sein, wenn gewünscht). Eine solche schnelle Wechselfolge kann durch einen Kontroller bewerkstelligt werden, der selektiv den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators variiert, um ungleichförmige Lichtintensitäten zu kompensieren, die entsprechend Pixeln vom Lichtdetektor detektiert werden.
Ähnlich kann das Mikroskop die Intensität des von der Probe zum Lichtdetektor ausgehenden Lichts variieren, indem die Intensität des zur Probe durchgelassenen Lichts variiert wird, weil es typischerweise eine direkte Beziehung (weiter typischerweise eine 1:1-Beziehung) zwischen der Intensität des von einer Probe emittierten Lichts und der Intensität des auf die Probe auftreffenden Lichts gibt. Ein solches Mikroskop kann besonders nützlich sein, wo die auf ein spezielles Pixel des Lichtdetektors auftreffende Lichtintensität größer als oder gleich einem Schwellenwert ist, der anzeigt, dass die Lichtintensität benachbarte Pixel signifikant nachteilig beeinflusst (z.B. durch Überstrahlen des Lichtes oder ein Unvermögen des Lichtdetektors, wie z.B. ein menschliches Auge, um sich im Hinblick auf eine solche übermäßige Intensität anzupassen). Sobald der Detektor und typischerweise der mit dem Detektor funktional verbundene Kontroller feststellt, dass das auf ein spezielles Pixel des Lichtdetektors auftreffende Licht den Schwellenwert überschritten hat, dann variieren der Detektor und Kontroller den Ein/Aus-Zustand der entsprechenden Pixel im Beleuchtungsarray, um die Intensität des Lichts zu reduzieren, das zum Pixel der Probe durchgelassen wird, das dem überhellen Pixel des Detektionsarrays entspricht, bis die Intensität des das Pixel des Detektionsarrays erreichende Licht unter den Schwellenwert reduziert ist.
In einer verwandten Ausführungsform können der Lichtdetektor und Kontroller die Lichtintensitätscharakteristiken einer Probe feststellen, indem sie die Intensität des Lichts detektieren, das auf die Detektoren auftrifft, dann den Ein/Aus-Zustand der entsprechenden Pixel im Beleuchtungsarray modifizieren, bis eine gleichförmige Lichtintensität zu den Pixeln des Detektorarrays durchgelassen wird, und dann die Lichtintensitätscharakteristiken der Probe feststellen, indem die Zeitdauer festgestellt wird, die einzelne Pixel im Beleuchtungslichtarray im räumlichen Lichtmodulator ein- oder ausgeschaltet sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Mikroskop weiter als konfokales Mikroskop arbeiten, wie oben erörtert, und das Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im räumlichen Lichtmodulator, der eintrittsseitig von der Probe in einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, stellt mindestens einen Beleuchtungsfleck bereit, der für konfokale Mikroskopie dimensioniert ist, indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind. Das Detektionsarray detektiert dann selektiv den Beleuchtungsfleck. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet der räumliche Lichtmodulator gleichzeitig eine Mehrzahl von Beleuchtungsflecken und liefert dann sequenzielle, komplementäre Muster der Flecken, wie in 4 wiedergegeben. Insbesondere sind, wie in der Figur dargestellt, Ein-Spiegel 52 als schwarze Quadrate in einem Array wiedergegeben, während Aus-Spiegel 54 als weiße Quadrate im Array wiedergegeben sind. Indem man sequenziell eine Reihe von komplementären Mustern bereitstellt, wobei im Wesentlichen dasselbe Muster wiederholt wird, aber während des Verlaufs der Zeit um ein Pixel nach rechts bewegt, ist es möglich, ein konfokales Bild der gesamten Probe in etwa 18 Ein/Aus-Zyklen bereitzustellen. Eine solche konfokale Mikroskopie kann detektiert werden, indem man einen in Pixel aufgeteilten Detektor, wie z.B. ein CCD-Element oder CID-Element, verwendet, oder es kann dann, wenn die Zykluszeit schnell genug ist, dass ein einzelnes beleuchtetes Pixel dann schneller als die Bilderfassungszeitdauer auf einer Videokamera oder für das menschliche Auge (oder Bilderfassungszeitdauer eines anderen Detektors) wiederbeleuchtet wird, konfokale Echtzeit-Mikroskopie beobachtet werden.
6 gibt schematisch eine Ausführungsform wieder, bei der zwar das mittige Detektionspixel 56 stärker beleuchtet wird als benachbarte oder umgebende Pixel 58, aber aufgrund der Eigenschaften der Probe die umgebenden Pixel tatsächlich beleuchtet werden, obwohl nur das mittige Pixel 56 direkt mit dem Ein-Beleuchtungspixel im Beleuchtungsarray des räumlichen Lichtmodulators ausgerichtet war. Folglich umfasst in einer Ausführungsform, die besonders für konfokale Mikroskopie nützlich ist, aber auch bei anderen Ausführungsformen verwendet werden kann, das Mikroskop einen Kontroller, der eine Computer-implementierte Programmierung enthält, die bewirkt, dass der Lichtdetektor Licht detektiert, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators im Beleuchtungsstrahlengang, das eingeschaltet ist, ausgerichtet ist, und dass er auch Licht detektiert, das auf mindestens ein zu dem mittigen Detektionspixel benachbartes Pixel und vorzugsweise alle benachbarten Pixel auftrifft, wobei der Kontroller auch Computer-implementierte Programmierung enthält, die die von dem (den) benachbarten Detektionspixel(n) gelieferten Daten zusammenstellt und sie mit den Daten kombiniert, die vom mittigen Detektionspixel geliefert werden, um die Information zu verbessern, die dem Mikroskop zur Verfügung gestellt wird und von ihm bereitgestellt wird. Z.B. kann ein solches Kombinieren der Daten die Rückweisung der Nicht-im-Fokus-Information des Mikroskops verbessern, wenn eine solche Rückweisung mit dem Fokus verglichen wird, der ohne die Daten von dem (den) benachbarten Detektor(en) erreicht wird. Alternativ kann die Information von den benachbarten Pixeln Daten über die Lichtstreuung und/oder -absorption oder andere Eigenschaften der Probe liefern. Alternativ kann, wenn gewünscht, der Detektor so eingestellt werden, dass der Detektor und/oder Kontroller keine Information von dem mittigen Detektorpixel detektiert, das direkt dem Ein-Beleuchtungspixel entspricht, sondern vielmehr nur vom (von) benachbarten Pixel(n) Information sammelt.
In noch einer anderen Ausführungsform kann ein räumlicher Lichtmodulator in einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet sein, die sich eintrittsseitig von der Probe befindet, und der Ein/Aus-Zustand der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays kann eingestellt sein, um ein ausgewähltes Bild in die Bildebene (und deshalb die konjugierten Bildebenen der Probe) des Mikroskops zu projizieren. Der räumliche Lichtmodulator ist funktional mit mindestens einem Kontroller verbunden, der den Ein/Aus-Zustand der einzelnen Lichtdurchlasspixel einstellt und/oder variiert, so dass er einem Bild entspricht, das separat zum Kontroller übertragen wird oder das im Speicher des Kontrollers voreingestellt und enthalten ist.
Das ausgewählte Bild kann direkt auf die Probe projiziert werden, oder das ausgewählte Bild kann benachbart zur Probe projiziert werden. Z.B. kann, wo das Mikroskop verwendet wird, um festzustellen, ob eine gegebene Probe mit einem gewünschten vorbestimmten Zustand übereinstimmt, dann ein Bild, das einen solchen vorbestimmten Zustand darstellt, entweder auf die Probe oder benachbart zur Probe projiziert werden; ein direktes Projizieren des Bildes auf die Probe kann einen Schabloneneffekt liefern, der es für sehr genau vorbestimmte Formen verhältnismäßig einfach machen kann, um festzustellen, ob die Form in der Probe mit der vorbestimmten Form übereinstimmt oder nicht. Mikroskope, die ein solches ausgewähltes Bild projizieren, können entweder einen einzigen räumlichen Lichtmodulator umfassen, um das ausgewählte Bild zu projizieren, während die Probe ohne Gebrauch eines räumlichen Lichtmodulators bestrahlt wird, oder zwei räumliche Lichtmodulatoren, von denen einer für das ausgewählte Bild ist und einer für den Durchlass von Licht direkt zur Probe, oder einen einzigen räumlichen Lichtmodulator, wobei unterschiedliche Teile des räumlichen Lichtmodulators den hierin beschriebenen unterschiedlichen Funktionen dediziert sind (z.B. ein Teil zur Probenbeleuchtung und ein Teil für einen ausgewählten Bildprojektor).
8 gibt ein Beispiel für ein Mikroskop wieder, das für konfokale Mikroskopie geeignet ist. Das Mikroskop ähnelt den in den 3 und 5 wiedergegeben Mikroskopen (welche Mikroskope auch für konfokale Mikroskopie verwendet werden könnten), außer dass das Mikroskop in 8 eine erste digitale Mikrospiegelvorrichtung in einer konjugierten Bildebene der Probe umfasst, die sich eintrittsseitig von der Probe befindet, sowie eine zweite separate digitale Mikrospiegelvorrichtung 34b, die in einer konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist, die austrittsseitig von der Probe angeordnet ist. Folglich wird in 8 Licht von der Lichtquelle 4 durch eine Projektivlinse 30a hindurch emittiert, um weg von einem einfachen Spiegel 32a und dann räumlichen Lichtmodulator 34a zu reflektieren. Licht, das durch den räumlichen Lichtmodulator 34a entlang dem Beleuchtungsstrahlengang durchgelassen wird, wird dann weg vom dichroitischen Spiegel 38, durch die Objektivlinsen 22 hindurch auf die Probe 20 reflektiert, wo das Licht zurück durch die Objektivlinsen 22 hindurch, dann durch den dichroitischen Spiegel 38 hindurch und auf den austrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator 34b reflektiert wird. Licht, das vom räumlichen Lichtmodulator 34b durchgelassen wird, setzt seinen Weg entlang dem Detektionspfad zu einem einfachen Spiegel 32b, dann durch eine Projektivlinse 30b hindurch zum Lichtdetektor 26 fort. Ein Vorteil des in 8 wiedergegebenen Mikroskops ist, dass, weil es zwei separate räumliche Lichtmodulatoren gibt, die beiden räumlichen Lichtmodulatoren keinen identischen Ein/Aus-Zustand für die Lichtdurchlasspixel darin aufzuweisen brauchen. Die Ausführungsform in 8 wird auch bevorzugt, wo der Detektor ein Okular, Fotovervielfacher (PMT), eine Videokamera oder eine andere nicht in Pixel aufgeteilte Vorrichtung ist. Außerdem kann die Detektionsapertur im austrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator im Detektionsstrahlengang auf dieselbe Weise dynamisch variiert werden, wie früher für räumliche Lichtmodulatoren beschrieben, die im Beleuchtungsstrahlengang angeordnet sind.
Indem man sich 9 zuwendet, gibt die Figur ein Mikroskop wieder, bei dem ein erster räumlicher Lichtmodulator in der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse und eintrittsseitig von der Probe angeordnet ist, und ein zweiter räumlicher Lichtmodulator austrittsseitig von der Probe angeordnet ist, und zwar auch in der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse. Kurz gesagt, die Lichtquelle 4 emittiert Licht durch die Lichtquellenlinse 12 hindurch entlang dem Beleuchtungspfad 3, durch die Projektivlinse 30a hindurch und auf die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34a. Die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34a lässt dann selektiv einen gewünschten Teil des Lichts entlang dem Beleuchtungsstrahlengang durch, um weg von dem einfachen Spiegel 32a zu reflektieren, durch Kondensorlinsen 16 und dann durch die Probe 20 hindurchzutreten. Von der Probe 20 ausgehendes Licht tritt durch die Objektivlinsen 22 hindurch, reflektiert weg vom einfachen Spiegel 32b und wird auf die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34b durchgelassen. Der digitale Mikrospiegel 34b lässt dann einen ausgewählten Teil des Lichts entlang dem Detektionsstrahlengang 5 durch die Projektivlinse 30b hindurch und auf den Lichtdetektor 26 durch. Die Bereitstellung eines räumlichen Lichtmodulators eintrittsseitig von der Probe in einer konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse liefert das Vermögen, um den Beleuchtungswinkel einer Probe und deshalb gleichzeitig den Detektionswinkel von von der Probe ausgehendem Licht zu steuern. Außerdem kann ein solches Mikroskop selektiv die Lichtmenge steuern, die eine Probe erreicht, welche Menge (wie bei dem räumlichen Lichtmodulator, der in der konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist) kleiner ist als die Lichtmenge bloß als Artefakt aufgrund des Hindurchtretens durch Linsen, Filter usw. In einigen Ausführungsformen kann die Lichtmenge etwa zwischen 1% bis 99% reduziert werden. Diese Reduktion in der Lichtmenge kann erzielt werden, indem man die gewünschte Beleuchtungsmenge auswählt und dann einen entsprechenden ausgewählten Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel ein- oder ausschaltet. Ein solcher ausgewählter Teil ist zumindest wesentlich kleiner als sämtliches Beleuchtungslicht, genug, um eine messbare Verminderung der Beleuchtung in Bezug zum gesamten Beleuchtungslicht zu erzielen.
Mikroskope mit einem räumlichen Lichtmodulator an einer konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse, wie z.B. dasjenige, das in 9 wiedergegeben ist, können für Dunkelfeldmikroskopie, Hellfeldmikroskopie und Wechselfolgen zwischen den beiden sorgen, sowie Wechselfolgen zwischen Arten von Dunkelfeldmikroskopie, wenn unterschiedliche Bereiche des räumlichen Lichtmodulators ein- und ausgeschaltet werden.
Dies kann ausgeführt werden, indem man ein gewünschtes Muster für die Dunkelfeldmikroskopie in den einzelnen Lichtdurchlasspixeln des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators auswählt. Ein solches gewünschtes Muster umfasst einen ausgewählten Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel, welcher Teil wesentlich kleiner ist als sämtliche solche Pixel; er wird ausreichend reduziert, so dass ein messbarer Dunkelfeldeffekt in Bezug zum Hellfeld erzielt wird (wobei Hellfeld Weitbereichsbeleuchtung und -detektion dieses selben Bereichs ist). In einigen Ausführungsformen liefert das Mikroskop einen hauptsächlichen oder selbst einen alleinigen Dunkelfeldeffekt. Ein komplementäres Muster wird dann im Detektionsstrahlengang angeordnet, vorzugsweise über Verwendung einer zweiten digitalen Mikrospiegelvorrichtung, die das komplementäre Muster in ihrem in Pixel aufgeteilten Array umfasst. Das komplementäre Muster ist das Komplement zu dem gewünschten Mustersatz im räumlichen Lichtmodulator im Beleuchtungsstrahlengang. Wenn das gewünschte Muster eine Mehrzahl von konzentrischen Kreisen ist, dann würde z.B. das komplementäre Muster ein entsprechendes Muster von konzentrischen Kreisen sein, außer dass das komplementäre Muster Licht in den konzentrischen Kreisen blockieren würde, die im gewünschten Muster lichtdurchlässig sind.
Außerdem ermöglicht die Änderung im Beleuchtungswinkel, die durch solche Mikroskope möglich gemacht wird, die Bestimmung von 3-D-Bildern der Probe. Z.B. kann die Probe aus einer Mehrzahl von unterschiedlichen Winkeln beleuchtet werden, und dann können die Änderungen in der Intensität in dem auf einzelne Pixel im Detektionsarray auftreffenden Licht detektiert werden und dann durch einen Kontroller kombiniert, zusammengestellt und/oder rekonstruiert werden, um ein 3-D-Bild der Probe zu liefern. Außerdem oder alternativ können die Lichtwinkel moduliert werden, um eine Mehrzahl von unterschiedlichen Beleuchtungswinkeln auszuwählen, die die Probe in unterschiedlichen Tiefen abtasten. Die von den unterschiedlichen Tiefen erhalte Information kann dann erhalten und tomographisch rekonstruiert werden, typischerweise durch den Kontroller, um ein 3-D-Bild der Probe zu liefern, jeweils eine einzige Schicht. Es ist ein signifikanter Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass eine solche 3-D-Abbildung bewerkstelligt werden kann, ohne dass man die Probe, eine Kondensorlinse oder eine Objektivlinse oder irgendeinen anderen Teil des Mikroskops außer dem räumlichen Lichtmodulator bewegt.
Dies ähnelt dem Vermögen von Mikroskopen, die einen räumlichen Lichtmodulator an der konjugierten Bildebene der Objektivlinsen-Aperturblende aufweisen, um die verschiedensten Dunkelfelduntersuchungen sowie eine Wechselfolge zwischen Dunkelfeld und Hellfeld durchzuführen, ohne die Probe, Kondensorlinsen, Objektivlinsen und andere Teile des Mikroskops außer den Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators zu bewegen. Folglich können solche Wechselfolgen ohne Refokussieren durchgeführt werden. Ein anderer Vorteil der schnellen Wechselfolge zwischen Dunkelfeld- und Hellfeldmikroskopie insbesondere bei Mikroskopen, die einen räumlichen Lichtmodulator an der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse aufweisen, ist, dass Licht, das von der Probe gestreut und/oder gebrochen wird, das normalerweise während des quan titativen Messprozesses bei quantitativer Hellfeldmikroskopie nicht korrekt berücksichtigt wird, an jeder Stelle in der Probe gemessen werden kann. Dies ermöglicht eine genauere Quantifizierung der Lichtmenge, die durch Absorption verlorengeht. Dies kann besonders wichtig sein, wenn man versucht, die gesamte Menge von Licht zu quantifizieren, die über gegebene Bereiche der Probe absorbiert wird, und stellt eine genauere räumliche Absorptionsdarstellung der Probe bereit.
Wenn 3-D-Bilder wie hierin beschrieben erzeugt werden, ist typischerweise das Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder, das für unterschiedliche Beleuchtungswinkel erforderlich ist, hoch genug, dass die Rekonstruktion nicht instabil wird und tatsächlich konvergiert. Abhängig von der Dicke der 3-D-Probe, die analysiert wird, ist in jedem Bild mehr oder weniger Nicht-im-Fokus-Information enthalten. Wenn die Probe zu dick in Bezug zur angenäherten Schärfentiefe des verwendeten Objektivs ist, dann kann die Nicht-im-Fokus-Information die Im-Fokus-Information überschwemmen, wodurch eine Rekonstruktion schwierig oder selbst unmöglich gemacht wird.
10 gibt schematisch eine Ausführungsform für ein Mikroskop wieder, das dieses Problem löst. Kurz gesagt, umfasst 10 vier räumliche Lichtmodulatoren, zwei im Beleuchtungsstrahlengang und zwei im Detektionsstrahlengang, wobei einer in jedem Strahlengang in der konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist und einer in jedem Strahlengang in der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist. Demgemäß emittiert in der Figur die Lichtquelle 4 Licht zum einfachen Spiegel 32a, der Licht zu einem ersten räumlichen Lichtmodulator 34a reflektiert, der in einer eintrittsseitigen konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist. Der räumliche Lichtmodulator 34a lässt einen gewünschten Teil des Lichts entlang dem Beleuchtungsstrahlengang 3 zur Projektivlinse 30a durch, wonach es weg vom einfachen Spiegel 32b reflektiert wird und zu einem zweiten räumlichen Lichtmodulator 34b durchgelassen wird, welcher räumliche Lichtmodulator in einer eintrittsseitigen konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist. Der zweite räumliche Lichtmodulator 34b lässt dann das gewünschte Licht durch die Kondenssorlinsen 16 hindurch zur Probe 20 durch, wo das Licht durch die Probe hindurch, durch die Objektivlinsen 22 hindurch und auf einen dritten räumlichen Lichtmodulator 34c durchgelassen wird, der in einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist. Licht, von dem man wünscht, dass es zum Lichtdetektor 26 durchgelassen wird, wird dann durch den dritten räumlichen Lichtmodulator 34c zum einfachen Spiegel 32c durchgelassen, wo es durch die Projektivlinsen 30b hindurch und auf einen vierten räumlichen Lichtmodulator 34d reflektiert wird, welcher Modulator in einer austrittsseitigen konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist. Der vierte räumliche Lichtmodulator lässt dann gewünschtes Licht zum einfachen Spiegel 32d durch, der das Licht zum Lichtdetektor 26 reflektiert.
Wegen der Kombination von räumlichen Lichtmodulatoren in sowohl der konjugierten Bildebene der Probe als auch der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse ist es möglich, selektiv sämtliche Merkmale zu kombinieren, die oben für räumliche Lichtmodulatoren erörtert wurden, die in einer oder einer anderen der Ebenen angeordnet sind. Z.B. sorgt ein Kombinieren von konfokaler Mikroskopie mit einer Beleuchtung unter den unterschiedlichsten Winkeln für konfokale 3-D-Durchlicht- und Reflexionsmikroskopie. Wegen der schnellen Schaltzeit, die unter Verwendung der räumlichen Lichtmodulatoren möglich ist, ist es weiter möglich, ein solches konfokales 3-D-Bild in Echtzeit zu sehen. Wegen des Vermögens Nicht-im-Fokus-Information zu berechnen und zu berücksichtigen, wie oben erörtert, kann außerdem eine solche Information begrenzt und gesteuert werden, wodurch die Rekonstruktionsaufgabe bei der Herstellung des 3-D-Bildes vereinfacht wird.
Die Hinzufügung von geeigneten Filtern ermöglicht auch, dass der Prozess für eine gesteuerte konfokale Fluoreszenzabbildung verwendet wird (in der Tat können alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung für Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden). Ein anderer Vorteil eines Kombinierens von räumlichen Lichtmodulatoren in beiden Ebenen besteht darin, dass es möglich ist, einige Effekte sphärischer Aberration zu korrigieren, indem man Bilder der Probe unter Verwendung von ausgewählten Beleuchtungs- und Detektionsausrichtungen von ausgewählten z-Positionen der Probe erfasst, wie in 11 veranschaulicht. In 11 gibt der obere Teil der Figur die Aufnahme von drei Bildern einer Probe in drei unterschiedlichen Tiefen wieder, gefolgt im Mittelteil der Figur vom Auswählen der Lichtstrahlen von jedem Teil, die in einer speziellen gewünschte Tiefe konvergieren (äquivalent zur zweiten Probentiefe im oberen Teil der Figur), dem sich dann das Kombinieren der gewünschten Beleuchtungswinkel in allen drei Probentiefen anschließt, wie schematisch im unteren Teil von 11 darstellt.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie leicht durchgeführte zeitverzögerte Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Dies kann erreicht werden, indem man gewünschte Beleuchtungspixel in den räumlichen Lichtmodulatoren im Beleuchtungsstrahlengang einschaltet und dann entsprechende Pixel in den räumlichen Lichtmodulatoren (oder Detektor) im Detektionsstrahlengang ausschaltet. Nachdem genug Zeit zur Anregung von Fluoreszenz in der Probe verstrichen ist, welche Fluoreszenz Autofluoreszenz sein kann oder Fluoreszenz aufgrund von Materialien, wie z.B. zur Probe hinzugefügte Farbstoffe, werden die räumlichen Lichtmodulatoren im Beleuchtungsstrahlengang ausgeschaltet, und eine kurze Zeit später werden die Detektionspixel des Detektors oder die Lichtdurchlasspixel der räumlichen Lichtmodulatoren, die im Detektionsstrahlen gang angeordnet sind, eingeschaltet. Ein Beispiel für die Zeitsteuerung für eine solche Situation ist in 12 wiedergegeben. Kurz gesagt, wird der räumliche Beleuchtungslichtmodulator 34b für eine kurze definierte Zeit t₀-t₁ eingeschaltet, und dann wird eine kurze Zeit später der räumliche Detektionslichtmodulator für eine definierte Zeit t₂-t₃ eingeschaltet, nach welcher Zeit der räumliche Beleuchtungslichtmodulator 34b wieder eingeschaltet wird. Eine solche Mikroskopie kann sowohl im konfokalen als auch Weitfeld-Modus durchgeführt werden.
13 gibt schematisch eine Anordnung von Linsen, Spiegeln und räumlichen Lichtmodulatoren wieder, die dem in 10 dargelegten Mikroskop ähnelt, außer dass das Mikroskop in 13 für Reflexionsmikroskopie geeignet ist, anstatt für Durchlichtmikroskopie. In 13 emittiert die Lichtquelle 4 Licht durch einen Strahlteiler 60 hindurch zu einer digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34a. Der Strahlteiler 60 kann ein dichroitischer Spiegel oder ein anderer Typ von Strahlteiler sein, andere Strahlteiler als dichroitische Spiegel können bei anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden. Gewünschtes Licht wird dann entlang dem Beleuchtungsstrahlengang 3 durch die Projektivlinse 30 hindurch reflektiert, um weg von dem einfachen Spiegel 32 auf eine zweite digitale Mikrospiegelvorrichtung 34b zu reflektieren. Gewünschtes Licht wird dann durch die digitale Mikrospiegelvorrichtung 34b durch die Objektivlinsen 22 hindurch und auf die Probe 20 durchgelassen, wo das Licht zurück durch die Objektivlinsen 22 hindurch, weg von der digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34b und dem einfachen Spiegel 32, durch die Projektivlinse 30 hindurch und weg von der ersten digitalen Mikrospiegelvorrichtung 34a reflektiert wird. Gewünschtes Licht wird dann zurück entlang dem Strahlengang durchgelassen, bis es den dichroitischen Spiegel 38 trifft, wo es zum Lichtdetektor 26 reflektiert wird. Folglich liefert das in 13 wiedergegebene Mikroskop eine Beleuchtung eines einzelnen Flecks oder Musters von Flecken, wie zuvor beschrieben, und für jeden Fleck oder Muster von Flecken können die unterschiedlichsten Beleuchtungswinkel sequenziell implementiert sein, und für jeden Winkel wird ein Bild oder eine Messung erfasst. Folglich können alle Bereiche der Ebene der Probenoberfläche erfasst werden. Man kann dann die Position der Probe entlang der optischen Achse des Mikroskops ändern und den Prozess für das neue Niveau der Probe wiederholen. Folglich kann Information von der ganzen Oberfläche von Interesse erfasst und tomographisch rekonstruiert werden, um eine 3-D-Darstellung der Oberfläche der Probe zu erzeugen. Die Mikroskope hierin sind folglich gegenüber herkömmlicher Reflexionsmikroskopie vorteilhaft, weil die Oberflächenausrichtung von jeder Stelle der Probe auf eine verhältnismäßig unkomplizierte Weise festgestellt werden kann.
14 gibt schematisch eine andere Ausführungsform eines Mikroskops wieder, das den Mikroskopen in den 10 und 13 ähnelt und vier räumliche Lichtmodulatoren umfasst, zwei im Beleuchtungsstrahlengang und zwei im Detektionsstrahlengang, wobei einer in jedem Strahlengang in der konjugierten Bildebene der Probe angeordnet ist und einer in jedem Strahlengang in der konjugierten Bildebene der Aperturblende der Objektivlinse angeordnet ist. Das Mikroskop in 10 wird zur Reflexionsmikroskopie verwendet und umfasst einen Strahlteiler 60, der zwischen den digitalen Spiegelvorrichtungen 34b, 34c und den Objektivlinsen 22 angeordnet ist.

Claims

Mikroskop (2), das ein ausgewähltes Bild in eine Bildebene einer Probe (20) des Mikroskops (2) projiziert, wobei das Mikroskop (2) einen räumlichen Lichtmodulator (34) umfasst, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln (46) umfasst und in einer konjugierten Bildebene der Probe (20) angeordnet ist, die sich eintrittsseitig von der Probe (20) befindet, wobei der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator (34) funktional mit mindestens einem Kontroller verbunden ist, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die einen Ein/Aus-Zustand der einzelnen Lichtdurchlasspixel (46) des Beleuchtungsarrays variiert, um dem ausgewählten Bild zu entsprechen, gekennzeichnet entweder – durch einen einzigen räumlichen Lichtmodulator (34) zum Projizieren des ausgewählten Bilds, während die Probe ohne Gebrauch eines räumlichen Lichtmodulators beleuchtet wird, oder – durch einen zusätzlichen räumlichen Lichtmodulator, wo der erste zum Projizieren des ausgewählten Bilds dient und der zweite zum Lenken des Lichtes zur Probe dient, oder – durch einen einzigen räumlichen Lichtmodulator mit unterschiedlichen Teilen des räumlichen Lichtmodulators, wobei ein erster Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel (46) des Beleuchtungsarrays Beleuchtungslicht zur Probe (20) liefert und sich ein zweiter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel (46) des Beleuchtungsarrays im Ein/Aus-Zustand befindet, entsprechend dem ausgewählten Bild.
Mikroskop (2) nach Anspruch 1, bei dem das ausgewählte Bild auf die Probe (20) projiziert wird.
Mikroskop (2) nach Anspruch 1, bei dem das ausgewählte Bild benachbart zur Probe (20) projiziert wird.
Mikroskop (2) nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Mikroskop (2) weiter einen Lichtdetektor (26) umfasst, der ein Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln umfasst und austrittsseitig von der Probe (20) in einem Detektionsstrahlengang an einer konjugierten Bildebene der Probe (20) angeordnet ist, wobei der räumliche Lichtmodulator und der Lichtdetektor (26) funktional mit mindestens einem Kontroller verbunden sind, der Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert und die die Lichtintensitätsdetektionsdaten, die durch den Lichtdetektor (26) bereitgestellt werden, zusammenstellt, wobei der Kontroller den Ein/Aus-Zustand von einzelnen Lichtdurchlasspixeln des räumlichen Lichtmodulators selektiv variiert, um die auf ausgewählte Flecken der Probe (20) auftreffende Lichtintensität zu variieren und dadurch die Intensität von Licht zu variieren, das von den ausgewählten Flecken der Probe (20) ausgeht und auf mindestens ein Pixel des Lichtdetektors (26) auftrifft.
Mikroskop (2) nach Anspruch 4, wobei das Mikroskop (2) ein konfokales Mikroskop (2) ist, bei dem das Detektionsarray von einzelnen Detektionspixeln dem Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln im eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulator entspricht und mit ihm ausgerichtet ist, und der mindestens eine Kontroller Computer-implementierte Programmierung enthält, die Durchlasseigenschaften des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators steuert, um mindestens einen Beleuchtungsfleck zur Probe (20) zu liefern, indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind, und das Detektionsarray selektiv den Beleuchtungsfleck detektiert.
Mikroskop (2) nach Anspruch 5, bei dem der mindestens eine Kontroller bewirkt, dass der eintrittsseitige räumliche Lichtmodulator gleichzeitig eine Mehrzahl der Beleuchtungsflecken bildet und sequenzielle komplementäre Muster der Flecken bereitstellt.
Mikroskop (2) nach Anspruch 6, bei dem der mindestens eine Kontroller bewirkt, dass der Lichtdetektor (26) Licht detektiert, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des eintrittsseitigen räumlichen Lichtmodulators ausgerichtet ist, das eingeschaltet ist, und Licht detektiert, das auf mindestens ein Detektionspixel auftrifft, das zum mittigen Detektionspixel benachbart ist, und der Kontroller Computer-implementierte Programmierung enthält, die die Daten zusammenstellt, die durch das mindestens eine benachbarte Detektionspixel bereitgestellt werden, und sie mit den Daten kombiniert, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden.
Mikroskop (2) nach Anspruch 7, bei dem die Computerimplementierte Programmierung die Daten zusammenstellt, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und sie mit den Daten kombiniert, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, so dass die Rückweisung der Nicht-im-Fokus-Information des Mikroskops (2) verbessert wird, im Vergleich mit dem Fokus ohne die Daten von den benachbarten Detektionspixeln.
Mikroskop (2) nach Anspruch 8, bei dem die Computerimplementierte Programmierung die Daten zusammenstellt, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und sie mit den Daten kombiniert, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, um die Lichtabsorptionseigenschaften der Probe (20) zu bestimmen.
Mikroskop (2) nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Computer-implementierte Programmierung die Mehrzahl der sequenziellen komplementären Muster der Beleuchtungsflecken bereitstellt, so dass alle Bereiche der Probe (20) im Beleuchtungsstrahlengang in weniger als etwa 0,03 Sekunden beleuchtet werden.
Mikroskop (2) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem der mindestens eine Kontroller ein einziger Kontroller ist.
Mikroskop (2) nach einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei das Mikroskop (2) weiter einen Fotovervielfacher umfasst, der an einem austrittsseitigen Ende des Detektionsstrahlengangs angeordnet ist.
Mikroskop (2) nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem das Mikroskop (2) eine zeitverzögerte Fluoreszenzdetektion bereitstellt, wobei die Computer-implementierte Programmierung bewirkt, dass mindestens einer der räumlichen Lichtmodulatoren die Probe (20) für eine Zeit beleuchtet, die ausreicht, um eine Fluoreszenz in der Probe (20) zu induzieren, und wobei dann mit einem Beleuchten der Probe (20) aufgehört wird und dann bewirkt wird, dass der Detektor damit beginnt, eine Fluoreszenz zu detektieren, die von der Probe (20) ausgeht.
Mikroskop (2) nach Anspruch 13, bei dem die Computerimplementierte Programmierung bewirkt, dass eine Beleuchtung und Detektion wiederholt mit einer Zykluszeit von weniger als etwa 0,03 Sekunden auftreten.
Verfahren zum Projizieren eines ausgewählten Bilds in eine Bildebene einer Probe (20) eines Mikroskops (2), wobei das Mikroskop (2) einen räumlichen Lichtmodulator (34) umfasst, der ein Beleuchtungsarray von einzelnen Lichtdurchlasspixeln (46) umfasst und in einer konjugierten Bildebene der Probe (20) angeordnet ist, um einen räumlichen Lichtmodulator (34) bereitzustellen, wobei der räumliche Lichtmodulator (34) funktional mit mindestens einem Kontroller verbunden ist, der Computerimplementierte Programmierung enthält, die einen Ein/Aus-Zustand der einzelnen Lichtdurchlasspixel des Beleuchtungsarrays variiert, um dem ausgewählten Bild zu entsprechen, wobei das Verfahren umfasst: Einstellen der einzelnen Lichtdurchlasspixel auf einen Ein/Aus-Zustand, entsprechend dem ausgewählten Bild, und Projizieren von Licht auf den räumlichen Lichtmodulator, so dass das Licht, das durch den räumlichen Lichtmodulator entlang dem Beleuchtungsstrahlengang zu der Bildebene der Probe (20) durchgelassen wird, das ausgewählte Bild transportiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (2) weiter umfasst entweder – einen einzigen räumlichen Lichtmodulator (34) zum Projizieren des ausgewählten Bilds, während die Probe ohne Gebrauch eines räumlichen Lichtmodulators beleuchtet wird, oder – einen zusätzlichen räumlichen Lichtmodulator, wo der erste zum Projizieren des ausgewählten Bilds dient und der zweite zum Lenken des Lichts zur Probe dient, oder – einen einzigen räumlichen Lichtmodulator mit unterschiedlichen Teilen des räumlichen Lichtmodulators, wobei ein erster Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel (46) des Beleuchtungsarrays Beleuchtungslicht zur Probe (20) liefert und sich ein zweiter Teil der einzelnen Lichtdurchlasspixel (46) des Beleuchtungsarrays im Ein/Aus-Zustand befindet, entsprechend dem ausgewählten Bild.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren weiter umfasst: Projizieren des ausgewählten Bilds auf die Probe (20).
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Verfahren weiter umfasst: Projizieren des ausgewählten Bilds benachbart zur Probe (20).
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, bei dem das Mikroskop (2) ein konfokales Mikroskop (2) ist und weiter ein Detektionsarray umfasst, wobei das Verfahren weiter umfasst: Liefern von mindestens einem Beleuchtungsfleck zur Probe (20), indem bewirkt wird, dass mindestens ein einzelnes Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators eingeschaltet ist, während benachbarte Pixel ausgeschaltet sind, und das Detektionsarray selektiv den Beleuchtungsfleck detektiert.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der räumliche Lichtmodulator gleichzeitig eine Mehrzahl der Beleuchtungsflecken bildet und sequenzielle komplementäre Muster der Flecken bereitstellt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Verfahren weiter umfasst: Detektieren von Licht, das auf ein mittiges Detektionspixel auftrifft, das mit einem einzelnen Lichtdurchlasspixel des räumlichen Lichtmodulators ausgerichtet ist, das eingeschaltet ist, und Detektieren von Licht, das auf mindestens ein Detektionspixel auftrifft, das zum mittigen Detektionspixel benachbart ist, und Zusammenstellen der Daten, die durch das mindestens eine benachbarte Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verfahren weiter umfasst: Zusammenstellen der Daten, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, so dass die Rückweisung der Nicht-im-Fokus-Information des Mikroskops (2) verbessert wird, im Vergleich mit dem Fokus ohne die Daten von den benachbarten Detektionspixeln.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verfahren weiter umfasst: Zusammenstellen der Daten, die durch die benachbarten Detektionspixel bereitgestellt werden, und ihr Kombinieren mit den Daten, die durch das mittige Detektionspixel bereitgestellt werden, und Bestimmen der Lichtabsorptionseigenschaften der Probe (20) daraus.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das Verfahren weiter umfasst: Bereitstellen der Mehrzahl der sequenziellen komplementären Muster der Beleuchtungsflecken, so dass im Wesentlichen alle Bereiche der Probe (20) im Beleuchtungsstrahlengang in weniger als etwa 0,03 Sekunden beleuchtet werden, um einen vollständigen Beleuchtungszyklus bereitzustellen, und dann Detektieren der Beleuchtungsflecken nicht mehr als einmal für jeden vollständigen Beleuchtungszyklus, wodurch Echtzeit-Direktsicht-Konfokalmikroskopie bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei das Verfahren weiter zeitverzögerte Fluoreszenzdetektion umfasst, wobei das Verfahren umfasst: Beleuchten der Probe (20) für eine Zeit, die ausreicht, um Fluoreszenz in der Probe (20) zu induzieren, Aufhören mit einem Beleuchten der Probe (20), und dann Detektieren von Fluoreszenz, die von der Probe (20) ausgeht.