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WO2005031427A1 - Verfahren zur probenuntersuchung und mikroskop mit evaneszenter probenbeleuchtung - Google Patents

Verfahren zur probenuntersuchung und mikroskop mit evaneszenter probenbeleuchtung Download PDF

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WO2005031427A1
WO2005031427A1 PCT/EP2004/052273 EP2004052273W WO2005031427A1 WO 2005031427 A1 WO2005031427 A1 WO 2005031427A1 EP 2004052273 W EP2004052273 W EP 2004052273W WO 2005031427 A1 WO2005031427 A1 WO 2005031427A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
detection light
microscope
field
illuminating
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/052273
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Hecker
Heinrich Ulrich
Werner Knebel
Kyra MÖLLMANN
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
Leica Microsystems Heidelberg Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10344410A external-priority patent/DE10344410A1/de
Application filed by Leica Microsystems Cms Gmbh, Leica Microsystems Heidelberg Gmbh filed Critical Leica Microsystems Cms Gmbh
Priority to EP04787190A priority Critical patent/EP1678544A1/de
Publication of WO2005031427A1 publication Critical patent/WO2005031427A1/de
Priority to US11/414,905 priority patent/US7633622B2/en

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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/32—Micromanipulators structurally combined with microscopes

Definitions

  • the invention relates to a method for microscopic examination of a sample.
  • the invention also relates to a microscope with evanescent sample illumination.
  • a microscope with evanescent illumination of a sample is known from US 2002/0097489 A1.
  • the microscope contains a white light source, the light of which is coupled via a slit diaphragm through the microscope objective into the specimen slide for evanescent illumination.
  • the illuminating light propagates in the slide by total internal reflection, the sample being illuminated only in the area of the evanescent field protruding from the slide.
  • Microscopes of this type are known under the term TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope).
  • the z-resolution of TIRF microscopes is extremely good due to the evanescent field that only projects into the sample by approx. 100 nm.
  • the lens consists of a first lens a positive refractive power, a second lens with a negative refractive power, the focal length ratio between the two lenses being in the range of - 0.4 and - 0.1 and the total refractive power being greater than zero. Furthermore, the lens contains two positive lenses, whose ratio diameter to the focal length is greater than 0.3 and less than 0.6.
  • the objective also includes a negative lens and a converging lens, the negative lens facing the front group and the focal length ratio of the negative lens and the converging lens being between ⁇ 0.5 and ⁇ 2.
  • the incident light illuminating arrangement contains an illuminating source that is polarized during operation
  • a microscope for TIRM Total Internal Reflection Microscopy
  • the microscope has a microscope housing and an objective.
  • the illuminating light emanating from an illuminating device can be coupled in via an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • an adapter which can be inserted into the microscope housing.
  • Illumination system includes a laser light source, the light of which is coupled into an optical fiber.
  • a coupling optic is also provided, which focuses the light emerging from the fiber into a rear focal point of the microscope objective.
  • the optical fiber can be displaced in a plane perpendicular to the optical axis of the microscope objective.
  • DE 102 29 935 A1 discloses a device for coupling light into a microscope. Laser light is directed onto the specimen in the light field diaphragm plane by an optical fiber coupling designed as a slide. The invention is particularly suitable for the TIRF process.
  • This task is solved by a method with the following steps: Illumination of the sample with a first evanescent field, the first evanscent field having a first depth of penetration into the sample, Detection of the first detection light which is illuminated by the one with the first evanscent field Part of the sample starts and generation of first detection light data, • illuminating the sample with a second evanescent field, the second evanscent field having a second depth of penetration into the sample which is greater than the first depth of penetration, • detecting a second detection light emitted by runs out of the part of the sample illuminated with the second evanscent field, and generate second detection light data, and • process the first and second detection light data. It is a further object of the present invention to provide
  • a microscope which is characterized in that a first evanscent field, which has a first depth of penetration into the sample, and a second evanscent field, which has a second depth of penetration into the sample, which is greater than the first depth of penetration , has, can be generated, and that at least one detector is provided, which detects the first detection light emanating from the part of the sample illuminated with the first evanscent field and generates first detection light data therefrom, and the second detection light that comes from that with the second evansescent Field illuminated part of the sample goes out, detected and second detection light data generated therefrom, and that a processing module is provided for processing the first and second detection light data.
  • the method according to the invention preferably comprises the further steps of illuminating the sample with one or more further evanescent fields of different penetration depth and detecting further detection light emanating from the part or parts of the sample illuminated with the further evansent field and generating of further detection light data.
  • the processing then preferably comprises the first, second and further detection light data.
  • a three-dimensional examination of the sample is consequently made possible by sequentially changing the penetration depth of the illuminating light. By increasing the penetration depth sequentially, additional sample layers are recorded.
  • the first and second detection light data contain data According to the invention, data from image objects and / or from parts of image objects.
  • the processing preferably includes assigning image objects to different layer depths (eg 20 nm - 40 nm, 40 nm - 60 nm, 60 nm - 80 nm ...) of the sample. This can be done with the help of a processing module.
  • the processing comprises the generation of a 3-D data stack, preferably with a processing module.
  • This data stack or the data record generated by the processing module can preferably be represented as a three-dimensional image of the sample or a sample area - preferably on a display.
  • the microscope according to the invention preferably has a lens with a lens pupil, the first and / or the second and / or the further evanescent field being generated by an illuminating light beam which has a focus in the area of the lens pupil of the lens.
  • the penetration depth of the first and / or the second and / or the further evanescent field can be set by adjusting the distance of the focus from the optical axis of the objective.
  • an adjustment means can be provided with which the spatial position of the focus can be changed within the plane of the objective pupil.
  • the setting means can comprise, for example, a beam deflection device with a plurality of rotating or tilting mirrors or with a gimbal-mounted mirror.
  • the setting means can also be designed as an acousto-optical element or contain micromirrors.
  • a displaceable optical fiber can also be used to adjust the spatial position of the focus of the illuminating light beam.
  • Illuminating light bundle leaves the lens depends on the spatial position of the focus in the lens pupil.
  • the penetration depth is set by adjusting the polarization of the illuminating light beam that generates the first and / or the second and / or the further evanescent field.
  • a rotatable ⁇ / 2 plate can be provided.
  • the microscope is advantageously calibrated - regardless of the method with which the penetration depth into the sample is set - so that reproducible examinations are made possible and quantitative statements about the nature of the sample - in particular about the arrangement of the individual sample components within the sample - are made can.
  • Detection is preferably carried out with at least one detector which comprises a camera and / or a CCD element and / or an EMCCD element and / or a multiband detector.
  • Bandpass filters and / or edge filters are preferably arranged in front of the detector and are matched to the respective emission focal length of the fluorescence signal.
  • a dispersive element can be provided for color selection, which generates a spectral splitting from which the wavelength components to be detected are masked out.
  • the detector can also be designed as a color detector, for example as a color camera. It is also possible for a dispersive element to split the detection light over several detectors in order to achieve spectral detection.
  • the detector is designed as a point detector and the detection comprises a point-by-point scanning of the respectively illuminated part of the sample.
  • a further adjustable beam deflection device can preferably be provided in the beam path of the detection light.
  • the microscope comprises a scanning microscope; especially a confocal scanning microscope.
  • the microscope according to the invention preferably has at least one multi-line light source and / or at least one broadband light source. The wavelengths or the wavelength of the first illuminating light beam and / or of the second illuminating light beam are preferably adjustable.
  • the first illuminating light beam and also the second illuminating light beam to contain light of one or more wavelengths, the wavelengths of the first illuminating light beam and the second illuminating light beam being able to differ from one another.
  • the diameter of the illuminating light beam is adjustable.
  • the opening angle of the illuminating light beam bundle converging to form a focus lying in the objective pupil can be adjusted. By changing the opening angle when focusing in the objective pupil, the size of the surface that is illuminated evanescently changes.
  • Fig. 2 shows another microscope according to the invention
  • Fig. 3 is an illustration of the method according to the invention.
  • the illuminating light beam 9 emanating from the light source 5 serves for the evanescent illumination of a sample 11 which is attached to a specimen slide 13.
  • the illuminating light beam 9 has a focus 19 represented by a point in the plane 15 of the objective pupil 17.
  • several optical elements for beam guidance and beam shaping are arranged. For example, there are first optics 21, second optics 23 and optics 25 that generate a first intermediate image plane 27 and a second intermediate image plane 29.
  • the spatial position of the focus 19 within the plane 15 of the objective pupil 17 can be changed with the aid of an adjusting means 31, which comprises an adjustable beam deflection device 33.
  • the adjustable beam deflection device 33 includes a gimbaled rotating mirror, not shown.
  • the detection light 37 emanating from the sample 11 passes through the lens 3 and through the beam splitter 39, which directs the illuminating light beam 9 to the lens 3, to a detector 41 which comprises a CCD camera 43 and which generates detection light data.
  • the beam splitter 39 is designed as a dichroic beam splitter and is designed such that light of the wavelength of the illuminating light beam is reflected while light of the wavelength of the detection light 37 can pass through.
  • the first detection light data are forwarded to a processing module 45. Then the distance between the focus of the illuminating light beam 9 and the optical axis 35 is increased and a second evanescent field is generated, the second
  • Depth of penetration into the sample is greater than the first depth of penetration.
  • the second detection light is emitted, which emanates from the part of the sample 11 illuminated with the second evanscent field, and that
  • the second detection light data are also forwarded to the processing module 45.
  • the Processing module 45 uses the first and second detection light data to assign image objects to different layer depths of the sample and to generate a 3-D data stack which is shown as a three-dimensional image of the sample or the illuminated sample area on the display 47 of a PC 49.
  • FIG. 2 shows a microscope according to the invention in which the penetration depth of the first and / or the second and / or the further evanescent field is set by adjusting the polarization of the illuminating light beam.
  • a ⁇ / 2 plate 51 is rotatably arranged in the beam path of the illuminating light beam 9 with which the direction of polarization of the illuminating light beam 9 can be rotated.
  • a beam splitter 53 is arranged in the further beam path of the illuminating light beam 9, which splits off a small part of the illuminating light beam 9 for polarization control as a measuring beam 55.
  • the measuring beam 55 is split by a polarization beam splitter 57 into an s-polarized partial beam 63, which is detected by a first detector 59, and into a p-polarized partial beam 65, which is detected by a second detector 61.
  • the polarization of the illuminating light beam 9 can be inferred from the ratio of the light powers measured with the first detector 59 and with the second detector 61.
  • the rotary position ⁇ / 2 plate 51 is set in accordance with the user specifications by means of a control circuit (not shown).
  • the sample is illuminated with a first evanescent field with a penetration depth of 20 nm, for example, and the first detection light for generating first detection light data 67 is detected.
  • the first detection light data comprise 3 image objects.
  • the sample is then illuminated with a second evanescent field with a penetration depth of 40 nm, for example, and the second detection light is detected to generate second detection light data 69.
  • the second detection light data comprise 5 image objects, 3 of which are already from the first Detection light data are known.
  • the sample is then illuminated with a further evanescent field with a penetration depth of 60 nm, for example, and the further detection light is detected to generate further detection light data 71.
  • the further detection light data comprise 8 image objects, 5 of which are already known from the first detection light data and the second detection light data.
  • the first, second and further detection light data are then processed 73.
  • the processing includes an assignment of which image objects belong to first sample layer data 75 (0-20 nm), which second sample layer data 77 (20-40 nm) and which to third sample layer data 79 (40-60 nm).
  • the data is stored as a 3-D data stack and can be displayed to the user, for example on a monitor.

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Abstract

Ein Mikroskop (1) mit evaneszenter Probenbeleuchtung (9) und ein Verfahren zur Probenuntersuchung ist offenbart. Es wird ein erstes evanseszentes Feld, das eine erste Eindringtiefe in die Probe (11) aufweist, und ein zweites evanseszentes Feld, das eine zweite Eindringtiefe in die Probe, die größer als die erste Eindringtiefe ist, aufweist, erzeugt. Es ist ein Detektor (43) vorgesehen, der erstes Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe (11) ausgeht, detektiert und daraus erste Detektionslichtdaten erzeugt und der zweites Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe (11) ausgeht, detektiert und daraus zweite Detektionslichtdaten erzeugt. Außerdem ist ein Verarbeitungsmodul (45) zum Verarbeiten der ersten und zweiten Detektionslichtdaten (37) vorgesehen.

Description

Verfahren zur Probenuntersuchunq und Mikroskop mit evaneszenter Probenbeleuchtunq
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung einer Probe.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop mit evaneszenter Probenbeleuchtung.
Aus US 2002/0097489 A1 ist ein Mikroskop mit evaneszenter Beleuchtung einer Probe bekannt. Das Mikroskop beinhaltet eine Weißlichtquelle, deren Licht über eine Schlitzblende durch das Mikroskopobjektiv hindurch in den eine Probe tragenden Objektträger zur evaneszenten Beleuchtung eingekoppelt wird. Das Beleuchtungslicht pflanzt sich in dem Objektträger durch totalinterne Reflektion fort, wobei die Beleuchtung der Probe nur im Bereich des aus dem Objektträger herausragenden evaneszenten Feldes erfolgt. Mikroskope dieser Art sind unter dem Begriff TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescent Microscope) bekannt.
Die z-Auflösung von TIRF-Mikroskopen ist aufgrund des nur ca. 100 nm in die Probe ragenden evaneszenten Feldes außerordentlich gut.
Aus DE 101 08 796 A1 ist ein hochaperturiges Objektiv, insbesondere für TIRF-Anwendungen bekannt. Das Objektiv besteht aus einer ersten Linse mit einer positiven Brechkraft, einer zweiten Linse mit negativer Brechkraft, wobei das Brennweitenverhältnis zwischen den beiden Linsen im Bereich von - 0,4 und - 0,1 liegt und die Gesamtbrechkraft größer Null ist. Ferner beinhaltet das Objektiv zwei positive Linsen, deren Verhältnisdurchmesser zur Brennweite größer 0,3 und kleiner 0,6 ist. Ferner beinhaltet das Objektiv eine Negativlinse und einer Sammellinse, wobei die Negativlinse der Frontgruppe zugewandt ist und das Brennweitenverhältnis der Negativlinse und der Sammellinse zwischen - 0,5 und - 2 liegt.
Aus DE 102 17 098 A1 ist eine Auflichtbeleuchtungsanordnung für die TIRF- Mikroskopie bekannt. Die Auflichtbeleuchtungsanordnung beinhaltet eine Beleuchtungsquelle, die im Betrieb ein polarisiertes
Beleuchtungsstrahlenbündel abgibt, das unter einem Winkel zur optischen Achse propagiert und eine Umlenkeinrichtung, die das Beleuchtungsstrahlenbündel umlenkt und parallel zur optischen Achse in das Objektiv einkoppelt. Es ist bei dieser Auflichtbeleuchtungsanordnung vorgesehen, dass das von der Beleuchtungsquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlenbündel s- und p-Polarisationsrichtungen mit einer Phasendifferenz aufweist und die Umlenkeinrichtung das Beleuchtungsstrahlenbündel x-mal reflektiert, wobei x = (n x 180 ° - d)/60 °. Aus DE 101 43 481 A1 ist ein Mikroskop zur TIRM (Total Internal Reflection Microscopy) bekannt. Das Mikroskop weist ein Mikroskopgehäuse und ein Objektiv auf. Das von einer Beleuchtungseinrichtung ausgehende Beleuchtungslicht kann über einen in das Mikroskopgehäuse einschiebbaren Adapter eingekoppelt werden. Aus US 2004/0001253 A1 ist ein Mikroskop mit einem optischen Beleuchtungssystem, das ein einfaches Umschalten zwischen evaneszenter Beleuchtung und Reflektionsbeleuchtung ermöglicht. Das
Beleuchtungssystem beinhaltet eine Laserlichtquelle, deren Licht in eine optische Faser eingekoppelt wird. Ferner ist eine Auskoppeloptik vorgesehen, die das aus der Faser austretende Licht in einen hinteren Brennpunkt des Mikroskopobjektivs fokussiert. Die optische Faser ist in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs verschiebbar. Aus DE 102 29 935 A1 ist eine Einrichtung zur Einkopplung von Licht in einem Mikroskop bekannt. Dabei wird in der Leuchtfeldblendenebene durch eine als Schieber ausgeführte Lichtleitfaser-Einkopplung Laserlicht auf das Präparat gerichtet. Die Erfindung ist insbesondere für das TIRF- Verfahren geeignet.
Die bislang bekannten Techniken zur evaneszenten Probenbeleuchtung erlauben lediglich die Probenschichten zu untersuchen, die direkt an das Deckglas bzw. direkt an den Objektträger angrenzen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung einer Probe bei evaneszenter Probenbeleuchtung anzugeben, das sich nicht auf die Probenschichten beschränkt, die unmittelbar an das Deckglas bzw. an den Objektträger angrenzen und das darüber hinaus eine 3-D-Untersuchung der Probe ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur mit folgenden Schritten gelöst: • Beleuchten der Probe mit einem ersten evaneszenten Feld, wobei das erste evanseszente Feld eine erste Eindringtiefe in die Probe aufweist, • Detektieren von erstem Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, und Erzeugen von ersten Detektionshchtdaten, • Beleuchten der Probe mit einem zweiten evaneszenten Feld, wobei das zweite evanseszente Feld eine zweite Eindringtiefe in die Probe aufweist, die größer als die erste Eindringtiefe ist, • Detektieren von zweitem Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, und Erzeugen von zweiten Detektionslichtdaten, und • Verarbeiten der ersten und zweiten Detektionslichtdaten. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikroskop anzugeben, das bei evaneszenter Probenbeleuchtung eine 3-D-Untersuchung der Probe ermöglicht.
Diese weitere Aufgabe wird durch ein Mikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein erstes evanseszentes Feld, das eine erste Eindringtiefe in die Probe aufweist, und ein zweites evanseszentes Feld, das eine zweite Eindringtiefe in die Probe, die größer als die erste Eindringtiefe ist, aufweist, erzeugbar sind, und dass zumindest ein Detektor vorgesehen ist, der erstes Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, detektiert und daraus erste Detektionslichtdaten erzeugt und der zweites Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, detektiert und daraus zweite Detektionslichtdaten erzeugt, und dass ein Verarbeitungsmodul zum Verarbeiten der ersten und zweiten Detektionslichtdaten vorgesehen ist.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die weiteren Schritte des Beleuchtens der Probe mit einem oder mehreren weiteren evaneszenten Feldern unterschiedlicher Eindringtiefe und des Detektierens von weiterem Detektionslicht, das von dem bzw. den mit dem weiteren evanseszenten Feld beleuchteten Teil bzw. Teilen der Probe ausgeht, und Erzeugen von weiteren Detektionslichtdaten. Das Verarbeiten umfasst dann vorzugsweise der ersten, zweiten und weiteren Detektionslichtdaten. Erfindungsgemäß ist folglich durch sequentielles Verändern der Eindringtiefe des Beleuchtungslichtes eine dreidimensionale Untersuchung der Probe ermöglicht. Durch sequentielles Erhöhen der Eindringtiefe werden jeweils zusätzliche Probenschichten erfasst. Durch - anschaulich gesprochen -„Abziehen" der Bilddaten der vorherigen - bei geringerer Eindringtiefe erfassten - Daten von den Daten, die die jeweils zusätzliche Probenschicht umfassen, kann eine genaue Zuordnung von einzelnen Bildrasterpunkten und/oder Bildobjekten zu den Schichttiefen erfolgen.
Die ersten und zweiten Detektionslichtdaten Daten beinhalten erfindungsgemäß Daten von Bildobjekten und/oder von Teilen von Bildobjekten. Das Verarbeiten umfasst vorzugsweise ein Zuordnen von Bildobjekten zu verschiedenen Schichttiefen (z.B. 20nm - 40nm, 40nm - 60nm, 60nm - 80nm ...) der Probe. Dies kann mit Hilfe eines Verarbeitungsmoduls erfolgen.
In einer besonderen Variante umfasst das Verarbeiten das Erzeugen eines 3- D-Datenstapels vorzugsweise mit einem Verarbeitungsmodul. Dieser Datenstapel bzw. der von dem Verarbeitungsmodul erzeugte Datensatz ist vorzugsweise als dreidimensionales Abbild der Probe oder eines Probenbereichs - vorzugsweise auf einem Display - darstellbar.
Das erfindungsgemäße Mikroskop weist vorzugsweise ein Objektiv mit einer Objektivpupille auf, wobei das erste und/oder das zweite und/oder das weitere evaneszente Feld von einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel erzeugt wird, das im Bereich der Objektivpupille des Objektivs einen Fokus aufweist. Die Eindringtiefe des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld ist in einer bevorzugten Variante durch Einstellen des Abstandes des Fokus von der optischen Achse des Objektivs einstellbar. Hierzu kann ein Einstellmittel vorgesehen sein, mit dem die räumliche Position des Fokus innerhalb der Ebene der Objektivpupille veränderbar ist. Das Einstellmittel kann beispielsweise eine Strahlablenkeinrichtung mit mehreren Dreh- oder Kippspiegeln oder mit einem kardanisch aufgehängten Spiegel umfassen. Das Einstellmittel kann auch als akustooptisches Element ausgebildet sein oder Mikrospiegel beinhalten. Zum Einstellen der räumlichen Position des Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels kann auch eine verschiebbare Lichtleitfaser dienen.
Der Winkel bezüglich der optischen Achse des Objektivs, unter dem der zur evaneszenten Beleuchtung der Probe vorgesehene
Beleuchtungslichtstrahlenbündel das Objektiv verlässt, hängt von der räumlichen Position des Fokus in der Objektivpupille ab. Der Winkel ist umso größer, je größer der Abstand des jeweiligen Fokus von der optischen Achse ist. Daher ist erfindungsgemäß insbesondere der Abstand des Fokus von der optischen Achse des Objektivs zur Einstellung des Winkels und damit zur Einstellung der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die Probe einstellbar.
In einer anderen vorteilhaften Variante erfolgt die Einstellung der Eindringtiefe durch Einstellen der Polarisation des Beleuchtungslichtstrahlebündels, das das erste und/oder das zweite und/oder das weitere evaneszente Feld erzeugt. Zum Einstellen der Polarisation eine Phasenplatte kann beispielsweise eine drehbar angeordnete λ/2-Platte vorgesehen sein.
Vorteilhafter Weise ist das Mikroskop - unabhängig von der Methode mit der die Eindringtiefe in die Probe eingestellt wird - kalibriert, so dass reproduzierbare Untersuchungen ermöglicht sind und quantitative Aussagen über die Beschaffenheit der Probe - insbesondere über die Anordnung der einzelnen Probenbestandteile innerhalb der Probe - getroffen werden können.
Vorzugsweise erfolgt das Detektieren mit zumindest einem Detektor, der eine Kamera und/oder ein CCD-Element und/oder ein EMCCD-Element und/oder einen Multibanddetektor umfasst. Vorzugsweise sind vor dem Detektor Bandpassfilter und/oder Kantenfilter angeordnet auf die jeweilige Emissionsbrandweite des Fluoreszenzsignals durch abgestimmt sind. Zur Farbselektion kann ein dispersives Element vorgesehen sein, dass eine spektrale Aufspaltung erzeugt, aus der die zu detektierenden Wellenlängenanteile ausgeblendet werden. Der Detektor kann auch als Farbdetektor, beispielsweise als Farbkamera ausgestaltet sein. Genauso ist es möglich, dass ein dispersives Element das Detektionslicht auf mehrere Detektoren aufteilt, um eine Spektraldetektion zu erreichen. In einer Variante ist der Detektor als Punktdetektor ausgebildet und das Detektieren umfasst ein punktweises Abrastern des jeweils beleuchteten Teils der Probe. Zum punktweisen Abrastern vorzugsweise eine weitere einstellbare Strahlablenkeinrichtung im Strahlengang des Detektionslichtes vorgesehen sein. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mikroskop ein Rastermikroskop; insbesondere ein konfokales Rastermikroskop. Das erfindungsgemäße Mikroskop weist vorzugsweise zumindest eine Mehrlinienlichtquelle und/oder zumindest eine Breitbandlichtquelle auf. Vorzugsweise sind die Wellenlängen bzw. ist die Wellenlänge des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und/oder des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar. Es ist erfindungsgemäß möglich, dass der erste Beleuchtungslichtstrahlenbündel und auch der zweite Beleuchtungslichtstrahlenbündel Licht einer oder mehrerer Wellenlängen beinhalten kann, wobei sich die Wellenlängen des ersten Beleuchtungslichtstrahlenbündels und des zweiten Beleuchtungslichtstrahlenbündels voneinander unterscheiden können.
In einer besonders bevorzugten Variante ist der Durchmesser des Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar. Insbesondere ist es von Vorteil, wenn der Öffnungswinkel des zu einem in der Objektivpupille liegenden Fokus zusammenlaufenden Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar ist. Durch Änderung des Öffnungswinkels bei der Fokussierung in die Objektivpupille ändert sich die Größe der Fläche, die evaneszent beleuchtet wird.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen: Fig. 1 Ein erfindungsgemäßes Mikroskop,
Fig. 2 ein weiteres erfindungsgemäßes Mikroskop und
Fig. 3 eine Illustration des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop 1 mit einem Objektiv 3 und einer Lichtquelle 5, die als Laser 7 ausgebildet ist und die ein Beleuchtungslichtstrahlenbündel 9 erzeugt. Das von der Lichtquelle 5 ausgehende Beleuchtungslichtstrahlenbündel 9 dient zur evaneszenten Beleuchtung einer Probe 11 , die an einem Objektträger 13 angelagert ist. Das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 9 weist in der Ebene 15 der Objektivpupille 17 einen durch einen Punkt dargestellten Fokus 19 auf. Im Strahlengang des Mikroskops 1 sind mehrere optische Elemente zur Strahlführung und Strahlformung angeordnet. So gibt es beispielsweise eine erste Optik 21 , eine zweite Optik 23 und eine Optik 25, die eine erste Zwischenbildebene 27 und eine zweite Zwischenbildebene 29 erzeugen. Die räumliche Position des Fokus 19 innerhalb der Ebene 15 der Objektivpupille 17 ist mit Hilfe eines Einstellmittels 31 , dass eine einstellbare Strahlablenkeinrichtung 33 umfasst, veränderbar. Die einstellbare Strahlablenkeinrichtung 33 beinhaltet einen nicht dargestellten kardanisch aufgehängten Drehspiegel. Mit Hilfe des Einstellmittels 31 kann der Abstand des Fokus 19 zur optischen Achse 35 des Objektivs 3 eingestellt werden und damit die Eindringtiefe des Beleuchtungslichtstrahlenbündels in die Probe 11 variiert werden. Das von der Probe 11 ausgehende Detektionslicht 37 gelangt durch das Objektiv 3 sowie durch den Strahlteiler 39, der das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 9 zum Objektiv 3 lenkt, hindurch zu einem Detektor 41 , der eine CCD-Kamera 43 umfasst und der Detektionslichtdaten erzeugt. Der Strahlteiler 39 ist als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet und so ausgelegt, dass Licht der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahlenbündels reflektiert wird, während Licht der Wellenlänge des Detektionslichts 37 passieren kann.
Zunächst wird ein erster Abstand des Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 zur optischen Achse 35 und damit eine erste Eindringtiefe eines ersten evaneszenten Feldes gewählt. Es erfolgt das
Detektieren von erstem Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe 11 ausgeht, und das
Erzeugen von ersten Detektionslichtdaten. Die ersten Detektionslichtdaten werden an ein Verarbeitungsmodul 45 weiter geleitet. Dann wird der Abstand des Fokus des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 zur optischen Achse 35 vergrößert und damit ein zweites evaneszentes Feld erzeugt, das eine zweite
Eindringtiefe in die Probe aufweist, die größer als die erste Eindringtiefe ist. Es erfolgt das Detektieren von zweitem Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe 11 ausgeht, und das
Erzeugen von zweiten Detektionslichtdaten. Die zweiten Detektionslichtdaten werden ebenfalls an das Verarbeitungsmodul 45 weiter geleitet. Im Verarbeitungsmodul 45 erfolgt aus den ersten und zweiten Detektionslichtdaten ein Zuordnen von Bildobjekten zu verschiedenen Schichttiefen der Probe und die Erzeugung eines 3-D-Datenstapels, der als dreidimensionales Abbild der Probe bzw. des beleuchteten Probenbereichs - auf dem Display 47 eines PC 49 dargestellt wird.
Fig. 2 zeigt ein erfindungsgemäßes Mikroskop bei dem die Einstellung der Eindringtiefe der des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld durch Einstellen der Polarisation des Beleuchtungslichtstrahlenbündels erfolgt. Im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 ist eine λ/2-Platte 51 drehbar angeordnet mit der die Polarisationsrichtung des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 gedreht werden kann. Zur Überwachung der eingestellten Polarisation ist im weiteren Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 ein Strahlteiler 53 angeordnet, der einen kleinen Teil des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 zur Polarisationskontrolle als Messstrahl 55 abspaltet. Der Messstrahl 55 wird von einem Polarisationsstrahlteiler 57 in einen s-polarisierten Teilstrahl 63, der von einem ersten Detektor 59 detektiert wird, und in einen p-polarisierten Teilstrahl 65, der von einem zweiten Detektor 61 detektiert wird, aufgespalten. Aus dem Verhältnis der mit dem ersten Detektor 59 und mit dem zweiten Detektor 61 gemessenen Lichtleistungen kann auf die Polarisation des Beleuchtungslichtstrahlenbündels 9 geschlossen werden. Über einen nicht dargestellten Regelkreis wird die Drehstellung λ/2-Platte 51 entsprechend den Benutzervorgaben eingestellt.
Fig. 3 illustriert das erfindungsgemäße Verfahren. Zunächst wird die Probe mit einem ersten evaneszenten Feld mit einer Eindringtiefe von beispielsweise 20 nm beleuchtet und das erste Detektionslicht zur Erzeugung von ersten Detektionslichtdaten 67 detektiert. Die ersten Detektionslichtdaten umfassen in diesem Beispiel 3 Bildobjekte. Dann wird die Probe mit einem zweiten evaneszenten Feld mit einer Eindringtiefe von beispielsweise 40 nm beleuchtet und das zweite Detektionslicht zur Erzeugung von zweiten Detektionslichtdaten 69 detektiert. Die zweiten Detektionslichtdaten umfassen in diesem Beispiel 5 Bildobjekte, von denen 3 bereits aus den ersten Detektionslichtdaten bekannt sind. Anschließend wird die Probe mit einem weiteren evaneszenten Feld mit einer Eindringtiefe von beispielsweise 60 nm beleuchtet und das weitere Detektionslicht zur Erzeugung von weiteren Detektionslichtdaten 71 detektiert. Die weiteren Detektionslichtdaten umfassen in diesem Beispiel 8 Bildobjekte, von denen 5 bereits aus den ersten Detektionslichtdaten und den zweiten Detektionslichtdaten bekannt sind. Anschließend erfolgt eine Verarbeitung 73 der ersten, zweiten und weiteren Detektionslichtdaten. Die Verarbeitung umfasst eine Zuordnung, welche Bildobjekte ersten Probenschichtdaten 75 (0-20 nm), welche zweiten Probenschichtdaten 77 (20-40 nm) und welche einer dritten Probenschichtdaten 79 (40-60 nm), angehören. Die Daten werden als 3-D- Datenstapel abgelegt und sind dem Benutzer beispielsweise auf einem Monitor darstellbar.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste:
1 Mikroskop
3 Objektiv
5 Lichtquelle
7 Laser
9 Beleuchtungslichtstrahlenbündel
11 Probe
13 Objektträger
15 Ebene der Objektivpupille 17
17 Objektivpupille
19 Fokus 1 erste Optik 3 zweite Optik 5 Optik 7 erste Zwischenbildebene 9 zweite Zwischenbildebene 1 Einstellmittel 3 Strahlablenkeinrichtung 5 optische Achse 7 Detektionslicht 9 Strahlteiler 1 Detektor 3 CCD-Kamera 5 Verarbeitungsmodul Display PC λy2-Platte Strahlteiler Messstrahl Polarisationsstrahlteiler erster Detektor zweiter Detektor s-polarisierter Teilstrahl p-polarisierter Teilstrahl erste Detektionslichtdaten zweite Detektionslichtdaten weitere Detektionslichtdaten Verarbeitung erste Probenschichtdaten zweite Probenschichtdaten dritte Probenschichtdaten

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung einer Probe gekennzeichnet durch folgende Schritte: • Beleuchten der Probe mit einem ersten evaneszenten Feld, wobei das erste evanseszente Feld eine erste Eindringtiefe in die Probe aufweist, • Detektieren von erstem Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, und Erzeugen von ersten Detektionslichtdaten, • Beleuchten der Probe mit einem zweiten evaneszenten Feld, wobei das zweite evanseszente Feld eine zweite Eindringtiefe in die Probe aufweist, die größer als die erste Eindringtiefe ist, • Detektieren von zweitem Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, und Erzeugen von zweiten Detektionslichtdaten, und • Verarbeiten der ersten und zweiten Detektionslichtdaten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die weiteren Schritte: • Beleuchten der Probe mit einem oder mehreren weiteren evaneszenten Feldern unterschiedlicher Eindringtiefe und • Detektieren von weiterem Detektionslicht, das von dem bzw. den mit dem weiteren evanseszenten Feld beleuchteten Teil bzw. Teilen der Probe ausgeht, und Erzeugen von weiteren Detektionslichtdaten, • Verarbeiten der ersten, zweiten und weiteren Detektionslichtdaten.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten Detektionslichtdaten Daten von
Bildobjekten und/oder von Teilen von Bildobjekten beinhalten und dass das Verarbeiten ein Zuordnen von Bildobjekten zu verschiedenen Schichttiefen der Probe umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verarbeiten das Erzeugen eines 3-D-Datenstapels umfasst,
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchten durch das Objektiv eines Mikroskops erfolgt, wobei das erste und/oder das zweite und/oder das weitere evaneszente Feld von einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel erzeugt wird, das im Bereich der Objektivpupille des Objektivs einen Fokus aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
Eindringtiefe des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld durch Einstellen des Abstandes des Fokus von der optischen Achse des Objektivs eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einstellmittel vorgesehen ist, mit dem die räumliche Position des Fokus innerhalb der Ebene der Objektivpupille veränderbar ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellmittel eine im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels angeordnete einstellbare Strahlablenkeinrichtung umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die
Eindringtiefe des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld durch Einstellen der Polarisation des Beleuchtungslichtstrahlenbündels eingestellt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren mit zumindest einem Detektor erfolgt, der eine Kamera und/oder ein CCD-Element und/oder ein EMCCD-Element umfasst, erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektieren durch punktweises Abrastern des jeweils beleuchteten Teils der Probe erfolgt.
12. Mikroskop mit evaneszenter Probenbeleuchtung, dadurch gekennzeichnet, dass ein erstes evanseszentes Feld, das eine erste Eindringtiefe in die Probe aufweist, und ein zweites evanseszentes Feld, das eine zweite Eindringtiefe in die Probe, die größer als die erste Eindringtiefe ist, aufweist, erzeugbar sind, und dass zumindest ein Detektor vorgesehen ist, der erstes Detektionslicht, das von dem mit dem ersten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, detektiert und daraus erste Detektionslichtdaten erzeugt und der zweites Detektionslicht, das von dem mit dem zweiten evanseszenten Feld beleuchteten Teil der Probe ausgeht, detektiert und daraus zweite Detektionslichtdaten erzeugt, und dass ein Verarbeitungsmodul zum Verarbeiten der ersten und zweiten Detektionslichtdaten vorgesehen ist.
13. Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass weitere evaneszente Feldern unterschiedlicher Eindringtiefe erzeugbar sind und dass der Detektor weiteres Detektionslicht, das von dem bzw. den mit dem weiteren evanseszenten Feld beleuchteten Teil bzw. Teilen der Probe ausgeht, detektiert und weitere Detektionslichtdaten erzeugt, die mit dem Verarbeitungsmodul verarbeitbar sind.
14. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten und zweiten Detektionslichtdaten Daten von
Bildobjekten und/oder von Teilen von Bildobjekten beinhalten und dass das Verarbeitungsmodul erfasste Bildobjekte zu verschiedenen Schichttiefen der Probe zuordnet.
15. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verarbeitungsmodul einen 3-D-Datenstapel erzeugt.
16. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Verarbeitungsmodul einen Datensatz erzeugt, der als dreidimensionales Abbild der Probe oder eines Probenbereichs - vorzugsweise auf einem Display - darstellbar ist.
17. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein Objektiv mit einer Objektivpupille aufweist und dass das erste und/oder das zweite und/oder das weitere evaneszente Feld von einem Beleuchtungslichtstrahlenbündel erzeugt wird, das im Bereich der Objektivpupille des Objektivs einen Fokus aufweist.
18. Mikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Eindringtiefe des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld durch Einstellen des Abstandes des Fokus von der optischen Achse des Objektivs einstellbar ist.
19. Mikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass ein Einstellmittel vorgesehen ist, mit dem die räumliche Position des Fokus innerhalb der Ebene der Objektivpupille veränderbar ist.
20. Mikroskop nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellmittel eine im Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahlenbündels angeordnete einstellbare Strahlablenkeinrichtung umfasst.
21. Mikroskop nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
Eindringtiefe des ersten und/oder das zweiten und/oder des weiteren evaneszenten Feld durch Einstellen der Polarisation des Beleuchtungslichtstrahlenbündels einstellbar ist.
22. Mikroskop nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass zum Einstellen der Polarisation eine Phasenplatte, vorzugsweise eine λ/2-Platte, vorgesehen ist.
23. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor eine Kamera und/oder ein CCD-Element und/oder ein EMCCD-Element umfasst.
24. Mikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Punktdetektor ist und das Detektieren ein punktweises Abrastern des jeweils beleuchteten Teils der Probe unfasst.
25. Mikroskop nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere einstellbare Strahlablenkeinrichtung im Strahlengang des Detektionslichtes vorgesehen ist.
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