DE69832489T2

DE69832489T2 - Induktion von männlicher sterilität in pflanzen durch erhöhte expression von streptavidin

Info

Publication number: DE69832489T2
Application number: DE69832489T
Authority: DE
Inventors: C. Marc ALBERTSEN; A. John HOWARD; Sheila Maddock
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1997-07-14
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2018-04-23
Also published as: CN1269837A; KR20010021940A; WO1999004023A1; CA2296445A1; EP1000164A1; AU7146098A; SK712000A3; BG104154A; MXPA00000580A; NZ502688A; TR200000098T2; DE69832489D1; RO120920B1; AU742366B2; EP1000164B1; ZA986087B; ATE310826T1; CR5812A; JP2001510052A; HUP0002649A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beetrifft ein Verfahren zur Kontrolle der Fertilität von Pflanzen unter Verwendung von DNA-Molekülen, die für Streptavidin kodieren. Diese Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von transgenischen, männlich-sterilen Pflanzen, die Streptavidin exprimieren. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Wiederherstellung von männlicher Fertilität in der Nachkommenschaft von männlich-sterilen Pflanzen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Produktion von Hybridsamen, insbesondere Hybridsamen mit einem oder mehreren gewünschten Korn- oder Samenmerkmalen unter Verwendung männlich-steriler Pflanzen, die Streptavidin exprimieren.
Hintergrund der Erfindung
Die Kontrolle von Pollenfertilität ist bei der Hybridnutzpflanzenproduktion essentiell. Siehe z. B. J. M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3. Ausg. (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987). In der Hybridmaisproduktion beispielsweise wird die Kontrolle der Pollenfertilität typischerweise durch physikalisches Entfernen der männlichen Infloreszenz, oder Fahne, bevor die Pollen ausfallen, durchgeführt. Ein manuelles Entfahnen ist in hohem Maße arbeitsintensiv. Obgleich ein mechanisches Entfahnen weniger arbeitsintensiv als manuelles Entfahren ist, ist es weniger zuverlässig und erfordert eine anschließende Untersuchung der Nutzpflanze und üblicherweise ein Abhilfe schaffendes manuelles Entfahnen. Beide Methoden des Entfahnens verursachen einen Verlust an weiblichem Elternbestand.
Die meisten wichtigen Nutzpflanzen von Interesse haben allerdings funktionelle männliche und weibliche Organe innerhalb derselben Blume; daher ist eine Emaskulation kein einfaches Verfahren. Obgleich es möglich ist, die Pollen bildenden Organe von Hand zu entfernen, bevor der Pollen ausfällt, ist diese Form der Hybridproduktion extrem arbeitsintensiv und teuer.
Pollenfertilität kann auch durch Aufbringen eines Blattspritzmittels, das männlich-gametozide Eigenschaften hat, kontrolliert werden (Cross et al., Sex Plant Reprod. 4: 235 (1991)). Beispielsweise resultiert die Auftragung von Ethrel auf Staubbeutel in zusätzlichen Pollenmitosen bei Weizen, in Degeneration von Tapetalzellen in Gerste und missgebildeten oder abgestoßenen Pollen in Eragrostis. Bennet et al., Nature 240: 566 (1972), Colhoun et al., Plant Cell Environ. 6: 21 (1983); Berthe et al., Crop Sci. 18: 35 (1978). Allerding ist der chemische Ansatz arbeitsintensiv, weist potenzielle Probleme mit der Toxizität von Chemikalien, die in die Umgebung eingeführt werden, auf, und kann bezüglich des Timings der Anwendung sehr empfindlich sein.
Außerdem ist eine kommerzielle Produktion von Hybridsamen durch Verwendung von Gametoziden durch die Ausgaben für die Chemikalien und die Verfügbarkeit der Chemikalien wie auch durch die Zuverlässigkeit und die Länge der Wirkung der Anwendungen begrenzt. Eine ernste Beschränkung bei Gametoziden besteht darin, dass sie phytotoxische Effekte haben, deren Schwere vom Genotyp abhängig ist. Andere Beschränkungen umfassen die Tatsache, dass diese Chemikalie für Nutzpflanzen mit längerer Blühperiode nicht wirksam sein können, da neue Blumen, die produziert werden, nicht beeinflusst werden können. Folglich ist eine wiederholte Anwendung von Chemikalien erforderlich.
Viele gängige kommerzielle Hybridsamenproduktionssysteme für Feldfrüchte beruhen auf einem genetischen Mittel der Bestäubungskontrolle. Pflanzen, die als weibliche Pflanzen verwendet werden, werfen entweder keinen Pollen ab, produzieren Pollen, der zur Selbstzerstäubung unfähig ist, oder produzieren keinen Pollen. Pflanzen, die unfähig sind, sich selbst zu bestäuben, werden als „selbstinkompatibel" genannt. Schwierigkeiten, die mit der Verwendung eines Selbstinkompatibilitätssystem verbunden sind, umfassen Verfügbarkeit und Vermehrung der selbstinkompatiblen weiblichen Linie und Stabilität der Selbstinkompatibilität. In einigen Fällen kann Selbstinkompatibilität chemisch überwunden werden oder unreife Knospen können von Hand vor dem biochemischen Mechanismus, der blockiert, dass Pollen aktiviert wird, bestäubt werden. Selbstunverträgliche Systeme bzw. selbstinkompatible Systeme, die desaktiviert werden können, sind oft für stressvolle klimatische Bedingungen sehr anfällig, welche die Wirksamkeit der biochemischen Blockierung zur Selbstbestäubung unterbrechen oder reduzieren können.
Von größerem Interesse für die kommerzielle Samenproduktion sind genetische Systeme auf Pollenkontrollbasis, die männliche Sterilität verursachen. Diese Systeme gehören zu zwei allgemeinen Typen: (1) nukleäre männliche Sterilität, die das Fehlen von Pollenbildung aufgrund von Mutationen in einem oder mehreren nukleären Genen ist, oder (2) cytoplasmatische-genetische männliche Sterilität, üblicherweise als „cytoplasmatische männliche Sterilität" (CMS) bezeichnet, bei der Pollenbildung wegen einer Veränderung in einer cytoplasmatischen Organelle, die im Allgemeinen die Mitochondrie ist, blockiert oder unentwickelt bleibt.
Nukleäre Sterilität kann entweder dominant oder rezessiv sein. Typischerweise kann dominante Sterilität nur zur Hybridsamenbildung eingesetzt werden, wenn eine vegetative oder klonale Vermehrung der weiblichen Linie möglich ist. Rezessive Sterilität kann verwendet werden, wenn sterile und fertile Pflanzen leicht unterschieden werden. Kommerzielle Nützlichkeit von dominanten und rezessiven Sterilitätssystemen ist begrenzt, allerdings auf Kosten einer klonalen Propagation bzw. einem „rouging" der weiblichen Reihen selbstbefruchtender Pflanzen.
Obgleich es Hybridisierungsschemata gibt, die die Verwendung von CMS involvieren, gibt es Beschränkungen bezüglich ihres kommerziellen Wertes. Ein Beispiel für ein CMS-System ist eine spezifische Mutation in den cytoplasmatisch lokalisierten Mitochondrien, die, wenn sie im geeigneten nukleären Hintergrund ist, zu dem Versagen bei der reifen Pollenbildung führen kann. In einigen Fällen kann der nukleäre Hintergrund die cytoplasmatische Mutation kompensieren und es tritt eine normale Pollenbildung auf. Spezifische nukleäre „Restorergene" erlauben eine Pollenbildung in Pflanzen mit CMS-Mitochondrien. Im Allgemeinen involviert die Verwendung von CMS für eine kommerzielle Samenproduktion die Verwendung von drei Züchtungslinien: eine männlich-sterile Linie (weiblicher Elter), eine „maintainer"-Linie, die zur männlich-sterilen Linie isogen ist, aber vollständig funktionelle Mitochondrien enthält, und eine männliche Elterlinie. Die männliche Elterlinie kann die spezifischen Restorergene im Cytoplasma tragen oder nicht.
Für Nutzpflanzen, z. B. Gemüse, für die eine Samengewinnung aus dem Hybrid unwichtig ist, kann ein CMS-System ohne Restauration eingesetzt werden. Für Nutzpflanzen, für die die Früchte oder Samen des Hybrids das kommerzielle Produkt sind, muss die Fertilität der Hybridsamen durch spezifische Restorergene im männlichen Elter wieder hergestellt werden oder das männlich-sterile Hybrid muss bestäubt werden. Eine Bestäubung von nicht-restaurierten Hybriden kann erreicht werden, indem ein. geringer Prozentgehalt an männlich fertilen Pflanzen eingeschlossen wird, um eine Bestäubung zu erreichen. In den meisten Spezies ist das CMS-Merkmal mütterlich vererbt, da alle cytoplasmatischen Organellen üblicherweise nur von der Eizelle vererbt werden.
CMS-Systeme besitzen Beschränkungen, die sie als alleinige Lösung zur Herstellung von männlich-sterilen Pflanzen ausschließen können. Beispielsweise verleiht ein besonderer CMS-Typ bei Mais (T-Cytoplasma) Empfindlichkeit für das Toxin, das durch Infektion durch einen besonderen Pilz produziert wird. Obgleich sie noch für eine Reihe von Nutzpflanzen eingesetzt werden, können CMS-Systeme unter bestimmten Umweltbedingungen zusammenbrechen.
Es ist daher klar, dass ein anderes Mittel als manuelle, mechanische, chemische und traditionelle genetische Methoden zur Kontrolle der Pollenproduktion erwünscht ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines isolierten DNA-Moleküls, das einen Anther-spezifischen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das isolierte DIVA-Molekül gemäß der Erfindung umfasst. In einer bevor zugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Expressionsvektor einer, wo eine Nukleotidsequenz, die für eine Signalsequenz kodiert, mit der betreffenden Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert. In einer weiteren Ausführungsform ist der Expressionsvektor einer, wo die betreffende Signalsequenz die Gerste-Alpha-Amylase-Signalsequenz ist.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine transgenische Pflanze bereitgestellt, wobei die Pflanze den Expressionsvektor gemäß der Erfindung umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist die transgenische Pflanze eine Maispflanze, eine Sojabohnenpflanze, eine Canolapflanze oder eine Sonnenblumenpflanze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer transgenischen männlich-sterilen Pflanze, umfassend in Pflanzenzellen die Einführung eines Expressionsvektors zu unternehmen, der einen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert, und das Regenerieren einer transgenischen Pflanze aus den betreffenden transformierten Zellen durchzuführen, wo der betreffende Promotor die Expression des betreffenden Gens steuert und wo die betreffende Genexpression männliche Sterilität der transgenischen Pflanze verursacht.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Anwendung eines Streptavidin-Gens zur Herstellung einer männlich-fertilen Hybridpflanze bereitgestellt, welches Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) Herstellung einer ersten männlich-sterilen Elternpflanze, die ein DNA-Molekül umfasst, das einen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert, wo die Expression dieses Streptavidins zu männlicher Sterilität führt; (b) Herstellen einer zweiten transgenischen Elternpflanze, die ein zweites Fremdgen exprimiert; und (c) Fremdbefruchten der betreffenden ersten Elternpflanze mit der betreffenden zweiten Elternpflanze, um eine Hybridpflanze herzustellen; wobei die Hybridpflanze das zweite Fremdgen exprimiert und wobei das Produkt des zweiten Fremdgens die Expression von Streptavidin in der Hybridpflanze reduziert, wodurch eine männlich-fertile Hybridpflanze produziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das zweite Fremdgen aus der Gruppe, bestehend aus einem Antisense-Gen, einem Ribozymgen und einem Gen einer externen Führungssequenz ausgewählt. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst das DNA-Molekül der ersten Elternpflanze einen LexA-Operator, der mit dem Promotor operabel verbunden ist, wobei das zweite Fremdgen das LexA-Repressor-Gen ist.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Samen, die ein gewünschtes Kornmerkmal haben, bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Herstellung einer Elternpflanze, die männlich-steril ist, und die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für Streptavidin kodiert, das mit einer Promotorsequenz operabel verbunden ist; (b) Herstellung einer zweiten Elternpflanze, die männlich-fertil ist und die ein Gen oder mehrere Gene trägt, welches/welche das gewünschte Kornmerkmal steuert/steuern; (c) Fremdbefruchtung der betreffenden ersten Elternpflanze mit der zweiten Elternpflanze, um Hybridsamen mit dem Kornmerkmal herzustellen; und (d) Ernte der Samen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist die erste Elternpflanze eine Hybridpflanze. In noch weiteren Ausführungsformen ist das Kornmerkmal aus der Gruppe ausgewählt, die Ölgehalt, Proteingehalt und Stärkegehalt umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Elternpflanze Mais, Sojabohne, Canola oder Sonnenblume.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz eine Anther-spezifische Promotorsequenz, die eine Antherbox umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1; der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:2; der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 und einem funktionellen Fragment davon besteht.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung besitzt die Antherbox die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1, wobei der Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus folgendem besteht: CaMV 35S-Kernpromotor; der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:4; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 5; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 und einem funktionellen Fragment davon.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Antherbox die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2, wobei der Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus folgendem besteht: CaMV 35S-Kernpromotor; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:4; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:5; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 und einem funktionellen Fragment davon.
In noch einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Antherbox die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:3, wobei der Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus folgendem besteht: CaMV 35S-Kernpromotor; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:4; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:5; der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 und einem funktionellen Fragment davon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Avidin-kodierende Plasmid PHI5168, in dem ein Mais-Ubiquitin-Promotor (einschließlich seines ersten Exons plus ersten Introns) die Expression einer Gerste-Alpha-Amylase-Exportsignalsequenz und einer für Avidin kodierenden Region steuert.
2 zeigt das Plasmid PHI610, das für das bar-Gen kodiert.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
1. Definitionen
In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Ausdrücken ausgiebig verwendet. Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung angeführt.
Ein Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wird, welche dann in einer Aminosäuresequenz translatiert wird, die für ein spezifisches Polypeptid charakteristisch ist.
Ein Fremdgen bezieht sich in der vorliegenden Beschreibung auf eine DNA-Sequenz, die funktionell mit wenigstens einem heterologen regulatorischen Element verknüpft ist. Beispielsweise wird ein beliebiges anderes Gen als das Mais-5126-Strukturgen als Fremdgen angesehen, wenn die Expression jenes Gens durch ein Anther-spezifisches regulatorisches Element des 5126-Gens kontrolliert wird.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Gens, z. B. eines Strukturgens, eines Antisense-Gens, eine Ribozymgens oder eines Gens für eine äußere Führungssequenz, steuert. Typischerweise ist ein Promotor in der 5'-Region eines Gens proximal zur Transskriptionsstartstelle lokalisiert. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann nimmt die Transkriptionsrate als Antwort auf ein induzierendes Mittel zu. Im Gegensatz dazu wird die Transkriptionsrate durch ein induzierendes Mittel nicht reguliert, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist. Ein Pflanzenpromotor ist eine Promotorsequenz, welche die Transkription eines Gens in Pflanzengewebe steuern wird.
Ein Kernpromotor enthält essentielle Nukleotidsequenzen für die Promotorfunktion, einschließlich der TATA-Box und einem Transkriptionsstart. Durch diese Definition kann ein Kernpromotor in Abwesenheit spezifischer Sequenzen, die die Aktivität verstärken können oder gewebespezifische Aktivität verleihen können, detektierbare Aktivität haben oder nicht haben. Beispielsweise besteht der SGB6-Kernpromotor aus etwa 38 Nukleotiden 5'-wärts der Transkriptionsstartstelle des SGB6-Gens, während der Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S-Kernpromotor aus etwa 33 Nukleotiden 5'-wärts der Transkriptionsstartstelle des 35S-Genoms besteht.
Ein gewebe-spezifischer Promotor ist eine DNA-Sequenz, die, wenn sie funktionell mit einem Gen verknüpft ist, einen höheren Level der Transkription von jenem Gen in einem spezifischen Gewebe steuert als in einigen oder allen anderen Geweben in einem Organismus. Beispielsweise ist ein Anther-spezifischer Promotor eine DNA-Sequenz, die einen höheren der Transkription eines assoziierten Gens in Pflanzen-Anther-Gewebe steuert. Der SGB6-Anther- spezifische Promotor z. B. kann die Expression eines Fremdgens in Anther-Gewebe, nicht aber in Wurzelgewebe oder Koleoptile-Gewebe steuern.
Der Ausdruck ein „Anther-spezifischer Promotor", wie er hierin verwendet wird, umfasst zwei funktionelle Elemente: eine „Anther-Box" und einen Kernpromotor. Eine bestimmte Anther-Box kann die funktionellen Charakteristika eines klassischen Enhancers bzw. Verstärkers besitzen. Die Kombination einer Anther-Box und eines Kernpromotors kann eine Genexpression zu einem höheren Grad stimulieren als ein Kernpromotor allein. Dies gilt sogar im Fall eines chimären Anther-spezifischen Promotors, der eine Anther-Box und einen Kernpromotor, der von unterschiedlichen Genen abgeleitet ist, enthält. Solche Chimären Anther-spezifischen regulatorischen Elemente werden unten beschrieben.
Ein Operator ist eine DNA-Sequenz, die 5'-wärts eines Gens lokalisiert ist und die eine Nukleotidsequenz enthält, die durch ein Repressorprotein erkannt und gebunden wird. Die Bindung eines Repressorproteins mit seinem verwandten Operator resultiert in der Inhibierung der Transkription des Gens. Beispielsweise kodiert ein LexA-Gen für ein Repressorprotein, das an den LexA-Operator bindet.
Ein isoliertes DNA-Molekül ist ein DNA-Fragment, das aus der DNA eines Organismus abgetrennt wurde. Beispielsweise ist ein kloniertes DNA-Molekül, das ein Avidin-Gen kodiert, ein isoliertes DNA-Molekül. Ein anderes Beispiel für ein isoliertes DNA-Molekül ist ein chemisch synthetisiertes DNA-Molekül oder eine enzymatisch produzierte cDNA, die nicht in die genomische DNA eines Organismus integriert ist.
Ein Enhancer ist ein DNA-regulatorisches Element, das die Effizienz der Transkription erhöhen kann.
Komplementäre DNA (cDNA) ist ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das aus einer mRNA-Matrize durch das Enzym reverse Transkriptase gebildet wird. Typischerweise wird ein Primer, der zu Teilen von mRNA komplementär ist, für die Initiierung der reversen Transkription verwendet. Der Fachmann auf diesem Gebiet verwendet den Ausdruck „cDNA" auch, um ein doppelsträngiges DNA-Molekül zu bezeichnen, das aus einem solchen einzelsträngigen DNA-Molekül und seinem komplementären DNA-Strang besteht.
Der Ausdruck Expression bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts. Im Fall eines Strukturgens z. B. involviert Expression die Transkription des Strukturgens zu mRNA und die Translation von mRNA in ein Polypeptid oder mehrere Polypeptide.
Ein Klonierunsvektor ist ein DNA-Molekül, z. B. ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das die Fähigkeit hat, autonom in einer Wirtszelle zu replizieren. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erken nungsstellen, an denen fremde DNA-Sequenz in bestimmbarer Art ohne Verlust einer essentiellen biologischen Funktion des Vektors insertiert werden können, wie auch ein Markergen, das zur Verwendung bei der Identifizierung und Selektion von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert wurden, geeignet ist. Markergene enthalten typischerweise Gene, die Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz bereitstellen.
Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, das in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise wird eine Genexpression unter die Kontrolle von bestimmten regulatorischen Elementen, einschließlich konstitutiver oder induzierbarer Promotoren, gewebe-spezifischer regulatorischer Elemente und Enhancer, gestellt. Ein solches Gen wird als „funktionell verknüpft mit" bzw. „operabel verbunden mit" den regulatorischen Elementen bezeichnet.
Ein rekombinanter Wirt kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Ausdruck umfasst auch solche prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die genetisch so manipuliert wurden, dass sie das klonierte Gen (die klonierten Gene) im Chromosom oder Genom der Wirtszelle enthalten.
Eine transgenische Pflanze ist eine Pflanze, die eine Pflanzenzelle oder mehrere Pflanzenzellen hat, die ein Fremdgen enthalten.
In Eukaryoten katalysiert RNA-Polymerase II die Transkription eines Strukturgens unter Produktion von mRNA. Es kann ein DNA-Molekül so entwickelt werden, dass es eine RNA-Polymerase II-Matrize enthält, in der das RNA-Transkript eine Sequenz hat, die komplementär zu der einer spezifischen mRNA ist. Das RNA-Transkript wird als Antisense-RNA bezeichnet und eine DNA-Sequenz, die für die Antisense-RNA kodiert, wird als Antisense-Gen bezeichnet. Antisense-RNA-Moleküle sind fähig, an mRNA-Moleküle zu binden, was in einer Inhibierung der mRNA-Translation resultiert.
Ein Ribozym ist ein RNA-Molekül, das ein katalytisches Zentrum enthält. Der Ausdruck beinhaltet RNA-Enzyme, selbst-spleißende RNAs und selbstspaltende RNAs. Eine DNA-Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, wird als Ribozym-Gen bezeichnet.
Eine externe Führungssequenz ist ein RNA-Molekül, das ein endogenes Ribozym, RNase P, zu einer bestimmten Spezies an intrazellulärer mRNA lenkt, was in einer Spaltung der mRNA durch RNase P resultiert. Eine DNA-Sequenz, die für eine äußere Guide-Sequenz bzw. Führungssequenz kodiert, wird als externes Guide-Sequenz-Gen bezeichnet.
Ein Korn- oder Samenmerkmal ist ein Ernährungs- oder physiologisches Charakteristikum des Samens, das vorzugsweise durch ein dominantes Gen kontrolliert wird, welches den indus triellen Typ signifikant beeinflusst. Die Korn- oder Samenmerkmale umfassen solche Charakteristika wie Öl, Protein- und Stärkegehalt wie auch Proteinqualität und Stärketyp.
E ine Einfachkreuzung ist eine Kreuzung zwischen zwei Inzuchtlinien.
Eine Doppelkreuzung ist eine Kreuzung zwischen zwei Monohybriden.
Eine Dreifachkreuzung ist die Nachkommenschaft einer Kreuzung zwischen einer Einfachkreuzung und einer Inzuchtlinie.
Eine Hybride ist die Nachkommenschaft der ersten Generation aus einer Kreuzung zwischen zwei Individuen, die sich in einem Gen oder mehreren Genen unterscheiden.
Eine Inzuchtlinie ist eine reine Linie, die üblicherweise durch Selbstbefruchtung und Selektion entstanden ist.
Eine synthetische Linie ist ein Gemisch von Stämmen, Klonen, Inzuchtprodukten oder Hybriden untereinander, die durch freie Bestäubung für eine spezifizierte Zahl von Generationen aufrechterhalten wird. Die Komponenteneinheiten werden vermehrt und die synthetischen in regelmäßigen Intervallen rekonstituiert.
Spezifische Kombinationsfähigkeit ist die Leistungsfähigkeit spezifischer Kombinationen genetischer Stämme bei Kreuzungen im Vergleich zur durchschnittlichen Leistungsfähigkeit aller Kombinationen.
Eine Bestäuberpflanze ist der männlich-fertile Elter, der Pollen an den männlich-sterilen, weiblichen Elter abgibt. Eine Bestäuberpflanze kann einen von vielen verschiedenen genetischen Hintergründen haben und kann daher eine Inzuchtlinie, eine Hybride, eine synthetische, offen bestäubte Linie oder ein genetischer Stamm sein. Eine Bestäuberpflanze kann eine transgenische Linie sein. Eine Bestäuberpflanze kann ein Samen- oder Kornmerkmal von Interesse oder mehrere Samen- oder Kornmerkmale von Interesse tragen.
2. Übersicht
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Erzeugung männlich-steriler Pflanzen durch Herstellung von transgenischen Pflanen, die Streptavidin exprimieren, bereit. Das Streptavidin kann konstitutiv in einer nicht-gewebe-spezifischen Weise exprimiert werden oder kann in einer Anther-spezifischen Weise exprimiert werden. Verfahren zur Wiederherstellung männlicher Fertilität werden ebenfalls bereitgestellt.
Bereitgestellt wird auch ein Verfahren zur Herstellung von Hybridsamen mit einem oder mehreren Korn- oder Samenmerkmalen von Interesse. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird eine erste Hybride, die männlich-steril ist und eine oder mehrere Kopien des Streptavidin-Gens trägt, als weiblicher Elter mit einer zweiten Hybride, die männlich-fertil ist und ein oder mehrere Korn- oder Samenmerkmale von Interesse trägt, gekreuzt. Hybridsamen werden mit einem oder mehreren Korn- oder Samenmerkmalen des männlichen Elters produziert.
Ein Streptavidin-Gen wird isoliert und in einen Expressionsvektor insertiert, der zur Einführung in Pflanzengewebe geeignet ist. Der Expressionsvektor umfasst außerdem einen Promotor, der ein konstitutiver Promotor, ein nicht-gewebe-spezifischer Promotor, z. B. der Ubiquitin-Promotor, ein gewebe-spezifischer Promotor, z. B. ein Anther-spezifischer Promotor, oder ein induzierbarer Promotor sein kann. Der Expressionsvektor kann eine Exportsignalsequenz umfassen. Eine Expression eines Genprodukts auf hohem Level, welches sich dann in Cytoplasma ansammelt, kann zu Toxizität für die Pflanzenzelle führen. Eine Entfernung des Genproduktes aus dem Cytoplasma kann somit in einer reduzierten Zelltoxizität resultieren. Pflanzengene und ihre Exportsignalsequenzen sind bekannt. Siehe Jones und Robinson, Tansley Review 17: 567–597 (1989). Der Expressionsvektor wird durch Standardverfahren in Pflanzengewebe eingeführt und transgenische Pflanzen werden selektiert und vermehrt. Die transgenischen Pflanzen, die Streptavidin exprimieren, sind männlich-steril. Männliche Fertilität kann durch Coexpression eines zweiten Gens, das die Transkription des Streptavidin-Gens inhibiert oder die Translation von Streptavidin-mRNA inhibiert, in transgenischen Pflanzen wieder hergestellt werden. Nach dieser Ausführungsform wird eine temporäre Suppression des Avidin-Gens erreicht, wenn das Suppressorgen funktionell mit einem induzierbaren Promotor verknüpft ist. Alternativ kann männliche Fertilität wieder hergestellt werden, indem sich entwickelnde Pflanzen mit Biotinlösungen besprüht werden.
3. Isolierung von DNA-Molekülen, die für Avidin kodieren
Nukleotidsequenzen, die für Avidin kodieren, können nach bekannten Verfahren isoliert werden. Beispielsweise ist die Nukleotidsequenz des Streptavidin-Gens bekannt. Argarana et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 1871–1882 (1986). Alternativ kann eine cDNA, die für Hühnereiweiß Avidin kodiert, aus einer Hühnerovidukt-cDNA-Bibliothek nach Verfahren, die bei Gope et al., Nucleic Acid Res., 15: 3595 (1987) beschrieben werden, isoliert werden.
Genomische Klone des Avidin-Gens können aus genomischer DNA von Organismen erhalten werden, von denen bekannt ist, dass sie Avidin produzieren. Beispielsweise kann ein Hühner-Avidin-Gen aus genomischer Hühner-DNA nach Verfahren geklont werden, die in Keinanen et al., Eur. J. Biochem. 220: 615 (1994) beschrieben sind.
Avidin-Gene können auch unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert werden, wobei Standardverfahren angewendet werden. Siehe Erlich, PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (Stockton Press, NY, 1989) und Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Academic Press, San Diego, 1990). Verfahren zur PCR-Amplifikation von langen Nukleotidsequenzen, z. B. das ELONGASE^TM-System (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) können auch zum Erhalt längerer Nukleotidsequenzen, z. B. genomischer Klone, die für Avidin kodieren, eingesetzt werden. PCR-Primer, die zu den 5'- und 3'-Termini bekannter Avidin-Gen-Sequenzen komplementär sind, können unter Verwendung kommerzieller Oligonukleotidsynthesizer, z. B. die, die von Applied Biosystems (Foster City, CA) geliefert werden, synthetisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Primer zusätzliche Nukleotidsequenzen, die Restriktionsendonuclease-Spaltungsstellen enthalten. Das Vorlegen von solchen Stellen sorgt für das gesteuerte Kloning von PCR-Produkten in geeignete Klonierungsvektoren nach Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym. Siehe Finney, „Molecular Cloning of PCR Products" in CURRENT PROTOCOLS In MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., Herausg. (John Wiley & Sons, New York, 1987) S. 15.7.1.
Matrizen-DNA für die PCR kann entweder cDNA oder genomische DNA sein und kann aus einem geeigneten Organismus unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). Genomische DNA kann direkt aus Vogel-, Reptilien- oder Amphibiengewebe hergestellt werden, wobei handelsübliche Reagenzien, z. B. Triazol^TM (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) verwendet werden. Alternativ kann cDNA, die für Avidin kodiert, unter Verwendung von mRNA, die aus Hühneroviduktgewebe extrahiert wurde, unter Verwendung eines im Handel verfügbaren Kits (Pharmacia, Piscataway, NJ) hergestellt werden. Die mRNA-Präparation wird als Matrize zur cDNA-Synthese unter Verwendung von poly(dT) oder statistischen Hexamer-Primern durch Standardtechniken verwendet. Siehe Sambrook et al., supra. cdNA-Synthese wird unter Verwendung eines im Handel verfügbaren Kits (Pharmacia) durchgeführt und die cDNA wird direkt zu PCR eingesetzt, wobei das Verfahren von Saiki et al., Science 239: 487 (1988) verwendet wird.
Genomische DNA- oder cDNA-Fragmente, die durch die oben beschriebenen Verfahren isoliert wurden, können in einen Vektor, z. B. einen Bakteriophagen- oder Cosmidvektor, nach herkömmlichen Techniken, z. B. die Verwendung einer Restriktionsenzymverdauung, um geeignete Termini bereitzustellen, die Verwendung einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um eine unerwünschte Verknüpfung von DNA-Molekülen zu vermeiden, und Ligation mit geeigneten Ligasen, insertiert werden. Techniken zur Manipulation von solchen Vektoren werden bei Ausubel et al. (Herausg.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Seiten 3.0.5–3.17.5 (1990) („Ausubel") offenbart.
Alternativ können Nukleotidsequenzen, die für Avidin kodieren, erhalten werden, indem DNA-Moleküle, die Avidin kodieren, unter Verwendung eines wechselseitigen Primings langer Oligonukleotide erhalten werden. Siehe z. B. Ausubel auf den Seiten 8.2.8 bis 8.2.13. Siehe auch Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987). Gängige Techniken unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion stellen die Fähigkeit, Gene mit einer Länge, die so groß wie 1,8 Kilobasen ist, bereit. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993). Die Nukleotidsequenz eines synthetisierten Avidin-Gens kann auf einem beliebigen bekannten Avidin kodierenden DNA-Molekül basieren. Siehe z. B. Gope et al, supra.
Diese Klone können unter Verwendung einer Vielzahl von Standardtechniken, z. B. Restriktionsanalyse, Southern-Analyse, Primerverlängerungsanalyse und DNA-Sequenzanalyse, analysiert werden. Eine Primerverlängerungsanalyse oder S1-Nuklease-Schutzanalyse kann z. B. verwendet werden, um die vermeintliche Startstelle der Transkription des klonierten Gens zu lokalisieren. Ausubel auf den Seiten 4.8.1–4.8.5; Walmsley et al., „Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the S 1 Nuclease Protection Assay", in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Bd. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (Herausg.), Seiten 271–281 (Humana Press Inc. 1991). Diese und verwandte Techniken, die einem Fachmann auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, werden zur Isolierung von anderen Genen von Interesse und für ihre Klonierung und Expression verwendet.
4. Klonierung eines Avidin-Gens in einen Expressionsvektor und Herstellung von transgenischen Pflanzeng
Sobald ein Avidin-Gen isoliert wurde, wird es durch Standardverfahren in einen Expressionsvektor platziert. Siehe Sambrook et al., supra. Die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors wird von dem Verfahren der Einführung des Expressionsvektors in Wirtszellen abhängen. Typischerweise enthält ein Expressionsvektor: (1) prokaryotische DNA-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsursprung kodieren, und ein Antibiotikum-Resistenzgen, um für das Wachstum und die Selektion des Expressionsvektors in dem bakteriellen Wirt zu sorgen; (2) eine Klonierungsstelle zur Insertion einer exogenen DNA-Sequenz, z. B. ein Avidin-Gen; (3) eukaryotische DNA-Elemente, die die Transkriptionsinitiation des exogenen Gens kontrollieren, z. B. ein Promotor; (4) DNA-Elemente, die die Prozessierung von Transkripten kontrollieren, z. B. eine Transkriptionsterminierungs-/Polyadenylierungssequenz, und (5) ein Gen, das für ein Markerprotein kodiert (z. B. ein Reportergen), in dem das Gen funktionell mit den DNA-Elementen verknüpft ist, welche die Transkriptionsinitiierung kontrollieren. Zusätzlich kann der Expressionsvektor eine DNA-Sequenz, die für eine Exportsignalsequenz kodiert, funktionell mit der exogenen DNA-Sequenz verknüpft, umfassen. Allgemeine Beschreibungen von Pflanzenexpressi onsvektoren und Reportergenen können in Gruber et al., „Vectors for Plant Transformation", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (Herausg.), Seiten 89–119 (CRC Press, 1993) gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Pflanzen-Ubiquitinpromotorsystem verwendet. Pflanzen-Ubiquitinpromotoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z. B. europäische Patentanmeldung 0 342 926. Der Ubiquitinpromotor ist ein konstitutiver Promotor.
Es wird ein induzierbarer Promotor verwendet, um eine induzierbare Regulation der Avidinexpression zu ermöglichen. Ein Beispiel für einen derartigen induzierbaren Promotor ist das Glutathion-S-Transferase-System in Mais. Siehe Wiegand et al., Plant Mol. Biol. 7: 235 (1986). Dieses Verfahren sorgt für eine reversible Induktion von männlicher Sterilität. Somit kann eine Expression von Avidin und gleichzeitige männliche Sterilität nach Wunsch durch Aktivierung des Promotors kontrolliert werden. Wenn der Promotor nicht aktiviert wird, wird Avidin nicht exprimiert und die Pflanzen sind männlich-fertil.
Die Expression kann einen selektierbaren oder durchmusterbaren Marker umfassen. Viele der gängig verwendeten positiven selektierbaren Markergene zur Pflanzentransformation wurden aus Bakterien isoliert und kodieren für Enzyme, die ein selektives chemisches Mittel, das ein Antibiotikum oder ein Herbizid sein kann, metabolisch entgiften. Andere positive selektive Markergene kodieren für ein verändertes Ziel, das gegenüber dem Inhibitor unempfindlich ist.
Ein üblicherweise verwendetes selektierbares Markergen zur Pflanzentransformation ist das Neomycin-Phosphotransferase II: (nptII)-Gen, isoliert aus Tn5, welches, wenn es unter die Kontrolle von pflanzenregulatorischen Signalen gestellt wird, Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983). Ein anderer üblicherweise verwendeter selektierbarer Marker ist das Hygromycin-Phosphotransferase-Gen, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin verleiht. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985). Zusätzliche positive selektierbare Markergene bakteriellen Ursprungs, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen, umfassen Gentamycin-Acetyltransferase, Streptomycin-Phosphotransferase, Aminoglycosid-3'-Adenyltransferase und die Bleomycinresistenzdeterminante. Hyford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86: (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986).
Andere positive selektierbare Markergene zur Pflanzentransformation sind nicht-bakteriellen Ursprungs. Diese Gene umfassen Maus-Dihydrofolat-Reduktase, Pflanzen-5-Enol-pyruvylshikimate-3-Phosphatsynthase und Pflanzenacetolactatsynthase. Eichholz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Sha et al., Science 233: 478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).
Andere übliche selektierbare Markergene für Pflanzen verleihen Resistenz gegenüber Herbizid-Inhibitoren von Glutaminsynthetase. Europäische Patentanmeldung Nr. 0 333 033 von Kumada et al. und US-Patent Nr. 4 975 374 von Goodman et al. offenbaren Nukleotidsequenzen von Glutaminsynthetase-Genen, die Resistenz gegenüber Herbiziden, z. B. L-Phosphinotricin, verleihen. Die Nukleotidsequenz eines Phosphinothricin-Acetyltransferase-Gens ist in der europäischen Anmeldung Nr. 0 242 246 von Leemans et al. bereitgestellt. De Greef et al., Bio/Technology 7: 61 (1989) beschreibt die Produktion von transgenischen Pflanzen, die chimäre bar-Gene exprimieren, welche für Phosphinotricin-Acetyltransferase-Aktivität kodieren.
Eine weitere Klasse von Markergenen zur Pflanzentransformation erfordert ein Screening von vermutlich transformierten Pflanzenzellen anstelle einer direkten genetischen Selektion von transformierten Zellen auf Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz, z. B. einem Antibiotikum. Diese Gene sind besonders nützlich, um das räumliche Expressionsmuster eines Gens in spezifischen Geweben zu quantifizieren oder sichtbar zu machen, und werden häufig als Reportergene bezeichnet, da sie an ein Gen oder an Genregulatorsequenz zur Erforschung der Genexpression fusioniert werden können.
Üblicherweise verwendete Gene zum Screening vermutlich transformierter Zellen umfassen β-Glucuronidase (GUS), β-Galactosidase, Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989); Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 131 (1987); De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984). Ein anderer Ansatz für die Identifizierung von relativ seltenen Transformationsereignissen stellt die Verwendung eines Gens dar, das für einen dominanten konstitutiven Regulator des Zea-mays-Anthocyanin-Pigmentierungswegs kodiert. Ludwig et al., Science 247: 449 (1990).
Die Expressionsvektoren können das Avidin-Gen funktionell mit einer DNA-Sequenz verknüpft umfassen, welche für eine Peptidexportsignalsequenz kodiert. Siehe Hones and Robinson, supra. Der Vektor ist so hergestellt, dass eine Signalsequenz an den N-Terminus einer reifen Avidin-Proteinsequenz fusioniert ist, was für eine normale zelluläre Prozessierung unter genauer Spaltung des Proteinmoleküls sorgt und zu reifem aktivem Avidin führt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Signalsequenz die Gerste-Alpha-Amylase-Signalsequenz. Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731–3738 (1985).
Expressionsvektoren, die ein Avidin-Gen enthalten, können in Protoplasten oder in intakte Gewebe, z. B. unreife Embryos und Meristem, oder in Callus-Kulturen oder in isolierte Zellen eingeführt werden. Vorzugsweise werden Expressionsvektoren in intakte Gewebe eingeführt. Es werden allgemeine Verfahren zum Kultivieren von Pflanzengewebe bereitgestellt, z. B. von Miki et al., „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al. (Herausg.), Seiten 67–88 (CRC Press, 1993), und von Phillips et al., „Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation", in CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3. Ausgabe, Sprague et al. (Herausg.), Seiten 345–387 (American Society of Agronomy, Inc. et al., 1988).
Verfahren zur Einführung von Expressionsvektoren in Pflanzengewebe umfassen die direkte Infektion oder Co-Kultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobacterium tumefaciens. Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). Vorzugsweise wird ein „entwaffnetes" Ti-Plasmid als Vektor für Fremd-DNA-Sequenzen verwendet. Eine Transformation kann unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die z. 13. in der europäischen Patentanmeldung Nr. 116 718 (1984) und 270 822 (1988) beschrieben sind. Bevorzugte Ti-Plasmidvektoren enthalten die Fremd-DNA-Sequenz zwischen den Bordersequenzen oder wenigstens stromaufwärts der rechten Bordersequenz lokalisiert.
Andere Vektortypen können zum Transformieren von Pflanzenzellen unter Verwendung von Verfahren, z. B. direkter Gentransfer (siehe z. B. PCT-Anmeldung WO 85/01856 und europäische Patentanmeldung 275 069), In-vitro-Protoplastentransformation (siehe z. B. US-Patent Nr. 4 684 611), pflanzenvirus-vermittelte Transformation (siehe z. B. europäische Patentanmeldung Nr. 067 553 und US-Patent Nr. 4 407 956) und liposomen-vermittelte Transformation (z. B. US-Patent Nr. 4 536 475), eingesetzt werden. Geeignete Verfahren zur Mais- bzw. Korntransformation werden von Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990) und von Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990) beqreitgestellt. Standardverfahren zur Transformation von Reis werden von Christou et al., Trends in Biotechnology 10, 239 (1992) und von Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991) beschrieben. Weizen kann unter Verwendung von Verfahren, die ähnlich den Techniken zum Transformieren von Mais oder Reis sind, transformiert werden. Darüber hinaus beschreiben Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993) ein Verfahren zur Transformation von Sorghum, während Wan et al., Plant Physiol. 104: 37 (1994) ein Verfahren zur Transformation von Gerste beschreiben.
Im Allgemeinen sind direkte Transferverfahren für die Transformation einer monocothylen Pflanze, insbesondere eines Getreides wie Reis, Mais, Sorghum, Gerste oder Weizen, bevorzugt. Geeignete direkte Transferverfahren umfassen mikroprojektil-vermittelte Abgabe, DNA-Injektion, Elektroporation und dergleichen. Siehe z. B. Gruber et al., supra, Miki et al., supra und Klein et al., Bio/Technology 10: 268 (1992). Bevorzugter werden Expressionsvektoren in Gewe be einer monocotylen Pflanze eingeführt, wobei eine mikroprojektil-vermittelte Abgabe mit einer Biolistik-Vorrichtung verwendet wird.
5. Regulierung der männlichen Fertilität
A. Produktion von männlich-sterilen Pflanzen
Um männliche Sterilität zu induzieren, wird ein Expressionsvektor konstruiert, in dem eine DNA-Sequenz, die für Avidin kodiert, funktionell mit DNA-Sequenzen verknüpft ist, die eine Gentranskription in Pflanzengewebe regulieren. Die allgemeinen Anforderungen an einen Expressionsvektor sind oben beschrieben. Um männliche Sterilität durch Expression von Avidin zu erreichen, ist es bevorzugt, dass Avidin nicht nur in transienter Weise exprimiert wird, dass aber der Expressionvektor in Pflanzenembryogewebe derart eingeführt wird, dass Avidin in einer späteren Entwicklungsstufe in der erwachsenen Pflanze exprimiert wird. Beispielsweise kann methodische Stabilität erreicht werden, indem Pflanzenvirusvektor verwendet werden, die epichromosomale Replikation bereitstellen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erreichung methodischer Stabilität wird durch die Integration von Expressionsvektorsequenzen in das Wirtschromosom bereitgestellt. Solche methodische Stabilität kann durch die Mikroprojektilabgabe eines Expressionsvektors an Pflanzengewebe oder unter Verwendung anderer Standardverfahren, wie sie oben beschrieben sind, bereitgestellt werden. Siehe z. B. Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990), Grodon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990) und Walters et al., Plant Molec. Biol. 18: 189 (1992).
Eine Transkription des Avidin-Gens nach Einführung in Pflanzengewebe wird vorzugsweise durch einen konstitutiven Promotor kontrolliert, der die Genexpression in Pflanzengewebe nicht spezifisch stimuliert. Ein Beispiel für einen konstitutiven Promotor, der für diesen Zweck geeignet ist, ist der Ubiquitinpromotor, wie er oben beschrieben ist.
Eine Transkription des Avidin-Gens kann auch durch einen Promotor kontrolliert werden, der die Genexpression in gewebespezifischer Weise stimuliert. Ein besonders bevorzugter Anther-spezifischer Promotor ist der 5126-Promotor, der aus der Mais-Inzucht-Linie B73 isoliert wurde. Der 5126-Promotor stimuliert die Expression eines Fremdgens in Antheren vom Vier-Pollenkörner-Stadium bis frühen uninukleären Mikrosporen-Stadium (from quartet to early uniculeate microspore-stage anthers).
Ein anderer geeigneter Anther-spezifischer Promotor ist der SGB6-Promotor, der auch aus der B73-Linie isoliert wurde. Der SGB6-Promotor kann die Expression eines Fremdgens in Anther-Tapetalzellen in der Mikrosporenentwicklung von der Viererstufe bis zur mittleren Einnukleären Stufe induzieren.
Alternativ kann eine Anther-spezifische Genexpression unter Verwendung einer Kombination aus einer Antherbox und einem Kernpromotor bereitgestellt werden. Eine besonders bevorzugte Antherbox ist eine 5126-Antherbox, die die folgende Nukleotidsequenz umfasst:
Eine weitere geeignete Antherbox basiert auf einem DNA-Fragment mit 94 Basenpaaren, das durch die Nukleotide 583 bis 490 stromaufwärts der SGB6-Startstelle der Transkription definiert wird. Die Nukleotidsequenz der SGB6-Antherbox mit 94 Basenpaaren ist wie folgt:
Alternativ wird eine geeignete Antherbox aus dem Mais-G9-Promotor erhalten, welche die Genexpression während der Entwicklung von der meiotischen Stufe zur Quartettstufe stimuliert. Die G9-Antherbox umfasst die folgende Nukleotidsequenz:
Die 5126-, SGB6- und G9-Antherboxen können durch Synthese von Oligonukleotiden, wie oben beschrieben, erhalten werden. Dem Fachmann wird klar sein, dass eine Deletionsanalyse durchgeführt werden kann, um eine oder mehrere zusätzliche Anther-spezifische regulatorische Sequenzen innerhalb der offenbarten Antherboxen zu lokalisieren. Solche „funktionellen Fragmente" der Antherboxen können auch. verwendet werden, um die Avidin-Genexpression in einer Anther-spezifischen Weise zu regulieren.
Bevorzugte Kernpromotoren werden von dem 5126-Kernpromotor, dem SGB6-Kernpromotor, dem G9-Kernpromotor und dem Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Kernpromotor abgeleitet.
Ein besonders bevorzugter Kernpromotor ist der 5126-Kernpromotor, der die folgende Nukleotidsequenz umfasst:
Der SGB6-Kernpromotor besteht aus etwa 38 Nukleotiden stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle des SGB6-Gens. Ein geeigneter SGB6-Kernpromotor hat die folgende Nukleotidsequenz:
Ein geeigneter Kernpromotor, der von dem G9-Gen abgeleitet ist, umfasst die Nukleotidsequenz:
Geeignete Kernpromotoren werden auch durch funktionelle Fragmente der 5126-, SGB6- und G9-Kernpromotoren bereitgestellt. Verfahren zum Erhalt solcher funktionellen Fragmente sind oben beschrieben.
Das Entwicklungsfenster der Avidin-Genexpression kann erweitert werden, indem ein chimäres regulatorisches Element verwendet wird, das eine Antherbox aus einem Gen und einem Anther-spezifischen Promotor aus einem zweiten Gen umfasst. Beispielsweise stimulieren SGB6-regulatorische Sequenzen die Genexpression aus der Quartett-Entwicklungsstufe zu der mittleren uninukleären Stufe, während G9-regulatorische Sequenzen eine Genexpression während der Meiose und während der Quartettstufe der Entwicklung stimulieren. Die Kombination einer SGB6-Antherbox und eines G9-Promotors stimuliert die Transkription eines Fremdgens während der Meiose und durch das „mid-uninucleate" Stadium der Entwicklung. Somit sind verschiedene Kombinationen von Antherboxen und Anther-spezifischen Promotoren für die vorliegende Erfindung besonders nützlich.
Es kann auch ein viraler Kernpromotor eingesetzt werden. Beispiele für geeignete virale Kernpromotoren umfassen einen Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV)-Kernpromotor, einen Fig wort-Mosaikvirus-Kernpromotor und dergleichen. Gruber et al., supra. Vorzugsweise ist der virale Kernpromotor der CaMV 35S-Kernpromotor oder eine Variante davon.
Um transformierte Zellen zu selektieren, enthält der Expressionsvektor ein selektierbares Markergen, z. B. ein Herbizid-Resistenzgen. Beispielsweise können solche Gene Resistenz gegenüber Phosphinothricin, Glyphosat, Sulfonylharnstoffen, Atrazin oder Imidazolinon verleihen. Vorzugsweise ist das selektierbare Markergen das bar-Gen oder pat-Gen, das für Phosphinothricinacetyltransferase kodiert. Die Nukleotidsequenzen der bar-Gene können bei Leemans et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0 242 246 (1987) und bei White et al., Nucleic Acid Res. 18: 1062 (1990) gefunden werden. Wohlleben et al., Gene 70: 25 (1988) offenbart die Nukleotidsequenz des pat-Gens. Bar- oder pat-Genexpression verleiht Resistenz gegenüber Herbiziden, z. B. Glufosinat (verkauft u. a. als Basta^® und Ignite^®) und Bialaphos (verkauft als Herbi-ace^® und Liberty^®).
Der Expressionsvektor kann DNA-Sequenzen, die für Avidin kodieren, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder eines Anther-spezifischen Promotors wie auch das selektierbare Markergen unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors enthalten. Alternativ kann das selektierbare Markergen in einem getrennten Selektionsexpressionsvektor durch „Co-Transformation" von Embryogewebe an Wirtszellen abgegeben werden.
B. Wiederherstellung von männlicher Fertilität in der F1-Hybride
Die oben beschriebenen Verfahren können eingesetzt werden, um transgenische männlich-sterile Pflanzen für die Produktion von F1-Hybriden in gesteuerten Kreuzungen im großen Maßstab zwischen Inzuchtlinien herzustellen. Wenn keine Eizellen der transgenischen männlich-sterilen Pflanzen das rekombinante Avidingen enthalten, dann wird ein Teil von F1-Hybriden einen männlich-fertilen Phänotyp haben. Andererseits werden F1-Hybride einen männlich-sterilen Phänotyp haben, wenn das rekombinante Avidin-Gen in allen Eizellen der transgenischen männlich-sterilen Pflanzen vorliegt. Somit könnte es wünschenswert sein, ein Wiederherstellungssystem für männliche Fertilität zu verwenden, um für die Produktion von männlich-fertilen F1-Hybriden zu sorgen. Ein derartiges Fertilitätswiederherstellungssystem ist bei autogamen Spezies von besonderem Wert, wenn das geerntete Produkt Samen ist.
Der allgemein vorgeschlagene Ansatz zur Wiederherstellung von Fertilität in einer Linie transgenischer männlich-steriler Pflanzen erfordert die Produktion einer zweiten „Restorer"-Linie von transgenischen Pflanzen. Beispielsweise würde eine transgenische Pflanze, die infolge einer Barnase-Expression männlich-steril ist, mit einer männlich-fertilen Pflanze, die den Barnase-Inhibitor exprimiert, wie oben diskutiert, gekreuzt werden. Mariani et al., Nature 357: 384 (1992).
Im vorliegenden Fall würde ein analoger Ansatz die Produktion einer Restorer-Linie von transgenischen Pflanzen erfordern, die Ribozyme exprimieren, welche auf Avidin-mRNA targetiert sind oder die Antisense-Avidin exprimieren. Beispielsweise können Ribozyme so entwickelt werden, dass sie Endonuklease-Aktivität exprimieren, die auf eine bestimmte Zielsequenz in einem mRNA-Molekül gerichtet ist. Beispielsweise erreichten Steinecke et al., EMBO J 11: 1525 (1992) bis zu 100% Inhibierung der Neomycinphosphotransferase-Genexpression durch Ribozyme in Tabakprotoplasten. In jüngerer Zeit inhibierten Perriman et al., Antisense Res. & Devel. 3: 253 (1993) Chloramphenicolacetyltransferase-Aktivität in Tabakprotoplasten unter Verwendung eines Vektors, der ein modifiziertes Hammerhead-Ribozym exprimiert. Im Kontext der vorliegenden Erfindung stellt Avidin-mRNA das geeignete Target-RNA-Molekül für Ribozyme bereit.
In einem ähnlichen Ansatz kann Fertilität durch Verwendung eines Expressionsvektors wiederhergestellt werden, der eine Nukleotidsequenz enthält, welche für eine Antisense-RNA kodiert. Die Bindung von Antisense-RNA-Moleküle an Target-mRNA-Moleküle resultiert in einem Hybridisierungs-Anhalten der Translation. Paterson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370 (1987). Im Kontext der vorliegenden Erfindung würde ein geeignetes Antisense-RNA-Molekül eine Sequenz haben, die zu. Avidin-RNA komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Antisense-RNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Eine Aktivierung dieses Promotors erlaubt dann eine Wiederherstellung der männlichen Fertilität.
In einem weiteren alternativen Ansatz können Expressionsvektoren konstruiert werden, wobei ein Expressionsvektor für RNA-Transkripte kodiert, die fähig sind, eine RNase-P-vermittelte Spaltung von Avidin-mRNA-Molekülen zu begünstigen. Nach diesem Ansatz kann eine externe Führungssequenz zur Steuerung des endogenen Ribozyms, RNase P, zu Avidin-mRNA konstruiert werden, die anschließend durch zelluläres Ribozym gespalten wird. Altman et al., US-Patent Nr. 5 168 053; Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). Vorzugsweise umfasst die externe Führungssequenz eine zehn- bis fünfzehn-Nukleotidsequenz, die komplementär zu Avidin-mRNA ist, und eine 3'-NCCA-Nukleotidsequenz, worin N vorzugsweise ein Purin ist. Id. Die Transkripte der äußeren Führungssequenz binden an die targetierte mRNA-Spezies durch Bildung von Basenpaaren zwischen der mRNA und den komplementären äußeren Führungssequenzen, wodurch eine Spaltung von mRNA durch RNase P an dem Nukleotid, das an der 5'-Seite der basengepaarten Region lokalisiert ist, begünstigt wird. Id.
In einem alternativen Verfahren zur Wiederherstellung männlicher Fertilität enthalten transgenische männlich-sterile Pflanzen einen Expressionsvektor, der zusätzlich zu einer Promo torsequenz, die funktionell mit einem Avidin-Gen verknüpft ist, auch ein prokaryotisches regulatorisches Element enthält. Es werden transgenische männlich-fertile Pflanzen produziert, die ein prokaryotisches Polypeptid unter der Kontrolle des Promotors exprimieren. In den F1-Hybriden bindet das prokaryotische Polypeptid an die prokaryotische regulatorische Sequenz und unterdrückt die Expression von Avidin.
Beispielsweise kann das LexA-Gen/LexA-Operatorsystem verwendet werden, um eine Genexpression gemäß der vorliegenden Erfindung zu regulieren. Siehe US-Patent Nr. 4 833 080 („das '080-Patent") und Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1805 (1993). Spezifischer ausgedrückt, der Expressionsvektor der männlichsterilen Pflanze würde die LexA-Operatorsequenz enthalten, während der Expressionsvektor der männlich-fertilen Pflanze die kodierenden Sequenzen des LexA-Repressor enthalten würde. In der F1-Hybride würde der LexA-Repressor an die LexA-Operatorsequenz binden und eine Transkription des Avidin-Gens inhibieren.
LexA-Operator-DNA-Moleküle können z. B. durch Synthetisieren von DNA-Fragmenten, die die gut bekannte LexA-Operator-Sequenz enthalten, erhalten werden. Siehe z. B. das '080-Patent und Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 236: 125 (1992). Das LexA-Gen kann durch Synthetisieren eines DNA-Moleküls, das für den LexA-Repressor kodiert, erhalten werden. Gensynthesetechniken sind oben diskutiert und LexA-Gensequenzen werden z. B. von Garriga et al., supra, beschrieben. Alternativ können DNA-Moleküle, die für den LexA-Repressor kodieren, aus Plasmid pRB500, American Type Culture Collection, Eingangsnummer 67758, erhalten werden.
Der Fachmann auf diesem Gebiet kann in einfacher Weise andere Strategien zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität unter Verwendung von prokaryotischen regulatorischen Systemen, z. B. das lac-Repressor/lac-Operon-System oder das trp-Repressor/trp-Operon-System ausarbeiten.
Noch ein anderes Verfahren zur Wiederherstellung von Fertilität nutzt die hohe Affinität von Avidin für Biotin durch Besprühen sich entwickelnder Pflanzen mit einer Biotinlösung. Die Biotinlösung kann eine Mindestmenge eines organischen Co-Lösungsmittels, z. B. DMSO, umfassen, um eine vollständige Löslichkeit des Biotins sicherzustellen. Allerdings kann die Biotinlösung kein organisches Co-Lösungsmittel enthalten. Ein Besprühen kann früh wie in der meiotischen Phase der Pollenentwicklung beginnen. Das Besprühen kann auch später in der Pollenentwicklung beginnen. Das Besprühen wird im Allgemeinen in regelmäßigen Abständen wiederholt, bis ein Pollenausfallen beobachtet wird. Die Intervalle zwischen den Sprühvorgängen werden zwischen 1 und 7 Tagen variieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Besprühen alle 3 bis 5 Tage wiederholt.
6. Produktion von Hybridsamen mit gewünschten Kornmerkmalen
Hybridsamen mit einem oder mehreren gewünschten Korn- oder Samenmerkmalen können vorteilhafterweise unter Verwendung der männlich-sterilen Pflanzenzelllinien wie oben beschrieben produziert werden. Eine transgenische Linie, die das Avidingen trägt, wird als der männlich-sterile weibliche Elter mit einer männlichen fertilen Bestäuberpflanze, die ein oder mehrere Gene für das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal trägt, gekreuzt. Die männlich-fertile Bestäuberpflanzenlinie ist vorzugsweise für das Gen (für die Gene), das (die) das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal kontrolliert (kontrollieren), homozygot. Hybridsamen, die das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal haben, die durch dieses Verfahren produziert wurden, werden geerntet. Das Verfahren zur Produktion von Hybridsamen, bei dem der männlich-sterile Elter mit einer männlich-fertilen Bestäuberlinie gekreuzt wird, die ein oder mehrere Gene für ein gewünschtes Korn- oder Samenmerkmal trägt, wird manchmal als das „Top-Kreuzungs-Verfahren" bezeichnet. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5 196 636.
Die männlich-sterilen und männlich-fertilen Linien, die zur Herstellung der Hybridsamen der vorliegenden Erfindung gekreuzt werden, können eine beliebige kompatible Kombination von Hybrid-, Inzucht- oder synthetischen Linien sein. Eine transgenische Linie, die das Avidingen funktionell mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor verknüpft trägt, wird unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren produziert. Die männlich-sterile Linie kann eine oder mehrere Kopien des Avidin-Gens tragen.
Eine transgenische männlich-sterile Linie, die das Avidin-Gen trägt, kann durch Unterdrücken männlicher Sterilität durch eines der oben beschriebenen Verfahren eine Selbstung vornehmen. Beispielsweise können Ribozyme so entwickelt sein, dass sie Endonuklease-Aktivität exprimieren, die auf eine bestimmte Zielsequenz im Avidin-mRNA-Molekül gerichtet ist. Das Gen, das das Ribozym kodiert, ist funktionell an einen induzierbaren Promotor geknüpft. Die männlich-sterile Pflanze wird mit denn Inducer behandelt, das Ribozym wird exprimiert und die Avidin-mRNA inaktiviert, was zu einer Wiederherstellung männlicher Fertilität führt. Alternativ wird Fertilität durch die Verwendung; einer Nukleotidsequenz, die für eine Antisense-RNA kodiert, wiederhergestellt. Die Bindung von Antisense-RNA-Molekülen an Ziel-mRNA-Moleküle resultiert in einem Hybridisierungsanhalten der Translation. Ein geeignetes Antisense-RNA-Molekül würde dann eine Sequenz haben, die zu Avidin-mRNA komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Antisense-RNA unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. Eine Aktivierung; dieses Promotors ermöglicht dann die Wiederherstellung von männlicher Fertilität.
In einem weiteren alternativen Ansatz werden RNA-Transkripte, die fähig sind, eine RNase-P-vermittelte Spaltung von Avidin-mRNA-Molekülen zu begünstigen, in einer männlich- sterilen Linie produziert. Nach diesem Ansatz kann eine externe Führungssequenz zur Steuerung des endogenen Ribozyms, RNase-P, zu Avidin-mRNA, die anschließend durch das zelluläre Ribozym gespalten wird, konstruiert werden. Die externen Führungssequenz-Transkripte binden an die targetierte mRNA-Spezies durch Bildung von Basenpaaren zwischen der mRNA und den komplementären externen Führungssequenzen, wodurch eine Spaltung von mRNA durch RNase-P an dem Nukleotid, das an der 5'-Seite der basengepaarten Region liegt, begünstigt wird.
In noch einem weiteren Ansatz zur Wiederherstellung männlicher Fertilität werden transgenische männlich-sterile Pflanzenlinien produziert, die einen Expressionsvektor enthalten, der zusätzlich zu einer Promotorsequenz, die funktionell mit einem Avidin-Gen verknüpft ist, auch ein prokaryotisches regulatorisches Element enthält. Transgenische Linien werden produziert, die dieses Avidin-Gen zusammen mit einem Gen, das für ein prokaryotisches Gen kodiert, das funktionell mit einem induzierbaren Promotor verknüpft ist, enthalten. Die transgenische Pflanzenlinie wird mit einem Inducer behandelt, um das prokaryotische Polypeptid zu produzieren, das an die prokaryotische regulatorische Sequenz bindet, die Expression von Avidin unterdrückt und männliche Fertilität wiederherstellt.
Noch ein anderes Verfahren zur Wiederherstellung von Fertilität nutzt die hohe Affinität von Avidin für Biotin. Transgenische männlich-sterile Linien werden mit einer Biotinlösung besprüht. Das Biotin bindet an Avidin und inaktiviert es, wodurch männliche Fertilität wiederhergestellt wird. Die transgenischen männlich-sterilen Linien werden im Allgemeinen unmittelbar, wenn die meiotische Phase der Pollenentwicklung beginnt, mit Biotin besprüht, obgleich ein Biotinbesprühen später beginnen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Unterdrückung von männlicher Sterilität durch Besprühen der Pflanze mit Biotin erreicht.
Die männlich-sterilen und männlich-fertilen Bestäuberlinien, die zur Produktion von Hybridsamen mit einem gewünschten Korn- oder Samenmerkmal gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Inzuchtlinien, Hybridlinien, synthetische offen bestäubte Linien oder genetisches Bestandsmaterial. Die Inzuchtlinie, Hybridlinien, synthetischen offen bestäubten Linien oder genetisches Bestandsmaterial werden durch ein beliebiges der Verfahren produziert, die dem erfahrenen Pflanzenzüchter gut bekannt sind. Siehe z. B. J. M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3. Ausgabe (Van Nostrand und Reinhold, New York, NY, 1987). Es werden Testkreuzungen unter ausgewählten Inzucht- und/oder Hybridlinien durchgeführt, um die spezifische Kombinationsfähigkeit zu beurteilen. Kommerziell akzeptable Kombinationen werden identifiziert.
Es wird eine männlich-fertile Bestäuberpflanzenlinie ausgewählt, die (l) ein oder mehrere Gene für ein gewünschtes Korn- oder Samenmerkmal trägt, und (2) mit der männlich-sterilen Linie kompatibel ist, mit der sie gekreuzt wird. Das Gen (die Gene), das (die) das ausgewählte Kornmerkmal oder Samenmerkmal kontrolliert (kontrollieren), kann (können) dominant sein, so dass das Merkmal in den Hybridsamen in einfacher Weise exprimiert wird. Allerdings kann das Gen (können die Gene), das (die) das ausgewählte Korn- oder Samenmerkmal kontrolliert (kontrollieren), rezessiv sein. Wenn das Gen, das das Korn- oder Samenmerkmal kontrolliert, rezessiv ist, werden die männlich-sterile Linie und die männlich-fertile Bestäuberlinie gezüchtet, um dieses rezessiv zu tragen. Wenn das Gen (die Gene), das (die) das Korn- oder Samenmerkmal von Interesse kontrolliert (kontrollieren), rezessiv ist (sind), sind die männlich-sterile Pflanze und die Bestäuberpflanze vorzugsweise für das Gen (die Gene) homozygot, so dass der gewünschte Phänotyp in allen durch die Kreuzung produzierten Samen exprimiert wird. Dementsprechend können die männlich-sterilen und männlich-fertilen Bestäuberlinien jeweils Gene tragen, die das Korn- oder Samenmerkmal in Nachkommensamen kontrollieren. Das Gen (die Gene) für das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal wird (werden) in die männlich-sterile Linie oder die männlich-fertile Bestäuberlinie durch traditionelle Züchtungsverfahren und/oder gentechnologische Verfahren eingeführt.
Das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal ist ein Ernährungs- oder physiologisches Merkmal des Samens, das den industriellen Typ, die Keimung oder die Krankheitsresistenz beeinflusst. Das gewünschte Korn- oder Samenmerkmal umfasst solche Charakteristika wie Öl, Protein- und Stärkegehalt wie auch Proteinqualität und Stärketyp. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um spezialisierte Samen- oder Korntypen zu produzieren, die auf verschiedenen Märkten eingesetzt werden. Mais mit hohem Ölgehalt z. B. wird verwendet, um Tierfette zu ersetzen, die Viehfutter zugesetzt werden. Mais mit hohem Amylosegehalt wird verwendet, um Klebstoffe, abbaubare Kunststofffilme und Verpackungsmaterial herzustellen. Stärke aus Wachsmais wird in verschiedenen Lebensmitteln, z. B. Suppen und Puddings, verwendet.
Die männlich-fertile Bestäuberlinie kann ein oder mehrere Gene tragen, die die Stärke- und Proteincharakteristika beeinflussen. Gene, die die Stärke- und Proteincharakteristika beeinflussen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden: Zucker (su), Amylose-Extender (ae), bröckelig (bt), matt (du), mehlig (fl), opak (o), hornhaltig (h), geschrumpft (sh) und wachsartig (wx). Siehe z. B. Hannah et al., Sci. Hortic. 55: 177–197 (1993). Die Eigenschaften von Stärke, die aus Maispflanzen erhaltern wird, welche für ae, du, wx, ae und aewx rezessiv sind, wurden charakterisiert. Siehe Brockett ete al., Starch-Stärke 40: 175–177 (1988) und US-Patent Nr. 5 516 939.
Alternativ kann die Bestäuberlinie mit einem Gen transformiert sein, das den Stärkegehalt beeinflusst. Beispielsweise kann der männlich-fertile Bestäuber mit einem bakteriellen Gen transformiert sein, das für ADPGlucose-Pyrophosphorylase kodiert, das in Gegenwart von Metboliten aktiv ist, die das Pflanzenenzym inhibieren. Der resultierende Samen hat einen höheren Stärkegehalt. Siehe Sivak et al., J. of Environ. Polymer Degradation 3(3): 145–152 (1995).
Die Bestäuberlinie kann ein oder mehrere Gene tragen, die den Fettsäuregehalt beeinträchtigen. Beispielsweise kann das fan1-Gen in Sojabohnen einen niedrigen Linolensäuregehalt kontrollieren. Hammond et al., Crop Sci 231:192 (1993). Das fas¹-Gen kontrolliert einen hohen Stearinsäuregehalt in Sojabohnen. Graef et al., Crop Sci 25: 1076 (1985). Die fap1- und fap2-Gene kontrollieren einen niedrigen Palmitinsäuregehalt bzw. einen hohen Palmitinsäuregehalt in Sojabohnen. Erickson et al., Crop Sci. 18: 544 (1988).
Die Bestäuberlinie kann mit einem Gen transformiert sein, das den Samenölgehalt beeinflusst. Beispielsweise kann die Bestäuberlinie ein Gen tragen, das für Stearoyl-Acyl-Carrierprotein (Stearoyl-ACP)-Desaturase kodiert, welche den ersten Desaturierungsschritt in der Samenölbiosynthese katalysiert. Das Stearoyl-ACP-Desaturasegen kann funktionell mit einem samenspezifischen Promotor verknüpft sein. Pflanzen, z. B. Sonnenblume, Mais, Canola oder Sojabohne, die mit dem Stearoyl-ACP-Desaturasegen transformiert sind, produzieren veränderte Stearinsäurelevel und können eingesetzt werden, um Samenöl zu produzieren, das modifizierte oder veränderte Level an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren enthält. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5 443 974.
Alternativ kann die Bestäuberlinie ein Antisense-Gen tragen, das die Expression eines Zielgens im Biosyntheseweg des Korn- oder Samenmerkmals inhibiert. Beispielsweise trägt die Bestäuberlinie ein Antisense-Gen, das die Expression von Stearoyl-Acyl-Desaturase inhibiert. Das Antisense-Gen kann funktionell mit einem samenspezifischen Promotor verknüpft sein. Pflanzen, die mit dem Stearoyl-ACP-Desaturase-Antisense-Gen transformiert sind, produzieren in Samen erhöhte Stearatlevel. Siehe z. B. Knutzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624–2628 (1992).
Das Verhältnis von männlich-sterilen zu männlich-fertilen Bestäuberelternsamen, die im Samenproduktionsfeld nach dem "Top-Kreuzungs-Verfahren" gepflanzt wurden, hängt von den Genen jedes Elters ab und wird zur Optimierung der Ausbeute variiert. Das Verhältnis von männlich-sterilem zu männlich-fertilem Bestäuberelter reicht von etwa 6:1 bis zu etwa 9:1. Vorzugsweise ist das Verhältnis von männlich-sterilem zu männlich-fertilem Bestäuberelter etwa 8:1. Am bevorzugtesten ist das Verhältnis von männlich-sterilem zu männlich-fertilem Bestäuberelter etwa 9:1.
Die folgenden Beispiele sind keine Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1: Herstellung von männlich-sterilem transgenischen Mais durch hochkonstitutive Expression von Avidin
Ein Verfahren zur Bildung von transgenischen Maispflanzen wurde in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 442 174 A1 beschrieben. Es folgt eine kurze Beschreibung dieser Methodologie.
PHI5168, ein Vektor, der das Avidin-Gen unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors trägt und auch eine PINII-Terminatorseguenz enthält, wurde zur Bildung transgenischer Maispflanzen eingesetzt. Die Struktur von PHI5168 ist in 1 gezeigt. PHI610, ein Expressionsvektor, der das bar-Gen unter Kontrolle des Doppel-35S-Promotors trägt und auch eine PINII-Terminatorsequenz trägt, wurde zusammen mit dem Avidin-Konstrukt co-transformiert, was die Selektion von transgenischen Pflanzen durch Behandlung des Transformationsgemisches mit Bioalophos erlaubt. Die Struktur von PHI610 ist in 2 gezeigt. Die zwei Expressionsvektoren wurden in Embryosuspensionskulturen, die vom Typ II-Embryokultur gemäß dem Verfahren von Green et al., Molecular Genetics of Plants and Animals, Herausg. Downey et al., Academic Press, NY, 20, 147 (1983) abgeleitet sind, transformiert. Die Kulturen wurden in Murashige und Skoog („MS")-Medium gehalten, wie es bei Murashige et al., Physio. Plant 15: 453 (1962) beschrieben ist, das mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) mit 2 mg/l und Saccharose mit 30 g/l supplementiert war. Die Suspensionskulturen wurden 7 Tage vor dem Experiment durch ein 710 Mikrometer-Sieb geführt und das Filtrat wurde in MS-Medium gehalten.
Zellen wurden durch Vakuumfiltration auf einem Buchner-Trichter (Whatman Nr. 614) aus der Suspensionskultur gesammelt und 100 ml (Frischgewicht) Zellen wurden in eine 3,3 cm- Petrischalte gegeben. Die Zellen wurden in 0,05 ml frischem Kulturmedium unter Bildung einer dünnen Schicht aus Zellen dispergiert. Die unbedeckte Petrischale wurde in die Probenkammer einer Partikelkanonenvorrichtung, hergestellt von Biolistics Inc. (Geneva, NY) gebracht. Es wurde eine Vakuumpumpe verwendet, um den Druck in der Kammer auf 0,1 Atmosphären zu reduzieren, um so die Verlangsamung der Mikropartikel durch Luftreibung zu reduzieren. Die Zellen wurden mit Wolframpartikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1,2 Mikrometer (GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, Pennsylvania) bombardiert. Ein Gemisch aus gleichen Mengen an PHI5168 und PHI610 wurde auf die Mikropartikel aufgeladen, indem 5 μl einer DNA-Lösung (1 μg DNA pro 100 Lambda) in TE-Puffer mit pH 7,7 zu 25 μl einer Suspension von 50 mg Wolframpartikeln pro ml destilliertem Wasser in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben wurden. Die Partikel wurden aggregiert und setzten sich im Röhrchen ab.
Kulturen von transformierten Pflanzenzellen, die die Fremdgene enthielten, wurden für vier bis acht Wochen in 560R (Medium) (Medium auf N6-Basis mit 1 mg/ml Bialaphos) für 4–8 Wochen kultiviert. Dieses Medium selektiert auf Zellen, die das bar-Gen exprimieren.
Dann wurde Embryobildung in den embryogenen Kulturen induziert und die Zellen zu Pflanzen gekeimt. Eine Zweikulturmediumfolge wurde verwendet, um somatische Embryos, die auf Callus-Aufrechterhaltungsmedium beobachtet wurden, zum Keimen zu bringen. Callus wurde zuerst auf ein Kulturmedium (Reifungsmedium), das 5,0 mg/l Indolessigsäure (IAA) enthielt, für 10 bis 14 Tage transferiert, während die Callus-Proliferation fortgesetzt wurde. Die Callus-Beladung war 50 mg pro Platte, um eine Gewinnung pro Materialmasseneinheit zu optimieren.
Callus wurde dann vom „Reifungs"-Medium auf ein zweites Kulturmedium, das einen reduzierten Level an IAA (1 mg/l) im Vergleich zum ersten Kulturmedium enthielt, transferiert. Zu diesem Punkt werden die Kulturen ins Licht gebracht. Eine Keimung somatischer Embryos war durch einen grünen Schössling charakterisiert, der mit einem verbindenden Wurzelzugang verlängert war. Somatische Embryos wurden dann auf Medium in einem Kulturröhrchen (150 × 25 mm) für weitere 10–14 Tage transferiert. Zu dieser Zeit waren die Pflanzen etwa 7–10 cm groß und hatten eine ausreichende Größe und Wuchsstärke, um gegenüber Gewächshausbedingungen abgehärtet zu werden.
Um regenerierte Pflanzen abzuhärten, wurden Pflanzen, die in die Wachstumskammer transferiert werden sollten, aus den sterilen Behältern entfernt und verfestigtes Agarmedium wurde von den Wurzeln abgespült. Die Pflänzchen bzw. Setzlinge wurden in eine kommerzielle Topfmischung in einer Wachstumskammer mit einer Nebeldüsenvorrichtung zur Aufrechterhaltung der relativen Feuchtigkeit nahe 100% ohne übermäßiges Befeuchten der Pflanzenwurzeln gestellt. Nach 3–4 Wochen in der Nebelkammer waren die Pflanzen für eine Transplantation in Feldbedingungen ausreichend robust.
Pflanzen auf dem Feld wurden analysiert, indem männliche Sterilität beobachtet wurde. Ausgewählte Pflanzen wurden dann weiter auf Vorliegen des Avidin-Gens durch PCR und Southern blotting sowie auf Expression von Avidin durch ELISA analysiert, und zwar durch Standardverfahren.
Vierundneunzig Pflanzen wurden durch PCR analysiert; es wurde festgestellt, dass 53 fertil und 41 steril waren. Wenn die Fertilität jeder Pflanze mit dem Vorliegen des Avidin-Gens durch PCR verglichen wurde, wurde eine 98%-ige Korrelation zwischen dem Vorliegen des Gens und Pflanzensterilität festgestellt. 5 Pflanzen wurden detailliert auf das Vorliegen des Avidin-Gens durch Southern blotting analysiert. Von drei Pflanzen wurde durch Southern-Analyse gezeigt, dass sie das Avidin-Gen enthalten. Alle drei Pflanzen wiesen Sterilität auf. Zwei Pflanzen, die das Avidin-Gen nicht hatten, waren vollständig fertil. Es gab somit eine 100%-ige Korrelation zwischen dem Vorliegen des Avidin-Gens und männlicher Sterilität.
BEISPIEL 2: Verwendung von Agrobacterium-Stämmen, die einen binären Vektor enthalten, welcher eine DNA-Sequenz, die für Avidin kodiert, enthält, um männlich-sterile transgenische Sojabohnenpflanzen zu erzeugen.
Ein Verfahren zur Bildung transgenischer Sojabohnenpflanzen ist das, das in der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 07/920 409 beschrieben ist. Sojabohnen (Glycine max)-Samen, Pioneer-Varietät 9341, wird oberflächensterilisiert, indem er Chlorgas ausgesetzt wird, das in einer Glasglocke entwickelt wird. Gas wird produziert, indem 3,5 ml Salzsäure (34 bis 37 Gew.-%) zu 100 ml Natriumhypochlorit (5,25 Gew.-%) gegeben werden. Die Behandlung erfolgt für 16 bis 20 Stunden in einem Behälter mit etwa 1 Kubikfuß Volumen. Oberflächensterilisierter Samen wird bei Raumtemperatur in Petrischalen gelagert. Samen wird gekeimt, indem ein mit einem 1/10 Festigkeit Agar-verfestigtes Medium gemäß Gambourg (B5-Basalmedium mit minimalen organischen Bestandteilen, Sigma Chemical Katalog Nr. G5893, 0,32 g/l Saccharose; 0,2 % Gewicht/Volumen 2-(N-Morpholino) Ethansulfonsäure (MES), (3,0 mM)) ohne Pflanzenwachstumsregulatoren plattiert wird und bei 28° mit einer Taglänge von 16 Stunden und kühlweißer fluoreszierender Beleuchtung mit etwa 20 μEm^–2·S^–1 kultiviert wird. Nach 3 oder 4 Tagen wird Samen zur Co-Kultivierung vorbereitet. Die Samenschale wird entfernt und die sich verlängernde Wurzel wird 3 bis 4 mm unter den Cotyledonen entfernt.
Übernachtkulturen vom Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404, der ein modifiziertes binäres Plasmid beherbergt, das das Avidin-Gen enthält, werden zur log-Phase in Minimal-A-Medium, das Tetracyclin, 1 μg/ml, enthält, wachsen gelassen und gesammelt und es wird eine Messung der optischen Dichte bei 550 nm vorgenommen. Ausreichend Volumen der Kultur wird in konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, so dass nach Sedimentation zwischen 1 und 2 × 10¹⁰ Zellen in jedem Röhrchen mit 10⁹ Zellen/ml gesammelt werden. Die Sedimentation erfolgt durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min. Nach Zentrifugation wird der Überstand dekantiert und die Röhrchen werden bei Raumtemperatur gehalten, bis Inoculum benötigt wird, aber nicht länger als 1 Stunde.
Inokulationen werden in Chargen durchgeführt, so dass jede Samenplatte mit einem neu resuspendierten Pellet von Agrobacterium behandelt wird. Bakterielle Pellets werden einzeln in 20 ml Inokulationsmedium, das B5-Salze (G5893), 3,2 g/l; Saccharose, 2,0% G/V; 6-Benzylaminopurin (BAP), 45 μM; Indolbuttersäure (IBA), 0,5 μM; Acetosyringon (AS), 100 μM; enthält und mit 10 mM MES auf pH 5,5 gepuffert ist, resuspendiert. Eine Resuspension wird durch Vortex-Behandlung erreicht. Das Inoculum wird dann in eine Petrischale gegossen, die vorbereiteten Samen enthält, und die Cotyledonenknoten werden mit einem chirurgischen Messer maceriert. Dies wird erreicht, indem Samen durch Längsschnitt durch den Schösslingsapex in Hälften geteilt werden, wobei die 2 ganzen Cotyledone erhalten bleiben. Die zwei Hälften der Schösslingsapex werden darin von ihren jeweiligen Cotyledonen abgebrochen, indem sie mit einem chirurgischen Messer weggeschnitten werden. Der Cotyledonarknoten wird dann mit einem chirurgischen Messer maceriert, indem mehrmals entlang der Symmetrieachse eingekerbt wird. Es muss vorsichtig gearbeitet werden, um nicht ganz durch das Explantat zur axialen Seite zu schneiden. Explantate werden in grob 5 Minuten präpariert und dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Bakterien, aber ohne Rühren inkubiert. Nach 30 Minuten werden die Explantate in Platten mit demselben Medium, das mit Gelrite (Merck & Company Inc.), 0,2% G/V, verfestigt wurde, transferiert. Explantate werden mit der adaxialen Seite nach oben eingebettet und mit der Oberfläche des Mediums egalisiert und bei 22°C für 3 Tage unter kühlem weißem Fluoreszenzlicht, etwa 20 μEm^–2·S^–1, kultiviert.
Nach 3 Tagen werden die Explantate in flüssiges Gegenselektionsmedium, das B5-Salze (G5893), 3,2 g/l; Saccharose, 2% G/V; BAP, 5 μM; IBA, 0,5 μM; Vancomycin, 200 μg/l; Cefotaxim, 500 μg/l, enthält und mit MES, 3 mM, auf pH 5,7 gepuffert ist, transferiert. Explantate werden in jeder Petrischale mit konstanter langsamer kreisförmiger Bewegung bei Raumtemperatur für 4 Tage gewaschen. Das Gegenselektionsmedium wird 4-mal ersetzt.
Die Explantate werden dann in mit Agarose verfestigtes Selektionsmedium, das B5-Salze (G5893), 3,2 g/l; Saccharose, 2% G/V; BAP, 5 μM; IBA, 0,5 μM; Kanamycinsulfat, 50 μg/l; Vancomycin, 100 μg/l; Cefotaxim, 30 μg/l; Timentin, 30 μg/ml, enthält und mit MES, 3 mM, auf pH 5,7 gepuffert ist, pikiert. Selektionsmedium ist mit Seakem Agarose, 0,3% G/V, verfestigt. Die Explantate werden in dem Medium mit der adaxialen Seite nach oben eingebettet und bei 28° bei einer Tageslänge von 16 Stunden bei kalter weißer Fluoreszenzbeleuchtung von 60 bis 80 μEm^–2·S^–1 kultiviert.
Nach 2 Wochen werden die Explantate erneut mit flüssigem Medium an einem Kreiselschüttler gewaschen. Der Waschvorgang wird über Nach in Gegenselektionsmedium, das Kanamycinsulfat, 50 μg/ml, enthält, durchgeführt. Am folgenden Tag werden die Explantate auf Agarose/verfestigtes Selektionsmedium pikiert. Sie werden in dem Medium mit der adaxialen Seite nach unten eingebettet und für einen weiteren 2-wöchigen Zeitraum kultiviert.
Nach 1 Monat auf Selektionsmedium wird transformiertes Gewebe als grüne Sektoren von regenerierendem Gewebe gegenüber einem Hintergrund aus gebleichtem nicht-gesundem Gewebe sichtbar. Explantate ohne grüne Sektoren werden verworfen und Explantate mit grünen Sekto ren werden zu Elongationsmedium transferiert, das B5-Salze (G5893), 3,2 g/l; Saccharose, 2% G/V; IBA, 3,3 μM; Gibberellinsäure, 1,7 μM; Vancomycin, 100 μg/l; Cefotaxim, 30 μg/ml; und Timentin, 30 μg/ml, enthält und mit: 3 mM MES auf pH 5,7 gepuffert ist. Das Elongationsmedium wird mit Gelrite, 0,2% G/V, verfestigt. Die grünen Sektoren werden mit der adaxialen Seite nach oben eingebettet und wie vorstehend beschrieben kultiviert. Die Kultur wird auf diesem Medium mit Übertragungen auf frische Platten alle zwei Wochen fortgesetzt. Wenn Schösslinge eine Länge von 0,5 cm haben, werden sie an der Basis ausgeschnitten und in Bewurzelungsmedium in 13 × 100 ml-Teströhrchen gelegt. Bewurzelungsmedium besteht aus B5-Salzen (G5893), 3,2 g/l; Saccharose, 15 g/l; Nikotinsäure, 20 μM; Pyroglutaminsäure (PGA), 900 mg/l und IBA, 10 μM. Das Bewurzelungsmedium wird mit 3 mM MES auf pH 5,7 gepuffert und mit Gelrite mit 0,2% G/V verfestigt. Nach 10 Tagen werden die Schösslinge auf dasselbe Medium ohne IBA oder PGA transferiert. Schösslinge werden wurzeln gelassen und in diesen Röhrchen unter denselben Umgebungsbedingungen wie vorher gehalten.
Wenn sich ein Wurzelsystem gut entwickelt hat, wird das Pflänzchen in sterile Erde transferiert. Temperatur, Lichtperiode und Lichtintensität bleiben dieselben wie vorher.
Die Expression von Avidin in transgenischen Sojabohnenpflanzen wird durch ELISA bestätigt und quantifiziert, und das Vorliegen des Gens wird durch PCR und Southern blotting bestätigt. Die Expressionsstabilität kann durch dieselben Verfahren über sukzessive Generationen beurteilt werden. Es wird festgestellt, dass Sterilitätsprobleme mit einer Expression von Avidin in den Sojabohnen in Korrelation stehen.
BEISPIEL 3: Herstellung von männlich sterilen Sonnenblumenpflanzen durch Expression von Avidin.
Eine Expressionskassette, die für Avidin kodiert, wird verwendet, um transgenische Sonnenblumenpflanzen und -samen zu erzeugen. Die DNA-Sequenz, die für Avidin kodiert, wird in eine Expressionskassette unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors insertiert. Diese Expressionskassette wird dann unter Verwendung der EcoRI-Stelle in einen binären Vektor, z. B. PHI 5765, subkloniert. Der binäre Vektor wird dann in einen Agrobacterium tumefaciens-Helferstamm transferiert.
Sonnenblumenpflanzen werden mit Agrobacterium-Stamm LBA4404 nach Mikropartikel-Bombardement transformiert, wie es von Bidney et al., Plant Mol. Biol. 18: 301 (1992) beschrieben wurde. Kurz zusammengefasst, Samen der Pioneer-Sonnenblumen-Linie SMF-3 werden geschält und oberflächensterilisiert. Die Samen werden im Dunklen bei 26°C für 18 Stunden auf Filterpapier, das mit Wasser angefeuchtet ist, gequollen. Die Cotyledonen und die Wurzel werden entfernt und Meristemexplantate werden auf 374BGA-Medium (MS-Salze, Shephard- Vitamine, 40 mg/l Adeninsulfat, 3% Saccharose, 1,8% Phytagar pH 5,6 plus 0,5 mg/l BAP, 0,25 mg/l, IAA und 0,1 mg/l GA) kultiviert. Vierundzwanzig Stunden später werden die ersten Blätter entfernt, um das apicale Meristem freizulegen und die Explantate werden mit dem apicalen Dom nach oben in einen 2 cm-Kreis in der Mitte einer 60 mm × 20 mm Petrischale, die Wasseragar enthält, gelegt. Die Explantate werden zweimal mit Wolframpartikel, die in TE-Puffer suspendiert sind, oder mit Partikeln, die mit einem Expressionsplasmid, das das Avidin-Gen enthält, verbunden sind, bombardiert. Die Meristemexplantate werden auf 374BGA-Medium im Licht bei 26°C für weitere 72 Stunden Co-Kultur co-kultiviert.
Mit Agrobacterium behandelte Meristeme werden nach dem 72 Stunden-Co-Kultur-Zeitraum auf Medium 374 (374BG mit 1% Saccharose und ohne BAP, IAA oder GA₃) und supplementiert mit 250 μg/ml Cefotaxim transferiert. Die Pflänzchen werden sich für weitere 2 Wochen unter Inkubationsbedingungen von 16 Stunden Tag und 26°C zu grün oder bleich entwickeln gelassen. Pflänzchen werden in Medium, das Kanamycin enthält, transferiert und wachsen gelassen. Das Vorliegen von Avidin in den Pflänzchen wird wie in Beispiel 2 beschrieben bestätigt und quantitativ bestimmt. Es wird festgestellt, dass das Vorliegen von männlicher Sterilität in Korrelation mit der Expression von Avidin durch die Pflanzen steht.

Claims

Ein isoliertes DNA-Molekül, das einen Anther-spezifischen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert.
Ein Expressionsvektor, der das isolierte DNA-Molekül gemäß Patentanspruch 1 umfasst.
Eine transgenische Pflanze, wo diese Pflanze den Expressionsvektor gemäß Patentanspruch 2 umfasst.
Eine transgensiche Pflanze gemäß Patentanspruch 3, wo diese Pflanze aus der Gruppe gewählt wird, die Mais, Sojabohnen und Sonnenblumen umfasst.
Der Expressionsvektor gemäß Patentanspruch 2, wo eine Nukleotidsequenz, die für eine Signalsequenz kodiert, mit der betreffenden Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Streptavidin kodiert.
Der Expressionsvektor gemäß Patentanspruch 5, wo die betreffende Signalsequenz die Gersten-Alpha-Amylase-Signalsequenz ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer transgenischen männlich-sterilen Pflanze, welches Verfahren darin besteht, in Pflanzenzellen die Einführung eines Expressionsvektors zu unternehmen, der einen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Steptavidin kodiert, und das Regenerieren einer transgenischen Pflanze aus den betreffenden transformierten Zellen durchzuführen, wo der betreffende Promotor die Expression des betreffen den Gens steuert, und wo die betreffende Genexpression zu einer männlichen Sterilität der betreffenden transgenischen Pflanze führt.
Ein Verfahren zur Anwendung eines Steptavidin-Gens zur Herstellung einer männlich-fertilen Hybridpflanze, welches Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) Herstellung einer ersten männlich-sterilen Elternpflanze, die ein DNA-Molekül umfasst, das einen Promotor umfasst, der mit einer Nukleotidsequenz operabel verbunden ist, die für Steptavidin kodiert, wo die Expression dieses Streptavidins zu männlicher Sterilität führt; (b) Herstellung einer zweiten transgenischen Elternpflanze, die ein zweites Fremdgen expirimiert; und (c) Kreuzbefruchtung der betreffenden ersten Elternpflanze mit der betreffenden zweiten Elternpflanze im Hinblick auf die Herstellung einer Hybridpflanze; wo die betreffende Hybridpflanze das betreffende zweite Fremdgen exprimiert und wo das Produkt des betreffenden zweiten Fremdgens die Expression von Streptavidin in der betreffenden Hybridpflanze reduziert, welches zur Herstellung einer männlich-fertilen Hybridpflanze führt.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 8, wo das betreffende zweite Fremdgen aus der Gruppe gewählt wird, die ein Antisense-Gen, ein Ribozym-Gen und ein externes Führungssequenz-Gen umfasst.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 8, wo das betreffende DNA-Molekül der betreffenden ersten Elternpflanze außerdem einen LexA-Operator umfasst, der mit dem betreffenden Promotor operabel verbunden ist, und wo das betreffende zweite Fremdgen das LexA-Repressor-Gen ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Samen, die ein gewünschtes Korn-Merkmal besitzen, welches Verfahren folgende Stufen umfasst: (a) Herstellung einer ersten Elternpflanze, die männlich-steril ist, und die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für Streptavidin kodiert, das mit einer Promotorsequenz operabel verbunden ist; (b) Herstellung einer zweiten Elternpflanze, die männlich-fertil ist, und die ein Gen oder mehrere Gene trägt, welches/welche das gewünschte Korn-Merkmal steuert/steuern; (c) Kreuzbefruchtung der betreffenden ersten Elternpflanze mit der betreffenden zweiten Elternpflanze im Hinblick auf die Herstellung von Hybridsamen mit dem betreffenden Korn-Merkmal; und (d) Ernte der betreffenden Samen.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 11, wo die erste Elternpflanze eine Hybridpflanze ist.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 11, wo das betreffende Korn-Merkmal aus der Gruppe gewählt wird, die Ölgehalt, Proteingehalt und Stärkegehalt umfasst.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 11, wo die betreffende erste und zweite Pflanze aus der Gruppe gewählt werden, die Mais, Sojabohnen, Canola und Sonnenblumen umfasst.
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 8 oder 11, wo die betreffende Promotorsequenz eine Anther-spezifische Promotorsequenz ist, die eine Antherbox umfasst, die aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 besitzt; (b) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:2 besitzt; (c) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 besitzt; und (d) einem funktionellen Fragment von (a), (b) oder (c).
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 15, wo die betreffende Antherbox die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:1 besitzt, und wo der betreffende Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) CaMV 35S Kernpromotor; (b) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:4 besitzt; (c) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt; (d) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 besitzt; und (e) einem funktionellen Fragment von (b), (c) oder (d).
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 15, wo die betreffende Antherbox die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:2 besitzt, und wo der betreffende Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) CaMV 35S Kernpromotor; (b) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:4 besitzt; (c) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt; (d) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 besitzt; und (e) einem funktionellen Fragment von (b), (c) oder (d).
Das Verfahren gemäß Patentanspruch 14, wo die betreffende Antherbox die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 besitzt, und wo der betreffende Anther-spezifische Promotor außerdem einen Kernpromotor umfasst, der aus der Gruppe gewählt wird, die aus folgendem besteht: (a) CaMV 35S Kernpromotor; (b) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:4 besitzt; (c) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:5 besitzt; (d) einem DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 besitzt; und (e) einem funktionellen Fragment von (b), (c) oder (d).