BG104154A - Индуциране на мъжка стерилност в растения чрез експресия на високи нива авидин - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до продуциране на мъжки стерилни растения чрез увеличаване на ендогенната концентрация на авидин в растителните тъкани. Трансгенните растения съдържат експресионен вектор, в който промоторът е оперативно свързан с ДНК последователност, кодираща авидин. Изобретението се отнася и до методи за възстановяване на мъжка плодовитост и до методи за произвеждане на семена с една или повече желани характеристики на зърната.

Description

Област на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до метод за контролиране на фертилностга на растения чрез използване на ДНК молекули, които кодират авидин. В частност, това изобретение е насочено към методи за получаване на трансгенни мъжко стерилни растения, които експресират авидин. Нещо повече, това изобретение е насочено към методи за съхраняване на мъжката фертилност в потомството на мъжко стерилни растения. Изобретението се отнася още и до методи за производство на хибридни семена, в частност хибридни семена с едно и повече желани качества на зърното или семето, чрез използване на мъжко стерилни растения, които експресират авидин.

Основание на изобретението

Контролирането на фертилностга на полена е от съществено значение при производството на хибридни култури. Виж например J. М. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3-то издание (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987), която е включена като литературен източник. При производството на хибридна царевица, например, контролът на фертилностга на полена обикновено се извършва чрез физическо отстраняване на мъжкия цвят или свилата преди разпръскването на полена. Ръчното премахване на свилата е много трудоемка дейност. Въпреки че механизираното премахване на свилата е по-малко трудоемко от ръчното премахване, то е помалко надеждно и изисква последващо наблюдение на културата,

ΜΜΜΜΗ както и обикновено допълнително оздравително ръчно премахване. И двата метода на премахване на свилата предизвикват загуба на добив от женския родител.

Повечето важни културни растения, обаче, притежават и двата функционални органа, мъжки и женски, в един и същи цвят; следователно, премахването на мъжките органи не е проста процедура. Тъй като е възможно да се отстранят образуващите полен органи преди разпръскването на полена, тази форма на хибридно производство е изключително трудоемка и скъпа.

Фертилностга на полена може да бъде контролирана още чрез използване на листен спрей с гаметоцидни качества. Cros et al., Sex Plant Reprod. 4: 235 (1991). Например прилагането на етрел към прашниците води до допълнителни поленови митози при пшеницата, дегенерация на тапетните клетки при ечемика и малформация или недоносен полен при Eragrostis, Bennet et al., Nature 240: 566 (1972), Сойюип et al., Plant Cell Environ. 6: 21 (1983); Berthe et al., Crop Sci. 18: 35 (1978). Ho химическият подход е трудоемък, предполага потенциални проблеми относно токсичността на химикалите, въведени в околната среда, и може да бъде много чувствителен по отношение на времето на прилагането му.

В допълнение, търговското призводство на хибридно семе с помощта на гаметоциди е лимитирано от разходите за и наличността на химикалите, както и от надеждността и продължителността на действие на приложенията. Сериозно ограничение при гаметоцидите е, че те имат фитотоксични ефекти, чиято проява зависи от генотипа. Другите ограничения са, че тези химикали могат да не бъдат ефективни за култури с удължен период на цъфтеж, тъй като новообразуваните цветове могат да не бъдат засегнати. Следователно се налага повторно прилагане на химикали.

Много съвременни системи за търговско производство на хибридни семена за полски култури разчитат на генетични средства за контрол на опрашването. Растения, които се използват като женски, или не могат да разпръскат полен, образуват полен, който е биохимически неспособен да осъществи самоопрашване, или въобще не образуват полен. Растения, които не са способни на самоопрашване, се наричат “авто-несъвместими”. Трудности, свързани с използването на авто-несъвместима система, включват наличието и разпространението на авто-несъвместимата женска линия и стабилността на авто-съвместимостга. В някои примери авто-несъвместимостта може да бъде преодоляна химически, или незрели пъпки могат да бъдат опрашени на ръка преди да бъде активиран биохимическият механизъм, който блокира полена. Автонесъвместимите системи, които могат да бъдат деактивирани, често са много уязвими на стресови климатични условия, които премахват или намаляват ефективността на биохимическия блокаж на самоопрашването.

От много по-широк интерес за търговското производство на семена са генетично базираните системи за контрол на полена, предизвикващи мъжка стерилност. Тези системи основно са от два типа: (1) ядрена мъжка стерилност, която представлява липса на образуване на полен поради мутации в един или повече ядрени гени или (2) цитоплазмена генетична мъжка стерилност, обикновено наричана “цитоплазмена мъжка стерилност” (ЦМС), при която образуването на полен е блокирано или прекъснато поради изменение в цитоплазмена органела, която най-често е митохондрията.

Ядрената стерилност може да бъде или доминантна или рецесивна. Обикновено доминантната стерилност може да бъде използвана само за производство на хибридни семена, ако е възможно вегетативно или клонално размножаване на женската линия. Рецесивната стерилност може да бъде използвана, ако стерилните и фертилните растения лесно се разграничават. Търговското приложение на системи за доминантна и рецесивна стерилност е ограничено обаче, от разходите за клонално размножаване и, съответно, разреждане на женските редове на самоопрашените растения.

Въпреки че съществуват схеми на хибридизиране, включващи употребата на ЦМС, съществуват ограничения относно търговската й стойност. Един пример на ЦМС система е специфична мутация в локализираните в цитоплазмата митохондрии, които могат, при подходяща ядрена ситуация, да доведат до неуспешно образуване на зрял полен. В някои примери ядрената ситуация може да компенсира цитоплазмената мутация и да се получи образуване на нормален полен. Специфични ядрени “възстановяващи гени” позволяват образуването на полен в растения с ЦМС митохондрии. Като цяло използването на ЦМС за търговско производство на семена включва използването на три линии на отглеждане: мъжко стерилна линия (женски родител), поддържаща линия, която е изогенна на мъжко стерилната линия, но съдържа напълно функционални митохондрии, и мъжка родителска линия. Мъжката родителска линия може да носи или да не носи специфичните възстановяващи гени в цитоплазмата.

За култури такива като зеленчуци, за които е невъзможно получаването на семена от хибрид, ЦМС система може да бъде използвана без възстановяване. За култури, за които плодът или семето на хибрида е търговският продукт, фертилностга на хибридното семе трябва да бъде възстановена чрез специфични възстановяващи гени в мъжкия родител или мъжко стерилният хибрид трябва да бъде опрашен. Опрашване на не-възстановени хибриди може да бъде постигнато чрез включване на малък процент мъжко фертилни растения за осъществяване на опрашване. При повечето видове ЦМС свойството се онаследява по майчина линия, тъй като всички цитоплазмени органели обикновено се наследяват само от яйцеклетката.

ЦМС системите притежават ограничения, които могат да им попречат да бъдат единствено решение за производство на мъжко стерилни растения. Например, един особен ЦМС тип в царевицата (Т-цитоплазма) дава чувствителност към токсина, получаван при инфекция с определена гъба. Въпреки че все още се използват за определени култури, ЦМС системите могат да бъдат прекъснати от някои условия на околната среда.

Следователно е очевидна необходимостта от средство за контрол на продукцията на полей по друг метод, различен от ръчните, механизираните, химичните и традиционните генетични методи.

Резюме на изобретението

Съответно обект на настоящото изобретение е осигуряването на метод за получаване на мъжко стерилни растения, които са възпроизведени стерилни чрез хетероложна експресия на авидин.

Друг обект на това изобретение е осигуряването на химерен ген, характеризиращ се с това, че включва кодираща авидин ДНК последователност, който оперативно е свързан с последователност на растителен промотор.

Друг обект на това изобретение е осигуряване на метод за отменяне на мъжка стерилност, предизвикана от експресия на авидин.

Друг обект на това изобретение е осигуряване на методи за производство на семена с едно или повече желани качества на зърното или семето.

Тези и други обекта са постигната, в съответствие с едно изпълнение на настоящото изобретение, чрез осигуряване на изолирана ДНК молекула, характеризираща се с нуклеотидна последователност, кодираща авидин, свързана оперативно с последователност на растителен промотор. В предпочитано изпълнение, изолираната ДНК последователност се съдържа в експресионен вектор. В друго предпочитано изпълнение последователността на растителния промотор е констатутавен промотор, а в друго предпочитано изпълнение консппутавният промотор е убиквитинов промотор. В друго предпочитано изпълнение авидиновият ген е оперативно свързан с експортна сигнална последователност.

В съответствие с друго изпълнение на изобретението е осигурено трансгенно растение, при което растението включва хетероложна нуклеотидна последователност, характеризираща се с авидинов ген, и при което хетероложната нуклеотидна последователност повишава концентрацията на авидин в тъканите на растението, предизвиквайки мъжка стерилност. В предпочитани изпълнения трансгенното растение е царевично растение, соево растение, растение от канола, или слънчогледово растение. В друго предпочитано изпълнение хетероложната ДНК молекула по-нататък включва последователност на констатутавен промотор, която в предпочитано изпълнение е последователност на убиквитинов промотор. В друго предпочитано изпълнение хетероложната ДНК молекула по-нататък включва тъканно специфичен промотор.

Особено предпочитаният тьканно специфичен промотор е прашниково специфичен промотор.

В съответствие с друг аспект на изобретението, то дава метод за получаване на трансгенно мъжко стерилно растение, характеризиращ се с въвеждането в растителните клетки на експресионен вектор, характеризиращ се с промотор и авидинов ген, при което промоторът контролира експресията на авидиновия ген, и където експресията на авидиновия ген предизвиква мъжка стерилност. В предпочитано изпълнение трансгенно растение се регенерира от растителна клетка. В друго предпочитано изпълнение промоторът включва убиквитинов промотор, тьканно специфичен промотор или индуцируем промотор.

В съответствие с друг аспект от изобретението, то дава метод на използване на авидинов ген за получаване на мъжко стерилно хибридно растение, характеризиращо се с получаването на първо родителско мъжко стерилно растение, характеризиращо се с описана по-горе ДНК молекула, при което експресията на авидин причинява мъжка стерилност, получавайки второ трансгенно растение, експресиращо втори чужд ген, и кръстосано опрашване на първия родител с втория родител за получаване на хибридно растение, което експресира втория чужд ген, и при това продуктът на втория чужд ген намалява експресията на авидин в хибридното растение, като по този начин се получава мъжко фертилно хибридно растение.

В предпочитано изпълнение на този аспект на изобретението вторият чужд ген е селекциониран от групата, състояща се от безсмислен ген, рибозимен ген и ген за външна водеща последователност. В друго предпочитано изпълнение безсмисленият ген включва последователности на авидинова иРНК, която, в друго предпочитано изпълнение, е под контрола на индуцируем промотор.

В още друго предпочитано изпълнение, рибозимният ген включва последователности на авидинова иРНК. В още друго предпочитано изпълнение, генът на външна водеща последователност включва последователности на авидинова иРНК. В още друго предпочитано изпълнение, ДНК молекулата на първото родителско растение понататък включва LexA оператор, който оперативно е свързан със същия промотор, при което вторият чужд ген е LexA репресорният ген. В друго предпочитано изпълнение, промоторната последователност е последователност на прашниково специфичен промотор, характеризиращ се с прашникова касета, селекциониран от групата, състояща се от нукпеотидната последователност на SEQ ГО N0:4; нукпеотидната последователност на SEQ ГО N0:5; нуклеотидната последователност на SEQ ГО N0:6 и функционален фрагмент от тях.

В още едно предпочитано изпълнение на този аспект от изобретението, прашниковата касета има нуклеотидната последователност на SEQ ГО N0:4, SEQ ГО N0:5 или SEQ ГО N0:6, и прашниково специфичният промотор по-нататък включва същински промотор, избран от групата, състояща се от: CaMV 35S същински промотор; нуклеотидната последователност на SEQ ГО N0:7; нуклеотидната последователност на SEQ ГО N0:8; нуклеотидната последователност на SEQ ГО N0:9 и функционални фрагменти от тях.

В съответствие с друг аспект от изобретението се дава метод за възстановяване фертилността в растение, превърнато в мъжко стерилно чрез експресия на авидин, характеризиращ се с напръскване на растението с разтвор на биотин.

В съответствие с още един аспект на изобретението се дава метод за получаване на семена, имащи едно или повече желани качества на зърното или семето. В предпочитано изпълнение на това изобретение, първо родителско растение, което е мъжко стерилно и носи едно или повече копия на авидиновия ген, се кръстосва като женски родител с второ родителско растение, което е мъжко фертилно и носи един или повече желани качества на зърното или семето. Получават се семена с качествата на зърното или семето на мъжкия родител. В предпочитани изпълнения родителското растение е царевица, соя, канола или слънчоглед. В още друго предпочитано изпълнение на изобретението авидиновият ген е стрепавидинов ген.

Кратко описание на Фигурите

Фигура 1 показва кодиращия авидин плазмид PHI5168, в който царевичен убиквитинов промотор (включително неговия първи екзон плюс първи интрон) направлява експресията на ечемичена експортна сигнална последователност на алфа амилаза и кодиращ авидин участък.

Фигура 2 показва плазмида РШ610, кодиращ bar гена.

Подробно описание на предпочитаните изпълнения.

1. Дефиниции

В описанието, което следва, широко се използват голям брой термини. Дефинициите, които следват, се дават за улеснение при разбиране на изобретението.

последователност, която се транскрибира в информационна РНК (иРНК), която след това се транслира в последователност от аминокиселини, определящи специфичен полипептид.

Чужд ген в настоящата дефиниция се отнася до ДНК последователност, която е оперативно свързана поне с един хетероложен регулаторен елемент. Например, всеки ген, различен от царевичния 5126 структурен ген, се смята за чужд ген, ако експресията на този ген се контролира от прашниково специфичен регулаторен елемент на гена 5126.

Промотор е ДНК последователност, която направлява транскрипцията на ген, такъв като структурен ген, безсмислен ген, рибозимен ген или ген на външна водеща последователност. Обикновено промотрът е локализиран в 5' региона на ген, съседен на мястото на начало на транскрипцията. Ако промоторът е индуцируем промотор, тогава скоростта на транскрипция се повишава в отговор на индуциращ агент. Обратно, скоростта на транскрипция не се регулира от индуциращ агент, ако промоторът е конститутивен промотор. Растителен промотор е промоторна последователност, която ще направлява транскрипцията на ген в растителна тъкан.

Същинският промотор съдържа важни за функцията на

промотора нуклеотидни последователности, включително ТАТАпоследователностга и начало на транскрипция. При това определение, същинският промотор може да има или да няма откриваема активност в отсъствието на специфични последователности, които могат да увеличават активността или да придават тьканно специфична активност. Например, SGB6 същинският промотор се състои от около 38 нуклеотида в посока към 5' от мястото на начало на транскрипция на SGB6 гена, докато същинският промотор на 35S на мозаечния вирус на карфиола (CaMV) се състои от около 33 нуклеотида в посока към 5' от мястото на начало на транскрипция на 35S генома.

Тъканно специфичен промотор е ДНК последователност, която, когато оперативно е свързана с ген, направлява по-високо ниво на транскрипция на този ген в специфична тъкан, отколкото в други или всички останали тъкани на организма. Например, пратпниково специфичен промотор е ДНК последователност, която направлява високо ниво на транскрипция на свързан ген в растителната прашникова тъкан. SGB6 прашниковият специфичен промотор, например, може да направлява експресията на чужд ген в прашникова тъкан, но не и в коренова тъкан или в тъкан от колеоптила.

Както тук се използва “прашниково-специфичният промотор” се състои от два функционални елемента: “прашникова касета” и същински промотор. Дадена прашникова касета може да притежава функционалните характеристики на класически усилител. Комбинацията на прашникова касета и същински промотор може да стимулира генна експресия в по-голяма степен, отколкото само същинския промотор. Това е истина дори в случая с химерен прашниково специфичен промотор, съдържащ прашникова касета и същински промотор, получени от различни гени. Такива химерни прашниково специфични регулаторни елементи са описани по-долу.

Оператор е ДНК последователност, която е локализирана в посока 5' в ген и която съдържа нуклеотидна последователност, която се разпознава и свързва от репресорен белтък. Свързването на репресорен белтък с негов родствен оператор води до инхибирането на транскрипцията на гена. Например, LexA генът кодира репресорен белтък, който се свързва с LexA оператора.

Изолирана ДНК молекула е фрагмент от ДНК, който е бил отделен от ДНК на организъм. Например, клонирана ДНК молекула, кодираща авидинов ген, е изолирана ДНК молекула. Друг пример на изолирана ДНК молекула е химически синтезирана ДНК молекула или ензимно получена кДНК, която не е интегрирана в геномната ДНК на организъм.

Усилител е ДНК регулаторен елемент, който може да повиши ефективността на транскрипция.

Комплементарна ДНК (кДНК) е едноверижна ДНК молекула, която е образувана от матрица иРНК чрез ензима обратна транскриптаза. Обикновено първичната комплементарност към части от иРНК се прилага за иницииране на обратната транскрипция. Специалистите в областта използват още термина “кДНК” за означаване да двойноверижна ДНК молекула, състояща се от такава едноверижна ДНК молекула и нейната комплементарна ДНК верига.

Терминът експресия се отнася до биосинтезата на генен продукт. Например, в случая на структурен ген експресията включва транскрипция на структурния ген в иРНК и превеждането на иРНК в един или повече полипептиди.

Клониращ вектор е ДНК молекула, като плазмид, козмид или бактериофаг, която притежава способността да се реплицира автономно в клетка-гостоприемник. Обикновено клониращите вектори съдържат един или малък брой места за разпознаване от рестрикционни ендонуклеази, на които може да се включи чужда ДНК последователност по определен начин без загуба на дадена важна биологична функция на вектора, както и маркерен ген, подходящ за използване при идентификацията и селекцията на трансформираните с клониращия вектор клетки. Маркерните гени обикновено включват гени, които носят резистентност на тетрациклин или на ампицилин.

Експресионен вектор е ДНК молекула, съдържаща ген, който се експресира в клетка на гостоприемник. Обикновено генната експресия е поставена под контрола на някои регулаторни елементи, включващи конститутивни или индуцируеми промотори, тъканно специфични регулаторни елементи и усилители. Подобен ген се нарича “оперативно свързан с” регулаторните елементи.

Рекомбинантен гостоприемник може да бъде всяка прокариотна или еукариотна клетка, която съдържа или клониращ вектор или експресионен вектор. Този термин включва още онези прокариотни или еукариотни клетки, които са били генетичино конструирани да съдържат клонирания ген (гени) в хромозомата или генома на клетката на гостоприемника.

Трансгенно растение е растение, имащо една или повече растителни клетки, които съдържат чужд ген.

При еукариотите РНК полимераза II катализира транскрипцията на структурен ген за получаване на иРНК. ДНК молекула може да бъде създадена да съдържа матрица на РНК полимераза П, в който РНК транскриптът има последователност, която е комплементарна на тази на специфична иРНК. РНК транскриптът е наречен безсмислена РНК. а ДНК последователността, която кодира безсмислена РНК, е наречена безсмислен ген. Безсмислените РНК молекули са способни да се свързват с иРНК молекули, което води до инхибиране на транслацията на иРНК.

Рибозим е РНК молекула, която съдържа каталитичен център. Понятието обхваща РНК ензими, автосплайсинг РНКи и автосрязващи се РНКи. ДНК последователност, която кодира рибозим е наречена рибозимен ген.

Външна водеща последователност е РНК молекула, която направлява ендогенния рибозим, РНКаза Р, към определен вид вътреклетъчна иРНК, което води до срязване на иРНК от РНКаза Р.

ДНК последователност, която кодира външна водеща последователност, се нарича ген на външна водеща последователност.

Качество на зърно или семе е хранителна или физиологична характеристика на семето, за предпочитане контролирана от доминантен ген, която значително влияе на промишления тип. Качествата на зърното или семето включват такива характеристики като съдържание на мазнини, белтъци и скорбяла, както и качеството на белтъка и вида на скорбялата.

Единична кръстоска е кръстоска между две инбредни линии.

Двойна кръстоска е кръстоска между две единични кръстоски.

Тройна кръстоска е потомството на кръстоска между единична кръстоска и инбредна линия.

Хибрид е потомството от първото поколение на кръстоска между два индивида, различаващи се по един или повече гени.

Инбредна линия е чиста линия, обикновено произлизаща от самоопрашване и селекция.

Синтетична линия е смес от щамове, клонове, инбреди или хибриди между тях, поддържани чрез отворено опрашване за определен брой поколения. Отделните компоненти се размножават и се реконструира синтетичната линия през определени интервали.

Способност за специфично комбиниране е представянето на специфични комбинации на генетични щамове в кръстоски, отнесени към средното представяне на всички комбинации.

Растение опрашител е мъжко фертилният родител, който дава полен на мъжко стерилния женски родител. Растението опрашител може да има всяка една от много различни генетичини основи и, следователно, може да бъде инбредна линия, хибрид, синтетична линия с кръстосано опрашване опрашване или генетичен резерв.

Растението опрашител може да бъде трансгенна линия. Растението опрашител може да носи едно или повече желани качества на зърното или семето.

2. Обзор

Настоящото изобретение дава методи за създаване на мъжко стерилни растения чрез получаване на трансгенни растения, които експресират авидин. Авидинът може да бъде експресиран конститутивно, по тъканно неспецифичен начин, или да бъде експресиран по прапшиково специфичен начин. Още се дават и методи за възстановяване на мъжката фертилност.

Даден още е и метод за производство на хибридни семена, имащи едно или повече желани качества на зърното или семето. В предпочитано изпълнение на това изобретение, първи хибрид, който е мъжко стерилен и носи едно или повече копия на авидиновия ген, се кръстосва като женски родител с втори хибрид, който е мъжко фертилен и носи едно или повече желани качества на зърното или семето. Хибридните семена се получават с едно или повече качества на зърното или семето от мъжкия родител.

Авидиновият ген е изолиран и вкаран в експресионен вектор, подходящ за въвеждане в растителна тъкан. Експресионният вектор по-нататък съдържа промотор, който може да бъде конститутивен промотор, специфичен нетьканен промотор като убиквитиновия промотор, тъканно специфичен промотор като прашниково специфичния промотор, или индуцируем промотор. Експресионният вектор може да съдържа експортна сигнална последователност. Високо ниво на експресия на генен продукт, който след това се натрупва в цитоплазмата, може да доведе до токсичност за растителната клетка. Отстраняването на генния продукт от цитоплазмата тогава може да доведе до намалена клетъчна токсичиност. Известни са растителни гени и техните експортни сигнални последователности. Виж Jones and Robinson, Tansley Review 17: 567-597 (1989). Експресионният вектор е вкаран в растителна тъкан чрез стандартни методи и са селекционирани и размножени трансгенни растения. Трансгенните растения, които експресират авидин, са мъжко стерилни. Мъжката фертилност може да бъде възстановена чрез ко-експресия в трансгенните растения на втори ген, който инхибира транскрипцията на авидиновия ген, или инхибира транслацията на авидиновата иРНК. В съответствие с това изпълнение, временна супресия на авидиновия ген се постига, ако супресорният ген е оперативно свързан с индуцируем промотор. Като алтернатива, мъжката фертилност може да бъде възстановена чрез напръскване на развиващи се растения с разтвор на биотин.

3. Изолиране на ДНК молекули, които кодират авидин

Нуклеотидни последователности, които кодират авидин, могат да бъдат изолирани чрез познати методи. Например, нуклеотидната последователност на стрепавидиновия ген е известна. Argarana et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 1871-1882 (1986). Алтернативно кДНК, кодираща авидин от пилешки яйчен белтък, може да бъде изолирана от библиотека на пилешки яйцепроводни кДНК чрез методите, описани от Gope et al., Nucleic Acids Res., 15: 3595 (1987), което e включено като литературен източник.

Геномни клонове на авидиновия ген могат да бъдат получени от геномна ДНК на организми, за които се знае, че образуват авидин. Например, пилешки авидинов ген може да бъде клониран от пилешка геномна ДНК чрез методите, описани в Keinanen et al., Eur. J. Biochem. 220: 615 (1994).

Авиданови гени могат да бъдат изолирани още с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR) по стандартни метода. Виж Erlich, PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (Stockton Press, NY, 1989) и Innis et. al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Academic Press, San Diego, 1990). Метода за PCR амплификация на дълги нуклеотидаи последователности, такива като ELONGASE™ system (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) също могат да бъдат използвани за получаване на по-дълги нуклеотидаи последователности, такива като геномни клонове, кодиращи авидин. PCR праймери, комплементарни на 5' и 3' краищата на известни последователности на авиданов ген, могат да бъдат синтезирани с помощта на търговски олигонуклеотидни синтезатори, такива като тези, доставяни от Applied Biosystems (Foster City, СА). В предпочитано изпълнение, праймерите включват допълнителни нуклеотидаи последователности, съдържащи места на срязване от рестрикционни ендонуклеази. Наличието на такива места дава възможност за направляваното клониране на PCR продукти в подходящи клониращи вектори чрез третиране с подходящ рестрикционен ензим. Виж Finney, “Molecular Cloning of PCR Products” CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Aususbel et al., Eds. (John Willey & Sons, New York, 1987) стр. 15.7.1.

ДНК матрица за PCR може да бъде или кДНК или геномна ДНК, и може да бъде получена от подходящ организъм, използвайки добре известни на специалистите метода. Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). Геномна ДНК може директно да бъде получена от тъкани на птици, влечуги или земноводни с помощта на търговски реактиви fcriirf irjfct-fc—...

като Triazol™ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD).

Алтернативно, кДНК, кодираща авидин, може да бъде приготвена с помощта на иРНК, екстрахирана от тъкан на пилешки яйцепровод с помощта на търговски набор (Pharmacia, Piscataway, NJ). иРНК

препаратът се използа като шаблон за синтез на кДНК с помощта на поли(бТ) или случайни хексамерни праймери при стандартни техники. Виж Sambrook et al·, supra. След това се провежда синтез на кДНК с помощта на търговски набор (Pharmacia) и кДНК се използва директно за PCR, използвайки метода на Saiki et al., Science 239: 487 (1988).

Фрагменти на геномна ДНК или кДНК, изолирани чрез описаните по-горе методи, могат да бъдат вкарани във вектор, такъв като бакгериофаг или козмиден вектор, в съответствие с традиционни техники, такива като използване на смилане с рестрикционни ензими за набавяне на подходящи краища, употребата на третиране с алкална фосфатаза за избягване на нежелано присъединяване на ДНК молекули, и свързване с подходящи лигази. Техники за манипулиране на такива вектори са разкрити от Ausubel et al., (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, страници 3.0.5-3.17.5 (1990) (“Ausubel”).

Алтернативно, нуклеотидни последователности, кодиращи авидин, могат да бъдат получени чрез синтезиране на ДНК молекули, кодиращи авидин, с помощта на еднакво праймирани дълги олигонуклеотиди. Виж например Ausubel на страници 8.2.8. до 8.2.13. Виж още Wosnick et al., Gene 60: 115 (1987). Съвременни техники, използващи полимеразната верижна реакция, дават възможността за синтезиране на гени, дълги 1.8 килобази. Adang et al., Plant Molec. Biol. 21.: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993). Нуклеотидната последователност на

синтезиран авидинов ген може да се основава на всяка позната кодираща авидин ДНК молекула. Виж например Gope et al., supra.

Тези клонове могат да бъдат анализирани с помощта на разнообразни техники, такива като рестрикционен анализ, Southern анализ, анализ с удължаване на праймерите и анализ на ДНК последователност. Анализ с удължаване на праймерите или S1 нуклеазен рестрикционен анализ, например, може да се използва за локализиране на предполагаемо място за начало на транскрипция на клониран ген. Ausubel на страници 4.8.1-4.8.5; Walmsley et al., “Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the SI Nuclease Protection Assay” в METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (ed.), страници 271-281 (Humana Press Inc. 1991). Тези и сродни техники, добре известни в областта, са приложени за изолиране на други желани гени и за тяхното клонирани и експресия.

4. Клониране на гена за авидин в експресионен вектор и изготвяне на трансгенни растения

След като гена за авидин се изолира, той се вкарва в експресионен вектор с помощта на стандартни методи. Виж Sambrook et al., supra. Селекцията на подходящ експресионен вектор ще зависи от метода за внедряване на експресионния вектор в клетката гостоприемник. Обикновено, експресионният вектор съдържа: (1) прокариотни ДНК елементи, кодиращи началото на репликация в бактерии и ген за устойчивост на антибиотици, за осигуряване на растеж и селекция на експресионния вектор в бактериалния гостоприемник; (2) място за клониране, за внедряване на чуждеродна ДНК последователност, например генът за авидин;

(3) еукарионти ДНК елементи, които контролират инициирането на транскрипцията на екзогенния ген, такива като промотор; (4) ДНК елементи, които контролират процесията на транскриптите, като последователности за спиране на транскрипцията или за полиаденилиране; (5) ген, кодиращ маркерен белтък (напр. репортерен ген), където генът е оперативно свързан с ДНК елементи, които контролират инициирането на транскрипцията. В допълнение, експресионният вектор може да съдържа ДНК последователност, кодираща сигнална последователност за експорт, оперативно свързана с чуждеродната ДНК последователност. Общо описание на растителните експресионни вектори и репортерни гени може да се намери в Gruber et al., “Vectors for plant transformation” в METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick etal. (eds.), 89-118 (CRC Press, 1993).

В един предпочитан вариант на настоящето изобретение се използва система с растителен убиквитинов промотор. Растителните убиквитинови промотори са добре известни в тази област на техниката. Виж например Заявка за Европейски Патент 0 342 926, която е посочена тук като литературен източник. Убиквитиновият промотр е конституитивен промотор.

В друг предпочитан вариант на настоящето изобретение се използва индуцируем промотор, който позволява индуцируема регулация на експресията на авидин. Пример за такъв индуцируем промотор е глутатион S-трансферазната система в царевица. Виж Wiegand et al., Plant Mol. Biol. 7: 235 (1986). Този метод позволява също така обратима индукция на мъжка стерилност. По този начин експресията на авидин и съпътствуваща го мъжка стерилност може да се контролират по желание чрез активиране на промотора. Когато

промоторът не се активира, авидинът не се експресира и растенията са мъжко фертилни.

Експресията може да включва селективен маркер или такъв за скриниране. Много от обичайно използваните положителни селективни маркерни гени за растителна трансформация са изолирани от бактерии и кодират ензими, които метаболитно детоксифицират селективния химичен агент, който може да бъде антибиотик или хербицид. Други положителни селективни маркерни гени кодират променена мишена, която е нечувствителна на инхибитор.

Често употребяван селективен маркерен ген за растителна трансформация е генът за неомицин фосфотрансфераза II (nptll), изолират от Тп5, който когато се постави под контрола на растителни регулаторни сигнали, придава устойчивост на канамицин. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: (1983). Друг често използван селективен маркер е генът за хигромицин фосфотрансфераза, който придава устойчивост към антибиотик хигромицин. Vander Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5. 299 (1985). Допълнителни положителни селективни маркерни гени с бактериален произход, които придават устойчивост към антибиотици включват гентамицин ацетил трансфераза, стрептомицин фосфотрансфераза, аминогликозид-3’-аденил трансфераза и детерминантата за устойчивост на блеомицин. Hayford et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svat et al., Plant Mol. Biol. 14: 1^7 (1990), Hille etal., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986).

Другите положителни селективни маркерни гени за растителна трансформация не са с бактериален произход. Тези гени включват миша дихидрофолат редуктаза, растителна 5-енолпирувилшикимат3-фосфат синтаза и растителна ацетолактат синтаза. Eichheiz et al.,

Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Shah et al., Science 233: 478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).

Други често употребявани селективни маркерни гени за растения придават устойчивост на хербицидни инхибитори на глутамин синтетазата. Заявката за Европейски патент 0 333 033 на Kumada et al., и Американски патент № 4, 975, 374 на Goodman et al. включват нуклеотидни последователности на гените за глутамин синтетаза, които придават устойчивост към хербициди такива като L-фосфинотрицин. Нуклеотидната последователност на фосфинотрицин - ацетил - трансферазния ген е представена в Заявка за Европейски патент № 0 242 246 на Leemans et al. De Greef et al., Bio/Technology ]_: 61 (1989) описват производството на трансгенни растения, които експресират химерични гени, кодиращи фосфинотрицин - ацетил - трансферазна активност.

Друг клас от маркерни гени за растителна трансформация в поголяма степен изисква скрининг на предполагаеми трансформирани растителни клетки, отколкото директна генетична селекция на трансформирани клетки за устойчивост на токсична субстанция, напр. антибиотик. Тези гени са особено полезни за количествено определяне или визуализиране на пространствения модел на експресия на гена в специфичните тъкани и често се наричат репортерни гени, тъй като могат да бъдат сливани с ген или генна регулаторна последователност за изучаване на генната експресия.

Често използваните гени за скрининг на предполагаемо трансфомирани клетки включват β-галактозидаза, луцифераза и хлорамфеникол ацетилтрансфераза, Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5:

387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989); Koncz et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 84: 131 (1987); De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984). Друг подход за идентифициране на относително редки трансформационни събития се използва за гени, които кодират доминантен конституитивен регулатор на метаболитния път за пигментиране с антоциан в Zea mays Ludwig et al., Science 247: 449 (1990).

Експресионните вектори могат да съдържат ген за авидин, оперативно свързан с ДНК последователност, която кодира сигнална последователност за експорт на пептиди. Виж Hones & Robinson, supra. Векторът се изготвя така, че сигналната последователност се прикрепя към N-края на последователността за зрял авидинов белтък, позволяваща по този начин нормалният клетъчен процесинг да среже точно белтъчната молекула и да даде зрял активен авидин. В особено предпочитан вариант на изобретението сигнална последователност е сигналната последователност за алфа амилаза от ечемик. Rojers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985).

Експресионните вектори, съдържащи ген за авидин, могат да бъдат интродуцирани в протопласти или в интактни тъкани, като незрели ембриони и меристеми или в калусни култури или в изолирани клетки. За предпочитане е експресионните вектори да се интродуцират в интактни тъкани. Известни са общи методи за култивиране на растителни тъкани като тези напр. от Miki et al., “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants” в METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick et al., (eds.), стр. 67-88 (CRC Press, 1993) и от Phillips et al., “Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulations” в “CORN AND CORN IMPROVEMENT” 3^rd Edition, Sprague et al., (eds.), стр. 345-387 (American Society of Agronomy, Inc., et al., 1988).

Методите за интродуциране на експресионни вектори в растителни тъкани включват директно инфектиране или кокултивиране на растителни тъкани с Agrobacterium tumefaciens.

Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). За предпочитане се използва обезоръжен Ti плазмид като вектор за чужди ДНК последователности. Трансформацията може да се проведе съгласно процедурите, описани напр. в Заявки за Европейски патенти № 116 718 (1984) и 270 822 (1988). Предпочитаните Ti плазмидни вектори съдържат чужди ДНК последователности между крайните си последователности или поне локализирани в посока нагоре от последователността на дясната граница.

Други типове вектори могат да се използват за трансформация на растителни клетки, използвайки такива процедури като директен трансфер на гени (виж например РСТ заявка WO 85/01856 и Заявка за Европейски патент 275 069), in vitro трансформация на протопласти (напр. Патент на САЩ № 4, 684, 611), растителна трансформация, опосредсвувана от вируси (напр. Заявка за Европейски патент 067 553 и Патент на САЩ № 4, 407, 956) и трансформация опосредствувана от липозоми (напр. Патент на САЩ № 4, 536,475). Подходящи методи за трансформация на царевица са предоставени στ Fromm et al., Biotechnology 8: 833 (1990) и от Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990). Стандартни методи за трансформация на ориз са описани от Christou et al., Trends in Biotechnology 10: 239 (1992) и от Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991). Пшеницата може да се трансформира с помощта на методи, които са подобни на техниките за трансформиране на царевица или ориз. Нещо повече, Casa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993), описват метод за трансформиране на сорго, докато Wan et al., Plant Physiol. 104: 37 (1994), описват метод за трансформиране на ечемик.

Общо казано, методите за директен трансфер са за предпочитане при трансформация на едносемеделни растения, особено зърнени култури като ориз, царевица, сорго, ечемик или пшеница. Подходящи методи за директен трансфер включват доставяне чрез “микро-снаряд”, ДНК инжектиране, електропорация и други такива. Виж напр. Gruber et al., supra, Miki et al .,supra, и Klein et al., Bio/Technology 10: 268 (1992). За предпочитане e експресионните вектори да се интродуцират в тъканите на едносемеделните растения с чрез “микро-снаряд” с помощта на прибор за биолистика.

5. Регулиране на мъжката стерилност

А. Продуциране на мъжко-стерилни растения

За да се индуцира мъжка стерилност, съгласно настоящето изобретение, се конструира експресионен вектор, в който ДНК последователност, кодираща авидин се свързва оперативно към ДНК последователности, които регулират генната транскрипция в растителната тъкан. Основните изисквания към експресионния вектор са описани по-горе. С цел да се постигне мъжка стерилност чрез експресията на авидин, за предпочитане е авидинът да не се експресира по неустойчив начин, а експресионният вектор да се интродуцира в растителната ембрионна тъкан по такъв начин, че авидинът да се експресира на по-късен етап от развитието във възрастното растение. Например, митотична стабилност може да се постигне с помощта на растителни вирусни вектори, които осигуряват епихромозомна репликация.

Предпочитан метод за получаване на митотична стабилност се осигурява чрез интегриране на последователности от експресионния вектор в хромозомата на гостоприемника. Такава митотична стабилност може да се осигури чрез доставяне на експресионния вектор в растителната тъкан с помощта на “микро-снаряд” или чрез използване на други стандартни методи, както беше описано погоре. Виж например Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990), Gordon Kamm et al., The Plant Cell 7: 603 (1990), Walters et al., Plant Molec.Biol. 18: 189(1992).

Транскрипцията на гена за авидин след интродуциране в растителната тъкан предпочитано се контролира от конституитивен промотор, който стимулира неспецифично генната експресия в растителните тъкани. Един пример за конституитивен промотор, подходящ за тази цел е убиквитиновия промотор, както бе описано

supra.

Транскрипцията на гена за авидин може също така да се контролира от промотор, който стимулира генната експресия по тъканно-специфичен начин. Особено предпочитан пращникспецифичен промотор е промоторът S126, който е изолиран от царевична инбредна линия В73. Промоторът S126 стимулира експресията на чужди гени от прашници в стадий четвъртична- до едноядрена микроспора.

Друг подходящ прашник-специфичен промотор е SGB6 промотора, който също е изолиран от линия В73. Промоторът SGB6 може да индуцира експресията на чужд ген в други тапетни клетки от прашника в стадий четвъртична- до средна едноядрена фаза от развитието на микроспората.

Алтернативно, прашник-спицифичната генна експресия може да се осигури с помощта на комбинация на друга прашникова касета и същински промотор. Особено предпочитана прашникова касета е прашниковата касета на S126 която представлява следната нуклеотидна последователност:

5’ GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC

CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG

TTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3’[SEQ ID NO: 4] AAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA

Друга подходяща прашникова експресионна касета, е разположена на ДНК фрагмент от 94 базови двойки, от нуклеотид 583 до 490, в посока нагоре от началото на транскрипцията на SGB6. Нуклеотидната последователност на 94-те базови двойки от SGB6 прашниковата експресионна касета е:

(-583) ACAGTTCACT AATTGCTGCT

TGTCAAGTGA

TTAACGACGA

AGATATGCAT

TCTATACGTA

GATCTTTAAC

CTAGAAATTG

GGATTGTGCG

GTT ТСТТ ТТ G

GCACAAATGG

CATGAACAGA

CCTAACACGA CAAAGAAAAC CGTGTTTACC G TACTTG

ТСТ

GTAATCCGGG ACGC (-490) [SEQIDNO.5] CATTAGGCCC TGCG

Алтернативно, друга подходяща прашникова експресионна касета е получена от промотора G9 от царевица, който стимулира генната експресия по време на стадий мейоза до стадий една четвърт от развитието. G9 прашниковата касета съдържа следната нуклеотидна последователност:

5’

GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA CGCCGGCGCC TAGGTCCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCT

AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTAGTTGGCG CCTGTCACCC ТСТТТТТТТТ TAACAACGTA CATCAACCGC GGACAGTGGG [SEQ ID NO : 6]

TCACGAACGT AGATCT 3’

AGTGCTTGCA TCTAGA

Прашниковите касети S126, SGB6 и G9 могат да се получат чрез синтезиране на олигонуклеотиди, както беше описано по-горе.

Всеки с достатъчен опит в съответното ниво на техниката знае, че може да се проведе делеционен анализ за локализиране на една или повече прашниково специфични регулаторни последователности в рамките на описаните тук касети. Такива “функционални фрагменти” от прашниковите касети могат също така да се използват за регулиране на експресията на гена за авидин по начин, специфичен за прашинка.

Предпочитаните същински промотори произхождат от S126 същинския промотор, SGB6 същинският промотор и G9 същинският промотор и същинският промотор от S3 5 мозаечния вирус по карфиола.

Особено предпочитан същински промотор е S126 същинския промотор, който включва следните нуклеотидаи последователности:

5’ AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCAGT СТССТААТТС TCTAGATTCA ТТССАТАТАТ ACACGTCT GAGGATTAAC

ТТСАТСТТСА ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTAC AAGTAGAACT TGGACATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATG

САСТСТТТСС ТТССТТССТТ ССТТСААТТС ТАААТАССАС GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTG

AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3’ [SEQIDNO :7] TTT AGTTT СА AGCAAACGGT AC

Същинският промотор SGB6 се състои от горните 38 нуклеотида, разположени в посока нагоре от мястото за начало на транскрипцията на гена SGB6. Подходящият същински промотор SGB6 има следната нуклеотидна последователност:

5’ АТСТСАСССТ ATTAATACCA TGCTGACGAG

TAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGACTGCTC

CCAATAGC 3’ [SEQ ID NO : 8]

GGTTATCG

Подходящият същински промотор, произхождащ от гена G9, съдържа нуклеотидната последователност:

5’ AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTT TCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAA

CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCAT GTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTA

ACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 3’ [SEQIDNO;9] TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC

Подходящи същински промотори могат да се получат от функционални фрагменти от същинските промотори S126, SGB6 и G9. Методите за получаване на такива функционални фрагменти са описани по-горе.

Кръгозорът на експресията на авидин може да бъде разширен чрез употреба на химеричен регулаторен елемент, състоящ се от прашникова касета на един ген и от прашник-специфичен промотор от втори ген. Например, SGB6 регулаторната последователност стимулира генната експресия от стадий една четвърт до среден едноядрен стадий на развитие, докато G9 регулаторните последователности стимулират генната експресия по време на мейозата и през четвъртичния стадий от развитието. Освен това комбинацията от SGB6 прашникова касета и промотор от G9 стимулира транскрипцията на чужди гени по време на мейозата и през среден едно-ядрен стадий на развитие. По този начин, различните комбинации от прашникови касети и прашникспецифични промотори са особено полезни за настоящето изобретение.

Може да се използва и вирусен същински промотор. Примери за подходящи вирусни същински промотори включват същинския промотор от мозаечен вирус по карфиола (CaMV), същинския промотор от мозаечен вирус по гърлицата и други подобни, Gruber et al., supra. За предпочитане е вирусният същински промотор да бъде CaMV 35S същинския промотор или негов вариант.

С цел да се подберат трансформирани клетки, всеки експресионен вектор съдържа селективен маркерен ген, като например ген за устойчивост на хербициди. Например, такива гени могат да придават устойчивост на фосфинотрицин, глифозат, сулфонилурея, атразин или имидазолин. За предпочитане е, селективният маркерен ген да бъде гена bar или гена pat, които кодират фосфинотрицин ацетилтрансфераза. Нуклеотидната последователност на гена bar може да бъде открита в Leamans et al., Заявка за Европейски патент № 0-242-246 (1987) и във White et al., Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990), Wohlleben et al., Gene 70: 25 (1988), включени тук като нуклеотидна последователност на гена pat. Bar или pat генната експресия придава устойчивост към такива хербициди като глюфозинат (продаван като Basta® и Ignite®, между останалите) и биалафос (продаван като Herbi-ace® и Liberty®).

Всеки експресионен вектор може да съдържа ДНК последователност, кодираща авидин под контрола на конституитивен промотор или прашник-специфичен промотор, както и селективен маркерен ген под контрола на конституитивен промотор. Обратно, селективният маркерен ген може да се достави на клетката гостоприемник с помощта на отделен селекционен експресионен вектор чрез “ко-трансфопмация” на ембрионна тъкан.

Б. Възстановяване на мъжката фертилност в F1 хибрид.

По-горе описаните методи могат да се използват за получаване на трансгенни мъжко-стерилни растения за получаване на F1 хибриди в голям мащаб, чрез директни кръстоски между имбредни линии. Ако всички яйцеклетки от трансгенните мъжко-стерилни растения не съдържат рекомбинантен ген за авидин, тогава част от F1 хибридите ще има мъжко-фертилен фенотип. От друга страна, F1 хибридите ще имат мъжко-стерилен фенотип ако рекомбинантен ген за авидин е наличен във всички яйцеклетки на трансгенните мъжкостерилни растения. По този начин, може да се окаже желателно да се използва мъжко-стерилна система за възстановяване, за да се осигури производство на мъжко-фертилни F1 хибриди. Такава система за възстановяване на фертилностга има особена стойност при самоопрапгващите се растения, където продуктът, който се събира като реколта е семето.

Често предлаганият подход за възстановяване на фертилностга в една линия от трансгенни мъжко-стирилни растения изисква производството на втора линия “възстановител” от трансгенни растения. Например, трансгенно растение, което е мъжко-стерилно, поради експресия на барназа, ще се кръстоса с мъжко-фертилно растение, което експресира инхибитор на барназа, като бе описано по-горе. Mariani et al., Nature 357: 384 (1992).

В настоящия случай, подобен подход би изисквал продуциране на линия възстановител от трансгенни растения, които експресират рибозими, насочени към иРНК за авидин или които експресират безсмислен авидин. Например, рибозимите могат да се аранжират така, че да експресират ендонуклеазна активност, насочена към определена последователност - мишена в молекулата на иРНК. Например, Steinecke et al., EMBO J. Il· 1525 (1992), достигат до 100 % инхибиране на експресията на гена за неомицин фосфотрансфераза от рибозими в протопласти на тютюн. Още понаскоро, Perriman et al., Antisense Res. & Devel. 3: 253 (1993), инхибират хлорамфеникол ацетил трансферазната активност в протопласти от тютюн с помощта на вектор, който експресира модифициран рибозим от един вид акула. В контекста на настоящето изобретение, иРНК за авидин осигурява подходящата РНК молекула - мишена за рибозимите.

При подобен подход, фертилността може да се възстанови с употребата на експресионен вектор, съдържащ нуклеотидна последователност, която кодира безсмислена РНК. Свързването на безсмислените РНК молекули към иРНК молекули - мишени води до хибридизационно спиране на транслацията, Paterson et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 74: 4370 (1987). В контекста на настоящето изобретение подходящата безсмислена иРНК молекула би трябвало да има последователност, която е комплементарна на иРНК за авидин. В един предпочитан вариант на изобретението, безсмислената РНК е под контрола на индуцируем промотор. Активирането на този промотор след това позволява възстановяване на мъжката фертилност.

В един допълнително разработен подход могат да се конструират експресионни вектори, в които експресионният вектор кодира РНК транскрипти, способни да промотират Р- опосредствано срязване на иРНК молекули за авидин с РНКаза. Съгласно този подход, може да се конструира външна водеща последователност за направляване на ендогенния рибозим, РНКаза Р, към иРНК за авидин, която след това ще се среже от клетъчния рибозим, Altman et al., U.S. Patent No 5, 168,053; Yuan et al., Science 263: 1269 (1994). Предпочитано външната водеща последователност се характеризира с това, че включва десет до петнадесет нуклеотида, комплементарни на иРНК за авидин и 3’NCCA нуклеотидна последователност, където N е предпочитано пурин. Id. Транскриптите на външната водеща последователност се свързват с иРНК - мишена от вида чрез образуване на основни двойки между иРНК и комплементарната външна водеща последователност, като по този начин промотират срязването на иРНК чрез РНКаза Р в нуклеотида, локализиран в 5’ позиция на сдвоения район. Id.

При един алтернативен метод за възстановяване на мъжка фертилност, трансгенните мъжко-стерилни растения съдържат експресионен вектор, който в допълнение към промоторната последователност, оперативно свързана с ген за авидин, съдържа също така и прокариотен регулаторен елемент. Произвеждат се трансгенни мъжко-фертилни растения, които експресират прокариотен полипептид под контрол на този промотор. В F1 фибридите, прокариотният полипептид се свързва с прокариотната регулаторна последователност и репресира експресията на авидин.

Например, системата ген LexA / Lex А оператор може да се използва за регулиране на генната експресия, съгласно настоящето изобретение. Виж U.S. Патент № 4,833,080 (“ ‘080 патент) и Wang et al., Mol. Cell. Biol., 13: 1805 (1993). По-специално, експресионният вектор от мъжко стерилното растение ще съдържа операторната последователност на LexA, докато експресионният вектор ва мъжкофертилното растение ще съдържа кодиращата последователност на репресора на LexA. В хибридите F1 репресорът LexA ще се свързва с операторната последователност на LexA и ще инхибира транскрипцията на гена за авидин.

Операторните ДНК молекули LexA могат да се получат например чрез синтезиране на ДНК фрагменти, които съдържат добре известна LexA операторна последователност. Виж например

060 патент и Garriga et al., Mol. Gen Genet. 236: 125 (1992). LexA генът може да се получи чрез синтезиране на ДНК молекула, кодираща репресор за LexA. Техниките за синтезата на гени са дискутирани по-горе и последователностите на гена LexA са описани, например от Garrige et al., supra. Обратно, ДНК молекули, кодиращи LexA репресор може да се получат от плазмид pRB500, Американска колекция за типови култури, входящ номер 67758.

Тези, достатъчно опитни в тази област на техниката, могат лесно да аранжират други стратегии за възстановяване на мъжка стерилност с помощта на прокариотни регулаторни системи, като например lac репресор / lac оперон системата или системата trp репресор / trp оперон.

Един друг метод за възстановяване на фертилността използва високия афинитет на авидин за биотин, чрез пръскане на развиващи се растения с разтвор на биотин. Разтворът на биотин може да съдържа минимално количество от органичен разтворител като напр. DMSO за осигуряване на пълна разтворимост на биотина. Обаче, биотиновият разтвор може да не съдържа органичен ко-разтворител. Пръскането може да започва още през мейотичната фаза от развитието на полена. Пръскането може да започва и по-късно с развитието на полена. Пръскането обикновено се повтаря през равномерни интервали докато се образува поленова обвивка. Интервалите между отделните пръскания ще варират от 1 до 7 дни. В един предпочитан вариант на изобретението пръскането се повтаря всеки 3 до 5 дни.

6. Производство на хибридни семена с желани качества на зърното.

Хибридни семена с едно или повече желани качества на зърното или семето могат да бъдат произвеждани с предимство с

помощта на мъжко стерилни растителни линии, съгласно настоящето изобретение. Една трансгенна линия, носеща гена за авидин се кръстосва като мъжко стерилна женска родителска линия с мъжко фертилно растение опрашител, което носи един или повече гени за желано качество на зърното или семето. Мъжко фертилната растителна линия опрашител за предпочитане е да е хомозиготна по гена(ите), контролиращи желаното качество на семето или зърното. С помощта на този метод се произвеждат хибридни семена, притежаващи желаното качество на семето или зърното и след това се събират. Методът за производство на хибридни семена, в които мъжко стерилната родителска линия се кръстосва с мъжко фертилна линия опрашител, носеща един или повече гени за желано качество на зърното или семето, понякога се нарича метод на връхно кръстосване. Виж например Американски патент № 5, 196, 636, който е включен тук като литературен източник.

Мъжко стерилните и мъжка фертилните линии, кръстосани за да се образуват хиридни семена, съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат всяка съвместима комбинация от хибридна, инбредна или синтетична линии. Една трансгенна линия, носеща гена за авидин, оперативно свързан с конституитивен или индуцируем промотор, се произвежда с помощта на методите, описани по-горе. Мъжко стерилната линия може да носи едно или повече копия на гена за авадин.

Една трансгенна мъжко стерилна линия, която носи гена за авидин, може да бъде опрашена чрез подтискане на мъжката стерилност по един от методите, описани по-горе. Например, рибозимите могат да бъдат аранжирани така, че да експресират ендонуклеазна активност, насочена към определена последователност - мишена в молекулата иРНК за авидин. Генът,

кодиращ рибозим, оперативно е свързан с индуцируем промотор. Мъжко стерилно растение се третира с индуктор, рибозимът се експресира и иРНК за авидин се инактивира, което води до възстановяване на мъжката фертилност. Алтернативно, фертилностга се възстановява с употребата на нуклеотидна последователност, която кодира безсмислена РНК. Свързването на безсмислената РНК молекула към иРНК молекули - мишени води до хибридизационно задържане на траслацията. В контекста на настоящето изобретение, подходяща безсмислена РНК молекула би имала последователност, комплементарна на иРНК за авидин. В предпочитан вариант на изобретението безсмислената РНК е под контрола на индуцируем промотор. Активирането на този промотор след това позволява възстановяване на мъжката фертилност.

При един друг алтернативен подход РНК транскриптите, способни да промотират Р-опосредствано срязване с РНКаза на молекулите иРНК за авидин, се образуват в мъжко стерилна линия. В съответствие с този подход, външна водеща последователност може да се конструира за насочване на ендогенен рибозим, РНКаза Р, към иРНК за авидин, която след това се срязва от клетъчните рибозими. Транскриптите на външната водеща последователност се свързват към иРНКи - мишени с образуването на базови двойки между иРНК и комплементарната външна водеща последователност, като по този начин промотират срязването на иРНК от РНКаза Р в нуклеотида, локализиран в 5’ края на района от сдвоени бази.

При един друг подход за възстановяване на мъжката фертилност, се образуват трансгенни мъжко стерилни растителни линии, които съдържат експресионен вектор, който в допълнение на промоторната последователност, оперативно свързана с гена за авидин, съдържат също така прокариотен регулаторен елемент.

Произвеждат се трансгенни линии, които съдържат този ген за авидин, заедно с ген, кодиращ прокариотен ген, оперативно свързан с индуцируем промотор. Трансгенната растителна линия се третира с индуктор, за да произвежда прокариотен полипептид, който се свързва с прокариотната регулаторна последователност, репресира експресията на авидин и възстановява мъжката фертилност.

Друг метод за възстановяване на фертилността използва високия афинитет на авидин към биотин. Трансгенни мъжко стерилни линии се пръскат с разтвор на биотин. Биотинът се свързва с авидина и го инактивира, като по този начин възстановява мъжката фертилност. Трансгенни мъжко стерилни линии се пръскат обикновено с биотин точно след отминаване на мейотичната фаза от развитието на полена, въпреки че пръскането с биотин може да се осъществи и по-късно. В един предпочитан вариант на изобретението, подтискането на мъжката стерилност се постига чрез пръскане на растението с биотин.

Мъжко стерилните и мъжко фертилни линии опрашител, използвани за производство на хибридни семена с желани качества на зърното или семето, съгласно методите на настоящето изобретение, са инбредни линии, хибридни линии, синтетични кръстосано опрашващи се линии или генетичен резерв. Инбредните линии, хибридните линии, синтетичните кръстосано опрашващи се линии или генетичния резерв се произвеждат по всеки един от методите, добре известни на опитните растителни селекционери. Виж например J.M.Pehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3^rd ed. (Van Nostrand and Rienhold, New York, NY, 1987), цитирани тук като литературни източници. Тест кръстоските между селекционирани инбредни и/или хибридни линии се провеждат за оценка на

специфичната активност на комбиниране. Търговски приемливите комбинации се идентифицират.

Селекционира се мъжко фертилна растителна линия опрашител, която (1) носи един или повече гени за желано качество на зърното или семето и (2) е съвместима с мъжко стерилна линия, с която ще се кръстоса. Генът(ите), контролиращи селекционираното качество на зърното или семето може да са доминантни, така че качеството да се експресира директно в хибридните семена. Обаче, генът(ите), контролиращи селекционираното качество на зърното или семето може и да са рецесивни. В случай, че генът, контролиращ качеството на семето или зърното, е рецесивен, мъжко стерилната линия и мъжко фертилната линия опрашител се отглеждат така, че да носят качеството като рецесивен белег. В случаи, че генът(ите), контролиращи интересуващото ни качество на зърното или семето са рецесивни, както мъжко стерилната, така и линията опрашител за предпочитане са хомозиготни по гена(ите), така че желаният фенотип се експресира във всички семена, продукт на кръстоската. По аналогичен начин, мъжко стерилните и мъжко фертилни линии опрашител може да носят гени, които контролират качествата на зърното или семето в семената на поколенията си. Генът(ите) за желаното качество на зърното или семето се внедряват в мъжко стерилна линия или в мъжко фертилна линия опрашител чрез методи на традиционната селекция и/или чрез генно инженерни техники.

Желаното качество на зърното или семето е хранителна или физиологична характеристика на семето, която значително повлиява промишления тип, прорастването или устойчивостта на заболявания. Желаното качество на зърното или семето включва такива качества като съдържание на мазнини, белтък или скорбяла, както и качество на белтък или типа скорбяла. Методите, съгласно настоящето

изобретение, се използват за производство на специализирани типове семе или зърно, които се използват на различните пазари. Царевица с високо съдържание на мазнини например, се използва като заместител на животинска мазнина, добавяна към храната на добитъка. Царевица с високо съдържание на амилоза се използва за изготвянето на адхезивни, разградими, пластични покрития и опаковъчни материали. Скорбяла от восъчната царевица се използва в много различни храни, като супи и пудинги.

Мъжко фертилната линия опрашител може да носи един или повече гени, които повлияват качествата на скорбялата и белтъка. Гените, които повлияват качествата на скорбялата и белтъка включват, но не са ограничени до захарност (зах), амилозоудължител (ау), крехкост (кр), матовост (мт), брашненост (бр), непрозрачност (нп), роговидност (рв), повяхване (пх) и восъчност (вс). Виж например, Hannah et al., Sci. Hortic. 55: 177-197 (1993). Качествата на скорбялата, получена от царевични растения, хомозиготно рецесивни по ау, мт, во, ау и ауво са характеризирани. Виж Brockett et al., Starch/Starke 40: 175-177 (1988) и Американски патент № 5, 516, 939.

Алтернативно, линията опрашител може да бъде трансформирана с ген, който повлиява съдържанието на скорбяла. Например, мъжко фертилна линия опрашител може да бъде трансформирана с бактериален ген, кодиращ АДФ-глюкозо пирофосфорилаза, който е активен в присъствие на метаболити, които инхибират растителния ензим. Получените семена имат повисоко съдържание на скорбяла. Веж Sivak et al., J. of Environ. Polymer Degradation 3(3): 145-152 (1995).

Линията опрашител може да носи един или няколко гена, които повлияват съдържанието на мастни киселини. Например, тенът fan 1 контролира ниското съдържание на линоленова киселина в соя. Hammond et al., Crop Sci. 231:192 (1993). Генът fas' контролира високото съдържание на стеаринова киселина в соя, Graef et al., Crop.Sci 25: 1076 (1985). Гените fapl и fap2 контролират ниското съдържание на палмитинова киселина и високото съдържание на палмитинова киселина, съответно в соя, Erickson et al., Crop Sci. 18: 644 (1988).

Линията опрашител може да бъде трансформирана с ген, който повлиява съдържанието на мазнини в семената. Например, една линия опрашител може да носи ген, кодиращ стеароил-ацил носител на белгък(стеарил-АНБ) десатураза, която катализира първата стъпка на ненасищане в биосинтезата на мазнини в семето. Генът за стеарил-АНБ десатураза може да бъде оперативно свързан със специфичен за семето промотор. Растения, такива като слънчоглед, царевица, канола или соя, трансформирани с ген за стеарил-АНБ десатураза, продуцират променени нива на стеаринова киселина и могат да бъдат използвани за производство на семенно масло, съдържащо модифицирани или променени нива на наситени и ненаситени мастни киселини. Виж например, Американски патент № 5,443,974.

Обратно, линия опрашител може да носи безсмислен ген, който инхибира експресията на ген-мишена в биосинтетичния път на качеството на зърното или семето. Например, линия опрашител може да носи безсмислен ген, който инхибира експресията на стеароил-ацил десатураза. Безсмисленият ген може да бъде оперативно свързан със специфичен за семето промотор. Растенията, трансформирани с безсмислен ген за стеароил-АНБ десатураза произвеждат повишени нива на стеарат в семената. Виж например, Knutzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 (1992).

Съотношението на мъжко стерилни към мъжко фертилни родителски семена опрашители, посети в опитно поле, съгласно метода на върхово кръстосване, зависи от генетичните особености на всеки един от родителите и може да варира с цел оптимизиране на добива. Съотношението на мъжко стерилния към мъжко фертилния родител опрашигел варира от около 6:1 до приблизително 9:1. За предпочитане е съотношението на мъжко стерилен към мъжко фертилен родител опрашигел да е приблизително 8:1. Найпредпочитано съотношение на мъжко стерилен към мъжко фертилен родител опрашител е приблизително 9:1.

Настоящето изобретение, описано в общ вид по този начин, ще бъде по-лесно разбрано с разглеждане на следните примери, представени като илюстрация и не ограничаващи настоящето изобретение.

ПРИМЕР 1: Приготвяне на трансгенна царевица с мъжка стерилност чрез висока конституитивна експресия на авидин

Метод за образуване на трансгенни царевични растения е описан в Европейска патентна заявка No. 0 442 174А1, която е тук по - долу инкорпорирана като библиографски източник. Следва кратко описание на този метод.

За формирането на трансгенни царевични растения беше използуван РШ5168 вектор, носещ ген за авидинн, контролиран от убикуитинов промотор и освен това съдържащ PINII терминаторна последователност. Структурата на PHI5168 е показана на фигура 1. PHI610 - експресионният вектор, носещ ген bar, контролиран от двоен 355 промотор и освен това носещ PINII терминаторна последователност, беше сътрансформиран заедно с авидиновата конструкция, позволявайки селекцията на трансгенни растения чрез третиране на трансформационната смес с биалофос. Структурата на РШ610 е показана на Фигура 2. Двата експресионни вектора, бяха трансформирани в суспензия на ембриогенни култури, получени от тип П ембриогенни култури, съгласно метода на Green et al., Molecular Genetics of Plants and Animals, ed. Downey et al., Academic Press, NY, 20, 147 (1983). Културите бяха поддържани на среда Murashige & Skoog (“MS”) съгласно описанието на Mirashige et al., Physio. Plant 15: 453 (1962), в която е добавена 2,4дихлорфеноксиоцетна киселина (2,4-D) в количество 2 mg/Ι и захароза - 10 g/Ι. Суспензията на културата беше филтрувана през сито с размер на отворите 710 pm 7 дни преди експеримента и филтрата беше съхраняван на MS среда.

Клетките бяха отделени от суспензията чрез филтруване на бюхнерова фуния под вакуум (Whatman No. 614) и 100 ml (свежо тегло) клетки бяха поставени в 3.3 cm петриева паничка. Клетките бяха диспергирани в 0.5 ml свежа хранителна среда, така че да се образува тънък слой от клетки. Непокритата петриева паничка беше поставена в камерата за проба на устройство за частичково шприцоване, произведена от Biolistics Inc. (Женева, Ню Йорк). Налягането в камерата беше намалено до 0.1 атмосфери с помощта на вакуум помпа с цел да се намали скоростта на микрочастичките от въздушното триене. Клетките бяха бомбардирани с волфрамови частички със среден диаметър 1.2 цт (GTE Сипвания Група за Прецизни Материали, Пенсилвания). Еквивалентна смес от РШ5168 и РШ610 беше поставена върху микрочастичките чрез добавянето на 5 μΐ от ДНК разтвор (lpg ДНК на 100 lamda) в ΊΈ буфер при pH

7.7 до 25 μΐ от суспензия от 50 mg волфрамови частички на ml

дестилирана вода в Епендорф епруветка от 1.5 ml. Частичките агрегираха и се утаиха в епруветката.

Култури от трансформирани растителни клетки, съдържащи чуждуродни гени бяха култивирани за 4 - 8 седмици на 5GOR (среда) (NG - основна среда с 1 mg/ml биалофос). Тази среда е селективна за клетки, при които се експресира bar гена.

След това, образуването на ембриони беше индуцирано в ембриогенни култури и клетките покълнаха в растения. За покълване на соматичните ембриони наблюдавани на хранителна среда за поддържане на калуси, бяха използувани последователно две хранителни среди. Първоначално калусите бяха прехвърлени на хранителна среда (среда за съзряване), съдържаща 5.0 mg/1 индолоцетна киселина (IAA) за 10 до 14 дни докато продължава процеса на пролиферация на калуса. Нормата на посев на калусите беше 50mg на петриева паничка, за оптимално възстановяването на единица маса от материала.

След това калусите бяха прехвърлени от средата за съзряване на втора хранителна среда, съдържаща намалени нива на IAA (1 mg/Ι) в сравнение с първата хранителна среда. В този момент културите бяха поставени на светлина. Покълващите соматични ембриони бяха охарактеризирани по удължаване на зелената прокарала част със свързан достъп до корените. След това, соматичните ембриони бяха прехвърлени на среда в епруветка за култивиране (150 х 25 mm) за още 10 - 14 дни. В този момент, растенията бяха около 7 -10 cm високи и бяха с достатъчен размер и жизненост, за да бъдат прехвърлени в условия на оранжерия за заякване.

За да заякнат регенерираните растения, растенията които бяха прехвърлени в растежната камера бяха отделени от стерилните съдове и корените бяха промити от твърдата агаризирана среда. Младите растения бяха поставени в търговски саксии в термостат с оросяващо устройство за поддържане на относителна влажност почти 100 % без допълнително намокряне на растителните корени. След 3-4 седмици в оросителния термостат, растенията бяха достатъчно израствали за засаждане в полеви условия.

Растенията при полевия опит бяха анализирани чрез наблюдаване на мъжка стерилност. Селекционираните растения бяха след това анализирани за присъствието в тях на авидинов ген чрез PCR и Southern блотинг и за експресията на авидин чрез ELISA, следвайки стандартни процедури.

Бяха изследвани деветдесет и четири растения чрез PCR, от тях беше установено че 53 са плодовити и 41 стерилни. Когато плодовитостта на всяко растение беше сравнена по отношение присъствието на авидинов ген чрез PCR, беше установено 98 % корелация между присъствието на гена и стерилността на растенията. 5 растения бяха подробно анализирани за наличието на ген за авидин чрез Southern блотинг. Три от растенията показаха, че съдържат ген за авидин при Southern анализа. Всичките три растения показаха стерилност. Двете растения, които не показаха наличието на ген за авидин бяха напълно плодовити. Следователно, съществува 100 % корелация между наличието на ген за авидин и мъжка стерилност.

ПРИМЕР 2: Използуване на щамове Agrobacterium, съдържащи бинарен вектор, включващ ДНК последователност, кодираща авидин за генериране на мъжки стерилни трансгенни соеви растения

Метода за получаване на трансгенни соеви растения е този описан в патентна заявка на САЩ със сериен No. 07/920,409, която е инкорпорирана тук по - долу като библиографски източник. Сови семена (Glycine max) от вариетет Pioneer 9341, са повърхностно стерилизирани чрез експозирането им на газообразен хлор, отделен в стъклен звънчев съд. Газът се образува чрез добавянето на 3.5 ml солна киселина (34 до 37 %) към 100 ml натриев хипохлорит (5.25 % т/т). Експозирането е за 16 до 20 часа в съд с обем приблизително 1 кубичен фут. Повърхностно стерилизираните семена се съхраняват в петриеви панички при стайна температура. Семената покълват след поставянето на 1/10 по сила агарова среда съгласно Gambourg (В5 основна минерална среда с минимално количество органични компоненти, Sigma Chemical, каталожен No. G5893; 0.32 g/1 захароза, 0.2 % (т/об) 2 - (N-морфолино) етансулфонова киселина (MES) (3.0 тМ) без растежни растителни регулатори и култивиране при 28°С, с 16 часова продължителност на деня и осветяване със студена бяла флуоресцентна светлина с приблизително 20 pEm^S'¹. След 3-4 дни, семената се подготвят за съвместно култивиране. Обвивката на семената се отстранява и удължената част се отстранява на 3-4 mm под семеделния лист.

Култури на щам Agrobacterium tumefaciens LBA4404, съдържащи модифицирания бинарен плазмид, включващ ген на авидин, са култивирани до log фаза на минимална среда А съдържаща тетрациклин, 1 pg/ml и е определена оптическата плътност при 550 nm. Достатъчен обем от културата е поставена в 15 ml конична центрофужна епруветка, така че при утаяване са събрани между 1 и 2 хЮ¹⁰ клетки във всяка епруветка с 10⁹ клетки/ml. Утаяването беше постигнато чрез центрофугиране при 6 000 х g за 10 min. След центрофугиране, супернатантата е отдекантирана и епруветките са съхранявани на стайна температура до използуване на инокулума, но не повече от 1 час.

Инокулирането е проведено в отделни партиди по такъв начин, че всяка петриева паничка със семена е третирана с прясно ресуспендирана пелета от Agrobacterium. Бактериалните пелети са ресуспендирани индивидуално в 20 ml среда за инокулация, съдържаща В5 соли (G5893), 3.2 g/Ι; захароза, 2 % (т/об.); 6бензиламинопурин (ВАР), 45 μΜ; индолмаслена киселина (IBА), 0.5 μΜ; ацетосирингон (AS), 100 μΜ; буферирана до pH 5.5 с MES 10 μΜ. Ресуспендирането е постигнато на вортекс. След това инокулумът е поставен в петриева паничка съдържаща подготвените семена и семеделните разклонения, обработени с хирургически скалпел. Това е придружено от разделяне на семената на две части по надлъжната секция през израстващия връх, запазвайки двата цели семедела. Двете половини на връхната част са след това разрушени спрямо техните съответни семедели чрез отделяне със хирургически скалпел. Семеделните разклонения са след това надробени с хирургически скалпел чрез многократно разрязване по дължината на остта на симетрия. Особено внимание се обръща да не се разреже експланта през аксиалната страна. Растенията се подготвят приблизително 5 min и след това се инкубират за 30 min с бактериите при стайна температура без разбъркване. След 10 min зародишите се прехвърлят в петриеви панички със същата среда, втвърдена с гелрит (Merck & Company Inc.), 0.2 % т./об. Експлантите се поставят с адаксиалната част нагоре и подравняват с повърхността на средата и се култивират при 22°С за 3 дни при осветяване със студена флуоресцентна светлина, приблизително 20 pErn^S¹.

След 3 дни, експлантите са прехвърлени на течна селекционна среда, съдържаща В5 соли (G5893), 3.2 g/Ι; захароза, 2 % (т/об.);

ВАР, 5 μΜ; IBA, 0.5 μΜ; ванкомицин 200 Hg/ml; цефотаксим 500 μβ/πύ; буферирана до pH 5.7 с MES 3 тМ. Експлантите са промити във всяка петриева паничка с постоянно слабо спираловидно разклащане при стайна температура за 4 дни. Селекцианната среда се подменя 4 пъти.

Експлантите след това са поставени в твърда агарозна селекционна среда, съдържаща: В5 соли (G5893), 3.2 g/l; захароза, 2 % (т/об.); ВАР, 5 μΜ; IBA, 0.5 μΜ; канамицин сулфат 50 μg/ml; ванкомицин 100 μg/πll; цефотаксим 30 μg/ml; тиментин 30 pg/ml;

Ф буферирана до pH 5.7 с MES 3 шМ. Селекционната среда е втвърдена със Seakem агароза, 0.3 % т/об. Експлантите са поставени в средата, адаксиалната страна е надолу и са култивирани при 28°С, при продължителност на деня 16 часа на осветление с бяла студена флуоресцинтна светлина с 60 - 80 рЕт S'.

След 2 седмици експлантите са отново промити с течна среда на спираловиден шутелапарат. Промиването е проведено в продължение на една нощ в селекционна среда, съдържаща канамицин сулфат, 50 pg/ml. На следващия ден, експлантите са прехвърлени на агарозна селекционна среда. Те са поставени в петриеви панички, като адаксиалната страна е надолу и култивирани в продължение на 2 седмици.

След един месец на селекционна среда, трансформираната тъкан се вижда като зелен сектор от регенерираща се тъкан срещу • фон от обезцветена нездрава тъкан. Експлантите без зелени сектори ; са отстранени, а експлантите със зелени сектори са прехвърлени на ί; среда за нарастване, съдържаща В5 соли (G5893), 3.2 gA; захароза, 2 % (т/об.); DBA, 3.3 μΜ; гиберилинова киселина 1.7 μΜ; ванкомицин 100 μg/ml; цефотаксим 30 μg/ml; тиментин 30 μg/ml; буферирана до pH 5.7 с MES 3 тМ. Средата за нарастване е втвърдена с герлит 0.2 % т/об. Зелените сектори са поставени в петриева паничка с адаксиалната страна нагоре и култивирани както беше описано по горе. Култивирането е продължено на тази среда с прехвърляне на свежа хранителна среда всеки две седмици. Когато стръкчетата достигнат 0.5 cm дължина, те са отрязани в основата и поставени в среда за развиване на корените в 13 х 100 ml епруветки. Средата за коренообразуване съдържа В5 соли (G5893), 3.2 g/Ι; захароза, 15 g/1; никотинова киселина 20 μΜ; ΙΒΑ, 10 μΜ; и пироглутаминова киселина (PGA) 900 mg/l. Средата за коренообразуване е буферирана до pH 5.7 с MES 3 тМ и втвърдена с герлит 0.2 % т/об. След 10 дни стръкчетата са прехвърлени на същата хранителна среда без IBA и PGA. Стръкчетата са вкоренени и съхранявани в същите епруветки при същите условия на околната среда както и преди.

Когато кореновата система е добре развита, малките растения са прехвърлени върху стерилна почва. Температурата, фотопериода и интензивността на осветяване са същите както гореописаните.

Експресията на авидин в трансгенните соеви растения е потвърдена и количествено определена чрез ELISA, и присъствието на гена е потвърдено чрез PCR и Southern блотинг. Стабилността на експресията може да бъде оценена чрез същите тези методи и в следващите поколения. Установено е, че стерилността корелира с експресията на авидин в соята.

ПРИМЕР 3: Получаване на мъжки стерилни слънчогледови растения чрез експресията на авидин.

Експресианна касета кодираща авидин е използувана за генерирането на трансгенни слънчогледови растения и семена. ДНК

последователността, кодираща авидин е инсертирана в експресионна касета под контрола на убикуитинов промотор. Тази експресионна касета е след това субклонирана в бинарен вектор като PHI 5765, използувайки EcoRI сайт. Бинарния вектор е след това прехвърлен в помощен щам Agrobacterium tumifaciens.

Слънчогледовите растения са трансформирани със щам Agrobacterium LBA4404 след микрочастичково бомбардиране както е описано от Bidney et al., Plant Mol. Biol. 18:301 (1992). Накратко, семена от слънчогледова линия Pioneer SMF-3 са изчистени от шушулките и повърхностно стерилизирани. Семената се оставят да набъбнат на тъмно при 26°С за 18 часа върху филтърна хартия, навлажнена с вода. Семеделните листа и корените са отстранени и меристемните експрланти са култивирани на 374 BGA среда (MS соли, Shephard витамини, 40 mg/l, аденин сулфат, 3 % захароза, 0.8 фитагар, pH 5.6 плюс 0.5 mg/l ВАР, 0.25 mg/l IAA и 0.1 mg/l GA). Двадесет и четири часа по - късно, първичните листа са отстранени, за да се експозира апикалния меристем и експлантите са поставени с апикалния свод сочещ нагоре в 2 cm кръг в центъра на 60 mm до 20 mm петриева паничка, съдържаща воден агар. Експлантите са бомбардирани двукратно с волфрамови частици, суспендирани в ТЕ буфер, или с частици асоциирани с експресионния плазмид, съдържащ ген за авидин. Меристемните експланти са съвместено култивирани на 374 BGA среда на светлина при 26°С допълнителни за 72 часа.

Третираните с Agrobacterium меристеми са прехвърлени след часовия период на съвместно култивиране на среда 374 (374BGA с 1 % захароза без ВАР, IAA GA3) и към нея е добавен 250 pg/ml цефотаксим. Малките растения са оставени да се развият в продължение на 2 седмици при 16 часов ден и температура 26°С до образуването на зелени или обезцветени растения. Младите растения са прехвърлени на среда, съдържаща канамицин и са оставени да порастват. Присъствието на авидин в средата е потвърдено и количествено определено както е описано в Пример 2. Установено е, че стерилността корелира с експресията на авидин в растенията.

Въпреки, че гореспоменатото се отнася до определени методи, очевидно е, че настоящото изобретение не е ограничено само до тези примери. Очевидно е за всеки с познания и умения съгласно съществуващото ниво на техниката, че могат да бъдат направени различни модификации на описаните методологии и, че такива модификации се възнамерява де се считат в обхвата на настоящото изобретение, което е дефинирано от следните патентни претениции. Всички публикации и патентни заявки, споменати в тази спесификация са примерни за онези с опит и познания в съществуващото ниво на техниката, за които изобретението е предназначено.

Claims (18)

1. ПРОМЕНЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ [получени на 25 Ноември 1998 г. (25.11.98) в международното Бюро; оригиналните патентни претенции 1-65 заменени от променени патентни претенции 1 -18 (4 страници)]

   1. Изолирана ДНК молекула, характеризираща се с прашников промотор, оперативно свързан с нуклеотидна последователност, кодираща стрептавидин.
2. 2. Експресионен вуктор, включващ изолираната ДНК молекула, съгласно патентна претенция 1.
3. 3. Трансгенно растение, характеризиращо се с това, че споменатото растение включва експресионен вектор съгласно патентна претенция 2.
4. 4. Трансгенно растение, сагласно патентна претенция 3, характеризиращо се с това, че споменатото растение е селекционирано от група, състояща се от царевица, соя и слънчоглед.
5. 5. Експресионен вектор, съгласно патентна претенция 2, характеризиращ се с това, че нуклеотидната последователност кодираща сигналната последователност, е оперативно свързана със споменатата нуклеотидна последователност, кодираща стрептавидин.
6. 6. Експресионен вектор, съгласно патентна претенция 5, характеризиращ се с това, че сигналната последователност е сигнална последователност за алфа - амилаза от ечемик.
7. 7. Метод за продукцията на трансгенни мъжки стерилни растения, характеризиращ се с въвеждането в растителните клетки на експресионен вектор, включващ промотор съвместим с растението, оперативно свързан с нуклеотидна последователност, кодираща

   _.

   стрептавидин и регенериране на трансгенното растение от споменатите трансформирани клетки, като споменатия промотор контролира експресията на споменатия ген и споменатата генна експресия предизвиква мъжка стерилност на споменатото трансгенно растение.
8. 8. Метод за използуването на ген за стрептадивин за продукцията на хибридни растения с мъжка стерилност, характеризиращ се със следните етапи на:

   (a) продукция на първо родителско растение с мъжка стерилност, съдържащо ДНК молекула, включваща промотор съвместим с растението, оперативно свързан с нуклеотидна последователност, кодираща стрептавидин, където експресията на споменатия стрептавидин предизвиква мъжка стерилност;

   (b) продукцията на второ родителско трансгенно растение, в което е експресиран втори чуждероден ген; и (c) кръстосано оплождане на споменатия първи родител със споменатия втори родител за продукцията на хибридно растение, като хибридното растение експресира споменатия втори чуждероден ген и продукта от споменатия втори чуждероден ген намалява експресията на стрептавидин в споменатото хибридно растение, като по този начин продуцира мъжко плодовито хибридно растение.
9. 9. Метод съгласно патентна претенция 8, характеризиращ се с това, че вторият чуждероден ген е селекциониран от група състояща се от безсмислен ген, рибозимен ген и външен ген направляващ последователност.
10. 10. Метод съгласно патентна претенция 8, характеризиращ се с това, че споменатата ДНК молекула от споменатото първо родителско растение допълнително включва LexA оператор, който е оперативно свързан със споменатия промотор и където вторият чуждероден ген е LexA репресорен ген.
11. 11. Метод продукцията на семена, притежаващи желана характеристика на зарната, характеризиращ се със следните етапи на:

    (a) продукция на първо родителско растение, което е с мъжка стерилност и включва нуклеотидна последователност, кодираща стрептавидин, оперативно свързана с промоторна последователност съвместима за растението;

    (b) продукцията на второ родителско растение, което е с мъжка плодовитост и носи един или повече гени, контролиращи споменатата желана характеристика на зърното;

    (c) кръстосано оплождане на споменатия първи родител със споменатия втори родител за получаването на хибридни семена със споменатата характеристика на зълното;

    (фсъбиране на желаните семена.
12. 12. Метод съгласно патентна претенция 11, характеризиращ се с това, че споменатото първо родителско растение е хибридно растение.
13. 13. Метод съгласно патентна претенция 11, характеризиращ се с това, че споменатата характеристика на зърното е селекционирана от група, състояща се от съдържание на мазнини, белтъци и нишесте.
14. 14. Метод съгласно патентна претенция 11, характеризиращ се с това, че споменатите първо и второ растения са селекционирани от група, състояща се от царевица, соя, канола и слънчоглед.
15. 15. Метод съгласно патентни претенции 8 и 11, характеризиращ се с това, че споменатата промоторна последователност съвместима с растението, е специфичен за опрашването промотор, включващ прашникова касета, селекционирана от група състояща се от:

    (a) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDNO.1;

    (b) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDNO.2;

    (c) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от

    SEQIDNO:3;h (ффункционален фрагмент от (а), (Ь) или (с).
16. 16. Метод съгласно патентна претенция 15, характеризиращ се с това, че споменатата прашникова касета притежава нуклеотидна последователност от SEQ ID N0:1, и споменатия специфичен за опрашването промотор, допълнително включва промотор на сърцевина, селекциониран от група състояща се от:

    (a) CaMV 35S промотор на сърцевина;

    (b) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDN0.4;

    (c) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDN0.5;

    (д) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от

    SEQIDNO:6;h (е) функционален фрагмент от (Ь), (с) или (d).
17. 17. Метод съгласно патентна претенция 15, характеризиращ се с това, че споменатата прашникова касета притежава нуклеотидна последователност от SEQ ГО N0:2, и споменатия специфичен за опрашването промотор, допълнително включва промотор на сърцевина, селекциониран от група състояща се от:

    (a)CaMV 35S промотор на сърцевина;

    (b) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDNO:4;

    (c) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDNO:5;

    (фДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от

    SEQIDNO:6;h (е)функционален фрагмент от (Ь), (с) или (d).
18. 18. Метод съгласно патентна претенция 14, характеризиращ се с това, че споменатата прашникова касета притежава нуклеотидна последователност от SEQ ID N0:3, и споменатия специфичен за опрашването промотор допълнително включва промотор на сърцевина, селекциониран от група състояща се от:

    (a) CaMV 35S промотор на сърцевина;

    (b) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDN0:4;

    (c) ДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от SEQIDN0:5;

    (фДНК молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от

    SEQIDN0:6;h (е)функционален фрагмент от (Ь), (с) или (d).