JP4964588B2 - 植物の形質転換および選択 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、木の細胞に外来性遺伝子を形質転換させ、かつそこから安定に形質転換された木を再生するための遺伝子型非依存的方法に関する。特に、本発明は、木の移植片からトランスジェニック植物を形質転換および再生するためのアグロバクテリウム媒介遺伝子形質移入方法を教示する。本明細書に記載される形質転換プロセスは、細胞分裂を刺激する前培養培地、およびシュート発生を加速するシュート生成培地を利用する。この形質転換プロセスから生成される植物が提供される。特に、本発明は、形質転換効率、ならびに選抜されかつ扱いにくいクローンからのシュート再生を増加させるための方法を提供する。本発明はまた、植物、特に森林樹を選択および再生するための培地、方法、およびプラスミドに関する。

背景
植物の遺伝子操作は、商業的に重要な植物種の改善のための大きな潜在能力を提供してきた。近年、木の遺伝子操作が勢いを増し、パルプ産業および材木産業において特定の適用を見い出している。モミジバフウ（Sullivan and Lagrinini 1993）、ヨーロッパカラマツ（Huang et al. 1991）、ユリノキ（Wilde et al. 1992）、および多くのポプラ種（Minocha et al. 1986, Fillatti et al. 1988, De Block 1990,Brasileiro et al. 1992, Tsai et al. 1994）などの種のための、いくつかの確立された木の形質転換系が存在している。ポプラ属の種は木の遺伝子操作のためのモデル系として働く（Kim et al. 1997）。昆虫耐性および除草剤耐性などの種々の形質が、これらの種に操作されてきた（Klopfenstein et al. 1993, De Block 1990）。従って、木の種を遺伝子操作するための潜在能力は、商業的に重要な木の種（ユーカリ（ユーカリ属）を含む）にとって大きい。

ユーカリ植物は、500より多くの種を含む多数の属を有する植物である。ユーカリは、早い成長速度を有し、広範な環境に適合し、かつ昆虫による損傷に対してほとんど感受性を示さない。その例外的な成長特性に加えて、ユーカリ木は、紙産業のための繊維の最大の供給源を提供する。ユーカリなどの広葉樹種からの繊維は、一般的に、マツなどの針葉樹からの繊維よりもはるかに短い。ユーカリから産生されたより短い繊維は、望ましい表面特性（滑らかさおよび明るさを含む）を有するが、低い引き裂きまたは伸長強度を有する、パルプおよび紙の製造を生じる。材木としては、ユーカリは、中程度から高い密度を有する、長い、直線状の材木を提供する。ユーカリの材木は、一般的用途であり；合板およびパーティクルボード産業、家具産業において用途を見い出し；ならびに薪および建設資材の供給源を提供する。

ユーカリの形質転換を実証する大部分の報告は、育種プログラムを通して得られた選抜した遺伝子型よりもユーカリの苗木を使用している。例えば、国際公開公報第99/48355号は、ユーカリプツス・グランディス（E. grandis)およびユーカリプツス・カマルドゥレンシス(E. camaldulensis)の苗木からの若葉の移植片を形質転換するための方法を記載する。たとえこの形質転換方法が成功したとしても、この記載された方法には2つの主要な問題が存在する。第1に、再生プロトコールは、苗木移植片について作用するが、これは選抜した遺伝子型からの移植片には作用しない。第2に、苗木移植片および特許請求された改善を用いた場合でさえ、形質転換効率は、2つの種の子葉移植片およびユーカリプツス・カマルドゥレンシスの胚軸移植片について2.2%以下に制限されている。改善された形質転換および再生のプロトコールは、ユーカリプツス・カマルドゥレンシス苗木について、Ho et al., Plant Cell Reports 17: 675-680(1998)によって記載された；しかし、このプロトコールは、ユーカリプツス・カマルドゥレンシス苗木を用いた場合でさえ、反復可能ではなかった。数千もの移植片が培養され、かつトランスジェニックカルス株が産生されたが、回収されたシュートの数は最小であった。Hartcourt et al. Molecular Breeding 6: 306-315 (2000)は、殺虫性cry3A遺伝子および除草剤耐性bar遺伝子を用いるユーカリプツス・カマルドゥレンシス苗木の形質転換を報告した。5個の除草剤耐性カルス株が50個の苗木に由来する無数の移植片から再生されたが、1個の株は培養中または温室中で繁殖することが困難であり、別の株は逸出植物であることが判明した。さらに、繁殖することが困難であった株は、分子レベルで分析された2つの株のうちの1つであり、単一の挿入を有する唯一の株であった。これらの研究は、トランスジェニックユーカリ植物の回収が可能である場合でさえ、低い形質転換効率が、多くの遺伝子型への所望の遺伝子の送達を妨害することを示す。従って、ユーカリの形質転換および再生の、遺伝子型非依存的な方法についての必要性が継続して存在している。

ユーカリ苗木の微細繁殖は実行されてきたが、デノボシュート再生は、商業的に重要なユーカリ種の選択されたか「選抜された」クローンの代わりに、苗木に限定されてきた。逐次的なラウンドの育種を通して生じる選抜された遺伝子型は、経済的に所望される形質のそれらの組み合わせのために価値がある。導入遺伝子によって付与される所望の形質との成長形質の同時分離を保証するための多数の遺伝子型を必要とする苗木の形質転換とは異なり、選別されたクローンの形質転換は、遺伝子操作された木の種のために効率的かつ有利な系を提供する。選別された遺伝子型は、多数の開始遺伝子型を用いる何年間ものクローンのフィールド試験に基づいて選択され得る。他の迅速に成長する広葉樹種と同様に、形質の比較的正確な予測がユーカリについてなされ得る前に、何年間ものフィールド評価が行われる。それゆえに、苗木が遺伝子操作のために使用される場合、さらにより多くの遺伝子型が、導入遺伝子発現によって付与される所望の形質とともに、成長形質の首尾よい選択のために必要とされる。

ドイツ特許第2298205号(国際公開公報第9625504号)および 欧州特許第1050209号の両方が、トランスジェニックシュートの再生のために主要なサイトカイニンとして1-(2-クロロ-4-ピリジル)-3-フェノキシウレアまたはN-(2-クロロ-4-ピリジル)-N'-フェニルウレア(4-PUまたは4CPPU)の使用を主張している。両方の場合において、抗生物質が選択剤として使用された。国際公開公報第9625504号は、成熟遺伝子型からの移植片の形質転換を実証するが、この発明者らは、形質転換を実証するために、ユーカリプツス・グロブルスおよび ユーカリプツス・ニテンスについての苗木の移植片を使用した。欧州特許第1050209号は、トランスジェニック原基の形成を誘導するために、垂直回転培養系を使用する。形質転換は、成熟木からの活性化された移植片を用いて実証されたが、形質転換効率は、トランスジェニックカルス産生に基づいて計算され、そしてトランスジェニック植物産生についての頻度の表示は存在しなかった。効率的なデノボシュート再生は遺伝子操作のために決定的であるが、商業的に重要なユーカリ種からのクローンの選択のための高度に効率的な再生系を開発するための必要性が存在している。

改善された形質転換系のための必要性に加えて、形質転換された植物を選択するための改善された方法のための必要性が存在する。大部分の植物形質転換プロトコールは、抗生物質選択、選択培地に抗生物質を含めること、および形質転換遺伝子構築物に抗生物質耐性遺伝子を含めることを使用する。共通の選択方法は、選択マーカーとしてnptIIまたはhptII、および選択剤としてカナマイシンもしくはジェネティシン、またはハイグロマイシンをそれぞれ使用する。抗生物質選択は形質転換された細胞を選択するための手段を提供するのに対して、これはいくつかの制限を有する。第1に、トランスジェニック生物への抗生物質耐性遺伝子の組み込みは、トランスジェニック生物から環境に拡散する抗生物質および抗生物質耐性遺伝子に関する広範な関心に起因して、一般市民によって嫌悪されている。第2に、抗生物質選択マーカーは、形質転換された細胞の選択においてのみ機能するので、形質転換された植物に商業的に所望される表現型を提供しない。確かに、抗生物質耐性タンパク質の構成的産生は、これが商業的に所望される表現型から意味のあるバイオマスを転換するかもしれないという点では、形質転換された植物の価値に対して損害を生じるかもしれない。

これらの制限に取り組むために、実施者らは、トランスジェニック植物の産生における使用のためのさらなる選択マーカーを研究してきた。抗生物質選択マーカーの代わりのよく知られている置き換えは、アセト乳酸シンターゼ（ALS）などの酵素をコードする特定の変異体遺伝子によって媒介されるような、除草剤耐性である。ALS酵素は、分枝鎖アミノ酸、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを産生するための植物の生合成経路における最初の共通の工程を触媒する。多数の有効かつ広範に使用される除草剤がALS酵素を標的とし、これには、スルホニルウレア、イミダゾリノン、およびトリアゾロピリミジンが含まれる。

トランスジェニック植物の選択における使用のために利用されてきた別の型の耐性遺伝子は、生成物の構成的過剰発現によって代謝阻害剤を克服する変異体遺伝子を介して、生合成生成物の産生の間に天然のフィードバック阻害を模倣する代謝阻害剤に対して耐性を示す。このような遺伝子の例はアントラニル酸シンターゼ（ASA）であり、これは、トリプトファンの産生における決定的な段階を媒介し、かつ通常トリプトファンによるフィードバック阻害を供する。選択マーカーとして機能することに加えて、このような遺伝子は、生化学的生成物（この場合はトリプトファン）が通常には植物成長に対する限定要因である場合には、トランスジェニック植物に対して所望される成長表現型を付与し得る。

抗生物質ではない選択マーカー遺伝子が、抗生物質耐性マーカーの使用に関連する問題のいくつかを克服するが、抗生物質ではない選択マーカー遺伝子の使用は、植物形質転換のための万能薬ではなかった。これらのマーカーに関連する1つの問題は、高い割合の偽陽性である。従って、実施者は、真の陽性を同定するために多くの形質転換体を評価することを強制される。このような過度のスクリーニングは、トランスジェニック植物を作製することに関連する時間およびコストを非常に増加させる。

従って、形質転換された植物を選択する改善された方法についての必要性が存在する。

従って、ユーカリ細胞を形質転換し、かつ選抜した生殖質のクローンから形質転換された植物を安定に再生する頻度を増加させるための必要性が存在する。

発明の概要
本発明において、木の移植片の少なくとも1つの細胞を外来性DNAで形質転換するための方法が意図され、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で木の移植片を前培養する段階；（ii）この外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階；および（iv）この形質転換された移植片を再生して完全な植物を産生する段階を含む。好ましくは、アグロバクテリウムのインデューサーはアセトシリンゴンであり、このアセトシリンゴンの濃度は約10から約400mg/lまでである。また好ましくは、アセトシリンゴンの濃度は約5から約200mg/lまでであり、培地はさらにオーキシンおよび/またはサイトカイニンを含む。

本発明は、前培養する段階が、アグロバクテリウム形質転換の前に栄養培地上で植物移植片を培養することを含むことを意図する。この前培養培地は、アセトシリンゴンなどのアグロバクテリウムのインデューサーを含む。1つの態様において、この移植片は暗所で約1日間から約6日間まで前培養される。好ましくは、この移植片は約4日間前培養される。1つの態様において、この前培養培地は、任意に、オーキシンおよびサイトカイニンを含む植物生長レギュレーターを含んでもよい。

別の態様において、オーキシンはNAA、2,4-D、IBA、およびIAAからなる群より選択される。1つの態様において、NAA、2,4-D、IBA、およびIAAのいずれか1つの濃度範囲は約0.1mg/lから約10mg/lまでである。好ましくは、この濃度範囲は約0.2mg/lから約5mg/lまでである。より好ましくは、この濃度範囲は約0.2mg/lから約3mg/lまでである。

別の態様において、このサイトカイニンはゼアチン、カイネチン、およびBAからなる群より選択される。1つの態様において、ゼアチン、カイネチン、およびBAのいずれか1つの濃度範囲は約0.25mg/lから約15mg/lまでである。好ましくは、この濃度範囲は約1mg/lから約10mg/lまでである。より好ましくは、この濃度範囲は約1mg/lから約6mg/lまでである。

別の態様において、この移植片は葉、葉柄、節間組織、花組織、胚形成組織、または胚形成培養の少なくとも1つである。

1つの態様において、組織は齢または発生段階から独立して選択される。

別の態様において、この方法は遺伝子型非依存性である。

別の態様において、形質転換された移植片の全ての細胞が外来性DNAを含む。

1つの態様において、移植片はユーカリまたはマツ種からなる群より選択される。

本発明において、トランスジェニックユーカリ植物もまた記載され、ここで、この植物は非キメラトランスジェニック植物である。好ましくは、トランスジェニックユーカリ植物は非キメラユーカリプツス・グランディス、非キメラユーカリプツス・ニテンス、非キメラユーカリプツス・グロブルス、非キメラユーカリプツス・ドゥニー、非キメラユーカリプツス・サリグナ、非キメラユーカリプツス・オシデンタリス、またはこれらの雑種である。

関連する趣旨において、本発明は、非キメラ木を産生するための方法を開示し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を選択する段階；および（iv）この移植片を成長させて非キメラ木を産生する段階を含む。

1つの態様において、この方法は遺伝子型非依存性である。

トランスジェニック木を産生するための方法もまた記載され、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株を用いてこの移植片を形質転換する段階；（iii）形質転換した移植片を選択する段階；および（iv）前記移植片を再生させてトランスジェニック木を産生する段階を含む。

1つの態様において、この方法は遺伝子型非依存性である。

別の態様において、この方法はトランスジェニックユーカリ植物を産生する。

別の態様において、この方法は、除草剤耐性遺伝子および外来性遺伝子を有するトランスジェニックユーカリ植物を産生する。

別の局面において、本発明はトランスジェニックユーカリ植物を提供し、ここでこの植物は、外来性DNAによって安定にトランスフェクトされ、かつこの外来性DNAを子孫に伝達することが可能である。ある態様において、トランスジェニックユーカリ植物はユーカリプツス・グランディスおよびその雑種、ユーカリプツス・ニテンスおよびその雑種、ユーカリプツス・グロブルスおよびその雑種、ユーカリプツス・ドゥニーおよびその雑種、ユーカリプツス・サリグナおよびその雑種、ならびにユーカリプツス・オシデンタリスおよびその雑種である。

別の局面において、本発明は、スルホニル系除草剤およびカゼイン加水分解物様物質を含み、分枝鎖アミノ酸を実質的に含まない植物培地組成物を提供する。

関連する趣旨において、本発明は、トランスジェニック植物を産生するための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤、およびカゼイン加水分解物様化合物を含む培養培地上で選択し、ここで、これらの化合物が分枝鎖アミノ酸を実質的に含まず、かつスルホニルウレアまたはイミダゾリノン選択を妨げない段階；ならびに（iv）この移植片から全植物を再生する段階を含む。

別の局面において、本発明は、トランスジェニックユーカリ植物、ユーカリプツス・オシデンタリスを提供する。ユーカリ植物、ユーカリプツス・ドゥニー、外来性DNAで安定に形質転換された少なくとも1つの細胞から構成されるユーカリプツス・オシデンタリス植物、外来性DNAで形質転換された不稔性ユーカリプツス・ドゥニー、および子孫に外来性DNAを移すことが可能である、安定に形質転換されたユーカリプツス・サリグナ植物もまた記載される。

別の局面において、本発明は、アグロバクテリウムのインデューサーを含む木の前培養培地を提供する。アグロバクテリウムのインデューサーを含むユーカリ前培養培地もまた記載される。

別の局面において、本発明は、木材パルプを得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む前培養培地上で木の移植片を培養する段階；（ii）外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階；（iv）この形質転換された移植片を再生して、完全な植物を産生する段階；および（v）この植物から木材パルプを得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、材木を得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む前培養培地上で木の移植片を培養する段階；（ii）外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階；（iv）この形質転換された移植片を再生して、完全な植物を産生する段階；および（v）この植物から材木を得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、紙を得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む前培養培地上で木の移植片を培養する段階；（ii）外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階；（iv）この形質転換された移植片を再生して、完全な植物を産生する段階；および（v）この植物から紙を得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、オイルを得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む前培養培地上で木の移植片を培養する段階；（ii）外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階；（iv）この形質転換された移植片を再生して、完全な植物を産生する段階；および（v）この植物からオイルを得る段階を含む。

関連する趣旨において、本発明は、木材パルプを得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤、およびカゼイン加水分解物様化合物を含む培養培地上で選択し、ここで、これらの化合物が分枝鎖アミノ酸を実質的に含まず、かつスルホニルウレアまたはイミダゾリノン選択を妨げない段階；（iv）この移植片から全植物を再生する段階；ならびに（v）この植物から木材パルプを得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、材木を得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤、およびカゼイン加水分解物様化合物を含む培養培地上で選択し、ここで、これらの化合物が分枝鎖アミノ酸を実質的に含まず、かつスルホニルウレアまたはイミダゾリノン選択を妨げない段階；（iv）この移植片から全植物を再生する段階；ならびに（v）この植物から材木を得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、紙を得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤、およびカゼイン加水分解物様化合物を含む培養培地上で選択し、ここで、これらの化合物が分枝鎖アミノ酸を実質的に含まず、かつスルホニルウレアまたはイミダゾリノン選択を妨げない段階；（iv）この移植片から全植物を再生する段階；ならびに（v）この植物から紙を得る段階を含む。

別の局面において、本発明は、オイルを得るための方法を提供し、この方法は、（i）アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で移植片を前培養する段階；（ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階；（iii）形質転換した移植片を、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤、およびカゼイン加水分解物様化合物を含む培養培地上で選択し、ここで、これらの化合物が分枝鎖アミノ酸を実質的に含まず、かつスルホニルウレアまたはイミダゾリノン選択を妨げない段階；（iv）この移植片から全植物を再生する段階；ならびに（v）この植物からオイルを得る段階を含む。

本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。この詳細な説明および特定の実施例は、好ましい態様を示すものであるが、例示のみのために与えられる。なぜなら、本発明の精神および範囲内における種々の変更および改変が、この詳細な説明から、当業者には明らかになるからである。さらに、これらの実施例は本発明の原理を実証するものであり、本発明の応用を、先行技術において当業者に対して明白に有用である全ての実施例に対して具体的に例証することは予測できないことである。

発明の詳細な説明
遺伝子型非依存的な木の形質転換のための本発明の方法は、選抜した遺伝子型の形質転換から得られた低い形質転換効率を克服する。その最も広い局面において、本発明の方法は、木の移植片からの形質転換およびシュート再生の効率を増加させることに関する。形質転換効率の増加は、細胞分裂を刺激する培地上で移植片を前培養することによって達成される。形質転換された移植片のシュート再生頻度は、シュート再生を促進する培地上で移植片を培養することによって改善される。

本発明は、トランスジェニック植物を選択するために有用な培地組成物を提供する。この培地は、アミノ酸代謝を変化させる一つまたは複数の選択マーカーで形質転換された任意の植物細胞を培養するために使用され得る。本発明の培地および方法は、トランスジェニック森林樹を選択するために特に有用である。

1つの態様において、この培地は、ALSを標的とする選択剤、および分枝鎖アミノ酸を実質的に含まないカゼイン加水分解物の誘導体を含む。この誘導体はまた、上昇した濃度のグルタミンおよびアルギニンなどのアミノ酸を有し得、これらは、植物組織培養において特定の植物の再生可能な細胞を増殖および維持するために重要なアミノ酸である。

別の態様において、この培地は、アントラニル酸シンターゼを標的とする選択剤としてのトリプトファンアナログ、およびトリプトファンを実質的に含まないカゼイン加水分解物の誘導体を含む。この誘導体はまた、上昇した濃度のグルタミンおよびアルギニンなどのアミノ酸を有することができ、これらは、植物組織培養において特定の植物の再生可能な細胞を増殖および維持するために重要なアミノ酸である。

以下に続く記載において、多数の科学的用語および技術的用語が広範に使用される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学的用語および技術的用語は、本発明が属する当技術分野における当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を共有する。以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。

「背軸」とは、本明細書で使用される場合、葉の下側をいう。

「アグロバクテリウムインデューサー」とは、宿主植物核へのT-DNAの切除および送達を制御する生成物をコードするアグロバクテリウムビルレンス遺伝子の発現を誘導する分子をいう。本明細書において、アグロバクテリウムインデューサーは、前培養培地およびアグロバクテリウム培養培地の両方に加えられる。本発明において、アグロバクテリウムインデューサーには、アセトシリンゴンなどのフェノール化合物が含まれるがこれに限定されない。インデューサーの付加は、アグロバクテリウム感染の頻度および一貫性を改善する。

「アグロバクテリウム媒介形質転換」とは、アグロバクテリウム・ツメフェイシェンスからのTi（腫瘍誘導）プラスミドの使用を通して、DNAが植物細胞のゲノムに安定して挿入される方法である。T-DNAとして知られるTiプラスミドのほんの一部が、宿主植物細胞の核に組み込まれる。または、アグロバクテリウム・リゾゲネスからのRiプラスミドが形質転換のために使用されてもよい。アグロバクテリウム媒介形質転換において、植物導入のために意図される遺伝子またはDNAは、T-DNAのレフトボーダーとライトボーダーの間に配置される。

「抗酸化剤」とは、本明細書で使用される場合、植物移植片からのフェノール性物質の浸出を最小化する化合物をいう。本発明において、アスコルビン酸が抗酸化剤として使用されてもよい。

本明細書において、用語「オーキシン」は、切除した植物組織における細胞分裂を刺激するそれらの能力によって原理的には特徴付けられる植物成長調節剤の1つのクラスを含む。細胞分裂および細胞伸長におけるそれらの役割に加えて、オーキシンは、根の開始を含む、他の発生プロセスに影響を与える。本発明において、オーキシンおよびオーキシン型成長調節剤には、ナフタレン酢酸（NAA）、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、インドール-3-酪酸（IBA）、およびインドール-3-酢酸（IAA）が含まれるがこれらに限定されない。

「カゼイン加水分解物様化合物」とは、カゼイン加水分解物と構造的および機能的に関連している組成物をいう。語句「カゼイン加水分解物様化合物」において、この用語は、カゼイン加水分解物と同様のアミノ酸の組成を有し、かつカゼイン加水分解物と同じ機能を達成するが、一つまたは複数の成分が異なる化合物を示す。例えば、カゼイン加水分解物様化合物は、グルタミンおよびアルギニンなどのアミノ酸の上昇した濃度を有し得、これらは、植物組織培養において特定の植物の再生可能な細胞を増殖および維持するために重要なアミノ酸である。

「クローニングベクター」とは、宿主細胞中で自律的に複製する能力を有する、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの遺伝子エレメントである。クローニングベクターは、外来性DNA配列が決定可能な方向で挿入され得る1つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択のために適切な生成物をコードするマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子には、その生成物が抗生物質耐性または除草剤耐性を付与する遺伝子が含まれる。クローニングベクターへの外来性DNA配列の挿入は、クローニングベクターまたはマーカー遺伝子の本質的な生物学的機能を妨害しない。

「サイトカイニン」とは、組織培養中の細胞分裂およびシュート器官形成を刺激するそれらの能力によって特徴付けられる植物成長調節剤の1つのクラスをいう。本発明において、サイトカイニンには、N⁶-ベンジルアミノプリン（BAP）、N⁶-ベンジルアデニン（BA）、ゼアチン、カイネチン、チアジアズロン（TDZ）、2-イソペンテニルアデニン（2ip）、および4-CPPU（N-(2-クロロ-4-ピリジル)-N'-フェニルウレア）が含まれるがこれらに限定されない。

「誘導体」とは、別の物質に構造的および機能的に関連する物質をいう。語句「カゼイン加水分解物の誘導体」において、この用語は、カゼイン加水分解物と同様のアミノ酸の組成を有し、かつカゼイン加水分解物と同じ機能を達成するが、一つまたは複数の成分が異なる化合物を示す。例えば、カゼイン加水分解物の誘導体は、典型的なカゼイン加水分解物よりもより多くのアルギニンおよび/またはより少ないバリンを有する可能性がある。

本明細書で使用される場合、「選別された遺伝子型」とは、逐次的な育種プログラムを通して得られかつ選択された商業的に重要な遺伝子型をいう。

用語「移植片」とは、形質転換のための標的である植物組織をいう。好ましい移植片は、インビボおよび/またはインビトロで生育された植物からの葉、葉柄、花組織、節間組織、および胚形成組織を含む。

用語「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。例えば、1つの遺伝子の発現は、mRNAでのDNA配列の転写、および一つまたは複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を含む。生成されるRNAは、タンパク質もしくはポリペプチドをコードしてもよいし、またはRNA干渉もしくはアンチセンス分子をコードしてもよい。

「発現ベクター」とは、宿主細胞中で発現される遺伝子配列を含む遺伝子エレメントである。典型的には、遺伝子配列の発現は、構成的および誘導性プロモーター、組織優先的調節エレメント、およびエンハンサーを含む、いくつかの調節エレメントによって制御される。このような遺伝子は、調節エレメントに対して「作動可能に連結される」といわれる。

「外来性DNA」とは、別の種または関心対象の種から単離され、かつ同じ種に再導入されるDNAである。このDNAは、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、DNAフラグメントなどであり得る。

「遺伝子」とは、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写され、次いでポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳される遺伝可能なDNA配列である。

「非キメラトランスジェニック植物」とは、本質的に全ての細胞が形質転換され、かつ外来性DNAが子孫に移される形質転換事象の生成物である。

「作動可能に連結される」とは、植物細胞中でそれらが組み合わせて適切に機能するような様式で、2つ以上の分子を組み合わせることを説明する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが構造遺伝子の転写を制御する場合に、その構造遺伝子と作動可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、「植物」とは、特徴的に、胚を産生し、葉緑体を含み、およびセルロース細胞壁を有する、植物界の種々の光合成性の、真核生物の、多細胞生物のいずれかである。植物の一部として、植物組織が、トランスジェニック植物を産生するために、本発明の方法に従って処理され得る。多くの適切な植物組織が、本発明の方法に従って形質転換され得、その組織には、不定胚、花粉、葉、茎、カルス、匍匐枝、微小塊茎、およびシュートが含まれるがこれらに限定されない。従って、本発明は、被子植物および裸子植物、例えば、芝草、コムギ、トウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、テンサイ、ジャガイモ、トマト、タバコ、アルファルファ、レタス、ニンジン、イチゴ、キャッサバ、サツマイモ、ゼラニウム、ダイズ、オーク、マツ、モミ、アカシア、ユーカリ、ウォルナット、およびヤシの形質転換を想定する。本発明に従って、植物組織はまた植物細胞を含む。植物細胞は、懸濁培養、カルス、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、種子、および小胞子を含む。植物組織は、成熟の様々な段階にあってもよく、そして液体もしくは固体培養において、またはポット、温室、もしくはフィールド中の土もしくは適切な媒体中で生育させてもよい。植物組織はまた、有性的に生成されたかまたは無性的に生成されたかに関わらず、このような植物、種子、子孫、珠芽の任意のクローン、およびこれらのいずれかの子孫、例えば、切り枝または種子をいう。特に関心対象のものは、マツ、モミ、およびトウヒなどの針葉樹、ケンタッキーブルーグラス、コヌカグサ、トウモロコシ、およびコムギなどの単子葉植物、ユーカリ、アカシア、アスペン、モミジバフウ、ポプラ、ワタ、トマト、レタス、シロイヌナズナ、タバコ、およびゼラニウムなどの双子葉植物である。

「植物プロモーター」とは、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞中で転写を開始することが可能であるプロモーターである。例示的な植物プロモーターには、植物、植物ウイルス、および植物細胞中で発現される遺伝子を含むアグロバクテリウムまたは根粒菌などの細菌から得られるものが含まれるがこれらに限定されない。発生的制御下のプロモーターの例には、葉、根、または種子などの特定の組織中での転写を優先的に開始するプロモーターが含まれる。このようなプロモーターは、組織優先的プロモーターといわれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、組織特異的プロモーターといわれる。細胞型特異的プロモーターは、一つまたは複数の器官、例えば、根または葉の維管束細胞における特定の細胞型において主として発現を駆動する。誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターは、環境的な制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによって転写がもたらされ得る環境条件の例には、光の存在下での嫌気的条件が含まれる。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターは、大部分の環境条件下で、かつ大部分の植物の部分で活性であるプロモーターである。

「前培養培地」とは、本明細書で使用される場合、植物移植片がアグロバクテリウムを用いる形質転換の前にその上で培養され、かつ形質転換効率および植物再生を増加させるために必要とされる栄養培地である。前培養培地は、アグロバクテリウムのインデューサー、例えば、アセトシリンゴンを含む。前培養培地は、オーキシンおよびサイトカイニンを含む、植物成長調節剤を任意に含んでもよい。

子孫：本発明の「子孫」、例えば、トランスジェニック植物の子孫は、植物またはトランスジェニック植物から生まれ、これらから生じ、またはこれらから派生するものである。従って、「子孫」植物、すなわち、「F1」世代植物は、本発明の方法によって産生されるトランスジェニック植物の子または子孫（offspring or descendant）である。トランスジェニック植物の子孫は、その細胞ゲノム、本明細書に記載される方法によって親のトランスジェニック植物の細胞に組み込まれた所望のポリヌクレオチドの少なくとも1つ、そのいくつか、またはその全てを含み得る。従って、所望のポリヌクレオチドは、子孫植物によって「伝達される」かまたは「遺伝される」。子孫植物においてこのように遺伝される所望のポリヌクレオチドは、その親からの子孫植物によってまた遺伝されるT-DNA構築物中に存在してもよい。用語「子孫」はまた、本明細書で使用される場合、植物の群の子または子孫であると見なされることが可能である。

「シュート再生培地」とは、トランスジェニックシュートを再生するために設計された本発明の培地である。このシュート再生培地は、無機塩、アミノ酸およびビタミンの混合物、抗酸化剤、有機窒素、および植物成長調節剤を含む。

「不定胚形成」とは、配偶子融合の産物として以外の植物性かつ体細胞性組織から胚が発生する、クローン性増殖の方法である。

「安定に形質転換される」とは、外来性DNAを子孫に伝達することが可能であるトランスジェニック植物をいう。

「構造遺伝子」とは、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写され、次いで特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列に翻訳されるDNA配列である。

「実質的に含まない」とは、第2の化合物からの、第1の化合物の相対的な非存在をいう。この用語は、第1の化合物の10%、5%、4%、3%、2%、1%未満、または0%の第2の化合物が検出され得ることを示す。

「トランスジェニック植物」とは、外来性DNAを含む植物である。本発明において、トランスジェニック植物はアグロバクテリウム媒介形質転換に由来する。好ましくは、このトランスジェニック植物は、稔性でありかつ有性生殖を通して子孫植物に外来性DNAを伝達することが可能である。

転写および翻訳のターミネーター：本発明の発現DNA構築物は、典型的には、転写開始調節領域から反対の末端にある転写終結領域を有する。この転写終結領域は、発現を増強するためのmRNAの安定性のために、および/または遺伝子転写産物に付加されるポリアデニル化テールの付加のために選択されてもよい。

「木」とは、本明細書で使用される場合、木質部中心を蓄積する任意の多年生植物をいう。木には、被子植物種および裸子植物種が含まれる。木の例には、ポプラ、ユーカリ、ベイマツ、マツ、シュガーおよびモンテレー、ナッツの木、例えば、ウォルナットおよびアーモンド、果物の木、例えば、リンゴ、プラム、シトラス、およびアプリコット、ならびに広葉樹の木、例えば、アッシュ、カバノキ、オーク、およびチークが含まれる。特に関心対象のものは、針葉樹、例えば、マツ、モミ、スプルース、ユーカリ、アカシア、アスペン、モミジバフウ、およびポプラである。

本発明は、木移植片を形質転換するため、およびそこからトランスジェニック子孫を生成するための遺伝子型非依存性方法を提供する。本発明の方法は、アグロバクテリウムインデューサーの存在下における木の移植片の前培養を意図する。本発明の方法はさらに、アミノ酸、ビタミン、植物成長調節剤、グルコース、および抗酸化剤を含むシュート再生培地上での形質転換された移植片を培養することをさらに想定する。

本発明の方法は、ユーカリ移植片の形質転換およびシュート再生の遺伝子型非依存性方法を提供する。任意のユーカリ移植片が本発明の方法によって形質転換され得、これには、天然の環境中で生育されたユーカリ木およびクローン的に繁殖されたユーカリ移植片が含まれる。この移植片は、任意のユーカリ種から選択され得、これには以下が含まれる：ユーカリプツス・アルバ（Eucalyptus alba）、ユーカリプツス・バンクロフティー（Eucalyptus bancroftii）、ユーカリプツス・ボトロイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリプツス・ブリジェシアーナ（Eucalyptus bridgesiana）、ユーカリプツス・カロフィラ（Eucalyptus calophylla）、ユーカリプツス・カマルドゥレンシス（Eucalyptus camaldulensis）、ユーカリプツス・シトリオドラ（Eucalyptus citriodora）、ユーカリプツス・クラドカリクス（Eucalyptus cladocalyx）、ユーカリプツス・コキフェラ（Eucalyptus coccifera）、ユーカリプツス・カーティシー（Eucalyptus curtisii）、Eucalyptus dalrympleana、ユーカリプツス・ダルリンプレアアーナ（Eucalyptus deglupta）、ユーカリプツス・デレガテンシス（Eucalyptus delegatensis）、ユーカリプツス・ディバーシカラー（Eucalyptus diversicolor）、ユーカリプツス・ドゥニー（Eucalyptus dunnii）、ユーカリプツス・フィシフォリア（Eucalyptus ficifolia）、ユーカリプツス・グロブルス（Eucalyptus globulus）、ユーカリプツス・ゴムフォケファラ （Eucalyptus gomphocephala）、ユーカリプツス・グニー（Eucalyptus gunnii）、ユーカリプツス・ヘンリー（Eucalyptus henryi）、ユーカリプツス・ラエボピネア（Eucalyptus laevopinea）、ユーカリプツス・マカルツリ（Eucalyptus macarthurii）、ユーカリプツス・マクロロニンチャ（Eucalyptus macrorhyncha）、ユーカリプツス・マクラタ（Eucalyptus maculata）、ユーカリプツス・マルギナータ（Eucalyptus marginata）、ユーカリプツス・メガカーパ（Eucalyptus megacarpa）、ユーカリプツス・メリオドラ （Eucalyptus melliodora）、ユーカリプツス・ニチョリー（Eucalyptus nicholii）、ユーカリプツス・ニテンス（Eucalyptus nitens）、ユーカリプツス・ノヴァ-アンジェィカ（Eucalyptus nova-angelica）、ユーカリプツス・オブリクア（Eucalyptus obliqua）、ユーカリプツス・オシデンタリス（Eucalyptus occidentalis）、ユーカリプツス・オブトゥシフロラ（Eucalyptus obtusiflora）、ユーカリプツス・オレアデス（Eucalyptus oreades）、ユーカリプツス・パウチフローラ（Eucalyptus pauciflora）、ユーカリプツス・ポリブラクティア（Eucalyptus polybractea）、ユーカリプツス・レグナンス（Eucalyptus regnans）、ユーカリプツス・レシニフェラ（Eucalyptus resinifera）、ユーカリプツス・ロブスタ（Eucalyptus robusta）、ユーカリプツス・ルディス（Eucalyptus rudis）、ユーカリプツス・サリグナ（Eucalyptus saligna）、ユーカリプツス・シデロキシロン（Eucalyptus sideroxylon）、ユーカリプツス・ステュアーティアナ（Eucalyptus stuartiana）、ユーカリプツス・テレチコルニス（Eucalyptus tereticornis）、ユーカリプツス・トレルリアナ（Eucalyptus torelliana）、ユーカリプツス・アーニゲラ（Eucalyptus urnigera）、ユーカリプツス・ウロフィラ（Eucalyptus urophylla）、ユーカリプツス・ビミナリス（Eucalyptus viminalis）、ユーカリプツス・ビリディス（Eucalyptus viridis）、ユーカリプツス・ワンドゥー（Eucalyptus wandoo）、およびユーカリプツス・ユーマンニ（Eucalyptus youmanni）。

また好ましくは、標的植物は以下からなる群より選択される：バンクスマツ（Pinus banksiana）、パイナス・ブルティア（Pinus brutia）、カリビアマツ（Pinus caribaea）、パイナス・クラスサ（Pinus clasusa）、パイナス・コントータ（Pinus contorta）、パイナス・クールテリ（Pinus coulteri）、エキナタマツ（Pinus echinata）、パイナス・エルダリカ（Pinus eldarica）、パイナス・エルリオティー（Pinus elliotii）、ジェフリーマツ（Pinus jeffreyi）、サトウマツ（Pinus lambertiana）、タイワンアカマツ（Pinus massoniana）、モンチコラマツ（Pinus monticola）、ヨーロッパクロマツ（Pinus nigra）、ダイオウショウ（Pinus palustris）、フランスカイガンショウ（Pinus pinaster）、ポンデローサマツ（Pinus ponderosa）、ラジアータマツ（Pinus radiata）、レジノサマツ（Pinus resinosa）、リギダマツ（Pinus rigida）、パイナス・セロティナ（Pinus serotina）、ストローブスマツ（Pinus strobus）、ヨーロッパアカマツ（Pinus sylvestris）、テーダマツ（Pinus taeda）、バージニアマツ（Pinus virginiana）、アマビリスモミ（Abies amabilis）、バルサムモミ （Abies balsamea）、コロラドモミ（Abies concolor）、グランドファー（Abies grandis）、アルプスモミ（Abies lasiocarpa）、カリフォルニアアカモミ(bies magnifica)、ノーブルモミ（Abies procera）、カマエシパリス・ローソニオナ（Chamaecyparis lawsoniona）、カマエシパリス・ノートカテンシス（Chamaecyparis nootkatensis）、ヌマヒノキ（Chamaecyparis thyoides）、鉛筆柏槇（Juniperus virginiana）、ヨーロッパカラマツ（Larix decidua）、 アメリカカラマツ（Larix laricina）、カラマツ（Larix leptolepis）、セイヨウカラマツ（Larix occidentalis）、シベリアカラマツ（Larix siberica）、リボケドゥルス・デクレンス（Libocedrus decurrens）、 ヨーロッパトウヒ（Picea abies）、エンゲルマントウヒ（Picea engelmanni）、 カナダトウヒ（Picea glauca）、 マリアーナトウヒ（Picea mariana）、コロラドトウヒ（Picea pungens）、アカトウヒ（Picea rubens）、 シトカトウヒ（Picea sitchensis）、ベイマツ（Pseudotsuga menzeisii）、ジャイアントセコイヤ（Sequoia gigantea）、 セコイア（Sequoia sempervirens）、ラクウショウ（Taxodium distichum）、 カナダツガ（Tsuga canadensis）、 アメリカツガ（Tsuga heterophylla）、 コメツガ（Tsuga mertensiana）、 ニオイヒバ（Thuja occidentalis）、 ベイスギ（Thuja plicata）。

特に、トランスジェニック植物は、グランディスユーカリまたはその雑種、ラジアータマツ、テーダマツLまたはその雑種、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、アメリカクロヤマナラシ（Populus deltoides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、もしくはポプラの雑種、アカシア・マンギューム（Acacia mangium）、またはモミジバフウ（Liquidamber styraciflua）であり得る。

本発明の方法は、選抜したユーカリ遺伝子型の保存培養から得られたユーカリ移植片の形質転換を意図する。微細繁殖シュート培養は、新規に洗い流した先端または葉腋のシュートを収集すること、および滅菌溶液中で組織を表面滅菌することによって生成され得る。1〜5%ブリーチ溶液などの滅菌溶液は当技術分野において公知であり、滅菌した蒸留水を用いて反復してすすぐことが実行され得る。ユーカリ保存培養が、無機塩、炭素源、ビタミン、およびサイトカイニンを含む維持培地中でシュートクラスターとして維持され得る。本発明において、保存培養は、木本植物培地（Woody Plant Medium）（WPM）塩（Loyd and McCown, 1980）およびN⁶-ベンジルアデニン（BA）を含むユーカリ維持（EM）培地（表1）上で維持される。または、MS培地（Murashige and Skoog 1962）またはLepoivre培地などの他の塩培地が使用されてもよい。

（表１）ユーカリ維持培地（EM培地）

本発明は、遺伝子型非依存性形質転換の方法を提供する。本発明の方法は、齢および発生段階に依存しない移植片の形質転換を教示する。保存培養から得られる木の移植片が形質転換のために使用され得る。木の移植片は、葉、葉柄、節間組織、および花組織の一つまたは複数から選択され得る。本発明において、葉移植片は、それらの豊富な供給および形質転換の容易さに起因して選択される。葉の先端の部分が、ピンセットで除去されるかまたは穿孔されて、損傷した細胞の数を増加させてもよい。本願において、葉移植片は、背軸面を下にして前培養培地上に配置される。

本願において、植物移植片は前培養培地上で培養される。前培養培地は、アグロバクテリウム形質転換前に植物がその上で培養される栄養培地である。具体的には、本発明の前培養培地は、形質転換効率および植物再生を増加させる。この前培養培地は、アセトシリンゴンなどの、アグロバクテリウムのインデューサーを含む。または、ヒドロキシフェニルプロパノイド、フェノール化合物、およびコニフェリンなどの他のアグロバクテリウムインデューサーが使用されてもよい。木本培地（Woody Plant Medium）（WPM）塩（Loyd and McCown, 1980）が本発明において使用された；しかし、MS培地（Murashige and Skoog 1962）またはLepoivre培地などの他の塩培地が使用されてもよい。任意に、この前培養培地は、オーキシンおよびサイトカイニンを含む植物成長調節剤を含んでもよい。本発明において、植物移植片は、表2の前培養培地上で暗所にて4日間の間前培養された。他の前培養培地および培養の時間も使用され得る。

（表２）植物前培養培地

本発明の方法は、高濃度のオーキシンまたはオーキシン型成長調節剤を含む前培養培地上で移植片を前培養することを教示する。好ましくは、このオーキシンまたはオーキシン型成長調節剤は、ナフタレン酢酸（NAA）、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）、インドール-3-酪酸（IBA）、およびインドール-3-酢酸（IAA）からなる群より選択される。より好ましくは、オーキシンはNAAである。このオーキシンの濃度範囲は約0.1から約10mg/lである。この好ましいオーキシン濃度は約0.2から約5mg/lである。より好ましくは、このオーキシン濃度は約0.2から約3mg/lである。

好ましくは、本発明の方法は、十分なサイトカイニンを含む前培養培地上で木の移植片を前培養することを提供する。このサイトカイニンは、N⁶-ベンジルアミノプリン（BAP）、N⁶-ベンジルアデニン（BA）、ゼアチン、カイネチン、4-CPPU（N-(2-クロロ-4-ピリジル)-N'-フェニルウレア）、チアジアズロン（TDZ）、および2-イソペンテニルアデニン（2ip）からなる群より選択される。このサイトカイニンの濃度範囲は、約0.25から約15mg/lである。好ましくは、このサイトカイニンの濃度範囲は、約1から10mg/lである。より好ましくは、このサイトカイニンの濃度範囲は約1から6mg/lである。

本発明の方法は、アグロバクテリウムインデューサーを含む前培養培地上で木の移植片を前培養することを提供する。このインデューサーはアセトシリンゴンであり得る。アセトシリンゴンの濃度範囲は、約10から約400mg/lである。好ましくは、この濃度範囲は、約5から約200mg/lである。

本発明は、オーキシンおよびアグロバクテリウムインデューサーの両方を含む前培養培地上で木の移植片を任意に前培養する方法を意図する。本発明は、アグロバクテリウムインデューサーとのオーキシンの組み合わせが、いずれかの成分が独立しているときよりも、より高い感染率を生じることを実証する。移植片は、アグロバクテリウムの導入の約1日から約6日の間、この前培養培地上で前培養され得る。好ましくは、この移植片は約4日間前培養される。この前培養段階は、暗所条件下および明所条件下の両方で行われ得る；しかし、暗所において培養することが好ましい。

ユーカリ移植片形質転換は、形質転換ベクターを有する異なる株のアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスを用いて実行される。1つのこのようなベクターはGV2260であり、これは、アクチンプロモーターまたは構成的プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されたGUS遺伝子を含む。このベクターはまた、プロモーターに作動可能に連結された除草剤耐性遺伝子を有する。本発明において、アセト乳酸シンターゼ（ALS）遺伝子は除草剤耐性を付与し、かつそのシロイヌナズナネイティブプロモーターによって操作される。米国特許第6,225,105号を参照されたい。誘導培地（AIM処方）中で懸濁されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンス培養物は、全ての切断された端が細菌に露出するように移植片に対してピペットによって滴り落とされる。または、移植片は、真空浸透、floral dip法、および当技術分野において周知であるアグロバクテリウム媒介形質転換の他の方法によって形質転換され得る。アグロバクテリウム媒介形質転換の概説としては、Gelvin, SB.Microbiol. Mol Biol Rev 67: 1: 16-37 (2003)を参照されたい。アグロバクテリウムの導入の際に、移植片は、同じ培地上で、約3日間の間、アグロバクテリウムとともに同時培養される。同時培養後、この移植片は、トランスジェニックシュートの回収のために、シュート再生培地に移される。

本発明は、シュート再生のための方法を教示し、ここで、形質転換された移植片は、アミノ酸およびビタミンの混合物、植物成長調節剤、グルコース、および抗酸化剤を含む培地上で培養される。1つのこのような完全培地処方が表3に列挙され、これはEuc再生培地と呼ばれる。アスコルビン酸などの抗酸化剤は、植物フェノール化合物の浸出を最小化するためにEuc再生培地に加えられてもよい。グルコースおよびグルタミンは、シュート再生を加速するために培地に加えられてもよい。カルベニシリン、セフォタキシム、およびチメンチンなどの抗生物質もまた、細菌の過成長を妨害するために培地に含められ得る。チメンチンが好ましい抗生物質である。この抗生物質の濃度は、約75から800mg/lの範囲である。好ましくは、この抗生物質の濃度は、約400mg/lである。

Euc再生培地は、アミノ酸生合成を妨げないアミノ酸の混合物を含む。本発明において、Euc再生培地は、スルホニルウレアベースの除草剤選択を妨げない。好ましくは、Euc再生培地は、分枝鎖アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、およびバリン）を有さない。より好ましくは、この培地は、カゼイン加水分解物を置き換えるアミノ酸混合物を有する。最も好ましくは、このアミノ酸混合物は、植物組織培養成長のために重要なアミノ酸を有する。

（表３）ユーカリ再生培地

本発明において、形質転換された移植片の選択の前に4日間の回収期間が存在する。形質転換された移植片を選択するために、いずれかの選択マーカーが再生培地に加えられる。選択マーカーには、除草剤および抗生物質が含まれる。さらに、形質転換された植物を選択するためにいずれかのスクリーニング用マーカーが使用されてもよい。スクリーニング用マーカーの例には、B-グルクロニダーゼ（GUS）、グリーン蛍光タンパク質（GFP）、およびルシフェラーゼが含まれる。本発明において、除草剤選択剤が使用される。本発明の除草剤はAlliであるが、任意の除草剤が使用されてもよい。他の除草剤には、OustおよびLibertyが含まれる。除草剤濃度は、特定の種からの移植片の感受性に依存して変化し得る。選択された移植片は、不定芽の形成まで各2〜3週間サブクローニングされる。形質転換された不定シュートはシュートクランプから分離され、GUS（B-グルクロニダーゼ）発現について染色される。Jefferson et al. EMBO : 6: 13: 901-3907(1987)。GUSなどのレポーター遺伝子アッセイは、形質転換効率を決定するため、および形質転換されたシュートが逸出植物またはキメラではないことを保証するために使用される。

スクリーニング可能なマーカー遺伝子の発現を介する形質転換、サザンブロット分析、PCR分析、または当技術分野において公知である他の方法の完了に際して、形質転換されたシュートは、シュート伸長のための培地に好ましく移される。本発明は、MS塩、スクロース、オーキシン、およびジベレリン酸を含むシュート伸長培地を意図する。NAAは好ましいオーキシンであり、GA3は好ましいジベレリン酸である。シュートは、好ましくは暗所条件下で、約10から約14日間の間、シュート伸長培地上で培養される。E. duniiクローンの伸長については、さらなるオーキシンが伸長培地に加えられる必要があり、このシュートは伸長の期間の間暗所で培養されるべきである。

シュート伸長後、シュートは切除され、かつ根誘導培地に移される。光条件に依存して、根誘導培地に植物成長調節剤を加えることが必要であるかもしれない。本発明の方法は、節における、または節のすぐ下におけるシュート切除を教示する。より好ましくは、シュートは、シュートの先端の近くの節から切除される。1つのこのような根形成培地（表4）は、BTM-1栄養成分（Chalupa 1988）、活性炭（MeadWestvaco, Nuchar）、および余分量のCaCl₂から構成される。または、他の低塩培地、例えば、木本植物培地（Woody Plant Medium）および1/2強度MSが根誘導培地のために使用されてもよい。

光条件に依存して、根形成培地は、根形成を誘導するために成長調節剤を含んでもよい。例えば、シュート先端成長点における黄化およびオーキシン産生を誘導する暗所条件下では、根形成培地中にオーキシンを含めることは必要でないかもしれない。さらに、シュートが暗所において切除される場合、節領域および/またはシュート先端に切除の起源を制限することは必要でないかもしれない。または、根形成段階が光条件下で行われる場合、根形成培地中にオーキシンを含めることは必要ないかもしれない。さらに、根形成段階が光条件下で行われる場合、シュート先端の成長点の近くの節においてそのシュートを切除することが好ましい。

（表４）ユーカリのために好ましい根形成培地

^*追加の400mg/l CaCl₂・2H₂Oが培地に加えられる

根形成が困難である種については、切除したシュートが、シュート形成を誘導するために低レベルのオーキシンを有する培地でパルス処理され得る。例えば、0.25mg/l 2,4-Dを含む培地がパルス処理のために使用され得る。好ましくは、シュートは、活性炭を有するBTM-1培地に移す前に、約5〜14日間の間パルス処理される。

本発明の形質転換方法は、ユーカリ種またはマツ種に任意の外来性DNAを導入するために使用され得る。本発明の方法を使用して、任意の外来性DNAが、植物細胞に安定に組み込まれ、かつ子孫に伝達されることが可能である。例えば、リグニン生合成、花卉発生、セルロース合成、栄養成分の摂取および輸送、病害耐性、または環境条件に対する耐性の増強に含まれる遺伝子が、本発明の方法によって植物細胞に導入され得る。

本発明の方法は、ユーカリ種またはマツ種における遺伝子発現を減少させるために使用され得る。遺伝子発現の減少は、アンチセンス抑制、同時抑制（センス抑制）、および二本鎖RNA干渉を含む、当技術分野において公知の方法によって得られ得る。遺伝子抑制技術の一般的概説については、Science, 288: 1370-1372 (2000)を参照されたい。例示的な遺伝子サイレンシング法は、国際公開公報第99/49029号および国際公開公報第99/53050号においてもまた提供される。

アンチセンス抑制のために、cDNA配列が、DNA構築物中のプロモーター配列に対して逆の方向で配列される。このcDNA配列は、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAのいずれかに対して、全長である必要はない。一般的に、より高い同一性が、より短い配列の使用を補償するために使用され得る。さらに、導入される配列は、同じイントロンまたはエキソンのパターンを有する必要はなく、非コードセグメントの同一性は同等に効果的であり得る。通常、約30または40ヌクレオチドの間の配列およびほぼ全長ヌクレオチドが使用されるべきであるが、少なくとも約100ヌクレオチドの配列が好ましく、少なくとも約200ヌクレオチドの配列がより好ましく、そして約500から約3500ヌクレオチドの配列が特に好ましい。導入される核酸セグメントは、一般的に、抑制される内因性遺伝子の少なくとも一部に対して実質的に同一である。しかし、この配列は、発現を阻害するために完全に同一である必要はない。本発明のベクターは、阻害効果が、標的遺伝子に対して同一性または実質的な同一性を示す遺伝子のファミリー内の他の遺伝子に適用されるように設計され得る。

センス同時抑制における植物の遺伝子抑制の別の周知の方法。センス方向で構成される核酸配列の導入は、標的遺伝子の転写をそれによってブロックするための有効な手段を提供する。以下を参照されたい：Assaad et al. Plant Mol. Bio. 22: 1067-1085 (1993)；Flavell Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3490-3496 (1994)；Stam et al.Annals Bot. 79: 3-12 (1997)； Napoli et al., The Plant Cell 2 : 279-289 (1990)；ならびに米国特許第5,034,323号、5,231,020号、および5,283,184号。同時抑制のために、導入される配列は、一次転写産物または完全にプロセシングされたmRNAのいずれかに対して、全長である必要はない。好ましくは、導入される配列は、同時発生的な過剰発現表現型を回避するために、全長ではない。一般的に、全長配列よりも短い配列中の高い同一性が、より長い、より低い同一性の配列を補償する。

本発明の方法を使用して、リグニン生合成に関与する遺伝子のアンチセンス抑制が、形質転換されたユーカリ植物中でリグニンの含量および/または組成を改変するために使用され得る。ポプラ、タバコ（N. tabacum）、およびマツにおけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（CAD）をコードする配列のアンチセンス発現が、改変されたモノマー性組成を有するリグニンの産生をもたらすことが実証されてきた。それぞれ、Grand et al., Planta 163: 232-37 (1985)、Yahiaoui et al., Phytochemistry 49: 295-306 (1998)、およびBaucher et al., Plant Physiol. 112: 1479 (1996)。従って、本発明の方法は、リグニン生合成に関与する外来性DNAのアンチセンス抑制を有するユーカリ種を安定に形質転換および再生するために使用され得る。

本発明の方法は、ユーカリ種またはマツ種における花卉発生を調節するために使用され得る。いくつかの遺伝子産物が、葯発生および花粉形成のための決定的な成分であることが同定されている。例えば、小胞子細胞壁の形成および小胞子放出のために必須である、カロースの未成熟分解は、雄性不稔を引き起こすために十分である。Worrall et al. , Plant Cell 4 : 7: 759-71 (1992)。従って、いくつかの方法が、雄性不稔植物を産生するために開発されてきた。例えば、米国特許第5,962,769号は、アビジンの発現を介して、雄性不稔にされたトランスジェニック植物を記載する。アビジンは、非組織特異的様式で、または葯特異的組織において、構成的に発現され得る。さらに、雄性不稔は、カルコンシンターゼA遺伝子のアンチセンス抑制によって誘導され得る。van der Meer et al., The Plant Cell 4 : 253 (1992)。本発明の方法によって、雄性不稔ユーカリ種およびマツ種が産生および再生され得る。

本発明は、スルホニルウレアまたは関連する除草剤、およびカゼイン加水分解物の誘導体を含む植物培地を提供し、ここで、この誘導体は分枝鎖アミノ酸を実質的に含まない。カゼイン粉末またはカザミノ酸として知られるカゼイン加水分解物は、カゼインの加水分解から得られたアミノ酸および短いペプチドフラグメントの混合物である。種々のアミノ酸組成が文献中で報告されており、そして種々のアミノ酸組成が種々のカゼインの供給源および種々の加水分解の手段から入手されてもよいが、任意の手段によって任意の供給源から得られるカゼイン加水分解物は、通常、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの分枝鎖アミノ酸、トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、およびグリシンなどの他のアミノ酸を含む。さらに、組成が変化するのに対して、実施者は、この化合物が植物細胞、特に多くの型の胚形成培養および針葉樹植物細胞の成長をインビトロで開始するために決定的であることに同意する。アミノ酸および特にカゼイン加水分解物といった還元窒素成分での無機培地成分の補充は、植物に引き続き再生され得る培養の成長を誘導または維持するための必須の成分として、木本植物組織培養、特に針葉樹組織培養の当業者によって観察されている。例えば、針葉樹種の胚形成細胞培養の開始培地、誘導培地、および/または維持培地は、日常的にカゼイン加水分解物を含む。例えば、米国特許第5,034,326号、5,036,007号、5,041,382号、5,236,841号、5,310,672号、5,491,090号、5,413,930号、5,506,136号、5,534,433号、5,534,434号、5,563,061号、5,610,051号、5,821,126号、5,850,032号、6,200,809号および6,518,485号を参照されたい。

従って、引き続く培養段階の培地がカゼイン加水分解物を含むか否かに関わらず、少量の化合物が持続して存在する。このような痕跡量は選択の間に大損害を与え得る。例えば、わずかな量のカゼイン加水分解物は、関心対象のベクターによるトランスフェクション後にトランスジェニック植物細胞を同定するために働くスルホニルウレア、イミダゾリノン、およびトリアゾロピリミジンなどの選択剤の有効性を阻害し得る。

上記に述べたように、これらの選択剤はアセト乳酸シンターゼ（ALS）を標的とし、これは分枝鎖アミノ酸バリン、ロイシン、およびイソロイシンの植物の生合成経路において最初の共通の段階を触媒する。これらの薬剤に対して抵抗性である変異型のALSは、組換えDNA構築物中の選択マーカーとして利用され、形質転換された植物細胞を同定するために選択剤と対にされる。

それゆえに、選択培地中の少量のカゼイン加水分解物は、スルホニルウレア、イミダゾリノン、またはトリアゾロピリミジンの存在下で形質転換されていない細胞を成長させることを可能にする。これらの偽陽性はトランスジェニック植物の産生を妨害する。なぜなら、より多くの試料が、所望の形質転換体を同定するために評価されなくてはならないからである。

本発明は、分枝鎖アミノ酸を実質的に含まないために、カゼイン加水分解物の組成物を改変することによってこの問題を除外する。別の実施形態において、カゼイン加水分解物の誘導体は、アルギニンまたはグルタミンなどの、植物培養成長において重要であるアミノ酸の高いパーセンテージを含む。

別の局面において、本発明は、トリプトファンアナログを含む、トランスジェニック植物を選択するための培地組成物を提供し、ここでこの培地はトリプトファンを実質的に含まない。

フィードバック非感受性型のASは、植物形質転換のための有用な選択マーカーを作製する。これらのマーカーは、形質転換体を同定するためにトリプトファンアナログと組み合わせて機能する。ASA2は好ましい選択マーカーである。

トリプトファンは、カゼイン加水分解物の成分として植物培地中で日常的に見られる。選択培地中でのわずかな濃度のトリプトファンの存在は、非形質転換体が選択プロセスから逃れることを可能にし得、それによって偽陽性を生じる。

トリプトファンを実質的に含まない培地上で形質転換体を選択することは、偽陽性の数を減少することによって選択プロセスを増強することが発見された。従って、本発明の1つの局面は、関心対象の遺伝子およびフィードバック非感受性型のアントラニル酸シンターゼ（AS）をコードする遺伝子を含むベクターを用いて植物細胞を形質転換する段階、ならびにトリプトファンアナログを含む培地組成物上で形質転換した細胞を成長させる段階を含む、形質転換した植物細胞を選択する方法を提供し、ここで、この培地は、トリプトファンを実質的に含まない。

本明細書に記載される方法、培地、およびプラスミドは、アミノ酸代謝を変化させる選択剤、例えば、スルホニルウレア系除草剤およびイミダゾリノン系除草剤ならびにメチル化トリプトファンアナログを使用して、トランスジェニック森林樹植物または系統の選択において有用である。これらはさらに、アミノ酸代謝を変化させる選択マーカーを用いる形質転換に供せられる植物材料を培養するために使用される選択培地、前選択培地、および前形質転換培地においてさらに有用である。

上記の方法、培地、およびプラスミドは、アミノ酸代謝を変化させる選択剤を使用して選択された細胞株からの植物の再生においてさらに有用である。これらは、アミノ酸代謝を変化させ、およびまた、アミノ酸代謝を変化させる除草剤に対して抵抗性であってもよい選択マーカーを用いて形質転換された植物を入手するためであり得る。従って、本明細書に記載される本発明はまた、除草剤耐性の木の保存を得るために有用である。さらに、本発明は、森林の植林において雑草の除草剤管理のために適切である作物材料を提供する際に有用である。

本発明の方法、培地、およびプラスミドは、トリプトファンなどの特定のアミノ酸の過剰産生を生じる遺伝子を用いて形質転換された植物の選択および再生において使用され得る。従って、これらはさらに、このような過剰産生の結果としての増加または変化した成長を示す木の保存を得るために有用であってもよい。

本明細書に記載される本方法は、新規な選択培地および選択剤用量をを開発および試験するために一般的に有用である。これらの培地を設計するために使用される同じ原理が、通常、代謝されない糖の使用などのポジティブ選択方法のための選択培地の設計のために適用可能である。

本発明の方法はまた、植物組織培養培地を補充するためのアミノ酸混合物の処方を開発するために有用である。

別の態様において、本発明は、植物において異種タンパク質を発現するために有用な組換え構築物を提供する。本発明のベクターの例には以下が含まれる：pWVC20（図1）、pWVC21（図2）、pWVC23（図3）、pWVC24（図4）、pWVC25（図5）、pWVC26（図5）、pWVC30（図6）、pWVC33（図7）、pWVC34（図8）、およびpWVC35（図8）。

本発明の別の局面は、本発明の方法によって形質転換および選択された植物から木材、木材パルプ、紙、およびオイルを得る方法を提供する。トランスジェニック植物を形質転換および選択するための方法は上記に提供され、当技術分野において公知である。形質転換された植物は、任意の適切な条件下で培養または増殖され得る。例えば、マツは、米国特許出願公開第2002/0100083号において記載されるように培養または成長され得る。ユーカリは、例えば、Rydelius, et al., Growing Eucalyptus for Pulp and Energy（Mechanization in Short Rotation, Intensive Culture Forestry Conference, Mobile, AL, 1994において提供）におけるように培養および成長され得る。木材、木材パルプ、紙、およびオイルは、当技術分野において公知の任意の手段によって植物から得られ得る。

上記に述べられるように、本発明に従う木材および木材パルプは、以下の任意の一つまたは複数を含むがこれらに限定されない改善された特性を実証することが可能である：リグニン組成、リグニン構造、木材組成、セルロース重合、繊維寸法、繊維対他の植物成分比、植物細胞分裂、植物細胞発生、面積あたりの細胞数、細胞サイズ、細胞形状、細胞壁組成、木材形成の速度、木材の美的外見、茎欠損の形成、成長の速度、枝の植物性発生に対する根の形成の割合、葉面積指標、および葉の形状、リグニン含量の相加または減少、化学処理に対するリグニンの接近性の増加、リグニンの反応性の増加、セルロース含量の増加または減少、寸法安定性の増加、引っ張り強度の増加、剪断強度の増加、圧縮強度の増加、ショック耐性の増加、堅さ（stiffness）の増加、硬性（hardness）の増加または減少、ねじれの減少、収縮の減少、ならびに重量、密度、および比重の違い。

表現型は、任意の適切な手段によって評価可能である。植物は、それらの一般的な形態に基づいて評価され得る。トランスジェニック植物は、裸眼で観察可能であり、秤量可能であり、およびそれらの高さが測定可能である。植物は、植物組織の個々の層、すなわち、師部および形成層を単離することによって試験され得、これらはさらに、成長点細胞、初期拡大、後期拡大、二次壁形成、および後期壁形成に区分される。例えば、Hertzberg、上記を参照されたい。植物はまた、顕微鏡分析または化学分析を使用して評価可能である。

顕微鏡分析は、細胞型、発生の段階、ならびに組織および細胞による色素の取り込みを試験することを含む。繊維の形態、例えば、木材パルプ繊維の繊維壁の厚さおよび微小繊維角度は、例えば、顕微鏡透過偏光解析法を使用して観察され得る。Ye and Sundstrom, Tappi J., 80: 181 (1997)を参照されたい。濡れた木材における木材の強度、密度、および傾きの増加ならびに立木が、多変量解析と組み合わせて、可視光および近赤外光のスペクトルデータを測定することによって決定され得る。米国特許出願第2002/0107644号および2002/0113212号を参照されたい。内腔サイズは、走査型電子顕微鏡を使用して測定可能である。リグニン構造および化学特性は、Marita et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. I2939 (2001)において記載されるような、核磁気共鳴スペクトル分析を使用して観察され得る。

リグニン、セルロース、炭水化物、および他の植物抽出物の生化学的特徴は、公知の任意の標準的な分析方法によって評価評価可能であり、これには、分光光度法、蛍光スペクトル測定、HPLC、質量分析スペクトル測定、および組織染色法が含まれる。

本明細書に記載される方法および応用に対する他の適切な改変および適合が、本発明の範囲またはその任意の態様から逸脱することなくなされ得ることが、関連する分野における当業者には容易に明かである。

以下の実施例は、本発明の特定かつ好ましい態様の代表として示される。これらの実施例は、任意の様式で本発明の範囲を限定するものと解釈されない。多くのバリエーションおよび改変が、本発明の精神および範囲内にあるままでなされ得ることが理解されるべきである。

実施例
実施例1-植物材料
全優良クローンを、マゼンタボックス（Magenta box）中でシュートクランプとして維持し、4〜6週間毎にサブクローニングした。シュートクランプを、必要に応じて分け、保存培養として維持した。他に注記されない限り、全ての培養を、遮光した、寒色の蛍光下で、30〜40μE/m²/sの光強度で、16時間の光時間で増殖させた。成長室の温度は21℃である。選択したユーカリプツス・ドゥニークローンを別として、葉移植片を、全ての選択したクローンについて使用した。

市販のユーカリプツス・ドゥニー選抜クローンDUN00001は、MeadWestvaco Brazilの関連会社であるRijesaによって提供された。シュートクランプを、マゼンタボックスあたり4クランプで維持した。これらのクローンのために好ましい移植片は、節間、葉柄、および主脈などの後生的な維管束組織を有する組織である。

グランディスユーカリクローンは、Rubicon, New Zealandによって提供された。グランディスユーカリクローンは、固形培地上でシュートクランプとして受領した。これらのクランプを、マゼンタボックス中の、0.25〜0.5mg/lでBAを有するEuc維持培地（表1）に移した。これらのシュートクランプを、4〜6週間毎に新鮮な培地に移した。

市販のユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB1は、International Paper, USAによって提供された。シュートクランプは、ユーカリプツス・グランディスについて記載されたのと同じ方法を受け入れた。保存樹立手順および培養条件は、全ての培養が約120μE/m²/sの強度の完全光条件下で生育される以外は、ユーカリプツス・グランディスと同じであった。

市販のユーカリプツス・カマルドゥレンシスクローンは、International Paper, USAから切断物として受領した。新規に洗い流した先端および葉腋のシュートを、10〜15%の市販のブリーチで5〜10分間表面滅菌し、70%メタノールで手早くすすぎ、そして滅菌水で3回洗浄した。節を分離し、Euc維持培地上で培養した。葉腋のシュートが節から開始する場合、それらは、さらなる生育のために新鮮なEuc維持培地に移した。保存培養を、同じ培地上で3〜4培養サイクル後に樹立した。保存培養を、他のクローンについて以前に記載したのと同じ条件下で維持した。

実施例2-構築物
2つの構築物：pWVZ20およびpWVR133を形質転換実験のために使用した。バイナリプラスミドpWVZ20は、植物プロモーターによって駆動される除草剤耐性遺伝子、およびT-DNAボーダー間の構成的プロモーターによって駆動されるβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を含む。バイナリプラスミドpWVR133は、同じ除草剤耐性遺伝子構築物を含むが、GUS遺伝子はイントロンをふくみ、かつアクチンプロモーターによって駆動される。pWVR133のGUS発現は植物細胞においてのみ起こり、細菌細胞においては起こらない。アグロバクテリウム株GV2260（Deblaere et al.1985）を、形質転換研究のために使用した。当業者は、構成的植物プロモーターに作動可能に連結された除草剤耐性遺伝子を有する任意のバイナリ構築物を使用することが可能である。

実施例3-形質転換のためのアグロバクテリウムの調製
pWVZ20またはpWVR133のいずれかを含むアグロバクテリウムをYEP培地（10g/l酵母抽出物、10g/lペプトン、および50mg/l NaCl、pH 7.0〜7.2）上で3日間成長させた。プレートから単一コロニーを選択し、100mg/l カナマイシンおよび50mg/l リファンピシンを有する20〜50mlの液体YEP培地中で成長させた。培養を、28℃および150rpmにて、振盪インキュベーター中で一晩インキュベートした。約0.6〜1.1のODを有する一晩培養物を、3000gで20分間、卓上遠心分離機で遠心分離し、アグロバクテリウム誘導培地またはAIM（5g/lグルコース、250μMアセトシリンゴン、2mMリン酸緩衝液、および0.05M MES、pH 5.8を有するWPM塩）で再懸濁し、これは約0.6〜1.1のODを有する。培養を感染前に28℃で25分間インキュベートした。細菌濃度を感染の前後で決定した。

実施例4-感染および前培養のための移植片の調製
Euc維持培地上で維持したユーカリ保存培養を、移植片の供給源として使用した。葉、葉柄、節間組織、花組織、または胚形成組織を形質転換のために使用可能であるが、葉が豊富であるために葉移植片を選択した。健康かつ新規に開いた葉を形質転換のために選択した。損傷を有する細胞の数を増加させるために、はさみまたはピンセットによって葉の先端部分を除去した。移植片を、背軸面を下にして前培養培地（表2）上に配置した。前培養培地は、植物移植片がアグロバクテリウム形質転換の前にその上で培養される栄養培地である。具体的には、本発明の前培養培地は、形質転換効率および植物再生を増加させる。本前培養培地は、アセトシリンゴンなどの、アグロバクテリウムのインデューサーを含むが、他のアグロバクテリウムインデューサーが使用されてもよい。木本培地（Woody Plant Medium）（WPM）塩（Loyd and McCown, 1980）が本発明の前培養培地において使用された；しかし、MS培地（Murashige and Skoog 1962）またはLepoivre培地などの他の塩培地が使用されてもよい。任意に、この前培養培地は、オーキシンおよびサイトカイニンを含む植物成長調節剤を含んでもよい。

本発明において、植物移植片は、表2に記載の前培養培地上で暗所にて4日間の間前培養された。必要とされるわけではないが、本発明の前培養培地は、オーキシンおよびサイトカイニンの両方を含んだ。さらに、植物移植片は、アグロバクテリウム形質転換の前に、1日から6日までの前培養培地上で培養されてもよい。

実施例5-アグロバクテリウム接種および除去
誘導されたアグロバクテリウム培養を実施例3に記載されるように調製し、この培養物をピペットによって各移植片に滴り落とした。全ての切断された端が細菌溶液で覆われるように、十分なアグロバクテリウム培養物を滴り落とした。または、移植片は、真空浸透、floral dip法、およびアグロバクテリウム媒介形質転換の他の方法によって形質転換され得る。形質転換後、アグロバクテリウム培養物で覆われた移植片を、4日間の同時培養のために暗所に配置した。または、この移植片は、光条件下でアグロバクテリウムと同時培養され得る。さらに、この移植片は、2〜10日間の間、好ましくは4日間、明所条件下または暗所条件下でアグロバクテリウムとともに同時培養され得る。同時培養後、移植片は、400mg/lチメンチンを有するEuc再生培地（表3）に移した。移植片を洗浄する必要はない。移植片を、選択培地への移植前に4日間の間、この培地上で培養した。本実施例において、選択培地は、チメンチンおよび除草剤選択剤の両方を補充したEuc再生培地である。

実施例6-トランスジェニックシュートの再生
選択で生存するシュートクランプを、除草剤およびチメンチンを含むEuc再生培地上で維持し、これらを、シュートが増殖しかつ最初に延長するまで、3週間毎に移す。pWVR133を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織を、シュートが発生するとすぐに、GUS発現について染色する。pWVZ20を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織は、シュートがさらに発生し、かつ残渣のアグロバクテリウムを含まないときに、GUS発現について染色する。

実施例7-GUS染色
GUS染色を、アグロバクテリウム感染の頻度をモニターするため、および逸出またはキメラではない選択されたシュートを保証するために実行した。pWVR133を用いる形質転換実験のために、再生されたシュートからの葉および茎の組織を、シュート発生の際すぐにGUS発現について染色した。pWVZ20を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織は、シュートがさらに発生し、かつ残渣のアグロバクテリウムを含まないときに、GUS発現について染色する。GUS活性を決定するために、移植片を、100mM リン酸緩衝液（pH 7.0）、0.05%ジメチルスルホキシド、0.05% Triton X-100、10mM EDTA、0.5mMフェロシアン化カリウム、および1.5mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド（X-gluc）を含む物質中でインキュベートした。この移植片を10分間真空に供し、その後37℃で一晩インキュベーションを行った。一晩インキュベーションの後、GUS焦点を計数した。

実施例8-RNA単離
RNAを、野生型および形質転換したユーカリプツス・グランディス、グランディス ウロフィラ、およびユーカリプツス・カマデュレンシス（E. camadulensis）植物の葉組織およびシュート組織から、製造業者の指示書に従ってRNAqueous（商標）-96キットを用いて単離した。手短に述べると、0.1から1.5mgの組織を300μl 溶解/結合緩衝液中に懸濁し、プラスチックの乳棒を用いて微細粉末に粉砕した。試料を最大速度で3分間遠心分離し、上清を新鮮なプレートに移した。300μlの（1×v/v）64%エタノールを上清に加え、試料を手短にボルテックスした。次いで試料を1850gで2分間遠心分離した。遠心分離後、任意に、DNase処理工程を実行した。各試料に、5μlのDNase+35μl DNase緩衝液を、フィルターパッドの中心に加え、試料を室温で20分間インキュベートした。20分間のインキュベーションの後、600mlの洗浄緩衝液Aを各試料に加え、この試料を最大速度で2分間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、600μlの洗浄緩衝液Bを各試料のフィルターパッドに加えた。最大速度で2分間の遠心分離後、上清を廃棄し、600μlの洗浄緩衝液C/Dを各フィルターパッドに加えた。この試料を最大速度で2分間遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄検証液C/Dを用いる第2のすすぎの後、50μlのRNA溶出液を加え、試料を最大速度で2〜3分間遠心分離した。RNA溶出工程を反復し、溶出したRNA試料をさらなる使用まで-80℃に保存した。

実施例9-RT-PCR
ALS除草剤耐性遺伝子の存在および発現を決定するために、RT-PCRを実行した。全RNAを、実施例8において記載されるように、ユーカリプツス・グランディス、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ、およびユーカリプツス・カマデュレンシス植物の形質転換された試料および野生型試料から単離した。RNAの単離および定量の後、RT-PCRを、Ready to Go RT-PCRキット（Pharmacia）を製造業者の指示書に従って実行した。一般的には、5μlの全RNA（約20ng RNA）を、1μl Oligo dTn、1μl 3μM ALSフォワードプライマー、1μl 3μM ALSリバースプライマー、および42μl 水を含む、45μl RT-PCR反応混液に加えた。

RNAを変性させるために、チューブを少なくとも75℃の温度で3分間加熱した。次いで、試料を42℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、RT-PCRを以下のように実行した：
サイクル1：95℃5分間
55℃1分間
72℃1分間
サイクル2〜30：95℃1分間
55℃1分間
72℃1分間
サイクル31：95℃1分間
55℃1分間
72℃10分間

RT-PCRの完了後、PCR増幅産物を、エチジウムブロマイドを用いて染色したアガロースゲル上で可視化した。

実施例10-成長調節剤の最適化
本実施例は、扱いにくい市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00001または他の扱いにくいクローンからのシュート再生のための成長調節剤のレベルを最適化するための方法を教示する。節間移植片を実施例1に記載されるように調製し、実施例5に記載されるようにアグロバクテリウムを接種する。同時培養後、形質転換されたシュートクランプを、シュート再生培地に移す。本実施例の前の研究において、ゼアチンおよびNAAの組み合わせのみがシュート再生を生じ、そしてサイトカイニンBA、2ip、およびオーキシン2,4-D、IAA、IBAからの他の組み合わせが偶発的なシュートを生じなかった。シュート再生培地におけるオーキシンおよびサイトカイニンの濃度を最適化するために、いくつかのホルモンの組み合わせを、伸長したシュートの産生の関数として評価した。TDZおよびNAAなどの多くの組み合わせがシュート原基を産生するが伸長したシュートを産生しなかった。初期のスクリーニングの間、ゼアチンレベルは10、1、および0.1mg/lであり、NAAレベルは0.01、0.1、および1mg/lであった。ゼアチンは、1mg/lまたは0.1mg/lよりも10mg/lにおいて良好な結果を有した。以下のデータは、ゼアチンおよびNAAのレベルを最適化するための試みを要約する。

（表５）緑色シュート原基（GSP）および伸長したシュートの産生に対するゼアチンおよびNAAの効果

2つの実験は、一貫して、シュート形成のために、5mg/lのゼアチンが10mg/lよりも良好であり、0.11mg/lのNAAが低レベルよりも良好であるということを示した。さらなる研究は、より低いレベルのゼアチンが扱いにくいクローン（例えば、選択されたユーカリプツス・ドゥニークローン）の再生のためには5mg/lと同程度には有効ではなく、NAAの増加が所望されないカルス増殖を誘導する傾向があることを示した。従って、5mg/lのゼアチンおよび0.11mg/lのNAAを、Euc再生培地のための基本的な成長調節剤として選択する。

Euc再生培地は、任意のクローンについてのシュート発生を誘導するために使用され得る。異なるクローンが異なる濃度の植物成長調節剤のを必要とする可能性があるので、Euc再生培地は、各クローンについて最適化されるべきである。Euc再生培地は、ユーカリプツス・グランディスクローンFC1-5、FC9、ユーカリプツス・カマルドゥレンシス クローン4590、およびユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB1のような選択されたクローンについての偶発的なシュートを誘導するために日常的に使用されている。再生効率は、通常12週間の培養後に90パーセントよりも高い。

実施例11-シュート再生のためのアミノ酸混合
本実施例は、シュートの塊の成長を促進することによってシュート再生プロセスを加速するためのアミノ酸およびビタミンの混合（表2の処方を参照されたい）の使用を教示する。ユーカリプツス・グランディスクローンFC3の葉移植片を実施例1に記載されるように調製し、そしてアグロバクテリウム接種を実施例4に従って調製する。葉移植片を実施例5に記載されるように接種し、3日間同時培養した。同時培養後、葉移植片を収集し、マゼンタボックスあたり10片で、アミノ酸混合ありまたはなしで培地上に配置した。4週間後、初期相の器官形成を、偶発的なシュートの形成を形成する移植片の頻度として評価し、そしておよびシュート原基、小さなシュート、およびカルスを有するクランプのサイズを測定した（表6を参照されたい）。

（表６）ユーカリプツス・グランディスクローンFC3のシュート器官形成に対するアミノ酸混合の効果

本研究において示されるように、アミノ酸混合（表2）を含めることは、クランプサイズの増加を通してシュート再生を加速した。

実施例12-感染速度を増加させるための方法
本実施例は、アグロバクテリウム感染速度を増加させるための方法を教示する。特に、本実施例は、細胞増殖を刺激し、標的細胞の数を増加し、かつ感染を促進する方法を教示する。選抜されたユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB Iからの移植片を実施例1に記載されるように調製し、pWVR133を含むアグロバクテリウム株GV2260を実施例3に記載されるように調製した。収集した移植片を、ユーカリ再生培地上または種々のオーキシンリッチ成長調節剤を有する培地上のいずれかで、暗所で4日間インキュベートした。アグロバクテリウム培養を移植片に滴り落とし、そして暗所で3日間、同じ培地上で移植片とともに同時培養した。次いで、移植片をアグロバクテリウムの水たまりから取り出し、400mg/lチメンチンを補充したEuc再生培地に4日間移した。再生培地への移動後、移植片をGUS発現について染色した。表7〜8において示されるように、種々のオーキシン型成長調節剤は、感染後7日間のGUS発現に対してポジティブな効果を有した。

（表７）オーキシン前処理は、選抜されたユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB １についてアグロバクテリウム感染速度を増加する

感染率およびGUSを発現する細胞の数の有意な増加が存在したが、対照は、1.0mg/l 2,4-Dを有する培地からのシュート再生の遅れを示す。ゼアチンレベルは、5mg/lまで上昇し、これは再生培地におけるレベルと同じレベルである。

（表８）種々のオーキシン型成長調節剤は、選抜されたユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB １の感染に対するポジティブな影響を示す

上記の実験からの結果は、種々のオーキシン型植物調節剤が豊富である培地を用いる移植片の前培養が、GUS焦点を有する移植片の頻度によって評価されるような感染速度、および応答する移植片あたりのGUS焦点の平均数を増加させることを示す。さらに、再生は、対照実験における前培養によっては影響されない。

実施例13-アグロバクテリウムインデューサーは感染速度を改善する
この実施例は、前培養培地中にアセトシリンゴン（AS）を単独で含めることが感染速度を有意に改善することを示す。この実験において、ユーカリプツス・グランディスクローンFC3およびFC5からの葉移植片を4種の培地：Euc再生培地、250μMもしくは750μMのアセトシリンゴンを有するEuc再生培地、または0.25mg/l 2,4-Dおよび5mg/l ゼアチンの成長調節剤の組み合わせを有するEuc再生培地を用いて4日間前培養した。次いで、移植片を、アグロバクテリウムで感染させ、同じ培地上で3日間同時培養し、その後400mg/l チメンチンを有するEuc再生培地に移した。GUS染色を、同時培養後4日間実行した。データを表9〜10に要約する。

（表９）ユーカリプツス・グランディスクローンFC3のアグロバクテリウム感染に対するアセトシリンゴンの効果

（表１０）ユーカリプツス・グランディスクローンFC5のアグロバクテリウム感染に対するアセトシリンゴンの効果

これらの結果は、前培養培地中のAS単独が感染を刺激することを示す。さらに、GUS染色は、ASが、トランスジェニック植物が通常生じる、切断された端に沿った、損傷した細胞の感染を増加することを示す。

実施例14-アグロバクテリウムインデューサーおよび成長調節剤の組み合わせは感染速度を改善する
本実施例は、前培養相におけるASおよびオーキシンの組み合わせは感染をさらに高く増加させ得ることを示す。以下の実施例において、ユーカリプツス・グランディスクローンFC1〜5およびユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB １からの移植片を、250μM ASのあるなしで、感染前にオーキシンリッチ前培養上で培養した。移植片を、対照としてEuc再生培地を用いて前培養した。前培養後、実施例5に記載されるように、移植片にアグロバクテリウムを接種した。

（表１１）感染に対するアグロバクテリウムインデューサーどオーキシンを組み合わせることの効果

これらの結果は、前培養培地におけるASおよびオーキシンの両方の刺激を使用することによって一定の範囲のクローンを通しての感染に対して一貫して有利な結果を示す。これらのクローンは、感染頻度および応答する移植片あたりのGUS焦点の平均数の両方の増加を有する。さらに、切断された端に沿った損傷した細胞の感染が有意に増加する。

実施例15
本実施例は、同時培養相ASおよびオーキシンの組み合わせが感染速度をさらに増加させることを示す。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN0003からの葉移植片を、750μM AS単独、または250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン（2mg/l IAA 対0.1mg/l IAA）の組み合わせのいずれかを含む再生培地上で前培養した。移植片を、GUS遺伝子（構成的プロモーターによって駆動される）およびNPTII遺伝子（異なる構成的プロモーターによって駆動される）を含む、pWVR31を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。本実施例において、移植片にアグロバクテリウムを直接的に接種するか、または同時培養の4日後にGUS発現についてアッセイする。

（表１２）ユーカリプツス・ドゥニークローンDUN0003葉移植片

実施例16
本実施例は、前培養および同時培養相におけるASおよびオーキシンの組み合わせが、感染速度をさらに増加させ得ることを示す。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003からの葉移植片を、250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン（2mg/l IAA 対0.1mg/l NAA）の組み合わせを有する再生培地上のいずれかで前培養した。移植物を、4日間前培養し、GUS遺伝子（構成的プロモーターによって駆動される）およびNPTII遺伝子（異なる構成的プロモーターによって駆動される）を含む、pARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させる。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。200個の移植片を、30mg/lジェネティシンおよび400mg/l チメンチンを補充した再生培地上で選択した。再生培地上での3ヶ月の選択において、選択で生存する、カルスを有する移植片をGUS選択について染色した。

（表１３）ユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003葉移植片

実施例17
本実施例は、前培養および同時培養相におけるASおよびオーキシンの2つの組み合わせを比較する。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00001からの葉移植片を、250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン（2mg/l のIAAもしくは0.25mgの2,4-Dのいずれか）の組み合わせを有する再生培地上、または0.1mg/l NAAを有する再生培地上のいずれかで前培養した。移植片を4日間前培養し、次いで実施例16において記載されるように、pARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。

（表１４）ユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00001葉移植片

実施例18
本実施例は、2つのアグロバクテリウム株、GV2260およびEHA105を用いる葉移植片または節間移植片の感染を比較する。前培養培地および同時培養培地は、250μM ASおよび2mg/l IAAとしての（通常の再生培地における0.1mg/l NAAに対して）上昇濃度のオーキシンを有する再生培地である。葉抽出物および5mm節間を市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003の保存培養から収集し、実施例4に記載されるように、前培養培地上で培養した。移植片を4日間前培養し、次いでpARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260または株EHA105のいずれかで感染させた。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。

（表１５）ユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003葉移植片

実施例19-初期開花ユーカリプツス・オシデンタリスの形質転換
本実施例は、本発明の形質転換方法を使用する、3つの初期開花ユーカリプツス・オシデンタリスクローンEO66、EO129、およびEO208の感染および形質転換を詳述する。葉移植片を収集し、4日間前培養し、次いで移植片を、p35SGUSINT（35S::GUSINT、NOS::NPTII）を有するアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。EO66については、アグロバクテリウム株は、p35SGUSINT（35S::GUSINT、NOS::NPTII）を有するアグロバクテリウム株GV2260であった。EO129およびEO208については、アグロバクテリウム株は同じGV2260であったが、その構築物はpWVK192（イントロンを有するGUS遺伝子を駆動するマツ4CoAリガーゼのプロモーター-4CL::GUSINT、構成的::NPTII）であった。移植片を再生培地上で培養し、これは、NH₄H₂PO₄を0.25g/lの代わりに0.5g/lに変更したという改変を伴った。この培地は750μM ASを含み、オーキシン濃度を上昇しなかった。一過性のGUS発現データを、前培養および同時培養段階の後で収集した。EO66について、GUS発現データを、前培養および同時培養段階の後で収集した。EO129およびEO208については収集した一過性GUS発現データは存在しなかった。クローンEO66、EO129、およびEO208からのそれぞれ144、400、および200移植片を、30mg/lジェネティシンを有する通常の再生培地として選択培地に移植した。6ヶ月後、再生されたシュートをGUS発現について染色し、その結果を表16に示す。

（表１６）初期開花ユーカリプツス・オシデンタリスクローンEO66の形質転換

実施例20-いくつかのユーカリ種の優良クローンの形質転換
本実施例は優良クローンの形質転換を提供する。優良クローンからの移植片を実施例4に記載されるように調製し、オーキシンおよびアグロバクテリウムインデューサーを含む培地上で前培養する。この移植片を実施例5に記載されるように、アグロバクテリウムで形質転換し、同時培養した。同時培養および形質転換体の選択後、形質転換された移植片を実施例6に詳述されるようにシュート再生培地に移した。GUS発現の完了の際に、これらのシュートを収集し、根形成培地に移した。根形成を、5g/l MeadWestvaco Nuchar活性炭を補充したBTM-1培地上で行い、根形成は通常2〜4週間後に起こる。一旦根系が発生すると、形質転換体を土壌に移した。

実施例21-除草剤耐性遺伝子の発現を評価するためのRT-PCR
本実施例は、トランスジェニック株の試料における除草剤耐性遺伝子の存在および発現を示す。実施例8に記載されるように、RNAを各推定のトランスジェニック株の葉および茎組織から単離した。特に、RNAを、形質転換したグランディスユーカリ株、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ株、およびユーカリプツス・カマデュレンシス株から単離した。さらに、RNAを、野生型のユーカリプツス・グランディス株、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ株、およびユーカリプツス・カマデュレンシスの植物から単離した。各株について、5μl RNA試料を、除草剤耐性遺伝子の存在および発現を評価するためのRT-PCRのために使用した。RT-PCRを、Ready-to-Go RT-PCRキット（Pharmacia）を、製造業者の指示書に従って用いて実行した。手短に述べると、各5μl RNA調製物を、オリゴ(dT)_nおよび除草剤耐性遺伝子プライマーを含む別々のRT-PCR反応に加えた。RT-PCR後、増幅産物を、エチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で可視化した。

RT-PCR産物のアガロースゲル電気泳動は、全ての試験したユーカリ株が除草剤耐性遺伝子を発現していることを示した。具体的には、除草剤耐性遺伝子の存在について分析した10個全てのユーカリプツス・グランディス株が除草剤耐性遺伝子を発現するのに対して、野生型ユーカリプツス・グランディス植物はこれを発現しない。さらに、8個全てのユーカリプツス・グランディス x ウロフィラがALSを発現するのに対して、野生型ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ植物はこれを発現しない。ユーカリプツス・カマデュレンシス株ALS発現について分析され、その全てがALSを発現する。いずれの対照植物においても除草剤耐性遺伝子発現は検出されなかった。

実施例22
本実施例は、アミノグリコシド抗生物質ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン（G418）に対する耐性を付与する異なる選択マーカー、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子に対する、現在の形質転換方法論の適合性を実証する。市販のユーカリプツス・グランディス x ウロフィラクローンIPB1の葉移植片を、GUS遺伝子（構成的プロモーターによって駆動される）およびNPTII遺伝子（異なる構成的プロモーターによって駆動される）を含むpWVC33を有するアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。形質転換の前に、この移植片を、オーキシン増加（標準再生培地において0.1mg/l NAAの代わりに2mg/lのIAA）およびアセトシリンゴン（250μM）を有する培地上で4日間前培養した。実施例6に記載されるように、移植片をアセトシリンゴンで感染させ、同じ培地上で3日間同時培養し、次いで4日間、400mg/l チメンチンを補充した再生培地に移した。次いで、移植片を、除草剤選択剤の代わりにジェネティシンを含む選択培地に移した。

形質転換体を、ジェネティシン（20または30mg/lのいずれか）を含むジェネティシン選択培地上に配置した。除草剤選択培地で使用された3または4週間の移動サイクルの代わりに、移植片を新鮮なジェネティシン培地に2週間毎に移した。ジェネティシン選択培地上での約10週間の成長後、ジェネティシン耐性カルスの試料を収集し、実施例7に記載されるようにGUS発現についてx-glucで染色した。以下のデータは、ジェネティシンによって選択された形質転換体におけるGUS発現を要約する。

（表１８）抗生物質選択マーカー（NPTII）を有するユーカリプツス・グランディス x ウロフィラクローンIPB1の形質転換

実施例23
本実施例は、ユーカリ移植片が、P35SGUSINT（35S::GUSINT、NOS::NPTII）を有するアグロバクテリウム株GV2260で形質転換され得ることを実証する。実施例16において開示される方法と同様に、ユーカリプツス・カマデュレンシスクローンC9を、p35SGUSINTを有するGV2260で形質転換した。再生後、移植片をジェネティシン（30、40、50、または60mg/lジェネティシン）を含む選択培地に移した。30および50mg/lのレベルのジェネティシンについては、さらなるセットの移植片を1日間前培養した。選択培地上での8週間の後、初期発生段階にあるジェネティシン耐性シュート培養の試料を収集し、GUS発現についてx-glucで染色した。GUS発現データを以下の表に要約する。

（表１９）抗生物質選択マーカー（NPTII）を有するユーカリプツス・カマデュレンシスクローンC9の形質転換

GUSポジティブシュート株は全ての処理から一貫して産生した。より高濃度のジェネティシンおよびより短い前培養時間は、限られた逸出を有するトランスジェニック株を生じた。

実施例24
本実施例は、市販のユーカリプツス・グランディスクローンが、別の構築物pWVR8（シロイヌナズナActinII::GUSINT、構成的::NPTII）を有するアグロバクテリウム株GV2260を用いて形質転換され得ることを実証する。実施例4に記載されるように、ユーカリプツス・グランディスクローンIP1からの葉移植片を、オーキシンおよびアグロバクテリウムインデューサーを含む前培養培地上で前培養した。この移植片をアグロバクテリウムで形質転換し、オーキシン増加（標準再生培地において0.1mg/l NAAの代わりに2mg/lのIAA）およびアセトシリンゴン（250μM）を有する前培養培地上で3日間同時培養した。次いで、この移植片を400mg/lチメンチンを補充したEuc再生培地に4日間移した。ついでこの移植片を、ジェネティシン（30または40mg/lジェネティシン）を含む選択培地に移した。選択培地上で8日間の後、初期発生段階にあるジェネティシン耐性シュート培養の試料を収集し、GUS発現についてx-glucで染色した。GUS発現データを表20に要約する。

（表２０）抗生物質選択マーカー（NPTII）を有するユーカリプツス・カマデュレンシスクローンIP1の形質転換

実施例25
上記の実施例からのデータに基づいて、優良ユーカリクローンは、開示された方法によって外来性DNAで形質転換され得る。例えば、優良ユーカリクローンは、セルロースシンターゼなどのセルロース合成に関与する酵素をコードする遺伝子で形質転換され得る。セルロースシンターゼはUDP-グルコースに結合し、新生グルカン鎖の非還元末端に糖を転移させる。本発明の方法を使用して、UDP-グルコース結合ドメインがトランスジェニック植物において過剰発現され得る

構成的プロモーターに作動可能に連結されたセンスUDP-グルコース結合ドメイン配列を用いるユーカリ選抜クローンの形質転換は、セルロース合成、木材密度、および引っ張り強度の増加によって明示されるような成長表現型の増強を付与する。葉移植片はユーカリ植物株から収集され、この移植片を前培養培地上で培養される。この前培養培地は、組織移植片の切除された端に沿って細胞分裂を刺激するために、オーキシン、サイトカイニン、およびアグロバクテリウムインデューサー（例えば、アセトシリンゴン）を含む。4日間の前培養後、移植片に、構成的プロモーターに作動可能に連結されているGSコード領域の一部を有するプラスミドを含むアグロバクテリウム株GV2260を接種した。この移植片を3日間同時培養し、その後Euc再生培地に移した。この移植片をEuc再生培地上で4日間培養し、その後除草剤を含む選択培地に移した。

除草剤耐性形質転換体の選択後、この形質転換体をGUS発現についてアッセイした。GUS発現の確認の際に、シュートを収集し、そして根形成培地に移した。この根形成培地は5g/l活性炭を補充したBTM-1塩を含み、根の発生は通常2〜4週間で起こる。初代根系の発生の際に、形質転換植物を土壌に移す。

実施例26-トランスジェニック植物を選択する際のALS/スルホニルウレアの評価
本実施例は、モデル植物における選択のために十分なレベルでスルホニルウレア系除草剤を含む培地中での、ALSをコードする選択マーカーを使用する、遺伝子形質転換したマツの選択を記載する。以下の実施例において記載されるものを含む、いくつかの実験においては、植物組織中でals遺伝子を発現するベクターが、植物組織中でnptII遺伝子を発現するベクターを有する細胞に同時衝撃され、次いでその同時衝撃された細胞が2つの群に分けられて、スルホニルウレア系除草剤またはジェネティシンのいずれかを含む選択培地に配置され、その結果、形質転換体がジェネティシン上で選択される頻度が、除草剤上での選択の頻度と比較され得る。

テーダマツ（Pinus taeda）および雑種のマツ（P. taeda x P. rigida）の胚形成細胞株は、米国特許第5,506,136号に記載されている手順を使用して、個々の未成熟大配偶体の接合体胚から始められた。未成熟種子球果を、Charleston, South Carolinaの近くの栽培果樹園から収集し、そのときに優性接合体胚は発生の前子葉段階にある。von Arnold and Hakman(J. Plant Phys., 132: 164-169 (1988) )の分類系を使用すると、この段階にある優性接合体胚は段階2であるといわれる：すなわち、平滑かつ光沢のある表面を有する、突出した胚領域を有する胚であり、高度に空胞化した長いサスペンダー細胞が境界を形成している。しかし、発生のより初期（段階1）にある接合体胚もまた、胚形成培養を効果的に惹起するために使用され得る。

培養開始のために、種子球果から取り出したインタクトな種子を、10から20%の市販のブリーチ溶液（0.525%から1.050%の次亜塩素酸ナトリウム溶液と等価）を用いて15分間表面滅菌し、続いて3回滅菌水ですすいだ（各5分間の時間）。次いで、インタクトな大配偶体（これは発生しつつある接合体胚を含む）を、種皮および核膜から除去し、DCR₁またはWV5₁開始培地上に配置した。

マツの胚形成培養開始のために有効なbasal salt混合物には、表21に列挙されるDCRまたはWV5のbasal salt処方が含まれるがこれらに限定されない。本実施例および後の実施例におけるマツの胚形成培養の開始、維持、および増殖性成長のために使用される完全培地処方を表22に列挙する。培地のpHは、110kPa（16psi）および121℃で20分間のオートクレーブの前に、KOHおよびKClを用いて5.8に調整した。植物組織培養における当業者は、多くの他の滅菌条件が本発明の方法に伴って使用され得ることを認識している。

（表２１）マツの胚形成のための基礎培養培地処方

^aCoke(1996)による。
^bGupta and Durzan (1985)による。
^cBecwar et al. (1990)による。
^dフィルター滅菌した水性保存として、まだ暖かい（約60℃）間にオートクレーブした培地に加える。

（表２２）マツの胚形成のための開始培地、維持培地、および増殖培地

^a基礎培地の組成については表19を参照されたい。
^b以下の実施例のいくつかにおいては、カゼイン加水分解物の代わりに定義されたアミノ酸混合物に置換されている。
^cGELRITE（登録商標）（Merck,Inc.によって製造されたジェランガム）。
^d2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）またはナフタレン酢酸。
^eN⁶-ベンジルアミノプリン（BAP）またはN⁶-ベンジルアデニン（BA）。
^f全てのゲル化培地について、約10、15、または20mlの培地を各100×15mmの滅菌ペトリ皿に注ぎ、培地を使用するまで冷蔵するかまたは室温で保存した。全ての液体培養培地について、ゲル化剤を加えず、かつ培地を、使用前に冷蔵または冷凍下において500mlバッチで保存する。

各ペトリ皿の周囲を、NESCOFILM（登録商標）（Karlan Companyから市販されている）の2包みでシールした。この皿を、23℃±2℃の一定の温度で暗所にてインキュベートした。約7〜21日後、胚形成組織が大配偶体移植片の珠孔から突き出た。開始培地上での移植片の配置後6週間で、個々の移植片から突き出てかつ増殖した組織塊を、維持培地DCR₂またはWV5₂上の個々のペトリプレートに単離した。個体に株番号を割り振った。

維持培地上の1〜3ヶ月の培養後、組織培養物を凍結保存した。具体的には、細胞を、0.2〜0.4Mソルビトールの最終濃度のために、ソルビトールを含む等量の液体DCR培地に加えた。凍結保護剤ジメチルスルホキシド（DMSO）のアリコートを氷上の懸濁物に加え、DMSOの最終濃度を10%にした。次いで、DMSOを含む細胞懸濁物の1ミリリットルのアリコートを凍結バイアルに移し、プログラム可能なフリーザー内に配置し、そして1分間あたり0.33℃で-35℃まで冷却した。続いて、凍結バイアルを、長期保存のために、凍結生物保存容器の内側の液体窒素中に浸漬した。植物組織培養の当業者は、他の凍結保存プロトコールが本発明に適用可能であることを認識している。

凍結した培養物を、凍結生物保存容器から個々のバイアルを取り出すこと、および凍結した細胞懸濁物を急速に融解させるために42℃±2℃の水中にバイアルを配置することによって実験的使用のために回収した。融解した細胞懸濁物を、無菌的に凍結バイアルから、滅菌濾紙（Whatman no. 2、Whatman International Ltd.）の上に配置した滅菌ポリエステルメンブレン支持体（Sefarから市販されているポリエステル繊維、PeCap（登録商標）カタログ番号7-35/11の一巻きからカット）に数分間注ぎ、DMSO凍結保護剤溶液を胚形成組織から紙に拡散させた。次いで、ポリエステル支持メンブレン上の胚形成組織をDCR₂維持培地に移し、暗所で24時間、23℃においてインキュベートして、さらなるDMSOを組織から培地に拡散させた。次いで、胚形成組織を有するポリエステル支持体を培地から取り出し、新鮮なDCR₂維持培地に移し、そしてその後、プレートあたりの細胞の量が約1gに達するまで、14〜21日毎に新鮮な培地に移した。凍結保護剤回収後および成長の間の培養環境は、暗所で23℃±2℃であった。当業者は、多くの異なる凍結保存剤および回収手順が本発明の方法に伴って使用され得ること、および本実施例の詳細は本発明の方法の適用を制限されない可能性があることを認識する。

3つの異なるファミリー（2つの遺伝的に多様なテーダマツファミリーおよびテーダマツ×ヤニマツの雑種のファミリー）からの3つの胚形成株を、実験のために使用した。遺伝子が異なる組織培養株の各々からの均一な懸濁培養を、250ml Nepheloサイドアームフラスコ（Kontes Chemistry and Life Sciences Products）に、20mlのDCR₄液体培地中の1gの組織各々を接種することによって樹立した。液体培地中の細胞を含むフラスコを、暗培養室中で、23℃±2℃の温度で、100rpmのジャウロ回転振盪機上に配置した。1週間後、各フラスコ中の液体を、15mlの新鮮な培地を培養フラスコに注ぐこと、および均一に細胞を分配するために回転させることによって、35mlまでにする。細胞増殖を、細胞および培地をフラスコのサイドアーム部分にデカントすることによって測定し、細胞を30分間定着させ、次いで定着した細胞の体積（SCV）を測定する。SCVは最大SCVの半分以上である場合（フラスコの体積の50%が植物細胞によって占められた）、各培養物を、総計80mlの細胞および培地を含む500mlサイドアームフラスコに移した。移した培養物を同じ条件下で維持する。

これらの3つのマツ株の各々の懸濁細胞からの20個の同一の複製を、米国特許第6,518,485号において記載される方法に従って遺伝子移入のために調製した。所定の重量のポリエスエルメンブレン支持体を、オートクレーブによって滅菌し、別々の滅菌Buchner漏斗に配置し、そして1.5mlのSCV30の均質なマツ胚形成懸濁物を、胚形成組織が均一に支持体の表面上に分配されるように、各支持体にピペットで移した。次に、液体培地を、穏やかな減圧を使用して組織から吸引し、そして胚形成組織を有する各支持体を、100×25mmプラスチックペトリ皿中のGelrite（登録商標）固化DCR₃調製培地（表20）上に配置した。これは約24時間の間、暗生育チャンバー内で23℃±2℃にインキュベートする。次いで、PDS-1000/He BIOLISTICS（登録商標）粒子送達システム（Bio-Rad Laboratoriesから利用可能）を使用するキャリア粒子（微粒子銃）衝撃技術によって、DNAを組織および/または胚に移す。関心対象のDNA、ここでは、可視化マーカーuidAおよび潜在的な選択マーカーals、ならびに選択マーカーnptIIをそれぞれ含む等モル量のベクターを、金微粒子の表面に沈殿させた。次いで、繊維支持体および胚組織を有するペトリ皿をPDS-1000/He BIOLISTICS（登録商標）デバイスの内部に配置し、そして減圧を28インチHgのレベルまで適用した。1μgのDNAを有する金粒子は、1550psi破裂ディスクによって調節されるヘリウムの増加および破裂後に、胚形成組織の各プレートに向かって加速された。PDS-1000//He BIOLISTICS（登録商標）デバイスにおいて、破裂ディスクおよびマクロキャリアとの間の距離（ギャップ距離）は5mmであり、マクロキャリアの移動距離は13mmであった。DNA移入後、繊維支持体および組織を含むペトリ皿を、約24時間、23℃±2℃で暗生育チャンバー中でインキュベートした。次いで、組織および繊維支持体を、キャリア粒子衝撃から回収するために半固形維持培地、DCR₁（表20）に移し、そして5日間の間、23℃±2℃で暗生育チャンバー中でインキュベートした。この時点で、1細胞株あたり1プレートをGUS染色（組織培養細胞中で発現されるβ-グルクロニダーゼ酵素をコードする挿入されたuidA遺伝子は、発色性グルクロニダーゼ酵素基質、「X-gluc」（Inalcoから市販されている）への曝露の際にトランスジェニック株の各々からの細胞の深い青色染色によって検出された）、および顕微鏡検査のために使用し、これは、細胞分裂が再開されたこと、およびuidA導入遺伝子の一過性発現が、これらの衝撃について通常の頻度を示すことを実証する。

次いで、残りの組織を、選択培地、非形質転換細胞の増殖に対して阻害的である一定のレベルの選択剤を含む半固形維持培地DCR₁に、それらの繊維支持体上に移した。本実施例において、複製の2分の1を、15mg/Lのジェネティシン（Gibco/BRLより市販されている）を含む選択培地上に配置し、他の半分を、50nM Oust（登録商標）（DuPont（商標）から市販されている）を含む選択培地上に配置した。これらのプレートを、23℃±2℃で暗生育チャンバー中でインキュベートし、組織を有する繊維支持体を、3週間毎に同じ組成の新鮮な培養培地に移した。

選択培地上の活性のある増殖は、ペトリ皿の多くの上で探知された多数の領域中で起こる。選択剤の存在下でのこのような活性な増殖は、通常、増殖している組織が、組み込まれた選択遺伝子それらの染色体に有しており、かつ安定に形質転換されていることの表示である。活性増殖のこれらの領域は、独立した形質転換事象として扱われ、これからは推定のトランスジェニック亜系統と呼ぶ。推定のトランスジェニック胚形成組織は、それぞれの選択剤を補充した新鮮な半固形DCR₂培地に、増殖している領域を移すことによって増殖した。いずれの活性に増殖している推定のトランスジェニック胚形成組織も、トランスジェニック胚形成組織の個々の亜系統の増殖に依存して、約6〜12週間の期間の間、3週間間隔で新鮮な半固形維持選択培地に移した。

安定な形質転換は、ジェネティシンに対して選択され、選択培地上での増殖の組み合わせ、可視化マーカー遺伝子の発現についてのアッセイ、および導入遺伝子DNA配列の特定のセグメントのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を通して試験され、12個の推定のトランスジェニック亜系統の100%で確認された。これらの技術は、分子生物学の分野における当業者に周知の技術を使用して実行された。Oustに対して試験および選択された推定のトランスジェニック亜系統の80%が偽陽性であった。

実施例27-スルホニルウレアの選択性に対するカゼイン加水分解物の評価
2つの各々が異なる3つの異なるファミリーからである（2つの遺伝的に多様なテーダマツファミリーおよび1つのテーダマツ×ヤニマツの雑種）、6つの胚形成株を評価した。遺伝的に異なる組織培養株の各々からの均一な懸濁培養物を、実施例26に記載されるように樹立した。これらの6つの株の各々の懸濁細胞からの3つの同一の複製を、実施例26に記載されるように、DCR2培地の10個の処方、すなわち、カゼイン加水分解物のあるなし、および0、10、20、40、および80nMの除草剤Oustを含む各々に配置した。プレートをシールし、実施例26の実験開始前段階、維持段階、および選択段階のために使用されるのと同じ条件下でインキュベートした。3週間毎に培養物を、ポリエステル支持体上で組織の滅菌条件下で秤量後、以前に提供したのと同じ処方の新鮮な培地に移した。全体で12週間後の6種の細胞株の各々についてのこれらの培地上での増殖を図9に示す。

図9は、スルホニルウレア除草剤Oustが、カゼイン加水分解物の非存在下でのみ、複数の濃度において選択剤として成功したことを示す。

除草剤がトランスジェニック細胞のための選択剤として使用されるならば所望されることである、任意の濃度のスルホニルウレア除草剤Oustを使用して細胞の増殖を停止することは、カゼイン加水分解物の非存在下以外では達成されない。増殖は、分枝鎖アミノ酸の生合成を阻害するOustの存在と同時に、カゼイン加水分解物の非存在下において有意な程度まで遅延または停止し、このことは、分枝鎖アミノ酸生合成がこれらの細胞の増殖の間に活性であること、および確かに分枝鎖アミノ酸が増殖のために必須であることを示唆する。植物組織培養の分野における当業者の間で一般的に保持されている信念とは反対に、細胞は、培地中にカゼイン加水分解物がなくても増殖が可能であった；しかし、ある細胞株は、増殖レベルの低下を受けた。

さらなる実験は、少なくとも1つの株が、カゼインを欠く培地上での維持の後、同じ株がカゼインを含む培地上での維持後示していた、発芽可能な胚を産生する能力を喪失したことを実証した。また、2つの他の株は、カゼイン加水分解物を含む培地上での維持後に示した能力と比較して、カゼイン加水分解物を欠く培地上での維持後に、発芽可能な胚を産生する能力の有意な減少を示した。発芽可能な胚を産生する能力は、以下のようにして測定した。0 nM Oust除草剤上で培養した細胞塊が12週間の間増殖した後、これらをDCR₃液体培地に再度再懸濁した。細胞懸濁物を均一な（最大の半分）SCVにし、等量の懸濁培養細胞を、培養が高品質の収集可能な段階3（子葉）胚を発生する能力を評価するために、米国特許第5,506,136号に記載されるように、MSG₁発生/成熟培地（図23）上への配置のために滅菌メンブレン支持体にピペットで移した。ディッシュを23±2℃で暗生育チャンバー中でインキュベートした。メンブレン支持体を、新鮮な培地を含む新たなペトリ皿に3週間毎に移した。9週目に、段階3（子葉）胚が、発芽品質について目視で分析された。

（表２３）マツの胚形成細胞のための発生/成熟培地および発芽培地

^a基礎培地の組成については表19を参照されたい。
^bGELRITE（登録商標）（Merck,Inc.によって製造されたジェランガム）
^cポリエチレングリコール（分子量4000）
^dアブシジン酸

実施例28-カゼイン加水分解物を含まない培地を使用するスルホニルウレアの評価
本実施例において、4つの選抜したファミリーからの5つのテーダマツ株を、als選択マーカーを含むプラスミドを用いて形質転換し、そして選択を、カゼイン加水分解物を除外するように改変したスルホニルウレア含有培地上で行った。5つのマツ細胞株は、5つの株の1つがジョージア州のInternational Paper seed 果樹園において交雑された優良テーダマツであった以外は、実施例26に記載されるように惹起された。株を凍結保存し、実施例26に記載される誘導体に均一な懸濁物として培養した。

遺伝子移入のために準備するために、ポリエステルメンブレン支持体をオートクレーブによって滅菌し、別々の滅菌Buchner漏斗中に配置し、そして細胞株あたり6つの複製プレートの各々について、1〜3mlのマツ胚形成懸濁物を、胚形成組織が均一に分配されるように各支持体にピペットで移した。液体培地を組織から吸引し、胚形成組織を有する各支持体を、米国特許出願公開第2002-0100083号に記載される方法に従って、アグロバクテリウム接種のためのゲル化DCR₃調製培地上に配置した。具体的には、als選択マーカーを含むバイナリ構築物を、当業者に周知の技術によってアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスに導入し、そしてビルレンスは、誘導されたアグロバクテリウムが植物物質と混合される、一般的に使用される技術によって、アセトシリンゴンの投与に伴って誘導された。細胞を、暗所で22℃±2℃で、約72時間の間同時培養した。

同時培養後、アグロバクテリウムを培養から絶滅させた。細胞を、400mg/L TIMENTIN（登録商標）を含む新鮮なDCR₄液体洗浄培地（表20）に再懸濁した。再懸濁を、ピンセットを使用して感染した細胞を有する各メンブレン支持体をつかむことによって開始し、それが液体洗浄に配置され得るようにそれを回転させる。細胞を懸濁物中に得るために液体を穏やかに攪拌し、そして細胞がメンブレン支持体に付着している場合には、これを滅菌ピンセットを用いてこすり取る。一旦細胞が懸濁物中に存在すると、メンブレンは除去された。

各洗浄工程の後、再度、新鮮な滅菌支持体メンブレンをBuchner漏斗中に配置すること、植物細胞の懸濁物をメンブレンにピペットで移すこと、および穏やかな減圧を使用して組織から液体培地を吸引することによって、細胞を、以前の段階において使用されたのと同じ新鮮な滅菌支持メンブレンにプレートした。さらなる洗浄を、細胞からの培地のドレインが清澄になるまで実行した。各々の逐次的な洗浄サイクルにおいて、細胞を有するメンブレンを液体中で攪拌すること、ピンセットを用いて穏やかにこすりとることによって付着している細胞を取り出すことによって、細胞を、新鮮な滅菌洗浄培地に再懸濁した。次いで、細胞を、Buchner漏斗上の新鮮なメンブレン支持体上に再プレートした。アグロバクテリウムで形質転換し、かつ記載されるように洗浄した株を、培地が10mM ABAおよび400mg/l Timentin（登録商標）を含むこと以外は実施例26に記載されるように、ゲル化したDCR培地にプレートする。この回収処理を1週間継続する。次いで、ポリエステルメンブレン支持体上に保持された細胞を、培地がまたカゼイン加水分解物を含まず、選択のために50nMまたは100nM Ally（登録商標）（DuPont（商標））のいずれかを含むこと以外は同じ培地に移し、次いで、2週間の間隔で新鮮な選択培地に移した。7個の推定の形質転換された亜系統を、約2gに達した後で、標準的な技術を使用して、導入遺伝子の存在の確認のために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために選択した。反応のために使用したプライマー対を表24に示す。

（表２４）PCRのためのプライマー対

ALS遺伝子の検出のために、2セットのプライマーを使用し、これらは、野生型マツ遺伝子からの生成物を生じないように選択された。推定の形質転換された亜種は、マツPAL遺伝子についてのプライマーがポジティブ対照産物を生じ、virD遺伝子についてのプライマーが産物を生じず（アグロバクテリウムの夾雑が残っていないことを示す）、および適切な導入遺伝子についてのプライマーが産物を生じるならば、トランスジェニックであると確認された。試験された7個の形質転換体のうちの6個がポジティブであった。このことは、実施例26と比較した場合に、本発明において使用された改善された選択条件の結果として、14%のみの偽陽性の割合を示す。このことは、カゼイン選択法の非存在が、als選択マーカーおよび選択剤としてのスルホニルウレア系を使用して、形質転換された細胞を選択するために十分であることを実証する。

しかし、この実験において選択されたトランスジェニック細胞は増殖が遅く、かつ収集可能な、再生可能な胚に分化するには十分移植片健常ではないようである。従って、カゼイン加水分解物が除外されている改善された選択方法は、有用な再生系を支持するために十分ではなく、胚形成細胞の正常な増殖および発生のためにさらなる改善が必要とされることが明らかである

実施例29-選択マーカーALSまたはASA2を有するベクターの調製
構成的プロモーターによって駆動される、レポーター遺伝子およびnptII選択マーカーならびに代替的な選択マーカーalsまたはasa2を含む、DNAベクターを設計した。ベクター中の遺伝子の相対的な位置は、バイナリベクターにおいて、選択マーカーnptIIが、形質転換の間にほとんどの場合失われるボーダーの近くにあり、および代替的な選択マーカーが、nptII遺伝子とuidAレポーター遺伝子との間にあるように設計された。これは、細胞が最初にまたは並行してnptIIを使用して選択され得、かつnptII遺伝子の存在が、首尾よいジェネティシン選択によって明らかになるように、これらの2つの遺伝子間の連結された代替的な選択マーカーが存在する高い可能性の証拠である、選択実験を可能にするために実行された。この構成は、代替的なマーカー選択条件が樹立されるまで、形質転換の成功の迅速な非分子的尺度を使用して、選択系の試験および開発を容易にした。ベクターは、便利な制限部位が、nptII遺伝子およびuidA遺伝子の引き続く除去、ならびに関心対象の他の遺伝子の挿入を可能にするように設計した。形質転換の間に最も頻繁に失われるボーダーの近くに位置する代替的な選択マーカーは、関心対象の遺伝子が代替的な選択マーカーと同時移入されることを可能にする。

als遺伝子は公知であり、公的に利用可能である。GenBankは植物からの多数のals遺伝子を含む。例えば、GenBankアクセッション番号gi30693053、gi30685789、およびgi30685785は、Arabidopsis thalianaから単離されたals遺伝子を提供する。任意のals遺伝子が使用され得るが、本発明は、SalIおよびSmaIを使用して、pML1（DuPont（商標））からサブクローニングしたalsカセットを使用した。次いで、alsカセットをベクターBluescript（商標）（Stratagene）にクローニングし、構築物pWVC20（図1）を作製した。このカセットは、p2554（Norris et al. 1993. Plant Molecular Biology, 21: 895-906）から制限酵素HindIIIおよびNcoIを使用してサブクローニングしたユビキチンプロモーターの発現下に配置されてpWVC22を作製し、さらなる制限部位を提供し、かつ高コピー蓄積を可能にする。次いで、ApaIおよびNotIで制限された、より大きな（4.9kb）als植物発現カセットを、als植物発現カセットが、nptII遺伝子とuidA遺伝子の間に位置し、かつ便利な制限部位に隣接するように、異なる構成的プロモーターによって駆動されるnptII遺伝子およびuidA遺伝子を含むバイナリベクターに挿入し、pWVC23（図3）およびpWVC24（図4）を生じた。従って、uidAおよびals植物発現カセットのみを含むpWVC25（図5）、および関心対象のカセットがals選択を使用する植物への挿入のためにクローニングされ得るals植物発現カセットのみを含むpWVC36を得ることは簡単である。このような関心対象のカセットは、関心対象の分子の産生を付加するかまたは増加する遺伝子、例えば、シリンジルリグニン生合成移植片遺伝子またはストレス耐性遺伝子、または関心対象の分子の産生を減少するRNAiもしくはアンチセンス構築物を含み得る。

asa2遺伝子は公知であり、公的に利用可能である。GenBankは植物からの多数のasa2遺伝子を含む。例えば、GenBankアクセッション番号gi4256949、gi3348125は、植物から単離されたasa2遺伝子を提供する。任意のasa2遺伝子が使用され得るが、本発明は、SphIおよびBamHIを使用して、pUC35SASA2（Song, H. S. et al. (1998) Plant Physio. 117: 2: 533-548）からサブクローニングしたasa2遺伝子を使用して、pWVC30（図6）のための4800bpのプロモーターのないフラグメントを与え、そしてp2554からサブクローニングしたユビキチンプロモーターの発現制御下に配置された。このT4リガーゼ処理されたカセットをBluescript（商標）ベクターpBSKII+にクローニングし、さらなる制限部位ApaIおよびNotIを提供する。これらの制限酵素を使用して3800bpフラグメントを切り出し、これは、異なる構成的プロモーターによって駆動されるnptII遺伝子およびuidA遺伝子を含むバイナリベクターに連結され、上記のように、pWVC33（図7）を産生したasa2植物発現カセットは、nptII遺伝子とuidA遺伝子の間に位置し、かつさらなる便利な制限部位に隣接される。

従って、uidAおよびasa2植物発現カセットのみを含むpWVC34（図8）、および関心対象のカセットがasa2選択を使用する植物への挿入のためにクローニングされ得るasa2植物発現カセットのみを含むpWVC35（図8）を得ることは簡単である。このような関心対象のカセットは、関心対象の分子の産生を付加するかまたは増加する遺伝子、例えば、シリンジルリグニン生合成移植片遺伝子またはストレス耐性遺伝子、または関心対象の分子の産生を減少するRNAiもしくはアンチセンス構築物を含み得る。

プラスミドpWVC23（図3）、PWVC24（図4）、およびpWVC33（図7）を、標準的な技術を使用して、大腸菌 XL-10 -Gold細菌コンピテント細胞株、およびアグロバクテリウム・ツメフェイシェンス細胞株GV2260に形質転換した。

実施例30
テーダマツ細胞株を、実施例28と同じ方法を使用する形質転換のために調製し、そしてこれもまた実施例28に記載されるように、pWVC23（図5）で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスとともに同時培養した。アグロバクテリウムの根絶後、各細胞株を、15mg/Lジェネティシンまたは50もしくは100nMのいずれかのAllyのいずれかを含む選択培地に等しく分けた。推定の形質転換した亜系統を十分なサイズまで生育させ、Ally含有培地上で生育した9個の亜系統をジェネティシン含有培地に移し、PCRの前に迅速に形質転換状態をチェックした。これらの株の100%がジェネティシン含有培地上で生育可能であった。次いで、5個のこれらの株を、実施例28に記載される6個のプライマー対を使用するPCRを用いてチェックした。これらの株の100%がPCRによってポジティブな形質転換体と確認された。しかし、これらの株は、実施例28に記載される株と同じ非再生表現型を示した。

同様の実験において、5個のテーダマツ株および雑種のマツ株を、5個の株のうちの1個が、トレス バラス（Tres Barras）、ブラジルのリゲサ種果樹園から収集した球果から惹起した以外は、実施例28の方法を使用して形質転換のために調製した。これらの株を、実施例28に記載されるように、pWVC24（図4）を用いて形質転換されたアグロバクテリウムを用いて同時培養した。アグロバクテリウムの根絶後、各細胞株を、15mg/Lジェネティシンまたは50、75、100もしくは125nMのいずれかのAllyのいずれかを含む選択培地に等しく分けた。

8週間の選択後、推定の形質転換した亜系統を、ジェネティシンおよび4つのレベルの各々のAllyに対して生育させた。形質転換を、GUS染色およびPCRを用いて確証した。しかし、これらの株は、実施例28に記載される株と同じ非再生表現型を示した。

実施例31.合成カゼイン加水分解物混合物の調製および試験
カゼイン加水分解物は、カゼインミルクタンパク質の加水分解によって得られる主として遊離のアミノ酸を含むが、ある程度の遊離のアンモニアおよび少量のジペプチド、トリペプチド、およびより複雑なペプチドもまた含む複雑な混合物である、以下の表23は、2つの異なる年度のSigma（登録商標）において引用された分析手順によって決定されるような、カゼイン加水分解物の遊離のアミノ酸組成および遊離のアンモニア組成を示す。

（表２５）カゼイン（Sigma（C4523））のトリプシン消化
代表的な遊離アミノ酸アッセイ（mg/gカゼイン）

合成カゼイン加水分解物を設計する際に、天然のカゼイン加水分解物中の成分のいくつかは植物細胞の増殖および分化を促進するのに対して、他のものは反対の効果を有することが認識された。従って、植物の増殖および分化を妨げることが知られている成分のみを置き換えることが重要であった。種々の合成カゼイン加水分解物混合物が調製され、これらを表26に記載する。

（表２６）合成カゼイン加水分解物混合物

この合成混合物を、7つの遺伝的に多様なファミリーからの13個のテーダマツ株および雑種マツ株において試験した。これらの株を、実施例26に記載されるように開始されかつ凍結保存し、そして均一な懸濁培養に配置し、実施例27に記載されるようにそれぞれの培地処理にプレートした。これらの実験のための培地は、0.5g/Lカゼイン加水分解物を含むか、表24に示される比率を有す0.5g/Lの誘導された混合物の1つを含むか、またはカゼインおよびアミノ酸混合物の両方を欠くかのいずれかであるDCR₂維持培地を含み、そしてこれらの処理の各々が、除草剤Ally（登録商標）（DuPont（商標）から市販されている）の0、10、30、または50nMの各々を供給される。6週間後の増殖データを、図10に示すように、13株全てに対して平均化した。

図10は、カゼイン加水分解物の非存在が植物増殖を減少させることを示す。一方、両方の合成混合物は、カゼイン加水分解物を含む培地上で達成されたものと同じかまたはそれ以上の増殖を支持する。これらの結果は、増殖のためのカゼイン加水分解物の必要性が合成物への置き換えによって満たされたこと、およびこのような置き換えは胚形成マツ培養の優れた増殖を促進することを示す。

さらに、これらの結果は、増殖が、分枝鎖アミノ酸が存在せず、またスルホニルウレア除草剤Ally（登録商標）を含むアミノ酸混合物を含む培地上で有意な程度、遅延または停止することを示す。このことは、分枝鎖アミノ酸生合成が増殖のために必須であることを確証する。さらに、これらのデータは、スルホニルウレア系除草剤Ally（登録商標）による細胞の増殖遅延が、カゼイン加水分解物の非存在下と、分枝鎖アミノ酸を欠く混合物の存在において少なくとも同程度に有効であることを示す。

別の実験において、10個の異なるテーダマツ株および雑種のマツ株が、8つの遺伝的に多様なファミリーから使用された。これらの株を、実施例26に記載されるように、開始されおよび凍結保存し、均一な懸濁培養に配置し、そして実施例26に記載されるようにそれぞれの培地処理にプレートした。これらの実験のための培地は、0.5g/Lカゼイン加水分解物を含むか、表24に示される比率を有する0.5g/Lの誘導混合物AA4を含むか、またはカゼインおよびアミノ酸混合物の両方を欠くかのいずれかであるDCR₂維持培地を含み、そしてこれらの処理の各々が、5-メチルトリプトファン（5MT)の0、3、10、または30mg/Lの各々を供給される。新鮮な培地への移動を実行し、重量を、2〜3週間毎、図11に示される時間測定した。縦軸は、それぞれの時間後の全体の重量増加（g）である。

図11は、混合物AA4がカゼイン加水分解物を置き換えることができること、およびトリプトファンの非存在下でのみ、5-メチルトリプトファンの適用に伴う増殖の満足な減少を得ることが可能であることを示す。これらのデータはさらに、トリプトファンを欠く培地上で最初の2週間以内、および5-メチルトリプトファンの致死的なレベルを含むことが、いくらかの増殖がなお起こることを示す。このことは、通常のカゼイン加水分解物含有培地中での前の培養からの組織において得られるアミノ酸（例えば、この場合はトリプトファン）の前枯渇が、アミノ酸生合成経路をブロックする選択マーカーを使用するための有効な手段を提供する。

実施例32.5MTおよびAMTの選択性の評価
2個のテーダマツ細胞株を、実施例28の方法を使用する形質転換のために調製し、実施例28に記載されるように、pWVC33（図7）で形質転換したアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスとともに同時培養した。アグロバクテリウムの根絶後、各細胞株を、6枚のプレートに等しく分け、各々5つの異なる選択培地が、カゼイン加水分解物および15mg/Lのジェネティシン、またはアミノ酸混合物AA4および30もしくは50mg/Lの5-メチルトリプトファン（5MT）または30もしくは50mg/Lのα-メチルトリプトファン（AMT）のいずれかを含んだ。これらの結果を図12に示す。推定の形質転換された亜系統は、30mg/Lのメチル化トリプトファン選択性アナログが取り込まれた場合に、ジェネティシン含有プレートおよび両方の選択処理で増殖した。

推定の形質転換体が十分なサイズである後で、これらは、これらがマツネイティブなASA2遺伝子からの生成物を生じないように特異的に設計した、asa2についての以下のプライマー対とともに、実施例28において記載されるnptII、uidA、VirD、およびPALのプライマー対を使用するPCRによって確認した。

（表２７）PCRのためのプライマー対

PCRの結果を以下の表28に示す。偽陽性の割合は選択処理間で有意に異なっていない。

（表２８）asa2のPCRの結果

引き続く実験は、カゼインを含まない調製培地および回収培地を提供することによって、または調製培地および回収培地中でアミノ酸混合物AA4を提供することによって、選択の前の培地中のアミノ酸の枯渇を試験した。

実施例33
この実験において、実施例30と同様に、選抜したファミリーからのBrazilianテーダマツ株を含む、6個の遺伝的に多様なテーダマツ株および雑種マツ株を、実施例28と同様に形質転換のために調製し、かつ同時培養し、pWVC24（図4）またはpWVC33（図7）で形質転換したアグロバクテリウム株間の各々の細胞を分けた。

各株からの細胞を洗浄し、分枝鎖アミノ酸およびトリプトファンの1週間の枯渇になるように、カゼイン加水分解物を欠く回収培地上でプレートした。細胞を、DCRまたはMi3のいずれかを使用して、basal saltが変化している選択処理にわたって分けた（表27）。これは、実施例30〜33において選択培地に対してなされた改変が、異なるbasal salt処方においては異なって作用しないが、木本植物の組織培養の当業者に公知である任意の塩処方において適用可能であることを実証する。pWVC24（図4）を用いる形質転換体を、両方の塩処方において、ジェネティシン選択培地およびAlly選択培地から回収する。pWVC33（図7）を有する形質転換体を、両方の塩処方において、ジェネティシン選択培地およびα-メチルトリプトファン選択培地から回収する。alsまたはasa2のいずれも含まない対照プラスミドを使用する形質転換体を、両方の塩処方において、ジェネティシン選択培地から回収する。これらの結果は、実施例30〜33において選択培地に対してなされた改変が、異なるbasal salt処方においては異なって作用しなかったが、木本植物の組織培養の当業者に公知である任意の塩処方において適用可能であることを示す。

（表２９）mg/リットルおよびモル濃度（mM）の濃度におけるMi3維持培地処方

^aシグマC4523
^bSigma P-8169からのPhytaGel
^c全体は未知の分子量のカゼインを含まない

次いで、形質転換した細胞を、実施例27に記載されるように分化培地にプレートし、発芽可能な胚を得た。収集可能な胚を、ジェネティシンに対して培養したnptII形質転換体、Allyに対して培養したpWVC24形質転換体、およびα-メチルトリプトファンに対して培養したWVC33形質転換体からほぼ同じ数で収集した。

収集した胚を成熟させ、馴化植物に転換させ、そして露地栽培のために調製した。繊維支持体上の胚を、培地MSG₃（表21）に移し、そして4℃±2℃の温度で暗所にて約4週間インキュベートした。次に、繊維支持体上の胚を、シールした容器中の水の上で、25℃±2℃の温度で、暗所にて約3週間インキュベートした。上記の2つの処理後、繊維支持体上の胚を培地MSG₄（表21）に移し、そして25℃±2℃の温度で暗所にて約3日間インキュベートした。次いで、胚を、それらの繊維支持体から取り出し、発芽のための新鮮なMSG₄培地の表面に配置した。発芽を、25℃±2℃の温度で明所にて実行した。発芽プレートを毎週、約4週間の期間にわたって試験し、そして発芽している胚を、小植物への転換のために100mlのMSG₄培地を含むMAGENTA（登録商標）ボックスに移した。発生している小植物を含むMAGENTA（登録商標）ボックスを、約8から12週間の間、25℃±2℃で明所にてインキュベートした。

小植物が上胚軸（約2〜4cmの新たに形成されたシュート）を形成するとき、これらを鉢植え混合[2:1:2 ピート：パーライト：バーミキュライト、602g/m³ OSMOCOTE肥料 (18-6-12)、340g/m³ドロマイト石灰、および78g/m³ MICRO-MAX微量栄養素混合物（Sierra Chemical Co.）]で満たした容器に移した。小植物を、約2週間の期間、日よけを付けた温室で生育させ、不定期に水を霧状にして噴霧した。これらを、約4週間、温室中で順化のために霧から取り出した。次いで、小植物を、完全な日光条件も移動させる前に、最終的な順化のために約6週間の間、屋外の日陰に移した。

非常に低い割合のpWVC24トランスジェニック株が成熟して生き残る胚を産生したが、土壌での植栽に対して生き残株のパーセンテージは、対照の発芽に対する全ての処理と同様であった。

本発明の選択方法は、alsまたはasa2で安定に形質転換された数ダースのマツ株から、株あたり少なくとも10個の植物を生成し、これは、本年内に、APHIS告知の下で、操作上準備されたフィールド部位に植えられる予定である。

本発明は、再生可能なマツ植物を産生するマツの形質転換において、これらの選択剤およびこれらの選択マーカーの首尾よい使用を最初に報告する。従って、この選択方法は、多様なトランスジェニック木を選択するために使用され得る。

ベクターpWVC20の模式図を提供する。 ベクターpWVC21の模式図を提供する。 ベクターpWVC23の模式図を提供する。 ベクターpWVC24の模式図を提供する。 ベクターpWVC25およびpWVC26の模式図を提供する。 ベクターpWVC30の模式図を提供する。 ベクターpWVC33の模式図を提供する。 ベクターpWVC34およびpWVC35の模式図を提供する。 スルホニルウレアおよびイミダゾリノンの除草剤効果に対するカゼイン加水分解物の影響を示すグラフデータを提供する。 カゼイン加水分解物の種々の組成物の存在下でのスルホニルウレア系除草剤効果を示す。 5MTの除草剤効果に対するトリプトファンの効果を示す。 トランスジェニック植物を同定するための選択マーカーASA2とともに使用されたときに選択剤として作用する5MTおよびAMTの能力を実証する。

Claims (14)

1. 分枝鎖アミノ酸およびカゼイン加水分解物を含まず、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤およびアミノ酸成分としてカゼイン加水分解物の誘導体を含む、形質転換された移植片のシュート再生培地であって、カゼイン加水分解物の誘導体が、グリシン、スレオニン、セリン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、およびリシンからなる、シュート再生培地。
2. 以下の段階を含む、トランスジェニック植物を産生するための方法：
   （i）アセトシリンゴンを含む培地上で移植片を前培養する段階；
   （ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株に移植片を曝露する段階；
   （iii）形質転換した移植片を、請求項１記載の再生培地上で選択する段階；ならびに
   （iv）移植片からトランスジェニック植物を再生する段階。
3. トリプトファンおよびカゼイン加水分解物を含まず、トリプトファンアナログおよびアミノ酸成分としてカゼイン加水分解物の誘導体を含む、形質転換された移植片のシュート再生培地であって、カゼイン加水分解物の誘導体が、グリシン、スレオニン、セリン、チロシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、リシン、ロイシン、およびイソロイシンからなる、シュート再生培地。
4. 以下の段階を含む、形質転換された木の移植片を選択するための方法：
   （i）除草剤耐性型の植物アセト乳酸シンターゼ（ALS）をコードする遺伝子、およびリグニン生合成もしくはセルロース合成に関与する遺伝子を含むベクターで木の移植片細胞を形質転換する段階；
   （ii）形質転換された木の移植片細胞を培養する段階；および
   （iii）請求項１記載の再生培地上で形質転換された移植片を選択する段階。
5. 以下の段階を含む、形質転換された木の移植片を選択するための方法：
   （i）フィードバック非感受性型のアントラニル酸シンターゼ（AS）をコードする遺伝子、およびリグニン生合成もしくはセルロース合成に関与する遺伝子を含むベクターで植物細胞を形質転換する段階；
   （ii）形質転換された植物細胞を培養する段階；および
   （iii）請求項3記載の再生培地上で形質転換された移植片を選択する段階。
6. 1.99 mg/g グリシン、8.52 mg/g スレオニン、9.04 mg/g セリン、12.2 mg/g トリプトファン、12.7 mg/g チロシン、13.2 mg/g メチオニン、25.7 mg/g フェニルアラニン、25.8 mg/g アルギニン、および50.8 mg/g リシンからなるカゼイン加水分解物の誘導体 0.5g/Lを含む、請求項１記載の形質転換された移植片の再生培地。
7. 1.99 mg/g グリシン、8.52 mg/g スレオニン、9.04 mg/g セリン、12.7 mg/g チロシン、13.2 mg/g メチオニン、18.3 mg/g バリン、25.7 mg/g フェニルアラニン、25.8 mg/g アルギニン、50.8 mg/g リシン、54 mg/g ロイシン、および72.4 mg/g イソロイシンからなるカゼイン加水分解物の誘導体 0.5g/Lを含む、請求項３記載の形質転換された移植片の再生培地。
8. 以下の段階を含む、トランスジェニック植物を産生するための方法：
   （i）アセトシリンゴンを含む培地上で移植片を前培養する段階；
   （ii）植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株に移植片を曝露する段階；
   （iii）形質転換した移植片を、請求項３記載の再生培地上で選択する段階；ならびに
   （iv）移植片からトランスジェニック植物を再生する段階。
9. トランスジェニック植物が以下からなる群から選択される、請求項８記載の方法；
   トランスジェニックユーカリプツス・オシデンタリス植物、トランスジェニックユーカリプツス・ドゥニー植物、トランスジェニックユーカリプツス・グランディス植物、およびトランスジェニックユーカリプツス・グランディス×ユーカリプツス・ウロフィラ雑種植物。
10. トランスジェニック植物が以下からなる群から選択される、請求項２記載の方法；
    トランスジェニックユーカリプツス・オシデンタリス植物、トランスジェニックユーカリプツス・ドゥニー植物、トランスジェニックユーカリプツス・グランディス植物、およびトランスジェニックユーカリプツス・グランディス×ユーカリプツス・ウロフィラ雑種植物。
11. トランスジェニック植物から木材パルプを得る段階をさらに含む、請求項２または８記載の方法。
12. トランスジェニック植物から材木を得る段階をさらに含む、請求項２または８記載の方法。
13. トランスジェニック植物から紙を得る段階をさらに含む、請求項２または８記載の方法。
14. トランスジェニック植物からオイルを得る段階をさらに含む、請求項２または８記載の方法。

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