DE69822452T2

DE69822452T2 - Stabilisierte humane papillomaviruszusammensetzungen

Info

Publication number: DE69822452T2
Application number: DE69822452T
Authority: DE
Inventors: Gautum Sanyal; B. David VOLKIN; Li Shi
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2018-04-08
Also published as: SK138199A3; CA2286294A1; AU739829B2; IL132201A0; PL336715A1; CN1259051A; ATE261734T1; NO994879L; DE69822452D1; EP0973546A2; DK0973546T3; ES2216280T3; NZ500028A; KR20010006169A; JP2001519814A; EE9900612A; WO1998044944A2; JP4598201B2; PT973546E; AU6953398A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Papillomavirus-Antigen-Formulierungen, welche eine erhöhte Antigen-Stabilität und verringerte Antigen-Aggregation und -Präzipitation zeigen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von adjuvans-unterstützten HPV-Vakzinen unter Verwendung der hier offenbarten Human-Papillomavirus-Antigen-Formulierungen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch adjuvans-unterstützte Human-Papillomavirus-Vakzine, die aus diesen Human-Papillomavirus-Antigen-Formulierungen hergestellt werden.
Hintergrund der Erfindung
Papillomavirus (PV)-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische infektiöse Agenzien.
Papillomaviren werden auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Hybridisierungsstudien in mehr als 70 Typen eingeteilt. PV-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
Bei Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25, 36 und 46–50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Individuen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome der Schleimhäute der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45 und 58 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert.
Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Lese rahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E8 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation, transkriptionaler Regulation und zellulärer Transformation assoziiert.
Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55–60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 55–60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75–100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins in dem viralen Kapsomer befindet. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hochkonserviert. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren weniger konserviert.
Die L1- und L2-Gene wurden als gute Ziele für die Immunprophylaxe identifiziert. Von einigen der frühen Gene wurde auch gezeigt, daß sie potentielle Ziele für die Vakzin-Entwicklung sind. Studien in den Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV)- und Rinder-Papillomavirus (BPV)-Systemen haben gezeigt, daß Immunisierungen mit rekombinanten L1- und/oder L2-Proteinen (produziert in Bakterien oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren) Tiere vor einer Virusinfektion schützten. Die Expression von Papillomavirus-L1-Genen in Baculovirus-Expressionssystemen oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren führte zur Assemblierung von virusähnlichen Partikeln (VLP), welche zur Induktion von virus-neutralisierenden Antikörperreaktionen mit hohem Titer, die mit dem Schutz vor einer viralen Herausforderung korrelieren, eingesetzt wurden. Ferner wurden die L1- und L2-Gene zur Erzeugung von Vakzinen für die Verhütung und Behandlung von Papillomavirusinfektionen in Lebewesen eingesetzt.
Virusähnliche Partikel, die HPV11-L1-Protein enthalten, wurden sowohl in Insekten- als auch in Säugerzellsystemen exprimiert. Die Expression von VLPs in Hefezellen bietet die Vorteile, kosteneffektiv zu sein und leicht an die großmaßstäbliche Züchtung in Fermentern adaptiert zu werden. Jedoch wird das HPV11-L1-Protein in Hefezellen in niedrigen Niveaus exprimiert. Es wurde festgestellt, daß dies ein Ergebnis der Verkürzung der HPV11-L1-mRNA ist. im Gegensatz dazu wird das HPV6-L1-Gen als Volllängen-mRNA transkribiert und in hohen Niveaus exprimiert. Durch Modifizierung der HPV6-L1-DNA, um für das HPV11-L1-Protein zu kodieren, ist es möglich, die Transkription von Volllängen-mRNA zu erleichtern, was zu erhöhter HPV11-L1-Protein-Expression führt.
Die L1- und L2-Gene wurden zur Herstellung von Vakzinen für die Prophylaxe und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen bei Lebewesen eingesetzt. HPV-Typ 16-L1- und -L2-Gene wurden in einen Vacciniavirus-Vektor kloniert und infizierten CV-1-Säugerzellen mit dem rekombinanten Vektor, um virusähnliche Partikel (VLP) zu produzieren.
Es wurden aus Bakterien stammende rekombinante Rinder-Papillomavirus-L1 und -L2 erzeugt. Neutralisierende Seren gegen die rekombinanten bakteriellen Proteine reagierten in einer Kreuzreaktion mit nativem Virus auf niedrigen Niveaus, mutmaßlich aufgrund von Unterschieden in den Konformationen der nativen und von Bakterien stammenden Proteine.
Rekombinante Baculoviren, die HPV16-L1- oder HPV16-L2-ORFs exprimieren, wurden zur Infektion von Sf9-Insektenzellen und zur Produktion von L1- und L2-Proteinen eingesetzt. Westernblot-Analysen zeigten, daß die von Baculovirus erhaltenen L1- und L2-Proteine mit Antikörper gegen HPV16 reagierten. Das von Baculovirus erhaltene L1 bildet VLPs.
Jansen et al. (1995, Vaccine 13(16): 1509–1514) verwenden einen Laufpuffer, der Natriumchlorid und Tween 80^® umfaßt, während der Reinigung von L1- und L1 + L2-VLPs aus Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus.
WO 95 31476A betrifft rekombinantes Papillomavirus-L1-Protein und dessen Verwendung zum Nachweis und zur Behandlung von Papillomavirus-Infektionen.
Powell et al., Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (1995, Plenum Press, New York: Seite 205), stellen fest, daß Polysorbat 80 in Emulsions-Vakzinformulierungen eingesetzt werden kann.
Derzeit müssen gereinigte rekombinante HPV-VLP-Formulierungen bei hohen NaCl-Konzentrationen gelagert werden, um eine Aggregation in Lösung zu verhindern. Bei niedrigen Ionenstärken aggregieren HPV-VLPs bis zu dem Punkt, an dem sie aus der Lösung präzipitiert werden. Auf Grundlage dieser und anderer damit in Zusammenhang stehender Beobachtungen wurden HPV-Massenlösungen eingefroren in Gegenwart hoher Konzentrationen von NaCl (1,25–2,5 M) gelagert. Hoch aggregierte Proben von HPV 11-VLP zeigen eine schlechte in vitro-Antigenizität, wie gemessen durch RIA-, EIA- oder BIA-Kern-Assays. Deswegen besteht ein Bedarf zur Herstellung einer wässerigen HPV-VLP-Formulierung, welche unter physiologischen Salzbedingungen sowie unter annehmbaren Bedingungen zur Langzeitlagerung stabil ist. Die vorliegende Erfindung betrifft und erfüllt dieses Bedürfnis.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Human-Papillomavirus (HPV)-Antigen-Vakzinformulierung, welche frei von alaun-enthaltenden Adjuvantien ist und welche gegenüber Antigen-Aggregation bei Temperaturen oberhalb von 0°C stabilisiert ist, umfassend:

(a) eine Vakzin-Komponente, umfassend human-papillomavirus-ähnliche Partikel, die entweder L1-Protein oder L1- und L2-Protein umfassen;
(b) ein Salz, ausgewählt aus Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumacetat, Natriumcitrat und Natriumphosphat, welches in einer physiologisch annehmbaren Konzentration vorliegt; und
(c) ein nichtionisches Tensid, welches in einer physiologisch annehmbaren Konzentration vorliegt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung eines von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstützten HPV-Vakzins, welches durch Mischen einer HPV-Antigen-Formulierung der vorliegenden Erfindung mit einer biologisch wirksamen Menge eines Nicht-Alaun-Adjuvans hergestellt wird, um ein von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstütztes HPV-Vakzin herzustellen.
Die HPV-Antigen-Formulierungen und von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstützten Vakzine der vorliegenden Erfindung umfassen als Antigen-Komponente virusähnliche Partikel, die als ein rekombinantes HPV-Untereinheitsvakzin, umfassend entweder L1 oder eine Kombination von L1- und L2-Proteinen, von den HPV-Typen 6a, 6b, 11, 16 und 18 gebildet werden, sind jedoch nicht ausschließlich darauf beschränkt. Der Umfang dieser Erfindung umfaßt die Stabilisierung monovalenter Formen dieses rekombinanten Vakzins ebenso wie divalenter Formen (wie z.B., jedoch keineswegs beschränkt auf, rekombinantes HPV 11-L1, HPV 16-L1 und HPV 6a-L1) und multivalenter Formen (wie z.B., jedoch keineswegs beschränkt auf, rekombinantes HPV 11-L1, HPV 6a-L1, HPV 16-L1 und HPV 18-L1).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch HPV-Antigen-Formulierungen, welche eine physiologische Salzkonzentration und ein Tensid umfassen, um für eine erhöhte Stabilisierung der Vakzin-Komponente der Formulierung bei Temperaturen oberhalb von 0°C zu sorgen. Die HPV-Formulierungen der vorliegenden Erfindung sollten für eine längere Lagerung über Zeiträume bis zu mindestens einem Monat bis etwa zwei Jahren bei etwa 2°C bis etwa 8°C geeignet sein.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft HPV-Antigen-Formulierungen, bei denen die Formulierung ein physiologisch annehmbares Salz umfaßt, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Natriumchlorid, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat. Der Zweck des Einschlusses eines Salzes in der Formulierung ist die Erzielung der gewünschten Ionenstärke. Beiträge zur Ionenstärke können von Ionen kommen, die von der puffernden Verbindung gebildet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Phosphat, Citrat, Acetat, Succinat, Tris-HCl, MOPS, etc., sowie von den Ionen nicht-puffernder Salze.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft HPV-Antigen-Formulierungen, bei denen die Formulierung ein nichtionisches Tensid umfaßt, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Polysor bate), z.B. Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®), Polysorbat 60 (z.B. Tween 60^®) und Polysorbat 20 (z.B. Tween 20^®), Polyoxyethylenalkylether (z.B. Brij 58^®, Brij 35^®) sowie andere, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Triton X-100^®, Triton X-114^®, NP40^®, Span 85 und der Pluronic-Reihe nichtionischer Tenside (z.B. Pluronic 121).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 400 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 300 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigenformulierung, bei der das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist und das nichtionische Tensid, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®), in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist und das nichtionische Tensid, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®), in einem Bereich von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 400 mM vorliegt, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®) in einem Prozentbereich in Mengen von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 300 mM vorliegt, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®) in einem Prozentbereich in Mengen von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Einem Fachmann auf dem Gebiet ist es bekannt, die HPV-Antigen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung in einem physiologisch annehmbaren Puffer bereitzustellen, vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, eine Formulierung, die durch Phosphat, Citrat, Acetat, Succinat, Tris-HCl oder MOPS gepuffert wird, vorzugsweise, jedoch nicht beschränkt auf, ein(en) pH-Bereich von etwa pH 5,0 bis 9,0, und insbesondere innerhalb eines pH-Bereichs von etwa pH 6,0 bis etwa 8,0.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von HPV-Vakzinformulierungen, welche die Verwendung der HPV-Antigen-Formulierung der vorliegenden Erfindung beinhalten. Diese verbesserten Verfahren zur Herstellung eines HPV-Vakzins, das nicht auf Alaun basiert, sind hier beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch adjuvans-unterstützte HPV-Vakzine, bei denen eine biologisch wirksame Menge eines Adjuvans mit einer biologisch wirksamen Menge einer antigen-enthaltenden Formulierung wie hier offenbart kombiniert ist.
Der Begriff "PV", wie hier verwendet, ist die Abkürzung für "Papillomavirus".
Der Begriff "HPV", wie hier verwendet, ist die Abkürzung für "Human-Papillomavirus".
Der Begriff "VLP", wie hier verwendet, ist die Abkürzung für "virusähnliches Partikel".
Der Begriff "physiologisch annehmbar", wie hier verwendet, bedeutet einen Puffer, einen Exzipienten oder ein Salz, wobei entweder die Konzentration oder Ionenstärke derart ist, daß die Formulierung mit dem immunisierten Zielwirt, z.B. einem Menschen, biologisch kompatibel ist.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt die Wirkung der Proteinverdünnung auf die hydrodynamische Größe im Verlauf der Zeit für HPV 11-L1-VLP (50 mM MOPS, pH 7,0, 1,25 M NaCl) über einen Zeitraum von 2 Monaten bei 4°C; (☐) 470 μg/ml; (
) 18 μg/ml.
2 zeigt die Wirkung der Salzkonzentration auf die hydrodynamische Größe von HPV 11- und HPV 16-L1-VLPs während der Lagerung bei Raumtemperatur. Die Proben wurden in einem Puffer verdünnt, eine Stunde gelagert und dann analysiert. Im Falle von HPV 11 wurden die Proben dann auch über Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das HPV 11-L1-VLP wurde in 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,0), enthaltend unterschiedliche NaCl-Konzentra tionen, formuliert, (O) keine Dialyse; (☐) Dialyse. Das HPV 16-L1-VLP wurde in 50 mM MOPS-Puffer (pH 7,0), enthaltend unterschiedliche NaCl-Konzentrationen, formuliert, (•) keine Dialyse.
3 zeigt die Wirkung der Proteinadsorption an eine Dialysemembran auf die hydrodynamische Größe (•) und Proteinkonzentration (
) [als Prozentsatz an verbleibendem HPV 11-L1] von 50 μg/ml HPV 11-L1-VLP in 50 mM MOPS, pH 7,0, bei 180 mM NaCl in einem Polypropylenröhrchen bei Raumtemperatur für 96 h.
4 zeigt die Wirkung von Polystyrol (O), Polypropylen (•) und Glas (0) auf die HPV 11-L1-VLP-Adsorption in 50 mM MOPS, pH 7,0, bei 1,25 M NaCl bei Raumtemperatur für 24 h.
5 zeigt die Wirkung der Erhöhung des Oberfläche/Volumen-Verhältnisses auf die Adsorption von HPV-L1-VLP (18 μg/ml) an Polypropylen in 50 mM MOPS, pH 7,0, 0,25 M NaCl; (☐) Oberfläche/Volumen = 4 cm^–1; (•) Oberfläche/Volumen = 6 cm^–1.
6A und 6B zeigen die Wirkung verschiedener Tenside (bei 0,01%) auf die Stabilität von HPV 11-L1-VLP (18 μg/ml) in 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl bei Raumtemperatur für 20 h (Feld A) und in 50 mM MOPS, pH 7,0, 40 mM NaCl bei 50°C für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für 48 h (Feld B), bevor sie einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) unterworfen wurden.
7A und 7B zeigen die Wirkung von Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®) auf die Oberflächenadsorption (Feld A) und Aggregation (Feld B) von HPV 11-L1-VLP (16 μg/ml) gegenüber einer Polypropylenoberfläche bei Raumtemperatur in 50 mM MOPS, pH 7,0, bei verschiedenen Ionenstärken: (•) 0,4 M (NH₄)₂SO₄ + 0,01% Tween 80^®; (O) 0,1 M (NH₄)₂SO₄; (♢) 0,5 M (NH₄)₂SO₄; (x) 0,1 M Na₂SO₄; (|) 0,5 M Na₂SO₄; (Δ) 0,1 M NaCl; und (
) 0,5 M NaCl.
8 zeigt die Wirkung von Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®) auf sowohl den hydrodynamischen Durchmesser als auch die HPV 11-L1-VLP-Konzentration von HPV 11-L1-VLP (18 μg/ml) gegenüber einer Polypropylenoberfläche in 50 mM MOPS, pH 7,0, 250 mM NaCl bei Raumtemperatur im Verlauf der Zeit. Die Proteinkonzentration wird als Prozentsatz der ursprünglichen Proteinkonzentration gemessen. Eine Abnahme der Proteinkonzentration steht im umgekehrten Verhältnis zur Oberflächenadsorption. (x) 0,01% Tween 80^®, Proteinkonzentration; (Δ) kein Tween 80^®, Proteinkonzentration; (
) 0,01% Tween 80^®, hydrodynamischer Durchmesser, und (♦) kein Tween 80^®, hydrodynamischer Durchmesser.
9 zeigt die kombinierte Wirkung von NaCl-Konzentration und von Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®) auf die hydrodynamische Größe für HPV 11-L1-VLP (18 μg/ml) in 50 mM MOPS, pH 7,0, mit (•) 40 mM NaCl und 0,01% Tween 80^®, (♢) 100 mM NaCl und 0,01% Tween 80^®, und (O) 40 mM NaCl, kein Tween 80^®.
10A und 10B zeigen die Wirkung der Konzentration von Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®) [(•) 0,000% Gew./Vol.; (O) 0,001% Gew./Vol.; (
) 0,005% Gew./Vol.; (☐) 0,010% Gew./Vol.] auf die hydrodynamische Größe (Dh (nm)) für HPV 11-L1-VLP (18 μg/ml) in 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl bei 4°C (Feld A) und Raumtemperatur (Feld B) im Verlauf der Zeit.
11 zeigt die Wirkung verschiedener Tenside (bei 0,01%) auf die Stabilität von HPV 16-L1-VLP (20 μg/ml), gelagert in 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, bei Raumtemperatur für 50 Tage, bevor sie einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) unterworfen wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Papillomavirus (HPV)-Antigen-Formulierungen, welche eine Antigen-Aggregation verhindern und die Antigen-Stabilität bei physiologischen Salzkonzentrationen in Gegenwart eines Tensids erhöhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung eines von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstützten HPV-Vakzins, welches durch Mischen einer HPV-Antigen-Formulierung der vorliegenden Erfindung mit einer biologisch wirksamen Menge eines Nicht-Alaun-Adjuvans zur Herstellung eines von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstützten HPV-Vakzins hergestellt wird.
Die HPV-Antigen-Formulierungen und von einem Nicht-Alaun-Adjuvans unterstützten Vakzine der vorliegenden Erfindung umfassen als Antigen-Komponente virusähnliche Partikel, welche als rekombinantes HPV-Untereinheitsvakzin, umfassend entweder L1 oder eine Kombination von L1- und L2-Proteinen, von den HPV-Typen 6a, 6b, 11, 16 und 18 gebildet werden, sind jedoch nicht ausschließlich darauf beschränkt. Der Umfang dieser Erfindung umfaßt die Stabilisierung monovalenter Formen dieses rekombinanten Vakzins ebenso wie divalenter Formen (wie z.B., jedoch keineswegs beschränkt auf, rekombinantes HPV 11-L1, HPV 16-L1 und HPV 6a-L1) und multivalenter Formen (wie z.B., jedoch keineswegs beschränkt auf, rekombinantes HPV 11-L1, HPV 6a-L1, HPV 16-L1 und HPV 18-L1). Obwohl rekombinante HPV 11-L1-VLPs bei der beispielhaften Erläuterung der Erfindung verwendet werden, beschränkt dies in keiner Weise die HPV-Typen, welche zur Stabilisierung in den Antigen-Formulierungen dieser Erfindung hergestellt werden können. In der Tat ist es nach Studium dieser Offenbarung ersichtlich, daß die hier offenbarten Vakzinformulierungen zur Stabilisierung anderer Vakzinformulierungen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich beschränkt auf, andere(r) VLPs auf HPV-Basis, verwendet werden können. Beispielsweise schließen die HPV-Vakzinformulierungen der vorliegenden Erfindung virusähnliche Partikel ein, die als rekombinantes HPV-Untereinheitsvakzin, umfassend entweder L1 oder eine Kombination von L1- und L2-Proteinen, von den HPV-Typen 6a, 6b, 11, 16 und 18 gebildet werden, sind jedoch nicht ausschließlich darauf beschränkt. Deshalb ist es, wie oben angemerkt, ebenfalls ersichtlich, daß die Formulierungen der vorliegenden Erfindung zur Stabilisierung verschiedener divalenter und multivalenter Formulierungen geeignet sein werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, divalente(r) (z.B. rekombinantes HPV 11-L1 und HPV 6a-L1) und multivalente(r) (z.B. rekombinantes HPV 11-L1, HPV 6a-L1, HPV 16-L1 und HPV 18-L1) HPV-Formulierungen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung Antigen-Formulierungen, umfassend ein nichtionisches Tensid, welche HPV-VLPs bei physiologisch aktiven Salz- und Pufferbedingungen über ein Spektrum geeigneter Proteinkonzentrationen und bevorzugter Lagertemperaturen stabilisieren. Die HPV-Formulierungen der vorliegenden Erfindung sollten für eine längere Lagerung über Zeiträume bis zu mindestens einem Monat bis etwa zwei Jahre bei etwa 2°C bis etwa 8°C geeignet sein. Diese Formulierungen können mit Nicht-Alaun-Adjuvanzien gemischt sein, insbesondere Nicht-Alaun-Adjuvanzien, welche durch Formulierungen hoher Ionenstärke, die bekannterweise für HPV-VLPs verwendet werden, negativ beeinflußt werden.
Es ist bekannt, daß HPV 11-L1-VLPs bei niedriger Ionenstärke bis zu dem Punkt aggregieren, an dem sie aus der Lösung ausgefällt werden. Es ist bekannt, daß hoch aggregierte Proben von HPV 11-L1-VLP eine schlechte in vitro-Antigenizität zeigen (wie z.B. RIA-, EIA- oder BIA-Kern-Assays). Die Daten im Beispielsabschnitt 3 zeigen, daß ein HPV 11-VLP-L1 (470 μg/ml in 50 mM MOPS/1,25 M NaCl) aufgetaut wurde und eine Portion der Lösung auf 18 μg/ml im gleichen Puffer verdünnt wurde. Die Lösung mit niedrigerer Proteinkonzentration aggregierte im Laufe der Zeit, obwohl die NaCl-Konzentration bei 1,25 M NaCl gehalten wurde. Deshalb verhindern hohe Salzkonzentrationen allein die HPV-VLP-Aggregation nicht. Im Beispielsabschnitt 4 werden beim Testen verschiedener NaCl-Konzentrationsbereiche (durch entweder Lagerung oder Dialyse einer Massenlösung ("bulk solution") über einen kurzen Zeitraum) Daten präsentiert, welche zeigen, daß eine Abnahme der NaCl-Konzentration auf ein niedriges Niveau (etwa 150 mM NaCl und darunter) zu Proteinaggregation (gefolgt von Präzipitation) führt. Um dieses Problem zu umgehen, können Lösungen, die HPV 11-L1-VLP enthalten, in Gegenwart hoher Konzentrationen von NaCl (von etwa 1,25 M–2,5 M) eingefroren gelagert werden. Ein Teil der Erfindung, wie hier offenbart, betrifft verschiedene Formulierungen, umfassend HPV-VLPs, welche einer Aggregation bei physiologischen Salzkonzentrationen innerhalb brauchbarer Temperaturbereiche widerstehen. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung erleichtern die Langzeitlagerung stabiler HPV-VLPs-Lösungen bei 4°C und erlauben nützliche Immunogenizitätsstudien von HPV allein oder in Gegenwart von entweder Aluminiumsalz-Adjuvanzien oder Nicht-Aluminium-Adjuvanzien.
Darüber hinaus wird im Beispielsabschnitt 5 offenbart, daß das Kontaktieren von HPV-VLPs mit verschiedenen Oberflächen ebenfalls die Aggregation beeinflussen wird. Es wird hier gezeigt, daß die Erhöhung der Oberfläche für den Kontakt mit einem HPV-VLP (z.B. Dialysemembran oder Lagerungsröhrchen) die hydrodynamische Größe des VLP erhöht. Diese Zunahme der Aggregation führt zu einer gleichzeitigen Abnahme der Proteinkonzentration der HPV-VLP-Lösung, was eine Adsorption von HPV-VLPs auf der Membranoberfläche anzeigt und eine Korrelation zwischen der Oberflächenadsorption und Aggregation nahe legt. Deshalb umfaßt die Erfindung auch das Kontaktieren des Vakzins mit einer bevorzugten Behälteroberfläche. Die Daten weisen darauf hin, daß HPV 11-L1-VLPs (50 mM MOPS/1,25 M NaCl, pH 7,0) die 24 h lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, eine signifikante Adsorption an Borsilicatglas zeigen, während keine signifikante Adsorption bei Polystyrol beobachtet wird.
Beispielsabschnitt 6 beinhaltet Daten, welche bevorzugte Exzipienten und Salze für den Einschluß in die Formulierungen der vorliegenden Erfindung angeben.
Deshalb betrifft der Kern der vorliegenden Erfindung HPV-Antigen-Formulierungen, umfassend physiologische Salzkonzentrationen, bei denen ein nichtionisches Tensid so zugegeben wurde, daß die Antigen-Komponente der Formulierung eine verlängerte Stabilität bei Temperaturen von etwa 0°C bis etwa 40°C sowie eine Resistenz gegenüber der Aggregation, die oft bei bekannten HPV-Formulierungen beobachtet wird, besitzt. Diesbezüglich betrifft die vorliegende Erfindung HPV-Vakzinformulierungen, welche ein Salz umfassen, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Natriumchlorid, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat, welches in einer Ionenstärke vorliegt, die für den Wirt physiologisch annehmbar ist. Der Zweck des Einschlusses eines Salzes in die Formulierung ist die Erzielung der gewünschten Ionenstärke. Beiträge zur Ionenstärke können von Ionen kommen, die von der puffernden Verbindung gebildet werden, sowie von Ionen nicht-puffernder Salze.
Ein besonders bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft HPV-Antigen-Formulierungen, welche ein Salz auf einem physiologisch annehmbaren Niveau umfassen, bei denen eine minimale Menge eines nichtionischen Tensids zugesetzt ist, um für eine erhöhte Stabilisierung der Vakzin-Komponente der Formulierung zu sorgen. Nichtionische Tenside zur Verwendung in den Antigen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, einschließ lich, jedoch nicht beschränkt auf, Polysorbat 80 (Tween 80^®), Polysorbat 60 (Tween 60^®) und Polysorbat 20 (Tween 20^®), Polyoxyethylenalkylether, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Brij 58^®, Brij 35^®, sowie andere wie Triton X-100^®, Triton X-114^®, NP40^®, Span 85 und die Pluronic-Reihe nichtionischer Tenside (z.B. Pluronic 121).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 400 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine noch weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der die Formulierung ein nichtionisches Tensid wie oben offenbart umfaßt, das in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, wobei das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 300 mM ist, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigenformulierung, bei der das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist und das nichtionische Tensid, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®), in einem Bereich bis zu etwa 0,2% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der das physiologisch annehmbare Salz Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 500 mM ist und das nichtionische Tensid, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®), in einem Bereich von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 400 mM vorliegt, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®) in einem Prozentbereich in Mengen von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine HPV-Antigen-Formulierung, bei der Natriumchlorid in einer Konzentration von etwa 150 mM bis etwa 300 mM vorliegt, Polysorbat 80 (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Tween 80^®) in einem Prozentbereich in Mengen von etwa 0,01% bis etwa 0,1% Gew./Vol. vorliegt, in Gegenwart eines physiologisch annehmbaren Puffers.
Einem Fachmann auf dem Gebiet ist es bekannt, die HPV-Antigen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung in einem physiologisch annehmbaren Puffer bereitzustellen, vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, eine Formulierung, die durch Phosphat, Citrat, Succinat, Acetat, Tris-HCl oder MOPS gepuffert wird, innerhalb eines pH-Bereichs von einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, etwa 5,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise eines pH-Bereichs von etwa 6,0 bis etwa 8,0.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Formulierung erlaubt die Lagerung von HPV-Lösungen bei nahezu physiologischen Salzkonzentrationen im ungefrorenen Zustand. Deshalb wird sie zur Eliminierung von Einfrier- und Auftauschritten führen und eine direkte Formulierung von HPV-VLP-Lösungen mit Nicht-Aluminium-Adjuvanzien unter geeigneten Bedingungen physiologischer Ionenstärke erlauben.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte eine verlängerte Lagerung der ursprünglichen Antigen-Formulierung bei Temperaturen im Bereich von etwa 2°C bis etwa 8°C für eine Zeitspanne bis zu mindestens zwei Jahren erlauben.
Nach Studium dieser Offenbarung ist ersichtlich, daß ein Vorteil der HPV-Antigen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung in ihrem Vermögen liegt, direkt mit einem Nicht-Alaun-Adjuvans in physiologisch annehmbaren Konzentrationen kombiniert zu werden. Es ist nach Studium dieser Offenbarung ebenfalls ersichtlich, daß ein weiterer Vorteil die erhöhte Stabilität bei Temperaturen oberhalb des Gefrierpunktes von etwa 0°C bis etwa 40°C und insbesondere von zwischen etwa 2°C und 8°C ist, so daß diese Formulierungen direkt einem geeigneten, kein Alaun enthaltenden Adjuvans zugegeben werden können. Mit anderen Worten, die hier beschriebenen Formulierungen eignen sich auch für eine direkte Formulierung von HPV-Lösungen mit Nicht-Alaun-Adjuvanzien bei physiologischen Salzkonzentrationen.
Der Dosierungsplan unter Verwendung der HPV-Vakzinformulierungen der vorliegenden Erfindung kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren gewählt werden, welche Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten, und die speziell davon eingesetzte Verbindung einschließen. Ein durchschnittlich befähigter Arzt kann unschwer die wirksame Menge des HPV-Vakzins, welche zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforderlich ist, bestimmen und verschreiben.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Überexpression von rekombinantem HPV 11-L1-VLP
Konstruktion des synthetischen L1-Gens – Die Überexpression und Reinigung des HPV11-L1-VLP wird in den US-Anmeldungen mit den Seriennummern 08/413,571 und 08/413,572, beide am 30. März 1995 eingereicht, beschrieben und wird auch in diesem Beispielsabschnitt dargestellt, lediglich zur beispielhaften Erläuterung und keineswegs zur Beschränkung der Verfahren, welche bei der Herstellung rekombinanter HPV-VLPs eingesetzt werden können. Diese Patentbeschreibung offenbart die Verwendung rekombinanter HPV 11-L1 und HPV 16-L1 zur beispielhaften Erläuterung der Formulierungen der vorliegenden Erfindung. Einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wird bekannt sein, daß bekannte rekombinante DNA-Methodiken eingesetzt werden können, um rekombinante HPV-VLPs herzustellen, die in der vorliegenden Erfindung genannt werden. Es wird auch bekannt sein, daß andere Wirte als Hefe eingesetzt werden können, um HPV-VLPs zu überexprimieren, welche in den Antigen-Formulierungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Der offene Leserahmen von 1,5 kbp von HPV 11-L1 wurde unter Verwendung synthetischer DNA-Oligomere, welche von Midland Reagent Company bezogen wurden, erstellt. Diese Oligomere wurden mit 5'-terminalen Phosphaten geliefert. Insgesamt 24 Oligomere waren erforderlich und sind im folgenden aufgelistet:
Oligomere, die komplementäre Paare bilden (#241-1 und #241-24, #241-2 und #241-23, #241-3 und #241-22, #241-4 und #241-21, #241-5 und #241-20, #241-6 und #241-19, #241-7 und #241-18, #241-8 und #241-17, #241-9 und #241-16, #241-10 und #241-15, #241-11 und #241-14, #241-12 und #241-13), wurden in separaten Röhrchen, enthaltend 2,5 mM Tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA, verschmolzen. Die Röhrchen wurden 4 Minuten lang auf 98°C erwärmt und dann in 200 ml Wasser von 98°C in einem 250-ml-Becherglas gestellt, um langsam abzukühlen. Als das Wasser auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurden die verschmolzenen Paare Röhrchen wie angegeben zugegeben: Fragment A (Oligomerpaare #241-1 & -24 und -2 & -23); Fragment B (#241-3 & -22, -4 & -21, -5 & -20 und -6 & -19); Fragment C (#241-7 & -18, -8 & -17, -9 & -16 und -10 & -15) und Fragment D (#241-11 & -14 und -12 & -13). Diese Oligomerpaar-Mischungen wurden 2 Minuten lang auf 62°C erwärmt und dann langsam wie zuvor abgekühlt. Die Inhalte eines jeden Röhrchens wurden über Nacht bei 23°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim, Inc.) und den vom Hersteller gelieferten Reagenzien ligiert.
Nach der Ligierung benötigte das Fragment B eine PCR-Amplifizierung, um die Menge an Volllängen-Produkt zu erhöhen. Dies erforderte 10 Zyklen von 94°C, 1 Min.; 48°C, 1 Min.; 72°C, 1 Min., gefolgt von 10 Min. bei 72°C, in einem Applied Biosystems Thermocycler unter Verwendung von Boehringer Mannheim Taq-Polymerase und den Oligomer-Primern:
5' GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG 3' (SEQ-ID-NR. 25) und
5' GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA 3' (SEQ-ID-NR. 26).
Die ligierten Produkte und das PCR-Produkt von Fragment B wurden mit Restriktionsenzymen (Boehringer Mannheim, Inc.) wie folgt verdaut: Das Fragment A wurde mit BglII und SphI verdaut; Fragment B, SphI und KpnI; Fragment C, KpnI und XhoI; und Fragment D, XhoI und BglII. Die verdauten Fragmente wurden auf Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC BioProducts) aufgetrennt und Fragmente mit der richtigen Größe durch Ausschneiden der Bande und Verdauung der Agarose mit Agarase^TM (Boehringer Mannheim, Inc.), wie vom Hersteller empfohlen, isoliert. Die Fragmente A, B und D wurden durch Ethanolfällung gewonnen und dann separat in den Vektor pSP72 (Promega, Inc.) ligiert, der gleichermaßen mit Restriktionsenzymen verdaut worden war, um dem jeweiligen Fragment, das ligiert wurde, zu entsprechen.
Das KpnI-XhoI-verdaute Fragment C wurde zuerst mit den verschmolzenen Oligomeren
5' TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC 3' (SEQ-ID-NR. 27) und
5' TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT 3' (SEQ-ID-NR. 28) ligiert.
Das Fragment C wurde dann erneut mit XhoI gespalten und das KpnI-XhoI-Fragment von 450 bp wurde mit dem KpnI, Xho-I-verdauten Vektor pSP72 ligiert. Die Ligierungsmischungen wurden zur Transformation kompetenter Zellen des Escherichia coli-Stammes DH5 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) eingesetzt. Die Transformanten wurden hinsichtlich Klone, die Inserts enthielten, durch Koloniehybridisierung (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) gescreent. Plasmid-DNA wurde aus den positiven Klonen mit Hilfe eines Wizard Miniprep-Kits (Promega Corp.) isoliert und dann mit Hilfe eines Applied Biosystems 373A-DNA-Sequenzierer sequenziert. Klone, welche die korrekte DNA-Sequenz für jedes der vier Fragmente enthielten, wurden wie zuvor verdaut, um die Fragmente aus dem pSP72-Vektor freizusetzen. Das mit KpnI, XhoI-verdaute Fragment C wurde mit dem XhoI, BglII-verdauten Fragment D und KpnI, BglII-gespaltenen pSP72 in einer Dreifachligierung ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden dann zur Transformation von E. coli eingesetzt. Die resultierenden Transformanten wurden sequenziert und ein Klon der korrekten Sequenz erhalten (als CD bezeichnet). Das 750-bp-BglII-KpnI-Insert von CD wurde erneut aus dem pSP72-Vektor gespalten und mit BglII, SphI-verdautem Fragment A und SphI, KpnI-verdautem Fragment B in einer Dreifachligierung ligiert wie zuvor, mit Ausnahme dessen, daß BglII zugegeben wurde, um unerwünschte Ligierungsprodukte zu vermindern. Die Ligierungsprodukte wurden auf Agarosegelen aufgetrennt, das 1,5-kpb-Fragment wurde isoliert und als D361-1 bezeichnet.
Konstruktion von HPV6/11-L1-, HPV11-L1- und HPV6-L1-Hefe-Expressionsvektoren – Der Hefe-Expressionsvektor pGAL1-10 wurde konstruiert durch Isolierung eines 1,4-kbp-SphI-Fragments aus einem bidirektionalen GAL-Promotor-pUC18-Plasmid, welches die divergenten Saccharomyces cerevisiae-GAL1-GAL10-Promotoren aus dem Plasmid pBM272 enthält (bereitgestellt von Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Die divergenten Promotoren sind auf jeder Seite von einer Kopie des Hefe-ADH1-Transkriptionsterminators (Bennetzen und Hall, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018–3025), einer zwischen dem GAL1-Promotor und der ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen BamHI-Klonierungsstelle und einer zwischen dem GAL10-Promotor und der zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen SmaI-Klonierungsstelle flankiert. Ein Hefe-Shuttle-Vektor, bestehend aus pBR322, dem Hefe-LEU2d-Gen (Erhart und Hollenberg, 1983, J. Bacteriol. 156: 625–635) und dem Hefe-2μ-Plasmid (Gabe von Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA) (Broach und Volkert, 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) wurde mit SphI gespalten und mit dem 1,4-kbp-SphI-Fragment mit dem divergenten GAL-Promotor ligiert, was pGAL1-10 ergab.
Die HPV6/11-Hybrid-L1-DNA, kodierend für das HPV11-L1-Protein (Probe D361-1 aus Beispiel 1), enthält eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern et al., 1986, Gene 46: 135–141) unmittelbar stromaufwärts des HPV6/11-L1-Initiations-Methionin-Codons. Das Plasmid pGAL1-10 wurde mit BamHI linearisiert, welches zwischen dem GAL1-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet, und mit dem HPV6/11-L1-Genfragment von 1,5 kbp (Probe D361-1) ligiert. Transformanten von E. coli DH5 (Gibco BRL, Inc.) wurden gescreent und ein pGAL1-10-Plasmid, enthaltend das HPV6/11-L1-Gen, wurde isoliert und als D362-1 bezeichnet.
Die Wildtyp-HPV11 (Wt-HPV11)-DNA wurde aus einer Condyloma-acuminatum-Läsion (großzügige Gabe von Dr. Darron Brown) kloniert. Genomische Human-Gesamt-DNA wurde extrahiert und mit Restriktionsendonukleasen verdaut. Die Fraktion, welche Wt-HPV11-DNA enthielt, wurde in einen E. coli-Klonierungsvektor ligiert, der als Matrize für PCR verwendet werden sollte. Das Wt-HPV11-L1-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 s) und den folgenden Oligonukleotidprimern, welche flankierende Bgl II-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:

Sense-Primer: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' (SEQ-ID-NR. 29)

Antisense-Primer: 5'-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG-3' (SEQ-ID-NR. 30)
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz (Kniskern et al., 1986, Gene 46: 135–141) unmittelbar stromaufwärts des Wt-HPV11-L1-Initiations-Methionin-Codons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das Wt-HPV11-L1-PCR-Produkt von 1,5 kbp wurde mit BgIII verdaut, gelgereinigt und mit dem BamHI-verdauten Plasmid pGAL1-10 ligiert, um das Plasmid p329-1 zu ergeben.
Genomische Gesamt-DNA wurde aus einer HPV6a-positiven Condyloma-acuminatum-Läsion (großzügige Gabe von Dr. Darron Brown) extrahiert. Das HPV6a-L1-Gen wurde mittels PCR unter Einsatz der Biopsieproben-DNA als Matrize, von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 s), des oben angeführten Sense-Primers für die PCR von Wt-HPV11-L1 und eines Antisense-Primers mit der Sequenz
5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (SEQ-ID-NR. 31)
amplifiziert.
Das HPV6a-L1-PCR-Produkt von 1,5 kbp wurde mit BglII verdaut, gelgereinigt und mit dem BamHI-verdauten Plasmid pGAL1-10 ligiert, um das Plasmid D128 zu ergeben.
Herstellung des Stammes 1558
a. Herstellung des Hefestammes U9 – Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, ade1, cir°) wurde von Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA) erhalten. Zellen des Stammes 2150-2-3 wurden über Nacht bei 30°C in 5 ml YEHD-Medium (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2: 117–121) vermehrt. Die Zellen wurden dreimal in sterilem destilliertem Wasser gewaschen, in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 0,1 ml Zellsuspension wurde auf jede von sechs 5-Fluororotsäure (FOA)-Platten ausplattiert, um hinsichtlich ura3-Mutanten zu selektionieren (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Die Platten wurden bei 30°C inkubiert. Das Medium enthielt auf 250 ml destilliertes Wasser: 3,5 g Difco-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,5 g 5-Fluororotsäure, 25 mg Uracil und 10,0 g Dextrose.
Das Medium wurde mittels Filtration durch 0,2-μm-Membranen sterilisiert und dann mit 250 ml 4%igem Bacto-Agar (Difco), gehalten bei 50°C, 10 ml einer 1,2-mg/ml-Lösung von Adenin und 5 ml L-Leucin-Lösung (180 mg/50 ml) gemischt. Das resultierende Medium wurde mit 20 ml pro Petrischale aufgeteilt.
Nach 5 Tagen Inkubation waren zahlreiche Kolonien erschienen. Einzelkolonien wurden isoliert durch erneutes Ausstreichen von Kolonien von den ursprünglichen FOA-Platten auf frische FOA-Platten, welche dann bei 30°C inkubiert wurden. Eine Anzahl Kolonien von dem zweiten Satz von FOA-Platten wurde hinsichtlich der Anwesenheit der ura3-Mutation durch Replica-Plattierung auf sowohl YEHD-Platten als auch Uracil-Minus-Platten getestet. Das gewünschte Ergebnis war gutes Wachstum auf YEHD- und kein Wachstum auf Uracil-Minus-Medium. Ein Isolat (U9) wurde erhalten, welches diese Eigenschaften zeigte. Es wurde als eingefrorene Glycerinstammlösung (Stamm #325) bei –70°C für die spätere Verwendung gelagert.
b. Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-MNN9-Gens – Zur Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des MNN9-Gens war es erforderlich, zuerst das MNN9-Gen aus genomischer S. cerevisiae-DNA zu klonieren. Dies wurde erreicht durch eine Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik. Ein 5'-Sense-Primer und ein 3'-Antisense-Primer für die PCR der für MNN9 kodierenden Volllängen-Sequenz wurden auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz für das Hefe-MNN9-Gen konstruiert (Zymogenetics: EP-Patentanmeldung Nr. 88 117 834.7, Veröffentlichungsnummer 0-314-096-A2). Es wurden die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer eingesetzt, welche flankierende HindIII-Stellen (unterstrichen) enthielten:
Sense-Primer: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (SEQ-ID-NR. 32);
Antisense-Primer: 5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (SEQ-ID-NR. 33).
Das initiierende Methionincodon für das MNN9-Gen ist in Fettdruck hervorgehoben. Die PCR erfolgte unter Einsatz von genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm JRY188 als Matrize, Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 25 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 37°C, 2 Min., 72°C, 3 Min.). Das resultierende 1,2-kbp-PCR-Fragment wurde mit HindIII verdaut, gelgereinigt und mit HindIII-verdautem, mit alkalischer Phosphatase behandeltem pUC13 (Pharmacia) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als p1183 bezeichnet.
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens mit dem Hefe-URA3-Gen wurde das Plasmid pBR322-URA3 (welches das 1,1-kbp-HindIII-Fragment, kodierend für das S. cerevisiae-URA3-Gen, subkloniert in die HindIII-Stelle von pBR322 enthält) mit HindIII verdaut und das 1,1-kbp-DNA-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit dem PmlI-verdauten Plasmid p1183 (PmlI spaltet innerhalb der für MNN9 kodierenden Sequenz) ligiert. Das resultierende Plasmid p1199 enthält eine Unterbrechung des MNN9-Gens durch das funktionelle URA3-Gen.
c. Konstruktion des U9-Derivat-Stammes 1372, welcher eine Unterbrechung des MNN9-Gens enthält – Zur Unterbrechung des MNN9-Gens in dem Stamm U9 (# 325) wurden 30 μg des Plasmids p1199 mit HindIII verdaut, um eine lineare mnn9::URA3-Unterbrechungs kassette zu schaffen. Zellen des Stamms 325 wurden mit der HindIII-verdauten p1199-DNA nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933) transformiert und Transformanten wurden auf einem synthetischen Agarmedium, dem Uracil fehlte und das 1,0 M Sorbit enthielt, selektioniert. Das synthetische Medium enthielt pro Liter destilliertes Wasser: Agar, 20 g, Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren, 6,7 g, Adenin, 0,04 g, L-Tyrosin, 0,05 g, Sorbit, 182 g, Glucose, 20 g, und Leucin-Minus-Lösung #2, 10 ml. Leucin-Minus-Lösung #2 enthält pro Liter destilliertes Wasser: L-Arginin, 2 g, L-Histidin, 1 g, L-Leucin, 6 g, L-Isoleucin, 6 g, L-Lysin, 4 g, L-Methionin, 1 g, L-Phenylalanin, 6 g, L-Threonin, 6 g, L-Tryptophan, 4 g.
Die Platten wurden bei 30°C fünf Tage lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt zahlreiche Kolonien erschienen waren. Chromosomale DNA-Präparationen wurden von 10 Kolonien hergestellt und dann mit EcoRI plus HindIII verdaut. Die DNA-Verdauungen wurden dann mittels Southernblots (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) unter Verwendung des 1,2-kbp-HindIII-Fragments, welches das MNN9-Gen trägt (isoliert aus dem Plasmid p1199), als Sonde beurteilt. Ein Isolat wurde identifiziert (Stamm # 1372), welches die erwarteten DNA-Banden-Verschiebungen auf dem Southernblot sowie die extreme Klumpigkeit zeigte, die typischerweise von mnn9-Mutanten gezeigt wird.
d. Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-HIS3-Gens – Zur Konstruktion einer Unterbrechungskassette, bei der das S. cerevisiae-HIS3-Gen durch das URA3-Gen unterbrochen wird, wurde das Plasmid YEp6 (Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035) mit BamHI verdaut und das 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit pUC18 ligiert, welches zuvor mit BamHI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid (als p1501 oder pUC18-HIS3 bezeichnet) wurde mit NheI verdaut (welches innerhalb der für HIS3 kodierenden Sequenz spaltet) und das Vektorfragment wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Das URA3-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322-URA3 durch Verdauung mit HindIII isoliert und das 1,1-kbp-Fragment, welches das URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem obigen pUC18-HIS3-NheI-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-his3::URA3 oder p1505 bezeichnet) enthält eine Unterbrechungskassette, bei der das Hefe-HIS3-Gen durch das funktionelle URA3-Gen unterbrochen ist.
e. Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-PRB1-Gens durch das HIS3-Gen – Das Plasmid FP8ΔH, welches das S. cerevisiae-PRB1-Gen trägt, wurde von Dr. E. Jones von der Carnegie-Mellon University (Moehle et al., 1987, Genetics 115: 255–263) zur Verfügung gestellt. Es wurde mit HindIII plus XhoI verdaut und das 3,2-kbp-DNA-Fragment, welches das PRB1-Gen trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18 wurde mit BamHI verdaut, gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das resultierende Vektorfragment wurde mit dem obigen PRB1-Gen-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC18-PRB1 zu ergeben. Das Plasmid YEp6, welches das HIS3-Gen enthält, wurde mit BamHI verdaut. Das resultierende 1,7-kbp-BamHI-Fragment, welches das funktionelle HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt und dann durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-PRB1 wurde mit EcoRV plus NcoI verdaut, welches innerhalb der für PRB1 kodierenden Sequenz spaltet und die aktive Stelle der Protease B und flankierende Sequenz entfernt. Das 5,7-kbp-EcoRV-NcoI-Fragment, welches die restlichen 5'- und 3'-Abschnitte der für PRB1 kodierenden Sequenz in pUC18 trägt, wurde gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert und mit dem oben beschriebenen glattendigen HIS3-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-prbI::HIS3 bezeichnet, Stamm # 1245) enthält das funktionelle HIS3-Gen anstelle des PRB1-Gen-Abschnitts, welcher oben deletiert worden war.
f. Konstruktion eines U9-verwandten Hefestammes, der Unterbrechungen sowohl des MNN9- als auch des PRB1-Gens enthält – Der U9-verwandte Stamm 1372, welcher eine MNN9-Gen-Unterbrechung enthält, wurde hier verwendet. Klonale Isolate des Stammes 1372 wurden einer Passage auf FOA-Platten unterworfen, um ura3-Mutanten zu selektionieren. Eine Anzahl von ura3-Isolaten des Stammes 1372 wurde erhalten und ein spezielles Isolat (Stamm 12930-190-S1-1) wurde für die nachfolgende Unterbrechung des HIS3-Gens ausgewählt. Der pUC18-his3::URA3-Genunterbrechungsvektor (p1505) wurde mit XbaI plus EcoRI verdaut, um eine lineare his3::URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-190-S1-1 nach dem Lithiumacetatverfahren (Methods in Enzymology, 1992, 194: 290) verwendet. Ura⁺-Transformanten wurden auf synthetischem Agarmedium ohne Uracil selektioniert, für klonale Isolate auf dem gleichen Medium erneut ausgestrichen und dann auf Medium, dem entweder Uracil oder Histidin fehlte, replikaplattiert, um hinsichtlich derjenigen Isolate zu screenen, welche sowohl Ura⁺ als auch His⁺ waren. Ein Isolat (Stamm 12930-230-1) wurde für die anschließende Unterbrechung des PRB1-Gens ausgewählt. Der PRB1-Genunterbrechungsvektor (pUC18-prb1::HIS3, Stamm # 1245) wurde mit SacI plus XbaI verdaut, um eine lineare prb1::HIS3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-230-1 nach dem Lithiumacetat-Verfahren eingesetzt. His⁺-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Histidin selektioniert und auf demselben Medium für klonale Isolate erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe der resultierenden His⁺-Isolate präpariert, mit EcoRI verdaut und dann auf 0,8%igen Agarosegelen elektrophoresiert. Southernblot-Analysen erfolgten dann mit Hilfe einer radioaktiv markierten 617-bp-Sonde für das PRB1-Gen, welche mittels PCR mit Hilfe der folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer hergestellt worden war:
5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3' (SEQ-ID-Nr. 34) und
5' CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3' (SEQ-ID-Nr. 35).
Es wurden 11 Isolate erhalten, welche die erwartete Hybridisierung der Sonde mit einem prb1::HIS3-DNA-Fragment von 2,44 kbp zeigten. Dies stand im Gegensatz zur Hybridisierung der Sonde mit dem 1,59-kbp-Fragment für das Wildtyp-PRB1-Gen. Eines dieser Isolate, enthaltend die gewünschte prb1::HIS3-Unterbrechung, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt und als Stamm # 1558 bezeichnet.
BEISPIEL 2
Expression von HPV11-L1 und HPV6-L1 in Hefe – Die Plasmide D362-1 (pGAL1-10 + HPV6/11-L1), p329-1 (pGAL1-10 + Wt-HPV11-L1), D128 (pGAL1-10 + HPV6-L1) und pGAL1-10 wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes #1558 (MATα, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, cir°) nach dem Sphäroplastenverfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929–1933) eingesetzt. Der mit dem Plasmid D362-1 transformierte Hefestamm #1558 wurde als Stamm #1782 bezeichnet. Für RNA-Studien wurden klonale Hefe-Isolate bei 30°C in YEH-Komplexmedium (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2, 117–121), enthaltend 0,1 M Sorbit und entweder 2% Glucose oder Galactose, 26 h lang gezüchtet. Nach Ernten der Zellen wurde Hefe-RNA unter Anwendung des Verfahrens mit heißem saurem Phenol wie beschrieben extrahiert (Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Current Protocols, 1993). Für die Proteinanalyse wurden die identischen Isolate bei 30°C in YEH-Komplexmedium, enthaltend 0,1 M Sorbit, 2% Glucose und 2% Galactose, 70 h lang gezüchtet. Nach Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen und Zelllysate hinsichtlich der Expression von HPV11-L1- oder HPV6-L1-Protein durch Immunblot-Analyse analysiert.
Fermentation von HPV6/11-L1 (Stamm #1782) – Das Oberflächenwachstum einer Plattenkultur des Stammes 1782 wurde steril auf ein leucin-freies flüssiges Medium überführt, das (pro Liter) enthielt: 8,5 g Difco-Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,2 g Adenin, 0,2 g Uracil, 10 g Bernsteinsäure, 5 g Ammoniumsulfat und 0,25 g L-Tyrosin; dieses Medium wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 5,0–5,3 eingestellt. Nach Wachstum für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler wurden eingefrorene Kulturgefäße vorbereitet durch Zugabe von sterilem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 17% (Gew./Vol.) vor der Lagerung bei –70°C (1 ml pro Kryogefäß). Das Impfgut für die Fermentation des Stammes 1782 wurde im gleichen Medium (750 ml pro 2-l-Kolben) entwickelt und gestartet durch Überführung der aufgetauten Inhalte von zwei eingefrorenen Kulturgefäßen in die 2-l-Kolben und Inkubation für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler. Bei der Fermentation des Stammes 1782 wurde ein Chemap 23 L-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 18 l nach der Animpfung verwendet. Das verwendete Produktionsmedium enthielt (pro l): 20 g Difco-Hefeextrakt, 10 g Sheffield-HySoy-Pepton, 20 g Glucose, 20 g Galactose; das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Der gesamte Inhalt (500 ml) des 2-l-Impfkolbens wurde in den Fermenter überführt, welcher bei 28°C, 9 l Luft pro Minute, 500 UpM, 3,5 psi Druck inkubiert wurde. Die mechanische Bewegung wurde erforderlichenfalls erhöht, um Niveaus an gelöstem Sauerstoff von mehr als 40% Sättigung aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Fermentation wurde durch Offline-Glucose-Messungen (Beckman Glucose 2 Analysator) und Online-Massenspektroskopie (Perkin-Elmer 1200) überwacht. Nach 66 h Inkubation wurde eine Zelldichte von 9,32 g Trockenzellgewicht pro Liter erreicht. Die Inhalte zweier solcher Fermentationen (insgesamte 17,5 l Bouillon) wurden vor der Zellgewinnung vereinigt. Die Kultur wurde durch Hohlfaserfiltration (Amicon H5MP01-43-Kartusche in einem Amicon DC-10-Filtrationssystem) auf etwa 2 l konzentriert, mit 2 l phosphatgepufferter Salzlösung diafiltriert und vor dem Abfüllen in 500-ml-Zentrifugenflaschen weiter konzentriert (auf etwa 1 l). Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei 8000 UpM (Sorvall GS3-Rotor) für 20 Minuten bei 4°C gewonnen. Nach Dekantierung des Überstands wurden die Pellets (insgesamt 358 g nasse Zellen) bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
Reinigung von rekombinanten HPV Typ 11-L1-Kapsidproteinen – Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 180 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 900 ml „Aufbruchpuffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren AEBSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1,7 mM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 4 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Ein ausreichendes Volumen an 10%igem Triton X100^®-Detergenz (Pierce, Rockford, IL) wurde der aufgebrochenen Zellaufschlämmung zugegeben, um die Konzentration an TX100 auf 0,5% zu bringen. Die Aufschlämmung wurde 20 Stunden lang gerührt. Das mit Triton X100 behandelte Lysat wurde mit 12.000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1-Protein, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde gegen 5 Volumina 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, unter Verwendung einer 300K-Tangentialströmungs-Membrankassette (Filtron, Northborough, MA) diafiltriert. Das von der Membran zurückgehaltene Material wurde mittels Radioimmunoassay und Westernblots befunden, das L1-Protein zu enthalten.
Das Retentat wurde auf eine hochauflösende Affinitätssäule (11,0 cm ID × 5,3 cm) von SP-Spherodex (M)^®-Harz (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Frankreich), äquilibriert in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Äquilibrierungspuffer und einer Stufenwaschung mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, wurde das L1-Protein mit einer Stufenwaschung von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 2,5 M NaCl, eluiert. Fraktionen wurden während der Waschschritte und Elution gesammelt. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen. Die Fraktionen wurden dann durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Fraktionen wurden auch durch Radioimmunoassay analysiert.
SP-Spherodex-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Endprodukt wurde durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde als > 90% homogen abgeschätzt. Die Identität des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt. Das Endprodukt wurde steril durch eine 0,22-μm-Membran filtriert und bei –70°C in 50 mM MOPS und 1,25 M NaCl gelagert.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wird mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wird auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure, pH 7,0, wird 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wird vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wird mit Hilfe eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein – Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) untersucht. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-H₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard- bzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) verwendet, um die Standardkurve zu erstellen. Ein Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh Ilci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assays – Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, Proben wurden auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1:1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Min. lang bei 100°C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V 1 h 45 Min. lang elektrophoresiert. Die Gele wurden durch Anfärbung mit kolloidalem Coomassie unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt.
Für Westernblots wurden Proteine bei 25 V für 40 Min. auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Milli-Q-H₂O gewaschen und luftgetrocknet. Der primäre Antikörper war polyklonales Kaninchen-Antiserum, induziert gegen ein TrpE-HPV11-L1-Fusionsprotein (Gabe von Dr. D. Brown). Die Antikörperlösung wurde hergestellt durch Verdünnung von Antiserum in Blottingpuffer (5% fettfreie Milch in 6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Die Inkubation fand für mindestens 1 h bei 20–23°C statt. Der Blot wurde für jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Eine Lösung von sekundärem Antikörper wurde präpariert durch Verdünnung von Konjugat-Antiserum von an alkalische Phosphatase gekoppeltem Antikaninchen-Ziegen-IgG (Pierce, Rockford, IL) in Blottingpuffer. Die Inkubation fand unter denselben Bedingungen mindestens 1 h lang statt. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen.
BEISPIEL 3
Proteinkonzentrationsabhängigkeit der Aggregation
Ein Lot HPV 11-VLP wurde wie oben beschrieben hergestellt und bei 0,47 mg/ml in 50 mM MOPS, enthaltend 1,25 M NaCl, gelagert. Dieses Lot wurde aufgetaut und eine Portion dieser Lösung auf 18 μg/ml im gleichen Puffer verdünnt. Während die Stammlösung bei einer höheren Proteinkonzentration den selben hydrodynamischen Durchmesser (Dh) im Bereich von 107–115 nm (wie mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen) für 2 Monate bei 4°C aufrecht erhielt, aggregierte die Lösung mit niedrigerer Proteinkonzentration im Laufe der Zeit, obwohl die Salzkonzentration bei 1,25 M NaCl gehalten wurde (1). 1 zeigt, daß bei einer niedrigeren HPV-Proteinkonzentration selbst hohe Salzkonzentrationen HPV nicht vor einer Aggregation während der Lagerung bei 4°C schützen.
BEISPIEL 4
Salzkonzentrationsabhängigkeit der Aggregation
Ein Lot von HPV 11- und HPV 16-VLP wurde hergestellt und hinsichtlich der Salzabhängigkeit der hydrodynamischen Größe während der Lagerung getestet. Rekombinante HPV 11- und -16-VLP wurden aus der Stammlösung (in 50 mM MOPS, 1,25 M NaCl, pH 7,0) in 50 mM MOPS-Puffer so verdünnt, daß die endgültige Proteinkonzentration konstant bei etwa 20 μg/ml blieb, jedoch die NaCl-Konzentration variierte wie in 2 angegeben. Die Verdünnungen erfolgten in Polypropylen-Eppendorfröhrchen und wurden bei Raumtemperatur gelagert. Messungen erfolgten innerhalb einer Stunde ab Herstellung der Verdünnungen, da, wie im vorherigen Beispiel (1) angegeben, eine langsame Aggregation bei dieser Proteinkonzentration stattfindet, selbst in einer Lösung, die eine hohe Salzkonzentration enthält. Der D_h-Wert war nahezu invariant bis herunter zu 0,15 M NaCl (HPV 11) und 0,5 M NaCl (HPV 16), nahm jedoch bei niedrigeren Salzkonzentrationen zu (2). Andererseits zeigten dialysierte Proben von HPV 11 größere hydrodynamische Größen bei allen Salzkonzentrationen und der Effekt war bei Salzkonzentrationen unter 0,5 M NaCl besonders ausgeprägt.
Ein separates Experiment mit einem anderen Lot von HPV 11 (Daten nicht als Figur dargestellt) zeigt, daß rekombinante HPV 11-L1-VLP (dialysiert in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), der unterschiedliche NaCl-Konzentrationen enthielt) eine Dh-Erhöhung von etwa 113 nm in 0,5 M NaCl auf 133 nm in 0,15 M NaCl zeigten. Proben, die in 1,0, 2,0 und 3,0 M NaCl dialysiert worden waren, zeigten Dh-Werte von 114, 113 und 108 nm in einem direkten Vergleich, während eine Probe, die in eine NaCl-Konzentration von 0,025 M dialysiert worden war, ein sichtbares Präzipitat bildete. Die Proteinkonzentrationen dieser Proben lagen im Bereich von 130–179 μg/ml (wie gemessen mit dem Lowry-Proteinassay), mit Ausnahme für die Probe in 0,025 M NaCl, bei der nur 16 μg/ml Protein in der Lösung verblieben. Eine Kontrollprobe, welche in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) mit 2,5 M NaCl gelagert, jedoch nicht dialysiert wurde, ergab einen Dh-Wert von 82 nm.
Die Daten dieses Beispiels zeigen, daß, obwohl niedrige Salzkonzentrationen oder niedrige Ionenstärken zu einer Interpartikel-Aggregation von HPV-VLPs führen, niedrige Proteinkonzentrationen und physikalische Manipulationen der HPV-Lösung (wie z.B. Dialyse des Proteins) ebenfalls stark zur HPV-VLP-Aggregation beitragen.
BEISPIEL 5
Oberflächenadsorption von HPV 11-VLPs
Dialysemembranoberfläche – Eine 50-μg/ml-Lösung des Proteins in 50 mM MOPS-Puffer bei pH 7,0, enthaltend 0,18 M NaCl, wurde mit verschiedenen Oberflächen der Dialysemembran inkubiert, um die Wirkung der Dialysemembran direkt auf die HPV 11-Aggregation zu untersuchen. Der Dh-Wert wurde befunden, mit zunehmender Oberfläche der Membran nach 96 h Inkubation bei Raumtemperatur zuzunehmen (3). Gleichzeitig wurde die Proteinkonzentration in Lösung befunden, mit zunehmender Membranoberfläche abzunehmen (3). Diese Beobachtungen weisen auf eine Adsorption von HPV 11 auf der Membranoberfläche hin und legen eine Korrelation zwischen Oberflächenadsorption und Aggregation nahe. Diese Daten zeigen, daß eine längerere Exposition niedriger Konzentrationen von HPV gegenüber einer Polypropylenoberfläche und Dialysemembranoberfläche Oberflächenadsorption und Aggregation verursacht. Diese beiden Prozesse sind temperaturabhängig. Proben, die bei 4°C inkubiert worden waren, zeigten eine langsamere Kinetik für beide Prozesse als diejenigen bei 25°C.
Vergleich der HPV-Adsorption auf verschiedenen Behälteroberflächen – Die HPV-Adsorption wurde, bei identischen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnissen, in Borsilicatglas-, Polypropylen- und Polystyrol-Röhrchen (identische Abmessungen von 12 × 75 mm²) bei verschiedenen HPV-Konzentrationen verglichen. Die Proben wurden in 50 mM MOPS-Puffer, enthaltend 1,25 M NaCl, bei pH 7,0 inkubiert und 24 h lang bei Raumtemperatur belassen. 4 zeigt, daß die Oberflächenadsorption in Borsilicatglas unter 100 μg/ml signifikant ist. Polypropylen ist insofern besser, als die Adsorption unter diesen Bedingungen ein signifikantes Problem unter 30 μg/ml wird, jedoch nicht bei höheren Konzentrationen. Polystyrol liefert das beste Ergebnis und zeigt keinerlei signifikante Proteinadsorption bis herunter zu 10 μg/ml.
Die Oberflächenadsorption von HPV wurde weiter untersucht, wobei HPV 11 (18 μg/ml in 50 mM MOPS-Puffer mit 0,25 M NaCl) in Polypropylenröhrchen mit zwei verschiedenen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnissen eingebracht wurde (5). Nach einem Tag bei Raumtemperatur war im wesentlichen das gesamte HPV bei einem Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis von 6,0 cm^–1 an der Oberfläche adsorbiert, während etwa 15% Adsorption beobachtet wurde, wenn das Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis 4,0 cm^–1 betrug (5).
BEISPIEL 6
Exzipienten inhibieren HPV 11-VLP-Oberflächenadsorption und -Aggregation
Screening von Tensiden in einem Versuch mit beschleunigter Stabilität – In einem einleitenden Screeningversuch wurden HPV 11-Proben in Anwesenheit und Abwesenheit von 0,01% verschiedener Tenside 20 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die HPV-Konzentration betrug 18 μg/ml und der Puffer enthielt 50 mM MOPS, 0,15 M NaCl bei pH 7,0. Mehrere Tenside boten einen partiellen Schutz gegenüber Aggregation unter diesen Bedingungen im Vergleich zu der nicht mit Tensid behandelten HPV-Probe, wie durch dynamische Lichtstreuung festgestellt (6A).
Ein Tensid-Screening-Versuch wurde unter Bedingungen stärkerer Beanspruchung durchgeführt. HPV 11 wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,01% eines jeden Tensids bei 50°C für 30 Minuten inkubiert und dann bei Raumtemperatur für 2 Tage. Die HPV-Konzentration betrug 18 μg/ml und der Puffer enthielt 50 mM MOPS und 0,04 M NaCl bei pH 7,0. Unter diesen Bedingungen aggregierte die nicht mit Tensid behandelte Kontroll-HPV-Probe in einem viel größeren Ausmaß im Vergleich zu dem oben beschriebenen Versuch. Von den getesteten Tensiden zeigt 6B, daß Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Tween 80^®) und Polyoxyethylenalkylether (Brij 58^®) den besten Schutz vor einer HPV 11-VLP-Aggregation ergaben.
Schutzwirkung von Salz und Polysorbat 80 in Kombination 7A und 7B zeigen für Natriumchlorid, Natriumsulfat und Ammoniumsulfat bei jeweils 0,1 M und 0,5 M, daß bei niedrigeren HPV-Konzentrationen hohe Salzkonzentrationen allein die HPV-VLP-Oberflächenadsorption oder -Aggregation nicht verhindern. Umgekehrt zeigen 7A und 7B auch, daß die Zugabe des nichtionischen Tensids Tween 80^® zu einem 0,4 M Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer zu einem fast vollständigen Schutz gegenüber Adsorption und Aggregation selbst nach 6 Tagen bei Raumtemperatur führt.
Die Wirkung von Polysorbat 80 (z.B. Tween 80^®) und NaCl auf die Oberflächenadsorption und Aggregation wurde erneut in einem separaten Versuch bestätigt. HPV 11-L1-VLP wurde in einer Konzentration von 18 μg/ml in Polypropylenröhrchen in 50 mM MOPS-Puffer, enthaltend 250 mM NaCl bei pH 7, mit oder ohne 0,01% Tween 80^® inkubiert. 8 zeigt den Prozentsatz an adsorbiertem Protein und die Dh-Werte als Funktion der Inkubationszeit bei Raumtemperatur. In Abwesenheit von Tween 80^® sind sowohl der adsorptive Verlust als auch die Aggregation sehr signifikant, während 0,01% Tween 80^® einen Schutz gegen beide Probleme bietet.
9 zeigt, daß eine optimale Salzkonzentration zusätzlich zu Polysorbat 80 erforderlich ist, um niedrige Konzentrationen an HPV 11-VLPs (100 μg/ml) vor Aggregation und Adsorption zu schützen. Es ist auch zu sehen, daß eine Erhöhung an Tween 80^® in Formulierungen mit einer niedrigen Ionenstärke einen partiellen, aber keinen vollständigen Schutz bietet. 9 zeigt, daß die Aggregation von HPV 11 (18 μg/ml) nur teilweise von 0,01% Tween 80^® in einem Puffer, der 50 mM MOPS und 0,04 M NaCl enthielt, kontrolliert wurde, jedoch fast vollständig gegen eine VLP-Aggregation für 48 h bei Raumtemperatur schützte, wenn die NaCl-Konzentration auf 0,10 M erhöht wurde.
10 zeigt die Wirkung der Titration von Polysorbat 80 auf die Aggregation von HPV 11-VLP (18 μg/ml) in 50 mM MOPS-Puffer, enthaltend 0,15 M NaCl, bei pH 7,0. Die Proben wurden mit Tween 80^®-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 0,01% bei 4°C und Raumtemperatur inkubiert. Bei 4°C wurde keine signifikante Aggregation bis zu 20 Tagen in der 0,01% Tween enthaltenden Probe beobachtet, während ein partieller Schutz gegen Aggregation bei Raumtemperatur beobachtet wird.
11 zeigt das Vermögen von nichtionischen Tensiden zum Schutz vor HPV 16-VLP gegen Aggregation. Die untersuchten Tenside umfassen Polysorbat 80 (z.B. Tween 80), Polysorbat 20 (z.B. Tween 20), NP-40, Triton X-100, Triton X-114 sowie Polyoxyethylenalkylether (z.B. Brij 35 und Brij 58). Die HPV 16-Proben bei 20 μg/ml Protein wurden mit 0,01% verschiedener Tenside bei Raumtemperatur (Umgebungstemperatur) 50 Tage lang inkubiert. Der Inkubationspuffer enthielt 50 mM MOPS, 0,15 M NaCl bei pH 7. Alle Tenside schützten HPV 16 gegen Aggregation während der Lagerung im Vergleich zu einer Kontroll-HPV 16-Probe ohne Tensid, wie mittels DLS festgestellt (11). Das Ausmaß des Schutzes bei dieser Tensidkonzentration (0,01%) variiert etwas von Tensid zu Tensid. Zum Testen der Salzabhängigkeit des Schutzvermögens nichtionischer Tenside wurden HPV 16-Proben mit 30–60 μg/ml Protein 24 Stunden lang bei 4°C mit 0,01~0,02% Tween 80 und einer NaCl-Konzentration von 0,15–0,5 M inkubiert. Es wurde beobachtet, daß NaCl-Konzentrationen von 0,2 M oder höher in Kombination mit nichtionischen Tensiden einen signifikanten Schutz gegen HPV 16-VLP-Aggregation ergeben.
Die Stabilisierungswirkung der Salzkonzentration gegenüber einer HPV-Aggregation in Anwesenheit nichtionischer Tenside wurde als Gesamtionenstärke untersucht. 2 und 9 zeigen, daß eine minimale NaCl-Konzentration erforderlich ist, um HPV-VLP in Anwesenheit oder Abwesenheit nichtionischer Tenside zu stabilisieren. Im folgenden Versuch wurden verschiedene Salze hinsichtlich ihres Vermögens zur Stabilisierung von HPV 16-VLP bei einer konstanten Ionenstärke untersucht. 60 μg/ml HPV 16 wurden 24 h lang bei 22°C inkubiert, dann bei 4°C gelagert, bis ein Assay hinsichtlich der hydrodynamischen Größe (Dh) durch dynamische Lichtstreuung und durch in vitro-Antigenizität (Antikörperbindung) durch EIA- und BIA-Kernanalyse durchgeführt wurde. Tabelle 1 zeigt, daß wenn eine Vielfalt von Salzen anstelle von NaCl verwendet wurde, eine ähnliche HPV-Stabilität bei niedrigeren Salzkonzentrationen, jedoch bei derselben Ionenstärke beobachtet wurde. Als Kontrolle führte eine Lösung mit niedrigerer Ionenstärke zu HPV-Aggregation und partiellem Verlust der Antigenizität. Diese Ergebnisse legen nahe, daß unter diesen Bedingungen die Salzstabilisierungswirkung durch die Ionenstärke und nicht durch den Salztyp dominiert wird. Wurden ähnliche Salzstabilisierungswirkungen unter Bedingungen höherer Beanspruchung (37°C) getestet, so wurden gewisse Variationen des Stabilisierungsvermögens bei verschiedenen Salzen beobachtet, wie durch in vitro-Antigenizität-Assays und Aggregationsanalyse gezeigt. Beispielsweise waren CaCl₂ und MgCl₂ sowie Phosphatpuffer weniger effektiv hinsichtlich der Stabilisierung von HPV-VLPs bei einer konstanten Ionenstärke. TABELLE 1

* Die relative in vitro-Antikörperbindungsreaktion wurde auf eine bei –70°C eingefrorene Kontroll-HPV 16-Probe normalisiert. Die Kontrolle wurde unmittelbar vor dem Assay aufgetaut. Der hydrodynamische Durchmesser (Dh) der Kontrollprobe gemäß dynamischer Lichtstreuung wurde als 73 nm gemessen.

Deshalb schützt die Anwesenheit von Polysorbat 80 bei einer so niedrigen Konzentration wie 0,01% HPV 11 und HPV 16 vor einer Adsorption an Behälteroberflächen und vor einer Inter partikel-Aggregation bei nahezu physiologischer Ionenstärke für Wochen bei 4°C. Diese Daten zeigen auch, daß (1) die Adsorption von HPV auf Oberflächen und die Aggregation in Zusammenhang stehen und (2) sowohl elektrostatische als auch hydrophobe Mechanismen beteiligt sein mögen, da weder Detergenzien allein noch ein Salz allein einen vollen Schutz gegen entweder Adsorption oder Aggregation bieten kann.
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Human-Papillomavirus-Antigen-Vakzinformulierung, welche frei von alaun-enthaltenden Adjuvantien ist und welche gegenüber Antigen-Aggregation bei Temperaturen oberhalb von 0°C stabilisiert ist, umfassend: (a) eine Vakzin-Komponente, umfassend human-papillomavirus-ähnliche Partikel, die entweder L1-Protein oder L1- und L2-Protein umfassen; (b) ein Salz, ausgewählt aus Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumacetat, Natriumcitrat und Natriumphosphat, welches in einer physiologisch annehmbaren Konzentration vorliegt; und (c) ein nichtionisches Tensid, welches in einer physiologisch annehmbaren Konzentration vorliegt.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 1, worin die human-papillomavirus-ähnlichen Partikel aus der Gruppe von Human-Papillomavirus-Typen, bestehend aus 6a, 6b, 11, 16, 18, und irgendeiner Kombination davon ausgewählt sind.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 2, worin das Salz Natriumchlorid ist.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 3, worin Natriumchlorid in einer Konzentration von 50 mM bis 500 mM vorliegt.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 3, worin Natriumchlorid in einer Konzentration von 150 mM bis 300 mM vorliegt.
Antigen-Formulierung nach irgendeinem der vorgehenden Ansprüche, worin das nichtionische Tensid aus der Gruppe nichtionischer Tenside, bestehend aus Polysorbaten, Polyoxyethylenalkylethern, Triton X-100^®, Triton 114^®, NP40^®, Span 85 und Pluronic 121, ausgewählt ist.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 6, worin das Polysorbat ein Polysorbat 80 ist.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 7, worin Polysorbat 80 in einer Konzentration von bis zu 0,2% Gew./Vol. vorliegt.
Antigen-Formulierung nach Anspruch 7, worin Polysorbat 80 in einer Konzentration von bis zu 0,01% Gew./Vol. vorliegt.
Human-Papillomavirus-Antigen-Formulierung nach Anspruch 1, welche umfaßt: a) eine Population von human-papillomavirus-ähnlichen Partikeln, umfassend das Human-Papillomavirus-L1-Protein, welches aus der Gruppe, bestehend aus 6a, 6b, 11, 16 und 18, ausgewählt ist; b) Natriumchlorid in einer Konzentration von 150 mM bis 300 mM; und c) Polysorbat 80 in einer Konzentration von bis zu 0,1% Gew./Vol.
Verfahren zur Stabilisierung einer Population von gereinigten virusähnlichen Partikeln, die von L1- oder L1- und L2-Protein von Human-Papillomavirus abgeleitet sind, bei Temperaturen oberhalb von 0°C für eine Zeitspanne von mindestens einem Monat, welches das Einbringen der gereinigten virusähnlichen Partikel in eine Formulierung, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 50 mM bis 500 mM und Polysorbat 80 in einer Konzentration von bis zu 0,2% Gew./Vol. enthält, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Vakzin-Formulierung Natriumchlorid in einem Konzentrationsbereich von 150 mM bis 300 mM umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei Polysorbat 80 in einer Konzentration von bis zu 0,1% Gew./Vol. vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Formulierung bei Temperaturen von 2°C bis 8°C für eine Zeitspanne von mindestens einem Monat stabil ist.