DE69531308T2

DE69531308T2 - Verfahren zur Herstellung von gereinigten papillomavirus Proteinen

Info

Publication number: DE69531308T2
Application number: DE69531308T
Authority: DE
Inventors: Ernest D. Lehman; Iii James C. Cook; Hugh A. George; Kathryn J. Hofmann; Kathrin U. Jansen; Joseph G. Joyce; Henry Z. Markus; Loren D. Schultz
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1994-11-14
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2015-11-14
Also published as: FI972030A0; BR9510520A; EP0789767A1; EP0789767B1; AU708737B2; DE69531308D1; JPH11500002A; SK59497A3; WO1996015247A1; MX9703570A; ATE245192T1; SK281878B6; FI972030A; YU71195A; AU4365896A; CZ145297A3; DK0789767T3; AR004464A1; ES2201129T3; NZ298224A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von gereinigten rekombinanten Proteinen eines Papillomavirus (PV).
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt einen bidirektionalen Hefe-Expressionsvektor, der zur Expression von Papillomavirus-L1- und/oder -L2-Kapsidproteinen vewendet wurde.
2 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von HPV6a-L1-VLPs, exprimiert in Hefe.
3 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme von HPV6a-L1/L2-VLPs, exprimiert in Hefe.
4 ist ein schematischer Überblick über die Herstellung des S. cerevisiae-Stammes 1558.
5 ist ein schematischer Überblick über die Herstellung des S. cerevisiae-Stammes 1569.
6 stellt die Hauptschritte in einem Reinigungsverfahren dar.
7 ist eine Liste von Stämmen.
8 zeigt einen Satz von SDS-PAGE-Analysen von HPV16-L1 + L2, gereinigt aus Hefe. Neben dem endgültig gereinigten VLP sind Proben aus Zwischenschritten im Reinigungsverfahren eingeschlossen. Die Tabelle ermöglicht die Identifizierung der Probe in jeder Spur. Ein Gel, das mit kolloidalem Coomassie angefärbt wurde, sowie Westernblots, die mit Antiseren gegen L1- und L2-Proteine sondiert wurden, sind eingeschlossen.
9 ist eine schematische Darstellung von alternativen Reinigungsverfahren für Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus-L1.
Hintergrund der Erfindung
Papillomavirus (PV)-Infektionen treten bei einer Vielzahl von Lebewesen, einschließlich von Menschen, Schafen, Hunden, Katzen, Kaninchen, Affen, Schlangen und Rindern, auf. Papillomaviren infizieren Epithelzellen, wobei sie im allgemeinen gutartige epitheliale oder fibroepitheliale Tumore an der Infektionsstelle induzieren. Papillomaviren sind speziesspezifische infektiöse Agenzien; ein Human-Papillomavirus kann kein nicht-menschliches Lebewesen infizieren.
Papillomaviren können auf Grundlage des Wirts, den sie infizieren, in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Human-Papillomaviren (HPV) werden weiterhin auf der Grundlage von DNA-Sequenzhomologie in mehr als 70 Typen eingeteilt. PV-Typen scheinen insofern typspezifische Immunogene darzustellen als eine neutralisierende Immunität gegen Infektion durch einen Typ von Papillomavirus keine Immunität gegen einen anderen Typ von Papillomavirus verleiht.
Bei Menschen verursachen verschiedene HPV-Typen unterschiedliche Erkrankungen. Die HPV-Typen 1, 2, 3, 4, 7, 10 und 26–29 verursachen gutartige Warzen bei sowohl normalen als auch immungeschwächten Personen. Die HPV-Typen 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19–25, 36 und 46–50 verursachen flache Läsionen bei immungeschwächten Personen. Die HPV-Typen 6, 11, 34, 39, 41–44 und 51–55 verursachen nicht-maligne Condylome der Schleimhäute der Genitalien oder Atemwege. Die HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45 und 58 verursachen eine Epithel-Dysplasie der Genitalschleimhaut und sind mit der Mehrheit von in situ- und invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses, der Vagina, Vulva und des Analkanals assoziiert.
Papillomaviren sind kleine (50–60 nm), nicht von einer Hülle umgebene, ikosaedrische DNA-Viren, welche für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. Die offenen Leserahmen (ORF) der Virusgenome werden als E1 bis E7 und L1 und L2 bezeichnet, wobei "E" früh bedeutet und "L" spät bedeutet. L1 und L2 kodieren für Virus-Kapsidproteine. Die frühen (E) Gene sind mit Funktionen wie viraler Replikation und zellulärer Transformation assoziiert.
Das L1-Protein ist das Haupt-Kapsidprotein und besitzt ein Molekulargewicht von 55-60 kD. Das L2-Protein ist ein weniger häufiges Kapsidprotein, welches ein vorausgesagtes Molekulargewicht von etwa 55–60 kD und ein scheinbares Molekulargewicht von 75–100 kD, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt, aufweist. Immunologische Daten legen nahe, daß sich der größte Teil des L2-Proteins innerhalb des L1-Proteins befindet. Der L1-ORF ist bei verschiedenen Papillomaviren hochkonserviert. Die L2-Proteine sind bei verschiedenen Papillomaviren weniger konserviert.
Die L1- und L2-Gene wurden als gute Ziele für immunprophylaktische Maßnahmen identifiziert. Von einigen der frühen Gene wurde auch gezeigt, daß sie potentielle Ziele für die Vakzin-Entwicklung sind. Studien in den Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV)- und Rinder-Papillomavirus (BPV)-Systemen haben gezeigt, daß Immunisierungen mit diesen Poteinen, exprimiert in Bakterien oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren, Tiere vor einer Virusinfektion schützten. Die Expression von Papillomavirus-L1-Genen in Baculovirus-Expressionssystemen oder unter Verwendung von Vaccinia-Vektoren führte zum Zusammenbau von virusähnlichen Partikeln (VLP), welche zur Induktion von virusneutralisierenden Antikörperreaktionen mit hohem Titer, die mit dem Schutz vor einer vitalen Herausforderung korrelieren, eingesetzt wurden. Ferner wurden die L1- und L2-Gene zur Erzeugung von Vakzinen für die Verhütung und Behandlung von Papillomavirus-Infektionen in Lebewesen eingesetzt. HPV-Typ 16-L1- und -L2-Gene wurden in einen Vacciniavirus-Vektor kloniert; der resultierende Vektor wurde zur Infektion von CV-1-Säugerzellen eingesetzt, um virusähnliche Partikel (VLP) herzustellen.
Die Entwicklung und kommerzielle Verwendung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine PV-Infektion und -Erkrankung, welche L1-Protein, L1 + L2-Proteine oder modifizierte L1- oder L1+L2-Proteine enthalten, wurde durch den Mangel an großen Mengen von gereinigtem Virus und gereinigtem Protein behindert. Nachdem PV nicht ohne weiteres in vitro kultiviert wird, ist es schwierig, die erforderlichen Mengen an L1- und L2-Protein durch in vitro-Vermehrung von PV herzustellen. Die resultierenden Versorgungsprobleme machen die Charakterisierung von PV und PV-Proteinen schwierig. Dementsprechend wäre es von Nutzen, eine unschwer erneuerbare Quelle von rohen PV-Proteinen, insbesondere PV-L1- und -L2-Proteinen oder modifizierten L1- und L2-Proteinen, zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, Verfahren zur Reinigung großer Mengen der rohen Papillomavirus-Proteine auf Niveaus einer für immunologische Studien und Vakzin-Entwicklung geeigneten Reinheit zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, große Mengen an Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des nativen Proteins, herzustellen. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, Verfahren zur Analyse der PV-Proteine und Verfahren zur Bestimmung der relativen Reinheit der Proteine sowie von Zusammensetzungen, welche die Proteine enthalten, zu entwickeln. Solche hochgereinigten Proteine wären auch von Nutzen bei der Herstellung einer Vielfalt von Reagenzien, die sich für das Studium der PV-Infektion eignen; solche Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und analytische Standards.
R. C. Rose et al., J. Virol. 67, 1936–1944 (1993), offenbaren die Reinigung von rekombinantem HPV-L1-Protein in zwei aufeinander folgenden Chromatographieschritten.
Die vorliegende Erfindung betrifft hochgereinigte L1- und L2-Proteine von PV. Die Erfindung umfaßt auch Verfahren, mit denen rekombinante Papillomavirus-Proteine mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Papillomavirus-Proteine hergestellt und gereinigt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine Papillomavirus-Infektion. Die rekombinanten Proteine der vorliegenden Erfindung sind zur Bildung von virusähnlichen Partikeln in der Lage. Diese VLP sind immunogen und verhindern die Warzenbildung bei einem Tiermodell. Die Erfindung wird mit rekombinanten, von Hefe erhaltenen L1- und L1 + L2-Proteinen des Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus (CRPV), HPV Typ 6 (Subtyp 6a) und HPV Typ 16 als Modell systeme beispielhaft erläutert. Die Reinigungsverfahren und analytischen Verfahren der vorliegenden Anmeldung können an andere HPV-Typen, andere HPV-Proteine und andere rekombinante Expressionssysteme angepaßt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft gereinigte rekombinante Proteine von Papillomaviren (PV) und Verfahren zur Herstellung, Bestimmung, Verwendung und Formulierung derselben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Papillomavirus-Kapsidproteins, umfassend:

a) Transformation eines Hefewirts mit einem rekombinanten DNA-Molekül, wobei das rekombinante DNA-Molekül für ein Protein kodiert, das aus Papillomavirus-L1-Protein und Papillomavirus-L1+L2-Proteinen ausgewählt ist;
b) Kultivierung des transformierten Wirts unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten DNA-Moleküls erlauben, um ein rohes rekombinantes Papillomavirus-Protein herzustellen; und
c) Reinigung des rohen rekombinanten Papillomavirus-Proteins mit einem einzigen Chromatographieschritt unter Anwendung von lonenaustauschchromatographie, um das gereinigte Protein herzustellen, wobei das Protein zu mindestens 90% rein ist.

Es wurden von Bakterien erhaltene, rekombinante Rinder-Papillomavirus-L1 und -L2 hergestellt. Neutralisierende Seren gegen die rekombinanten bakteriellen Proteine ergaben Kreuzreaktionen mit nativem Virus auf niedrigen Niveaus, mutmaßlich aufgrund von Unterschieden in den Konformationen der nativen Proteine und der von Bakterien erhaltenen Proteine.
Rekombinante Baculoviren, die HPV16-L1- oder HPV16-L2-ORFs exprimierten, wurden zur Infektion von SF9-Insektenzellen und zur Herstellung von L1- und L2-Proteinen verwendet. Westernblot-Analysen zeigten, daß die von Baculovirus erhaltenen L1- und L2-Proteine mit Antikörper gegen HPV16 reagierten. Das von Baculovirus erhaltene L1 bildet VLPs.
Die Herstellung von rohen HPV16-L1- und HPV16-L2-Proteinen durch rekombinante Stämme von Saccharomyces cerevisiae wurde berichtet. Die rekombinanten Proteine wurden als intrazelluläre und als sekretierte Produkte hergestellt. Wenn die Proteine intrazellulär exprimiert wurden, wurde die Hauptmenge des Proteins als unlöslich befunden, wenn die Zellen in Abwesenheit denaturierender Reagenzien lysiert wurden. Die Reinheit dieser Proteine wurde nicht mitgeteilt.
Von rekombinanten Proteinen, die von Hefe sekretiert wurden, wurde gezeigt, daß sie von Hefe stammende Kohlenhydrate enthalten. Die Anwesenheit dieser N-verknüpften Oligosaccharide kann native Epitope maskieren. Darüber hinaus können die sekretierten rekombinanten Proteine andere Modifizierungen enthalten, wie z. B. die Retention der sekretorischen Leadersequenz. Der Sekretionsprozeß kann auch weniger effizient sein.
Die Entwicklung und kommerzielle Verwendung prophylaktischer und therapeutischer Vakzine für eine PV-Infektion und -Erkrankung, welche L1-Protein, L1 + L2-Proteine oder modifizierte L1- oder L1 + L2-Proteine enthalten, wurde durch den Mangel an großen Mengen von gereinigtem Virus und gereinigtem Protein behindert. Nachdem PV nicht ohne weiteres in vitro kultiviert wird, ist es schwierig, die erforderlichen Mengen an L1- und L2-Protein durch in vitro-Vermehrung von PV herzustellen. Die mit der in vitro-Kultivierung von PV verbundenen Schwierigkeiten führen auch zu Schwierigkeiten bei der chemischen, immunologischen und biologischen Charakterisierung von PV und PV-Proteinen. Dementsprechend wäre es von Nutzen, eine unschwer regenerierbare Quelle von rohen PV-Proteinen, insbesondere PV-L1- und -L2-Proteinen oder modifizierten L1- und L2-Proteinen, zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, Verfahren zur Reinigung großer Mengen der rohen Papillomavirus-Proteine auf Niveaus einer für immunologische Studien und Vakzin-Entwicklung geeigneten Reinheit zu entwickeln. Es wäre auch von Nutzen, große Mengen an Papillomavirus-Proteinen mit den immunitätsverleihenden Eigenschaften der nativen Proteine, wie z. B. der Konformation des nativen Proteins, herzustellen. Darüber hinaus wäre es von Nutzen, Verfahren zur Analyse der PV-Proteine und Verfahren zur Bestimmung der relativen Reinheit der Proteine sowie von Zusammensetzungen, welche die Proteine enthalten, zu entwickeln. Solche hochgereinigten Proteine wären auch von Nutzen bei der Herstellung einer Vielfalt von Reagenzien, die sich für das Studium der PV-Infektion eignen; solche Reagenzien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und analytische Standards.
Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, welche die DNA oder von der DNA kodierte Proteine umfassen, können nach bekannten Verfahren formuliert werden, wie z. B. durch die Zumischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins oder VLP enthalten. Solche Zusammensetzungen können Proteine oder VLP enthalten, die von mehr als einem HPV-Typ stammen.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um PV-Infektionen zu behandeln oder zu diagnosti zieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z. B, dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen in Dosen verabreicht, die von etwa 1 μg bis etwa 1 mg reichen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Routen, wie z. B. subkutan, topisch, oral, mukosal, intravenös und intramuskulär, verabreicht werden.
Die Vakzine umfassen DNA, RNA oder Proteine, die von der DNA kodiert werden, welche die antigenen Determinanten enthält, die zur Bildung neutralisierender Antikörper in dem Wirt erforderlich sind. Solche Vakzine sind auch sicher genug, um ohne Gefahr einer klinischen Infektion verabreicht zu werden, besitzen keine toxischen Nebenwirkungen, können auf einem effektiven Weg verabreicht werden, sind stabil und kompatibel mit Vakzin- Trägern.
Die Vakzine können auf einer Vielfalt von Routen verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, subkutan, mukosal, intravenös oder intramuskulär. Die verabreichte Dosis kann mit dem Zustand, Geschlecht, Gewicht und Alter des Individuums, dem Verabreichungsweg und dem PV-Typ des Vakzins variieren. Das Vakzin kann in Dosierungsformen wie Kapseln, Suspensionen, Elixieren oder flüssigen Lösungen eingesetzt werden. Das Vakzin kann mit einem immunologisch annehmbaren Träger formuliert werden.
Die Vakzine werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d.h. in ausreichenden Mengen, um eine immunologisch schützende Reaktion hervorzurufen. Die therapeutisch wirksame Menge kann entsprechend dem PV-Typ variieren. Das Vakzin kann in Einzeldosen oder mehreren Dosen verabreicht werden.
Die gereinigten Proteine der vorliegenden Erfindung können bei der Formulierung immunogener Zusammensetzungen eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen sind bei Einführung in einen geeigneten Wirt zur Induktion einer Immunreaktion in dem Wirt in der Lage.
Die gereinigten Proteine der Erfindung können zur Herstellung von Antikörpern ein gesetzt werden. Der Begriff "Antikörper", wie hier verwendet, umfaßt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie Fragmente davon, wie z. B. Fv-, Fab- und F(ab)₂-Fragmente, die zur Bindung von Antigen oder Hapten in der Lage sind.
Die Proteine und Protein-Derivate der vorliegenden Erfindung können zur Serotypenbestimmung einer HPV-Infektion und zum HPV-Screening eingesetzt werden. Die gereinigten Proteine, VLP und Antikörper sind geeignet zur Formulierung von Kits, die sich für den Nachweis und die Serotypenbestimmung von HPV eignen. Ein solcher Kit würde einen aufgeteilten Träger umfassen, der dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu umfassen. Der Träger kann ferner Reagenzien wie rekombinante HPV6a-L1-oder -L2-Proteine oder -VLP oder Anti-HPV6a-Antikörper oder rekombinante HPV16-L1-oder -L2-Proteine oder -VLP oder Anti-HPV16-Antikörper, die sich zum Nachweis einer Vielfalt von HPV-Typen eignen, umfassen. Der Träger kann auch Mittel zum Nachweis, wie z. B. markiertes Antigen oder Enzym-Substrate oder dgl., enthalten.
Die gereinigten Proteine eignen sich auch als immunologische Standards, Molekulargewichtsmarker und molekulare Größenmarker.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon eingesetzt werden, um für eine spezielle Aminosäure zu kodieren, und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide kodiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit den HPV6a- oder HPV16-Sequenzen identisch sein, wird jedoch in der Lage sein, sogar in Gegenwart von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen unter geeigneten Bedingungen mit HPV6a- oder HPV16-DNA zu hybridisieren. Unter alternativen Bedingungen könnten die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide immer noch mit HPV6a- oder HPV16-DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von für HPV6a oder HPV16 kodierender DNA zu erlauben.
Die gereinigte HPV6a- oder HPV16-DNA der Erfindung kann zur Isolierung und Reinigung von Homologen und Fragmenten von HPV6a aus anderen Quellen eingesetzt werden. Um dies zu erreichen, kann die erste HPV6a-DNA mit einer Probe, enthaltend DNA, welche für Homologe von HPV6a kodiert, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen gemischt werden. Der hybridisierte DNA-Komplex kann isoliert und die DNA, welche für die homologe DNA kodiert, kann daraus gereinigt werden.
Es ist bekannt, daß es ein erhebliches Maß an Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, welche für spezielle Aminosäuren kodieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch diejenigen DNA-Sequenzen, welche alternative Codons enthalten, die für das schließliche Translationsprodukt der identischen Aminosäure kodieren. Für die Zwecke dieser Patentbeschreibung wird eine Sequenz, die ein oder mehrere ersetztes) Codons) trägt, als Degenerationsvariante definiert werden. Ebenfalls eingeschlossen sind Mutationen entweder in der DNA-Sequenz oder dem translatierten Protein, welche die schließlichen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins nicht wesentlich ändern. Beispielsweise mag eine Substitution von Leucin durch Valin, Lysin durch Arginin oder Glutamin durch Asparagin keine Veränderung der Funktionalität des Polypeptids verursachen.
Es ist bekannt, daß DNA-Sequenzen, die für ein Peptid kodieren, verändert werden können, so daß sie für ein Peptid mit Eigenschaften kodieren, welche sich von denjenigen des in der Natur vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Veränderung der DNA-Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, stellengerichtete Mutagenese.
Eine Vielfalt von im Stand der Technik bekannten Verfahren kann zur molekularen Klonierung von HPV6a-DNA eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, direkte funktionelle Expression der HPV6a-Gene nach der Erstellung einer HPV6a-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem. Ein weiteres Verfahren ist das Screenen einer HPV6a-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank, die in einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer markierten Oligonukleotid-Sonde, die anhand der Aminosäuresequenz des HPV6a konstruiert wurde. Ein weiteres Verfahren besteht im Screenen einer HPV6a-enthaltenden cDNA-Bank oder genomischen DNA-Bank, die in einem Bakteriophagen oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer partiellen DNA, welche für das HPV6a kodiert. Diese partielle DNA wird erhalten durch die spezifische Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifizierung von HPV6a-DNA-Fragmenten durch die Konstruktion degenerierter Oligonukleotid-Primer anhand der Aminosäuresequenz von gereinigtem HPV6a. Ein weiteres Verfahren ist die Isolierung von RNA aus HPV6aproduzierenden Zellen und Translation der RNA in ein Protein über ein in vitro- oder ein in vivo-Translationssystem. Die Translation der RNA in ein Peptid oder ein Protein wird zur Bildung mindestens eines Teils des HPV6a-Proteins führen, welches beispielsweise durch die Aktivität des HPV6a-Proteins oder durch immunologische Reaktivität mit einem Anti-HPV6a-Antikörper identifiziert werden kann. Bei diesem Verfahren können Pools von RNA, die aus HPV6a-produzierenden Zellen isoliert wurden, hinsichtlich der Anwesenheit einer RNA, die für mindestens einen Teil des HPV6a kodiert, analysiert werden. Eine weitere Fraktionierung des RNA-Pools kann erfolgen, um die HPV6a-RNA von Nicht-HPV6a-RNA zu reinigen. Das nach diesem Verfahren hergestellte Peptid oder Protein kann analysiert werden, um Aminosäuresequenzen bereitzustellen, welche wiederum zur Bereitstellung von Primern für die Produktion von HPV6a-cDNA eingesetzt werden, oder die für die Translation eingesetzte RNA kann analysiert werden, um Nukleotidsequenzen, die für HPV6a kodieren, bereitzustellen und Sonden für das Screening einer HPV6a-cDNA-Bank zu ergeben. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, zu finden.
Es ist für Fachleute ersichtlich, daß andere Typen von Banken sowie Banken, die aus anderen Zellen oder Zelltypen erstellt wurden, zur Isolierung von DNA, die für HPV6a kodiert, geeignet sein können. Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken, die von anderen Zellen oder Zellinien stammen, die HPV Typ 6a enthalten, und genomische DNA-Banken.
Die Erstellung von cDNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren erfolgen. Verfahren zur Erstellung von cDNA-Banken sind beispielsweise in Sambrook, J., et al., oben, zu finden. Für Fachleute ist ersichtlich, daß für HPV6a kodierende DNA auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert werden kann. Die Erstellung von genomischen DNA-Banken kann nach im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt werden. Verahren zur Erstellung genomischer DNA-Banken sind in Sambrook, J., et al., oben, zu finden.
Die klonierte HPV6a-DNA oder Fragmente davon, welche mit den hier beschriebenen Verfahren erhalten wurde(n), kann/können durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert werden und in eukaryotische Wirtszellen überführt, um rekombinantes HPV6a zu bilden. Techniken für solche Manipulationen werden vollständig in Sambrook, J. et al., oben, beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initüerung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initüerung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielzahl von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von HPV6a oder von Fragmenten davon in Pilzzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante HPV6a-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen mittels irgendeiner aus einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation. Die Zellen, welche Expiessionsvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie HPV6a-Protein produzieren. Die Identifizierung von HPV6a-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-HPV6a-Antikörpern und die Anwesenheit von wirtszell-assoziierter HPV6a-Aktivität, wie z. B. HPV6a-spezifische Ligandenbindung oder Signalübermittlung, definiert als eine Reaktion, welche durch die Wechselwirkung von HPV6a-spezifischen Liganden mit dem HPV6a vermittelt wird.
Die Expression von HPV-DNA-Fragmenten kann auch mit Hilfe von in vitro produzierter synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder aus HPV6a-produzierenden Zellen isolierte mRNA kann sowohl effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, als auch effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten, wobei die Mikroinjektion in Frosch-Oozyten bevorzugt ist.
Nach der Expression von HPV6a-Proteinen in einer Wirtszelle wird HPV6a-Protein gewonnen, um HPV6a in gereinigter Form bereitzustellen.
Für Fachleute ist ersichtlich, daß die Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper eingesetzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für HPV-Polypeptidfragmente oder naszierende HPV-Polypeptide voller Länge spezifisch sind. Insbesondere ist für Fachleute ersichtlich, daß monospezifische Antikörper hergestellt werden können, welche für die voll funktionsfähigen HPV-Proteine oder Fragmente davon spezifisch sind.
Es werden Verfahren zum Screening hinsichtlich Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV, sowie die Funktionen) von HPV6a-Proteinen) in vivo modulieren, offenbart. Verbindungen, welche diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nicht-proteinhaltige organische Moleküle sein. Die Verbindungen können durch Erhöhung oder Abschwächung der Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV6a, oder der Funktion des HPV6a-Proteins modulieren. Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für HPV6a, oder die Funktion von HPV6a-Protein modulieren, können mit einer Vielfalt von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher "Ja/Nein"-Assay sein, um festzustellen, ob es eine Veränderung in der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann durch Vergleich der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus der Expression oder Funktion in einer Standardprobe quantitativ gemacht werden.
Es können Kits hergestellt werden, welche HPV6a-DNA, Fragmente von HPV6a-DNA, Antikörper gegen HPV6a-DNA oder HPV6a-Protein, HPV6a-RNA oder HPV6a-Protein enthalten. Solche Kits werden zum Nachweis von DNA eingesetzt, welche mit HPV6a-DNA hybridisiert oder zum Nachweis der Anwesenheit von HPV6a-Proteinen) oder Peptidfragmenten in einer Probe. Eine solche Charakterisierung ist für eine Vielzahl von Zwecken von Nutzen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, gerichtsmedizinische Analysen und epidemiologische Studien.
Nukleotidsequenzen, welche zu der für HPV6a kodierenden DNA-Sequenz komplementär sind, können für eine Antisense-Therapie synthetisiert werden. Diese Antisense-Moleküle können DNA, stabile Derivate von DNA, wie z. B. Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA, wie z. B. 2'-O-alkyl-RNA oder andere HPV6a-Antisense-Oligonukleotid-Mimetika sein. HPV6a-Antisense-Moleküle können durch Mikroinjektion, Liposomenverkapselung oder durch Expression von Vektoren, welche die Antisense-Sequenz beherbergen, in Zellen eingeführt werden. Eine HPV6a-Antisense-Therapie kann insbesondere für die Behandlung von Krankheiten geeignet sein, bei denen es von Vorteil ist, die HPV6a-Aktivität zu verringern.
Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, welches zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele solcher Gruppierungen werden in einer Vielfalt von Texten, wie z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
Verbindungen, die nach den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können allein in geeigneten Dosierungen eingesetzt werden, welche durch Routinetests festgelegt wurden, um eine optimale Inhibierung des HPV6a oder dessen Aktivität zu erhalten, während eine etwaige potentielle Toxizität minimiert wird. Darüber hinaus kann eine gemeinsame oder sequenzielle Verabreichung anderer Mittel wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die gesamte Tagesdosis kann in mehreren aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Ferner können Verbindungen für die vorliegende Erfindung über eine Vielfalt von Routen verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, intranasal, transdermal, mittels Zäpfchen, oral und dgl.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem Wirkstoff, wobei die Wirkstoffe in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die Wirkstoffe gleichzeitig verabreicht werden oder sie können jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan unter Anwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird entsprechend einer Vielfalt von Faktoren ausgewählt, welche Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischen Zustand des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, den Verabreichungsweg, die Nieren- und Leberfunktion des Patienten und die speziell eingesetzte Verbindung einschließen. Ein durchschnittlich befähigter Art kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffes, welche zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforder lich ist, feststellen und verschreiben. Eine optimale Präzision bei der Erzielung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan, der auf der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffs für Zielstellen basiert. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die hier detailliert beschriebenen Verbindungen den aktiven Bestandteil bilden und werden typischerweise in Mischung mit geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, Exzipienten oder Trägern verabreicht (hier zusammen als "Träger"-Materialien bezeichnet), die in geeigneter Weise in Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsform, d. h., orale Tabletten, Kapseln, Elixiere, Sirup, Zäpfchen, Gele und dgl., und in Einklang mit herkömmlicher pharmazeutischer Praxis ausgewählt sind.
Beispielsweise kann für die orale Verabreichung in Form einer Tablette oder Kapsel die aktive Wirkstoffkomponente mit einem oralen, nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren inerten Träger, wie z. B. Ethanol, Glycerin, Wasser und dgl., kombiniert werden. Darüber hinaus können erforderlichen- oder gewünschtenfalls geeignete Bindemittel, Gleitmittel, Desintegrationsmittel und Färbemittel ebenfalls in die Mischung eingeschlossen werden. Geeignete Bindemittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Gelatine, natürliche Zucker wie Glucose oder Beta-Lactose, Maissüßstoffe, natürliche und synthetische Gummiarten wie Akaziengummi, Tragant oder Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglycol, Wachse und dgl. Gleitmittel, welche in diesen Dosierungsformen verwendet werden, umfassen, ohne Beschränkung, Natriumoleat, Natriumstearat, Magnesiumstearat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid und dgl. Desintegrationsmittel umfassen, ohne Beschränkung, Stärke, Methylcellulose, Agar, Bentonit, Xanthangummi und dgl.
Für flüssige Formen kann die aktive Wirkstoffkomponente mit in geeigneter Weise aromatisierten Suspendier- oder Dispergiermitteln kombiniert werden, wie z. B. synthetischen und natürlichen Gummiarten, z. B. Tragant, Akaziengummi, Methylcellulose und dgl. Andere Dispergiermittel, welche eingesetzt werden können, umfassen Glycerin und dgl. Für die parenterale Verabreichung sind sterile Suspensionen und Lösungen erwünscht. Isotonische Präparate, welche im allgemeinen geeignete Konservierungsmittel enthalten, werden eingesetzt, wenn eine intravenöse Verabreichung erwünscht ist.
Topische Präparate, welche die aktive Wirkstoffkomponente enthalten, können mit einer Vielfalt von Trägermaterialien gemischt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z. B. Alkohole, Aloe Vera-Gel, Allantoin, Glycerin, Vitamin A- und -E-Öle, Mineralöl, PPG2-Myristylpropionat und dgl., um beispielsweise alkoholische Lösungen, topische Reiniger, Reinigungscremes, Hautgele, Hautlotions und Shampoos in Creme- oder Gel-Formulierungen zu bilden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch in Form von Liposomen-Abgabesystemen verabreicht werden, wie z. B. kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposomen können aus einer Vielfalt von Phospholipiden, wie z. B. Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholinen, gebildet werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern als individuelle Träger, an welche die Verbindungsmoleküle gekoppelt sind, verabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit löslichen Polymeren als zielgerichtete Arzneiwirkstoffträger gekoppelt werden. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartatamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, substituiert mit Palmitoyl-Resten, einschließen. Ferner können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung an eine Klasse von biologisch abbaubaren Polymeren angekoppelt werden, die zur Erreichung einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneiwirkstoffs geeignet sind, wie z. B. Polymilchsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und vernetzte oder amphipathische Block-Copolymere von Hydrogelen.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Herstellung des Hefestamms U9
Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm 2150-2-3 (MATalpha, leu2-04, adel, cir°) wurde von Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA) erhalten. Zellen des Stamms 2150-2-3 wurden über Nacht bei 30°C in 5 ml YEHD-Medium (Carty et al., J. Ind Micro 2 (1987), 117–121) vermehrt. Die Zellen wurden dreimal in sterilem, destilliertem Wasser gewaschen, in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und 0,1 ml Zellsuspension wurde auf jede von sechs 5-Fluorotsäure (FOA)-Platten ausplattiert, um hinsichtlich ura3-Mutanten zu selektionieren (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Die Platten wurden bei 30°C inkubiert. Das Medium enthielt auf 250 ml destilliertes Wasser: 3,5 g Difco-Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,5 g 5-Fluorotsäure, 25 mg Uracil und 10,0 g Dextrose.
Das Medium wurde mittels Filtration durch 0,2-μm-Membranen sterilisiert und dann mit 250 ml 4%igem Bacto-Agar (Difco), gehalten bei 50°C, 10 ml einer 1,2-mg/ml-Lösung von Adenin und 5 ml L-Leucin-Lösung (180 mg/50 ml) gemischt. Das resultierende Medium wurde mit 20 ml pro Petrischale aufgeteilt.
Nach 5 Tagen Inkubation waren zahlreiche Kolonien erschienen. Einzelkolonien wurden isoliert durch erneutes Ausstreichen von Kolonien von den ursprünglichen FOA-Platten auf frische FOA-Platten, welche dann bei 30°C inkubierf wurden. Eine Anzahl Kolonien von dem zweiten Satz von FOA-Platten wurde durch Replica-Plattierung auf sowohl YEHD-Platten als auch Uracil-Minus-Platten hinsichtlich der Anwesenheit der ura3-Mutation getestet. Das gewünschte Ergebnis war gutes Wachstum auf YEHD- und kein Wachstum auf Uracil-Minus-Medium. Ein Isolat (U9) wurde erhalten, welches diese Eigenschaften zeigte. Es wurde als eingefrorene Glycerinstammlösung (Stamm # 325) bei –70°C für die spätere Verwendung gelagert.
BEISPIEL 2
Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-MNN9-Gens
Zur Herstellung eines Vektors für die Unterbrechung des MNN9-Gens war es erforderlich, zuerst das MNN9-Gen aus genomischer S. cerevisiae-DNA zu klonieren. Dies wurde erreicht durch eine Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik. Ein 5'-Sense-Primer und ein 3'-Antisense-Primer für die PCR der für MNN9 kodierenden Vollängen-Sequenz wurden auf Grundlage der veröffentlichten Sequenz für das Hefe-MNN9-Gen konstruiert (Zymogenetics: EP-Patentanmeldung Nr. 88 117 834.7, Veröffentlichungsnummer 0-314-096-A2). Es wurden die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer eingesetzt, welche flankierende HindIII-Stellen (unterstrichen) enthielten:
Das initiierende Methionincodon für das MNN9-Gen ist in Fettdruck hervorgehoben. Die PCR erfolgte unter Verwendung von genomischer DNA aus dem S. cerevisiae-Stamm JRY188 (Rine et al.) als Matrize, Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 25 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 37°C, 2 Min., 72°C, 3 Min.). Das resultierende 1,2-kbp-PCR-Fragment wurde mit HindIII verdaut, gelgereinigt und mit HindIII-verdautem, mit alkalischer Phosphatase behandeltem pUC13 (Pharmacia) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als p1183 bezeichnet.
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens mit dem Hefe-URA3-Gen wurde das Plasmid pBR322-URA3 (welches das 1,1-kbp-HindIII-Fragment, kodierend für das S. cerevisiae-URA3-Gen, subkloniert in die HindIII-Stelle von pBR322 enthält) mit HindIII verdaut und das 1,1-kbp-DNA-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit dem Pmll-verdauten Plasmid p1183 (Pmll spaltet innerhalb der für MNN9 kodierenden Sequenz) ligiert. Das resultierende Plasmid p1199 enthält eine Unterbrechung des MNN9-Gens durch das funktionelle URA3-Gen.
BEISPIEL 3
Konstruktion des U9-Derivat-Stammes 1372 welcher eine Unterbrechung des MNN9-Gens enthält
Zur Unterbrechung des MNN9-Gens in dem Stamm U9 (# 325) wurden 30 μg des Plasmids p1199 mit HindIII verdaut, um eine lineare mnn9 :: URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen. Zellen des Stamms 325 wurden mit der HindIII-verdauten p1199-DNA nach dem Sphäroplasten-Verfahren (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933) transformiert und Transformanten wurden auf einem synthetischen Agarmedium, dem Uracil fehlte und das 1,0 M Sorbit enthielt, selektioniert. Das synthetische Medium enthielt pro Liter destilliertes Wasser: Agar, 20 g, Hefe-Stickstoffbase w/o Aminosäuren, 6,7 g, Adenin, 0,04 g, L-Tyrosin, 0,05 g, Sorbit, 182 g, Glucose, 20 g, und Leucin-Minus-Lösung #2,10 ml. Leucin-Minus-Lösung #2 enthält pro Liter destilliertes Wasser: L-Arginin, 2 g, L-Histidin, 1 g, L-Leucin, 6 g, L-Isoleucin, 6 g, L-Lysin, 4 g, L-Methionin, 1 g, L-Phenylalanin, 6 g, L-Threonin, 6 g, L-Tryptophan, 4 g.
Die Platten wurden bei 30°C fünf Tage lang inkubiert, zu welchem Zeitpunkt zahlreiche Kolonien erschienen waren. Chromosomale DNA-Präparationen wurden von 10 Kolonien hergestellt und dann mit EcoRl plus Hindill verdaut. Die DNA-Verdauungen wurden dann mittels Southernblots (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboraton Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboraton Press, 1989) unter Verwendung des 1,2-kbp-HindIII-Fragments, welches das MNN9-Gen (isoliert aus dem Plasmid p1199) trägt, als Sonde beurteilt. Ein Isolat wurde identifiziert (Stamm # 1372), welches die erwarteten DNA-Bartden-Verschiebungen auf dem Southernblot sowie die extreme Klumpigkeit zeigte, die typischerweise von mnn9-Mutanten gezeigt wird.
BEISPIEL 4
Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-HIS3-Gens
Zur Konstruktion einer Unterbrechungskassette, bei der das S. cerevisiae-HIS3-Gen durch das URA3-Gen unterbrochen wird, wurde das Plasmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 1035) mit BamHl verdaut und das 1,7-kbp-BamHl-Fragment, welches das HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit pUC18 ligiert, welches zuvor mit BamHl verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid (als p1501 oder pUC18-HIS3 bezeichnet) wurde mit Nhel verdaut (welches innerhalb der für HIS3 kodierenden Sequenz spaltet) und das Vektorfragment wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und dann mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelt. Das URA3-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322-URA3 durch Verdauung mit HindIII isoliert und das 1,1-kbp-Fragment, welches das URA3-Gen trug, wurde gelgereinigt, mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem obigen pUC18-HIS3-Nhel-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-his3 :: URA3 oder p1505 bezeichnet) enthält eine Unterbrechungskassette, bei der das Hefe-HIS3-Gen durch das funktionelle URA3-Gen unterbrochen ist.
BEISPIEL 5
Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-PR81-Gens durch das HIS3-Gen
Das Plasmid FP8ΔH, welches das S. cerevisiae-PR81-Gen trägt, wurde von Dr. E. Jones von der Carnegie-Mellon University (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115: 255–263) zur Verfügung gestellt. Es wurde mit HindIII plus Xhol verdaut und das 3,2-kbp-DNA-Fragment, welches das PR81-Gen trug, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18 wurde mit BamHl verdaut, gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das resultierende Vektorfragment wurde mit dem obigen PR81-Gen-Fragment ligiert, um das Plasmid pUC18-PRB1 zu ergeben. Das Plasmid YEp6, welches das HIS3-Gen enthält, wurde mit BamHl verdaut. Das resultierende 1,7-kbp-BamHl-Fragment, welches das funktionelle HIS3-Gen trägt, wurde gelgereinigt und dann durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Das Plasmid pUC18-PRB1 wurde mit EcoRV plus Ncol verdaut, welches innerhalb der für PR81 kodierenden Sequenz spaltet und die aktive Stelle der Protease B und flankierende Sequenz entfernt. Das 5,7-kbp-EcoRV-Ncol-Fragment, welches die restlichen 5'- und 3'-Abschnitte der für PR81 kodierenden Sequenz in pUC18 trägt, wurde gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase dephosphoryliert und mit dem oben beschriebenen glattendigen HIS3-Fragment ligiert. Das resultierende Plasmid (als pUC18-prbl :: HIS3 bezeichnet, Stamm # 1245) enthält das funktionelle HIS3-Gen anstelle des PRB1-Gen-Abschnitts, welcher oben deletiert worden war.
BEISPIEL 6
Konstruktion eines U9-verwandten Hefestammes der Unterbrechungen sowohl des MNN9-als auch des PRB1-Gens enthält
Der U9-verwandte Stamm 1372, welcher eine MNN9-Gen-Unterbrechung enthält, wurde in Beispiel 3 beschrieben. Klonale Isolate des Stammes 1372 wurden einer Passage auf FOA-Platten (wie in Beispiel 1 beschrieben) unterworfen, um ura3-Mutanten zu selektionieren. Eine Anzahl von ura3-Isolaten des Stammes 1372 wurde erhalten und ein spezielles Isolat (Stamm 12930-190-S1-1) wurde für die nachfolgende Unterbrechung des HIS3-Gens ausgewählt. Der pUC18-his3 :: URA3-Genunterbrechungsvektor (p1505) wurde mit Xbal plus EcoRl verdaut, um eine lineare his3 :: URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-190-S1-1 nach dem Lithiumacetatverfahren (Methods in Enzymology, 194 : 290 (1991)) verwendet. Ura⁺-Transformanten wurden auf synthetischem Agarmedium ohne Uracil selektioniert, für klonale Isolate auf demselben Medium erneut ausgestrichen und dann auf Medium, dem entweder Uracil oder Histidin fehlte, replikaplattiert, um hinsichtlich derjenigen Isolate zu screenen, welche sowohl Ura⁺ als auch His waren. Ein Isolat (Stamm 12930-230-1) wurde für die anschließende Unterbrechung des PRB1-Gens ausgewählt. Der PR81-Genunterbrechungsvektor (pUC18-prb1 :: HIS3, Stamm # 1245) wurde mit Sacl plus Xbal verdaut, um eine lineare prb1 :: HIS3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und zur Transformation des Stammes 12930-230-1 nach dem Lithiumacetat-Verfahren eingesetzt. His-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Histidin selektioniert und auf demselben Medium für klonale Isolate erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe der resultierenden His⁺-Isolate präpariert, mit EcoRl verdaut und dann auf 0,8%igen Agarosegelen elektrophoresiert. Southernblot-Analysen erfolgten dann mit Hilfe einer radioaktiv markierten 617-bp-Sonde für das PR81-Gen, welche mittels PCR mit Hilfe der folgenden Oligodesoxynukleotid-Primen hergestellt worden war:
Es wurden 11 Isolate erhalten, welche die erwartete Hybridisierung der Sonde mit einem prb1 :: HIS3-DNA-Fragment von 2,44 kbp zeigten. Dies stand im Gegensatz zur Hybridisierung der Sonde mit dem 1,59-kbp-Fragment für das Wildtyp-PRB1-Gen. Eines der Isolate, enthaltend die gewünschte prbl :: HIS3-Unterbrechung, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt und als Stamm # 1558 bezeichnet.
BEISPIEL 7
Konstruktion eines Vektors für die Unterbrechung des Hefe-PEP4-Gens
Das S. cerevisiae-PEP4-Gen wurde aus einer genomischen Hefe-Bank auf folgende Weise kloniert. E. coli-Zellen, welche die genomische Hefebank pLS101 enthielten (Schultz und Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155: 8–14), wurden über Nacht in 5 ml LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, vermehrt. Aus dieser Kultur wurden 10^–4 – und 10^– ⁵-Verdünnungen auf LB+Ampicillin-Platten ausplattiert. Kolonie-Plattenübertragungen wurden mit Hilfe von Nitrocellulosefiltern durchgeführt. Eine 600-pb-Sonde für das Hefe-PEP4-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase, Gesamt-Plasmid-DNA aus der pLS101-Hefebank und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern präpariert, die auf Grundlage der veröffentlichten DNA-Sequenz für PEP4 (C. A. Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2500 (1986)) konstruiert worden waren.
Die PCR wurde mit 25 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 37°C, 2 Min., 72°C, 3 Min.) durchgeführt. Die PCR-Sonde wurde gelgereinigt, radioaktiv markiert und mit den obigen Koloniefiltern hybridisiert. Mehrere Kolonien waren positiv hinsichtlich einer Hybridisierung mit der PEP4-Sonde und wurden erneut auf LB+Ampicillin-Platten für Einzelkolonien ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde durch die alkalische SDS-Lyse (Sambrook et al., oben) aus mehreren der Isolate präpariert und mit BamHl verdaut. Die erwartete 14-kbp-Vektorbande und 6,9-kbp-PEP4-Insertbande wurden beobachtet. Nach Doppelverdauung mit EcoRl plus Xhol wurde die erwartete 1,5-kbp-Bande für PEP4 beobachtet. Ein Isolat (E. coli-Stamm # 860), welches die erwarteten Ergebnisse zeigte, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Plasmid-DNA aus dem Stamm # 860 wurde mit BamHl verdaut und das 6,9-kbp-BamHI-DNA-Fragment, welches das chromosomale PEP4-Gen trägt, wurde in die BamHl-Stelle von pUC13 subkloniert, um das Plasmid p890 zu ergeben. Das Plasmid p890 wurde dann mit Ncol (welches innerhalb der für PEP4 kodierenden Sequenz spaltet) verdaut, gelgereinigt, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht und mit dem glattendigen 1,1-kbp-Fragment, welches das funktionelle URA3-Gen trägt (hergestellt wie in Beispiel 2), ligiert. Das resultierende Plasmid, welches das PEP4-Gen unterbrochen von dem URA3-Gen enthält, wurde als pUC13-pep4 :: URA3 (Stamm # 906) bezeichnet.
BEISPIEL 8
Konstruktion der Hefestämme # 1569, # 1538 und # 1592, welche Derivate des Stammes U9 sind, die sowohl prb1- als auch pep4-Mutationen enthalten
Zur Unterbrechung des HIS3-Gens in dem Stamm U9 wurde der Unterbrechungsvektor pUC18-his3 :: URA3 mit EcoRl plus Xbal verdaut und dann zur Transformation des Stammes U9 nach dem Lithiumacetat-Verfahren verwendet. Ura+-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Uracil selektioniert und auf demselben Medium für klonale Isolate erneut ausgestrichen. Eine Reihe der resultierenden Ura⁺-Isolate wurde dann auf Agarmedium, dem entweder Uracil oder Histidin fehlte, replika-plattiert und hinsichtlich derjenigen gescreent, welche sowohl Ura⁺ als auch His waren. Ein Isolat (Stamm # 1524) wurde für die anschliessende Unterbrechung des PR81-Gens ausgewählt. Der PR81-Genunterbrechungsvektor pUC18-prb1 :: HIS3 wurde mit Sacl plus Xbal verdaut und dann zur Transformation des Stammes # 1524 nach dem Lithiumacetat-Verfahren verwendet. His⁺-Transformanten wurden auf Agarmedium ohne Histidin selektioniert und für klonale Isolate auf demselben Medium erneut ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Reihe der His+-Isolate präpariert und mittels Southernblot-Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten PRB1-Sonde beurteilt. Eines der Isolate (Stamm # 1537), welches die gewünschte Unterbrechung des PRB1-Gens durch HIS3 zeigte (d. h., prbl :: HIS3), wurde für die anschließende Unterbrechung des PEP4-Gens ausgewählt. Der Stamm # 1537 wurde einer Passage auf FOA-Platten unterworfen, um ura3-Isolate zu erhalten, und ein Isolat (Stamm # 1541) wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
Zur Unterbrechung des PEP4-Gens in dem Stamm # 1541 wurde der PEP4-Genunterbrechungsvektor pUC13-pep4 :: URA3 mit Xhol verdaut, um eine lineare pep4 :: URA3-Unterbrechungskassette zu schaffen, und für die Transformation des Stammes # 1541 nach dem Lithiumacetat-Verfahren eingesetzt. Ura+-Transformanten werden auf Uracil-Minus-Agarmedium selektioniert und für klonale Isolate auf demselben Medium ausgestrichen. Genomische DNA wurde aus einer Anzahl der Ura+-Transformanten präpariert und mittels Southernblots unter Verwendung einer radioaktiv markierten Sonde für das PEP4-Gen beurteilt. Ein Isolat (Stamm # 1569), welches die gewünschte Unterbrechung des PEP4-Gens durch das URA3-Gen zeigte, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. In einem unabhängigen Experiment, bei dem praktisch dieselbe Schrittfolge eingehalten wurde, wurde der Stamm # 1538 konstruiert. Der Stamm # 1538 ist ein Derivat des Stammes U9. Der Stamm # 1538 enthält sowohl prb1- als auch pep4-Mutationen. Darüber hinaus wurde ein ura3-Derivat des Stammes # 1569 durch Passage auf FOA-Platten erhalten. Das resultierende ura3-Derivat des Stammes # 1569 wurde als Stamm # 1592 bezeichnet.
BEISPIEL 9
Extraktion von Nukleinsäure aus einer Biopsie
Eine große Condyloma-acuminatum-Läsion der Vulva wurde von einer 25 Jahre alten Patientin nach der Geburt erhalten. Ein Fragment der Läsion wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann mit einem Braun-Mikrodismembrator II (B. Braun Instruments, Melsungen, Deutschland) aufgearbeitet. Das resultierende Material wurde mit 0,6%igem (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) solubilisiert, mit Proteinase K (50 μg/ml) behandelt und mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. DNA wurde ethanolgefällt und mittels UV-Spektrophotometrie quantitativ bestimmt. Die Anwesenheit von DNA mit hohem Molekular gewicht wurde durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Anfärbung mit Ethidiumbromid, festgestellt.
BEISPIEL 10
Typenbestimmung von HPV-DNA
Der HPV-DNA-Typ wurde mit Hilfe des Hybrid-Capture-Assays, der als Vira Type Plus vertrieben wird (Digene Diagnostics, Beltsville, MD), bestimmt. Die verwendeten HPV-Sonden wurden in zwei Pools aufgeteilt, deren Zusammensetzung auf der Assoziation eines jeden Typs mit malignen Tumoren des Genitaltrakts basiert. Sondengruppe A enthielt die "Niedrigrisiko"-Typen HPV6, 11, 42, 43 und 44, während die Sonde B die "Hochrisiko"-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 und 56 enthielt. Gesamt-DNA wurde mit Pstl, BamHl und HindIII verdaut und Southernblots wurden unter Bedingungen hoher Stringenz (T_m– 15°C) durchgeführt, um den HPV-Subtyp zu bestimmen.
BEISPIEL 11
Klonierung des HPV6a-Genoms
Gesamt-DNA, extrahiert aus der HPV6a-positiven Biopsieprobe, wurde mit HindIII-Endonuklease verdaut. Nach Größenfraktionierung durch ein präparatives 0,8%iges Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur wurde eine Region, die DNA von ~8 kbp entsprach, aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose wurde mit Gelase^TM-Enzym verdaut (Epicentre Technologies, Inc., Madison, WI). Die Probe wurde mit pUC18 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) ligiert, welches mit HindIII verdaut und dephosphoryliert worden war. Nach der Transformation von kompetenten E. coli-DHS-Zellen (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD) wurde die Plasmid-Bank hinsichtlich HPV6a-positiver Klone durch Koloniehybridisierung gescreent unter Verwendung eines ³²P-markierten Antisense-Oligodesoxynukleotids, welches komplementär zu dem 3'-Ende des HPV6b-L1-Gens war (5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'). Ein pUC18-Plasmid, welches das 8,1-kbp-HPV6a-Genom enthielt, wurde isoliert und durch Restriktionsenzym- und Southernblot-Analysen charakterisiert. Dieses Plasmid wurde als pUC18-HPV6a bezeichnet. Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des Qiagen^TM Plasmid Maxi-Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) hergestellt.
BEISPIEL 12
Sequenzanalyse von pUC18-HPV6a
Zur Bestimmung der vollständigen HPV6a-Sequenz wurden Sequenzierungsprimer auf Grundlage der veröffentlichten HPV6b-Sequenz synthetisiert. Beide Stränge des vollständigen 8,1-kbp-HPV6a-Genoms wurden mit dem Didesoxykettenabbruchverfahren unter Ver- wendung des PRISM^TM-Kits und eines automatischen Sequenzierers (# 373A) von Applied Biosystems (ABI) nach den Anweisungen des Herstellers (ABI, Inc., Foster City, CA) sequenziert. In Fällen, in denen die Sense- und Antisense-Sequenz nicht übereinstimmten, wurden zusätzliche HPV6a-spezifische Primer synthetisiert, um in beiden Richtungen erneut über das fragliche Gebiet zu sequenzieren, um einen Konsensus zu erhalten.
Die DNA-Sequenzen von HPV6a und HPV6b zeigten über 97% Identität mit insgesamt 229 bp Abweichungen, die unter 8010 bp identifiziert wurden. Die signifikantesten Unterschiede im Vergleich zu der HPV6b-Sequenz wurden in der langen Kontrollregion (LCR; Nt. 7205-Nt. 106) gefunden. Abgesehen von mehreren Einzelnukleotid (Nt.)-Änderungen in der HPV6a-LCR wurde eine 94-bp-Insertion bei Nt. 7350 und eine weitere 19-bp-Insertion bei Nt. 7804 gefunden. Bei Nt. 7615 waren sechs Basenpaare aus dem HPV6a-Genom deletiert.
BEISPIEL 13
Konstruktion eines HPV6a-L1-Hefe-Expressionsvektors
HPV-Typ 6a-DNA wurde als Matrize für eine PCR eingesetzt. Das HPV6a-L1-Gen wurde durch PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 35 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 Sek.) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern, welche flankierende Bglll-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV6a-L1-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,5-kbp-L1-PCR-Produkt wurde mit Bglll verdaut und gelgereinigt. Der pGAL10-Expressionsvektor wurde konstruiert durch Isolierung eines 1,4-kbp-Sphl-Fragments aus einem bidirektionalen GAL-Promotor-Vektor, pUC18-GAL1p-GAL10p, welcher den divergenten GAL1/GAL10-Promotor aus dem Plasmid pBM272 enthält (zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Johnston, Washington University, St. Louis), flankiert auf jeder Seite von einer Kopie des Hefe-ADH1-Transkriptionsterminators [Bennetzen, J. L., und Hall, B. D. (1982), J. Biol. Chem. 257 : 3018-3025], Klonierung einer zwischen dem GAL1-Promotor und der ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen BamHI-Stelle und einer zwischen dem divergenten GAL10-Promoter und der zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators gelegenen Smal-Klonierungsstelle. Ein Hefe-Shuttle-Vektor, bestehend aus pBR322, dem Hefe-LEU2- d-Gen und dem Hefe-2 μ-Plasmid, wurde mit Sphl gespalten und mit dem 1,4-kbp-Sphl-GAL-Promotor-Fragment ligiert. Der resultierende Vektor, pGAL10, wurde mit BamHI linearisiert, welches zwischen dem GAL1-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Der BamHl-verdaute pGAL10-Vektor und das Bglll-verdaute HPV6a-L1-PCR-Fragment wurden ligiert und zur Transformation von E. coli-DH5-Zellen (BRL) eingesetzt. Es wurde ein pC1/1-GAL-Plasmid isoliert, welches das HPV6a-L1-Gen enthält und als p13173-357-6 bezeichnet wurde. Das L1-Gen in p13173-357-6 wurde sequenziert (ABI-Sequenzierer # 373A) und befunden, mit dem L1-Gen in dem pUC18-HPV6a-Klon identisch zu sein.
BEISPIEL 14
Konstruktion des HPV6a-L1- und -L2-Hefe-Expressionsvektors
Das Plasmid p13173-357-6 (pGAL10 + HPV6a-L1) wurde mit Smal verdaut, welches zwischen dem GAL10-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Das 1,4-kbp-HPV6a-L2-Gen wurde amplifiziert mittels PCR unter Verwendung der pUC18-HPV6a-DNA als Matrize, Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 Zyklen PCR-Amplifizierung (94°C, 1 Min., 48°C, 1 Min., 72°C, 1 Min. 45 Sek.) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern, welche flankierende Smal-Stellen (unterstrichen) enthalten:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV6a-L2-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das PCR-Fragment wurde mit Smal verdaut, gelgereinigt und mit dem Smal-verdauten Plasmid p13173-357-6 ligiert. Ein pGAL10-Plasmid, enthaltend sowohl das HPV6a-L1- als auch das -L2-Gen, wurde isoliert und als p14049-7-2 bezeichnet. Das L2-Gen wurde sequenziert (ABI-Sequenzierer # 373A) und befunden, mit dem L2-Gen in dem pUC18-HPV6a-Klon identisch zu sein.
BEISPIEL 15
Expression von HPV6a-L1 und Coexpression von HPV6a-L1 und -L2 in Hefe
Die Plasmide p13173-357-6 (pGAL10 + HPV6a-L1) und p14049-7-2 (pGAL10 + HPV6a-L1 und -L2) wurden zur Transformation der S. cerevisiae-Stämme # 1569 (MATα, leu2-04, prb1, ade1, pep4, cir°) und # 1558 (MATα, leu2-04, prb1, mnn9, ade1, cir°) verwendet. Die unter Verwendung des Wirtsstammes # 1558 erhaltenen resultierenden rekombinanten Stämme waren die Stämme # 1644 (HPV6a-L1) und # 1670 (HPV6a-L1+L2) wie in der Tabelle gezeigt. Klonale Isolate wurden bei 30°C in YEHD-Medium, enthaltend 2% Galactose, für 68–78 Stunden gezüchtet. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen und die Zellysate hinsichtlich Expression von HPV6a-L1- oder HPV6a-L2-Protein durch Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die 40 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden auf 10%igen Tris-Glycin-Gelen unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen elektrophoresiert und auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Das L1-Protein wurde mit Hilfe von Kaninchen-Antiseren, die gegen ein trpE-HPV11-Fusionsprotein induziert worden waren (Brown, D. R., et al., Virology 201: 46–4), als primärer Antikörper und an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelten ganzen Antikaninchen-Esel-IgG-Antikörper (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper immunologisch nachgewiesen. Die Filter wurden mit dem chemolumineszierenden ECL^TM-Detection Kit (Amersham, Inc.) aufgearbeitet. Eine L1-Protein-Bande von 50-55-kD wurde in allen Proben nachgewiesen mit Ausnahme der negativen Kontrolle (Vektorkontrolle ohne L1- oder L2-Gen).
Das L2-Protein wurde als 70-kD-Proteinbande durch Westernanalyse unter Verwendung von 1 : 250 verdünnten Seren aus Mäusen, welche dreimal mit einem trpE-HPV6a-L2-Fusionsprotein, hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Carter et al., immunisiert worden waren, als primärer Antikörper und HRP-gekoppeltem Antimaus-Schaf-IgG (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper (1 : 1000-Verdünnung) nachgewiesen.
Für die EM-Analyse (Structure Probe, West Chester, PA) wurde ein Aliquot einer jeden Probe auf kohlenstoffbeschichtete 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphonnrolframsäure (PTA), pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Die Gitter wurden vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wurde mit Hilfe eines JEOL 1000X-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen besaßen eine 100.000fache Endvergrößerung.
VLP wurden im Größenbereich von 50–55 nm Durchmesser bei allen Hefeproben beobachtet, welche entweder die HPV6a-L1- oder HPV6a-L1- und -L2-Coexpressionsplasmide beherbergten. Keine VLP wurden bei Hefe-Kontrollproben beobachtet.
BEISPIEL 16
Fermentierung von HPV6a-L1 + L2 Stamm # 1670)
Das Oberflächenwachstum einer Plattenkultur des Stammes 1670 wurde steril auf ein leucin-freies flüssiges Medium überführt, das (pro Liter) enthielt: 8,5 g Difco-Hefe-Stickstoff- Base ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 0,2 g Adenin, 0,2 g Uracil, 10 g Bernsteinsäure, 5 g Ammoniumsulfat und 0,25 g L-Tyrosin; dieses Medium wurde vor der Sterilisation mit NaOH auf pH 5,0–5,3 eingestellt. Nach Wachstum für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler wurden eingefrorene Kulturgefäße vorbereitet durch Zugabe von sterilem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 17% (Gew.Nol.) vor der Lagerung bei –70°C (1 ml pro Kryogefäß). Das Impfgut für die Fermentation des Stammes 1670 wurde im gleichen Medium (500 ml pro 2-l-Kolben) entwickelt und gestartet durch Überführung der aufgetauten Inhalte von zwei eingefrorenen Kulturgefäßen in die 2-l-Kolben und Inkubation für 25 h bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler. Bei der Fermentation des Stammes 1670 wurde ein New Brunswick SF-116-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 10 l nach der Animpfung verwendet. Das verwendete Produktionsmedium enthielt (pro l): 20 g Difco-Hefeextrakt, 10 g Sheffield-HySoy-Pepton, 20 g Glucose, 20 g Galactose; das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Der gesamte Inhalt (500 ml) des 2-l-Impfkolbens wurde in den Fermenter überführt, welcher bei 28°C, 5 l Luft pro Minute, 400 UpM, 3,5 psi Druck inkubiert wurde. Die mechanische Bewegung wurde erforderlichenfalls erhöht, um Niveaus an gelöstem Sauerstoff von mehr als 40% Sättigung aufrechtzuerhalten. Der Fortschritt der Fermentation wurde durch Oftline-Glucose-Messungen (Beckman Glucose 2 Analysator) und Online-Massenspektroskopie (Perkin-Elmer 1200) überwacht. Nach 69 h Inkubation wurde eine Zelldichte von 9,9 g Trockenzellgewicht pro Liter erreicht. Die Kultur wurde durch Hohlfaserfiltration (Amicon H5MP01-43-Kartusche in einem Amicon DC-10-Filtrationssystem) auf etwa 2 l konzentriert, mit 2 l phosphatgepufferter Salzlösung diafiltriert und vor dem Abfüllen in 500-ml-Zentrifugenflaschen weiter konzentriert (auf etwa 1 ). Zellpellets wurden durch Zentrifugation bei 8000 UpM (Sorvall GS3-Rotor) für 20 Minuten bei 4°C gewonnen. Nach Dekantierung des Überstands wurden die Pellets (insgesamt 225 g nasse Zellen) bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
BEISPIEL 17 (Referenz)
Reiniqunq von rekombinanten HPV6a-L1- + -L2-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen des Stammes # 1670 wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 38,0 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 50 ml "L1-Puffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 8000 psi durch drei Passagen in einem M110 Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellaufschlämmung wurde mit 5000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zelttrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, L1- + L2-Antigen enthaltend, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde 1 : 5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf eine Anionenaustausch-Einfangsäule (5,0 cm ID × 4,0 cm) von Fractogel^®-EMD-TMAE-650 (S)-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibriert in Puffer A, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem Gradienten von 0–1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Es wurde ein Immunodot-Blotting durchgeführt, um zu festzustellen, welche Fraktionen von der Säule L1-Protein enthielten.
L1-Protein-enthaltende Fraktionen, wie durch Immunodot-Blot bestimmt, wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren, gefolgt von SDS-PAGE unter Einsatz von Silberfärbung und Western-Blotting, unterworfen.
TMAE-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert. Die Lösung wurde auf 63% gesättigtes Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugegeben wurde. Die Probe wurde auf Eis gestellt und die Präzipitation 30 Min. lang fortschreiten gelassen. Die Probe wurde mit 12.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) resuspendiert.
Das resuspendierte Pellet wurde auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm) von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert. Der Laufpuffer war PBS. Die Chromatographie wurde bei 20–23°C durchgeführt. Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE unter Einsatz von Silberfärbung und Westernblot-Nachweis analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Der resultierende Pool wurde konzentriert.
Das Endprodukt wurde durch SDS-PAGE unter Einsatz von kolloidaler Coomassiefärbung analysiert. Die L1- und L2-Proteine wurden als 85% homogen abgeschätzt. Die Identität der L1- und L2-Proteine wurde durch Westernblots unter Vennrendung der geeigneten Antiseren bestätigt. Das Endprodukt wurde in Aliquots aufgeteilt und bei –70°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 3,0 mg Protein.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wurde mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen 2%iger Phosphorwolframsäure, pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wurde vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wurde mit Hilfe eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen hatten eine 100.000fache Endvergrößerung. Die Anwesenheit virusähnlicher Partikel im Größenbereich von 50–55 nm wurde bestätigt.
BEISPIEL 18
Konstruktion eines CRPV-L1-Expressionsvektors
Das CRPV-L1-Gen wurde aus dem Plasmid pLAII, welches das vollständige CPR-Virusgenom enthält (Dr. Peter Howley, NCl), mittels PCR unter Einsatz von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.) amplifiziert; es wurden 35 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min.; 50°C, 1 Min.; 72°C, 2 Min.) eingesetzt und die folgenden Oligonukleotid-Primer, welche flankierende Bglll-Stellen (unterstrichen) enthalten:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des CRPV-L1-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,6-kb-L1-PCR-Produkt wurde mit Bglll verdaut, gelgereinigt und in die Bglll-Stelle des Vektors pSP72 (Promega) subkloniert, um das Plasmid pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1) zu ergeben.
Ein Subklon wurde vollständig sequenziert und befunden, sich in vier Nukleotiden von der veröffentlichten CRPV-L1-Sequenz zu unterscheiden. Die Abweichungen führen zu keinen Aminosäureaustauschen. Das L1-Gen wurde aus pSP72-CRPV-L1 als Bglll-Fragment ausgeschnitten und in die nur einmal vorkommende BamHl-Stelle subkloniert, die sich zwischen dem Hefe-GAL10-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator in einem Hefe-Expressionsvektor befindet, welcher den GAL10-Promotor aus YEp52 (Broach et al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83 : 81–116) und ADH1-Transkriptionsterminator im selben Vektorgerüst enthält. Das resultierende Plasmid wurde als p12930-323-6-1 bezeichnet.
BEISPIEL 19
Konstruktion eines CRPV-L2-Expressionsvektors
Das CRPV-L2-Gen wurde aus dem Plasmid pLAII nach Verdauung des Plasmids mit Sall, Gelreinigung des 7,9-kb-Fragments und dessen Selbstligierung mittels PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.) amplifiziert. Es wurden 35 Amplifizierungszyklen (90°C, 1 Min.; 50°C, 1 Min.; 72°C, 2 Min.) eingesetzt und Oligonukleotid-Primer, welche flankierende EcoRl-Stellen (unterstrichen) enthalten:
Der Sense-Primen führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des CRPV-L2-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,5-kb-PCR-Produkt wurde mit EcoRl verdaut, gelgereinigt und in die EcoRl-Stelle des bidirektionalen Promotor-Vektors pUC18-GAL1 p-GAL10p, enthaltend den divergenten Hefe-GAL1/GAL10-Promotor, subkloniert. Dieser Vektor enthält eine nur einmal vorkommende BamHl-Stelle zwischen dem GAL1-Promotor und einer ersten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators, nur einmal vorkommende EcoRl- und Smal-Stellen, die sich zwischen dem GAL10-Promotor und einer zweiten Kopie des ADH1-Transkriptionsterminators befinden. Die resultierende Expressionskassette wird von einem 1,4-kb-Sphl-Fragment getragen. Ein Klon (p12930-295-2-2), enthaltend das gewünschte L2-Insert neben dem GAL10-Promotor, wurde vollständig sequenziert und von ihm gezeigt, daß er 6 Nukleotidabweichungen von der veröffentlichten Sequenz enthält, wovon 4 zu Aminosäureaustauschen führen. Eine Sequenzanalyse der ursprünglichen Matrizen-DNA bestätigte, daß die Abweichungen auch in pLAII vorlagen und nicht durch die PCR eingeführt wurden. Der pUC18-GAL1 p-GAL10p-Vektor, enthaltend das L2-Gen, wurde mit Sphl gespalten und das 2,9-kb-Fragment, welches die ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t-Expressionskassette beherbergt, wurde mit dem großen Sph1-Fragment des Hefe-Shuttle-Vektors ligiert. Das resultierende Plasmid wurde als p12930-323-2-3 bezeichnet.
BEISPIEL 20
Expression von CRPV-L1- und -L2-Kapsidproteinen in Hefe
Die Plasmide p12930-323-6-1 und p12930-323-2-3 wurden zur Transformation der S. cerevisiae-Stämme # 1569, # 1538, BJ5462 (E. W. Jones, Methods in EnzymoloQV 194 (1991), 428–453] und BJ1995 (Jones, ebendort] eingesetzt. Klonale Isolate wurden bei 30°C in YEHD-Medium mit 2% Galactose für 48–72 h gezüchtet. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen, Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben und die resultierenden Zellysate hinsichtlich der Expression von CRPV-L1 und -L2 durch Immunoblot-Analysen beurteilt. Proben, die 40 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden auf 12%igen Tris-Glycin-Gelen (Novex) unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen einer Elektrophorese unterworfen und auf PVDF-Membranen (Novex) elektrogeblottet. CRPV-L1- und -L2-Proteine wurden mit Hilfe polyklonaler Anti-L1- oder -Anti-L2-Kaninchen-Antiseren (Gabe von Dr. John Kreiden, Hershey Medical Center) als primäre Antikörper und Protein A, gekoppelt an Meerrettichperoxidase, (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper nachgewiesen. Die Membranen wurden mit Hilfe des chemolumineszierenden ECL^TM Detection Kit (Amersham, Inc.) aufgearbeitet. Eine L1-Proteinbande von 55–61 kD wurde in allen Proben nachgewiesen, welche das L1-Expressionsplasmid beherbergten, und eine L2-Proteinbande von ~90 kD wurde in allen Proben aus Hefeklonen nachgewiesen, welche das L2-Expressionsplasmid beherbergten.
Kein Signal wurde mit Anti-L2-Antiseren in Proben nachgewiesen, welche von Hefeklonen stammten, die das L1-Expressionsplasmid beherbergten, oder umgekehrt (6).
Auf Grundlage dieser Expressionsergebnisse wurden die folgenden rekombinanten Hefestämme für weitere Studien ausgewählt: Stamm # 1582, welcher der Wirtsstamm # 1569 ist, der das Plasmid p12930-323-6-1 enthält, und Stamm # 1583, welcher der Wirtsstamm # 1538 ist, der das Plasmid p12930-323-2-3 enthält.
BEISPIEL 21 (Referenz)
A. Reinigung von rekombinantem CRPV-L1-Kapsidprotein
Zellen des Stammes # 1582, bei –70°C gelagert, wurden aufgetaut und in einem gleichen Volumen an Aufbruchpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) suspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden der Aufschlämmung bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellen wurden mittels 10 Passagen in einem Microfluidizer lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt. Der Überstand wurde über ein 5-cm-Kissen von 45%iger Sucrose (Gew./Vol.) in L1-Puffer geschichtet und L1 wurde durch Zentrifugation mit 100.000 × g für 4 h pelletiert. Das Pellet wurde in 1/10 Volumen L1-Puffer resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt. Tween-80 wurde dem Überstand bis zu einer Endkonzentration von 0,01% zugegeben und der Überstand wurde bei Raumtemperatur durch Größenausschlußchromatographie auf einer 1700-ml-Säule (5 cm ID) von Sephacryl S-1000-Harz (Pharmacia) fraktioniert. Der Laufpuffer für diese Säule war 10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01% Tween-80. Fraktionen, die gemäß Immunodot-Blot-Assay immunreaktives Material enthielten, wurden gepoolt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle mit einer YM-100-Flachfolienmembran (100.000 Molekulargewichtsausschluß) von 76 mm Durchmesser auf 1/6 Volumen konzentriert. Das Produkt wurde durch eine Millex-GV-Membran von 0,22 μm (Millipore) steril filtriert.
B. Charakterisierung von rekombinantem CRPV-L1-Kapsidprotein
Die Identität des Endprodukts wurde durch Westernblots und durch N-terminale Sequenzanalyse bestätigt. Die Reinheit wurde mittels SDS/PAGE mit Coomassie- und Silberfärbung und durch Lösungssiebkapillarelektrophorese („Solution Sieving Capillary Electrophoresis"; SSCE) mit einem optischen Nachweis bei 215 nm festgestellt. L1 war gemäß SSCE zu 75% rein. Eine Elektronenmikroskopie zeigte, daß VLP im Größenbereich von 50–55 nm vorhanden waren.
C. Analytische Größenausschluß-HPLC
Zur Untersuchung hinsichtlich VLP wurden Proben durch Größenausschlußchromatographie nach der Größe fraktioniert. Die Chromatographie wurde mit einer Perkin-Eimer Series 410 Biopump-HPLC-Vorrichtung mit einem ISS 100-Autoinjektor, der mit einer 200-Mikroliter-Einspritzschleife ausgerüstet war, durchgeführt. Die Säule war ein TSK-Gel G5000PW, 7,5 × 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA). Zur Überwachung der Proteinelution von der Säule wurde ein optischer Nachweis bei 280 nm mit einem Perkin-Elmer LC-235-Diodenanordnungsdetektor durchgeführt. Die mobile Phase war 0,5 M NaCl in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2. Die Durchflußrate betrug 0,5 ml/Min. und es wurden 1-Milliliter-Fraktionen gesammelt. Die Säulenkalibrierung erfolgte mit Proteinstandards von Sigma sowie rekombinantem Hepatitis B-Oberflächenantigen (Recombivax^TM, Merck & Co,. West Point, PA). Der Antigennachweis in Fraktionen, die während der Elution gesammelt wurden, erfolgt durch Immunodot-Blot-Assay.
D. Immunodot-Blot-Assay
Eine 10-Mikroliter-Probe einer jeden Fraktion wurde auf einen Streifen von PVDF-Membran (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA) aufgebracht, welcher vorgetränkt und auf angefeuchtes Fließpapier plaziert worden war. Der Probe wurde gestattet, in die Membran einzusickern, und die Membran wurde in eine Blockierungslösung (5% (Gew./Vol.) von fettfreier Trockenmilch, gelöst in 0,15 M NaCl, 0,02% (Gew./Vol.) Natriumazid und 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2) gebracht und bei Raumtemperatur unter sanfter mechanischer Bewegung für ein Minimum von drei Stunden inkubiert. Die Blockierungslösung wurde dekantiert und durch eine Lösung des primären Antikörpers ersetzt.
Der verwendete primäre Antikörper variierte in Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Antigen:
CRPV-L1 wurde mit dem Anti-CRPV-Kaninchenserum "late response" (Biodesign International, Kennebunk, ME) sondiert. CRPV-L2 wurde mit Anti-CRPV-L2-Kaninchenserum sondiert. HPV6a-L1 wurde mit dem monoklonalen Antikörper MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) sondiert. HPV6a-L2 wurde mit Anti-HPV6a-L2-trpE-Fusions-Mausserum sondiert.
Die Sichtbarmachung der Immunkomplexe erfolgte nach Standardverfahren unter Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, und des chromogenen Substrats NBT/BCIP.
E. Herstellung von Vakzin aus rekombinantem CRPV-L1-Kapsidprotein
Gereinigtes CRPV-L1-Kapsidprotein wurde an Al(OH)₃ in einer Konzentration von 100 μg/ml adsorbiert.
BEISPIEL 22 (Referenz)
Reinigung von rekombinantem CRPV-L1-Kapsidprotein - Schema 2
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Zellen des Stammes # 1582, bei –70°C gelagert, wurden aufgetaut und in einem gleichen Volumen an Aufbruchpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) suspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden der Aufschlämmung bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellen wurden mit Hilfe eines BioNeb Cell Disruptor-Systems (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN) lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt.
Der Überstand wurde über ein 5-cm-Kissen von 45%iger Sucrose (Gew./Vol.) in L1-Puffer geschichtet und L1 wurde durch Zentrifugation mit 100.000 × g für 4 h pelletiert. Das Pellet wurde in 1/10 Volumen L1-Puffer resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt.
Der Überstand wurde 1 : 5 mit PBS verdünnt, erneut durch Zentrifugation in einem Sorvall SA-600-Rotor mit 6500 UpM für 10 Minuten bei 4°C geklärt. Der Überstand wurde durch ein 0,22-Mikron-Spritzenfilter filtriert und mittels Anionenaustauschchromatographie fraktioniert.
Die Anionenaustauschchromatographie wurde mit einer Perkin-Eimer Series 410 Biopump-HPLC-Vorrichtung mit einer 5-Milliliter-Einspritzschleife durchgeführt. Das Chromatographiemedium war ein Fractogel-EMF-TMAE-650 (S)-25-40-Mikron-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ) in einer Glassäule von 150 mm × 10 mm Innendurchmesser. Zur Überwachung der Proteinelution von der Säule wurde ein optischer Nachweis bei 280 nm mit einem Perkin-Eimer LC-235-Diodenanordnungsdetektor durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,15 M NaCl in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2 (Puffer A), voräquilibriert. Die Säule wurde mit einer Durchflußrate von 0,75 ml/Min. betrieben. Die Probe wurde auf die Säule aufgetragen und die Säule mit Puffer A gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Gebundenes Material wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Natriumchlorid, 0,15 M bis 0,65 M, für 5 Minuten, gefolgt von einem linearen Gradienten von 0,65 M bis 1,15 M für 30 Minuten, eluiert. Der Antigennachweis in Fraktionen, die während der Elution gesammelt worden waren, erfolgte durch Immunodot-Blot-Assay. Fraktionen, die immunreaktives Material enthielten, (d. h. Fraktionen, die zwischen 0,81 M und 1,05 M NaCl eluierten) wurden gepoolt.
Die gepoolten Fraktionen wurden in Macrosep-Zentrifugationskonzentrationsvorrichtungen (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) auf 1/5 Volumen konzentriert.
Das Konzentrat wurde durch Größenausschlußchromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-1000 SF-Ha₂ (Pharmacia, Piscataway, NJ) in einer Säule von 87 cm × 27 mm Innendurchmesser fraktioniert. Die Säule wurde bei einer Durchflußrate von 2,5 ml/Min. betrieben. Die Proteinelution wurde mittels A₂₈₀ nm überwacht. Antigen wurde durch Immunoblot nachgewiesen.
Fraktionen, die immunreaktives Material enthielten, wurden gepoolt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Rührzelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) mit einer YM-100-Flachfolienmembran von 43 mm Durchmesser (Amicon, Inc., Beverly, MA) unter Stickstoff bei 10 psi Druck konzentriert.
Das Endprodukt wurde durch SDS/PAGE mit Coomassiefärbung und durch Lösungssiebkapillarelektrophorese (SSCE) charakterisiert. Das Endprodukt von Schema 2 war gemäß SSCE zu 88% rein.
BEISPIEL 23 (Referenz)
A. Reinigung von rekombinantem CRPV-L1-Kapsidprotein - Schema 3 (17)
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. Zellen des Stammes # 1582, bei –70°C gelagert, wurden aufgetaut und in einem gleichen Volumen an Aufbruchpuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) suspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden der Aufschlämmung bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellen wurden mit Hilfe eines BioNeb Cell Disruptor-Systems (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN) lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt.
Der Überstand wurde über ein 5-cm-Kissen von 45%iger Sucrose (Gew./Vol.) in L1-Puffer geschichtet und L1 wurde durch Zentrifugation mit 100.000 × g für 4 h pelletiert. Das Pellet wurde in 1/10 Volumen L1-Puffer resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt.
Der Überstand wurde mit 1/2 Volumen Chloroform extrahiert. Die wässerige Schicht wurde entfernt und durch Zentrifugation mit 12.000 UpM in einer Beckman-Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei Raumtemperatur geklärt.
Der Überstand wurde 1 : 5 mit PBS verdünnt, erneut durch Zentrifugation in einem Sorvall SA-600-Rotor mit 6500 UpM für 10 Minuten bei 4°C geklärt. Der Überstand wurde durch ein 0,22-Mikron-Spritzenfilter filtriert und durch Anionenaustauschchromatographie fraktioniert.
Die Anionenaustauschchromatographie wurde mit einer Perkin-Eimer Series 410 Biopump-HPLC-Vorrichtung mit einer 5-Milliliter-Einspritzschleife durchgeführt. Das Chromatographiemedium war ein Fraetogel-EMF-TMAE-650 (S)-25-40-Mikron-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ) in einer Glassäule von 150 mm × 10 mm Innendurchmesser. Zur Überwachung der Proteinelution von der Säule wurde ein optischer Nachweis bei 280 nm mit einem Perkin-Eimer LC-235-Diodenanordnungsdetektor durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,15 M NaCl in 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2 (Puffer A), voräquilibriert. Die Säule wurde mit einer Durchflußrate von 0,75 ml/Min. betrieben. Die Probe wurde auf die Säule aufgetragen und die Säule mit Puffer A gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Gebundenes Material wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Natriumchlorid, 0,15 M bis 0,65 M, für 5 Minuten, gefolgt von einem linearen Gradienten von 0,65 M bis 1,15 M für 30 Minuten, eluiert. Der Antigennachweis in Fraktionen, die während der Elution gesammelt worden waren, erfolgte durch Immunodot-Blot-Assay. Fraktionen, die immunreaktives Material enthielten, (d. h. Fraktionen, die zwischen 0,81 M und 1,05 M NaCl eluierten) wurden gepoolt.
Die gepoolten Fraktionen wurden in Macrosep-Zentrifugationskonzentrationsvorrich tungen (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) auf 1/5 Volumen konzentriert.
Das Konzentrat wurde durch Größenausschlußchromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-1000 SF-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) in einer Säule von 87 cm × 27 mm Innendurchmesser fraktioniert. Die Säule wurde bei einer Durchflußrate von 2,5 ml/Min. betrieben. Die Proteinelution wurde mittels A₂₈₀ nm überwacht. Antigen wurde durch Immunoblot nachgewiesen.
Fraktionen, die immunreaktives Material enthielten, wurden gepoolt und mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Rührzelle (Amicon, Inc., Beverly, MA) mit einer YM-100-Flachfolienmembran von 43 mm Durchmesser (Amicon, Inc., Beverly, MA) unter Stickstoff bei 10 psi Druck konzentriert.
Das Endprodukt wurde durch SDS/PAGE mit Coomassiefärbung und durch Lösungssiebkapillarelektrophorese (SSCE) charakterisiert. Das Endprodukt von Schema 3 war gemäß SSCE zu 95% rein.
Lösungssiebkapillarelektrophorese (SSCE)
Proben von CRPV-VLP (~0,2 mg/ml) wurden 15 Minuten lang bei 100°C in 1% 2-Mercaptoethanol und 1% (Gew.Nol.) SDS erwärmt. Die Probe wurde elektrokinetisch zusammen mit einem Referenzmarker, Mellitsäure, auf eine Quarzglaskapillare, 42 cm (22 cm bis zum Detektor) × 0,05 mm Innendurchmesser, mit 10 Hohlraumvolumina an 0,1 N NaOH, Wasser und ProSort-Siebreagens (Applied Biosystems, Foster City, CA) voräquilibriert, aufgetragen. Eine Trennspannung von 300 Volt/cm wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 270A-HT CE-Instruments angelegt. Die Probenelution wurde anhand der Extinktion bei 215 nm überwacht und Daten mit Hilfe von Nelson Turbochrom 3-Software erfaßt.
BEISPIEL 24
Schutz gegen eine von CRPV verursachte Papilloma-Entwicklung durch Impfung mit CRPV-L1-VLPs aus Hefe
Fünf Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden intramuskulär mit entweder 135 μg L1-VLPs (75% rein), adsorbiert an Alaun, oder 100 μg rekombinantem Hepatitis B-Oberflächenantigen (99% rein), adsorbiert an Aluminiumhydroxid, als negative Kontrolle immunisiert. Die Tiere erhielten zwei weitere Auffrischungsimpfungen im Verlauf von 8 Wochen, bevor sie mit CRPV 10 Tage nach der letzten Auffrischung herausgefordert wurden. Die Seren, die vor der Immunisierung, bei jeder Auffrischung und vor der Herausforderung entnommen worden waren, wurden mit einem L1-spezifischen ELISA analysiert. 96-Mulden-Platten wurden mit 5 μg rohem Lysat von CRPV-L1 oder CRPV-L2 aus Hefe beschichtet. Protein wurde entfernt und die Platten wurden in 10%iger Trockenmilch (Carnation) + TTBS (20 mM TRIS, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,1% Tween) für 2 h bei 4°C blockiert. Nach dem Waschen der Platten mit TTBS wurden verdünnte Kaninchenseren in 1%iger Milch + TTBS zugegeben und 2 h lang bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden mit TTBS gewaschen und mit einer 1 : 1000-Verdünnung von Antikaninchen-IgG-alkalischer Phosphatase (Kirkegaard und Perry Labs., Inc.) in 1%iger Milch + TTBS für 2 h bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden mit TTBS gewaschen und durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphat entwickelt (Kirkegaard und Perry Labs., Inc.). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5% EDTA gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm gemessen. Der Titer wurde als positiv angesehen, falls das L1/L2-Extinktionsverhältnis 2 : 1 betrug.
Anti-L1-Antikörpertiter waren vier Wochen nach der ersten Injektion vorhanden und sie nahmen mit jeder zusätzlichen Auffrischungsimpfung zu. Die Kontrolltiere waren negativ. 6 Wochen nach der CRPV-Herausforderung waren die geimpften Tiere an 15 von 15 Stellen warzenfrei (1 : 2 verdünnte oder 1 : 12 verdünnte Virus-Stammlösung), während die Kontrolltiere eine Warzenbildung an 12 von 15 Stellen (1 : 2 verdünntes Virus) oder 9 von 15 (1 : 12 verdünntes Virus) zeigten. Nach 15 Wochen waren die geimpften Tiere immer noch warzenfrei.
Virus-Neutralisations-Assays wurden (im wesentlichen nach dem Verfahren von Christensen et al., 1991, Virolgy 181: 572–579) durch Mischen von Kaninchenseren mit CRPV und anschließende Herausforderung von Kaninchen mit dem behandelten CRPV durchgeführt. Der Standard für die Bestimmung eines neutralisierenden Antikörpers war vollständige Virus-Neutralisation (3/3 Stellen negativ für Warzenbildung). Seren von den fünf geimpften Tieren und fünf Kontrolltieren wurden analysiert. Die nach einer Dosis an CRPV-L1-VLPs gewonnenen Seren enthielten Antikörper, welche unverdünnten Virus in 80% der Kaninchen (4/5) vollständig neutralisierten. Nach zwei oder drei Dosen an CRPV-L1-VLPs besaßen 100% der Kaninchen (5/5) virus-neutralisierende Antikörper. Kontrollseren zeigten keinerlei virus-neutralisierende Aktivität. In Abhängigkeit von den endgültigen Titern konnten die Seren ausgewählter geimpfter Tiere zwischen 10-1000fach verdünnt werden und waren immer noch zu 100% neutralisierend.
BEISPIEL 25
Konstruktion eines Vektors für die Coexpression von CRPV-L1/L2 von einem einzigen Plasmid
Das Plasmid pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1) wurde mit Bglll verdaut und das 1,5-kbp-Bglll-Fragment, welches den CRPV-L1-ORF mit einer 5'-untranslatierten Hefe-Leadersequenz trug, wurde gelgereinigt. Das Plasmid p12930-323-2-3 wurde mit BamHl verdaut, welches zwischen dem GAL1-Promotor und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Das lineare Vektorfragment wurde gelgereinigt und dann mit dem vorgenannten CRPV-L1-Bglll-Fragment ligiert, um das Plasmid p12930-366-1-2 zu ergeben. Dieses resultierende Plasmid enthält den CRPV-L1-ORF unter der Kontrolle des GAL1-Promotors und den CRPV-L2-ORF unter der Kontrolle des GAL10-Promotors.
BEISPIEL 26
Konstruktion eines Vektors für die Coexpression von CRPV-L1/L2 von zwei Plasmiden
Der Vektor pUC18-GAL1 p-GAL10p, enthaltend das L2-Gen, wurde mit Sphl gespalten und das 2,9-kb-Fragment, welche die ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t-Expressions kassette beherbergte, wurde gelgereinigt und durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht. Der Hefe-Shuttlevektor YEp24 [Botstein et al., Gene 8: 17 (1979)] wurde mit BamHl verdaut, durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase dephosphoryliert und dann mit der obigen glattendigen L2-Expressionskassette ligiert, um das Plasmid p1594 zu ergeben.
BEISPIEL 27
Coexpression von CRPV-L1 und -L2 in Hefe
Das Plasmid p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1 + L2) wurde zur Transformation der S. cerevisiae-Stämme # 1569 und BJ5462 eingesetzt (1-Plasmid-System) und die resultierenden Transformanten wurden auf synthetischem Leucin-Minus-Agarmedium selektioniert. In einem parallelen Experiment wurde der Stamm # 1592 mit dem CRPV-L1-Expressionsvektor p12930-323-6-1 plus dem YEp24-GAL10p-L2-Expressionsvektor p1594 cotransformiert (2-Plasmid-System) und die resultierende Transformanten, die beide Vektoren enthielten, wurden auf synthetischem Agarmedium selektioniert, dem sowohl Leucin als auch Uracil fehlte. Klonale Isolate für sowohl das 1-Plasmid-System als auch das 2-Plasmid-System wurden bei 30°C in YEHD-Komplexmedium, das 2% Galactose enthielt, 48–72 Stunden lang gezüchtet. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen. Triton X-100 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben und Zellysate wurden hinsichtlich der Expression von CRPV-L1 und -L2 durch Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die 50 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden einer Elektrophorese auf 8–16%igen Tris-Glycin-Gradientengelen (Novex) unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen unterworfen und auf PVDF-Membranen (Novex) elektrogeblottet. CRPV-L1- und L2-Proteine wurden mit Hilfe polyklonaler Anti-L1-oder Anti-L2-Kaninchenantiseren (Gabe von Dr. John Kreider, Hershey Medical Center) als primäre Antikörper und Protein A in Kopplung mit Meerettichperoxidase (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper nachgewiesen. Die Membranen wurde mit Hilfe des chemolumineszierenden ECL^TM Detection Kit (Amersham, Inc.) aufgearbeitet. Eine L1-Proteinbande von 55–61 kD und eine L2-Proteinbande von ~90 kD wurde in allen Proben von Hefenklonen nachgewiesen, welche das L1 + L2-Expressionsplasmid beherbergten. Kein Signal für L2 wurde in Proben nachgewiesen, die von Hefeklonen stammten, welche das Expressionsplasmid für L1 beherbergten (6). Kein Signal für L1 wurde in Proben aus Zellen nachgewiesen, die nur den L2-Expressionsvektor enthielten.
BEISPIEL 28
Reinigung von CRPV-L1- und CRPV-L1 + L2-VLPs für EM-Studien
Die in Hefe exprimierten CRPV-L1- und CRPV-L1- und -L2-Proteine wurden für elektronenmikroskopische (EM)-Studien partiell gereinigt und konzentriert. 1 bis 1,5 Liter YEHD-Medium, enthaltend 2% Galactose, wurden mit dem S. cerevisiae-Stamm # 1569 oder BJ5462, transformiert mit dem L1+L2-Coexpressionsvektor p12930-366-1-2, angeimpft und 48–72 Stunden lang bei 30°C gezüchtet. In einem parallelen Experiment wurden Zellen des Stammes # 1569, cotransformiert mit dem CRPV-L1-Expressionsvektor p12930-323-6-1 plus dem YEp24-GAL10p-L2-Plasmid p1594, auf ähnliche Weise gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und Zellpellets bei –70°C eingefroren. Alle folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Zellpellets wurden aufgetaut und in einem gleichen Volumen an „L1-Puffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) suspendiert. Die Proteininhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden der Aufschlämmung in einer Endkonzentration von 2 μM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellen wurden durch 3–5 Passagen in einem Microfluidizer lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Minuten geklärt. Der Überstand wurde über ein 5-cm-Kissen von 45%iger (Vol./Vol.) Sucrose in L1-Puffer geschichtet und die L1-, L2- oder L1- und L2-Proteine wurden durch Zentrifugation mit 100.000 × g für 4 Stunden pelletiert. Das Pellet wurde in 1/10 des Volumens an L1-Puffer resuspendiert. Das resuspendierte Pellet wurde durch Zentrifugation mit 5000 × g für 10 Min. geklärt.
Für die EM-Analyse (Structure Probe, Westchester, PA) wurde ein Aliquot einer jeden Probe auf kohlenstoffbeschichtete 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure (PTA), pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Die Gitter wurde vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie erfolgte mit Hilfe eines JEOL 1000X-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen besaßen eine 100.000fache Endvergrößerung.
In allen Hefeproben, welche entweder das CRPV-L1-Expressionsplasmid oder Plasmide für die Coexpression von CRPV-L1 und -L2 beherbergten, wurden VLPs in einem Größenbereich von ≤25 nm Durchmesser beobachtet. Keine VLP wurde in Hefekontrollproben oder in Hefeproben, welche das L2-Expressionsplasmid allein beherbergten, beobachtet.
BEISPIEL 29
Expression von CRPV-L1 (Stamm 1582) und HPV Tvp 6a-L1 (Stamm 1644) in angereicherten komplexen und chemisch definierten Medien
Die Impfgüter für diese Stämme wurden in leucin-freiem synthetischem Medium wie oben für den Transfer zu Schüttelkolbenkulturen beschrieben entwickelt. Die verwendeten Schüttelkolben wurden für eine hohe Belüftungskapazität (70 ml Flüssigkeit pro 300-ml-Kolben, Tunair Labware) mit einer Schikane versehen und die Medien wurden mit etwa 0,5 ml/l eines Antischaummittels (UCON LB-625, Union Carbide) ergänzt. Angereichertes komplexes Medium enthielt (pro l): 40 g Difco-Hefeextrakt, 20 g Sheffield-HySoy-Pepton, 30 g Glucose, 50 g Galactose; das Medium wurde vor der Sterilisation auf pH 5,3 eingestellt. Das verwendete chemisch definierte Medium war ähnlich dem von Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16: 1197–1212, 1974) beschriebenen, jedoch ergänzt mit (pro l): 0,1 g Cholin-CI, 0,4 g Adenin, 30 g Mononatriumglutamat als Stickstoffquelle, 0,2 g Uracil, 20 g Glucose, 40 g Galactose. Die Kolben wurden mit 3 ml Impfgut angeimpft und 66 Stunden lang bei 28°C, 250 UpM, auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Den Kolben wurden in Intervallen Proben entnommen für die Bestätigung der Expression durch Immunoblot unter Verwendung von Anti-CRPV-L1- und Anti-HPV 6a-L1-Antiseren.
BEISPIEL 30
Klonierung von HPV16-L1- und -L2-Genen
Genomische Gesamt-DNA wurde aus Caski-Zellen (ATCC # CRL1550) nach Standardtechniken (Sambrook et al., oben) extrahiert. Die DNA wurde mit den Endonukleasen Bst11071 und Sphl verdaut und einer Elektrophorese durch ein 0,8%iges präparatives Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur unterworfen. Ein Bereich, der DNA von ~3,5 kbp entsprach, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die Agarose mit Gelase^TM-Enzym (Epicentre Technologies, Inc.) verdaut. Die gelgereinigte DNA wurde mit T4-DNA-PoIymerase glattendig gemacht und mit glattendigen phosphorylierten Oligodesoxynukleotid-Linkern ligiert, welche eine verborgene HindIII-Stelle enthielten. Die Ligierungsmischung wurde mit HindIII bis zur Vervollständigkeit verdaut und die ~ 3,5-kbp-DNA wurde durch ein Agarosegel wie oben beschrieben größenfraktioniert. Die gelgereinigte DNA wurde mit pUC18-Plasmid-DNA, welche mit HindIII verdaut und dephosphoryliert worden war, ligiert. Nach der Transformation kompetenter E. coli-DH5-Zellen (BRL) wurde die Plasmidbank hinsichtlich HPV16-positiver Klone gescreent durch Koloniehybridisierung unter Verwendung eines ³²P-markierten Antisense-Oligodesoxynukleotids, welches komplementär zu dem 3'-Ende des HPV16-L1-Gens ist (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Ein pUC18-Plasmid, enthaltend ein genomisches 3,3-kbp-HPV16-Fragment, wurde isoliert und charakterisiert durch Restriktionsenzym- und Southernblot-Analysen. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pUC18-HPV16L1/L2 und enthält alle für L1 und L2 kodierenden DNA-Sequenzen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiagen^TM Plasmid Maxi-Kits (Qiagen, Inc.) präpariert.
BEISPIEL 31
Konstruktion des HPV16-L1-Hefe-Expressionsvektors
Der Klon pUC18-HPV16L1/L2 wurde als Matrize für PCR eingesetzt. Das HPV16-L1-Gen wurde mittels PCR unter Einsatz von Vent-Polymerase (New England Biolabs, Inc.), 10 Amplifizierungszyklen (94°C, 1 Min.; 48°C, 1 Min.; 72°C, 1 Min. 45 s) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern, welche flankierende Bglll-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert.
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV16-L1-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,5-kbp-L1-PCR-Produkt wurde mit Bglll verdaut, gelgereinigt und mit dem BamHl-verdauten pGAL10-Vektor ligiert. Ein pGAL10-Plasmid wurde isoliert, welches das HPV16-L1-Gen enthält, und als p14049-37-1 bezeichnet. Das L1-Gen in p14049-37-1 wurde mit Hilfe des PRISM^TM-Kits (ABI, Inc.) und eines ABI-Sequenzierer Modell # 373 A nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Es wurde gezeigt, daß das L1-Gen in diesem Isolat drei Nukleotidabweichungen von der korrigierten veröffentlichten Prototyp-Sequenz (Kirnbauer, R., et al. (1993), J. Virol. 67: 6929–6936) enthält, was zu zwei Aminosäurenaustauschen führt: His-202 zu Asp; Thr-266 zu Ala. Eine Sequenzanalyse der ursprünglichen Matrizen-DNA bestätigte, daß diese Abweichungen auch im genomischen Klon pUC18-HPV16L1/L2 vorlagen und nicht durch die PCR eingeführt wurden.
BEISPIEL 32
Konstruktion des HPV16-L1- und -L2-Hefe-Expressionsvektors
Das Plasmid p14049-37-1 wurde mit Smal verdaut, welches zwischen dem GAL10-Promoter und dem ADH1-Transkriptionsterminator spaltet. Das 1,4-kbp-HPV16-L2-Gen wurde mittels PCR unter Einsatz der pUC18-HPV16L1/L2-DNA als Matrize, Vent-Poly merase (New England Biolabs, Inc.), 10 Zyklen PCR-Amplifizierung (94°C, 1 Min.; 48°C, 1 Min.; 72°C, 1 Min. 45 s) und den folgenden Oligodesoxynukleotid-Primern, welche flankierende Smal-Stellen (unterstrichen) enthalten, amplifiziert:
Der Sense-Primer führt eine untranslatierte Hefe-Leadersequenz unmittelbar stromaufwärts des HPV16-L2-Initiations-Methionincodons (in Fettdruck hervorgehoben) ein. Das 1,4-kbp-L2-PCR-Produkt wurde mit Smal verdaut, gelgereinigt und mit dem Smal-verdauten Vektor p14049-37-1 ligiert. Ein pLS110-Plasmid, welches die HPV16-L1- und L2-Gene beide enthält, wurde isoliert und als p14049-42-2 bezeichnet. Das L2-Gen in p14049-42-2 wurde mit Hilfe des PRISM^TM-Kits (ABI, Inc.) und eines ABI-Sequenzierers (Modell #373A) nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Es wurde gezeigt, daß das L2-Gen in diesem Isolat fünf Nukleotidabweichungen von der korrigierten veröffentlichten Prototyp-Sequenz (Kirnbauer, R., et al., (1993), oben) enthält, was zu einem Aminosäureaustausch führt: Ser-269 zu Pro. Eine Sequenzanalyse des genomischen Klons pUC18-HPV16L1/L2 bestätigte, daß diese Abweichung auch in der ursprünglichen Matrizen-DNA vorlag und nicht durch die PCR eingeführt wurde.
BEISPIEL 33 (Referenz)
A. Expression von HPV16-L1 und Coexpression von HPV16-L1 und -L2 in Hefe
Die Plasmide p14049-37-1 und p14049-42-2 wurden zur Transformation des S. cerevisiae-Stammes # 1558 eingesetzt. Die resultierenden rekombinanten Stämme waren # 1678 (HPV16-L1) und # 1679 (HPV16-L1+L2) wie in der Tabelle gezeigt. Klonale Isolate wurden bei 30°C in YEHD-Medium, das 2% Galactose enthielt, für 68–78 Stunden gezüchtet. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Zellpellets mit Glasperlen aufgebrochen und die Zellysate hinsichtlich der Expression von HPV16-L1- oder HPV16-L2-Protein durch Immunoblot-Analyse analysiert. Proben, die 40 μg zelluläres Gesamtprotein enthielten, wurden auf 10%igen Tris-Glycin-Gelen unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen elektrophoresiert und auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet. Das HPV16-L1-Protein wurde mit Hilfe polyklonaler Kaninchen-Antiseren, die gegen ein trpE-HPV11-L1-Fusionsprotein induziert worden waren, (D. Brown et al., Virology 201: 46–54) als primärer Antikörper und HRP-gekoppeltem Antikaninchen-Esel-IgG-Antikörper (Amersham, Inc.) als sekundärer Antikörper nachgewiesen. Die Filter wurden mit Hilfe des chemolumineszierenden ECL^TM-Detection Kit (Amersham, Inc.) aufgearbeitet. Ein L1-Proteinbande von 50–55 kD wurde in allen Proben mit Ausnahme der negativen Kontrolle (Vektorkontrolle ohne L1- oder L2-Gen) nachgewiesen. Das L2-Protein wurde als eine 70-kD-Proteinbande durch einen Immunodot unter Verwendung von Anti-HPV16-L2-Mausseren, die gegen in E. coli exprimierte trpE-L2-Fusionsproteine induziert worden waren, als primärer Antikörper nachgewiesen. Antimaus-Ziegen-IgG, an HRP gekoppelt, (Amersham, Inc.) wurde als sekundärer Antikörper verwendet und die Filter wurden wie oben beschrieben aufgearbeitet.
B. Reinipunq von rekombinanten HPV Typ 16–L1 + L2-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 27,6 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 40 ml „L1-Puffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 8000 psi durch 3 Passagen in einem M110 Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellaufschlämmung wurde mit 5000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1- + L2-Antigen, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde 1 : 5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf eine Anionenaustausch-Einfangsäule (5,0 cm ID × 4,8 cm) von Fractogel^®-EMD-TMAE-650 (S)-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibriert in Puffer A, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem Gradienten von 0–1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Ein Immunodot-Blot wurde durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen von der Säule L1-Protein enthielten.
Fraktionen, welche L1-Protein enthielten, wie durch Immunodot-Blot bestimmt, wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Vertahren, gefolgt von SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblotting, unterworfen.
TMAE-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert. Proben wurden auf 48% gesättigtes Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugegeben wurde. Die Proben wurden auf Eis gestellt und die Präzipitation über Nacht stattfinden gelassen. Die Proben wurden mit 12.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) resuspendiert.
Die resuspendierten Pellets wurden separat auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm) von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) bei 20–23°C chroma tographiert. Der Laufpuffer war PBS. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblot-Nachweis analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Die resultierenden Pools wurden in einer 50-ml-Rührzelle unter Einsatz von YM-100-Flachfolienmembranen (Amicon, Beverly, MA) von 43 mm bei einem N₂-Druck von 4–6 psi konzentriert.
Das Endprodukt wurde mittels SDS-PAGE unter Anwendung von kolloidaler Coomassiefärbung analysiert. Die L1- und L2-Proteine wurden als zu 70% homogen abgeschätzt. Die Identität der L1- und L2-Proteine wurde durch Westernblots mit Hilfe der geeigneten Antiseren bestätigt. Das Endprodukt wurde in Aliquots aufgeteilt und bei –70°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 0,53 mg Protein.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wurde mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot einer Probe wurde auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Einen Tropfen von 2%iger Phosphonnrolframsäure, pH 7,0, wurde 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wurde vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wurde unter Verwendung eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen hatten eine 100.000fache Endvergrößerung. Die Anwesenheit virusähnlicher Partikel im Größenbereich ≤25 nm wurde bestätigt.
C. Reiniqunq von rekombinanten HPV Tvp 16-L1 + L2-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 92,8 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 105 ml „L1-Puffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16000 psi durch 3 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellaufschlämmung wurde mit 6100 × g 15 Minuten lang zentrifugiert, um Zelttrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1- + L2-Antigen, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde 1 : 5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf eine Anionenaustausch-Einfangsäule (5,0 cm ID × 4,2 cm) von Fractogel^®-EMD-TMAE-650 (S)-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibriert in Puffer A, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem Gradienten von 0–1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Ein Immunodot-Blot wurde durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen von der Säule L1-Protein enthielten.
Fraktionen, welche L1-Protein enthielten, wie durch Immunodot-Blot bestimmt, wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren, gefolgt von SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblotting, unteewvorfen.
TMAE-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert. Proben wurden auf 35% gesättigtes Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zugegeben wurde. Die Proben wurden auf Eis gestellt und die Präzipitation 4 h lang stattfinden gelassen. Die Proben wurden mit 12.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl), enthaltend 1 mM EDTA, zentrifugiert.
Die resuspendierten Pellets wurden separat auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm) von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert. Der Laufpuffer war PBS mit 1 mM EDTA. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblot-Nachweis analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Die resultierenden Pools wurden in einer 50-ml-Rührzelle unter Einsatz von YM-100-Flachfolienmembranen (Amicon, Beverly, MA) von 43 mm bei einem N₂-Druck von 4–6 psi konzentriert.
Das Endprodukt wurde mittels SDS-PAGE unter Anwendung von kolloidaler Coomassiefärbung analysiert. Die L1- und L2-Proteine wurden als zu 70% homogen abgeschätzt. Die Identität der L1- und L2-Proteine wurde durch Westernblots mit Hilfe der geeigneten Antiseren bestätigt. Das Endprodukt wurde in Aliquots aufgeteilt und bei –70°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 3,8 mg Protein.
BEISPIEL 34 (Referenz)
A. Fermentation des Stammes 1679 (HPV Tvp 16-L1 + L2)
Die für die Herstellung eingefrorener Stammkulturen, Impfgutentwicklung, Fermentation und Zellgewinnung des Stammes 1679 eingesetzten Verfahren waren im wesentlichen wie oben beschrieben. Nach 67 Stunden Inkubation wurde eine Zelldichte von 4,2 g Trockenzellgewicht pro Liter erreicht und ergab insgesamt 93 g nasses Zellpellet nach der Gewinnung.
B. Fermentation des Stammes 1678 (HPV Tvp 16-L1)
Die für die Herstellung eingefrorener Stammkulturen, Impfgutentwicklung, Fermentation und Zellgewinnung des Stammes 1678 eingesetzten Verfahren waren im wesentlichen wie oben beschrieben. Nach 70,5 Stunden Inkubation wurde die Inhalte von zwei 10-l- Fermentationen gepoolt (eine Zelldichte von 8,7 g Trockenzellgewicht pro Liter), was insgesamt 258 g nasses Zellpellet nach der Gewinnung ergab.
C. Reinigung von rekombinanten HPV Tvp 16-L1-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Zellen des Stammes # 1678 wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 128 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 140 ml „Modifiziertem L1-Puffer" (20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 100 mM NaCl) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren PMSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16000 psi durch 3 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellaufschlämmung wurde mit 11000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1- + L2-Antigen, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde 1 : 5 durch Zugabe von Puffer A (20 mM MOPS, pH 7,0) verdünnt und auf eine Anionenaustausch-Einfangsäule (5,0 cm ID × 6,4 cm) von Fractogel^®-EMD-TMAE-650 (S)-Harz (EM Separations, Gibbstown, NJ), äquilibriert in Puffer A, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Puffer A wurde das Antigen mit einem Gradienten von 0–1,0 M NaCl in Puffer A eluiert. Ein Immunodot-Blot wurde durchgeführt, um festzustellen, welche Fraktionen von der Säule L1-Protein enthielten.
Fraktionen, welche L1-Protein enthielten, wie durch Immunodot-Blot bestimmt, wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren, gefolgt von SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblotting, unterworfen.
TMAE-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Das Antigen wurde durch Ammoniumsulfatfraktionierung konzentriert. Proben wurden auf 35% gesättigtes Ammoniumsulfat eingestellt, indem festes Reagenz unter sanftem Rühren im Verlauf von 10 Minuten zugegeben wurde. Die Proben wurden auf Eis gestellt und die Präzipitation 5 h lang stattfinden gelassen. Die Proben wurden mit 12.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20,0 ml PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) resuspendiert.
Die resuspendierten Pellets wurden separat auf einer Größenausschlußsäule (2,6 cm ID × 89 cm) von Sephacryl 500 HR-Harz (Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert. Der Laufpuffer war PBS. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE unter Anwendung von Silberfärbung und Westernblot-Nachweis analysiert. Die reinsten Fraktionen wurden gepoolt. Die resultierenden Pools wurden in einer 50-ml-Rührzelle unter Verwendung von YM-100- Flachfolienmembranen (Amicon, Beverly, MA) von 43 mm bei einem N₂-Druck von 4–6 psi konzentriert.
Das Endprodukt wurde mittels SDS-PAGE unter Anwendung von kolloidaler Coomassiefärbung analysiert. Das L1-Protein wurde als zu 70% homogen abgeschätzt. Die Identität von L1 wurde durch Westernblots mit Hilfe der geeigneten Antiseren bestätigt. Das Endprodukt wurde in Aliquots aufgeteilt und bei –70°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 7,4 mg Protein.
D. Analytische Verfahren
Immunodot-Blot-Verfahren
Die Proben wurden (erforderlichenfalls) 1 : 10 in Milli-Q-N₂O verdünnt und 10 μl der Probe wurden auf PolyScreen^TM-PVDF-Membranen (NEN Research Products, Boston, MA) aufgetragen. Nachdem die Flecken getrocknet waren, wurden die Membranen in Wasser gewaschen und trocknen gelassen. Ein Lösung von primärem Antikörper wurde hergestellt durch Verdünnung des geeigneten Antiserums in Blottingpuffer (5% fettfreie Milch in 6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Die Inkubation war für mindestens 1 Stunde bei 20–23°C. Der Blot wurde jeweils 1 Minute lang in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Eine Lösung von sekundärem Antikörper wurde hergestellt durch Verdünnung des geeigneten, an alkalische Phosphatase gekoppelten Konjugat-Antiserums in Blottingpuffer. Die Inkubation fand unter denselben Bedingungen für mindestens 1 Stunde statt. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und unter Verwendung eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen.
Die zum Nachweis verwendeten Antikörper waren wie folgt:
HPV6a-L1 wurde durch MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) nachgewiesen. HPV6a-L2 wurde durch den Anti-HPV6a-L2-trpE-Fusions-Mausserumpool # 641 und 647 (im Haus von M. Rosolowski hergestellt) nachgewiesen. HPV16-L1 wurde durch MAB 885 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) nachgewiesen. HPV16-L2 wurde durch den Anti-HPV16-L2-trpE-Fusions-Mausserumpool # 611 (im Haus von K. Jansen hergestellt) nachgewiesen.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein
Gesamtprotein wurde mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-H₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard- bzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) eingesetzt, um die Standardkurve zu erstellen. Der Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh Ilci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assays
Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, die Proben wurden auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1 : 1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 100°C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V für 1 Stunde 45 Minuten elektrophoresiert. Die Gele wurden unter Anwendung von entweder Silberfärbung mit einer Variation des Verfahrens von Heukeshoven und Dernick [Electrophoresis, 6 (1985), 103–112] oder kolloidaler Coomassiefärbung unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt. Für Westernblots wurden die Proteine bei 25 V für 40 Minuten auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden getrocknet und mit Antikörper-Lösungen wie für die Immunodot-Blots inkubiert.
BEISPIEL 35
Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen
Gereinigte VLPs werden nach bekannten Verfahren formuliert, wie z. B. durch die Zumischung von pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Stabilisatoren oder einem Vakzin-Adjuvans. Die immunogenen VLPs der vorliegenden Erfindung können für die Verwendung als Vakzin durch Kombination mit einer physiologisch annehmbaren Zusammensetzung, wie z. B. PBS, Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, präpariert werden. Die immunogenen VLPs werden in einem Dosisbereich von etwa 0,1 bis 100 μg, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 μg, verab-reicht, um die gewünschte immunogene Wirkung zu erhalten. Die VLP-Menge pro Formulierung kann gemäß einer Vielfalt von Faktoren variieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, den Zustand, das Gewicht, Alter und Geschlecht des Individuums. Die Verabreichung der VLP-Formulierung kann auf einer Vielfalt von Routen erfolgen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, oral, subkutan, topisch, mukosal und intramuskulär. Solche VLP-Formulierungen können einen einzigen VLP-Typ (d. h., VLP von HPV6a) oder eine Mischung von VLPs (d. h., VLPs von HPV6a, HPV11, HPV16 und HPV18) umfassen.
Ein antimikrobielles Konservierungsmittel, z. B. Thimerosal, kann gegebenenfalls vorhanden sein. Die immunogenen Antigene der vorliegenden Erfindung können gewünschtenfalls in Kombination mit Vakzin-Stabilisatoren und Vakzin-Adjuvantien eingesetzt werden.
Typische Stabilisatoren sind spezielle Verbindungen, z. B. Polyanionen wie Heparin, Inosithexasulfat, sulfatiertes Betacyclodextrin, weniger spezielle Exzipienten, z. B. Aminosäuren, Sorbit, Mannit, Xylit, Glycerin, Sucrose, Dextrose, Trehalose, und Variationen der Lösungsbedingungen, z. B. neutraler pH-Wert, hohe lonenstärke (ca. 0,5–2,0 M Salze), zweiwertige Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺). Beispiele von Adjuvantien sind Al(OH)₃ und Al(PO₄). Das Vakzin der vorliegenden Erfindung kann gekühlt oder in lyophilisierter Form gelagert werden.
BEISPIEL 36
Herstellung von Antikörpern gegen VLP
Gereinigte VLP werden zur Bildung von Antikörpern eingesetzt. Der Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie Fragmente davon ein, wie z. B. Fv-, Fab- und F(ab)₂-Fragmente, welche zur Bindung von Antigen oder Hapten in der Lage sind. Die Antikörper werden in vielfältiger Weise eingesetzt, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, Reinigung von rekombinanten VLP, Reinigung von nativen L1- oder L2-Proteinen und Kits. Kits würden einen aufgeteilten Träger umfassen, der dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu enthalten. Der Träger würde ferner Reagenzien, wie z. B. den Anti-VLP-Antikörper oder das VLP, geeignet zum Nachweis von HPV oder Fragmenten von HPV oder Antikörper gegen HPV, enthalten. Der Träger kann auch Nachweismittel, wie z. B. markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dgl., enthalten. Die Antikörper oder VLP oder Kits eignen sich für eine Vielfalt von Zwecken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, forensische Analysen und epidemiologische Studien.
BEISPIEL 37
Reinigung von rekombinanten HPV Tvp 11-L1-Kapsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 180 g) wurden bei 20–23°C aufgetaut und in 900 ml „Aufbruchpuffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren AEBSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 4 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Ein ausreichendes Volumen an 10%igem Triton X100^®-Detergens (Pierce, Rockford, IL) wurde der aufgebrochenen Zellaufschlämmung zugegeben, um die Konzentration an TX100 auf 0,5% zu bringen. Die Aufschlämmung wurde 20 Stunden lang gerührt. Das mit Triton X100 behandelte Lysat wurde mit 12.000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1-Protein, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde gegen 5 Volumina 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, unter Verwendung einer 300K-Tangentialströmungs-Membrankassette (Filtron, Northborough, MA) diafiltriert. Das von der Membran zurückgehaltene Material wurde mittels Radioimmunoassay und Westernblots befunden, das L1-Protein zu enthalten.
Das Retentat wurde auf eine hochauflösende Affinitätssäule (11,0 cm ID × 5,3 cm) von SP-Spherodex (M)^®-Harz (IBF, Villeneuve-1a-Garenne, Frankreich), äquilibriert in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Äquilibrierungspuffer und einer Stufenwaschung mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1,0 M NaCl, wurde das L1-Protein mit einer Stufenwaschung von 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 2,5 M NaCl, eluiert. Fraktionen wurden während der Waschschritte und Elution gesammelt. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen. Die Fraktionen wurden dann durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Fraktionen wurden auch durch Radioimmunoassay analysiert.
SP-Spherodex-Fraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt.
Das Endprodukt wurde durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde als ≥90% homogen abgeschätzt. Die Identität des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt. Das Endprodukt wurde steril durch eine 0,22-μm-Membran filtriert und bei 4°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 100 mg Protein.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wird mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wird auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure, pH 7,0, wird 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wird vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wird mit Hilfe eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein
Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) untersucht. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-H₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standard bzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) verwendet, um die Standardkurve zu erstellen. Ein Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh Ilci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assays
Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, Proben wurden auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1 : 1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Min. lang bei 100°C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V 1 h 45 Min. lang elektrophoresiert. Die Gele wurden durch Anfärbung mit kolloidalem Coomassie unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt.
Für Westernblots wurden Proteine bei 25 V für 40 Min. auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Milli-Q-H₂O gewaschen und luftgetrocknet. Der primäre Antikörper war polyklonales Kaninchen-Antiserum, induziert gegen ein TrpE-HPV11-L1-Fusionsprotein (Gabe von Dr. D. Brown). Die Antikörperlösung wurde hergestellt durch Verdünnung von Antiserum in Blottingpuffer (5% fettfreie Milch in 6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Die Inkubation fand für mindestens 1 h bei 20–23°C statt. Der Blot wurde für jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Eine Lösung von sekundärem Antikörper wurde präpariert durch Verdünnung von Konjugat-Antiserum von an alkalische Phosphatase gekoppeltem Antikaninchen-Ziegen-IgG (Pierce, Rockford, IL) in Blottingpuffer. Die Inkubation fand unter denselben Bedingungen mindestens 1 h lang statt. Die Blots wurden wie zuvor gewaschen und mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen.
BEISPIEL 38
Reinigung von rekombinanten HPV Tvp 6a-L1-Kagsidproteinen
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, soweit nicht anders angegeben.
Die Zellen wurden bei –70°C eingefroren gelagert. Eingefrorene Zellen (Naßgewicht = 60 g) wurden in einem 45°C-Wasserbad aufgetaut und in 300 ml „Aufbruchpuffer" (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) resuspendiert. Die Proteaseinhibitoren AEBSF und Pepstatin A wurden bis zu Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 1,7 μM zugegeben. Die Zellaufschlämmung wurde bei einem Druck von etwa 16.000 psi durch 5 Passagen in einem M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgebrochen. Ein ausreichendes Volumen an 10%igem Triton X100^®-Detergens (Pierce, Rockford, IL) wurde der aufgebrochenen Zellaufschlämmung zugegeben, um die Konzentration an TX100 auf 0,5% zu bringen. Die Aufschlämmung wurde 18 Stunden lang gerührt. Das mit Triton X100 behandelte Lysat wurde mit 12.000 × g 40 Minuten lang zentrifugiert, um Zelttrümmer zu entfernen. Die Überstandsflüssigkeit, enthaltend L1-Protein, wurde gewonnen.
Die Überstandsflüssigkeit wurde gegen 5 Volumina 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, unter Verwendung einer 300K-Tangentialströmungs-Membrankassette (Filtron, Northborough, MA) diafiltriert. Das von der Membran zurückgehaltene Material wurde mittels Radioimmunoassay und Westernblots befunden ≥90% der ursprünglichen Menge an L1-Protein zu enthalten.
Das Retentat wurde auf eine hochauflösende Säule (5,0 cm ID × 10,0 cm) von POROS^®-50HS-Harz (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA), äquilibriert in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,5 M NaCl, aufgetragen. Nach einem Waschschritt mit Äquilibrierungspuffer wurde das L1-Protein mit einem linearen Gradienten von 0,5 – 1,5 M NaCl in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, eluiert. Fraktionen wurden während der Waschschritte und Elution gesammelt. Die Säulenfraktionen wurden einem Assay hinsichtlich Gesamtprotein nach dem Bradford-Verfahren unterworfen. Die Fraktionen wurden dann durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Fraktionen wurden auch durch Radioimmunoassay analysiert.
Säulenfraktionen, die eine vergleichbare Reinheit und Anreicherung von L1-Protein zeigten, wurden gepoolt. Die gepoolten Fraktionen wurden steril durch eine 0,22-μm-Membran filtriert. Das Produkt wurde in einer 50-ml-Rührzelle unter Verwendung von YM-100-Flachfolienmembranen (Amicon, Beverly, MA) von 43 mm bei einem N₂-Druck von 4–6 psi konzentriert. Das Produkt wurde bei 4°C gelagert. Diese Prozedur führte zu insgesamt 2,7 mg Protein.
Eine Probe des Endprodukts wurde durch TCA-Fällung weiter konzentriert und durch Westernblots und SDS-PAGE mit kolloidalem Coomassie-Nachweis analysiert. Das L1-Protein wurde durch Densitometrie von mit kolloidalem Coomassie angefärbten Gelen als 90% homogen abgeschätzt. Die Identität des L1-Proteins wurde durch Westernblots bestätigt.
Eine elektronenmikroskopische Analyse wird mittels Structure Probe (West Chester, PA) durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wird auf ein kohlenstoffbeschichtetes 200-Mesh-Kupfergitter plaziert. Ein Tropfen von 2%iger Phosphorwolframsäure, pH 7,0, wird 20 Sekunden lang auf das Gitter plaziert. Das Gitter wird vor der TEM-Untersuchung lufttrocknen gelassen. Die gesamte Mikroskopie wird mit Hilfe eines JEOL 100 CX-Transmissionselektronenmikroskops (JEOL USA, Inc.) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV durchgeführt. Die gemachten mikroskopischen Aufnahmen haben eine 100.000fache Endvergrößerung.
Bradford-Assay hinsichtlich Gesamtprotein
Gesamtprotein wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Coomassie Plus^®-Kits (Pierce, Rockford, IL) untersucht. Die Proben wurden auf geeignete Niveaus in Milli-Q-N₂O verdünnt. Die erforderlichen Volumina waren 0,1 ml und 1,0 ml für die Standardbzw. Mikroassay-Protokolle. Für beide Protokolle wurde BSA (Pierce, Rockford, IL) verwendet, um die Standardkurve zu erstellen. Ein Assay wurde nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Standardkurven wurden mit Hilfe von CricketGraph^®-Software auf einem Macintosh Ilci-Computer graphisch dargestellt.
SDS-PAGE und Westernblot-Assavs
Alle Gele, Puffer und elektrophoretischen Apparaturen wurden von Novex (San Diego, CA) erhalten und nach den Empfehlungen des Herstellers betrieben. In Kürze, Proben wurden auf gleiche Proteinkonzentrationen in Milli-Q-H₂O verdünnt und 1 : 1 mit Probeninkubationspuffer gemischt, der 200 mM DTT enthielt. Die Proben wurden 15 Min. lang bei 100°C inkubiert und auf vorgegossene 12%ige Tris-Glycin-Gele aufgetragen. Die Proben wurden bei 125 V 1 h 45 Min. lang elektrophoresiert. Die Gele wurden durch Anfärbung mit kolloidalem Coomassie unter Verwendung eines im Handel erhaltenen Kits (Integrated Separation Systems, Natick, MA) entwickelt.
Für Westernblots wurden Proteine bei 25 V für 40 Min. auf PVDF-Membranen überführt. Die Membranen wurden mit Milli-Q-H₂O gewaschen und luftgetrocknet. Der primäre Antikörper war MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA), der kovalent an das Enzym alkalische Phosphatase gekoppelt worden war (J. Cook, MRL). Die Antikörperlösung wurde hergestellt durch Verdünnung von Antiserum in Blottingpuffer (5% fettfreie Milch in 6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Die Inkubation fand für mindestens 1 h bei 20–23°C statt. Der Blot wurde für jeweils 1 Minute in drei Austauschen von PBS (6,25 mM Na-Phosphat, pH 7,2, 150 mM NaCl) gewaschen. Die Blots wurden mit Hilfe eines einstufigen NBT/BCIP-Substrats (Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Papillomavirus-Kapsidproteins, umfassend: (a) Transformation eines Hefewirts mit einem rekombinanten DNA-Molekül, wobei das rekombinante DNA-Molekül für ein Protein kodiert, das aus Papillomavirus-L1-Protein und Papillomavirus-L1+L2-Proteinen ausgewählt ist; (b) Kultivierung des transformierten Wirts unter Bedingungen, welche die Expression des rekombinanten DNA-Moleküls erlauben, um ein rohes rekombinantes Papillomavirus-Protein herzustellen; und (c) Reinigung des rohen rekombinanten Papillomavirus-Proteins mit einem einzigen Chromatographieschritt unter Anwendung von lonenaustauschchromatographie, um das gereinigte Protein herzustellen, wobei das Protein zu mindestens 90% rein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisae ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die lonenaustauschchromatographie über POROS^®-Harz erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Papillomavirus aus Human-Papillomavirus und Baumwollschwanzkaninchen-Papillomavirus ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Human-Papillomavirus aus HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HPV45 und HPV58 ausgewählt ist.