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Die
vorliegende Anmeldung beansprucht nach 35 U. S. C. § 119(e)
die Priorität
der vorläufigen
Anmeldung Serial No. 60/096 625, Anmeldetag 14. August 1998, wobei
diese Anmeldung hier vollinhaltlich in Bezug genommen wird.
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Mosaik-Virus-ähnlichen
Partikeln, die Kapsidproteine des humanen Papillom-Virus (HPV),
Typen 6 und 16, enthalten und befähigt sind, eine Immunantwort
gegen beide HPV-Typen zu induzieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
erfolgversprechende Strategie zur Induzierung einer Immunantwort,
durch die Infektionen durch das Papillom-Virus (PV) neutralisiert
werden können,
ist die Verwendung von Viruskapsidproteinen als Antigene. Im Fall
der genitalen menschlichen Papillom-Viren (HPVs) wurde dieser Ansatz durch
das Fehlen jeglicher In-vivo- oder
In-vitro-Quelle für
ausreichende Mengen des nativen Virus verhindert. Zur Lösung dieses
Problems wurden heterologe Expressionssysteme in großem Umfang
verwendet, um große
Mengen an Kapsidproteinen zu gewinnen und die Analyse ihrer strukturellen
und immunologischen Eigenschaften zu ermöglichen. Die Expression des
späten
Haupt-Kapsidproteins 1 (L1) aus verschiedenen PV-Typen unter Verwendung
von prokaryotischen Expressionssystemen (25), Baculovirus-Expressionssystemen
(21, 23, 37, 41, 42, 46), Hefe-Expressionssystemen
(14, 18, 19, 20, 29) und Säuger-Expressionssystemen
(15, 16, 51) ergaben, dass dieses Protein zur Selbstmontage zu Virus-ähnlichen
Partikeln (VLPs) in der Lage ist. Die Coexpression des späten Neben-Kapsidproteins
2 (L2) ist nicht zwingend erforderlich, um VLPs zu erzeugen, obwohl
sein Vorliegen die Effizienz der Partikelbildung erhöht (15,
22, 51) und neutralisierende Anti-L2-Antikörper induziert (32). Die L1-
und L2-VLPs sehen in der Elektronenmikroskopie (EM) ähnlich wie
native Virionen aus. Die Verwendung verschiedener Tiermodelle zeigte,
dass VLPs bei der Induzierung einer schützenden Immunantwort sehr wirksam
sein können.
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VLPs
erfüllen
viele der Kriterien, die sie zu idealen Surrogaten von nativen Virionen
machen. Sie gleichen in der Ultrastrukturanalyse (16) infektiösen Partikeln,
rufen Virus-neutralisierende
Antikörper
hervor und binden am mutmaßlichen
Rezeptor auf der Oberfläche
von Säugerzellen
(28, 31, 33, 44, 47). In besonders bemerkenswerter Weise ergaben
die mit Tiermodellen gewonnenen Ergebnisse, dass eine prophylaktische Immunisierung
mit VLPs in vivo sehr wirksam sein kann. Wildkaninchen, Kälber und
Hunde, die mit L1-VLPs immunisiert waren, waren gegen eine anschließende Testinfektion
mit dem homologen PV geschützt
(20, 23, 41), und die passive Übertragung
von Immunseren rief Schutz bei naiven Tieren hervor (20, 41), was
darauf hinweist, dass eine über
Antikörper
erfolgende Antwort eine Hauptrolle bei der Verhinderung einer Virusinfektion
spielt.
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Untersuchungen
mit infektiösen
HPV-Virionen sowie mit VLPs unterschiedlicher HPV-Typen ergaben jedoch
den starken Hinweis, dass die Immunantwort überwiegend typspezifisch ist.
Die Wirksamkeit von Anti-HPV-Vakzin-Kandidaten auf VLP-Basis kann
ferner nicht bei Tieren ermittelt werden, da diese Viren einen hohen
Grad an Speciesspezifität
zeigen. Daher wurde die über
Antikörper
verlaufende Virusneutralisation unter Verwendung entweder von In- vitro-Assays oder
von Xenotransplantat-Systemen untersucht, die eine Vermehrung infektiöser Viren
spezifischer HPV-Typen erlauben (1, 2, 5, 6, 24). Die erste Schlussfolgerung,
die aus diesen Versuchen gezogen werden konnte, war, dass die Immunisierung
mit HPV-VLPs eine neutralisierende Immunantwort hervorruft, die überwiegend
typspezifisch ist (6, 7, 34, 35, 36, 48).
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Eine
Kreuzneutralisation zwischen HPV-6 und HPV-11 (92% Identität der Aminosäuresequenz)
(8) und zwischen HPV-16 und HPV-33 (80% Identität der Aminosäuresequenz)
(48) wurde berichtet. Dies kann auf das Vorliegen einer gewissen
Korrelation zwischen Proteinsequenzen und strukturelle Ähnlichkeiten
hinweisen, die möglicherweise
für den
Mechanismus der Kapsidmontage relevant sein könnten. Auf der Basis dieser Überlegungen
ist allerdings das Konzept, dass HPV-6L1- und HPV-16L1-Proteine
eine Comontage zeigen können, nicht
naheliegend, da diese beiden Viren zu phylogenetisch weiter auseinander
liegenden Gruppen gehören (3,
45) und eine geringere Identität
(67%) der L1-Aminosäuresequenz
zeigen.
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Darüber hinaus
scheint, während
Hüllproteine
von zu sehr unterschiedlichen Familien gehörenden Viren in die gleiche
Hülle eingebracht
werden können
(50), die Kombination von Nucleocapsidproteinen erheblich stärker beschränkt zu sein.
Gemischte Corepartikel von Moloney-Murine-Leukämie-Virus (MuLV) und humanem
Immundefizienz-Virus (HIV) wurden erhalten, jedoch nur, wenn künstliche
chimäre
Gag-Vorläufer,
die sowohl HIV- als auch MuLV-Determinanten enthalten, mit Wildtyp-MuLV-Gag-Proteinen coexprimiert
werden (10). Durch Verwendung eines Hefe-Zweihybrid-Systems auf der Basis von
GAL4-Gag-Fusionsprotein-Expressionsplasmiden
konnten Franke et al. zeigen, dass die Fähigkeit von zwei heterologen
Gag-Proteinen zur Multimerisierung mit dem genetischen Verwandtschaftsgrad
zwischen ihnen korreliert war (13).
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Eine
gemischte Kapsidbildung zwischen Wildtyp-Gag-Proteinen wurde bisher nicht berichtet.
Im Fall des Core(C)-Proteins des Hepadnavirus zeigten Chang et al.
(4), dass sich ein Epitop-markiertes
trunkiertes Hepatitis B-Virus (HBV)-C-Polypeptid in Xenopus-Oocyten
mit C-Proteinen von Waldmurmeltier-Hepatitis-Virus (Woodchuck Hepatitis Virus, WHV)
und Erdhörnchen-Hepatitis-Virus (Ground
Squirrel Hepatitis Virus, GSHV) vereinigen konnte, jedoch nicht
mit dem C-Protein von Enten-Hepatitis B-Virus (DHBV). Dieses Ergebnis
war nicht unerwartet, da die beiden Coreproteinsequenzen signifikant
verschieden waren und keine immunologische Kreuzreaktivität zeigen.
Wenn eine Vereinigung von C-Polypeptiden von HBV, WHV und GSHV eintrat,
resultierte die Bildung gemischter Kapside aus der Aggregation unterschiedlicher
Species von Homodimeren (4). Es wurden synthetische HPV16-VLPs beschrieben,
bei denen in bestimmten Bereichen Mutationen eingeführt worden
waren, so dass HPV11-spezifische Antikörper binden (53). Ferner wurden
auch Flock House-Virus-Partikel beschrieben, bei denen heterologe
Aminosäuresequenzen,
die zum Beispiel Epitope aufweisen, in das Kapsidprotein eingeführt worden
waren (54).
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In
einigen Berichten wurde die Bedeutung von Disulfidbindungen für die Integrität von nativen
Rinder-Papillomvirus Typ 1 (Bovine Papillomavirus, BPV-1)-Virionen
(26) und VLP-Strukturen
(25, 38, 39) beschrieben. Von Li et al. (26) wurde ferner gezeigt,
dass die Cystein 424-Mutante (C424) von HPV-11L1 in der carboxyterminalen
Domäne,
die als für
die Kapsidbildung kritisch identifiziert worden war (25), noch befähigt ist,
Kapsomere zu bilden, nicht jedoch VLPs, was darauf hindeutet, dass
dieser Rest an einer Interpentamer-Bindung beteiligt sein kann.
Die essentielle Rolle von Disulfidbindungen wurde durch eine Single-Point-Mutation
von C176 oder C427 in HPV-33L1 (C428 in HPV-18L1) bestätigt, die
sämtliche
VLP-Trimeren in Monomere umwandelt und so die Kapsomerbildung ermöglicht,
nicht jedoch die Vereinigung zum VLP (39).
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Vor
kurzem wurde nachgewiesen, dass unter Verwendung eines In-vitro-Infektionssystems
und eines empfindlichen Assays auf der Basis einer Reverse-Transcriptase-PCR
(RT-PCR) Antiseren gegen HPV-6-VLPs nicht befähigt sind, authentische HPV-16-Virionen
zu neutralisieren (48). Da Cysteinreste, die den oben als bei der
Disulfidbindung beteiligt beschriebenen Disulfidresten entsprechen,
in den HPV-6L1- und HPV-16L1-Proteinen konserviert sind, wurde von
uns die Hypothese aufgestellt, dass Mosaik-VLPs entweder aus einer
intrakapsomeren oder interkapsomeren Assoziierung der beiden Proteine
und/oder aus der Wechselwirkung zwischen typspezifischen Subsets
von Kapsomeren resultieren könnten.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von mosaikartigen Virus-ähnlichen
Partikeln, welche die Kapsidproteine der HPV-Typen 6 und 16 enthalten.
Gemäß einem weiteren
bevorzugten Aspekt sind die Kapsidproteine die Proteine L1 und L2
der HPV-Typen 6 und 16.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und
Wirtszellen zur Expression der Kapsidproteine von mindestens zwei
HPV-Typen. Gemäß einem
bevorzugten Aspekt stammen die Kapsidproteine von den HPV-Typen
6 und 16. Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt sind die Kapsidproteine die Proteine
L1 und L2 von HPV-Typ 6 und HPV-Typ
16. Gemäß einem
weiteren bevorzugten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf einen diploiden Hefestamm, der die Kapsidproteine L1 und L2
von HPV-6 und HPV-16 als Mosaik-VLPs coexprimiert.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
von VLPs, welche die Kapsidproteine der HPV-Typen 6 und 16 enthalten,
zur Induzierung einer Immunantwort. Nach einem weiteren bevorzugten
Aspekt enthalten die Mosaik-VLPs die Kapsidproteine L1 und L2 der
HPV-Typen 6 und 16.
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Gemäß noch einem
weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein immunogenes
Virus-ähnliches
Partikel, das Kapsidproteine von unterschiedlichen HPV-Typen enthält, am meisten
bevorzugt der HPV-Typen 6 und 16. Gemäß einem weiteren bevorzugten
Aspekt enthalten die Mosaik-VLPs die Kapsidproteine L1 und L2 von
HPV Typ 6 und HPV Typ 16.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung des Aufbaus des pBS-6L1-Plasmids.
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2 zeigt
die rekombinante PCR, die beim Aufbau des pBS-6L1-Plasmids durchgeführt wurde.
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3 zeigt eine Western Blot-Analyse von
Zellextrakten von Hefestämmen,
die HPV-6- und HPV-16-Kapsidproteine exprimieren.
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Äquivalente
Mengen der Gesamtzellextrakte aus dem parentalen Stamm JSC310 (Bahnen
1) und verschiedenen rekombinanten Stämmen (Bahnen 2 und 3) wurden
durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, durch Elektrotransfer auf Nitrocellulosefilter übertragen
und mit den typspezifischen H6.C6(a)- oder H16.H5(c)-Anti-L1-Mabs
und mit HPV-6L2(b)- oder HPV-16L2(d)-Antiseren inkubiert. Bahnen
2a und 2c: JSC310-6L1epi; Bahnen 3a und 3c: JSC310-16L1epi; Bahnen 2b
und 2d: JSC310-6L2epi; Bahnen 3b und 3d: JSC310-16L2epi. Die Molekülmassenstandards
(in kDa) sind angegeben. Diese aus mehreren Feldern bestehende Figur
sowie die folgenden Figuren wurden unter Verwendung der Programme
Photoshop 4.0 und FreeHand 7.0 für
Macintosh zusammengestellt.
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4 ist eine schematische Darstellung der
in Hefe vorkommenden integrativen Plasmide und Vektoren YIpAde (a)
und YIpLys-L2 (b). Die durchgezogenen Linien stellen die pUC-Vektorsequenzen
dar. Der mit ade2 markierte Kasten in (a) stellt die Adenin-2-Gensequenz
dar. Die mit lys2 markierten Kästen
in (b) stellen Lysin-2-Genfragmente dar; der mit L2 markierte Kasten
bedeutet das L2-Gen, die übrigen
Kästen
bedeuten den ADH2/GAP-Hybridpromotor und die MFα-Terminationssequenz der Gentranscription.
Der Pfeil in dem Kasten L2 zeigt die 5'-3'-Orientierung
der kodierenden Sequenz an. Die relevanten Restriktionsstellen sind
angegeben.
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5 stellt eine Western Blot-Analyse von
Zellextrakten von rekombinanten haploiden und diploiden Hefestämmen dar.
Die Gesamtzellextrakte wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, durch
Elektrotransfer auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit Anti-HPV-6L1(a)-
und Anti-HPV-16L1(c)-Mabs sowie mit HPV-6L2(b)- und HPV-16L2(d)-Antiseren inkubiert.
Bahnen 1: AB110-6L1/16L2; Bahnen 2: JSC310-16L1/6L2; Bahnen 3: AB/JS-4L;
Bahnen 4: JSC310-6L2epi; Bahnen 5: JSC310-16L2epi. Die Pfeile in
(b) und (d) bezeichnen die Banden, die den L2-Proteinen entsprechen.
Die Molekülmassenstandards
(in kDa) sind angegeben.
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6 zeigt eine Analyse der Fraktionen aus
der CsCl-Gradientensedimentation eines AB/JS-4L-Zellextrakts. (A)
Aliquote der Fraktionen 1 bis 9 wurden auf Nitrocellulosefilter
geblottet, wobei entweder (a und c) denaturierende und reduzierende
(D) oder (b und d) nichtdenaturierende und nichtreduzierende (N)
Bedingungen angewandt wurden. Die Filter wurden mit den typspezifischen
Anti-L1-H6.C6(a)-
und Anti-L1-H16.H5(c)-Mabs sowie mit den konformationsabhängigen typspezifischen
Anti-L1-H6.B10.5(b)- und Anti-L1-H16.V5(d)-Mabs
inkubiert. Als Kontrolle wurden die konformationellen Anti-HPV-6-L1-
und Anti-HPV-16-L1-Mabs mit CsCl-gereinigten VLPs (e), die unter
denaturierenden oder unter nichtdenaturierenden Bedingungen geblottet
worden waren, inkubiert. Die Pfeile in A bezeichnen die Fraktion
No. 5. (B) Aliquote der Fraktion No. 5 wurden der SDS-PAGE unterzogen,
auf Nitrocellulosefilter elektrogeblottet und mit HPV-6L2-Antiserum
(Bahn 3a) oder HPV-16L2-Antiserum (Bahn 3b) inkubiert. Als Kontrolle
wurden Gesamtzellextrakte der Stämme
JSC310-6L2epi (Bahnen 1) und JSC310-16L2epi (Bahnen 2) verwendet.
Die Molekülmassenstandards
(in kDa) sind angegeben. Die Pfeile bezeichnen Banden, die den L2-Proteinen
entsprechen.
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7 zeigt eine elektronenmikroskopische
(EM) Analyse von CsCl-gereinigten VLPs. Die VLPs HPV-6 (a), HPV-16
(b) und HPV-6/16 wurden auf Formvar-Kohlenstoff-beschichteten Netzchen
adsorbiert, mit 4% Uranylacetat gefärbt und mit einem Elektronenmikroskop
Zeiss EM10C bei einer Vergrößerung von 100000
untersucht (Strich = 100 nm).
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8 zeigt eine Western Blot-Analyse von
immunpräzipitierten
VLPs. CsCl-gereinigte VLPs des diploiden Stamms AB/JS-4L wurden
mit dem konformationsabhängigen
Anti-HPV-6L1-H6.B10.5-Mab immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten
Proteine wurden unter Verwendung eines 15 Zentimeter (cm) langen
10% Polyacrylamid-SDS-Gels
getrennt, auf eine Nitrocellulosemembran elektrogeblottet und mit
dem spezifischen Anti-HPV-6L1-H6.C6-Mab (a) oder mit dem spezifischen
Anti-HPV-16L1-H16.H5-Mab (b) inkubiert. Kontrollreaktionen unter
Verwendung von entweder lediglich den VLPs oder lediglich des konformationellen
Mabs wurden angesetzt und unter identischen Versuchsbedingungen
durchgeführt.
Bahn 1: VLPs, die über
Nacht ohne den Mab inkubiert wurden; Bahn 2: über Nacht inkubierter Mab;
Bahn 3: VLPs, die über
Nacht mit dem konformationellen H6.B10.5-Mab inkubiert wurden; Bahn
4: Gesamtzellextrakt aus dem Stamm JSC310-6L1epi; Bahn 5: Gesamtzellextrakt
des Stamms JSC310-16L1epi. Die Pfeile bezeichnen eine konformationelle, Mab-bezogene
Bande (A), die L1-Banden (B) und eine Bande von Protein A-Sepharose
(C).
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9 zeigt eine Charakterisierung von Seren,
die von Mäusen
stammten, die mit HPV-6, HPV-16 und Mosaik-VLPs immunisiert worden
waren. (A) Vergleichbare Mengen von HPV-6-VLPs (Bahnen 1), HPV-16-VLPs
(Bahnen 2) und von Mosaik-VLPs (Bahnen 3) wurden an SDS-PAGE getrennt
und mit Antiseren von Mäusen
immungeblottet, die mit HPV-6-VLPs (a), HPV-16-VLPs (b) und Mosaik-VLPs
(c) immunisiert worden waren. (B) Vergleichbare Mengen von HPV-6-
und HPV-16-VLPs wurden unter denaturierenden und reduzierenden Bedingungen
(D) und unter nichtdenaturierenden und nichtreduzierenden Bedingungen
(N) Dot-geblottet
und mit dem S16-Antiserum einer Maus inkubiert, die mit Mosaik-VLPs
immunisiert worden war.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Zum
Testen der Möglichkeit
der Induzierung von Antikörpern
gegen multiple HPV-Typen wurde ein rekombinanter diploider Hefestamm
erzeugt, der die Gene L1 und L2 von HPV-6 und HPV-16 coexprimiert.
Die HPV-6/16-Mosaik-VLPs wurden aus dem Zelllysat gereinigt und
als Antigene zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Die nachstehend
angeführten
Daten bestätigen
die Bildung von Mosaik-VLPs, die alle vier Proteine enthalten. Der
Immunpräzipitationsversuch
ist ein starker Hinweis darauf, dass die CsCl-gereinigten VLPs das Ergebnis
einer reziproken Wechselwirkung der beiden L1-Proteine darstellen
und nicht einfach unterschiedliche VLP-Typen koexistieren. Die Tatsache,
dass die L2-Proteine in den gleichen CsCl-Fraktionen vorliegen, stützt die
Hypothese, dass sie ebenfalls in die VLPs eingeführt wurden, da das L2-Protein
allein in einem CsCl-Gradienten bei der gleichen Dichte wie der
der L1-VLPs keine Bande bildet (22). Ferner wurden Antiseren erhalten,
die befähigt
sind, Konformationsepitope der beiden L1-Proteine zu erkennen. Obgleich
noch zu bestätigen
ist, dass die Immunantwort, die durch HPV-6/16-VLPs hervorgerufen
wird, die beiden Viren zu neutralisieren vermag, stützen die
vorliegenden Daten die Verwendung von Mosaik-VLPs zur Immunisierung
gegen ein breiteres Spektrum von Virustypen.
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Ein
Hefe-Expressionssystem, wie es hier angegeben wurde, ist bevorzugt.
Verschiedene Labors hatten festgestellt, dass ein Expressionssystem
von Saccharomyces cerevisiae erfolgreich zur leichten Reinigung von
PV-VLPs verwendet werden kann (14, 18), die zur Induzierung einer
schützenden
Immunantwort in Tiermodellen hochwirksam sind (20). Hefe-exprimierte
VLPs sind befähigt,
eine spezifische Immunantwort nicht nur auf systemischem Niveau,
sondern auch auf Schleimhautniveau hervorzurufen. Lowe et al. berichteten
die Erzeugung von neutralisierenden IgG-Antikörpern in den Seren und Genitalsekreten
von afrikanischen Meerkatzen, die intramuskulär mit HPV-11-VLPs, die auf
Aluminium-Adjuvans adsorbiert worden waren, immunisiert worden waren
(27). Greer et al. stellten die Induzierung von spezifischen Anti-L1-IgG-
und Anti-L1-IgA-Antikörpern in
den Seren und Genitalsekreten von Mäusen fest, die intranasal mit
HPV-6-VLPs immunisiert worden waren, die entweder mit hitzelabilem
E. coli-Enterotoxin (LT) oder mit einer von LT abgeleiteten nichttoxischen
Mutante als Adjuvans versehen worden waren (14). Die Hefe-Expression
ergibt ferner das Potential zur Gewinnung von Tausenden von Litern
unter relativ niedrigen Kosten; außerdem sind zahlreiche von
Hefen abgeleitete Produkte zur menschlichen Verwendung aufgrund
ihrer Sicherheit bereits auf dem Markt zugelassen.
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Zur
Expression des L1-Gens und des L2-Gens von HPV-6 und HPV-16 in der
gleichen Hefezelle erzeugten wir einen diploiden Stamm von S. cerevisiae
durch Paarung zweier haploider Stämme, die jeweils zwei der vier
Kapsidproteine exprimieren. Zur Erzielung einer Expression der heterologen
Gene unter identischen Kulturbedingungen wurde jedes in die gleiche
Expressionskassette auf der Basis des Glucose-repressiven Hybridpromotors
ADH2/GAP und der TMFα-Transcriptionsterminationssequenz
kloniert. Die L1-Proteine von
HPV-6 und HPV-16 wurden mit Hilfe des episomalen Expressionsvektors
pBS24.1 exprimiert. Andererseits wurde die Expression der L2-Proteine
von HPV-6 und HPV-16 durch Klonieren der Expressionskassette in
ein integratives Plasmid erzielt, das sich zur Insertion in den
lys2-Locus des Genoms des haploiden Stamms eignet (4b).
Als Konsequenz dieser Klonierungsstrategie waren die Kopienzahlen
des L1-Gens und des L2-Gens in den haploiden Stämmen verschieden, was zu höheren Expressionsniveaus
der L1-Proteine führte. Dies
sollte dem Verhältnis
von L1 zu L2 entsprechen, das bei nativen HPV-Virionen beobachtet
wird und das als im Bereich von 5:1 bis 30:1 liegend geschätzt worden
war (25).
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In
Tabelle 1 sind die verwendeten parentalen Hefestämme, die beiden erhaltenen
rekombinanten haploiden Stämme
und der aus der Paarung resultierende diploide Stamm aufgeführt. TABELLE 1.
Liste der
parentalen und rekombinanten Hefestämme mit Gentyp en und exprimierten
H PV-Genen |
Hefestamm | Genotyp | Episomales HPV-Gen | Integriertes HPV-Gen |
JSC310 | MATa
leu2-3 ura3-52 prb1-1122 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15 cir° | | |
AB110 | MATa
leu2-3-112 ura3-52 pep4-3 his4-580 cir° | | |
JSC310-6L1epi | MATa
prb1-1122 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15 cir° | 6L1 | |
JSC310-16L1epi | MATa
prb1-1122 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15cir° | 16L1 | |
JSC310-6L2epi | MATa
prb1-1122 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15 cir° | 6L2 | |
JSC310-16L2epi | MATa
prb1-1122 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15 cir° | 16L2 | |
ISC310-6L2int
6L2 | MATa
leu2-3 ura3-52 prb1-1122 lys2 pep4-3 prc1-407 adr1::DM15 cir° | | |
AB110-16L2int | MATa
leu2-3-112 ura3-52 pep4-3 lys2 his4-580 cir° | | 16L2 |
JSC310-16L1/6L2 6L2 | MATa
prb1-1122 lys2 prc1-407 pep4-3 ade2 adr1::DM15 cir° | 16L1 | |
AB110-6L1/16L2 | MATa
pep4-3 lys2 his4-580 cir° | 6L1 | 16L2 |
AB/JSC-4L
16L2 | MATa/MATa
PRB1/prb1-1122 lys2/lys2 PRC1/prc1-407 pep4-3/pep4-3 HIS4/his4-580
ADR1/adr1::DM15 cir° | 6L1-16L1 | 6L2- |
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Der
hier verwendete Ausdruck "Mosaik-VLP" bezieht sich auf
ein VLP, das Kapsidproteine von mehr als einem Virustyp enthält.
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VLPs,
die aus einer intrakapsomeren und/oder interkapsomeren Assoziierung
der Proteine resultieren, sind darin eingeschlossen.
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Der
hier in Bezug auf Viren verwendete Ausdruck "Typ" schließt Viren
(tierische und pflanzliche) innerhalb der gleichen Familie, der
gleichen Gruppe oder des gleichen Genus sowie Viren in unterschiedlichen
Familien, Gruppen oder Genera ein.
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Der
hier in Bezug auf Vektoren verwendete Ausdruck "nichtintegrativ" bringt zum Ausdruck, dass der Vektor
nicht in die Wirts-DNA integriert wird.
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Hefestämme. Die
verwendeten haploiden Stämme
von Saccharomyces cerevisiae waren JSC310 (MATa, leu2-3, ura3-52,
prb1-1122, pep4-3, prc1-407, adr1::DM15, cir°) (17) und AB110 (MATa, leu2-3-112, ura3-52,
pep4-3, his4-580, cir°)
(43), geliefert von Vicky Hines (Chiron Corporation, Emeryville,
CA, USA). Monoklonale und polyklonale Antikörper. Die monoklonalen Antikörper (Mabs)
H6.C6 und H16.H5, die an den L1-Proteinen von HPV-6 bzw. HPV-16
binden, sowie die Mabs H6.B10.5 und H16.V5, die für intakte
HPV-6- und HPV-16-VLPs
spezifisch sind, wurden von Christensen et al. angegeben (8, 9).
Zur Western Blot-Analyse wurden diese Mabs in einer Verdünnung von
1:3000 und unter Inkubation über
Nacht bei 4°C
eingesetzt. Kaninchen-HPV-16L2-Antiserum war ein Geschenk von Lutz
Gissmann (DKFZ, Heidelberg, Deutschland); die Kaninchen-HPV-6L2-Antiseren
wurden freundlicherweise von Denise Galloway (Fred Hutchinson Cancer
Research Center, Seattle, Washington) und Robert C. Rose (University
of Rochester, NY) zur Verfügung
gestellt. Alle Antiseren wurden in einer Verdünnung von 1:3000–5000 unter
Inkubation über
Nacht bei 4°C
verwendet. Peroxidase-konjugierte
Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper stammten von Biosource
International (Camarillo, CA) und wurden in einer Verdünnung von
1:5000 1,5 h bei Raumtemperatur eingesetzt.
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Beispiel 1
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HPV-typspezifischer Nachweis von in Hefe
exprimierten Kapsidproteinen.
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Es
wurde ein einziger Hefestamm hergestellt, der die vier Kapsidproteine
L1 und L2 von HPV-6 und von HPV-16 exprimieren konnte. Ein notwendiges
Werkzeug zur Erreichung dieses Ziels war die Verfügbarkeit von
Antikörpern,
die spezifisch oder bevorzugt mit dem L1-Protein oder dem L2-Protein
lediglich eines HPV-Typs reagierten. Das L1-Gen und das L2-Gen von
HPV-6 und von HPV-16 wurden in dem episomalen Vektor pBS24.1 kloniert
(vergleiche das untenstehende Beispiel 2) und in dem S. cerevisiae-Stamm
JSC310 exprimiert, um die Typspezifizität der erhältlichen Antikörper zu
testen. 3 zeigt die Ergebnisse einer
Western Blot-Analyse von Gesamtzellextrakten, die von den rekombinanten
Stämmen
hergestellt worden waren, mit spezifischen Anti-HPV-6-L1-Mabs (a)
oder Anti-HPV-16-L1-Mabs (c) und mit HPV-6-L2-Antiseren (b) oder HPV-16-L2-Antiseren
(d) inkubiert worden waren. In allen Fällen wurden HPV-typspezifische
Banden ermittelt, obgleich eine schwache Kreuzreaktivität bei beiden
L2-Antiseren erkennbar war. Während
die Anti-HPV-6-L1-Mabs und die Anti-HPV-16-L1-Mabs Proteine mit
dem erwarteten Molekulargewicht von etwa 55 Kilodalton (kDa) identifizierten,
zeigten die L2-Proteine, wie früher
berichtet worden war (11, 12), eine elektrophoretische Mobilität, die etwa
72 bis 75 kDa entspricht, anstelle des Molekulargewichts von 55
kDa, das auf der Basis ihrer Aminosäuresequenzen vorausgesagt worden
waren.
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Beispiel 2
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Konstruktion von rekombinanten Plasmiden
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DNA-Fragmente,
welche die HPV-Proteine kodieren, wurden aus verfügbaren rekombinanten
Plasmiden entweder durch Verdau mit Restriktionsenzymen oder durch
PCR-Amplifizierung (Expand High Fidelity PCR System, Boehringer
Mannheim) hergestellt; sie wurden unter Verwendung eines DNA-Sequenzierers
von Applied Biosystem (Norvalk, CELLTECH, USA), Model 373, sequenziert.
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Der
episomale Hefe-Expressionsfaktor pBS24.1, ein Hefe-"Shuttle"-Vektor (17 und Philip J. Barr, Chiron
Corporation, Emeryville, CA, USA), der die selektierbaren Gene Leucin
2 (Leu2) und Uracil 3 (Ura3) enthielt, wurde verwendet. In diesem
Fall wurde er durch Verdau eines verfügbaren Plasmids pBS24.1αt6E7 mit BamHI
und SalI hergestellt. Das Plasmid pBS24.1αt6E7 wurde zur Hefe-Expression
des Antigens HPV-6E7 in einer sezernierten Form hergestellt.
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Das
pBS-6L1-Plasmid, welches das HPV-6-L1-Protein unter der Kontrolle
des Glucose-repressiven Alkoholdehydrogenase-2-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase
(ADH2/GAP)-Promotors (J. Shuster, Chiron Corporation, Emeryville,
CA, USA) und der Transcriptionsterminationssequenz des Gens des
Alpha-Faktors vom Paarungstyp (TMFα) exprimiert,
wurde aus dem pBS24.1-Plasmid wie folgt abgeleitet.
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Das
Plasmid pBS-6L1 ist ein Hefe-Expressionsvektor, der das HPV-6L1-Gen
enthält,
das unter der Kontrolle des ADH2/GAP-Promotors in die BamHI- und SalI-Stellen
des Vektors pBS24.1 kloniert wurde. Der Vektor pBS24.1 enthält den Alpha-Faktor- Terminator; daher
wird eine "Expressionskassette" für HPV-6L1
erhalten. Die "Expressionskassette" für HPV-6L1
besteht aus den folgenden fusionierten Sequenzen (von 5' zu 3'): ADH2/GAP-Hybridpromotor, HPV-6L1-Gen
und Alpha-Faktor-Terminator. Am Ende der Klonierungsprozeduren wurde
die obige "Expressionskassette" im pBS24.1 (17)
erhalten. Der Vektor pBS24.1 kann sowohl in Escherichia coli als
auch in Saccharomyces cerevisiae repliziert werden, da er pBR322-Sequenzen
(einschließlich
des Replikationsursprungs und des Ampicillinresistenz-Gens) und
die kompletten 2μ-Sequenzen (einschließlich des
Replikationsursprungs) enthält.
Es enthält
ferner das Hefe-URA3-Gen und das Hefe-LEU2-Gen.
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Eine
Zusammenfassung der Konstruktion des Plasmids pBS24.1-A/G-6L1 ist
in 1 schematisch dargestellt. Aufgrund des Fehlens
geeigneter Restriktionsstellen wurde die Fusionierung zwischen dem
Glucose-repressiven ADH2/GAP-Promotor und dem L1-ORF durch rekombinante
PCR erzielt. Das 1–563 bp-Segment
des Hybridpromotors (Länge
1113 bp) ist von dem Plasmid GAGαt6E7
abgeleitet, während
das 564–1113
bp-Segment aus der PCR-Amplifizierung
des Gga-Plasmids abgeleitet ist (siehe unten). Das 1–115 bp-Segment
der L1-Sequenz (Länge
1503 bp) ist von der PCR-Amplifizierung
des Plasmids pAcC13-6L1 abgeleitet (Greer et al., J. Clin. Microbiology,
(1995), 2058–2063,
und Munemitsu et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 5977–5982),
während
das 116–1503
bp-Segment direkt vom Plasmid pAcC13-6L1 abgeleitet ist. Die DNA-Sequenz
von HPV-6 ist in Schwarz et al., EMBO J., 2 (1983), 2341–2348, angegeben.
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Das
Plasmid GAGαt6E7
ist ein Derivat des Vektors pGEM-3z (Promega), in dem die folgende
Sequenz konstruiert wurde (von 5' nach
3'): ADH2/GAP-Promotor,
eine vom Alpha-Faktor abgeleitete Leader-Sequenz und die HPV-6E7 kodierende Sequenz.
Das Plasmid GAGαt6E7 wurde
mit BclI und XbaI gespalten. Die von DH5α abgeleitete Plasmid-DNA konnte mit BclI
nicht geschnitten werden, da die DH5α-Zellen dam+ sind; das Enzym
BclI wird durch überlappende
dam-Methylierung inhibiert; zur Herstellung einer durch BclI spaltbaren
DNA wurde das Plasmid in die dam-JM110-Zellen von E. coli transformiert
(Stratagene). Das von JM110 abgeleitete Plasmid wurde mit BclI und
XbaI gespalten; das Fragment, das den Vektor und die 5'-Hälfte des ADH2/GAP-Promotors enthielt,
wurde einer Gelreinigung unterzogen und zur weiteren Ligasierung
beiseitegestellt.
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Das
Plasmid pAcC13-6L1 wurde mit XbaI gespalten; das Insert wurde der
Gelreinigung unterzogen und zur Ligasierung beiseitegestellt. Das
XbaI-Insert bestand in der L1-Sequenz von bp 115 bis zum Ende der Sequenz,
einschließlich
des Stoppcodons.
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Die
rekombinante PCR ist schematisch in 2 dargestellt.
Die Sequenzen der Primer sind nachstehend aufgeführt.
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Eine
erste PCR wurde unter Verwendung der Primer RP5 und RP6 und der
Gga-Plasmid-DNA als Matrize durchgeführt. Das Plasmid Gga ist ein
Derivat des Plasmids pGEM-3z, das im Kontext der vorstehenden Prozeduren
für die
HPV-6E7-Klonierung in Hefe erhalten wurde und den ADH2/GAP-Promotor
enthält.
Zielsetzung dieser ersten PCR war es, den 563–1113 bp-Abschnitt (3'-Hälfte) des
ADH2/GAP-Promotors zu erzeugen. Der Primer RP5 überlappte eine BclI-Stelle.
Eine zweite PCR wurde unter Verwendung der Primer RP7 und RP8 und
des Plasmids pAcC6L1 (Greer et al., 1995) als Matrize durchgeführt. Zielsetzung
dieser zweiten PCR war es, das 5'-Ende
der L1-Sequenz vom Initiierungscodon bis zu bp 543 zu amplifizieren.
Das amplifizierte Fragment enthielt eine XbaI-Stelle in Position
115. Die Primer RP6 und RP7 waren so ausgelegt, dass das 3'-Ende des Produkts
der ersten PCR mit dem 5'-Ende
des Produkts der zweiten PCR verbunden wurde. Durch Mischen des
ersten und des zweitens Amplimers und der externen Primer RP5 und
RP8 wurde eine dritte PCR durchgeführt. Während dieser PCR trat eine
Verbindung zwischen dem ersten und dem zweiten Amplimer ein und
ferner eine Amplifizierung des verbundenen Produkts.
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Es
war vorauszusagen, dass das erwartete Produkt der dritten PCR mit
1126 bp aus der Sequenz 563–1113
(3'-Hälfte) des
ADH2/GAP-Promotors, der mit der Sequenz 1–530 (5'-Ende) des HPV-6L1-ORF verbunden ist,
besteht. Das abschließende
PCR-Produkt sollte
eine BclI-Stelle am 5'-Ende
und eine XbaI-Stelle im L1-Bereich der Sequenz in Position 115 aufweisen.
Das dritte PCR-Produkt
wurde einem Verdau mit BclI und XbaI unterzogen und an einem Gel
gereinigt. Das Fragment, das den Vektor pGEM-3z und the 5'-Hälfte des
Promotors enthält
und aus dem Verdau durch BclI-XbaI des Plasmids GAGαt6E7 stammte,
wurde mit dem mit BclI-XbaI gespaltenen Produkt der rekombinanten
PCR und dem aus dem XbaI-Verdau des Plasmids pAcC13-6L1 stammenden
L1-Insert ligasiert.
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Nach
der Transformierung in DH5α-Zellen
wurden mehrere Transformanten erhalten. Die Miniprep-DNAs von 14
Transformanten wurden unter Verwendung von EcoRI gespalten. Das
Enzym EcoRI wurde gewählt,
da es durch Verwendung dieses Enzyms möglich war, sowohl die erwarteten
Molekülgrößen als
auch die korrekte Orientierung des 6L1-Fragments zu verifizieren.
Das 6L1-Fragment hatte identische Enden (wie etwa XbaI), so dass
die Wahrscheinlichkeit dafür,
dass das Fragment eine entgegengesetzte Orientierung annimmt, 50%
beträgt.
Durch Verwendung von EcoRI sollte die Plasmid-DNA der richtigen
Klone zwei Fragmente liefern, die 2600 und 2700 bp lang sind. Die
Miniprep-DNA des Klons No. 8 ergab auf einem ersten Gel eine einzige
Bande; durch stärkeres
Laufenlassen des Gels war es möglich,
die Fragmente 2600 und 2700 bp aufzulösen. Auch unter Verwendung
von SphI war es möglich,
einen weiteren Hinweis darauf zu gewinnen, dass der Klon No. 8 gut
war. Somit wurde angenommen, dass der Klon No. 8 das korrekte Plasmid
pGAG-6L1 enthielt, das in dem Vektor pGEM-3z besteht, der die HPV-6L1-Sequenz
unter der Kontrolle des ADH2/GAP-Promotors enthält.
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Das
ADH2/GAP-HPV-6L1-Insert wurde durch Verdau mit BamHI und SalI aus
dem aus dem Plasmid pGAG-6L1 herausgeschnitten; das Insert wurde
an einem Gel gereinigt und zur weiteren Ligasierung beiseitegestellt.
Das Promotor-L1-Fragment und der Vektor pBS24.1 wurden ligasiert,
und das Reaktionsprodukt wurde in DH5α-Zellen transformiert. Die Miniprep-DNAs
von 5 Transformanten wurden durch Spaltung mit BamHI und SalI analysiert;
die Klone A, B, C und E wurden als gute Klone selektioniert, die
das richtige Molekulargewichtsmuster zeigten.
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Ein
Klon wurde durch Elektroporation in den Stamm JSC310 von Saccharomyces
cerevisiae transformiert; die Zellen wurden auf URA-Platten plattiert.
Ausgewählte
Transformanten wurden aus den URA-Platten entnommen und auf LEU-Platten
aufgestrichen. Einzelne Kolonien von den LEU-Platten wurden in LEU-Medium
inokuliert. Vier in dem LEU-Medium gewachsene Klone wurden in YEPD-Medium
reinokuliert. Zellpellets von den vier JSC310-6L1-Klonen A, B, C und
D wurden nach 24 und 48 Stunden Wachstum in YEPD-Medium zur Überprüfung der
Expression des Proteins L1 auf –20°C gefroren.
Glycerinansätze
der vier Klone wurden bei –80°C gelagert.
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Die
Pellets der 6L1-Hefezellen wurden über Glaskügelchen extrahiert; lösliche und
unlösliche
Extrakte wurden durch Zentrifugieren getrennt und für die SDS-PAGE-Analyse
vorbereitet. Als Negativkontrolle wurden ferner Extrakte von einem
Stamm hergestellt, der das Plasmid pBS-6L1 nicht enthielt (mit dem
Vektor pAB24 transformierte JSC310-Zellen). In mit Coomassie-Blau
gefärbtem
Gel sowie im Western-Immunoblot war eine induzierte Bande sichtbar,
die das erwartete Molekulargewicht aufwies. Ein Vergleich des in
dem Hefestamm JSC310 exprimierten HPV-6L1 mit dem in Insektenzellen
exprimierten gleichen Antigen zeigte, dass die beiden Antigene gleiches
Molekulargewicht besitzen.
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Der
DNA-Abschnitt des aus der rekombinanten PCR abgeleiteten L1-Gens
(bp 1–115)
wurde unter Verwendung des folgenden Primers sequenziert:
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Der
Primer erzeugte die Verbindung am 3'-Ende des Promotors ADH2/GAP in Position –37 vom L1-Startcodon.
Das Plasmid pGAG-6L1 (pGEM-3z, das den mit der L1-Sequenz verschmolzenen
Promotor ADH2/GAP enthält)
wurde als Matrize verwendet. Durch Sequenzierung wurde sichergestellt,
dass weder bei den Manipulationen der rekombinanten PCR noch in
den Klonierungsschritten Fehler eintraten.
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Zur
Konstruktion des integrativen Plasmids VIpAde wurde ein genomisches
DNA-Fragment XbaI mit 1059 bp des Adenin2-Gens von S. cerevisiae
(Ade2) unter Verwendung des PCR-Oligonucleotidprimers 5'AdeE (5'-GCGGCGAATTCTAGAACAGTTGGTATATTAG-3' SEQ ID NO: 5, der
eine EcoRI-Stelle einfügt) und
des PCR-Oligonucleotidprimers 3'AdeP
(5'GCGGCCTGCAGGGTCTAGACTCTTTTCCATATA-3' SEQ ID NO: 6, der
eine PstI-Stelle einfügt)
amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in das Plasmid pUC8 kloniert,
das mit EcoRI und PstI gespalten wurde; die XbaI-Stellen, die im
amplifizierten DNA-Fragment
enthalten waren, wurden dazu verwendet, das Insert zur Hefetransformation
herauszuschneiden. Zur Herstellung des integrativen Expressionsplasmids
YIpLys-L2 wurde ein genomisches DNA-Fragment von 1318 bp des Lysin2-Gens
(Lys2) von S. cerevisiae amplifiziert, wobei die PCR-Oligonucleotidprimer
5'LysE (5'-GCGGAATTCCACTAGTAATTACA-3' SEQ ID NO: 7, der
eine EcoRI-Stelle einfügt)
und 3'LysH (5'-GATGTAAGCTTCTACTAGTTGA-3' SEQ ID NO: 8, der
eine HindIII-Stelle einfügt)
verwendet wurden. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde dann in pUC8
eingefügt
(Derivate leicht im Handel erhältlich,
z. B. von Promega), das mit EcoRI und HindIII gespalten wurde, wodurch
ein Plasmid erhalten wurde, das als YIpLys bezeichnet wurde. Ein
BamHI-DNA-Fragment des Vektors pSI3 (Isabel Zaror, Chiron Corporation,
Emeryville, CA, USA, Grundsequenz pBR322, Promotor ADH2/GAP, Protein
SOD und TMFα),
das den Promotor ADH2/GAP, das Gen der humanen Superoxiddismutase
(SOD) und die Transcriptions terminationssequenz TMFα enthielt,
wurde in die einzige BglII-Restriktionsstelle
in der Sequenz des Lys2-Gens von YIpLys kloniert, wodurch ein als
YIpLys-SOD bezeichnetes Plasmid erhalten wurde. Das Plasmid YIpLys-6L2
wurde von YIpLys-SOD abgeleitet, indem das NcoI-SalI-DNA-Fragment,
welches das SOD-Gen kodiert, durch das DNA-Fragment NcoI-SalI von pGEM3z-6L2
(Kent Thudium, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA), das den
offenen Leserahmen (ORF) von HPV-6bL2 kodiert, ersetzt wurde. Zur
Konstruktion des Plasmids YIpLys-16L2 wurde das Gen L2 aus der klonierten
genomischen HPV-16-DNA (in diesem Fall von Dennis J. McCance, University
of Rochester, NY, freundlicherweise zur Verfügung gestellt) unter Verwendung
des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-5'L2 (5'-CGACACAAACGTTCTGCAA-3' SEQ ID NO: 9) und
des PCR-Oligonucleotidprimers DT-3'L2 (5'-ATTAGTCGACCTAGGCAGCCAAGAGACATC-3' SEQ ID NO: 10),
der das Translationsterminationscodon und eine SalI-Stelle enthält, amplifiziert.
Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit SalI gespalten und in YIpLys-SOD
kloniert, aus dem die SOD kodierende Sequenz durch Verdau mit NcoI,
Verfüllen
mit Klenow-Enzym und Verdau mit SalI entfernt worden war.
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Die
episomalen Expressionsplasmide pBS-6L2 und pBS-16L2 wurden durch
Ersatz eines SacI-SalI-DNA-Fragments von pBS-6L1, das einen Teil
des ADH2/GAP-Promotors und den ganzen HPV-6bL1-ORF enthält, durch SacI-SalI-DNA-Fragmente,
die entweder von YIpLys-6L2 oder YIpLys-16L2 abgeleitet waren und
den entsprechenden Promotorabschnitt und den L2-ORF enthielten,
hergestellt.
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Zur
Konstruktion des episomalen Expressionsplasmids pBS-16L1 wurde das L1-Gen
aus klonierter genomischer HPV-16-DNA unter Verwendung des PCR-Oligonucleotidprimers
DT-5'L1 (5'-TCTCTTGGCTGCCTAGTGAGGCCA-3' SEQ ID NO: 11) und
des PCR-Oligonucleotidprimers DT-3'L1 (5'-CTAGTAATGTCGACTTACAGCTTACGTTTTTTGCG-3' SEQ ID NO: 12),
der das Translationsterminationscodon und eine SalI-Stelle enthält, amplifiziert.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Agarosegel gereinigt und
in pSI3-Vektor mit glatten Enden kloniert, aus dem zuvor das SOD-Gen
durch Verdau mit den Restriktionsenzymen NcoI und SalI entfernt
und danach mit Klenow-Enzym
aufgefüllt
worden war. Aus diesem intermediären
Konstrukt wurde ein SacI-SalI-DNA-Fragment, das einen Teil des Promotors
ADH2/GAP und den HPV-16L1-ORF enthielt, gereinigt und zum Ersatz
des entsprechenden SacI-SalI-DNA-Fragments in pBS-6L1 verwendet.
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Beispiel 3
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Erzeugung von rekombinanten Hefestämmen
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Die
Stämme
JSC310-6L1epi (14), JSC310-16L1epi, JSC310-6L2epi und JSC310-16L2epi, welche die vier
Kapsidproteine über
episomale Vektoren exprimieren, wurden durch Transformation des
parentalen Stamms. JSC310 mit den Expressionsplasmiden pBS-6L1 (14), pBS-16L1,
pBS-6L2 und pBS-16L2 hergestellt.
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Die
Stämme
JSC310-6L2int und AB110-16L2int wurden unter Anwendung des folgenden
Versuchsansatzes hergestellt. Kompetente Hefezellen wurden mit 5 μg des integrativen
Plasmids YIpLys-6L2 oder YIpLys-16L2, die mit EcoRI-HindIII gespalten
worden waren, und 1 μg
episomalem Vektor pBS24.1 co-transformiert,
um eine Selektion von Transformanten zu ermöglichen. Die verschiedenen
Klone wurden auf Platten mit Minimalmedium (MM), das mit α-Adipat ergänzt war,
auf Wachstum getestet, um Mutanten mit einem inaktivierten Lys2-Gen
zu selektieren (49). Eine korrekte Integration in den Lys2-Locus
wurde durch PCR-Analyse verifiziert, wobei Paare von Oligonucleotidprimern
verwendet wurden, die komplementär
zu den Sequenzen innerhalb der Expressionskassette und dem Genomabschnitt
des Lys2-Gens waren. Von den Kolonien, die das Protein L2 exprimierten,
wurde eine ausgewählt,
mit dem Plasmid pBS24.1 behandelt und auf seine Unfähigkeit
getestet, in Abwesenheit von Uracil und Leucin zu wachsen. Die Einführung des
episomalen, L1 exprimierenden Vektors in diese Stämme wurde
nach zwei unterschiedlichen Strategien vorgenommen. AB110-16L2int
wurde mit dem Expressionsplasmid pBS-6L1 transformiert; die Selektion
von Transformanten auf MM-Platten ohne Leucin und Uracil erlaubten
die Isolierung des haploiden Stamms AB110-6L1/16L2. Auf der anderen
Seite wurde der Stamm JSC310-6L2int mit dem Expressionsvektor pBS-16L1
und mit dem integrativen Plasmid YIpAde, das mit XbaI gespalten
worden war, co-transformiert. Die auf selektiven Platten gewachsenen
Transformanten wurden auf vollständiges
Hefeextrakt-Pepton-Medium
(YEP) plattiert und 3–4 Tage
bei 30°C
wachsen gelassen, bis Kolonien (1–2%) aufgrund der Disruption
des ade2-Locus eine rote Färbung
entwickelten (52). Einer der Klone, die aufgrund der PCR und der
Expression von L1 und L2 nach Western Blot-Analyse eine korrekte
Integration in den ade2-Locus zeigte, wurde als JSC310-16L1/6L2
bezeichnet.
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Die
Erzeugung des diploiden Stamms AB/JSC-4L wurde durch gemischte Kultivierung
der beiden haploiden Stämme
AB110-6L1/16L2 und JSC310-16L1/6L2 in YEP-Medium mit Gehalt von
5% Glucose erhalten. Die Selektion des diploiden Stamms AB/JSC-4L
erforderte einen zusätzlichen
genetischen Marker in dem haploiden Stamm JSC310-6L2int. Dies wurde
durch Inaktivierung des endogenen Gens Ade2 mit dem in 4a dargestellten
Integrationsplasmid erzielt. Diploide Zellen wurden auf MM-Platten
selektiert, die kein Histidin und kein Adenin enthielten.
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Die
Expression der vier Proteine in den haploiden Stämmen und in dem aus ihrer Paarung
resultierenden Stamm wurde durch Western Blot-Analyse ermittelt. 5 zeigt die Ergebnisse solcher Versuche,
die zeigen, dass sowohl die haploiden Stämme AB110-6L1/16L2 (a und d, Bahnen 1) als auch
JSC310-16L1/6L2 (b und c, Bahnen 2) die heterologen Gene exprimierten,
sowie, dass die Expression sämtlicher
vier Proteine bei dem resultierenden diploiden Stamm AB/JS-4L (a,
b, c und d, Bahnen 3) stabil aufrechterhalten blieb.
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Beispiel 4
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Herstellung von VLPs
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Parentale
Hefestämme
wurden in vollständigem
YEP-Medium wachsen gelassen. Mit episomalen Vektoren transformierte
Stämme
wurden zuerst in MM-Medium ohne Leucin mit 4% Glucose kultiviert,
bis sie die Midlog-Phase erreichten. Die Expression der Gene unter
der Kontrolle des Glucose-repressiven Promotors ADH2/GAP wurde durch
1:50-Verdünnung
in vollständigem
YEP-Medium und Kultivieren
der Zellen während 2–3 Tagen
bei 30°C
induziert. Gesamtzellextrakte wurden von den Hefezellkulturen, die
bis zu einer optischen Dichte (OD) von etwa OD600 =
20 kultiviert worden waren, bei einer optischen Dichte von 3,5 erzeugt.
Die Zellen wurden durch 10 min Inkubieren auf Eis in 0,24 N NaOH
und 0,96% β-Mercaptoethanol
lysiert und anschließend
mit Trichloressigsäure
(TCA) ausgefällt
und mit eiskaltem Aceton gewaschen, worauf das Proteinpellet schließlich in
100 μl Proteinloading-Puffer
suspendiert wurde. Zur Durchführung
von Dot Blot-Experimenten, bei denen die Beibehaltung der L1-Konformation
erforderlich war, wurden die Hefezellen gesammelt, gewaschen, in
Phosphat-gepufferter Salzlösung
(PBS, pH 7,5) suspendiert und durch fünfmalige Behandlung in einem
Vortex-Gerät
für 1 min
in Gegenwart von Glaskügelchen
(425–600 μm Sigma)
aufgebrochen.
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Gefrorene
Hefezellpellets wurden in einem Puffer aufgetaut, der 0,1 M Tris-HCl
(pH 7,5), 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl2 und 1
mM EGTA (#E3889, Sigma Chemical Co.) und CompleteTMProtease
Inhibitors (#1-697-498, Boehringer Mannheim) enthielt. Die Zellen
wurden durch zweimal 10 min Behandlung in einem Vortex-Gerät, mit einem
5 min-Intervall auf Eis, in Gegenwart von Glaskügelchen (0,5 ml Kügelchen
pro ml der Zellsuspension) unter Verwendung eines VWR-Multi-Tube-Vortexers
(VWR Scientific Product) aufgebrochen. Die Zellbruchstücke wurden
durch 20 min Zentrifugieren bei 2000 g abgetrennt. Die Überstände wurden
dann durch ein 40-%-iges (G/G) Sucrosekissen zentrifugiert (2 Stunden
Zentrifugieren bei 100000 g). Die resultierenden Pellets wurden
in PBS suspendiert, auf einen vorgebildeten CsCl-Gradienten (1,17–1,57 g/ml)
aufgegeben und 24 Stunden bei 285000 g zentrifugiert. Die Gradienten
wurden fraktioniert; Aliquote jeder Fraktion wurden der Western
Blot-Analyse mit typspezifischen Anti-L1- und Anti-L2-Antikörpern unterzogen.
Die Peakfraktionen wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert. Die
Gesamtproteinkonzentration wurde mit dem BCATM Protein Assay Reagent
(#23225, Pierce Chemicals) bestimmt.
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Beispiel 5
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Charakterisierung von VLPs
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Die
Proteine wurden durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese
mit Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE, 10 Polyacrylamid) und Western
Blotting auf eine Nitrocellulosemembran (Porengröße 0,45 μm, MSI, Westborough, MA, USA)
nach Standardprotokollen analysiert. Die Dot Blot-Analyse von denaturierten und
reduzierten VLPs wurde durch 5 min Kochen der Proteinproben in Gegenwart
von Dithiothreitol (DTT) vor ihrem Aufbringen auf Nitrocellulosefilter
unter Verwendung eines Bio-Dot-Geräts (Biorad)
durchgeführt.
Wenn die native VLP-Struktur aufrechterhalten werden sollte, wurden
die VLPs in PBS ohne Kochen und in Abwesenheit von DTT auf die Membran
aufgebracht. Die Umsetzung mit HPV-spezifischen Antikörpern wurde
unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting-Reagens
(Amersham) und von Hyperfilm ECL (Amersham) erfasst.
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Im
Einzelnen wurde der Zellextrakt des diploiden Stamms der CsCl-Gradientensedimentation
unterzogen, und Aliquote der gesammelten Fraktionen wurden in Gegenwart
von DTT gekocht und doppelt auf Nitrocellulosefilter aufgeblottet.
Die Filter wurden mit spezifischen Anti-HPV-6-Mabs und Anti-HPV-16-Mabs
inkubiert, die mit denaturiertem L1 reagieren (8, 9), was zeigt,
dass die beiden L1-Proteine in den gleichen Fraktionen angereichert
waren (6A, a und c). Der Dot Blot-Versuch
wurde ohne Denaturierung und ohne Reduzierung der Proteinproben
unter Verwendung der spezifischen Anti-HPV-6L1- und Anti-HPV-16L1-Mabs wiederholt,
von denen früher
angegeben worden war, dass sie ausschließlich mit intakten VLPs in
enzymmarkierten Immunosorbent-Assays (ELISA) reagieren (8, 9). Das
erhaltene Ergebnis bestätigte,
dass die beiden konformationsabhängigen
Mabs befähigt
waren, die in den CsCl-Fraktionen co-gereinigten L1-Proteine zu erkennen
(6A, b und d). Wie erwartet, reagierten die beiden
Mabs spezifisch mit HPV-6- und HPV-16-Kontroll-VLPs lediglich unter
nichtdenaturierenden und nichtreduzierenden Bedingungen (6A,
e). Die Western Blot-Analyse von Fraktion 5 bestätigte, dass sowohl das HPV-6L2-Protein
als auch das HPV-16L2-Protein
vorlagen (6B, a und b). Die Abschätzung des
Brechungsindex des identifizierten Proteinpeaks ergab einen Wert
von 1,29–1,3
mg/ml. Die EM-Analyse der angereicherten Fraktion ergab das Vorliegen
von VLPs, die gleich aussahen wie Kontroll-VLPs, die mit HPV-6L1 oder HPV-16L1
hergestellt worden waren (7).
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Zur
Ermittlung, ob die Proteine HPV-6L1 und HPV-16L1 miteinander Wechselwirken
und sich zu Mosaik-VLPs vereinigen können, wurden Immunpräzipitationsversuche
unter Verwendung der CsCl-aufgereinigten VLPs und des spezifischen,
konformationsabhängigen
Anti-HPV-6L1-Mabs H6.B10.5 (9) durchgeführt. Etwa 1 μg der CsCl-aufgereinigten
VLPs wurden mit PBS verdünnt
und mit dem konformationsabhängigen
Anti-HPV-6L1-Mab
H6.B 10.5 (Verdünnung
1:1000) über
Nacht bei 4°C
unter vorsichtigem Schütteln
inkubiert. Die Immunkomplexe wurden mit Protein A-Sepharose CL-4B
(Pharmacia Biotech) gesammelt, viermal mit 1 ml PBS gewaschen, im
gleichen Puffer suspendiert, 5 min gekocht, der SDS-PAGE unterzogen
und durch Western Blot unter Verwendung von Anti-HPV-6L1- und Anti-HPV-16L1-Mabs analysiert.
Durch Western Blot der Immunpräzipitate
unter Verwendung typspezifischer Anti-L1-Mabs (8)
wurden drei Hauptbanden identifiziert: (A) war eine Mab-abhängige Bande,
da sie auch beobachtet werden konnte, wenn der konformationelle
Mab mit dem Anti-Maus-Antikörper
immungeblottet wurde; (B) war eine Bande, die nur dann auftrat,
wenn die VLPs mit dem konformationellen Anti-HPV-6L1-Mab inkubiert
wurden (Bahnen 3), der spezifisch immunpräzipitierte Proteine mit einer
elektrophoretischen Mobilität
identifiziert, die der von HPV-6L1 (a, Bahn 4) und HPV-16L1 (b,
Bahn 5) entspricht; (C) war eine Harz-abhängige
Bande, die auch erfasst wurde, wenn ein Aliquot von Protein A-Sepharose
in PBS suspendiert und mit dem Anti-Maus-Antikörper immungeblottet wurde. Die
Banden (B) waren nicht erkennbar, wenn die Immunpräzipitation
unter Verwendung eines nichtzugehörigen Mabs durchgeführt wurde.
In ähnlicher
Weise konnte HPV-16L1 nicht erfasst werden, wenn HPV-6- und HPV-16-VLPs gemischt und
immunpräzipitiert
wurden.
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Beispiel 6
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Immunisierung von Mäusen mit VLPs.
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Zur
Untersuchung, ob HPV-6/16-Mosaik-VLPs befähigt sind, eine gegen beide
HPV-Typen gerichtete Immunantwort zu induzieren, wurden Gruppen
von Mäusen
mit HPV-6-VLPs, HPV-16-VLPs
und Mosaik-VLPs subcutan immunisiert, und die Seren wurden nach
der dritten Immunisierung getestet. Sechs Wochen alte weibliche
Balb/c-Mäuse
erhielten durch subcutane Injektion 20 μg der folgenden gereinigten
Antigene: (i) HPV-6-VLPs, (ii) HPV-16-VLPs, (iii) HPV-6/16-VLPs. Sämtliche
Antigene wurden mit dem gleichen Volumen MF59-Adjuvans (30) verabreicht.
Eine Gruppe von Kontrollmäusen
erhielt lediglich Injektionen mit MF59. Die Mäuse wurden mit 15 μg des entsprechenden
Antigens bei Woche 3 und mit 10 μg
bei Woche 5 geboostet. Die Serumproben wurden am Tag 12 nach dem
letzten Boosten gesammelt und auf Kapsidprotein-spezifische Antikörper geprüft.
-
9A zeigt
das Ergebnis des Western Blots, der mit den drei Typen von denaturierten
VLPs durchgeführt
wurde, die mit drei Seren inkubiert worden waren, die jeweils für die verschiedenen
Gruppen der immunisierten Mäuse
repräsentativ
waren. Während
die Reaktivität
der Seren von den entweder mit HPV-6-VLPs oder HPV-16-VLPs immunisierten
Mäuse überwiegend
typspezifisch war (9A, a und b), reagierte das
Serum von Maus 16 (S16), die mit HPV-6/16-VLPs immunisiert worden
war, sowohl mit HPV-6L1 als auch mit HPV-16L1 (9A,
c). Zur Analyse, ob die Immunantwort auch gegen konformationelle
Epitope der L1-Proteine gerichtet war, wurden gleiche Mengen von
HPV-6-VLPs oder HPV-16-VLPs unter denaturierenden und nichtdenaturierenden
Bedingungen geblottet und mit dem S16-Antiserum inkubiert. 9B zeigt,
dass das Signal signifikant niedriger war, wenn die Proben denaturiert
und reduziert waren, was nahelegt, dass konformationelle Antikörper induziert
worden waren.
-
Die
vorstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind
nicht so aufzufassen, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise
einschränken.
Fachleute sind in der Lage, Modifizierungen zu erkennen, die innerhalb
des Konzepts und des Umfangs der Erfindung liegen. Sämtliche
hier zitierten Referenzen werden in ihrer Gesamtheit hiermit in
Bezug genommen.
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