DE69711649T2

DE69711649T2 - P1, p4-dithio-p2,p3-monochloromethylen 5',5'''-diadenosin-p1,p4-tetraphosphat verwendet als anti-thrombose mittel

Info

Publication number: DE69711649T2
Application number: DE69711649T
Authority: DE
Inventors: Samuel W. Chan; Byung K. Kim; Paul C. Zamecnik
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-05-02
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: EP0927038A4; JP4212114B2; EP0927038B1; DE69711649D1; CA2252862A1; WO1997040840A1; US5681823A; CN1112930C; AU2823097A; CN1220606A; EP0927038A1; JP2000509397A

Description

Hintergrund der Erfindung

Gerinnselbildung im Inneren eines Gefäßes ist eine häufige Störung. Eine der häufigsten derartiger Störungen ist die Bildung von Thromben in einem arteriellen Blutgefäß, welche an ihrem Bildungsort verbleiben. Thromben können schwerwiegende nachteilige Auswirkungen auf ein Individuum haben. Beispielsweise kann eine Thrombusbildung in der Herzarterie den Blutfluß einschränken, was zu einem Herzinfarkt (Absterben des Herzmuskels) führt, welcher eine der schwerwiegendsten Formen von Herzattacken ist.
Thrombose in arteriellen Blutgefäßen und medizinischen Prothesen ist gekennzeichnet durch das Anhaften von Plättchen an die beschädigte Gefäßwand oder Oberfläche der Prothese, Freisetzung des Inhalts ihrer Granulen, Synthese von Prostaglandinendoperoxiden und Plättchenaggregation. Das neu gebildete Plättchenaggregat ist ein fragiler Klumpen, ein sogenannter "weißer Thrombus". Das Vorhandensein von Koagulation verursachender Aktivität auf der Oberfläche von aggregierten (aktivierten) Plättchen löst die Bildung eines Fibrinnetzwerks auf dem weißen Thrombus aus und stabilisiert ihn. Verschiedene Antiplättchenmittel wurden über viele Jahre hinweg als potentielle Ziele für nützliche klinische Erfindungen in bezug auf eine Inhibition der Thrombusbildung untersucht. Manche Mittel wie etwa Aspirin und Dipyridamol sind als prophylaktische gerinnungshemmende Mittel zur Verwendung gelangt, und andere waren Gegenstand klinischer Untersuchungen. Bisher haben die wirksamsten Mittel wie etwa Disintegrine, Ticlopidin und dessen Analoga erhebliche Nebenwirkungen, während die verträglicheren Mittel wie etwa Aspirin eine nützliche aber beschränkte Wirksamkeit aufweisen (Hass, W.K. et al., N. Engl. J. Med. 321: 501-507 (1989); Weber, M.A.J. et al., Am. J. Cardiol. 66: 1461- 1468 (1990); Lekstrom, J.A., Beil, W.R., Medicine 70: 161-177 (1991)). Soweit Information verfügbar ist, ist die klinische Wirksamkeit von neueren Arzneimitteln, wie etwa ReoPro (7E3), beeindruckend, aber der Erfolg von Versuchsreihen in der jüngeren Vergangenheit wurde kompliziert, nachdem herausgefunden wurde, daß diese Ansätze mit einem erhöhten Risiko von schweren Blutungen, die manchmal eine Bluttransfusion erfordern, in Zusammenhang stehen (The EPIC Investigators (1994), New Engl. J. Med. 330: 956-961). Somit wurde das ideale "Nutzen/Risiko" Verhältnis (das heißt verbesserte Wirksamkeit gegenüber der von Aspirin verglichen mit der Tendenz, unerwünschte Blutungen hervorzurufen) anscheinend nicht erreicht.
Jüngere Studien über wirksamere und selektivere Verbindungen zur Inhibition der Plättchenaggregation legen einen größeren Nutzen ihrer gerinnungshemmenden Wirksamkeit nahe. Eine Reihe von Studien haben nahegelegt, daß ADP, ein herkömmlicher Agonist, eine Schlüsselrolle bei der Initiation und Progression arterieller Thrombusbildung spielt (Bernat, A. et al., Thromb. Haemost. 70: 812-126 (1993); Maffrand, J.P. et al., Thromb. Haemostas. 59: 225-230 (1988); Herbert, J.M. et al., Arteriosclerosis and Thrombosis 13: 1171-1179 (1993)). Ein wirksamer Inhibitor von ADP-induzierter Plättchenaggregation wäre daher bei der Suche nach gerinnungshemmenden Mitteln von besonderem Interesse. Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß Diadenosin-5',5'''-P¹,P&sup4;-tetraphosphat (AP&sub4;A) ein kompetitiver Inhibitor der ADP-induzierten Plättchenaggregation ist (Zamecnik, P.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2370-2373 (1992); Harrison, M.J. et al., FEBS Lett. 54(1): 57-60 (1975); Luthje, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 118: 704-709 (1984); Chao, F.C. et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 365: 610 (1984)).
Das Dinucleotid AP&sub4;A ist eine ubiquitäre Komponente lebender Zellen (Zamecnik, P. C. und Stephenson, M.L., Regulatory mechanisms for protein synthesis, in: Mammalian Cells, San Pietro, A., Lamborg, M.R. und Kenney, P.C. (Hrsg.), Academic Press, New York, Seiten 3-16 (1967)). AP&sub4;A ist in normalen Humanplättchen in einer höheren Konzentration vorhanden als in jedem anderen Zellkompartment (Flodgaard, M. und Klenow, M., Biochemical Journal 208: 737-742 (1983)). Es wurde angenommen, daß das bevorratete AP&sub4;A metabolisch inert ist, da eine Inkubation von Plättchen mit ³H-Adenosin zu markiertem ATP, aber nicht zu markiertem AP&sub4;A führt. Eine Behandlung von Plättchen mit Thrombin induziert die vollständige Freisetzung von AP&sub4;A zusammen mit anderen Nucleotiden des Vorratspools, umfassend ADP und das Dinucleotid Diadenosin-5',5'''-p¹,p³- triphosphat (AP&sub3;A) (Luthje, J. und Oglivie, A., Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 252-260 (1983)). AP&sub3;A wird im Plasma zu AMP (Adenosinmonophosphat) und ADP (Adenosindiphosphat) hydrolysiert; AP&sub4;A wird zu AMP und ATP (Adenosintriphosphat) abgebaut (Luthje, J. und Oglivie, A., European Journal of Biochemistry 149: 119-127 (1985)).
Die genaue physiologische Rolle von AP&sub4;A wurde nicht definiert, aber es wurde mit einer Reihe von zellulären metabolischen Ereignissen assoziert, Zamecnik, P., Annals of Biochemistry 134: 1-10 (1983). Die ungewöhnlich hohe Konzentration von AP&sub4;A in Plättchen hat zu der Spekulation geführt, daß es eine Rolle in der Physiologie von Plättchen spielt. Plättchen, die stimuliert worden waren um Aggregation einzugehen, zeigen nach Freisetzung von endogenem, in dichten Granulen gespeicherten ADP eine zweite Phase der Aggregation. In vitro Experimente haben gezeigt, daß AP&sub4;A die ADP induzierte Plättchenaggregation kompetitiv inhibiert, wobei eine sofortige Dispergierung von aggregierten Plättchen hervorgerufen wird, sogar wenn die Aggregation zu 60% vollständig abgelaufen ist (Chao, F.C. und Zamecnik, P., Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 365: 610 (1984)). Im Gegensatz dazu verursacht AP&sub3;A eine allmähliche Aggregation von Plättchen, vermutlich über sein Abbauprodukt ADP. Die Aggregationsaktivität von AP&sub3;A durch Zugabe von AP&sub4;A ist unmittelbar reversibel (Luthje, J. und Oglivie, A., Biochem. Biophys. Res. Comm. 118: 704-709 (1984)).
Obwohl der Vorgang einer Thrombusbildung nur unvollständig verstanden ist, wurden zwei Hauptstufen identifiziert: die Aggregation von Plättchen an der Stelle einer Beschädigung eines arteriellen Blutgefäßes und die Bildung von vernetztem Fibrinpolymer, welches das sich entwickelnde Gerinnsel zusammenbindet.
US-Patent Nr. 5,049,550, erteilt am 17. September 1991 an P.C. Zamecnik (hierin nachstehend "Zamecnik '550") beschreibt die Verwendung von AP&sub4;A und AP&sub4;A- Analoga als gerinnungshemmende Mittel, beispielsweise bei der Verhinderung von koronaren und zerebrovaskulären thromboembolischen Ereignissen, und bei der Verhinderung von Thrombose und arteriovenösen Shunts bei Hämodialyse. Das Zamecnik '550-Patent beschreibt auch Verfahren zur Verhinderung einer Thrombusbildung, welche auf der Verhinderung der Plättchenaggregation beruhen, und auf verwandten Zusammensetzungen, die ein AP&sub4;A-Analogum alleine, oder zusammen mit einem Thrombolysemittel enthalten. Insbesondere gibt Zamecnik '550 die inhibitorischen Wirkungen (ID&sub5;&sub0;) von verschiedenen AP&sub4;A-Analoga auf die ADPinduzierte Plättchenaggregation als ein Maß für die gerinnungshemmende Wirkung dieser Mittel an. Der Austausch eines Chlors für ein Fluor im Biphosphonat- Analogum von AP&sub4;A mit einer P-C-P-Brücke in der P&sub2;,P&sub3;-Position schien keine erhebliche Wirkung auf die inhibitorische Aktivität des Analogums in dem Assay auf ADP induzierte Plättchenaggregation zu haben.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³- monochlormethylen-5',5'''-diadenosin-P¹,P&sup4;-tetraphosphat (alternativ hierin als "Thio- CHCl-AP&sub4;A" oder ApspCHClppsA" bezeichnet) eine stärkere inhibitorische Wirkung auf die ADP induzierte Plättchenaggregation hat, verglichen mit den inhibitorischen Wirkungen, welche für die anderen, früher in Zamecnik '550 offenbarten AP&sub4;A- Analoga beobachtet worden waren. Demgemäß betrifft diese Erfindung ApspCHClppsA enthaltende Zusammensetzungen und die Verwendung derartiger Zusammensetzungen bei der Verhinderung von koronarer und zerebrovaskulärer Thrombose und arteriovenösen Shunts bei Hämodialyse und zur Verhinderung von Thrombusbildung. Die Erfindung betrifft weiterhin ApspCHClppsA enthaltende Zusammensetzungen zur therapeutischen Verwendung, alleine oder zusammen mit einem Thrombolysemittel.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine AppsCHClppsA enthaltende Zusammensetzung offenbart. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ApspCHClppsA zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger in einer gerinnungshemmend wirksamen Menge vorhanden. Eine gerinnungshemmend wirksame Menge ist im allgemeinen eine Menge, welche die Plättchenaggregation wirksam inhibiert.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt. Die Zusammensetzung enthält ApspCHClppsA und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung eine Menge an ApspCHClppsA zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger. In der bevorzugten Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung somit derart formuliert, daß sie eine im voraus ausgewählte Menge (z. B. eine Einzeldosis) an ApspCHClppsA zur Verabreichung dem Säuger enthält.
Gemäß einem nochmals anderen Aspekt der Erfindung wird hierin eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ApspCHClppsA zusammen mit einer thrombolytischen Menge mindestens eines Thrombolysemittels offenbart. ApspCHClppsA ist bevorzugt in einer gerinnungshemmend wirksamen Menge in der Zusammensetzung vorhanden. Stärker bevorzugt ist das Thrombolysemittel ausgewählt aus der Gruppe von Mitteln, bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase.
Es werden hierin auch Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger, der einer derartigen Modulation bedarf, offenbart. Die Verfahren umfassen das Verabreichen dem Säuger einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend eine wirksame Menge ApspCHClppsA, um die thrombolytische Wirkung zu modulieren. Gemäß einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung das Auflösen eines Thrombus in dem Säuger. Die wirksame Menge an ApspCHClppsA, welche erforderlich ist um die thrombolytische Wirkung zu modulieren, ist eine gerinnungshemmend wirksame Menge. Bevorzugt wird das ApspCHClppsA dem Säuger zusammen mit einer thrombolytisch wirksamen Menge eines Thrombolysemittels verabreicht. Bevorzugte Thrombolysemittel werden aus der Gruppe, bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase ausgewählt. Wie für den Fachmann leicht ersichtlich sein wird, kann ApspCHClppsA dem Säuger gleichzeitig mit der Verabreichung dem Säuger einer thrombolytisch wirksamen Menge des Thrombolysemittels verabreicht werden, oder nacheinander.
Gemäß einer nochmals anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger eine Inhibition des Wachstums eines Thrombus in dem Säuger. Eine wirksame Menge von ApspCHClppsA, welche erforderlich ist um das Wachstum eines Thrombus zu inhibieren, ist eine zur Inhibition der Plättchenaggregation wirksame Menge oder eine gerinnungshemmend wirksame Menge.
Gemäß einer nochmals anderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in dem Säuger das Verringern (z. B. Verhindern) der Bildung eines Thrombus in dem Säuger. Die Bildung eines Thrombus in einem Säuger kann verringert werden durch Verabreichen dem Säuger einer gerinnungshemmend wirksamen Menge von ApspCHClppsA oder durch Verabreichen einer Menge von ApspCHClppsA, welche zur Inhibition von Plättchenaggregation wirksam ist. Obwohl die Anmelder nicht beabsichtigen, die Erfindung auf einen bestimmten Mechanismus zur Verringerung von Thrombusbildung zu beschränken, wird angenommen, daß die Bildung eines Thrombus in dem Säuger durch Inhibition der Plättchenaggregation verringert wird, und daß die Verabreichung dem Säuger einer wirksamen Menge von ApspCHClppsA die Plättchenaggregation inhibiert, wodurch die Bildung des Thrombus verringert oder verhindert wird.
Gemäß einer nochmals anderen Ausführungsform eines Verfahrens zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger wird dem Säuger eine zur Inhibition der Plättchenaggregation wirksame Menge an ApspCHClppsA verabreicht, um die Plättchenaggregation in vivo zu inhibieren.
Diese und andere Aspekte der Erfindung, sowie verschiedene Vorteile und Nutzen werden unter Bezugnahme auf die ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen besser ersichtlich werden.
Alle in diesem Dokument identifizierten Patente, Patentveröffentlichungen und Literaturstellen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von ApspCHClppsA als gerinnungshemmendes Mittel. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die Verabreichung von ApspCHClppsA einem Säuger die Plättchenaggregation inhibiert und vermutlich dadurch die Thrombosehäufigkeit verringert. Überraschenderweise ist die inhibitorische Wirkung von ApspCHClppsA auf die Plättchenaggregation in vitro beinahe eine Größenordnung höher als die inhibitorische Aktivität von natürlich vorkommendem Ap&sub4;A und signifikant höher als die Aktivitäten bekannter Ap&sub4;A- Analoga (z. B. Verbindung E&sub1;&sub3;, wie in Zamecnik '550 offenbart, die sich von ApspCHClppsA dadurch unterscheidet, daß sie ein Fluor anstelle eines Chlors an der Methylenbrücke aufweist). ApspCHClppsA hat auch eine signifikant höhere inhibitorische Aktivität auf die Plättchenaggregation als die seines entsprechenden nicht-Thio-Gegenstücks (Verbindung E&sub1;&sub0;, wie in Zamecnik '550 offenbart. Siehe auch die Beispiele hierin). Dieser erhebliche Anstieg in inhibitorischer Aktivität auf die Plättchenaggregation konnte auf Basis einer strukturellen Ähnlichkeit zu AP&sub4;A oder bekannten AP&sub4;A-Analoga (deren Strukturen nachstehend angegeben werden) nicht vorhergesagt werden. Beispielsweise zeigt Zamecnik '550 (Tabelle 3), daß die inhibitorische Wirkung (ID&sub5;&sub0;-Wert) für AppCHClppA (Verbindung E&sub1;&sub0;) 3 uM ist, und daß der ID&sub5;&sub0;-Wert für AppCHFppA (Verbindung E&sub5;) 4 uM ist. Somit hatte für diese AP&sub4;A-Analoga der Austausch von Chlor gegen Fluor wenig Wirkung auf die inhibitorische Wirkung der ADP-induzierten Plättchenaggregation. Angesichts dieser Ergebnisse hätte der Fachmann keine erheblich verbesserte inhibitorische Aktivität für die Erfindung im Vergleich zu AP&sub4;A-Analoga aus dem bekannten Stand der Technik erwartet.
Natürlich vorkommendes AP&sub4;A hat die nachfolgende Formel ("Formel I"):
Die Zamecnik '550 Zusammensetzung E&sub5; (abgekürzt AppCHFppA) hat die nachfolgende Formel:
Die Zamecnik '550 Zusammensetzung E&sub1;&sub0; (abgekürzt AppCHClppA) hat die nachfolgende Formel:
Die Zamecnik '550 Zusammensetzung E&sub1;&sub3; (abgekürzt ApspCHFppsA) hat die nachfolgende Formel:
Das neu offenbarte AP&sub4;A-Analogum ApspCHClppsA hat die nachfolgende Formel:
Es wurde gezeigt, daß AP&sub4;A, wenn es einem Säuger verabreicht wird, die ADPinduzierte Plättchenaggregation merklich inhibiert. Bei Zugabe vor oder während der Aggregation schwächt exogenes AP&sub4;A die Sekundärwelle-Reaktion und verursacht eine rasche Dispergierung von aggregierten Plättchen. Es wurde gezeigt, daß die Größenordnung der Inhibition in direkter Relation zu der Dosis an exogenem AP&sub4;A steht. Da Plättchenpfropfen die Hauptmasse von arteriellen Thromben bilden, ist es eine bevorzugte Strategie zur Verhinderung von Thrombose, ein therapeutisches Mittel (z. B. AP&sub4;A) zu verwenden, das die Anhaftung von Plättchen aneinander sowie vermutlich an der Gefäßwand beeinträchtigt. Somit wird in einer Ausführungsform der Erfindung ApspCHClppsA einem Säuger verabreicht, um eine thrombolytische Wirkung in dem Säuger zu modulieren, z. B. um Restenose zu verhindern oder zu inhibieren.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Modulation einer thrombolytischen Wirkung" die Verhinderung oder Verringerung der Thrombosehäufigkeit in einem Säuger, z. B. eine statistische Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Bildung oder des Wachstums eines Thrombus, bezogen auf die Wahrscheinlichkeit von Thrombusbildung/wachstum ohne Verabreichung von Thio-CHCl-AP&sub4;A. Eine Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger umfaßt beispielsweise: (1) ein Erleichtern des Auflösens eines Thrombus in dem Säuger, (2) eine Inhibition des Wachstums eines Thrombus in dem Säuger, (3) eine Verringerung (z. B. Verhinderung) der Bildung eines Thrombus in dem Säuger, und (4) eine Inhibition der Plättchenaggregation in dem Säuger (z. B. bei prophylaktischen Anwendungen, bei denen es erwünscht ist, die Wahrscheinlichkeit einer Thrombusbildung zu verringern).
AP&sub4;A hat sowohl in vivo als auch ex vivo in Kaninchenblut eine kurze Halbwertszeit (Plättchen aus dem Blut von Tieren erhalten, die AP&sub4;A empfangen hatten). Im Vergleich zur in vivo Clearance dauert der ex vivo Zerfall von AP&sub4;A erheblich länger. Dies kann durch die Verwendung von mit Citrat behandeltem Blut erklärt werden, von dem gezeigt worden ist, daß es die Metallionen-abhängige, für den Katabolismus von AP&sub4;A verantwortliche Hydrolase inhibiert (Luthje, J. und Ogilvie, A., European J. Bio. Chem. 149: 119-127 (1995)), und ist konsistent mit der Beobachtung, daß 90% von zu normalem Plasma zugegebenem, ³²P-markierten AP&sub4;A bei Inkubation bei 37ºC innerhalb von zehn Minuten abgebaut werden (Kim et al., Blood 66: 735-737 (1995)). Endogenes Plättchen-AP&sub4;A, das in relativ hohen Konzentrationen aus dichten Granulen freigesetzt wird, wenn stimulierte Plättchen das Freisetzungsphänomen durchmachen, können hinsichtlich einer Modulierung von lokaler Plättchenaggregation/dispergierung von Bedeutung sein. Somit kann, wie in US- Patent Nr. 5,049,550 (Zamecnik '550) beschrieben, eine gerinnungshemmende Wirkung erhalten werden durch Aufrechthalten einer hohen Konzentration an zirkulierendem AP&sub4;A über die Verabreichung von exogenem AP&sub4;A. Dies legt nahe, daß AP&sub4;A oder ein Analogum davon, wie etwa ApspCHClppsA, als ein klinisches, gerinnungshemmendes Antiplättchenmittel verwendet werden kann.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger, der dieser bedarf, bereitgestellt. Das Verfahren zur Modulierung der thrombolytischen Wirkung umfaßt das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend eine zur Modulierung der thrombolytischen Wirkung wirksame Menge an ApspCHClppsA, dem Säuger. Wie hierin verwendet, umfaßt eine Modulation einer thrombolytischen Wirkung ein Erleichtern des Auflösens eines Thrombus in dem Säuger, eine Inhibition des Wachstums eines existierenden Thrombus in dem Säuger, eine Verringerung (z. B. Verhinderung) der Bildung eines Thrombus, und eine Inhibition der Plättchenaggregation (in Gegenwart oder Abwesenheit eines bereits existierenden Thrombus).
Im allgemeinen kann ApspCHClppsA intraperitoneal, intramuskulär, oral, gastrointestinal, subkutan oder eingekapselt mit langsamer Freisetzung verabreicht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung dem Säuger ist jedoch mittels intravenöser Injektion. ApspCHClppsA wird an jeder geeigneten Stelle in den Blutstrom des Säugers eingebracht, obwohl eine Injektion stromaufwärts von und in Nähe der Stelle des vermuteten oder bekannten Thrombus bevorzugt ist. Die wirksame Menge von ApspCHClppsA zur Modulation der thrombolytischen Wirkung in dem Säuger ist diejenige Menge, welche die besondere thrombolytische Wirkung in dem Säuger hervorruft, für welche der Säuger behandelt wird. Wenn das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung beispielsweise darin besteht, die Auflösung eines Thrombus in dem Säuger zu erleichtern, ist die wirksame Menge von ApspCHClppsA zur Modulation dieser thrombolytischen Wirkung eine gerinnungshemmend wirksame Menge, d. h. diejenige Menge, welche in Kombination mit einem gerinnungshemmenden Mittel das Auflösen eines bereits existierenden Thrombus erleichtert. Bevorzugt beträgt die gerinnungshemmend wirksame Menge zwischen etwa 5 mg und 25 mg pro kg Körpergewicht. Stärker bevorzugt beträgt die gerinnungshemmend wirksame Menge zwischen etwa 10 mg und 15 mg pro kg Körpergewicht.
Wenn das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung darin besteht, das Wachstum eines Thrombus in dem Säuger zu inhibieren, ist die wirksame Menge von ApspCHClppsA diejenige ApspCHClppsA-Menge, welche zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo wirksam ist (5-25 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, stärker bevorzugt zwischen 10-15 mg pro kg pro Tag). Im allgemeinen beträgt die zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo wirksame Menge zwischen etwa 5 mg und 25 mg pro kg Körpergewicht, stärker bevorzugt zwischen etwa 10 mg und 15 mg pro kg Körpergewicht.
Wenn das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung darin besteht, die Bildung eines Thrombus in dem Säuger zu verringern (z. B. durch Inhibition der Plättchenaggregation in vivo), dann ist die wirksame Menge von ApspCHClppsA um dieses Ziel zu erreichen, eine ApspCHClppsA-Menge, welche die Plättchenaggregation in vivo inhibiert, und vermutlich dadurch die Bildung eines Thrombus in dem Säuger verringert (z. B. verhindert). Wenn das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung darin besteht, die Plättchenaggregation in dem Säuger zu inhibieren (in Gegenwart oder Abwesenheit eines Thrombus), ist die wirksame Menge an ApspCHClppsA annähernd die gleiche Menge an ApspCHClppsA, welche zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo wirksam ist.
Die tatsächliche Menge an ApspCHClppsA, welche in einem spezifischen Fall verabreicht wird, um die vorstehenden Ziele zu erreichen, variiert in Abhängigkeit von den besonderen formulierten Zusammensetzungen, der Verabreichungsmethode, und den klinischen Bedürfnissen des Patienten. Im allgemeinen liegt die ApspCHClppsA-Dosis jedoch im Bereich von 10 ug bis 10 mg/kg/Tag.
Wie vorstehend ausgeführt, ist die wirksame Dosis zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo annähernd die gleiche wie die wirksame Dosis zur Inhibition von Thrombose ("eine gerinnungshemmend wirksame Menge"). Die in vivo Gerinnselbildung innerhalb eines Gefäßes (Thrombose) ist jedoch das Ergebnis eines komplizierten Prozesses, an dem eine Reihe pathophysiologischer Ereignisse beteiligt sind, umfassend beispielsweise
1) Plättchenaktivierung, Aggregation, und Aktivierung des Koagulationssystems (Thrombinerzeugung) im Anschluß an die Anhaftung von Plättchen an eine beschädigte Blutgefäßwand;
2) Freisetzung von Gewebekoagulationsfaktor durch das beschädigte Blutgefäß (Thrombinerzeugung durch den extrinsischen Koagulationsweg);
3) Freisetzung von Gewebeplasminogenaktivator durch das beschädigte Blutgefäß (Plasminerzeugung);
4) gerinnungshemmende Aktivität (assoziiert mit normaler physiologischer Aktivität); und
5) erhöhte Wechselwirkung von Plättchen mit subendothelialen Geweben und Abscheren loser Gerinnsel durch den Blutstrom.
Zusammen genommen führen diese Ereignisse zu Thrombose, obwohl manche dieser Ereignisse dazu dienen, Gerinnsel zu bilden, und andere Ereignisse, eine Gerinnselbildung verhindern. Demgemäß wird in einer bevorzugten Ausführungsform ApspCHClppsA in Kombination mit einem gerinnungshemmenden Mittel verabreicht, wie etwa Heparin, dem am häufigsten verwendeten gerinnungshemmenden Mittel.
ApspCHClppsA kann durch Injektion zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Arzneimittel (z. B. einem thrombolytischen Mittel) verabreicht werden. Pharmazeutisch akzeptable Träger sind diejenigen, welche ApspCHClppsA auflösen oder in Suspension halten, und welche mit physiologischen Bedingungen kompatibel sind. Beispiele von pharmazeutisch akzeptablen Trägern sind wässrige Lösungen von Salzen oder nicht-ionischen Verbindungen, wie etwa Natriumchlorid oder Glucose, im allgemeinen in einer isotonischen Konzentration. Obwohl andere Arzneimittel zusammen mit ApspCHClppsA in der Lösung vorhanden sein können, ist es von Bedeutung, daß derartige zusätzliche Komponenten nicht die Fähigkeit von ApspCHClppsA beeinträchtigen, die Plättchenaggregation in vivo zu inhibieren. Der Fachmann kennt besondere pharmazeutisch akzeptable Träger für ApspCHClppsA, oder wird in der Lage sein, diese mit nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren zu bestimmen. Weiterhin weiß der Fachmann, oder wird in der Lage sein, dies mit nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren zu bestimmen, ob andere Arzneimittel in der Lösung mit ApspCHClppsA vorhanden sein können, ohne die Fähigkeit von ApspCHClppsA zu beeinträchtigen, die Plättchenaggregation in vivo zu inhibieren. Die Zusammensetzungen zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung sind zur Behandlung jedes Säugers geeignet, umfassend, aber nicht beschränkt auf Menschen, Haustiere und Nutztiere.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung in einem Säuger, die Auflösung eines Thrombus in dem Säuger zu erleichtern oder dessen weitere Ausbreitung zu verhindern. Bevorzugt umfaßt das Verfahren zur Auflösung des Thrombus das Verbreichen dem Säuger einer gerinnungshemmend wirksamen Menge von ApspCHClppsA zusammen mit einer thrombolytisch wirksamen Menge eines Thrombolysemittels. Wie hierin verwendet, bezeichnet "Thrombolysemittel" ein Mittel, welches einen Thrombus aufbricht oder auflöst. Ein Thrombus bezeichnet ein aus Blutbestandteilen gebildetes Gerinnsel im kardiovaskulären System; es kann einen Verschluß bilden oder an der Gefäß- oder Herzwand anhaften, ohne den Gefäßinnenraum vollständig zu verschließen. Eine thrombolytisch wirksame Menge des Thrombolysemittels ist somit diejenige Menge, die in vivo ein Gerinnsel auflöst. Der Fachmann kennt die gerinnungshemmend wirksamen Mengen von ApspCHClppsA sowie die thrombolytisch wirksamen Mengen des Thrombolysemittels, oder wird in der Lage sein, diese mit nicht mehr als routinemäßigem Experimentieren zu bestimmen. In den besonders bevorzugten Ausführungsformen wird das Thrombolysemittel aus der Gruppe, bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase, ausgewählt.
ApspCHClppsA kann dem Säugerempfänger gemeinsam mit dem Thrombolysemittel verabreicht werden. In dieser Erfindung umfaßt eine "gemeinsame Verabreichung" (1) die gleichzeitige Verabreichung von ApspCHClppsA und dem Thrombolysemittel und (2) die Verabreichung von ApspCHClppsA kurz vor oder nach der Verabreichung des Thrombolysemittels. Die Verabreichung von ApspCHClppsA auf diese Weise führt zu einer Dispergierung und/oder Verhinderung der erneuten Aggregation von Plättchen, welche in Reaktion auf die Wirkung des Thrombolysemittels aus dem Blutgerinnsel freigesetzt werden. Da ApspCHClppsA in einem sehr frühen Stadium der Thrombusbildung wirkt, ist ApspCHClppsA in Kombination mit einem oder mehreren Gerinnsel-auflösenden Arzneimitteln, wie etwa den vorstehend beschriebenen, besonders nützlich.
Gemäß einer nochmals anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung eine Inhibition des Wachstums eines existierenden Thrombus in dem Säuger. Gemäß dieser Ausführungsform ist die wirksame Menge an ApspCHClppsA, welche verabreicht wird, eine Menge, die zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo wirksam ist (eine gerinnungshemmend "wirksame" Menge). Obwohl die Anmelder nicht beabsichtigen, die Erfindung auf einen besonderen Mechanismus zu beschränken, wird angenommen, daß die Inhibition des Wachstums des Thrombus bewirkt wird, indem die weitere Aggregation von Plättchen an der Peripherie des existierenden Thrombus verhindert wird.
Gemäß einer nochmals anderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Modulation einer thrombolytischen Wirkung die Verringerung der Thrombusbildung in dem Säuger. Es wird angenommen, daß die Verabreichung von ApspCHClppsA die Thrombusbildung in dem Säuger inhibiert, indem die Plättchenaggregation in vivo verhindert wird. Demgemäß ist die wirksame Menge an ApspCHClppsA zur Verringerung (z. B. Verhinderung) der Bildung des Thrombus in dem Säuger eine Menge, welche zur Inhibition der Plättchenaggregation in vivo wirksam ist. ApspCHClppsA ist somit zur Verhinderung von koronaren und zerebrovaskulären Thromboseereignissen besonders geeignet. Da Thromben vorwiegend im arteriellen System auftreten, besteht darüber hinaus eine bevorzugte Verwendung von ApspCHClppsA in der Behandlung von Patienten mit einem hohen Risiko von arteriellen Thromben in Herz und Gehirn. Zusätzlich ist ApspCHClppsA bei der Dialyse nützlich, bei der Patienten an künstliche Nieren angeschlossen werden, um Thrombose in arteriellen venösen Shunts zu verhindern. Weiterhin wird angenommen, daß ApspCHClppsA als ein sekundäres prophylaktisches Mittel zur Verhinderung des erneuten Auftretens eines Herzinfarkts und/oder Herzanfalls nützlich ist, wenn in einer ausreichenden Menge vorhanden um die Plättchenaggregation zu inhibieren. Somit ist die wirksame Menge an ApspCHClppsA für prophylaktische Anwendungen im allgemeinen die gleiche wie die vorstehend beschriebenen wirksamen Mengen zur Verhinderung der Plättchenaggregation in vivo an der Stelle eines bereits existierenden Thrombus.
Die Nützlichkeit von ApspCHClppsA zur Modulation der vorstehend beschriebenen thrombolytischen Ereignisse wird gestützt durch die bestätigte Nützlichkeit des natürlich vorkommenden Moleküls AP&sub4;A in vivo. Es ist beispielsweise gezeigt worden, daß AP&sub4;A, wenn es einem Säuger verabreicht wird, die ADP induzierte Plättchenaggregation merklich inhibiert. Bei Zugabe vor oder während der Aggregation verursacht exogenes AP&sub4;A eine rasche Dispergierung von aggregierten Plättchen, wobei die Größenordnung der Inhibition zu der Dosis an exogenem AP&sub4;A in direkter Relation steht. Da Plättchenpfropfen die Hauptmasse von arteriellen Thromben ausmachen, ist eine bevorzugte therapeutische Strategie zur Verhinderung von Thrombose konsistent mit der vorstehend beschriebenen Verabreichung von ApspCHClppsA einem Säuger, um das Anhaften von Plättchen aneinander in vivo zu beeinträchtigen. Die Nützlichkeit von ApspCHClppsA zur Modulation von thrombolytischen Ereignissen in vivo beruht somit auf der wissenschaftlichen Sicherheit, daß das natürlich vorkommende Elternmolekül AP&sub4;A und ein Analogum, AppCHClppA, bei klinischer Verabreichung einem Säuger die Thrombusbildung inhibieren.
Überraschenderweise bietet ApspCHClppsA vorteilhaft erhöhte inhibitorische Eigenschaften auf die Plättchenaggregation im Vergleich zu denjenigen des natürlich vorkommenden AP&sub4;A oder früher beschriebener AP&sub4;A-Analoga. Diese Eigenschaften sind unerwartet und konnten auf Basis der strukturellen Ähnlichkeiten zu den Analoga von natürlich vorkommenden AP&sub4;A-Molekülen nicht vorhergesagt werden. Die signifikanten Unterschiede in bezug auf die inhibitorische Aktivität von ApspCHClppsA im Vergleich zu einem bekannten AP&sub4;A-Analogum werden in den beigefügten Beispielen, die in keinerlei Weise als einschränkend anzusehen sind, veranschaulicht.

BEISPIELE

Sofern nicht anders angegeben wurden die experimentellen Verfahren nach den in US-Patent Nr. 5,049,550 (Zamecnik '550) angegebenen Verfahren durchgeführt. Manche alternative Verfahren (z. B. Freisetzungsreaktion, PF3-Assays) und eine Reihe zusätzlicher Studien werden ebenfalls bereitgestellt (z. B. cytoplasmatische Calciummobilisierung, Fibrinogenbindungsstelle, andere Agonisten als ADP, Plättchen-cAMP und Verteilung von CHCl-AP&sub4;A in Blutkomponenten). Blut wurde gesammelt in einem 0,1 Volumen 3,8% Natriumcitrat aus gesunden freiwilligen Menschen, die mindestens 10 Tage keine Antiplättchenmittel eingenommen hatten. Plättchenreiches Plasma (PRP, platelet rich plasma) wurde durch stufenweise Zentrifugation abgetrennt, und auf 3,3 · 10&sup8; Plättchen pro ml Plasma eingestellt. Sofern nicht anders angegeben wurde in den Beispielen PRP verwendet.
In diesem Dokument wird P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³-monochlormethylen-5',5'''-diadenosin- P¹,P&sup4;-tetraphosphat durchwegs alternativ als "Thio-CHCl-AP&sub4;A" oder "ApspCHClppsA" bezeichnet.

BEISPIEL 1 - Synthese von ApsCHClppsA

Die Synthese von ApspCHClppsA wurde im Labor von Professor M. Blackburn, University of Sheffield, England, durchgeführt und umfaßte zwei Schritte. Zunächst wurde das (pq)-Bisthio-Analogum hergestellt durch die Aktivierung von Adenosin-5'- thiomonophosphat mit Diphenylphosphochloridat, und danach wurde übergegangen zur Kondensation von Adenosin-5'-thiomonophosphat mit Monochlormethylenbisphosphat (Blackburn, G.M. et al., Nucl. Acids Res. 15: 6991- 7004 (1987)). Siehe auch APIA and other Dinucleoside Polyphosphates, A. McLennan, Hrsg., CRC Press Inc. (1992), Kapitel 11 mit dem Titel "Synthetic Structural Analogues of Dinucleoside Polyphosphates", von G.M. Blackburn et al. Nach Chromatographie über DEAE-Sepharose hatte das Produkt gemäß ³¹P NMR eine Reinheit von 90%. Analytische Reinigung unter Verwendung von Reversphase- HPLC lieferte Material mit einer Reinheit von 99% und löste vier Stereoisomere auf, z. B. ApspCHClppsA, ApspCHClppA, AppCHClppsA und AppCHClppA. Eine weitere Reinigung der Stereoisomere wurde nicht durchgeführt.

Beispiel 2 - Charakterisierung von ApspCHClppsA

Ergebnisse

I. Inhibitionswirksamkeit von Thio-CHCl-AP&sub4;A auf ADP-induzierte Plättchenaggregation

Es wurde ein Ausgangsscreening hinsichtlich der inhibitorischen Wirkungen von mehreren Mitteln (umfassend z. B. Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A als Referenzmittel) auf die durch ADP induzierte Plättchenaggregation durchgeführt. Die Plättchenaggregation wurde mit Plättchen-reichem Plasma (PRP) mittels der turbidimetrischen Methode von Born (J. Physiol. 162: 67, 1962) in einem Aggregometer (Chrono-log, Model 530 VS) gemessen. Die durch 5 uM ADP induzierte Plättchenaggregation in der Abwesenheit oder Gegenwart von 5 uM der Mittel wurde untersucht. Die Studie wurde ausgedehnt, um die IC&sub5;&sub0;-Werte für jedes Mittel abzuschätzen, indem ein Dosis-abhängiger Inhibitionsassay wie früher gezeigt (P. Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2370-2373 (1992)) durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Der IC&sub5;&sub0;-Wert von CHCl- AP&sub4;A (Referenzmittel) war mit dem früher publizierten Wert (P. Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2370-2373 (1992)) konsistent. Der Wert von Thio-CHCl- AP&sub4;A schien der niedrigste (0,81 uM) von den getesteten Mitteln zu sein, was die höchste inhibitorische Wirksamkeit anzeigt. Wenn beide Adenosinmoleküle von Thio- CHCl-AP&sub4;A durch Desoxyadenosin (Thio-CHCl-dAP&sub4;dA) ersetzt wurden, wurde die inhibitorische Wirksamkeit erheblich verringert (9,22 uM). In ähnlicher Weise führte ein Ersatz durch Desoxyadenosin in der nicht-Thiophosphonatverbindung (CHCldAP&sub4;dA) zu einem vollständigen Verlust der inhibitorischen Wirkungen (> 100 uM). Es wurde eine Inhibitionskinetikstudie für Thio-CHCl-AP&sub4;A durchgeführt, wie früher für CHCl-AP&sub4;A gezeigt (P. Zamecnik et al., PNAS (USA) 89: 2370-2373 (1992)). Der Wert der Inhibitionskonstante (Ki) von Thio-CHCl-AP&sub4;A betrug 0,33 uM und zeigte eine kompetitive Inhibition, was die gleiche Natur aber eine höhere Wirksamkeit als die des Referenzmittels CHCl-AP&sub4;A (1,1 uM) anzeigt.

Tabelle 1

Inhibitoren IC&sub5;&sub0; (uM)
AppCHClppA (CHCl-AP&sub4;A) 3,28*
ApspCHClppsA (Thio-CHCl-AP&sub4;A) 0,81*
dAppCHClppdA (CHCl-dAP4dA) > 100
dApspCHClppsdA (Thio-CHCl-dAP&sub4;dA) 9,22
* Mittelwerte aus drei Bestimmungen, die anderen Werte sind der Mittelwert aus zwei Bestimmungen

II. Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A auf andere Plättchenreaktionen als die Aggregation

Plättchenreaktionen auf die Agonisten umfassen zusätzlich zur Aggregation a) Freisetzungsreaktion, b) Fibrinogenrezeptorstellen (GPIIb/IIIa) und c) Plättchenfaktor 3-Aktivierung. Die Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und dem Referenzmittel (CHCl- AP&sub4;A, Verbindung E&sub1;&sub0; von Zamecnik '550) auf jede dieser Reaktionen wurden getestet.
a) Plättchenfreisetzungsreaktion: Die Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und dem Referenzmittel sowohl auf die ADP- als auch auf die Kollagen-induzierte Plättchenaggregation, und die Freisetzungsreaktion wurden in einem Lumiaggregometer getestet. Normales humanes PRP wurde aus mit Natriumcitrat (0,38%) gerinnungshemmend behandeltem Blut abgetrennt. Die Plättchenaggregation und Freisetzungsreaktion wurden induziert durch 5 uM ADP oder 1 ug Kollagen/ml. Das Lumiaggregometer war ausgestattet um sowohl die Plättchenaggregation als auch die Luciferasereaktion von ATP gleichzeitig a) in der Abwesenheit von Mittel (Kontrolle) und b) in der Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Thio-CHCl-AP&sub4;A oder CHCl-AP&sub4;A zu testen. Die gemessene Menge von aus den aktivierten Plättchen durch den Agonisten freigesetztem ATP stellt die Freisetzungsreaktion dar. Die durch die Luciferin-Luciferase-Reaktion erzeugte Lumineszenz war bezogen auf die freigesetzte ATP-Menge linear.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für inhibitorische Wirkungen auf die Freisetzungsreaktion sind im allgemeinen niedriger als diejenigen der Aggregation, was darauf hindeutet, daß die inhibitorischen Wirkungen der Mittel (Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A) auf die Freisetzungsreaktion gegenüber den inhibitorischen Wirkungen dieser Mittel auf die Aggregation überwiegen. Kollageninduzierte Aggregation wurde durch CHCl-AP&sub4;A nicht inhibiert, die Freisetzungsreaktion wurde jedoch durch CHCl-AP&sub4;A inhibiert. Tabelle 2
b) Fibrinogenbindungsstellen (GPIIb/IIIa) auf den Plättchen:
Plättchenoberflächenrezeptoren für Fibrinogen werden durch Aktivierung bekanntermaßen vermehrt. Die Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A auf Fibrinogenbindungsstellen von aktivierten Plättchen wurden mittels Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Antifibrinogenantikörper (FITC-anti-fgn) Techniken in einem Durchflußcytometer (FACS, Becton-Dickinson) untersucht. PRP wurde in einer Endverdünnung von 1 : 20 verwendet. Plättchen wurden mittels ADP in der Gegenwart oder Abwesenheit der Mittel 5 min bei 22ºC aktiviert. Nach 10-minütiger Inkubation von aktivierten Plättchen mit FITC-anti-fgn bei 22ºC wurden 0,5 ml 0,2% Formylsalzlösung (0,2% Formaldehyd in 0,9% NaCl) zugegeben, um eine weitere Aktivierung zu inhibieren. Proben umfaßten Plättchen, die a) nicht stimuliert worden waren, b) mit 5 uM ADP stimuliert worden waren, c) 5 Minuten vor ADP-Stimulierung den Mitteln (CHCl-AP&sub4;A oder Thio-CHCl-AP&sub4;A) ausgesetzt worden waren. An ADPaktivierte Plättchen gebundenes Fibrinogen wurde bevorzugt durch Thio-CHCl-AP&sub4;A, im Vergleich zum Referenzmittel CHCl-AP&sub4;A, inhibiert (Tabelle 3). Tabelle 3
c) Aktivierung von Plättchenfaktor 3 (PF3): PF3-Aktivität der Plättchen wird durch ADP-Stimulierung verstärkt und mittels der Stypven-Gerinnungsdauer (P. Zamecnik et al., PNAS (USA) 89: 2370-2373 (1992)) gemessen. Tabelle 4 faßt die Ergebnisse der Wirkungen der Mittel auf ADP-stimulierte PF3-Aktivität zusammen. Die Daten stellen einen Mittelwert von zwei Experimenten dar. Frisches normales Plättchenreiches Humanplasma (3 · 10&sup8; Plättchen pro ml) wurde 5 min bei 37ºC in der Gegenwart oder Abwesenheit der Mittel (10 uM) vorinkubiert und danach auf PF3- Aktivität der Plättchen, die durch 10 uM ADP stimuliert worden waren, getestet. Die inhibitorische Wirkung von Thio-CHCl-AP&sub4;A war signifikant größer als die des nicht- Thio-Referenzmittels (CHCl-AP&sub4;A). Tabelle 4

III. Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A auf die regulatorischen Faktoren in der ADP-induzierten Plättchenaktivierung:

Es sind drei regulatorische Faktoren in den Plättchenaktivierungsprozessen bekannt: a) Mobilisierung von cytoplasmatischen Calciumionen, b) die Änderungen der Konzentrationen von zellulärem cAMP, und c) metabolische Aktivität von Arachidonsäure. Die Testergebnisse der Mittel (Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A) für die ersten beiden dieser Faktoren sind nachstehend beschrieben.
a) Mobilisierung von cytoplasmatischen Calciumionen (Ca&spplus;&spplus;): Eine Zunahme von cytoplasmatischem Ca&spplus;&spplus; in den Plättchen stellt einen aktivierten Zustand dar. Indo-1- acetomethylester (Indo-1) wurde gewöhnlich als das Reagenz zur Bestimmung von intrazellulärem freien Ca&spplus;&spplus; verwendet. Indo-1 reagiert mit Ca&spplus;&spplus; und erzeugt eine Fluoreszenz, die in einem Doppelwellenlängen-Durchflußcytometer (408/485) (Coulter EPIG Systems) gemessen werden kann. Plättchen wurden 45 min bei 37ºC mit Indo-1 inkubiert. Überschüssiges Indo-1 im Medium wurde durch ein Gelfiltrationsverfahren entfernt. Indo-1-beladene Plättchen wurden danach durch 6,7 uM ADP in der Abwesenheit oder Gegenwart von Thio-CHCl-AP&sub4;A (3,3 uM) oder CHCl-AP&sub4;A (6,7 uM) aktiviert. Die Fluoreszenzintensität der Plättchen wurde überwacht und gegen die Plättchenzahl aufgetragen. Die aus den Auftragungen erzeugten Histogramme wurden analysiert. Unstimulierte Plättchen zeigten eine Fluoreszenzintensität (FI) zwischen 42 und 250 mit einem Peak bei 133 (Basislinie Kontrolle). Mit 2 uM A23187 (einem Calciumionophor) behandelte Plättchen zeigten eine merkliche Verschiebung nach rechts (FI zwischen 150 und 1000 mit einem Peak bei 530), was eine positive Kontrolle darstellt. ADP-aktivierte Plättchen hatten eine moderate Verschiebung nach rechts (FI zwischen 67 und 300 mit einem Peak bei 158). Die Wirkung der ADP-Aktivierung auf die Ca&spplus;&spplus;-Mobilisierung war im Vergleich zu der des Calciumionophors relativ mild und wurde in der Gegenwart von entweder Thio-CHCl-AP&sub4;A oder CHCl-AP&sub4;A vollständig blockiert, z. B. zeigten ADP-aktivierte Plättchen in der Gegenwart des Inhibitionsmittels das gleiche Muster, das mit nicht stimulierten Plättchen erhalten wurde.
b) Konzentration an intrazellulärem cAMP: Die inhibitorische Wirkung von cAMP auf die Plättchenaggregation war als eine Gegenwirkung gegen die Calciumionenmobilisierung bekannt. Demgemäß wurden die inhibitorischen Wirkungen der Mittel auf einen cAMP-vermittelten Mechanismus getestet. PRP wurde mit Salzlösung (Kontrolle), Mitteln (bei 20 uM und 100 uM) oder Forskolin (10 uM) 5 min bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden unter Verwendung von Ba(OH)&sub2; und ZnSO&sub4; Extrakte hergestellt. Zyklisches AMP in den Extrakten wurde in das Etheno-cAMP-Derivat überführt, und die Konzentrationen wurden mittels HPLC unter Verwendung eines Fluoreszenzdetektors abgesschätzt (W. Wojcik et al., 1 Cyclic Nucleotide Res. 7: 27-35 (1981)). Die Konzentration von zyklischem AMP in einem unbekannten Extrakt wurde durch Extrapolation aus einem Standardgraphen bestimmt. Es wurde eine lineare Relation zwischen der Konzentration an cAMP in den extrahierten Proben und der Fluoreszenzbestimmung beobachtet. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse der Wirkung der Mittel auf die Plättchen-cAMP-Konzentration. Sowohl Thio-CHCl-AP&sub4;A als auch CHCl-AP&sub4;A zeigten bei 20 uM keine Wirkung auf die cAMP-Konzentration, zeigten aber eine moderate Erhöhung der Plättchen-cAMP- Konzentration bei einer höheren Konzentration (100 uM). Diese Erhöhung muß jedoch nicht eine spezifische Wirkung sein. Obwohl keine Kontamination mit Adenosin in den getesteten AP&sub4;A-Mitteln nachgewiesen wurde, ist es möglich, daß entweder Metabolismusprodukte von zellulären Adenosinnucleotiden oder eine Adenosirlkontamination in den getesteten Mitteln für die erhöhte cAMP-Konzentration verantwortlich sein könnten. Eine merkliche Erhöhung von Plättchen-cAMP durch 10 uM Forskolin, einem wirksamen Stimulator für Adenylatcyclase, stellte eine positive Kontrolle dar. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die inhibitorische Wirkung der Mittel auf die Plättchenaktivierung durch ADP nicht einem durch cAMP-vermittelten Mechanismus folgen könnte. Tabelle 5

IV. Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A auf die durch andere Agonisten als ADP induzierte Plättchenaggregation

Die Freisetzungsreaktion scheint eine einzigartige Reaktion auf die Plättchenaktivierung zu sein. Neben mehreren Plättchenbestandteilen scheint ADP eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Aktivierung zu spielen. Wir haben die Rolle von ADP untersucht, das bei der von anderen Agonisten induzierten Plättchenaggregation freigesetzt wird, umfassend Arachidonsäure Kollagen, Epinephrin, Thrombin und Ristocetin. Die durch eine gegebene Konzentration von Agonisten induzierte Aggregierbarkeit von Plättchen betrug in der Abwesenheit von Mitteln annähernd 60-80%. Die IC&sub5;&sub0;-Werte wurden durch eine Dosis-abhängige Inhibitionsstudie mit variierenden Konzentrationen von CHCl-AP&sub4;A und Thio-CHCl- AP&sub4;A abgeschätzt. Weder Thio-CHCl-AP&sub4;A noch CHCl-AP&sub4;A beeinflußten die Thrombin- und Ristocetin-induzierte Plättchenaggregation. Die Werte der inhibitorischen Wirksamkeit (IC&sub5;&sub0;) für die anderen drei Agonisten sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Obwohl die Kollagen-induzierte Aggregation von CHCl-AP&sub4;A anscheinend nicht beeinflußt wird, wurde für Thio-CHCl-AP&sub4;A eine nachweisbare inhibitorische Wirkung festgestellt. Diese Ergebnisse legen nahe, daß mindestens 50% der durch Arachidonsäure, Kollagen oder Epinephrin induzierten Aggregierbarkeit von Plättchen von ADP abhängig sind, welches bei der anfänglichen Plättchenaktivierung freigesetzt wird. Diese Feststellung unterstützt die vorstehend beschriebenen Beobachtungen der inhibitorischen Wirkungen der Mittel auf die Freisetzungsreaktion. Tabelle 6

V. Fähigkeit der Plättchen nach vorhergehendem Aussetzen an Thio-CHCl-AP&sub4;A oder CHCl-AP&sub4;A zu aggregieren

Plättchen weisen den Purinozeptor (P2T), eine spezifische Bindungsstelle für ADP an der Plättchenoberfläche auf. Wir nehmen an, daß der Inhibitionsmechanismus von AP&sub4;A-Analoga eine Kompetition mit ADP um die Bindung an den Purinozeptor der Plättchen umfaßt. Um die Stabilität und inhibitorischen Wirkungen des gebundenen Mittels zu testen, wurde Plättchenreiches Plasma, das mit ACD-Lösung gerinnungshemmend behandelt worden war, 30 Minuten bei 22ºC mit 25 uM Thio- CHCl-AP&sub4;A oder 50 uM CHCl-AP&sub4;A vorinkubiert. Plättchen, die durch Gelsäulenfiltration (2 · 10&sup8; Zellen/ml) oder Zentrifugation (3 · 10&sup8; Zellen/ml) isoliert worden waren, wurden in dem von Inhibitor freien Plasma resuspendiert und die ADP induzierte Aggregierbarkeit wurde gemessen. Die Werte stellen einen Mittelwert von drei Experimenten für die Reihe der Abtrennung mittels Gelfiltration dar und einen Mittelwert von zwei Experimenten für die Abtrennung mittels Zentrifugation. Tabelle 7 faßt die Ergebnisse zusammen. Plättchen, die Thio-CHCl-AP&sub4;A ausgesetzt worden waren, zeigten eine moderate Inhibition in der Fähigkeit nach Aussetzen an ADP zu aggregieren (22-33%), während an CHCl-AP&sub4;A ausgesetzte Plättchen nur eine geringe Inhibitionswirkung zeigten (8%). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die inhibitorischen Aktivitäten der AP&sub4;A-Analoga, die an die Plättchen banden, anscheinend reversibel sind. Tabelle 7

VI. Zeitabhängige Wirkungen von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCi-AP&sub4;A auf ADP- induzierte Aggregation

Um die Stabilität der Mittel durch einen funktionellen Assay zu beobachten wurde PRP 3 Stunden bei 37ºC mit 2,5 uM Thio-CHCl-AP&sub4;A oder 5 uM CHCl-AP&sub4;A inkubiert. Die Konzentrationen der in diesem Experiment verwendeten Inhibitoren waren relativ niedrig, insbesondere für die Thioverbindung. Zu den angegebenen Zeitpunkten entnommene Proben wurden auf ADP induzierte (10 uM) Aggregation getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt. Die inhibitorische Wirkung von Thio-CHCl-AP&sub4;A wurden für bis zu 3 Stunden gut beibehalten, während die Wirkungen von CHCl-AP&sub4;A mit längerer Inkubationsdauer allmählich abnahmen. Die Ergebnisse legen nahe, daß CHCl-AP&sub4;A instabil wird, wenn es mehr als 60 Minuten bei 37ºC in PRP gehalten wird, und daß Thio-CHCl-AP&sub4;A für einen Zeitraum von mindestens 3 Stunden sehr stabil ist. Eine ähnliche Stabilität von Thio-CHCl- AP&sub4;A wurde bei der Inkubation in Gesamtblut beobachtet. Tabelle 8

VII. Wärmestabilität von Thio-CHCl-AP&sub4;A und CHCl-AP&sub4;A

Beide Mittel wurden bei der Siedetemperatur erwärmt. Proben wurden nach 5, 15 und 30 Minuten entnommen. Die inhibitorischen Wirkungen auf die Plättchenaggregierbarkeit und die mittels HPLC getestete physikalische Integrität der Mittel zeigte keine Veränderungen, was darauf hindeutet, daß beide Mittel gegenüber einer Wärmebehandlung von bis zu 30 Minuten beständig sind.

VIII. Stabilität von Thio-CHCl-AP&sub4;A und AP&sub4;A in Gesamtblut

Um die Molekülstabilität der Mittel zu testen, wurde Blut mit jedem Mittel 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zu den angegebenen Inkubationszeiträumen wurden Proben extrahiert und CHCl-AP&sub4;A oder Thio-CHCl-AP&sub4;A wurden in einer HPLC (Waters 600E Pumpe und Steuerungseinheit) mit einer quaternären Amin-Anionenaustauschsäule (Whatmari Partisil 10) untersucht und analysiert (Beckman System Gold). Die Rückhaltezeiten für CHCl-AP&sub4;A und Thio-CHCl-AP&sub4;A betrugen 3,39 bzw. 5,95. Peakflächen wurden integriert und zur Herstellung einer Standardkurve für einen Konzentrationsbereich (1, 2, 4, 6, 8 und 10 uM) verwendet. Sowohl CHCl-AP&sub4;A als auch Thio-CHCl-AP&sub4;A waren rein, wie festgestellt durch einen einzigen Peak bei HPLC und durch eine lineare Beziehung zwischen der Konzentration des Mittels und den HPLC-Peakflächen. Normales Humanblut, das mit 0,38% Natriumcitrat gerinnungshemmend behandelt worden war, wurde 4 Stunden bei 37ºC in der Gegenwart von 250 uM CHCl-AP&sub4;A oder Thio-CHCl-AP&sub4;A inkubiert. Blutproben wurden mit 3% Perchlorsäure extrahiert und mit K&sub2;OO&sub3; neutralisiert. Die Extrakte wurden bis zu einem Assay unter Verwendung von HPLC bei -80ºC gehalten. Die Ergebnisse für die Blutextrakte sind in Tabelle 9 zusammengefaßt. Die Werte in Tabelle 9 stellen einen Mittelwert aus zwei Experimenten dar und sind in nMol/ml Blut ausgedrückt. Wir identifizierten zwei Peaks (Haupt- und Nebenpeak) aus den. Blutextrakten für CHCl-AP&sub4;A oder Thio-CHCl-AP&sub4;A. Die Gesamtextraktionseffizienz zeigt 110% für CHCl-AP&sub4;A bei 60 Minuten und 85% für Thio-CHCl-AP&sub4;A bei 120 Minuten. Der scheinbar hohe Wert für die Extraktionseffizienz von CHCl-AP&sub4;A legt nahe, daß Adenosinverbindungen aus Blut (möglicherweise Adenosin und AMP) einen Beitrag zu dem Hauptpeak leisten könnten. Eine geschätzte Menge des CHCl- AP&sub4;A-Hauptpeaks deutete auf einen langsamen Abbau hin, und zeigte nach 4 Stunden Inkubation eine 30%-ige Verringerung an. Mindestens 80% des Abbauprodukts, möglicherweise Chlormethylenmonoadenosintriphosphat (AppCp) sind mit dem zweiten Peak (X1) assoziiert. Die Extraktionseffizienz von Thio-CHCl- AP&sub4;A war zum Zeitpunkt 0 relativ schlecht (69%), zeigte aber eine Verbesserung (81- 85%) und nach 60 Minuten näherte sie sich zwischen den Probeentnahmen einander an. Die Daten deuten darauf hin, daß das Thioderivat im allgemeinen für mindestens 4 Stunden bei 37ºC in Blut sehr stabil ist. Der zweite Peak des Blutextrakts mit Thio- CHCl-AP&sub4;A kann ein Isomer (X2) sein, z. B. eine Monothioverbindung (ApspCppA oder AppCppsA). Sie wurde bei HPLC der reinen Verbindung nicht nachgewiesen, aber als ein geringer Anteil (< 10%) in der Blutextraktion zum Zeitpunkt 0 und danach als etwa 20% des Hauptpeaks festgestellt. Tabelle 9

IX. Verteilung von ¹²&sup5;I-markiertem CHCl-AP&sub4;A auf verschiedene Blutzellfraktionen

Plättchen weisen den P2T Purinozeptor auf, die spezifischen Stellen für ADP und ATP (R.G. Humphries et al., J. Cyclic Nucleotide Res. 7: 27-35 (1981)). Es gibt jedoch eine Reihe von Purinozeptoren auf anderen Zelltypen. Wenn Gesamtblut mit den Mitteln behandelt wird, ist es möglich, daß AP&sub4;A -Analoga nicht nur an Plättchen sondern auch an die Erythrozyten und Leukozyten binden. Wir haben herausgefunden, daß in der Tat alle drei Zellfraktionen mit CHCl-AP&sub4;A assoziiert sind. In unserer Studie wurde Humanblut 30 Minuten bei 22ºC mit 23 uM CHCl-AP&sub4;A, enthaltend eine Spurenmenge ¹²&sup5;I-CHCl-AP&sub4;A (spezifische Aktivität von ~35 uCi/uMol, eine Gabe von Dr. David Elmaleh, Radiology Department, Massachusetts General Hospital, Boston, MA), inkubiert. Plättchen wurden durch stufenweise Zentrifugation abgetrennt, die gepackten roten Zellen mit Leukozytenmanschetten (Leukozyten) wurden gemischt, und mittels histopaker Gradientenzentrifugation (A. Boyum, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97):77 (1968)) fraktioniert. Die Zellfraktionen wurden zweimal gewaschen und die endgültigen Suspensionen in bezug auf Zellzahl und Radioaktivität gezählt. Die prozentuale Verteilung wurde auf Basis der CBC-Daten von Gesamtblut berechnet. Die Ergebnisse (ein Mittelwert aus zwei Bestimmungen) sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Bindungsstellen sind ausgedrückt als Werte pro Zellen. Tabelle 10
Alle drei Zellfraktionen waren mit Radioaktivität assoziiert, was anzeigt, daß das CHCl-AP&sub4;A an mehrere Blutzelltypen bindet. Ein Vergleich zwischen den Zelltypen und den Verteilungsdaten ermöglichte es uns, eine Grobabschätzung der Bindungsstellen pro Zelle zu berechnen. Plättchen schienen im Vergleich zu Erythrozyten mehr (einen log-Wert) Bindungsstellen pro Zelle zu haben, obwohl die Größe von Plättchen weniger als ein Zehntel der von Erythrozyten beträgt. Andererseits waren in Leukozyten die Bindungsstellen pro Zelle zwei log-Werte höher, im Vergleich zu dem für Plättchen beobachteten Wert. Die Ergebnisse legen nahe, daß die Bindungsstellen für CHCl-AP&sub4;A pro Oberfläche der Zellen relative Werte von 10³, 10² und 1 auf den Leukozyten, Plättchen bzw. Erythrozyten aufweisen.

BEISPIEL 3 - Weitere Charakterisierung von Thio-CHCl-AP&sub4;A

1. Pharmakokinetik & Pharmakodynamik

Allgemeines Protokoll

In diesem Beispiel wird das gleiche Kaninchenmodell verwendet, das früher beschrieben wurde (S. Louie et al., Thromb. Res. 49: 557-565 (1988); B.K. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11056-11058 (1992)). Der Fachmann erachtet, daß dieses Kaninchenmodell Vorhersagen bezüglich der Wirkungen der getesteten Mittel in Menschen zuläßt, und geeignet ist, um Dosisbereiche der Mittel für die Verabreichung an Menschen auszuwählen. Um mögliche Verzerrungen durch geringfügige Unterschiede in der chirurgischen Technik zu vermeiden, wird die gesamte Arbeit am Tier von derselben Person durchgeführt, wobei die Kaninchen nach dem Zufallsprinzip Versuchs- oder Kontrollgruppen zugeordnet werden.
Männliche weiße Neuseelandkaninchen mit einem Gewicht von 2-2,5 kg erhalten eine Thio-CHCl-AP&sub4;A-Infusion der angegebenen Dosis auf einmal oder während 2 h kontinuierlich über eine periphere Ohrvene. Aus der Arterie des Ohrs wird zu dem angegebenen Zeitpunkt nach Infusion Blut mit einem 1/10 Volumen 3,8% Natriumcitrat entnommen. Unmittelbar nach den Blutentnahmen wird die mikrovaskuläre Blutungsdauer bestimmt (Mielke, C.H., Thromb. Haemostasis 52: 210-211 (1984)). Für einen HPLC-Assay des Mittels wird ein Blutaliquot mit Perchlorsäure extrahiert. Gesamtblut-Plättchenaggregation durch ADP wird für alle Blutproben getestet. Die Ergebnisse liefern eine vorläufige Information über die wirksame Dosis sowie die wirksame Zeitspanne.
Nach vorläufigen Versuchsreihen mit kontinuierlicher Infusion oder Einmalinfusion wird ein Thio-CHCl-AP&sub4;A-Standardinfusionsprotokoll wie folgt aufgestellt. Drei verschiedene Dosen, 0,5x, 1x und 2x Dösis, werden zu dem im spezifischen Protokoll angegebenen Zeitpunkt hinsichtlich ihrer gerinnungshemmenden Wirkung im Kaninchen-Intrakarotis-Kanüle-Thrombosemodell (S. Louie et al., Thromb. Res. 49: 557-565 (1988); B.K. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11056-11058 (1992)) getestet. Eine Dosis von Thio-CHCl-AP&sub4;A wird in 10 ml physiologischer Salzlösung rekonstituiert und mittels einer Pumpe in einer gleichmäßigen Rate oder durch Einmalinfusion verabreicht. Kontrollkaninchen erhalten nur 10 ml Salzlösung. Im anästhetisierten Kaninchen wird ein Abschnitt der gewöhnlichen Karotisarterie durch Verwendung von Gefäßklammern isoliert. Die Kanüle wird eingeführt, und zum Zeitpunkt 15 min wird der Blutfluß wieder hergestellt. Nach Vollendung der Infusion, oder 1 h nach Einmalinfusion, wird der Schlauch in der Karotis entfernt und sein Inhalt in eine Petrischale gespült. Das Vorhandensein eines Gerinnsels oder von flüssigen Blutbestandteilen wird festgestellt. Die Häufigkeit einer Gerinnselbildung in der Kanüle in der Karotis in den verschiedenen Gruppen wird mittels des Chi- Quadrat-Tests verglichen.

Thio-CHCl-AP&sub4;A- Blutassay

Vor und nach (0, 10, 20, 40, 60 und 120 min) Infusion von Thio-CHCl-AP&sub4;A werden Blutproben aus der gegenüberliegenden Karotisarterie oder der Ohrarterie entnommen. Das Blut wird durch Mischen mit einem 1110 Volumen Säure-Citrat- Dextran-Lösung gerinnungshemmend behandelt. Blutproben werden mit Perchlorsäure extrahiert, zentrifugiert, und die säurelösliche Fraktion mit 5M K&sub2;CO&sub3; neutralisiert (S. Louie et al., Thromb. Res. 49: 557-565 (1988)). Die Proben werden bis zum Assay der Nucleotide mittels HPLC bei -80ºC gehalten.

Plättchenagqregationsstudien

Ein mit einer Aufzeichnungsvorrichtung ausgestattetes Chrono-log-Gesamtblut- Plättchenaggregometer (Model 530 VS) wird zur Messung der Plättchenaggregation, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet.

Untersuchung der mikrovaskulären Blutungsdauer

Es wird eine Simplate-Blutungsdauer-Vorrichtung (Organon Teknika) verwendet. Nach Rasieren der dorsalen Ohroberfläche wird die Stelle unter einer Beleuchtungsvorrichtung sorgfältig ausgewählt, um große Gefäßsysteme zu vermeiden. Die Blutungsdauer wird unter freiem Fluß, ohne Druck, gemessen. Der ungepaarte T-Test wird verwendet, um die Verlängerung der Blutungsdauer in der verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

Karotisarterie-Kanüle-Thrombosemodell

Die Kaninchen werden mit Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg i.m.) anästhetisiert. Ein Segment der linken gewöhnlichen Karotisarterie wird mittels Gefäßklemmen isoliert. Ein Polyethylenschlauch mit einer Länge von 1 cm (1 mm Innendurchmesser, Intramedic Polyethylene Tubing PE-90, Clay Adams, Parsippany, NY) wird eingeführt, durch Seideligaturen gesichert, und der Blutfluß durch Entfernen der Klemmen wieder hergestellt.

Spezifisches Protokoll

a) Dosis- und zeitabhängige Wirkungen auf die Plättchenaggregation

Es wird eine Reihe von vier verschiedenen Dosen und Zeitintervallen für die inhibitorischen Wirkungen auf die ADP induzierte Plättchenaggregation untersucht. Kaninchen mit einem Gewicht von annähernd 2,5 kg wird intravenös eine Einmalinfusion des Mittels mit einer Dosismenge von 5, 10, 20, 40 und 100 mg/kg verabreicht. Blutproben werden vor der Infusion, 30 min. 2 h, 6 h, 24 h und 48 h (falls erforderlich) nach der Infusion entnommen. Unmittelbar nach den Blutentnahmen wir die mikrovaskuläre Blutungsdauer bestimmt. Gesamtblut-Plättchenaggregation durch ADP wird für alle Blutproben getestet (B.K. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11056-11058 (1992)).
Die Ergebnisse zeigen die wirksame Dosis sowie das wirksame Zeitintervall an. Bevorzugt werden für jede Dosisstudie sechs Kaninchen verwendet, und die erforderliche Gesamtzahl an Kaninchen beträgt vierundzwanzig Kaninchen.

b) Gerinnungshemmende Wirkungen

Auf Basis der vorhergehenden Studie werden drei verschiedene Dosen, das 0,5-, 1- und 2-fache der wirksamen Dosis (ED, effective dose) auf ihre gerinnungshemmende Wirkung im Kaninchen-Intrakarotis-Kanüle-Thrombosemodelt (S. Louie et al., Thromb. Res. 49: 557-565 (1988); B.K. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11056-11058 (1992)) zu einer wirksamen Zeit (ET, effective time) x1, x2 und x4 nach Infusion des Mittels getestet. Bevorzugt werden für jede Dosisstudie fünfzehn Kaninchen verwendet, und die erforderliche Gesamtzahl an Kaninchen beträgt 150 Kaninchen.

c) Doppelblind-Wirksamkeitsstudie

Auf Basis der vorhergehenden Studie wird eine wirksame Dosis ausgewählt und unter Verwendung des gleichen Protokolls, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, wird eine Doppelblindstudie durchgeführt. Dem Käninchen, ID# nach dem Zufallsprinzip zugeordnet, wird eine Infusion einer Salzlösung verabreicht, welche kein Mittel oder eine wirksame Dosis des Mittels enthält, was dem Forscher bis Vollendung der Studie nicht offenbart wird. Bevorzugt werden für jede Gruppe (mit oder ohne Mittel) fünfzehn Kaninchen verwendet, und die erforderliche Gesamtzahl an Kaninchen beträgt 30 Kaninchen. Die Häufigkeit einer Gerinnselbildung in der Intrakarotis-Kanüle in den zwei Gruppen wird mittels des Chi- Quadrat-Tests verglichen.

d) Studie über die Bioverteilung und Clearancedauer des Mittels

Thio-CHCl-AP&sub4;A wurde von Dr. David Elmaleh, Radiology Department, Massachusetts General Hospital, Boston, MA) oder von einem gewerblichen Markierungsdienst mit ¹²&sup5;I markiert. Die Bioverteilung von [¹²&sup5;I]-Thio-CHCl-AP&sub4;A wird in zwei Gruppen von drei Kaninchen untersucht. 2-5 uCi des Mittels in 0,2 ml Salzlösung werden intravenös in eine Ohrvene der Kaninchen injiziert. Von der anderen Ohrarterie werden 5, 10, 20, 40 und 90 min nach Injektion Blutproben entnommen, gefolgt von Opfern des Tieres mit Pentobarbital (150 mg/kg). Die Hauptorgane, z. B. Blut, Niere, Leber, Lungen, Milz, Gehirn, Schilddrüse, Muskel und Knochen sowie der aus der Blase abgesaugte Urin werden gesammelt und gewogen. Gewebe oder Organe werden in kleinere Stücke geschnitten, gewogen und in Szintillationsröhrchen gegeben, und auf ¹²&sup5;I untersucht. Der Prozentanteil an injizierter Dosis pro Organ wird berechnet.

e) Verabreichungsmethode, Weg und Häufigkeit

Phosphodiesterformen von AP&sub4;A-Analoga treten nicht durch die äußere Zellmembran hindurch (P.C. Zamecnik und M.L. Stephenson in H.M. Kalckar et al., Hrsg., Alfred Benzon Symposium I, 276-291, Munksgaard, Kopenhagen (1968)). Eine jüngere Studie hat jedoch angezeigt, daß die Thionierung der Oligodesoxynucleotide ihre antivirale Wirksamkeit erheblich verstärkt (Leiter, J.M.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3430-3434 (1990); Agrawal, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079- 7083; Zamecnik, P.C. et al., in AIDS Res. Reviews Vol. 1, Koff, W.C. et al. (Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., NY, 301-313 (1991); Matsukura, M., in Antisense Res. and Applications, Crooke, S.T. et al. (Hrsg.), CRC Press, NY, 505-520 (1993)). Dies legte uns die Möglichkeit nahe, daß Thio-CHCl-AP&sub4;A für eine Verabreichung über die Nahrungsaufnahme geeignet sein könnte.
Die Blutwerte des Mittels nach Verabreichung durch einen Magenkatheter in anästhetisierte Kaninchen werden bestimmt. Nach der Anästhesie wird ein Magenkatheter durch den Mund eingeführt und eine gewünschte Dosis des Mittels wird verabreicht. Blutproben werden 10, 30, 60, 120, 240 und 360 min nach Verabreichung des Mittels entnommen. Blutproben werden bezüglich Gesamtblut- Plättchenaggregation überwacht (Cardinal, D.C. und Flower, R.J., J. Pharmacol. Method 3: 135-158 (1980)). Das Mittel wird extrahiert und seine Konzentration in Blut mittels HPLC bestimmt. Dem Säuger werden wiederholte Dosen in einer gewünschten Häufigkeit verabreicht, um eine Blutkonzentration des Mittels, welche für eine Antiplättchen-Aktivität wirksam ist, aufrecht zu halten.
Bevorzugt werden sechs Kaninchen für diese Studie verwendet. Die Ergebnisse aus diesem Experiment werden verwendet, um die Parameter für einen oralen Verabreichungsweg besser zu definieren.

2. Toxizität und Sicherheit des Mittels

Nach der erfolgreichen Vollendung der vorstehend beschriebenen Pharmakologiestudien werden gemäß Standardvorgehensweisen Toxizitätsstudien in Tieren durchgeführt. Bevorzugt werden zwei Tierspezies, Kaninchen und Schweine, für die Toxizitätsstudien ausgewählt. Diese sind etablierte Tierspezies für Toxizitätsstudien und werden von den entsprechenden Zulassungsbehörden für derartige Studien anerkannt. Toxizitätsstudien in Tieren werden in einer GLP- Einrichtung (TSI Mason Laboratories/Genzyme Corp., Worcester, MA) gemäß Standardpraxis ausgeführt. Typischerweise umfassen die akuten Toxizitätsstudien zwei Teile: (1) eine Studie zum Herausfinden eines Bereichs, um den tolerierten Dosisbereich zu etablieren, und (2) eine akute Toxizitätsstudie, um die maximal tolerierte Dosis zu etablieren. Akute Toxizitätsstudien werden gefolgt von chronischen Toxizitätsstudien, um durch wiederholte Verabreichung an die Tiere in verschiedenen Dosismengen (einschließlich einer erwartungsgemäß toxischen Menge) funktionelle und/oder morphologische Veränderungen in Tieren zu induzieren. Der chronische Toxizitätstest wird durchgeführt um Zielorgane zu identifizieren, in denen man das Auftreten ungünstiger Nebenwirkungen erwarten könnte. Während des Verlaufs der Studie werden Tiere in bezug auf Veränderungen des physischen Aussehens und klinischen Verhaltens, Körpergewichtszunahme und Nahrungs- und Wasseraufnahme beobachtet. Ophthalmologische Untersuchung, kardiovaskuläre und andere physiologische Parameter werden gemessen oder überwacht, wenn angebracht. Alle wichtigen Organe und Gewebe werden histopathologisch untersucht.
Ein Test auf akute Toxizität eines Arzneimittels stellt im allgemeinen den ersten Schritt bei der Bewertung seines Toxizitätspotentials dar. Der Sinn eines akuten Toxizitätstests besteht darin, die ungünstigen Wirkungen und, falls möglich, die Lethalität des Mittels bei nur einmaliger Verabreichung in relativ hohen Dosierungen zu definieren. Soweit vorhanden, werden offenkundige Anzeichen einer Toxizität, die bei einer oder mehreren Dosismengen erzeugt werden, festgehalten, und die mittlere lethale Dosis wird abgeschätzt, wenn Todesfälle bei mehr als einer Dosismenge auftreten.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³-rnonochlormethylen-5',5'''- diadenosin-P¹,P&sup4;-tetraphosphat.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³- monochlormethylen-5',5'''-diadenosin-P¹,P&sup4;-tetraphosphat in einer gerinnungshemmend wirksamen Menge vorhanden ist und die Zusammensetzung weiterhin einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die gerinnungshemmend wirksame Menge zwischen 1 mg und 25 mg pro kg Körpergewicht pro Tag beträgt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, weiterhin umfassend eine thrombolytische Menge mindestens eines Thrombolysemittels.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Thrombolysemittel aus der Gruppe, bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase ausgewählt ist.

6. Verwendung von P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³-mochlormethylen-5',5'''-diadenosin-P¹,P&sup4;- tetraphosphat bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung einer thrombolytischen Wirkung.

7. Verwendung von P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³-mochlormethylen-5',5'''-denosin-P¹,P&sup4;- tetraphosphat und einer thrombolytischen Menge mindestens eines Thrombolysemittels bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Modulierung einer thrombolytischen Wirkung.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Thrombolysemittel aus der Gruppe, bestehend aus Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase und Urokinase ausgewählt wird.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Modulierung einer thrombolytischen Wirkung eine Inhibition der Plättchenaggregation umfaßt.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die verwendete Menge an P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³-monochlormethylen-5',5'''-diadenosin-P¹,P&sup4;-tetraphosphat eine Menge ist, welche wirksam ist um die Plättchenaggregation in vivo zu inhibieren.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend P¹,P&sup4;-dithio-P²,P³- monochlormethylen-5',5'''-diadenosin-P¹,P&sup4;-tetraphosphat und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung derart formuliert ist, daß sie eine Einzeldosis zur Verabreichung einem Säuger enthält.