DE60313866T2

DE60313866T2 - Polypeptide mit alpha-h alpha amino acid amide racemase aktivitität und nukleinsäuren kodierend dafür

Info

Publication number: DE60313866T2
Application number: DE60313866T
Authority: DE
Inventors: Wilhelmus Hubertus Boesten; Petronella Catharina Raemakers-Franken; Theodorus Sonke; Gerrit Jan Euverink; Pieter Grijpstra
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2002-06-14
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2023-06-14
Also published as: ATE362544T1; JP4402587B2; WO2003106691A1; DE60313866D1; EP1513946A1; CN100471950C; AU2003238717A1; CN1675371A; US20040248274A1; EP1513946B1; JP2005529611A; ES2285128T3; US7371555B2

Description

Die Erfindung betrifft isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität und Nukleinsäuren, die für diese kodieren. Die Erfindung betrifft außerdem Vektoren und Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung und zur Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Isolieren von Polypeptiden mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivitat, zum Isolieren von Nukleinsäuren, die hierfür kodieren und zum Isolieren von Mikroorganismen, die Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität enthalten. Die Erfindung betrifft außerdem neue Mikroorganismen, die α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität enthalten.
α-H-α-Aminosäureamide sind leicht verfügbare Verbindungen, die wichtige Vorstufen bei der Produktion von Pharmazeutika und von α-H-α-Aminosäuren darstellen. So kann man zum Beispiel enantiomerenangereicherte α-H-α-Aminosäuren aus Mischungen aus D- und L-α-H-α-Aminosäureamiden mit frei gewähltem Enantiomerenüberschuß (ee) dadurch erhalten, daß man mit einem der Enantiomere des α-H-α-Aminosäureamids eine enantioselektive enzymatische Hydrolyse durchführt. So kann zum Beispiel Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 α-H-α-Amino-, α-Alkyl-α-amino-, N-Hydroxy-α-amino-, N-Hydroxy-α-aminosäureamide L-selektiv zu α-Hydroxysäureamiden hydrolysieren (van den Tweel, W.J.J. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1993) 39:296-300). EP 0494716-A2 beschreibt die enzymkatalysierte Herstellung einer α-substituierten optisch aktiven Carbonsäure mittels enantioselektiver Hydrolyse einer Mischung der Enantiomere des entsprechenden Amids, wobei ein Ochrobactrum anthropi oder eine Klebsiella sp. als Enzym verwendet wird. Bei solch einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäuren wäre die gleichzeitige Racemisierung der α- H-α-Aminosäureamide von großem Vorteil, da hiermit eine vollständige Umwandlung des α-H-α-Aminosäureamids in die gewünschte optisch aktive α-H-α-Aminosäure möglich ist. Außerdem ist bei anderen Verfahren häufig die Racemisierung von α-H-α-Aminosäureamiden erwünscht. Da eine enzymatische Racemisierung gegenüber der chemischen Racemisierung bevorzugt ist (schonende Reaktionsbedingungen, Umweltvorteile usw.), hat es nicht an Versuchen gefehlt, Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität zu identifizieren und Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität sowie Gene, die für diese Aktivität kodieren, zu isolieren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität definiert als die Fähigkeit, die Racemisierung eines enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäureamids gemäß Formel 1 zu katalysieren,
wobei R¹ für ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit 1-20 C-Atomen oder ein gegebenenfalls substituiertes (Hetero)aryl mit 3-20 C-Atomen (inklusive der C-Atome der Substituenten) steht und wobei R², R³ und R⁴ jeweils unabhängig für H oder für ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl mit 1-20 C-Atomen oder ein gegebenenfalls substituiertes (Hetero)aryl mit 3-20 C-Atomen (inklusive der C-Atome der Substituenten) stehen und wobei R¹ mit R² und/oder R³ mit R⁴ gemeinsam mit den Kohlenstoff- und/oder Stickstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen Ring bilden können. Jeder Ring ist vorzugsweise 5-8-gliedrig. Vorzugsweise stehen R¹, R², R³ bzw. R⁴ jeweils unabhängig voneinander für ein Alkyl mit 1-10 C-Atomen oder ein (Hetero)aryl mit 3-10 C- Atomen (inklusive der C-Atome der Substituenten). Substituenten am Alkyl oder am (Hetero)aryl können aus der folgenden Gruppe stammen: Hydroxy, Alkoxy, Mercapto, Thioalkyl, Alkyl, Carboxy, Amino, Imino, Nitro, Halogen, Carbamoyl, Cyano, Acyl, Peroxy, Sulfo oder Phospho. Beispiele für α-H-α-Aminosäureamide gemäß Formel 1 sind: Prolinamid, Leucinamid, Glutaminsäureamid, Phenylalaninamid, t-Leucinamid, Methioninamid, Tryptophanamid, Leucylglycin, Valylglycin, Valylalanin, Leucylalanin.
Unter α-H-α-Aminosäureamidracemase versteht man ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität.
Die α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kann mit Verfahren nachgewiesen werden, die den Verfahren für die Bestimmung der racemisierenden Aktivität von Racemasen, die auf Verbindungen, bei denen es sich nicht um α-H-α-Aminosäureamide handelt, einwirken, verwendet werden. Solche Methoden sind dem Fachmann bekannt. So kann man zum Beispiel durch Bestimmen der Abnahme des Enantiomerenüberschusses eines L-α-H-α-Aminosäureamids oder eines D-α-H-α-Aminosäureamids die α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität bestimmen.
Fukumura et al., 1977, Agric. Biol. Chem., Band 41, S. 1509-1510 beschreibt eine aus Achromobacter obere isolierte α-Amino-ε-caprolactamracemase; die Nukleinsäuresequenz, die für dieses Enzym kodiert, sowie die Aminosäuresequenz dieses Enzyms wurden in Naoko et al., 1987, Biochemistry of vitamin B6, S. 449-452 veröffentlicht. Für ihre Enzymaktivität benötigt die aus Achromobacter obere isolierte α-Amino-ε-caprolactamracemase Pyridoxal-5-phosphat als Kofaktor (Ahmed et al., 1983, Agric. Biol. Chem., Band 47, S. 1887-1893).
Es ist bekannt, daß die aus Achromobacter obere isolierte α-Amino-ε-caprolactamracemase ausschließlich die Racemisierung von α-Amino-ε-caprolactam katalysiert. Obwohl die α-Amino-ε-caprolactamracemase aus Achromobacter obae mit den folgenden Substraten, bei denen es sich um α-H-α-Aminosäureamide gemäß Formel 1 handelt: L-Tryptophanamid, L-Leucinamid, L-Leucylglycin, L-Valylglycin, L-Valyl-L-alanin, L-Leucyl-L-alanin, auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet wurde, wurde sogar dann, wenn ein Überschuß an Enzym verwendet wurde, keine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gefunden (Ahmed et al., 1983, Agric. Biol. Chem., Band 47, S. 1887-1893).
EP-A-383403 beschreibt eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität bei der Gattung Klebsiella sowie verwandten Gattungen, und EP-B1-378592 beschreibt eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität bei Arthrobacter sp. ATCC 31652 (DSM 4639) und bei Corynebacterium sp. ATCC 31662 (DSM 4640). Mit dem in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Mikroorganismen wurde jedoch keine Racemisierung nachgewiesen. Die Schriften EP-A-383403 und EP-B1-378592 sollten daher nicht als Stand der Technik betrachtet werden.
Obwohl also intensiv an der Entdeckung einer α-H-α-Aminosäureamidracemase gearbeitet wurde, ist bis jetzt keine einzige α-H-α-Aminosäureamidracemase beschrieben worden.
Solche α-H-α-Aminosäureamidracemasen werden nun durch die Erfindung bereitgestellt.
Überraschenderweise wurde von den Anmeldern auch ein geeignetes Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gefunden, bei dem eine mikroorganismenhaltige Probe mit D-α-Amino-ε-caprolactam oder einer Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einziger Stickstoffquelle angereichert wird und bei dem die so gefundenen Kulturen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet werden.
Eine geeignete Art und Weise für die Durchführung solch eines Verfahrens lautet zum Beispiel folgendermaßen; dieses Verfahren wird in Zukunft als Anreicherungsverfahren bezeichnet werden. Um erfindungsgemäße Polypeptide aufzufinden, wird eine mikroorganismenhaltige Probe, z.B. eine Umweltprobe, zum Beispiel eine Bodenprobe oder eine Abwasserprobe, in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, so lange gezüchtet, bis ein Wachstum nachgewiesen wird.
Die Probe kann direkt auf/in das geeignete Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, gegeben werden. Es gibt auch noch andere Möglichkeiten, die Probe auf das Medium aufzutragen, zum Beispiel durch Versetzen mit dem Filtrat einer Waschlösung, die zum Waschen der Probe verwendet wurde.
Die Züchtung der Umweltprobe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, ist eine sogenannte Anreicherung, die von Fukumura et al., 1977, Agric. Biol. Chem., Band 41, S. 1321-1325 beschrieben wurde, der diese Anreicherung bei einem Verfahren zum Isolieren von α-Amino-ε-caprolactamracemasen verwendete. Die Anreicherung wird vorzugsweise durch ein- oder mehrmaliges Passagieren des gezüchteten Mikroorganismus bzw. der gezüchteten Mikroorganismen in oder auf ein 'frisches' geeignetes Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als einzige Stickstoffquelle enthält, fortgesetzt, und zwar so lange, bis eine Reinkultur (im Gegensatz zu einer Mischkultur) erzielt wird. Dies wird typischerweise nach 4- oder 5 Passagen der Fall sein.
Es kann vorteilhaft sein, auch noch andere Stickstoffquellen als D- oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam zuzugeben; zum Beispiel, um die Kulturen beim Beginn des Wachstums zu unterstützen. Für eine gute Anreicherung liegt jedoch das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung von D- und L-α-Amino-ε-caprolactam in solchen Mengen vor, daß Mikroorganismen mit der Fähigkeit, D- und/oder L-α-Amino-ε-caprolactam umzusetzen, weiter wachsen können, während dies anderen Mikroorganismen nicht möglich ist.
Der Fachmann weiß, wie die Kulturbedingungen zu wählen sind; so können die Kulturbedingungen zum Beispiel von der Herkunft der Umweltprobe und/oder den gewünschten Bedingungen für das gewünschte Verfahren abhängig sein.
Die durch Anreicherung erhaltenen Mikroorganismen werden auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet. Dieses Testen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kann direkt an den ganzen Zellen oder an permeabilisierten Zellen von Kolonien, die nach dem Ausplattieren der gezüchteten Mikroorganismen erhalten wurden, erfolgen. Alternativ dazu werden die erhaltenen Kolonien getrennt in einem geeigneten Wachstumsmedium gezüchtet, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung von D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle oder als einzige Stickstoffquelle enthält, wonach hieraus ein zellfreier Extrakt hergestellt wird, der anschließend auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet wird.
Ein zellfreier Extrakt kann nach Standardverfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, hergestellt werden, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung, mit der French-Press usw. Eine Zellpermeabilisierung kann nach Standardverfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, erfolgen, zum Beispiel durch Versetzen mit kleinen Mengen Toluol. Geeignete Wachstumsmedien sind alle diejenigen Medien, die D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthalten. Geeignete Wachstumsmedien sind der Fachwelt gut bekannt. Sie können zum Beispiel vom Fachmann unter Zuhilfenahme von Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, entwickelt werden.
Das Prüfen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität erfolgt vorzugsweise an einer Reinkultur, kann jedoch auch an einer Mischkultur vorgenommen werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Misch- und/oder Reinkulturen, die nach dem Anreicherungsverfahren erhalten wurden, auf die Fähigkeit, L-α-Amino-ε-caprolactam und auf die Fähigkeit, D-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. einzige Stickstoffquelle zu verwerten, getestet.
Die Erfindung betrifft also auch ein Verfahren zum Isolieren von Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt:

a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen,
b. Testen der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich das Anreicherungsverfahren für die Isolation von Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität eignet. Dies ist umso mehr überraschend, als bei dieser Anreicherung auf α-Amino-ε-caprolactamracemase-Aktivität und nicht auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität selektiert wird. Die Erfindung betrifft daher auch neue Mikroorganismen (enthaltend Polypeptide) mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, die mit diesem Verfahren erhalten werden können.
Auf diese Weise können verschiedene Mikroorganismen isoliert werden; so kann man zum Beispiel Mikroorganismen der folgenden Gattungen isolieren: Agrobacterium, Ochrobactrum, Arthrobacter, Micrococcus, Aureobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Rubrobacter, Nocardioides, Terrabacter.
Mit dem Anreicherungsverfahren wurden verschiedene Reinkulturen von Stämmen von Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität isoliert, und diese Mikroorganismen werden gemäß dem Budapester Vertrag am 8. Mai 2002 bei The National Collections of Industrial and Marine Bateria Limited (NCIMB), Aberdeen, Schottland, hinterlegt: Agrobacterium rhizogenes Na wurde unter der Nummer NCIMB 41127 hinterlegt, Agrobacterium rhizogenes Bi wurde unter der Nummer NCIMB 41128 hinterlegt, Arthrobacter nicotianae wurde unter der Nummer NCIMB 41126 hinterlegt, Ochrobactrum anthropi 1A wurde unter der Nummer NCIMB 41129 hinterlegt.
Aus den mit dem Anreicherungsverfahren erhaltenen isolierten Mikroorganismen kann man eine Nukleinsäuresequenz isolieren, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, und diese Nukleinsäure kann kloniert und exprimiert werden, um zu einem erfindungsgemäßen Polypeptid zu gelangen. Die Isolation einer Nukleinsäuresequenz und deren anschließendes Umklonieren und Expression kann nach Standardmethoden erfolgen, mit denen der Fachmann vertraut ist.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, das die folgenden Schritte umfaßt:

a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen,
b. Testen des so erhaltenen Mikroorganismus bzw. der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität;
c. Isolieren einer Nukleinsäuresequenz, die für eine α-H-α-Aminosäureamidracemase kodiert, aus dem erhaltenen Mikroorganismus bzw. den erhaltenen Mikroorganismen auf bekannte Weise.

Das Isolieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, aus einem Mikroorganismus mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kann zum Beispiel dadurch erfolgen, daß man eine DNA-Bibliothek, eine cDNA-Bibliothek oder eine Expressionsbibliothek aus dem Mikroorganismus bzw. den Mikroorganismen mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität herstellt, und zwar durch (teilweises) Aufreinigen des Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, wonach sich ein "reversed genetics"-Schritt anschließt, oder dadurch, daß man Nukleinsäure-Arrays verwendet. Alle diese Techniken sind dem Fachmann bekannt. So kann zum Beispiel nach der Herstellung einer DNA- oder cDNA-Bibliothek die Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, durch Verwendung einer Sonde oder eines PCR-Primers, die bzw. der auf einer Sequenzinformation eines homologen Gens oder auf einer Sequenzinformation eines Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität beruht, selektiert werden. So kann zum Beispiel nach der Herstellung einer Expressionsbibliothek der Klon der Bibliothek, der über eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität verfügt, dadurch selektiert werden, daß man einen α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivitäts-Assay verwendet, dadurch, daß man das Anreicherungsverfahren der Erfindung durchführt, oder dadurch, daß man Antikörper gegen ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität erzeugt. So kann man zum Beispiel "reversed genetics" dadurch durchführen, daß man das Polypeptid (bzw. einen Teil des Polypeptids) mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität aufreinigt und sequenziert und die gewünschte Nukleinsäuresequenz, die auf der Sequenzinformation des Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität beruht, isoliert, zum Beispiel mit einer Sonde oder einem PCR-Primer. So können zum Beispiel DNA-Arrays dazu verwendet werden, um die Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, abzuleiten, wenn die Genomsequenz des Mikroorganismus mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität bekannt ist, und zwar dadurch, daß man das Expressionsmuster des Mikroorganismus unter Bedingungen, unter denen der Mikroorganismus keine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität ausübt, mit Bedingungen, unter denen der Mikroorganismus sehr wohl eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität ausübt, vergleicht.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz, die für eine α-H-α-Aminosäureamidracemase kodiert, folgendermaßen isoliert.
In einem ersten Schritt wird aus den Mikroorganismen, die mit den Anreicherungsverfahren erhalten wurden, Gesamt-DNA isoliert und eine Genbibliothek hergestellt und in einem geeingneten Vektor in einem geeigneten Wirt exprimiert (z.B. wie dies in den Beispielen beschrieben ist). In einem zweiten Schritt werden die Klone der Genbibliothek, die einen Vektor mit Insert enthalten (bei dem Insert handelt es sich um ein Stück DNA, das aus dem Mikroorganismus isoliert wurde), auf die Fähigkeit, die Racemisierung eines α-H-α-Aminosäureamids zu katalysieren, getestet. Das Testen der Klone auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kann gemäß den Verfahren, die in den Beispielen beschrieben sind, erfolgen.
In anschließenden Schritten wird die Nukleinsäuresequenz des Inserts des Vektors in einem Klon mit der Fähigkeit, die Racemisierung eines α-H-α-Aminosäureamids zu katalysieren, bestimmt, und aus der so bestimmten Nukleinsäuresequenz werden offene Leseraster identifiziert, wonach die offenen Leseraster umkloniert und in einem geeigneten Vektor und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden und erneut auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet werden. Durch Exprimieren des offenen Leserasters, das für α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, in einem geeigneten Vektor in einem geeigneten Wirt kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität erzeugt werden.
Mit dem Anreicherungsverfahren und der anschließenden Isolation der Nukleinsäuresequenz wurde die Nukleinsäuresequenz, die für eine α-H-α-Aminosäureamidracemase aus einem Stamm, der als Ochrobactrum anthropi 1A identifiziert und unter der Nummer NCIMB 41129 beim NCIMB hinterlegt wurde, kodiert, erhalten. Diese Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID: NO. 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des entsprechenden Polypeptids ist in SEQ ID: NO. 2 dargestellt. Es wurde gefunden, daß die α-H-α-Aminosäureamidracemase, deren Aminosäuresequenz in SEQ ID: NO. 2 dargestellt ist, über einen breiten pH- und Temperaturbereich aktiv ist. Mit diesem Anreicherungsverfahren wurde auch die Nukleinsäuresequenz, die für eine α-H-α-Aminosäureamidracemase aus einem Stamm, der als Arthrobacter nicotianae identifiziert und unter der Nummer NCIMB 41126 beim NCIMB hinterlegt wurde, kodiert, erhalten (SEQ ID: NO. 8). Die Aminosäuresequenz des entsprechenden Polypeptids ist in SEQ ID: NO. 9 dargestellt.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodieren und die nach dem oben genannten Verfahren erhalten werden können.
Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, wie eine Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID: NO. 1 oder SEQ ID: NO. 8, kann auch nach standardmäßigen molekularbiologischen Techniken mit der im vorliegenden Text bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. So kann zum Beispiel eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz mittels standardmäßigen Hybridisierungs- und Klonierungstechniken (z.B. wie sie bei Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben sind) isoliert werden, und zwar dadurch, daß man die gesamte Nukleinsäuresequenz SEQ ID: NO. 1 oder SEQ ID: NO. 8 oder einen Teil dieser Nukleinsäuresequenzen als Hybridisierungssonde verwendet.
Weiterhin kann eine Nukleinsäuresequenz, die die gesamte SEQ ID: NO. 1 oder SEQ ID: NO. 8 oder einen Teil dieser Sequenzen umfaßt, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit synthetischen Oligonukleotid- Primern isoliert werden, die auf Grundlage der Sequenzinformation in SEQ ID: NO. 1 oder SEQ ID: NO. 2 bzw. SEQ ID: NO. 8 oder SEQ ID: NO. 9 entwickelt wurden.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel mit genomischer DNA, cDNA oder auch mRNA als Matrize und entsprechenden Oligonukleotid-Primern gemäß standardmäßigen (RT)-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einem geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
Weiterhin können Oligonukleotide, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen entsprechen bzw. mit diesen hybridisieren, mit standardmäßigen Synthesetechniken hergestellt werden, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät.
Es ist anzumerken, daß die Erfindung auch Mutanten der Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodieren, und die im Vergleich zu dem entsprechenden, aus einem natürlich vorkommenden Wirt isolierten Polypeptid eine oder mehrere Mutationen aufweisen, beinhaltet. Verfahren zur Erzeugung von Mutationen sind dem Fachmann bekannt, z.B. mittels Zufallsmutagenese (zum Beispiel mittels "error-prone"-PCR oder UV-Strahlung), gerichtete Mutagenese usw.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt:

a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen,
b. Testen des so erhaltenen Mikroorganismus bzw. der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität;
c. Isolieren der Nukleinsäuresequenz aus dem erhaltenen Mikroorganismus bzw. den erhaltenen Mikroorganismen auf bekannte Weise,
d. Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten Wirt, um ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität herzustellen.

Das Exprimieren der Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, kann zum Beispiel dadurch erfolgen, daß man die Nukleinsäure in einem geeigneten Vektor kloniert und nach dem Einführen in einen geeigneten Wirt die Sequenz gemäß standardmäßigen Klonierungs- und Expressionstechniken, die dem Fachmann bekannt sind (wie zum Beispiel bei Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben) (über)exprimiert, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid herzustellen. Die Erfindung betrifft daher auch Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthalten.
Zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Polypeptids kann die Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert, jedoch auch in das Genom einer Wirtszelle integriert und (über)exprimiert werden. Dies kann nach Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, erfolgen. Die Erfindung betrifft daher auch eine Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält und exprimiert, vorzugsweise eine Wirtszelle, die einen Vektor enthält, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann jedoch auch in seinem natürlichen Wirt überexprimiert werden, zum Beispiel dadurch, daß man der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz einen geeigneten Promoter voranstellt, daß man eine oder mehrere Kopien einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in das Genom ihres natürlichen Wirts integriert, vorzugsweise dadurch, daß man eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem geeigneten Vektor in dem natürlichen Wirt exprimiert, wobei es sich bei all diesen Methoden um Methoden, die dem Fachmann vertraut sind, handelt.
Geeignete Wirte sind diejenigen Wirte, die üblicherweise für Klonierungs- und Expressionszwecke verwendet werden und mit denen der Fachmann vertraut ist. Beispiele für geeignete Wirtsstämme von E. coli sind: TOP10F', TOP10, DH10B, DH5α, HB101, W3110, BL21(DE3) und BL21(DE3)pLysS.
Geeignete Wirte sind diejenigen Wirte, die üblicherweise für Klonierungs- und Expressionszwecke verwendet werden und mit denen der Fachmann vertraut ist. Beispiele für geeignete Vektoren für die Expression von E. coli sind zum Beispiel in Tabelle 1 in Makrides, S.C., 1996, Microbiological Reviews, S. 512-538, angegeben. Vorzugsweise enthält der Vektor oberhalb der Klonierungsstelle, die die Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, enthält, einen Promoter, der angeschaltet werden kann, nachdem der Wirt gezüchtet worden ist, um das entsprechende Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität zu exprimieren. Promoter, die an- und abgeschaltet werden können, sind dem Fachmann vertraut; dies sind zum Beispiel der lac-Promoter, der araBAD-Promoter, der T7-Promoter, der trc-Promoter, der tac-Promoter der trp-Promoter und der aroH-Promoter.
Die Erfindung betrifft daher Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, die nach dem oben genannten Verfahren erhältlich sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität und mit mindestens ungefähr 55%, insbesondere mindestens ungefähr 65%, speziell bevorzugt mindestens ungefähr 75%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 85%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 90%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 95%, ganz besonders speziell bevorzugt mindestens ungefähr 97% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 2.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität und mit mindestens ungefähr 50%, insbesondere mindestens ungefähr 60%, speziell bevorzugt mindestens ungefähr 70%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 80%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 90%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 95%, ganz besonders speziell bevorzugt mindestens ungefähr 97% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 9.
Für die vorliegende Erfindung wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen mit dem "blastp pairwise alignment algorithm" (NCBI) mit einer Identitätstabelle und den folgenden Alignment-Parametern bestimmt: mismatch = –3, penalty = –3, gap extend = 1, match bonus = 1, Gap x – droff = 50, expect = 10, wordsize = 3.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, die von Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die mit SEQ ID: NO. 1 oder einem dazu komplementären Strang oder mit SEQ ID: NO. 8 oder einem dazu komplementären Strang unter Bedingungen mit niedriger Stringenz, vorzugsweise unter Bedingungen mit mittelhoher Stringenz, stärker bevorzugt unter Bedingungen mit hoher Stringenz und am stärksten bevorzugt unter Bedingungen mit sehr hoher Stringenz hybridisieren.
Hybridisierungsversuche können nach verschiedenen Verfahren, mit denen der Fachmann vertraut ist, durchgeführt werden. Allgemeine Richtlinien für das Auswählen unter diesen verschiedenen Methoden finden sich z.B. in Kapitel 9 von Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Unter Stringenz der Hybridisierungsbedingungen versteht man die Bedingungen, unter denen die Hybridisierung, die aus der tatsächlichen Hybridisierung und den Waschschritten besteht, durchgeführt wird. In den Waschschritten werden die Nukleinsäuren, die nicht mit der Zielnukleinsäure, die auf z.B., einem Nitrozellulosefilter immobilisiert ist, hybridisieren, weggewaschen. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen kann zum Beispiel durch Verändern der Salzkonzentration der Waschlösung und/oder durch Verändern der Temperatur, unter der der Waschschritt durchgeführt wird (Waschtemperatur) verändert werden. Die Stringenz der Hybridisierung steigt mit sinkender Salzkonzentration in der Waschlösung bzw. mit erhöhter Waschtemperatur. Für den Zweck der vorliegenden Anmeldung wird die Hybridisierung ungefähr 12 Stunden lang bei ungefähr 45°C in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) durchgeführt. Zwei aufeinanderfolgende Waschschritte mit 1 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C ist ein Beispiel für niedrige Stringenz, bei 55°C ein Beispiel für mittlere Stringenz, bei 60°C ein Beispiel für hohe Stringenz, bei 65°C ein Beispiel für sehr hohe Stringenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, die eine immunologische Kreuzreaktivität mit einem Antikörper gegen ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 2 oder SEQ ID: NO. 9 aufweist.
Die immunologische Kreuzreaktivität kann dadurch im Assay geprüft werden, daß man einen Antikörper verwendet, der gegen mindestens einen Epitop des isolierten erfindungsgemäßen Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität erzeugt wurde bzw. mit diesem Epitop reagiert. Der Antikörper, der entweder monoklonal oder polyklonal sein kann, kann nach fachbekannten Verfahren hergestellt werden, wie sie z.B. von Hudson et al., Practical Immunology, Dritte Ausgabe (1989), Blackwell Scientific Publications, beschrieben sind. Die immunochemische Kreuzreaktivität kann dadurch bestimmt werden, daß man fachbekannte Assays verwendet, zum Beispiel Western-Blotting, z.B. wie bei Hudson et al., Practical Immunology, Dritte Ausgabe (1989), Blackwell Scientific Publications, beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität mit mindestens 100 Aminosäuren, vorzugsweise 125 bis 350 Aminosäuren, stärker bevorzugt 200 bis 300 Aminosäuren.
Die Erfindung betrifft auch Fusionsproteine, die durch Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, in operativer Verknüpfung mit einer oder mehreren Nukleinsäuresequenz(en), die für (ein) Markerpolypetid(e) kodiert/kodieren, hergestellt werden. Unter operativer Verknüpfung versteht man, daß die Nukleinsäuresequenzen so verknüpft sind, daß, wenn sie exprimiert werden, das erfindungsgemäße Polypeptid mit dem Markerpolypeptid bzw. den Markerpolypeptiden an seinem N- und/oder C-terminalen Ende erzeugt wird. Das Markerpolypeptid kann verschiedenen Zwecken dienen; so kann es zur Erhöhung der Stabilität oder Löslichkeit des Fusionsproteins verwendet werden, es kann als Sekretionssignal verwendet werden, bei dem es sich um ein Signal handelt, das das Fusionsprotein an ein gewisses Zellkompartiment adressiert, oder es kann dazu verwendet werden, um die Aufreinigung des Fusionsproteins zu erleichtern. Ein Beispiel für ein Markerpolypeptid, das dafür verwendet wird, um die Aufreinigung des Fusionsproteins zu erleichtern, ist das Hexahistidinpeptid. Die Aufreinigung eines Fusionsproteins mit Hexahistidin-Tag ist zum Beispiel bei Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, S. 821-824 beschrieben. Ein Fusionsprotein mit Hexahistidin-Tag kann zum Beispiel in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) nach der Vorschrift des Zulieferers hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit einer erfindungsgemäßen α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodieren. Diese Nukleinsäuresequenzen können nach dem Anreicherungsverfahren und der anschließenden Isolation der gewünschten Nukleinsäuren wie oben beschrieben erhalten werden.
α-H-α-Aminosäureamidracemasen und Mikroorganismen, die eine erfindungsgemäße α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität aufweisen können, können in einem Verfahren zur Racemisierung eines enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäureamids verwendet werden. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Racemisierung eines enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäureamids, wobei die Racemisierung in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus durchgeführt wird.
Erfindungsgemäße α-H-α-Aminosäureamidracemasen können zweckmäßig gemeinsam mit einer enantioselektiven Amidase in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäuren aus einer Mischung von D- und L-α-H-α-Aminosäureamiden oder in einem Verfahren zur Herstellung von L-α-H-α-Aminosäuren aus den entsprechenden D-α-H-α-Aminosäureamiden oder in einem Verfahren zur Herstellung von D-α-H-α-Aminosäuren aus den entsprechenden L-α-H-α-Aminosäureamiden verwendet werden. Die Verwendung von α-H-α-Aminosäureamidracemasen in solchen Verfahren wird (theoretisch) einer 100%igen Umsatzrate des α-H-α-Aminosäureamids in die entsprechende enantiomerenangereicherte α-H-α-Aminosäure (Ausbeute 100%) führen. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen α-H-α-Aminosäureamidracemase in Kombination mit einer enantioselektiven Amidase in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäuren aus einer Mischung aus D- und L-α-H-α-Aminosäureamiden oder in einem Verfahren zur Herstellung von L-α-H-α-Aminosäuren aus den entsprechenden D-α-H-α-Aminosäureamiden oder in einem Verfahren zur Herstellung von D-α-H-α-Aminosäuren aus den entsprechenden L-α-H-α-Aminosäureamiden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäure aus einer Mischung der entsprechenden D- und L-α-H-α-Aminosäureamide oder zur Herstellung einer L-α-H-α-Aminosäure aus dem entsprechenden D-α-H-α-Aminosäureamid oder zur Herstellung einer D-α-H-α-Aminosäure aus dem entsprechenden L-α-H-α-Aminosäureamid, wobei das Verfahren in Gegenwart einer enantioselektiven Amidase und in Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität oder in Gegenwart eines Mikroorganismus, der eine erfindungsgemäße α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität aufweist, durchgeführt wird.
Vorzugsweise ist die enantioselektive Amidase mindestens 90% enantioselektiv, stärker bevorzugt mindestens 95% enantioselektiv, noch stärker bevorzugt mindestens 98% enantioselektiv, am stärksten bevorzugt mindestens 99% enantioselektiv. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine 90%ige Enantioselektivität für die Amidase (zum Beispiel eine D-Amidase) als diejenige Fähigkeit der Amidase definiert, eine racemische Mischung von DL-α-H-α-Aminosäureamiden in 90% des einen Enantiomers der α-Aminosäure (z.B. D-α-H-α-Aminosäure) und in 10% des anderen Enantiomers der α-H-α-Aminosäure (z.B. L-α-H-α-Aminosäure) bei einer 50%igen Gesamtumsatzrate der α-H-α-Aminosäureamidmischung umzuwandeln. Eine 95%ige Enantioselektivität (z.B. 95% D- und 5% L-α-H-α-Aminosäure) entspricht einem E-Wert von 58,4 (e.e. 90%). 98% Enantioselektivität (z.B. 98% D- und 2% L-α-H-α-Aminosäure) entspricht einem E-Wert von 193,6 (e.e. 96%). 99% Enantioselektivität (z.B. 99% D- und 1% L-α-H-α-Aminosäure) entspricht einem E-Wert von 458,2 (e.e. 98%).
Für die α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kann es manchmal vorteilhaft sein, einen Kofaktor, zum Beispiel Pyridoxal-5-phosphat, zuzugeben.
Bei diesem Verfahren weist die erfindungsgemäße α-H-α-Aminosäureamidracemase vorzugsweise keine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität auf, also keine Fähigkeit, die Racemisierung einer D-α-H-α-Aminosäure und einer L-α-H-α-Aminosäure zu katalysieren.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sollen die Erfindung jedoch nicht einschränken.
Beispiele
Allgemeine Vorgehensweisen
Standardmäßige Techniken der molekularen Klonierung, wie Isolation von Plasmid-DNA, Gelelektrophorese, Modifikation von Nukleinsäuren mittels enzymatischer Restriktion, Transformation von E. coli, usw., wurden wie von Sambrook et al. 1989, "Molecular Cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY oder im Handbuch des Zulieferers beschrieben durchgeführt. Standardmäßige Enzyme für die molekulare Klonierung wie Restriktionsendonukleasen, T4-DNA-Ligase usw. wurden, falls nicht anders erwähnt, von Invitrogen (Breda, Niederlande) bezogen. Synthetische Oligodesoxynukleotide stammten von Sigma-Genosys (Cambridge, GB) und Invitrogen (Paisley, Schottland, GB). Die DNA-Sequenzanalysen wurden von BaseClear (Leiden, Niederlande) durchgeführt und zwar mit dem Kettenabbruchverfahren mit farbstoffmarkierten Didesoxy-Terminatoren.
Beispiel 1
Anreicherungsverfahren
Bei diesem Anreicherungsverfahren wurden unterschiedliche Boden- und Schlammproben, die bei –80°C aufbewahrt worden waren, für die direkte Inokulation von 50 ml Flüssigmedium A (Yeast Carbon Base (Difco, 11,7 g/l), KH₂PO₄ (6,7 g/l), K₂HPO₄ (8,9 g/l), pH 7,0) mit racemischem DL-α-Amino-ε-caprolactam (2 g/l) als einziger Stickstoffquelle verwendet. Pro Kolben wurde eine Spatelspitze inoculum verwendet. Die verschiedenen Flaschen wurden bei 28°C und 200 U/min inkubiert.
Nach ungefähr 2 Tagen wurde in allen Kolben gutes Wachstum beobachtet. Nach dem Sedimentieren der Bodenteilchen in allen Kulturen wurden 1:1500- Verdünnungen in Medium A, das 2 g/l DL-α-Amino-ε-caprolactam enthielt, hergestellt und bei 28°C und 200 U/min inkubiert. Nachdem ein ausreichend starkes Wachstum stattgefunden hatte, wurden aus jedem Kolben Proben entnommen, um die Konzentration von L- und D-α-Amino-ε-caprolactam in den Kulturbrühen zu bestimmen. Diese Proben wurden zentrifugiert und die Überstände wurden zum Entfernen aller Zellen durch ein 0,45-μM-Filter filtriert. Anschließend wurden diese Proben mittels HPLC analysiert. Bei dieser HPLC-Methode wurde o-Phthaldehyd in Kombination mit D-3-Mercapto-2-methylpropionsäure als chirales Reagens für die Trennung der beiden α-Amino-ε-caprolactam-Enantiomeren verwendet (Duchateau et al., 1992, J. Chromatogr., Bd. 623, S. 237-245).
Für die nächsten Schritte wurden nur solche Kolben verwendet, in denen Kulturen herangewachsen waren, die beide α-Amino-ε-caprolactam-Enantiomere verwerteten. Unterschiedliche Verdünnungen dieser Kulturen wurden auf Platten mit Medium A, das 2 g/l DL-α-Amino-ε-caprolactam als einzige Stickstoffquelle enthielt, ausgestrichen und bei 28°C inkubiert. Zufallsmäßig gewählte Kolonien wurden nochmals auf der gleichen Art selektiven Platten isoliert, um zu Reinkulturen zu gelangen. Dann wurde eine Kolonie von jeder Reinkultur in 5 ml Medium A, das 2 g/l DL-α-Amino-ε-caprolactam enthielt, überführt. Nach 3tägiger Inkubation bei 28°C und 200 U/min wurden die erhaltenen Kulturen genau wie oben beschrieben auf die Verwertung von D- und L-α-Amino-ε-caprolactam analysiert. Diejenigen Reinkulturen, die sowohl D- als auch L-α-Amino-ε-caprolactam verwerten konnten, wurden bei –80°C in 20% (v/v) Glycerol aufbewahrt.
Zellen von diesen Reinkulturen wurden schließlich auf α-Amino-ε-caprolactamracemase-Reaktivität getestet. Nach 3tägiger Kultur in Medium A, das DL-α-Amino-ε-caprolactam (2 g/l) enthielt bei 28°C und 200 U/min wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, mit 20 mM HEPES-NaOH Puffer (pH 7,7) gewaschen und lyophilisiert.
Dann wurde ein Ansatz, der aus 10 mM HEPES -NaOH Puffer (pH 7,7), Toluol (2,5 v/v%), Pyridoxal-5-phosphat (20 μM) und L-α-Amino-ε-caprolactam (2,5 m%) bestand, mit 100 mg dieser lyophilisierten Zellen von jeder Reinkultur versetzt. Als Negativkontrolle wurden chemische Blindproben (Assay-Mischung ohne lyophilisierte Zellen) verwendet. Alle Ansätze (inklusive der Blindproben) wurden ungefähr 72 Stunden lang bei 40°C inkubiert, und dann wurde die Reaktion durch Versetzen mit 9 Volumenteilen 1 M H₃PO₄ gestoppt. Nach dem Entfernen der Zellen durch Filtrieren durch ein 0,45-μM-Filter wurden diese Ansätze mit der oben beschriebenen HPLC-Methode analysiert, um die Konzentration von D- und L-α-Amino-ε-caprolactam zu bestimmen. Schließlich wurden Reinkulturen, die D-α-Amino-ε-caprolactam aus dem L-α-Amino-ε-caprolactam-Substrat bildeten, zwecks Stammbestimmung an die NCIMB gesandt.
Zur Beachtung: in den chemischen Blindproben konnte kein D-α-Amino-ε-caprolactam bestimmt werden.
Stammbestimmung

Eine der so erhaltenen Reinkulturen, die zur Racemisierung von L-α-Amino-ε-caprolactam fähig war, wurde von der NCIMB als ein Ochrobactrum anthropi-Stamm bestimmt und gemäß dem Budapester Vertrag bei der NCIMB unter der Nummer NCIMB 41129 als Ochrobactrum anthropi IA hinterlegt. Die Ergebnisse der Bestimmung sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Ergebnisse der Stammidentifikation von Isolat IA durch die National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB LTD). Identifikationsnummer ID4036.

Isolat Nr.	IA
Inkubationstemperatur (°C)	30
Gramfärbung	–
Sporen	–
Beweglichkeit	+
Morphologie der Kolonien (nach zweitägigem Wachstum auf LB-Medium)	Rund, regelmäßig, vollständig, glatt, glänzend, leicht konvex, beige, undurchsichtig, 1 mm Durchmesser
Wachstum bei 37°C	+
Wachstum bei 45°C	–
Katalase	+
Oxidase	+
Fermentativ in Glukose-OF	Oxidativ
Ergebnisse des API 20 NE-Tests:
NO₃-Reduktion	+
Indolreduktion	–
Säure aus Glukose	–
Arginindihydroxylase	–
Urease	+
Hydrolyse von Aesculin	–
Hydrolyse von Gelatine	–
β-Galactosidase	–
Verwertung von Glucose	+
Verwertung von Arabinose	+
Verwertung von Mannose	+
Verwertung von Mannit	+
Verwertung von N-Acetylglucosamin	+
Verwertung von Maltose	–
Verwertung von Gluconat	–
Verwertung von Caprat	–
Verwertung von Adipat	–
Verwertung von Malat	+
Isolat Nr.	IA
Verwertung von Citrat	+
Verwertung von Phenylacetat	–
Cytochromoxidase	+
Ergebnisse von weiteren biochemischen Tests:
Säureproduktion in:
Glucose-ASS^a	+
Dulcitol-ASS	+
Adonitol-ASS	+
Raffinose-ASS	–
Xylose-OF	+
Glycin-CSU^b	+
Nitritreduktion zu N₂	+
PPA	+
Simmons-Citrat	–
Hydrolyse von Tween 80	–
Abbau von Tyrosin	–
H₂S-Produktion (PbAc)	+

^a: ASS = Ammoniumsalz-Zucker
^b: CSU (carbon source utilization) = Verwertung der Kohlenstoffquelle

Bestimmung der α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität von lyophilisierten Ochrobactrum anthropi IA Zellen
O. anthropi IA Zellen wurden in Medium A, das DL-α-Amino-ε-caprolactam (2 g/l) als einzige Stickstoffquelle enthielt, kultiviert. Nach 3tägiger Inkubation bei 28°C und 200 U/min (OD_{620 mm} = 4,7) wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit 20 mM HEPES-NaOH Puffer, pH 7,7, gewaschen und lyophilisiert.
Mit den lyophilisierten Zellen wurde die α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität nachgewiesen. Die Assay-Mischung bestand aus 10 mM HEPES-NaOH Puffer (pH 7,7), der Toluol (2,5 v/v%), Pyridoxal-5-phosphat (20 mM), D- oder L-Leucinamid (2,5 m%) sowie gegebenenfalls EDTA (20 mM) enthielt. Pro Assay wurden 150 mg lyophilisierte Zellen verwendet. Als Negativkontrolle wurden chemische Blindproben (mit Assaymischung, jedoch ohne O. anthropi IA Zellen) verwendet. Alle Ansätze (inklusive Blindproben) wurden ungefähr 72 Stunden lang bei 40°C inkubiert, wonach die Reaktion durch Versetzen mit 9 Volumenteilen 1 M H₃PO₄ gestoppt wurde. Schließlich wurden die Ansätze mittels HPLC analysiert, um die Konzentration von D- und L-Leucinamid und von D- und L-Leucin zu bestimmen. Bei dieser HPLC-Methode wurde o-Phthaldehyd in Kombination mit D-3-Mercapto-2-methylpropionsäure als chirales Reagens für die Trennung der beiden α-Amino-ε-caprolactam-enantiomeren verwendet (Duchateau et al., 1992, J. Chromatogr., Bd. 623, S. 237-245).
Bei mehreren Ansätzen wurde mit EDTA versetzt, um in den O. anthropi IA Zellen vorhandene L- und/oder D- spezifische Amidase(n) zu hemmen. Durch Hemmung dieser Amidase wird das L- und/oder D-Aminisäureamid nicht oder nur teilweise in die entsprechende Aminosäure umgewandelt, was dem Nachweis von Aminosäureamidracemaseaktivität durch Nachweisen des anderen Aminosäureamidenantiomers ermöglicht. Diese Ansätze mit EDTA (Nr. 3 und 4) zeigten deutlich, daß O. anthropi IA Zellen eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität enthalten, da D-Leucinamid in L-Leucinamid umgewandelt wurde und umgekehrt. Die Racemisierungsreaktion trat bei den chemischen Blindproben nicht auf.
Ohne EDTA wandeln Amidasen das Substrat und/oder Produkt α-H-α-Aminosäureamide in α-H-α-Aminosäuren um und gestatten auf diese Weise keinen direkten Nachweis des anderen α-H-α-Aminosäureamidenantiomers als Racemisierungsprodukt. Ausgehend von D-Leucinamid jedoch zeigte der Ansatz ohne EDTA ebenfalls deutlich das Vorhandensein einer α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität in O. anthropi IA, da dieses Substrat in beträchtliche Mengen L-Leucin umgewandelt worden war, und ein Kontrollversuch verhinderte seine Bildung über D-Leucin da O. anthropi IA Leucin nicht racemisierte.

In der chemischen Blindprobe konnte keine Bildung von L-Leucin aus D-Leucinamid nachgewiesen werden. Tabelle 2: α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität in lyophilisierten O. anthropi IA Zellen.

Nr.	Substrat	EDTA (20 mM)	D-Leucin-amid (m%)	L-Leucinamid (m%)	D-Leucin (m%)	L-Leucin (m%)
1	D-Leucinamid	–	0,22	<0,001	0,015	0,044
2	L-Leucinamid	–	<0,001	<0,001	0,001	0,21
3	D-Leucinamid	+	0,24	0,032	0,007	0,008
4	L-Leucinamid	+	0,021	0,15	0,003	0,058

Bei den angegebenen Konzentrationen handelt es sich um die in den Ansätzen gemessenen Konzentrationen, die im Vergleich zu den ursprünglichen Ansätzen auf das zehnfache verdünnt sind.
Beispiel 2
Anreicherungsverfahren
Ungefähr 30 g frische Bodenproben von unterschiedlichen Herkunftsorten wurden in 50 ml Medium A mit einem Zusatz von 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam als einziger Stickstoffquelle suspendiert und 30 Minuten lang bei 4°C und 200 U/min geschüttelt. Die Suspensionen wurden durch ein Papierfilter filtriert, um die Bodenteilchen zu entfernen. Mit den erhaltenen Filtraten wurden für die Selektion auf Stämme, die D-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle verwerten konnten, die folgenden beiden Ansätze vorgenommen:

• 5 ml der verschiedenen Filtrate wurden in leere 100-ml-Kolben überführt. Alle Kolben wurden bei 28°C und 200 U/min inkubiert, bis eine OD_{600 nm} von ungefähr 2,5 erreicht wurde. Anschließend wurden die Kulturen 1:100 mit frischem Medium A, das 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam enthielt, verdünnt und nochmals kultiviert. Dieser Verdünnungs- und Kultivierungsschritt wurde noch 3mal wiederholt. Dann wurden verschiedene Verdünnungen von gut wachsenden Kulturen auf Platten mit Medium A, das 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam als einzige Stickstoffquelle enthielt, ausgestrichen und die Platten wurden bei 28°C inkubiert. Es wurden Kolonien zufallsmäßig ausgewählt und 5mal auf identische selektive Platten umisoliert, wodurch man reine Reinkulturen erhielt. Schließlich wurden diese Reinkulturen bei –80°C in 20% (v/v) Glycerin aufbewahrt.
• Als alternative Anreicherungsstrategie wurden unterschiedliche Verdünnungen von allen Filtraten direkt auf Medium A, das 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam als einzige Stickstoffquelle enthielt, ausgestrichen. Nach 2tägiger Inkubation bei 28°C erschienen auf beinahe allen Platten die ersten Kolonien. Nach einigen weiteren Tagen bis 3 Wochen erhielt man viele morphologisch unterschiedliche Kolonien. Morphologisch unterschiedliche Kolonien wurden zufallsmäßig ausgewählt und 5mal auf identische selektive Platten umisoliert, wodurch man reine Reinkulturen erhielt. Schließlich wurden diese Reinkulturen bei –80°C in 20% (v/v) Glycerin aufbewahrt.

Zellen von diesen Reinkulturen wurden schließlich auf α-Amino-ε-caprolactamracemase-Aktivität getestet. Nach dem Kultivieren in 800 ml Medium A, das 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam enthielt, 28°C und 200 U/min wurden die Zellen durch Zentrifugation (20 Minuten bei 5000 × g, 4°C) geerntet und in 40 ml Ultraschallpuffer (NaCl, 16 g/l; KCl, 0,74 g/l; Na₂HPO₄, 0,27 g/l; Glucose, 2 g/l; HEPES, 10 g/l, pH 7,0) suspendiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Ultraschall mit einem Soniprep 150 von MSE bei einer Amplitude von 20 Mikrometern in Zyklen von 10 Minuten mit Zeitintervallen von 10 Sekunden (d.h. 10 Sekunden Ultraschallbehandlung, 10 Sekunden Abkühlen) und Abkühlen in Eis/Aceton aufgebrochen. Nach jedem Zyklus wurden die Zellen unter dem Mikroskop beobachtet, und wenn 50-70% der Zellen aufgebrochen waren, wurde die Ultraschallbehandlung abgebrochen.
Dann wurden die Suspensionen der aufgebrochenen Zellen jeder Reinkultur mit D-α-Amino-ε-caprolactam und Pyridoxal-5-phosphat versetzt, und zwar auf Konzentrationen von 5 g/l bzw. 0,01 mM. Nach 1,5stündiger Inkubation bei 20°C und 20 U/min wurden Proben zu je 2 ml in je 1 ml 1 M H₃PO₄ überführt. Nach dem Entfernen aller teilchenförmigen Bestandteile durch Abzentrifugieren und anschließendes Filtrieren durch ein 0,22-μM-Filter wurden die Konzentationen von D- und L-α-Amino-ε-caprolactam in den Proben mittels HPLC bestimmt, und zwar gemäß der Vorschrift von Beispiel 1. Schließlich wurden Reinkulturen, die aus dem Substrat D-α-Amino-ε-caprolactam L-α-Amino-ε-caprolactam bildeten, zwecks Stammbestimmung an die NCIMB gesandt.
Stammbestimmung
Die so erhaltenen Reinkulturen wurden von der NCIMB über 16S-rDNA-Sequenzbestimmung als Agrobacterium rhizogenes Bi und Agrobacterium rhizogenes Na und Arthrobacter nicotianae bestimmt. Die Ergebnisse dieser 16S-rDNA-Bestimmung sind unten dargestellt. Die Mikroorganismen wurden gemäß dem Budapester Vertrag bei der NCIMB hinterlegt, und zwar wurde Agrobacterium rhizogenes Na unter der Nummer NCIMB 41127, Agrobacterium rhizogenes Bi unter der Nummer NCIMB 41128 und Arthrobacter nicotianae unter der Nummer NCIMB 41126 hinterlegt.
Analyse der 16S-rDNA-Sequenz
Methoden
DNA-Extraktion: Die DNA wurde mit dem Prepman-Aufreinigungskit extrahiert und bis zur Verwendung auf Eis aufbewahrt.
Polymerasekettenreaktion: Das Gen für die 16S ribosomale DNA wurde mit Eubakterien-Universalprimern amplifiziert und mittels Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel analysiert.
DNA-Clean-Up: Das 500 Bp Fragment wurde mittels Spin-Säulen-Zentrifugation aufgereinigt und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert.
Sequenzierung der DNA: Das aufgereinigte DNA-Produkt wurde automatisch mit der Didesoxy-Kettenabbruchmethode sequenziert (Sanger et al., 1997).
Sequenzanalyse mittels Datenbankvergleich: Die Sequenz des 16S-rDNA-Gens wurde mit Nukleinsäuresequenz-Datenbanken verglichen.
Ergebnisse
Die 16S-rDNA-Sequenzen von Agrobacterium rhizogenes Na NCIMB 41127 (SEQ ID: NO. 5), Agrobacterium rhizogenes Bi NCIMB 41128 (SEQ ID: NO. 4) und Arthrobacter nicotianae NCIMB 41126 (SEQ ID: NO. 3) sind im Sequenzbeschreibungsteil dargestellt.
Messung der α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität von aufgebrochenen Zellen von Agrobacterium rhizogenes Na, Agrobacterium rhizogenes Bi, Arthrobacter nicotianae
Herstellung von aufgebrochenen Zellen
Nachdem diese drei Stämme in Medium A, das 2 g/l D-α-Amino-ε-caprolactam enthielt, gezüchtet worden waren, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 12000 × g geerntet. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abdekantiert und das Frischgewicht des Pellets wurde bestimmt. Das Pellet wurde mit Ultraschallpuffer (NaCl, 16 g/l; KCl, 0,74 g/l; Na₂HPO₄, 0,27 g/l; Glukose, 2 g/l; HEPES, 10 g/l, pH 7,0) im Verhältnis 1:2 versetzt (Frischgewicht des Zellpellets:ml Puffer). Während der Aufbewahrung zwischen der Zellernte und der Ultraschallbehandlung wurde das Pellet im Ultraschallpuffer bei –86°C tiefgefroren.
Die Ultraschallbehandlung erfolgte mit einem Soniprep 150 von MSE bei einer maximalen Amplitude von 20 Mikrometern in Zeiträumen von 10 Minuten mit Zeitintervallen von 10 Sekunden (d.h. 10 Sekunden Ultraschallbehandlung, 10 Sekunden Abkühlen), wobei die Probe auf Eis/Aceton gekühlt wurde. Alle 10 Minuten wurden die Zellen unter dem Mikroskop beobachtet. Wenn > 70% der Zellen aufgebrochen waren, wurde die Ultraschallbehandlung abgebrochen.
α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität-Test mit aufgebrochenen Zellen
1 ml aufgebrochene Zellen von jedem der drei Stämme wurde in HEPES/NaOH-Puffer (20 mM) pH 7,7, der mit Pyridoxal-5-phosphat (0,01 mM) als Kofaktor und D-Leucinamid (60,8 mM) als Substrat versetzt worden war, in einem Gesamtvolumen von 10 ml (0,79 w/w% D-Leucinamid) inkubiert. Nach 0 und 139 Stunden wurden Proben zu je 1 ml entnommen (die genau gewogen wurden), und die Reaktion in diesen Proben wurde durch Versetzen mit 1 ml Methanol (das ebenfalls genau gewogen wurde, um die Verdünnungsfaktoren berechnen zu können) abgebrochen. Die Ansätze mit den abgebrochenen Reaktionen wurden zentrifugiert, um teilchenförmige Bestandteile zu entfernen. Die Überstände wurden bis zu der HPLC-Analyse gemäß Beispiel 1 bei –86°C tiefgefroren.
Auf gleiche Art und Weise wurden Blindansätze hergestellt, von denen auf gleiche Art und Weise Proben gezogen wurden und die Reaktion auf gleiche Art und Weise abgebrochen wurde, nur daß kein Substrat zugesetzt wurde und daß statt den aufgebrochenen Zellen nur mit HEPES/NaOH-Puffer (20 mM, pH 7,7) versetzt wurde.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3. Bestimmung der α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität von aufgebrochenen Zellen von Agrobacterium rhizogenes Na, Agrobacterium rhizogenes Bi und Arthrobacter nicotianae.

Proben-Code	Inkubationszeit (h)	D-Leucin (w/w%)	L-Leucin (w/w%)	D-Leucinamid (w/w%)
A. nicotianae	139	0,002	0,068	0,56
A. rhizogenes Na	139	0,036	0,078	0,51
A.rhizogenes Bi	139	0,013	0,025	0,61

Aus der Tabelle sieht man, daß in den aufgebrochenen Zellen von Agrobacterium rhizogenes Na, Agrobacterium rhizogenes Bi und Arthrobacter nicotianae eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität vorhanden ist, da D-Leucinamid zu L-Leucin umgesetzt wird; diese Umsetzung wird in den chemischen Blindproben nicht nachgewiesen.
In den chemischen Blindproben konnte auch nach 139 Stunden kein D-Leucin oder L-Leucin nachgewiesen werden; die Konzentration des D-Leucinamids war konstant (0,7 w/w%) was bedeutet, daß D-Leucinamid unter den angewandten Reaktionsbedingungen sehr stabil ist.
Beispiel 3
Isolierung des α-H-α-Aminosäureamidracemasegens aus Ochrobactrum anthropi IA.
Konstruktion einer Expressionsbibliothek
Zur Gewinnung von Einzelkolonien wurde eine Vorratskultur von O. anthropi IA in Glycerin auf eine Hefe-Kohlenstoff-Ausgangsplatte, die 0,5% (w/v) DL-α-Amino-ε-caprolactam als einzige Stickstoffquelle enthielt, ausgestrichen und bei 28°C kultiviert. Eine Einzelkolonie wurde in 150 ml LB-Flüssigmedium überführt und bei 28°C unter kräftigem Schütteln auf eine OD_{620 nm} von 0,9 herangezüchtet. Anschließend wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet und bei –20°C eingefroren.
Nach dem Auftauen der Zellen wurde die Gesamt-DNA gemäß der "Qiagen Genomic DNA Purification Procedure" für Bakterien isoliert, und zwar mit Spitzen des Typs Qiagen Genomic-tip 100/G. Es wurde gemäß dem Standardprotokoll von Qiagen vorgegangen, jedoch mit den folgenden Abänderungen:

• der erste Inkubationsschritt für die Zellyse wurde zwei Stunden bei 37°C ohne Proteinase K durchgeführt, wonach zweimal mit der empfohlenen Menge Proteinase K versetzt wurde und die Lösung nochmals 2 Stunden bei 50°C inkubiert wurde.
• Vor dem Auftragen des Lysats auf die Qiagen-Spitzen wurde ein Zentrifugationsschritt durchgeführt (10 Minuten bei 5000 × g, 4°C), um die teilchenförmigen Bestandteile zu pelletieren.
• Das Lysat der Zellen der 150-ml-Kultur wurde auf 3 G/100-Säulen aufgetragen.

Dann wurden 50 μg der erhaltenen chromosomalen DNA 30 Minuten lang mit Sau3A I anverdaut, und zwar mit 1/12 U pro μg DNA. Die Hälfte der verdauten DNA wurde auf einem 0,6%igen Agarosegel laufen gelassen, und DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 4 und 10 kB wurden isoliert und in 20 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, gelöst.
Die Vektor-DNA wurde durch Verdauen von 1 μg pZErO-2 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) mit BamH I gemäß dem Protokoll von Invitrogen hergestellt.
Die linearisierte Vektor-DNA (50 ng) und Fragmente der chromosomalen DNA von O. anthropi IA (10 μl) wurden mit T4-DNA-Ligase (gemäß dem Protokoll von Invitrogen) ligiert. Anschließend wurde der Ligationsansatz mit NaAc/Ethanol gefällt und dann in 20 μl TE-Puffer suspendiert. Mit 1 μl dieser Lösung wurde eine Elektroporation von elektrokompetenten E. coli DH10B-Zellen (Life Technologies) mit einem Gen-Pulser von BioRad (Bedingungen: 2,5 kV, 25 μF, 100Ω, 0,1 cm-Küvette, 40 μl Zellsuspension) gemäß der Vorschrift des Zulieferers durchgeführt. Die Transformanten wurden auf LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin ausgestrichen und 24 Stunden lang bei 28°C inkubiert. Insgesamt wurden über 12000 Kolonien erhalten, die die Primärgenbibliothek bildeten. Alle 12000 Kolonien wurden in LB-Medium mit einem Zusatz von 50 mg/l Kanamycin gepoolt. Mit einem Teil der erhaltenen Zellsuspension wurde eine Gesamtplasmidisolation gemäß der der QiaPrep-Vorschrift (Qiagen) durchgeführt. Diese "Bibliothek in Plasmidform" wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Der Rest der Zellsuspension wurde mit Glycerin auf eine Endkonzentration von 20% (v/v) versetzt. Die erhaltene Suspension wurde in aliquoten Teilen bei –80°C als Primärgenbibliothek aufbewahrt.
Herstellung von L-Aminopeptidase-Helferlösung
Die L-Aminopeptidase-Helferlösung für das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Screening wurde mit einem rekombinanten E. coli Stamm, der das Plasmid pTrcLAP enthielt, hergestellt. Der E. coli Expressionsvektor pTrcLAP enthält das pepA-Gen von Pseudomonas putida ATCC 12633 unter der Kontrolle des trc-Promoters. Genauere Informationen zu diesem Gen, das für die L-Aminopeptidase aus P. putida kodiert, findet sich bei T. Sonke, B. Kaptein, W.H.J. Boesten, Q.B. Broxterman, H.E. Schoemaker, J. Kamphuis, F. Formaggio, C. Toniolo, F.J.T. Rutjes in Stereoselective Biocatalysis (Hrsg.: R.N. Patel). Dekker, New York. 2000, S. 23-58.
200 ml LB-Medium, das sowohl 0,4 mM IPTG als auch 100 mg/l Ampicillin enthielt, wurde mit einer frischen Übernachtkultur von E. coli TOP10/pTrcLAP inokuliert. Nach Wachstum über Nacht bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren pelletiert und dann in 4 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 suspendiert. Nach dem Aufbrechen der Zellen durch einmaliges Passagieren durch eine French-Presse (140 mPa Druck in einer 4 ml fassenden French-Press-Zelle) wurden die festen Teilchen abzentrifugiert (45 Minuten bei 40000 × g, 4°C) . Das Pellet wurde dann in 2 ml Tris-HCl, pH 7,5, das 100 mM MgSO₄ enthielt, suspendiert. Diese Suspension wurde 30 Minuten lang vorsichtig bei 4°C gerührt. Nach dem Abzentrifugieren der Teilchen (45 min bei 40000 × g, 4°C) wurde die klare Lösung bis zur Verwendung in Screening-Assay bei –20°C in aliquoten Teilen aufbewahrt.
Screening
Die Lösung der "Bibliothek in Plasmidform" wurde mit Wasser auf das 1000fache verdünnt. Mit 1μl dieser Plasmidlösung wurden elektrokompetente E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen) transformiert, und die Transformanten wurden auf LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin ausgestrichen. Nach 2tägiger Inkubation bei 28-30°C waren die erhaltenen Kolonien groß genug, um in 200 μl flüssiges Screening-Medium (Trypton 16 g/l; Hefeextrakt 3g/l; NaCl 5 g/l; Glycerin 2 g/l; pH 7,3) mit 50 mg/l Kanamycin in Mikrotiterplatten überführt zu werden. Die Kulturen wurden 2 Tage lang bei 28-30°C herangezüchtet. Anschließend wurde eine Replik der Mikrotiterplatten hergestellt, und zwar dadurch, daß man einige Mikroliter jedes Näpfchens in frischen Mikrotiterplatten, die festes (0,8% Agar) LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin enthielten, überführte. Diese Platten wurden 16-20 Stunden lang bei 28-30°C inkubiert, wonach sie als Orginalplatten bei 4°C aufbewahrt wurden. Die Zellen des verbleibenden Teils der Zellsuspensionen wurden mittels Zentrifugation geerntet (10 Minuten bei 1500 × g, Raumtemperatur), zweimal mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gewaschen und schließlich in 50 μl Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 suspendiert.
Die Screening-Reaktion wurde durch Versetzen mit 50 μl einer Substratlösung, die eine Mischung aus 140 mM D-Phenylalaninamid, D-Leucinamid und D-Valinamid, jeweils in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 2 mM MnCl₂, enthielt, gestartet. Nach 20stündiger Inkubation der Mikrotiterplatten auf einem Schüttler bei 30°C wurde mit 2 μl L-Aminopeptidase-Helferlösung (Herstellung: siehe oben) versetzt. Nach nochmaliger 1,5stündiger Inkubation bei 30°C wurden alle Reaktionen durch Versetzen mit 100 μl 0,15 M HCl abgebrochen.
Anschließend wurde die Ammoniumkonzentration in allen Ansätzen bestimmt, und zwar dadurch, daß man 7 μl dieser Ansätze auf frische Mikrotiterplatten, die 93 μl GDH-Reagens pro Näpfchen enthielten, überführte. Diese GDH-Reagens enthielt pro 100 ml: 43 mg NADH, 116 mg α-Ketoglutarsäure, 11,8 mg ADP und 1200 Einheiten Glutamatdehydrogenase (Sigma) in 150 mM Tris-HCl, pH 8,0. Nach 15minütiger Inkubation bei 37°C wurde die OD₃₄₀ nm in jedem Näpfchen mit einem Spectramax-plus- Mikrotiterplattenlesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien, USA) bestimmt. Klone mit einer OD_{340 nm}, die niedriger als der Mittelwert der Mikrotiterplatte, die diesen Klon enthielt, minus dreimal der Standardabweichung derselben Mikrotiterplatte waren, wurden als potentiell positive Klone betrachtet.
Von den 11272 gescreenten Klonen konnten 32 Klone als potentiell positive Klone identifiziert werden.
Bestätigung von potentiell positiven Klonen
Von allen 32 potentiell positiven Klonen, die bei dem Screening identifiziert wurden, wurde Material von den Ausgangsplatten verwendet, um 3 ml flüssiges Screening-Medium, das 50 mg/l Kanamycin enthielt, zu inokulieren. Nach 2tägigem Wachstum bei 30°C wurden die Zellen dadurch gewonnen, daß man 2 ml dieser Zellkulturen zentrifugierte. Die Zellpellets wurden anschließend viermal mit 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gewaschen. Anschließend wurden die Zellpellets in 100 μl Substratlösung, die 70 mM D-Phenylalaninamid oder D-Leucinamid, oder D-Valinamid in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 1 mM MnCl₂ enthielt, erneut suspendiert. Nach 20stündiger Inkubation bei 30°C wurden die Reaktionen durch Versetzen mit 100 μl 0,15 M HCl gestoppt, wonach die Ansätze mit der in Beispiel 1 beschriebenen HPLC-Methode analysiert wurden.
Von den 32 potentiell positiven Klonen, die in dem Screening identifiziert wurden, wies einer eine signifikante L-Leucinbildung aus D-Leucinamid auf. Dieser Klon enthielt auf seinem 7,7 kB großen Plasmid das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen von O. anthropi IA. Diese Schlußfolgerung wurde aus der Tatsache gezogen, daß die Transformation dieses Plasmids in E. coli TOP10-Zellen unweigerlich zu rekombinanten Zellen führte, die D-Leucinamid in L-Leucin umwandelten. Durch Sequenzierung dieses Plasmids, das pOa(1)PLV49B10 genannt wurde, gelangte man zur vollständigen Nukleotidsequenz des α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gens. Die Sequenz dieses Gens ist als Nukleotide 98 bis 1417 (inklusive TAA-Stop-Codon) von SEQ ID: NO. 1, das wie unten dargestellt das Protein gemäß SEQ ID: NO. 2 kodiert, angeführt.
Beispiel 3A:
Isolation des α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gens aus Arthrobacter nicotianae NCIMB 41126
Konstruktion der Expressionsbibliothek
Eine Stammkultur von Arthrobacter nicotianae NCIMB 41126 in Glycerin wurde auf eine Hefe-Kohlenstoff-Grundplatte, die 0,2% (w/v) D-α-Amino-ε-caprolactam als einzige N-Quelle enthielt, ausgestrichen und 3-4 Tage lang bei 28°C kultiviert, um zu isolierten Kolonien der gewünschten Größe zu gelangen. Eine Einzelkolonie wurde in 50 ml LB-Flüssigmedium überführt und über Nacht bei 28°C unter kräftigem Schütteln herangezüchtet. Während der letzten halben Stunde dieser Wachstumsdauer wurde zur Schwächung der Zellwand mit Carbenicillin (Endkonzentration 200 μg/ml) versetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und das erhaltene Pellet wurde in 5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, das 50 mM EDTA enthielt, erneut suspendiert. Nach Versetzen mit 100 μl Lysozym (100 mg/ml) und 25 μl Proteinase K (20 mg/ml) wurde die Suspension 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde mit 6 ml Nuclei Lysis Solution (Promega Corporation, Madison, USA) versetzt und danach 15 Minuten lang bei 80°C inkubiert. Schließlich wurde die Lösung bei 65°C inkubiert, bis die Lyse vollständig war. Nach 30minütiger Behandlung mit RNase (Endkonzentration 4 μg/ml) bei 37°C wurde mit 2 ml Protein Precipitation Solution (Promega Corporation, Madison, USA) versetzt und die Lösung wurde 20 Sekunden lang gevortext und anschließend auf Eis inkubiert. Nach dem Zentrifugieren (10'; 4500 × g, 4°C) wurde der Überstand in eine Mischung von 0,1 Volumenteil NaAc (3 M, pH 5) und 2 Volumenteilen absolutem Ethanol überführt. Die gefällte genomische DNA wurde mit einer sterilen Pipette herausgezogen und in Röhrchen mit 2 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8) überführt. Nachdem sich die gDNA gelöst hatte, zeigte eine Messung von E_{260 nm} und E_{280 nm}, daß ungefähr 2,3 mg gDNA in guter Qualität isoliert worden waren. Mittels Agarosegelelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die isolierte gDNA keine rRNA enthielt und daß sie größer als 15 kB war.
50 μg der gDNA wurde bei 37°C 30 Minuten lang mit Sau3A I in einer Konzentration von 1/24 U pro μg DNA anverdaut. Ein Teil der verdauten DNA wurde auf einem präparativen 0,6%igen Agarosegel laufen gelassen, und DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 4 und 10 kB wurden aus dem Gel mit dem QIAquick Extraction Kit (Qiagen) isoliert, mittels NaAc/Ethanol-Fällung konzentriert und dann in 10 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, gelöst.
Die Vektor-DNA wurde durch Verdauen von 1 μg pZErO-2 (Invitrogen, Breda, Niederlande) mit BamH I gemäß der Vorschrift des Zulieferers hergestellt.
Linearisierte Vektor-DNA (10 ng) und Fragmente von A. nicotianae NCIMB 41126 gDNA (2,5 μl) wurden in einem Gesamtvolumen von 10 μl mit 2,5 U T4-DNA-Ligase 1 Stunde lang bei 16°C ligiert. Anschließend wurde der Ligationsansatz mit NaAc/Ethanol gefällt und dann in 5 μl TE-Puffer suspendiert. Mit 2,5 μl dieser Lösung (ungefähr 5 ng Vektor) wurde eine Elektroporation von Elektrokompetenten E. coli DH10B-Zellen (Life Technologies) mit einem Gen-Pulser von BioRad (Bedingungen: 2,5 kV, 25 μF, 100Ω, 0,1 cm-Küvette, 40 μl Zellsuspension) gemäß der Vorschrift des Zulieferers durchgeführt. Die Transformanten wurden auf LB-Medium mit 50 mg/l Kanamycin ausgestrichen und 24 Stunden lang bei 28°C inkubiert. Insgesamt wurden über 100000 Kolonien erhalten, die die Primärgenbibliothek bildeten. Alle 100000 Kolonien wurden in LB-Medium mit einem Zusatz von 50 mg/l Kanamycin gepoolt. Mit einem Teil der erhaltenen Zellsuspension wurde eine Gesamtplasmidisolation gemäß der der QiaPrep-Vorschrift (Qiagen) durchgeführt. Diese "Bibliothek in Plasmidform" wurde bis zur weiteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Der Rest der Zellsuspension wurde mit Glycerin auf eine Endkonzentration von 8% (v/v) versetzt. Die erhaltene Suspension wurde in aliquoten Teilen bei –80°C als Primärgenbibliothek aufbewahrt.
Screening
Die A. nicotianae NCIMB 41126 Bibliothek wurde mit dem in Beispiel 3 angegebenen Protokoll auf Klone, die α-H-α-Aminosäureamidracemase enthielten, gescreent, nur daß eine leicht modifizierte Substratlösung verwendet wurde. Neben allen Bestandteilen, die in Beispiel 3 erwähnt sind, enthielt die Substratlösung beim vorliegenden Screening noch 20 μM Pyridoxal-5-phosphat.
Insgesamt wurden 10691 Klone der A. nicotianae NCIMB 41126 Bibliothek gescreent. 2 dieser Klone wurden als potentiell positive Klone identifiziert.
Bestätigung von potentiell positiven Klonen
Die Bestätigung von beiden potentiell positiven Klonen erfolgte gemäß der in Beispiel 3 angegebenen Vorschrift, nur daß alle 3 verwendeten Substratlösungen 10 μM Pyridoxal-5-phosphat enthielten.
Dieser Versuch zeigte, daß beiden Klone D-Leucinamid signifikant in L-Leucin und D-Valinamid signifikant in L-Valin umwandelten. Wie in Beispiel 1 angegeben bewiesen diese Umwandlungen das Vorhandensein von α-H- α-Aminosäureamidracemase-Aktivität in diesen Klonen. Umtransformationsversuche, in denen die Plasmide von beiden Klonen in E. coli TOP10-Zellen eingeführt wurden, zeigten, daß diese α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität vom Plasmid kodiert wird, da alle getesteten rekombinanten Zellen D-Leucinamid in L-Leucin und D-Valinamid in L-Valin umwandelten.
Anschließend wurde mit den Plasmiden von den beiden positiven Klonen eine Restriktionsenzymanalyse durchgeführt. Diese Analyse zeigte deutlich, daß die beiden rekombinanten Plasmide ein überlappendes Insert enthielten. Daher wurde nur eines dieser Plasmide, nämlich pAn(1)PLV36D6, sequenziert. Die Analyse der Nukleotidsequenz dieses Plasmids mit einer Gesamtgröße von 7,1 kB ergab die vollständige Nukleotidsequenz des α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gens. Die Sequenz dieses Gens ist als Nukleotide 80 bis 1417 (inklusive TGA-Stop-Codon) von SEQ ID: NO. 8, das wie oben angegeben für das Protein gemäß SEQ ID: NO. 9 kodiert, angeführt. Wie unten dargestellt ist es auch möglich, eine aktive α-H-α-Aminosäureamidracemase ausgehend von Nukleotidposition 41 (GTG) von SEQ ID: NO. 8 zu exprimieren.
Beispiel 4
Konstruktion von Plasmid pKEC-AZAR
Das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen aus O. anthropi IA wurde mittels PCR in den E. coli Expressionsvektor pKECaroP subkloniert. Der Expressionsvektor pKECaroP ähnelt dem Konstrukt pKECtrp, dessen Konstruktion in WO 00/66751 beschrieben wurde, nur daß pKECaroP die par-Funktion von pSC101 und statt dem trp-Promoter den aroH-Promoter aus E. coli enthält. Das offene Leseraster der α-H-α-Aminosäureamidaminoracemase wurde mit
5'-GCCTCACATATGCAAACACCGCTTTCATTGCG-3'[SEQ ID: NO. 6] als Forward-Primer (die Nde I-Spaltstelle ist unterstrichen) und
5'-GCCTCACCCGGGTTACCACATCATAAAATGGGCGACATC-3' [SEQ ID: NO. 7] als Reverse-Primer (die Xma I-Spaltstelle ist unterstrichen) und dem Plasmid pOa(1)PLV49B10 als Matrize amplifiziert. Diese PCR, die mit PCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies) gemäß der Vorschrift des Zulieferers durchgeführt wurde, ergab ein einziges Fragment. Die korrekte Größe (1341 Bp) des amplifizierten Fragments wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt.
Nach Aufreinigung des amplifizierten Fragments mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) wurde das Fragment in den Vektor pCR^®4Blunt-TOPO (Invitrogen) kloniert. Mit dem Klonierungsansatz wurden anschließend One Shot^TM chemisch kompetente E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Rekombinante Zellen wurden dadurch selektiert, daß man den gesamt Transformationsansatz auf LB-Platten, die 100 μg/ml Carbenicillin enthielten, ausplattierte und anschließend über Nacht bei 28°C inkubierte.
Nach Übernachtkultur des Materials von sechs Kolonien in 5 ml LB-Medium, das 100 μg/ml Carbenicillin enthielt, wurde Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. Durch Verdauen mit den Restriktionsenzymen Nde I und Xma I wurde gezeigt, daß fünf von diesen sechs Kolonien den gewünschten rekombinanten Vektor enthielten.
Plasmid-DNA der fünf korrekten Klone wurde gepoolt und vollständig mit Nde I und Xma I verdaut. Der gesamte Verdau wurde zur Trennung der unterschiedlichen Fragmente auf ein präparatives 1%iges Agarosegel aufgetragen. Das korrekte Fragment (1322 Bp) wurde anschließend aus dem Gel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) isoliert und bis zur weiteren Verwendung als Insertfragment bei –20°C aufbewahrt.
Das Plasmid pKECaroP wurde vollständig mit Nde I und Xma I verdaut, wodurch man gemäß analytischer Agarosegelelektrophorese zu zwei Fragmenten mit 2850 bzw. 3036 Bp gelangte. Nach Hitzeinaktivierung der Restriktionsenzyme Nde I und Xma I (20 Minuten, 65°C) wurde der Ansatz mit Bsa I versetzt, um das unerwünschte 2850 Bp große Fragment in zwei kleinere Stücke zu schneiden. Der vollständige Verdau wurde auf ein 1%iges präparatives Agarosegel aufgetragen, wonach man das gewünschte 3036 Bp große Fragment mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) isolierte und bis zur weiteren Verwendung als Vektorfragment bei –20°C aufbewahrte.
Vektor- und Insertfragment wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, und mit der erhaltenen Ligationsmischung wurden anschließend One Shot^TM chemisch kompetente E. coli TOP10-Zellen transformiert. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Platten, die 50 μg/ml Kanamycin enthielten, ausgestrichen und bei 28°C so lange inkubiert, bis ausreichend große Kolonien entstanden waren.
Um auf Kolonien, die den korrekten rekombinanten Vektor enthielten, zu screenen, wurde eine Kolonien-PCR durchgeführt, und zwar mit PCR SuperMix (Life Technologies) und den oben angegebenen Primern [SEQ ID: NO. 6] und [SEQ ID: NO. 7]. 12 Röhrchen mit 5 ml LB-Medium, das 50 μg/ml Kanamycin enthielt, wurden mit Material von zwölf PCR-Positiven inokuliert. Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit isoliert. Durch Verdauen mit dem Restriktionsenzym Hind III erhielt man bei allen zwölf Plasmiden zwei Fragmente mit einer Größe von 1731 bzw. 2627 Bp, was zeigt, daß alle zwölf Kolonien den gewünschten rekombinanten Vektor enthielten.
Fünf dieser zwölf positiven Klone wurden in 25 ml LB-Medium mit Zusatz von 50 μg/ml Kanamycin kultiviert.
Nach Übernachtkultur bei 28°C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in demselben Ultraschallpuffer wie in Beispiel 2 gewaschen. Nach dem Suspendieren der Zellpellets in Ultraschallpuffer (Verhältnis von Zellfrischgewicht zu Ultraschallpuffer 1:10) wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Durch Abzentrifugieren der teilchenförmigen Bestandteile gelangte man zu Zellrohextrakten.
Die fünf erhaltenen Zellrohextrakte wurden durch Vermischen von 0,5 ml dieser Extrakte mit 4,5 ml Substratlösung, die aus einem 22,2 mM HEPES-NaOH-Puffer pH 7,7 mit 0,01 mM Pyridoxal-5-phosphat und 66 mM D-Leucinamid bestand, auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität getestet. Die Ansätze wurden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 0,18 und 44 Stunden wurden Proben entnommen und in ein gleiches Volumen 1 M H₃PO₄ überführt, um die Reaktion zu stoppen. Diese Proben wurden gemäß der in Beispiel 1 angegebenen Methode mittels HPLC analysiert.
Mit dem Rohextrakt von zwei der fünf Klone mit der Bezeichnung E. coli/pKEC_AZAR_3 und E. coli/pKEC-_AZAR_11 wurde in den 18- und 44-Stunden-Proben wesentlich mehr L-Leucin und L-Leucinamid als in der 0-Stunden-Probe nachgewiesen. Schließlich zeigte die Nukleotidsequenzierung von pKEC_AZAR_3 und pKEC_AZAR_11 die korrekte Nukleotidsequenz des α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gens und flankierende Vektorteile in diesen beiden rekombinanten Plasmiden.
Beispiel 4A
Konstruktion des Plasmids pBADAn36D6-DEST
Das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen aus A. nicotianae NCIMB 41126 wurde mittels PCR und GATEWAY Cloning Technology (Invitrogen) in den E. coli-Expressionsvektor pBAD/Myc-His-DEST subkloniert. Das offene Leseraster der α-H-α-Aminosäureamidaminoracemase wurde mit
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGGAGGAATTAACCATG-AGTACGCCGCGTTGCGGGGAG-3' [SEQ ID: NO. 10]
als Forward-Primer (Shine-Delgarno-Stelle unterstrichen, ATG-Startcodon kursiv gedruckt und attB1-Stelle doppelt unterstrichen) und
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACCAACCAGCATAGG-GAGCGATCTG-3' [SEQ ID: NO. 11]
als Reverse-Primer (Stop-Codon kursiv gedruckt und attB2-Stelle doppelt unterstrichen) und dem Plasmid pAn(1)PLV36D6 als Matrize amplifiziert. Die Indentifikation des Plasmids pAn(1)PLV36D6 wurde im Beispiel 3A beschrieben. Die PCR, die mit Expand High Fidelity Polymerase (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) gemäß der Vorschrift des Zulieferers durchgeführt wurde, ergab ein einziges Fragment. Die korrekte Größe (1449 Bp) des amplifizierten Fragments wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt.
Nach Aufreinigung des amplifizierten Fragments von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) wurde das Fragment als Substrat für die sogenannte BP-in-vitro-Rekombinationsreaktion verwendet, die gemäß dem GATEWAY-Handbuch des Zulieferers (Invitrogen) durchgeführt wurde. Die Rekombination zwischen dem attB-PCR-Fragment und dem Donatorvektor pDONR207 sowie die anschließende Transformation der erhaltenen Mischung in kompetente E. coli DH5α-Zellen (Invitrogen) führten zu dem ENTRY-Klon pAn36D6-ENTRY. Rekombinante Zellen wurden dadurch ausgewählt, daß man den gesamten Transformationsansatz auf 2·TY-Platten, die 7 μg/ml Gentamicin enthielten, ausstrich und anschließend über Nacht bei 37°C inkubierte. Plasmid-DNA wurde von einigen Einzelkolonien mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert, nachdem diese in 2·TY-Medium, das 7 μg/ml Gentamicin enthielt, 16 Stunden lang gezüchtet worden waren. Verdauung mit den Restriktionsenzymen Pvu II, Nsp I (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) bzw. BssS I (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) wurde nachgewiesen, daß alle getesteten Kolonien den gewünschten rekombinanten Vektor enthielten. Anschließend wurden die attB-PCR-Inserts von vier dieser korrekten Klone sequenziert. Es zeigte sich, daß alle vier sequenzierten pAn36D6-ENTRY-Plasmide die Sequenz enthielten, was aufgrund SEQ ID: NO. 8 und der beiden verwendeten PCR-Primer erwartet wurde.
Anschließend wurde das PCR-Fragment, das die α-H-α-Aminosäureamidracemase enthielt, über die sogenannte LR-in-vitro-Rekombinationsreaktion mit einem der korrekten pAn36D6-ENTRY-Klone und pBAD/Myc-His-DEST in den Destination-Vektor pBAD/Myc-His-DEST (siehe oben) eingeführt. Diese Reaktion wurde ebenfalls nach der Vorgehensweise des Zulieferers durchgeführt. Mit der Rekombinationsmischung wurden One Shot^TM chemisch kompetente E. coli TOP10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Rekombinante Zellen wurden dadurch ausgewählt, daß man den gesamten Transformationsansatz auf 2·TY-Platten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, ausstrich und anschließend über Nacht bei 37°C inkubierte. Nach Übernachtkultur von einigen wenigen Kolonien in 2·TY-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde Plasmid-DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert. Durch Verdauen mit den Restriktionsenzymen Acc I bzw. Rsr II (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) wurde nachgewiesen, daß alle Kolonien den gewünschten rekombinanten Vektor pBADAn36D6-DEST enthielten.
Mit einer Einzelkolonie des Stamms E. coli TOP10/pBADAn36D6-DEST wurden 50 ml 2 × TV-Medium mit Zusatz von 100 μg/ml Carbenicillin inokuliert. Nach Übernachtkultur bei 28°C wurden mit 500 μl dieser Kultur 500 ml 2·TY-Medium mit Zusatz von 100 μg/ml Carbenicillin und 0,005% Arabinose inokuliert. Nach Übernachtkultur bei 28°C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (15 Minuten bei 6200 × g, 4°C) und in einer Lösung, die 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 20 μM Pyridoxal-5-phosphat und 1,3 mM Dithiothreitol enthielt, gewaschen. Nach dem Suspendieren der Zellpellets in derselben Pufferlösung (Verhältnis von Zellfrischgewicht zu Ultraschallpuffer 1:3) wurden die Zellen durch 10minütige Ultraschallbehandlung mit einem Soniprep 150 von MSE, das bei einer maximalen Amplitude eingesetzt wurde, unter Verwendung von Zeitabständen von 10 Sekunden (d.h. 10 Sekunden Ultraschallbehandlung, 10 Sekunden Abkühlen) und Abkühlen in Eis/Aceton aufgebrochen. Durch Abzentrifugieren der teilchenförmigen Bestandteile gelangte man zu Zellrohextrakten. Schließlich wurde der zellfreie Extrakt mit Saccharose auf eine Endkonzentration von 0,25 M versetzt.
Der Zellextrakt wurde durch Vermischen von 0,5 ml des Extrakts mit 9,5 ml Substratlösung auf Racemaseaktivität geprüft. Die Ansätze wurden bei 37°C inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen, die in ein gleiches Volumen 1 M H₃PO₄ überführt wurden, um die Reaktion abzubrechen. Diese Proben wurden nach der in Beispiel 1 angeführten Methode mittels HPLC analysiert.
Dieser Versuch zeigte, daß das Substrat innerhalb von 20 Minuten vollständig racemisiert war. Man zieht daher die Schlußfolgerung, daß die α-H-α-Aminosäureamidracemase aus A. nicotianae NCIMB 41126 von dem offenen Leseraster gemäß SEQ ID: NO. 8 codiert wird.
Beispiel 4B
Konstruktion des GATEWAY-Destination-Vektors pBAD/Myc-His-DEST
Der Destination-Vektor pBAD/Myc-His-DEST, der für die Expression des α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gens aus A.
nicotianae NCIMB 41126 in E. coli verwendet worden war, wurde dadurch hergestellt, daß man eine cat/ccdB-Kassette in den im Handel erhältlichen E. coli Expressionsvektor pBAD/Myc-HisC einführte. Die cat/ccdB-Kassette wurde mittels PCR mit
5'-AAGAAGACCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTC-TACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACACAAGTTTGT-ACAAAAAAGCTGAAC-3' [SEQ ID: NO. 12]
als Forward-Primer (Promotersequenz doppelt unterstrichen, Bpi I Erkennungs- und Spaltstelle unterstrichen, attR-Sequenzen kursiv gedruckt, und
5'– TTGTTCTACGTAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAAC-3' [SEQ ID: NO. 13]
als Reverse-Primer (SnaB I Spaltstelle unterstrichen, attR-Sequenzen kursiv gedruckt) und dem Vektor pDEST15 (Invitrogen) als Matrize amplifiziert. Die PCR, die mit Expand High Fidelity Polymerase (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) nach der Vorschrift des Zulieferers durchgeführt wurde, ergab ein einziges Fragment. Die korrekte Größe (1792 Bp) des amplifizierten Fragments wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt. Nach Aufreinigung des amplifizierten Fragments aus einem präparativen Agarosegel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) wurde das Fragment vollständig mit Bpi I (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) (was zu einem überhängenden Ende, das zu BamH I komplementär war, führte) und SnaB I (New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland) verdaut und mit T4-DNA-Ligase in den E. coli Expressionsvektor pBAD/Myc-HisC (Invitrogen), der mit BamH I und SnaB I verdaut worden war, ligiert. Mit der Ligationsmischung wurden anschließend chemisch kompetente E. coli DB3.1 Zellen (Invitrogen) transformiert. Rekombinante Zellen wurden dadurch selektiert, daß man den gesamten Transformationsansatz auf 2·TY-Platten, die 35 μg/ml Chloramphenicol enthielten, ausstrich und über Nacht bei 37°C inkubierte. Nach Isolation des rekombinanten Plasmids aus drei Einzelkolonien wurden die Inserts sequenziert.
Es wurde gefunden, daß einer diese Klone das gewünschte Insert erhielt; dieser wurde pBAD/Myc-His-DEST genannt. Obwohl zwischen der Nukleotidsequenz des sequenzierten Teils von Plasmid pBAD/Myc-His-DEST und der Bezugssequenz (Invitrogen – Nukleotidsequenz von pDEST15) 7 Abweichungen beobachtet wurden, waren alle wesentlichen Merkmale (Chloramphenicolresistenz, ccdB-Selektion und attR-Rekombination) von pBAD/Myc-His-DEST voll funktionell.
Beispiel 5
Test auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität mit D-Leucinamid als Substrat und ganzen E. coli Zellen, die das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen aus Ochrobactrum anthropi IA enthalten, als Biokatalysator
Herstellung der Zellen
Zur Herstellung einer Vorkultur wurde eine Einzelkolonie von E. coli DH10B mit dem Plasmid pOA(1)PLV49B10 auf LB-Medium mit Kanamycin (50 mg/l) überführt. Nach Übernachtkultur bei 28°C und 200 U/min wurde mit dieser Vorkultur ein Kolben mit 500 ml 2·TY-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 16 g/l Trypton, 5 g/l NaCl) mit Kanamycin (50 mg/l) inokuliert. Nach Übernachtkultur bei 28°C (OD_{620 nm} = 4,4) und 200 U/min wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet (15 Minuten bei 6200 × g, 4°C) und mit 50 mM HEPES-NaOH Puffer, pH 7,7, gewaschen.
Um die Hintergrundaktivität des E. coli Wirts-Vektor-Systems in den Aktivitätstests bestimmen zu können wurde ein E. coli DH10B-Stamm, der ein Konstrukt auf pZErO-2-Grundlage, das ein mutiertes, für Green Fluorescent Protein (GFPuv) kodierendes Gen als Insertion in umgekehrter Richtung zu dem von dem Vektor getragenen lac-Promoter enthält, auf gleiche Art und Weise gezüchtet (E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrongorientation). Das Wachstum dieses rekombinanten E. coli Stamms ergab eine Übernachtkultur mit einer OD_{620 nm} von 3,8.
Die Zellpellets von beiden Kulturen wurden anschließend gewaschen und in 25 ml 50 mM HEPES-NaOH Puffer, pH 7,7 suspendiert. 2-ml-Portionen der beiden Zellsuspensionen wurden nochmals zentrifugiert und die Pellets wurden bis zur Durchführung der unten beschriebenen Aktivitätstests bei –20°C aufbewahrt. Der Rest dieser Zellsuspensionen wurde zur Verwendung in Beispiel 6 bei –20°C aufbewahrt.
α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber D-Leucinamid

Zur Bestimmung der Aktivität von E. coli pOA(1)PLV49B10 sowie der E. coli Kontrolle wurden die obengenannten Zellpellets aufgetaut und mit 50 mM HEPES-NaOH Puffer, pH 7,7 auf ein Gesamtvolumen von 1 ml suspendiert. Anschließend wurden Ansätze zu jeweils 10 ml hergestellt, die 50 mM HEPES-NaOH Puffer (pH 7,7), 10 μM Pyridoxal-5-phosphat (PLP), 2,5 Gew.-% D-Leucinamid, gegebenenfalls 20 mM EDTA um die E. coli Amidaseaktivität zu unterdrücken sowie 0,5 ml der Zellsuspensionen von E. coli/pOA(1)PLV49B10 und E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation bzw. Wasser (für chemische Blindproben) hergestellt. Die Reaktionen wurden durch Versetzen mit den Zellen gestartet. Die Ansätze wurden bei 30°C und 175 U/min inkubiert. Unmittelbar nach dem Versetzen mit den Zellen (t = 0 Stunden) sowie nach 27 und 43 Stunden wurden Proben gezogen, in denen die Reaktion durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließende Filtration über 0,22 μM gestoppt wurde. Schließlich wurden die filtrierten Proben bis zur Analyse mittels chiraler HPLC wie unten beschrieben bei –20°C aufbewahrt.

Säule:	Sumichiral OA5000 von Sumika (150 × 4,6 mm innerer Durchmesser, 5μ) + Vorsäule
Lösungsmittel:	85 v/v% 2 mM CuSO₄ + 15 v/v% Methanol
Durchflußgeschwindigkeit:	1,0 ml/min
Säulentemperatur:	40°C
Einspritzvolumen:	5 μl
Detektion:	Detektion der Fluoreszenz nach Nachsäulenderivatisierung mit o-Phthalaldehyd und 2-Mercaptoethanol (Anregungswellenlänge = 338 nm, Emissionswellenlänge > 420 nm)

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4. α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber D-Leucinamid von E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 und E. coli mit dem Leervektor (E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation).

Stamm	20 mM EDTA	Inkuba- tions-zeit (h)	D- Leucin- amid (Gew.-%)	L- Leucin amid (Gew.-%)	D-Leucin (Gew.-%)	L-Leucin (Gew.-%)
B	–	0	2,67	n.n.	n.n.	n.n.
B	–	27	2,51	n.n.	0,003	0,005
B	–	43	2,63	0,060	0,005	0,004
A	–	0	2,63	n.n.	n.n.	n.n.
A	–	27	1,03	0,170	0,009	1,71
A	–	43	0,512	0,063	0,017	2,12
A	+	0	2,61	n.n.	n.n.	n.n.
A	+	27	1,77	0,555	0,003	0,313
A	–	43	1,59	0,772	0,006	0,345

n.n.: nicht nachweisbar
Stamm A: E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10
Stamm B: E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation

Die Daten in Tabelle 4 zeigen deutlich, daß E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation D-Leucinamid nicht umsetzen konnte. Auch nach einer 43stündigen Reaktionsdauer enthielt der Ansatz die gleiche D- Leucinamidmenge wie zu Beginn der Reaktion. Dies war auch bei allen chemischen Blindwerten der Fall (Daten nicht angegeben).
Im Gegensatz dazu nahm bei E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 Zellen die D-Leucinamidmenge im Verlauf der Zeit deutlich ab. Ohne zusätzliches EDTA wurde dieses Substrat zu einer relativ niedrigen Menge L-Leucinamid und einer großen Menge L-Leucin umgesetzt. Mit zusätzlichem EDTA gelangte man zu einer viel höheren L-Leucinamidkonzentration, da EDTA, ein Chelator, die Amidaseaktivität von E. coli teilweise hemmt und dadurch den Umsatz von L-Leucinamid zu L-Leucin verringert.
Die in diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 Zellen eine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber D-Leucinamid enthalten. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß durch Kombinieren dieser α-H-α-Aminosäureamidracemase mit einer L-selektiven Amidase/Aminopeptidase (wie sie z.B. in E. coli DH10B vorliegt) D-α-H-α-Aminosäureamide in L-α-H-α-Aminosäuren umgewandelt werden können.
Beispiel 6
α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität-Test mit DL-Leucinamid als Substrat und ganzen E. coli Zellen, die das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen aus Ochrobactrum anthropi IA enthalten, als Biokatalysator
Man verwendete die Zellsuspensionen mit E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 und E. coli DH10B/pZErO-GFPuvwrong-orientation aus Beispiel 5 (Vorbereitung der Zellen). Um ihre Aktivität gegenüber racemischem DL-Leucinamid zu bestimmen, wurden identische Ansätze wie in Beispiel 5 hergestellt, nur daß 2,5 Gew. DL-Leucinamid verwendet wurde, EDTA bei allen Reaktionen weggelassen wurde und daß die Reaktionen mit 2 ml der Zellsuspensionen gestartet wurden. Proben wurden unmittelbar nach dem Beginn der Reaktionen (t = 0 Stunden) sowie nach 8 und 24 Stunden gezogen.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5. α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber DL-Leucinamid von E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 und E. coli mit dem Leervektor (E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation).

Codebezeichnung der Stichprobe	Inkubationszeit (h)	D-Leucinamid (Gew.-%)	L-Leucinamid (Gew.-%)	D-Leucin (Gew.-	L-Leucin (Gew.-	e.e.^aL-Leucin (%)
B	0	1,13	1,15	0,001	0,004	–
B	8	1,15	0,12	0,001	1,43	99,9
B	24	1,23	n.n.	0,002	1,48	99,7
A	0	1,19	1,25	0,001	0,003	–
A	8	1,24	0,33	0,004	1,45	99,4
A	24	0,43	0,14	0,028	2,25	97,5

n.n.: nicht nachweisbar
^aDer e.e.-Wert (Enantiomerenüberschuß) der L-Säure wurde mit der folgenden Formel berechnet:
e. e._L-säure = [(L-Säure-D-Säure)/(L-Säure+D-Säure)] × 100%
Stamm A: E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10
Stamm B: E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrong-orientation

Aus den Daten in Tabelle 5 wird klar, daß die E. coli-Zellen mit Leervektor (E. coli DH10B/pZErO-GFPuv-wrongorientation) nur L-Leucinamid in L-Leucin mit einem Enantiomerenüberschuß von über 95% umwandeln können.
Das D-Leucinamid bleibt unverändert, wodurch man zu einer maximalen Ausbeute von nur 50% gelangt.
Bei den E. coli DH10B/pOA(1)PLV49B10 Zellen mit dem Gen, das für α-H-α-Aminosäureamidracemase kodiert, werden eindeutig sowohl L- als auch D-Leucinamid in L-Leucin umgewandelt, was zu einer Ausbeute von über 50% und einer Maximalausbeute von 100% führt. Wiederum liegt der Enantiomerenüberschuß des erhaltenen L-Leucins bei deutlich über 95%.
Dieser Versuch zeigt, daß durch Kombinieren der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA mit einer L-selektiven Amidase/Aminopeptidase (wie sie z.B. in E. coli DH10B vorliegt) DL-α-H-α-Aminosäureamide in mehr als 50%iger Ausbeute in L-α-H-α-Aminosäuren umgewandelt werden können.
Beispiel 7
Bestimmung der Substratspezifität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus Ochrobactrum anthropi IA mit zellfreiem Extrakt aus E. coli TOP10/pKEC AZAR 3
Herstellung des zellfreien Extrakts
Durch Inokulieren von zwei Erlenmeyerkolben mit 100 ml 2·TY-Medium (10 g/l Hefeextrakt, 16 g/l Trypton, 5 g/l NaCl), das 50 mg/l Kanamycin enthielt, mit 10 μl Glycerin-Vorratskultur pro Kolben wurden zwei Vorkulturen von E. coli TOP10/PKEC_AZAR_3 (siehe Beispiel 4) hergestellt. Nach Übernachtkultur bei 28°C und 200 U/min wurden die Vorkulturen gepoolt und anschließend wurden damit zwei Erlenmeyerkolben, die jeweils 1 1 desselben Mediums enthielten, inokuliert. Diese Kolben wurden ebenfalls 16-18 Stunden lang bei 28°C und 200 U/min kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (15 Minuten bei 6200 × g, 4°C) mit 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, gewaschen, gepoolt, gewogen und in einer Lösung, die 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 20 mM Pyridoxal-5-phosphat und 1,3 mM Dithiothreitol enthielt, im Verhältnis Zellfrischgewicht zu Lösung 1:3 suspendiert. Anschließend wurden die Zellen durch 10minütige Ultraschallbehandlung mit einem Soniprep 150 von MSE, das bei maximaler Amplitude betrieben wurde, mit Zeitabständen von 10 Sekunden (d.h. 10 Sekunden Ultraschallbehandlung, 10 Sekunden Abkühlen) und Abkühlen in Eis/Aceton aufgebrochen.
Teilchen wurden abzentrifugiert, und danach wurde der zellfreie Extrakt mit Saccharose auf eine Endkonzentration von 0,25 M versetzt. Der erhaltene zellfreie Extrakt (ZFE) wurde in aliquoten Teilen bei – 20°C aufbewahrt. Auf genau die gleiche Art und Weise wurden auch E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC (Invitrogen) Zellen behandelt; diese dienten als Negativkontrolle.
Bestimmung der Substratspezifität
Die Substratspezifität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA wurde dadurch bestimmt, daß man die Racemaseaktivität des oben genannten ZFEs gegenüber verschiedenen enantiomerenreinen Aminosäureamiden bestimmte. Jeder 10-ml-Ansatz (darunter auch der ZFE) enthielt 50 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 20 mM Pyridoxal-5-phosphat, 0,4 mg/ml BSA, 1 mM Dithiothreitol, 20 mM EDTA und 75 mM eines der getesteten Aminosäureamide. Die Reaktionen wurden durch Versetzen mit 1 ml des aufgetauten ZFEs von E. coli TOP10/PKEC_AZAR_3 oder E. coli TOP10/p2AD/Myc-HisC (Leervektor) gestartet und bei 37°C inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wurden 1-ml-Proben gezogen und in Röhrchen, die 1 ml 1 M H₃PO₄ enthielten, überführt, um die Reaktion zu stoppen.

Nachdem die Proben ausreichend mit 0,4 M Boratpuffer pH 9,4 verdünnt worden waren, wurden die erhaltenen Mischungen mittels HPLC analysiert, um die genauen Konzentrationen der beiden Aminosäuren- und der beiden Aminosäureamid-Enantiomeren zu bestimmen, und zwar nach der folgenden Methode:

Säule:	Inertsil ODS-3 150 × 4,6 mm innerer Durchmesser
Lösungsmittel A:	50 mM Natriumacetat, pH 6,0, mit Essigsäure/Acetonitril 95/5% v/v
Lösungsmittel B:	50 mM Natriumacetat, pH 6,0, mit Essigsäure/Acetonitril 30/70% v/v
Gradient:	Zeit (min)	Lösungsmittel A (% v/v)	Lösungsmittel B (% v/v)
	0 100	0	100
	28	0	100
	33	0	100
	33,1	100	0
	41 (Abbruch)
Durchflußgeschwindigkeit	1,0 ml/min
Säulentemperatur:	40°C
Einspritzvolumen:	20 μl
Detektion:	Fluoreszenzdetektion nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldehyd und D-3-Mercapto-2-methylpropionsäure (Anregungswellenlänge = 338 nm, Emissionswellenlänge > 420 nm)
Vorsäulenreagentien:
Reagens A:	50 mM ortho-Phthalsäureanhydrid (170 mg/25 ml MeOH/Wasser 50/50
Reagens B:	113 mg D-S-Benzoyl-3-mercapto-2-methylpropionsäure in 1 ml 1 M NaOH, und Lösen. Versetzen mit 9 ml MeOH/Wasser 50/50, Einstellen auf pH 7,0 mit 1 M H₃PO₄
Reagens C:	0,25 M H₃PO₄
Derivatisierung:	35 μl Reagens A 35 μl Reagens B 210 μl Probenlösung (Probe in 0,4 M Boratpuffer pH 9,4) 140 μl Reagens C
Reaktionsdauer:	5 Minuten

Die ursprüngliche Aktivität für die verschiedenen getesteten Substrate wurde aufgrund der linearen Abschnitte der Fortschrittkurven berechnet, wobei die Umsatzrate gegen die Reaktionsdauer aufgetragen wurde.
Durch Verwendung des linearen Abschnitts der Fortschrittskurven wurde gewährleistet, daß nur Proben für die Berechnungen verwendet werden, die zu Zeitpunkten gezogen wurden, zu denen die Substratkonzentration noch ausreichend hoch war. Die Umsatzrate wurde dadurch berechnet, daß man die in der Racemasereaktion gebildeten Aminosäure- und Aminosäureamidmengen (also mit der umgekehrten Stereochemie im Vergleich zum Substratmolekül) durch die Gesamtmenge der beiden Aminosäure enantiomere und der beiden Aminosäureamidenantiomere dividierte. Auf diese Weise wurden die berechneten Umsatzraten um die eventuell stattfindende Hydrolyse des Amidsubstrats und/oder Produkts durch Amidasen/Aminopeptidasen, die vom EDTA in dem Ansatz nicht vollständig inhibiert wurden, korrigiert.
Bei dem ZFE von E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC wurde keines der verwendeten enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamidsubstrate racemisiert. E. coli TOP10 enthält eindeutig keine α-H-α-Aminosäureamidracemase. Die Ergebnisse dieses Versuchs mit dem ZFE aus E. coli TOP10/pKEC_AZAR_3 sind in Tabelle 6 angegeben.
Tabelle 6. Relative ursprüngliche Aktivität von ZFE aus von E. coli TOP10/pKEC_AZAR_3 gegenüber verschiedenen enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamiden

^aAlle ursprünglichen Aktivitäten sind relativ in bezug auf die Aktivität gegenüber D-Leucinamid ausgedrückt.

Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß der ZFE aus E. coli TOP10/pKEC_AZAR_3 nicht nur Leucinamid, sondern auch andere α-H-α-Aminosäureamide racemisieren kann. Da dieser rekombinante Stamm das α-H-α-Aminosäureamidracemase-Gen aus O. anthropi IA enthält, kann diese breite Substratspezifität nur auf die von diesem Gen kodierte Racemase zurückgeführt werden.
Beispiel 8
Bestimmung der Substratspezifität der teilweise aufgereinigten α-H-α-Aminosäureamidracemase aus Ochrobactrum anthropi IA
Teilweise Aufreinigung
Die α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA wurde teilweise aus E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 aufgereinigt. Um ausreichend Zellmaterial für diese Aufreinigung zu erhalten, wurde dieser rekombinante Stamm im 10-Liter-Maßstab fermentiert. Zuerst wurde ein Inokulum hergestellt, und zwar dadurch, daß man 500 ml 2·TY.-Medium, das 50 mg/l Kanamycin enthielt, mit 10 μl einer Glycerin-Vorratskultur dieses Stamms inokulierte. Nach 22stündiger Inkubation bei 28°C und 170 U/min erhielt man eine OD_{620 nm} von 2,2. Das vollständige Inokulum wurden anschließend in einen Fermenter (Typ ISF-200, Infors, Bottmingen, Schweiz), der 9 Liter 2·TY-Medium mit 50 mg/l Kanamycin enthielt, überführt. Der pH wurde durch Versetzen mit 5 N H₃PO₄ und/oder 5 N KOH auf 7,0 eingestellt, und der pO₂ wurde manuell eingestellt, und zwar dadurch, daß man sowohl die Belüftungsrate (1-2 Liter Luft pro Minute) als auch die Rührgeschwindigkeit (250-750 U/min) veränderte. Der Fermenter wurde 19 Stunden lang bei 28°C betrieben, wodurch man zu einer Zellsuspension mit einer OD_{620 nm} von 5,7 gelangte. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet (15 Minuten bei 12000 × g, 4°C), einmal mit 20 mM HEPES-NaOH, pH 7 gewaschen und als feuchtes Zellpellet (ungefähr 125 g )bei –20°C aufbewahrt.
Nach dem Auftauen des Zellpellets wurden die Zellen in Puffer A (20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 1,3 mM Dithiothreitol, 20 μM Pyridoxal-5-phosphat) mit 2,66 mM MgCl₂ erneut suspendiert. Pro Gramm Zellfrischgewicht wurden 3 Gramm Puffer A verwendet. Unmittelbar vor dem Aufbrechen wurde die Zellsuspension mit Benzonase (30 U/Gramm Zellfrischgewicht-Merck KgaA, Darmstadt, Deutschland) versetzt. Die Zellen wurden durch einmalige Passage durch einen Homogenisator (Haskel, Modell NJ1600HD15, Wesel, Deutschland) bei einem Arbeitsdruck von 1500 bar aufgebrochen. Anschließend wurden teilchenförmige Bestandteile abzentrifugiert (30 min bei 34000 × g, 4°C), und der erhaltene zellfreie Extrakt (ZFE) wurde in Portionen bei –20°C aufbewahrt.
Alle folgenden Aufreinigungsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Bei dem ersten Aufreinigungsschritt handelte es sich um eine Ammoniumsulfatfällung bei 40% Sättigung. Dieser Schritt wurde dadurch durchgeführt, daß man eine 80% gesättigte (NH₄)₂SO₄-Lösung tropfenweise zu einem gleichen Volumen ZFE zugab. Die trübe Lösung wurde langsam 1,5 Stunden lang geschüttelt, wonach das ausgefällte Protein durch Zentrifugation gewonnen wurde (30 min bei 15000 × g). Das Proteinpellet wurde in Puffer A gelöst und im nächsten Aufreinigungsschritt eingesetzt.
Um eine Anionenaustauschchromatographie als zweiten Aufreinigungsschritt durchführen zu können, mußte die Proteinlösung nach der Ammoniumsulfatfällung entsalzt werden. Sie wurde daher in 2,5-ml-Portionen auf PD-10-Entsalzungssäulen (Amersham Biosciences, Roosendaal, Niederlande), die mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 (Puffer B) equilibriert worden waren, aufgetragen. Das Protein wurde mit 3,5 ml Puffer B pro PD-10-Säule eluiert. Die entsalzte Proteinlösung wurde auf eine Mono Q HR 10/10 Säule (Amersham Biosciences, Roosendaal, Niederlande), die mit Puffer B equilibriert worden war, aufgetragen. Diese Säule wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4 ml/min betrieben, und es wurden Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die α-H-α-Aminosäureamidracemase wurde aus dieser Säule mit Puffer B, der 1 M NaCl enthielt, eluierte, wobei man einen linearen Gradienten von 0-100% NaCl in 100 ml auftrug. Die α-H-α-Aminosäureamidracemase eluierte bei ungefähr 0,34 M NaCl, und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt.
Die Proteinlösung, die die α-H-α-Aminosäureamidracemase enthielt, wurde anschließend auf eine HiLoad 26/60 Superdex 200 prep-grade Gelfiltrationssäule (Amersham Biosciences, Roosendaal, Niederlande), die mit Puffer B, der 1 M NaCl enthielt, equilibriert worden war, aufgetragen. Die α-H-α-Aminosäureamidracemase wurde mit dem Equilibrierungspuffer bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Es wurden Fraktionen zu je 3 ml aufgefangen. Die Fraktionen, die die Racemaseaktivität enthielten, wurden gepoolt und auf eine Konzentration von 0,25 M mit Saccharose versetzt, bevor sie in aliquoten Teilen bei mindestens –20°C aufbewahrt wurden.
Mit dieser Aufreinigungsvorschrift wurde die α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA teilweise aus den ZFE von 2. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 aufgereinigt, und zwar mit einer Gesamtausbeute von 19%. Mittels SDS-PAGE mit dem NuPAGE-System (Invitrogen) unter reduzierenden Bedingungen mit MES-Puffer wurde gezeigt, daß ungefähr 50% des Proteins in dem Präparat nach der Gelfiltration aus der Racemase bestand.
Bestimmung der Substratspezifität
Die Substratspezifität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA wurde mit dem teilweise aufgereinigten Enzympräparat, das gemäß der Vorschrift oben erhalten wurde, bestimmt. Ansätze mit einem Gesamtvolumen von 1 ml wurden dadurch hergestellt, daß man 772 μl 66,6 mM HEPES-NAOH, pH 8,0, 10 μl 0,1 M Dithiothreitol, 18 μl einer Lösung, die 20 mg/ml BSA und 1 mM Pyridoxal-5-phosphat enthielt, sowie 100 μl einer 0,75 M Substratlösung, pH 8,0, vermischte. Nach 5minütigem Equilibrieren bei 37°C wurden die Reaktionen durch Versetzen mit 100 μl der Enzymlösung gestartet. Die Ansätze wurden bei 37°C ohne Schütteln inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wurden 50-μl-Proben gezogen und in Röhrchen, die 950 μl 1 M H₃PO₄ enthielten, überführt, um die Reaktion zu stoppen. Nachdem die Proben ausreichend mit 0,4 M Boratpuffer pH 9,4 verdünnt worden waren, wurden die erhaltenen Mischungen mit HPLC analysiert, um die genauen Konzentrationen der beiden Aminosäureamidenantiomere nach der Methode von Beispiel 7 zu bestimmen.
Die Ausgangsaktivität für die verschiedenen getesteten Substrate wurde anhand der linearen Abschnitte der Fortschrittskurven berechnet, in denen die Menge des gebildeten Aminosäureamidenantiomers (also mit einer dem Substratmolekül entgegengesetzten Stereochemie) gegen die Reaktionsdauer aufgetragen wurde. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 7 angeführt. Tabelle 7. Relative Ausgangsaktivität der teilweise aufgereinigten α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA gegenüber verschiedenen enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamiden.

Die Daten in Tabelle 7 zeigen deutlich, daß die α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA eine breite Substratspezifität aufweist, da eine Aktivität gegenüber Aminosäureamiden mit kurz- und langkettiger Alkylseitenkette, die gegebenenfalls an ihrem C_β-Atom substituiert sein kann, sowie gegenüber Aminosäureamiden mit Arylseitenkette gefunden wurde.
Beispiel 9
Bestimmung der Substratspezifität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus Arthrobacter nicotianae NCIMB 41126 mit zellfreiem Extrakt aus E. coli DH10B/pAn(1)PLV36D06
Herstellung des zellfreien Extrakts
Der ZFE von E. coli DH10B/pAn(1)PLV36D06 wurde wie in Beispiel 7 für E. coli TOP10/pKEC_AZAR_3 beschrieben hergestellt.
Bestimmung der Substratspezifität
Bevor die Ansätze mit den verschiedenen enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamiden zwecks Bestimmung der Substratspezifität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus A. nicotianae mit dem ZFE aus E. coli DH10B/pAn(1)PLV36D06 versetzt wurden, wurden die Amidasen/Aminopeptidasen von E. coli in diesen ZFE durch Vorbehandlung mit einem Hemmstoffcocktail inhibiert. Eine Tablette Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) wurden in 9 ml des ZFEs gelöst und anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden Ansätze zu je 10 ml (inklusive dem ZFE) hergestellt, die 50 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 20 μM Pyridoxal-5-Phosphat, 0,4 mg/ml BSA, 1 mM Dithiothreitol und 75 mM eines der getesteten Aminosäureamide enthielten. Die Reaktionen wurden durch versetzen mit 1 ml des vorbehandelten ZFEs von E. coli DH10B/pAn(1)PLV36D06 oder E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC (Leervektor) gestartet und bei 37°C inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zu je 1 ml gezogen und in Röhrchen, die 1 ml 1 M H₃PO₄ enthielten, überführt, um die Reaktion zu stoppen. Nachdem die Proben ausreichend mit 0,4 M Boratpuffer pH 9,4 verdünnt worden waren, wurden die erhaltenen Mischungen mittels HPLC analysiert, um die genauen Konzentrationen der beiden Aminosäure-Enantiomere und der beiden Aminosäureamid-Enantiomere nach dem Verfahren von Beispiel 7 zu bestimmen. Die Berechnung der Ausgangsaktivität des ZFEs gegenüber den verschiedenen α-H-α-Aminosäureamidsubstraten erfolgte ebenfalls wie in Beispiel 7 beschrieben, inklusive der Korrektur für mögliche Hydrolyse des Amidsubstrats und/oder -Produkts durch Amidasen/Aminopeptidasen, die durch die Vorinkubation des ZFE mit dem Hemmstoffcocktail nicht vollständig gehemmt worden waren.
Wie bereits in Beispiel 7 zeigte sich auch bei dem vorbehandelten ZFE von E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC keine Racemisierung des verwendeten enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamidsubstrats. Die Ergebnisse dieses Versuchs mit dem ZFE von E. coli TOP10/pAn(1)PLV36D06 sind in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8. Relative Ausgangsaktivität von ZFE aus E. coli DH10B/pAn(1)PLV36D06 gegenüber verschiedenen enantiomerenreinen α-H-α-Aminosäureamiden

Die in Tabelle 8 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, daß die α-H-α-Aminosäureamidracemase aus A. nicotianae NCIMB 41126 nicht nur eine Aktivität gegenüber Leucinamid, sondern auch gegenüber anderen α-H-α-Aminosäureamiden aufweist.
Beispiel 10
α-H-α-Aminosäureamidracemaseaktivität-Test mit DL-2-Aminobuttersäureamid als Substrat und ZFE aus E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 mit der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA
Herstellung des zellfreien Extrakts
Die Kultivierung von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 sowie die Herstellung des zellfreien Extrakts erfolgten ähnlich wie bei Beispiel 7. Auch hier wurde E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC auf genau die gleiche Weise behandelt, um als Negativkontrolle zu dienen.
α-H-α-Aminosäureamidracemaseaktivität gegenüber DL-2-Aminobuttersäureamid

Zur Bestimmung der Aktivität des ZFEs aus E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 und E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC wurden Ansätze zu je 10 ml hergestellt, die 50 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 20 μM Pyridoxal-5-phosphat, 0,4 mg/ml BSA, 1 mM Dithiothreitol und 75 mM DL-2-Aminobuttersäureamid enthielten. Die Reaktionen wurden durch Versetzen mit 1 ml des aufgetauten ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 oder E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC (Leervektor) gestartet und 21,5 Stunden lang bei 37°C inkubiert. In regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben zu je 1 ml gezogen und in Röhrchen, die 1 ml McOH enthielten, überführt, um die Reaktion zu stoppen. Die Analyse dieser Proben zwecks Bestimmung der Konzentrationen an L- und D-2-Aminobuttersäure und L- und D-2-Aminobuttersäureamid erfolgte bei HPLC gemäß der folgenden Vorschrift.

Säule:	Sumichiral OA5000 von Sumika (150 × 4,6 mm innerer Durchmesser, 5μ) + Vorsäule
Lösungsmittel:	4 mM CuSO₄ in Wasser
Durchflußgeschwindigkeit:	1 ml/min
Säulentemperatur:	10°C
Einspritzvolumen:	6 μl
Detektion:	Fluoreszenzdetektion nach Nachsäulenderivatisierung mit o-Phthalaldehyd und 2-Mercaptoethanol in 0,4 M Boratpuffer unter Zusatz von EDTA (Anregungswellenlänge = 338 nm, Emissionswellenlänge >420 nm)

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9. α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber DL-2-Aminobuttersäure (Abu)-amid des ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 und E. coli mit Leervektor (E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC).

Codenummer der Probe	Inkubations- dauer (h)	D- Abu- Amid (mM)	L- Abu- Amid (mM)	D- Abu (mM)	L- Abu (mM)	Umsatz ratea (%)	e.e._L- (%)
B	0	41,1	37,5	0,0	2,1	2,6	100
B	0,75	43,2	26,1	0,0	14,4	17,2	100
B	2	42,2	7,2	0,0	30,5	38,2	100
B	4,65	38,9	0,1	0,3	39,4	50,1	98,5
B	8,25	42,4	0,1	0,7	40,9	48,7	96,7
B	21,5	40,9	0,1	1,7	38,3	47,4	91,7
A	0	42,3	40,5	0,0	1,4	1,6	100
A	0,75	39,6	29,3	0,0	12,3	15,2	100
A	2	34,7	17,8	0,0	29,1	35,7	100
A	4,65	20,8	11,5	0,1	52,3	61,8	99,6
A	8,25	12,4	8,6	0,5	64,9	75,1	98,5
A	21,5	6,7	5,8	1,4	71,7	83,9	96,3

^adie Umsatzrate zur L-Säure wurde mit der folgenden Formel berechnet:

Umsatzrate = [L-Säure/(L-Säure + D-Säure + L-Amid + D-Amid)] × 100%
Stamm A: E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10
Stamm B: E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC
Aus den Daten in Tabelle 9 geht klar hervor, daß der Maximalumsatz, der mit dem ZFE der E. coli-Zellen mit Leervektor (E. coli TOP10/pBAD/Myc-HisC) nicht mehr als 50% beträgt. Da diese Zellen keine α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität aufweisen, wird nur das L-Aminobuttersäureamid umgesetzt werden, während das andere Substratenantiomer unverändert bleibt. Die maximale theoretische Ausbeute beträgt in diesem Fall nur 50%, wie dies für (enzymatische) kinetische Trennungsreaktionen üblich ist. Die Daten der letzten beiden Zeitpunkte in dieser Reihe zeigen, daß, wenn die Konzentration des L-Substrats gegen null strebt, die L-Amidase/Aminopeptidase aus E. coli TOP10 auch langsam das D-Aminobuttersäureamid umsetzt, was nach einer Reaktionsdauer von 21,5 Stunden zu L-Aminobuttersäure mit einem Enantiomerenüberschuß von 91,7% führt.
Beim ZFE aus E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 mit der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA wird eindeutig auch das D-Aminobuttersäureamid umgesetzt, was nach 21,5 Stunden zu einem Gesamtumsatz zu L-Aminobuttersäure von 85,4% führt. Der enantiomere Überschuß der erhaltenen L-Aminobuttersäure in dem Ansatz liegt während der Reaktion trotzdem noch beträchtlich über 95%. Dies wird durch die höhere L-Aminobuttersäureamidkonzentration am Ende der Reaktion, die durch die Einwirkung der α-H-α-Aminosäureamidracemase entsteht, verursacht.
Dieser Versuch beweist, daß durch Kombinieren der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA mit einer L-selektiven Amidase/Aminopeptidase (wie sie z.B. in ZFE von E. coli TOP10 Zellen vorliegt) DL-α-H-α-Aminosäureamide in über 50%iger Ausbeute und mit ausgezeichnetem Enantiomerenüberschuß zu L-α-H-α-Aminosäuren umgesetzt werden können.
Beispiel 11
α-H-α-Aminosäureamidracemaseaktivitäts-Test mit DL-2-Aminobuttersäureamid als Substrat und ZFE von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 in Kombination mit der L Aminopeptidase aus Pseudomonas putida ATCC 12633
In diesem Versuch wurde der E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10-ZFE von Beispiel 11 angesetzt. Er wurde mit einem Präparat, das die L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 enthielt, kombiniert. Es handelt sich hierbei um dasselbe L-enantioselektive Enzym, das auch als L-Aminopeptidase-Helferlösung beim Screening der Genbibliotheken von O. anthropi IA und A. nicotianae NCIMB 41126 (Beispiele 3 und 3A) angesetzt wurde.

Es wurde ein Ansatz mit einem Volumen von 10 ml (Gesamtvolumen inklusive Enzympräparate) hergestellt, der 50 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 20 μM Pyridoxal-5-phosphat, 0,4 mg/ml BSA, 1 mM Dithiothreitol und 75 ml DL-2-Aminobuttersäureamid enthielt. Die Reaktion wurde durch Versetzen mit 0,4 ml des aufgetauten ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 und 0,17 ml einer Lösung, die L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 enthielt, gestartet. Der Ansatz wurde 18 Stunden lang bis 37°C inkubiert. Zu gewissen Zeitabständen wurden Proben zu je 1 ml gezogen und in Röhrchen mit 1 ml MeOH überführt, um die Reaktion zu stoppen. Die Analyse dieser Proben zwecks Bestimmung der Konzentrationen an L- und D-2-Aminobuttersäure und L- und D-2-Aminobuttersäureamid erfolgte mittels HPLC gemäß der Vorschrift von Beispiel 11. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10. α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber DL-2-Aminobuttersäure(Abu)-amid des ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 in Kombination mit der L-Aminopeptidase aus Pseudomonas putida ATCC 12633.

Inkubationsdauer (h)	D-Abu-Amid (mM)	L-Abu-Amid (mN)	D-Abu (mM)	L-Abu (mM)	Umsatzrate (%)	e.e._L- Abu (%)
0	36,2	34,1	0,0	0,5	0,7	100
0,5	34,6	22,2	0,0	11,7	17,1	100
1,0	36,4	7,3	0,1	32,2	42,4	99,4
1,5	33,0	2,7	0,0	38,5	51,9	100
2,0	30,4	1,7	0,0	41,9	56,7	100
18	0,4	0,0	1,6	70,8	97,3	95,7

Die Daten in Tabelle 10 zeigen, daß durch Kombinieren der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA und der L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 eine äußerst hohe Umsatzrate zu L-2-Aminobuttersäure (97,3%) erzielt werden kann. Diese Umsatzrate liegt sehr nahe bei dem maximalen theoretischen Wert, der für eine dynamische kinetische Trennung erzielt werden kann (d.h. 100%). Weiterhin beträgt der Enantiomerenüberschuß der L-2-Aminobuttersäure trotzdem noch mehr als 95%.
Beispiel 12
α-H-α-Aminosäureamidracemaseaktivitäts-Test mit DL-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäureamid als Substrat und ZFE aus E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 in Kombination mit der L-Aminopeptidase aus Pseudomonas putida ATCC 12633

In einer sehr ähnlichen Versuchsanordnung wurde die kombinierte Aktivität der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O.anthropi IA und der L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 gegenüber dem komplexeren Substrat DL-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäureamid bestimmt. Die Molekülstruktur dieses Amids findet sich in der Substrattabelle in Beispiel B. In diesem Versuch wurden 1 ml des aufgetauten ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 gemeinsam mit 1 ml einer Lösung mit der L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 verwendet. Die Reaktion erfolgte über 120 Stunden. Die Analyse dieser Proben zur Bestimmung der Konzentrationen an L- und D-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäure und L- und D-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäureamid erfolgte mittels HPLC nach der folgenden Vorschrift.

Säule:	Kronenether Cr(-)(150 × 4,6 mm innerer Durchmesser)
Lösungsmittel:	Perchlorsäure in Wasser, pH = 1,0
Durchflußgeschwindigkeit:	1,2 ml/min
Säulentemperatur:	18°C
Einspritzvolumen:	20 μl
Detektion:	Fluoreszenzdetektion nach Nachsäulenderivatisierung mit o-Phthalaldehyd und 2-Mercaptoethanol in 0,4 M Boratpuffer (Anregungswellenlänge = 338 nm, Emissionswellenlänge > 420 nm)

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11. α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität gegenüber DL-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäureamid des ZFEs von E. coli DH10B/pOa(1)PLV49B10 in Kombination mit der L-Aminopeptidase aus Pseudomonas putida ATCC 12633.

Inkubationsdauer (h)	D-Abu-Amid (mM)	L-Abu-Amid (mM)	D-Abu (mM)	L-Abu (mM)	Umsatzrate (%)	e.e._L- Abu (%)
0	36,6	36,5	0,0	4,3	5,6	100
3,6	35,7	2,7	0,0	37,6	49,5	100
22,1	29,9	1,0	0,1	40,3	56,6	99,5
53,2	27,4	0,1	0,1	43,5	61,1	99,5
120,2	23,7	0,1	0,4	46,0	65,5	98,2

Die Daten in Tabelle 11 zeigen, daß durch Kombinieren der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA und der L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633 bei einer Reaktionsdauer von 120 Stunden eine Umsatzrate des DL-2-Amino-5-[1,3]dioxolan-2-ylpentansäureamids zu der L-Säure von über 65% erzielt wird. Der Enantiomerenüberschuß der gebildeten der L-Säure liegt höher als 98%.
Die in diesem Versuch erzielten Ergebnisse beweisen, daß durch Kombinieren der α-H-α-Aminosäureamidracemase aus O. anthropi IA mit einer L-selektiven Amidase/Aminopeptidase (wie z.B. der L-Aminopeptidase aus P. putida ATCC 12633) auch bei komplexeren α-H-α-Aminosäureamiden mit funktionalisierten Seitenketten eine dynamische kinetische Auftrennung möglich ist.
SEQUENZBESCHREIBUNG

Claims

Isoliertes Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität und mit mindestens ungefähr 55%, insbesondere mindestens ungefähr 65%, speziell bevorzugt mindestens ungefähr 75%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 85%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 90%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 95%, ganz besonders speziell bevorzugt mindestens ungefähr 97% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 2.
Isoliertes Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität und mit mindestens ungefähr 50%, insbesondere mindestens ungefähr 60%, speziell bevorzugt mindestens ungefähr 70%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 80%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 90%, ganz speziell bevorzugt mindestens ungefähr 95%, ganz besonders speziell bevorzugt mindestens ungefähr 97% Identität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 9.
Isolierte Polypeptide mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, die von Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die mit SEQ ID: NO. 1 oder einem dazu komplementären Strang oder mit SEQ ID: NO. 8 oder einem dazu komplementären Strang unter Bedingungen hybridisieren, wobei die Hybridisierung ungefähr 12 Stunden lang bei ungefähr 45°C in 6x Natriumchlorid/Natriumcitrat durchgeführt wird und wobei zwei aufeinanderfolgende 30minütige Waschschritte mit 1x Natriumchlorid/Natriumcitrat, 0,1% SDS, bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, stärker bevorzugt bei 60°C, am stärksten bevorzugt bei 65°C, durchgeführt werden.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, das eine immunologische Kreuzreaktivität mit einem Antikörper gegen ein Fragment der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID: NO. 2 oder SEQ ID: NO. 9 aufweist.
Isoliertes Polypeptid oder Fragment davon nach Anspruch 1 oder 2 mit mindestens 100 Aminosäuren, vorzugsweise 125-350 Aminosäuren stärker bevorzugt 200-300 Aminosäuren, mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität.
Isoliertes Fusionsprotein, das durch Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-5 codiert, in operativer Verknüpfung mit einer oder mehreren Nukleinsäuresequenz(en), die für (ein) Markerpolypetid(e) kodiert/kodieren, hergestellt wird.
Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-5 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 6 codiert.
Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 7 enthält.
Wirtszelle, die eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 7 oder einen Vektor nach Anspruch 8 enthält und exprimiert.
Verfahren zum Isolieren eines Mikroorganismus mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt: a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen, b. Testen des so erhaltenen Mikroorganismus bzw. der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität.
Agrobacterium rhizogenes Na, hinterlegt unter der Nummer NCIMB 41127, Agrobacterium rhizogenes Bi, hinterlegt unter der Nummer NCIMB 41128, Arthrobacter nicotianae, hinterlegt unter der Nummer NCIMB 41126, Ochrobactrum anthropi IA, hinterlegt unter der Nummer NCIMB 41129.
Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität kodiert, das die folgenden Schritte umfaßt: a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen, b. Testen des so erhaltenen Mikroorganismus bzw. der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität; c. Isolieren der Nukleinsäuresequenz aus dem erhaltenen Mikroorganismus bzw. den erhaltenen Mikroorganismen auf bekannte Weise.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt: a. Kultivieren einer mikroorganismushaltigen Probe in oder auf einem geeigneten Wachstumsmedium, das D-α-Amino-ε-caprolactam oder eine Mischung aus D- und L-α-Amino-ε-caprolactam als Stickstoffquelle bzw. als einzige Stickstoffquelle enthält, und zwar mit einer oder mehreren Passagen, b. Testen des so erhaltenen Mikroorganismus bzw. der so erhaltenen Mikroorganismen auf α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität; c. Isolieren der Nukleinsäuresequenz aus dem erhaltenen Mikroorganismus bzw. den erhaltenen Mikroorganismen auf bekannte Weise, d. Exprimieren der Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten Wirt, um ein Polypeptid mit α-H-α-Aminosäureamidracemase-Aktivität herzustellen.
Verfahren zur Racemisierung eines enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäureamids, wobei die Racemisierung in Gegenwart eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-6, in Gegenwart einer Wirtszelle nach Anspruch 9 oder in Gegenwart eines Mikroorganismus nach Anspruch 11 durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung einer enantiomerenangereicherten α-H-α-Aminosäure aus einer Mischung der entsprechenden D- und L-α-H-α-Aminosäureamide oder zur Herstellung einer L-α-H-α-Aminosäure aus dem entsprechenden D-α-H-α-Aminosäureamid oder zur Herstellung einer D-α-H-α-Aminosäure aus dem entsprechenden L-α-H-α-Aminosäureamid, wobei das Verfahren in Gegenwart einer enantioselektiven Amidase und in Gegenwart eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-6 oder in Gegenwart einer Wirtszelle nach Anspruch 9 oder in Gegenwart eines Mikroorganismus nach Anspruch 11 durchgeführt wird.