DE68925588T2

DE68925588T2 - Verfahren zur aktivierung von polymeren trägern und damit hergestellte zusammensetzungen zur verwendung in der affinitätschromatographie

Info

Publication number: DE68925588T2
Application number: DE68925588T
Authority: DE
Inventors: That Ngo
Original assignee: Bioprobe International Inc
Current assignee: Bioprobe International Inc
Priority date: 1989-09-08
Filing date: 1989-11-27
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2009-11-28
Also published as: EP0491688A4; EP0491688B1; US4981961A; CA2005917A1; ATE133582T1; EP0491688A1; DE68925588D1; JPH05504978A; WO1991003257A1

Description

Diese Erfindung betrifft in ihren verschiedenen Ausführungsformen Verfahren zur Aktivierung von polymeren Trägern und zur kovalenten Bindung organischer Liganden an solche aktivierte polymere Träger, eine neuen Klasse von dadurch hergestellten Erzeugnissen und die Verwendung solcher Erzeugnisse für die Trennung und Reinigung von organischen Verbindungen, insbesondere solcher von biochemischem Interesse. In einer von ihren insbesondere bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aktivierung polymerer Gele und die kovalente Bindung eine oder mehrere nukleophile Gruppen enthaltender organischer Liganden, wie Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydryl-Gruppen an solche aktivierten polymeren Gele. In einer weiteren ihrer besonders bevorzugten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zur Reinigung und Wiedergewinnung von spezifischen organischen Molekülen von biologischem Interesse und insbesondere Proteinen wie Immunglobulinen durch die Verwendung eines nicht peptidischen, Protein A und/oder Protein G mimetischen Liganden (i.e. immunglobulinbindenden Liganden), der an ein polymeres Gel gebunden ist, und Verfahren zur Herstellung solcher nicht peptidischer, Protein A und/oder Protein G mimetischer Liganden.
Polymere, wie Polysaccharide, Polyvinylalkohol und Nylon, sind weitverbreitet als feste Träger für die Immobilisierung von Enzymen und die Herstellung biospezifischer Affinitätsmatrizen. Verschiedene Verfahren sind zur Kopplung biologisch aktiver Liganden an wasserunlösliche Träger bekannt. Diese Verfahren sind für die kovalente Immobilisierung von biologisch aktiven Materialien wie Enzymen, Antikörpern oder Antigenen verwendet worden. Immobilisierte biologisch aktive Materialien finden in verschiedenen Technologiebereichen Verwendung. Ein Beispiel dafür sind die immunologischen Bestimmungsverfahren. Eine weitere wichtige Anwendung liegt in der Affinitätschromatographie, worin ein organischer Ligand mit einer biospezifischen Affinität zu einer an deren organischen Substanz an einen wasserunlöslichen polymeren Träger gebunden worden ist. Proteine sind an wasserlösliche Polymere sowie an wasserunlösliche Polymere zur Modifizierung der Eigenschaften des Proteins gebunden worden.
Die Kopplung des Liganden an den Träger wird oft in einer solchen Weise ausgeführt, daß der Träger zuerst durch die Einführung einer reaktiven Gruppe in den Träger aktiviert wird, welcher dann mit dem gewünschten Liganden umgesetzt wird. Ein Beispiel ist die Verwendung von Bromcyan, CNBr, als ein Aktivierungsmittel, welch es in Porath et al., "Immobilized Enzymes, Methods in Enzymology", Vol. 44, (Mosbach, K., Ed.), Seiten 10 bis 45, Academic Press, New York (1976), beschrieben ist. Die Verwendung von Bromcyan für die Aktivierung von Hydroxylgruppen von polymeren Trägern ist das früheste und am meisten verbreitete Verfahren. Jedoch unterliegen die Bromcyanaktivierungsverfahren gewissen Nachteilen, nämlich (1) die zwischen den bromcyanaktivierten Gelen und den Aminogruppen der Affinitätsliganden gebildeten Bindungen sind anfällig, (2) die Umsetzung resultiert in der Einführung von geladenen Spezies, welche bei der Affinitätsabsorption stören, und (3) Bromcyan ist eine schädliche, Tränen erzeugende und giftige chemische Substanz, welche während ihrer Handhabung eine spezifische Vorsicht erfordert.
Ein weiteres Verfahren zur Aktivierung polymerer Träger ist die Verwendung von organischen Sulfonylchloriden, insbesondere 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid). Solche Aktivierungsmittel sind jedoch relativ teuer und schwer zu handhaben und sehr feuchtigkeitsempfindlich.
Die Suche nach anderen Verfahren zur Kopplung von Liganden an polymeren Trägern führte zu der Verwendung einer Zahl von verschiedenen Reagenzien einschließlich Triazintrichlorid, N-Hydroxysuccinimid, 1,1-Carbonyldiimidazol, gewissen Pyridinderivaten und gewissen Epoxidverbindungen. Ein Verfahren zur Herstellung kovalenter chromatographischer Matrizen unter Verwendung eines hydroxylhaltigen Polymers, welches durch Umsetzung mit 2-Fluor-1-pyridiniumtoluol-4-sulfonat (FMP) aktiviert worden ist, ist in der US-A-4,582,875 beschrieben. Das letztbeschriebene Verfahren ist als am effektivsten für die Bindung bei einem pH nahe dem neutralen pH-Wert gefunden worden, zum Beispiel pH 8 bis 9.
In der Tat ist kein bekanntes Verfahren gefunden worden zur Herstellung eines aktivierten polymeren Trägers, der in der Lage ist, wirksam einen Liganden bei einem sauren pH zu binden, zum Beispiel bei einem pH von weniger als etwa 4. Da einige Liganden im sauren pH-Bereich gebunden werden müssen, besteht die Notwendigkeit für ein Aktivierungsmittel, welches aktivierte Polymere erzeugen kann, die im sauren Bereich des pH-Wertes wirksam sind. Pepsin muß zum Beispiel bei einem pH-Wert von unter etwa 4 gekoppelt werden, da es denaturiert und seine enzymatische Affinität bei einem höheren pH-Wert verlieren wird.
Zusätzlich ist die Entwicklung von nützlichen Zusammensetzungen in der nicht-kovalenten Bindung von organischen Molekülen von enormer Signifikanz in der Chemie und Biologie, insbesondere wenn solche Zusammensetzungen jeden Grad einer Bindungsselektivität zeigen. Zum Beispiel verbleiben trotz der weitverbreiteten Entwicklung und Verwendung von Ionenaustauscherharzen und Protein A- oder Protein G-Affinitätsgelen zur Trennung und Reinigung von organischen Materialien von biologischem Interesse (wie insbesondere polyklonaler und monoklonaler Antikörper, wie sie in der Diagnostik, Reinigung und experimentellen Therapeutik verwendet werden) einige Nachteile inhärent in diesen Verfahren. Das Ionenaustauschchromatographieverfahren erfordert wegen seiner geringen Spezifität im allgemeinen die Verwendung verschiedener Säulen- und Gradientenelutionsverfahren, einschließlich spezifischer Detektionsverfahren, um das Verfahren zu überwachen. Im Gegensatz dazu sind obwohl Protein A-Affinitätsgele irgendwie mehr spezifischer sind, diese signifikant teurer als die Ionenaustauschchromatographie. Darüber hinaus sind Protein A-Gele nicht in der Lage, signifikante Mengen an Raffen-, Ziegen- oder Hühnchen-IgG zu binden. Es besteht auch die Möglichkeit von Immunreaktionen, da Protein A versehentlich in die zurückgewonnenen Antikörperpräparationen eindringen kann, welche den Wert der Chromatographieverfahren unter Verwendung von Protein A-Gelen zur Reinigung von Materialien, mit denen die Bindung eintriff, begrenzt. Schließlich sind immobilisierte Protein A-Gele empfindlich gegenüber mikrobiellen und Protein-Abbau, sowie anderer proteindenaturierender Mittel.
Aus diesem Grund ist es offensichtlich erwünscht, einen Chromatographieträger mit einem synthetischen Liganden zu entwickeln, vorzugsweise einen von niederem Molekulargewicht und geringen Kosten, welcher in der Lage sein würde, selektiv und wirksam Moleküle von biologischem Interesse zu binden, und insbesondere zum Binden von Antikörpern aller Art.
Die Entwicklung von thiophilen Gelen durch Porath et al. ist eine darauf gerichtete Anstrengung (vergleiche e.g. Porath J. et al., "A New Kind of "Thiophilic" Eledron-Donor-Acceptor Absorbent", Macromol. Chem., Macromol. Symp. 17: 359-71 (1988) und die darin genannten Zitate). Bei der thiophilen Interaktionschromatographie wird der Antikörper an ein thiophiles Gel in Gegenwart hoher Konzentrationen neutralwasserstrukturbildender Salze adsorbiert. Die Desorption wird durch Elution mit einem nicht Salze enthaltenden Puffer erreicht. Die Teilstruktur eines thiophilen Gels kann als P-O-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-SO&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-S-CH&sub2;-CH&sub2;-OH dargestellt werden, worin P das polymere Rückgrad darstellt.
Eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines stabilen und hydrolysebeständigen Kopplungsproduktes eines polymeren Trägers und eines organischen Liganden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung solch eines Verfahrens, welches unter relativ milden Bedingungen durchgeführt werden kann, um jegliche schädliche Wirkung auf die Reaktanten wie empfindliche biologische Liganden zu vermeiden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Reihe von Aktivierungsmitteln, welche mit den polymeren Trägern reagieren können, um ein aktiviertes Polymer zu erzeugen, das in der Lage ist, an eine große Vielzahl von organischen Liganden über einem weiten pH-Wert-Bereich gekoppelt zu werden.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Chromatographiematrizen, welche zur Bindung verschiedener biologisch aktiver Materialien sowohl kovalent als auch nicht-kovalent verwendet werden können.
Darüber hinaus ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, zusätzliche synthetische Liganden bereitzustellen, die selektiv und wirksam Materialien von Interesse aus einer Vielzahl von verschiedenen Quellen binden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Materialien zu entwickeln, die zur selektiven Bindung von Antikörpern aller Art fähig sind, einschließlich denen von Raffen, Ziegen und Hühnchen, die bis jetzt nicht einer Behandlung unter Verwendung herkömmlicher Reinigungsverfahren einschließlich Protein A-Affinitätsliganden zugänglich gewesen sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, synthetische Affinitätsliganden bereitzustellen, die zur Adsorption organischer Moleküle von Interesse im allgemeinen und von Peptiden wie Serumproteinen insbesondere, ohne die Verwendung von hohen Salzkonzentrationen beim Adsorptionsprozeß fähig sind.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Materialien und Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Immunglobulinen verschiedener Klassen und von einer Vielzahl von Spezies ohne die Verwendung von proteinhaltigem Material bereitzustellen, was selbst zur Kontamination des erhaltenen Erzeugnisses führen könnte.
Diese und andere Aufgaben werden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch die Bildung eines reaktiven Derivats eines polymeren Trägers durch Umsetzen des Polymers mit einem substituierten 2-Halopyridin, wie nachfolgend definiert, und anschließendem Umsetzen des aktivierten Polymers mit einem eine oder mehrere nukleophile Gruppen wie Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen enthaltenden Liganden, um ein gekoppeltes Produkt zu bilden, gelöst.
Das Verfahren gemäß dieser ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt einen Aktivierungsschritt, worin ein substituiertes 2-Halopyridin in einen polymeren Träger eingeführt wird, und einen Kopplungsschritt, in welchem ein organischer Ligand kovalent an den polymeren Träger gebunden wird.
Somit liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Polymers durch Umsetzen eines zumindest eine nukleophile Gruppe enthaltenden Polymers unter basischen Bedingungen mit einem substituierten 2-Halopyridin zur Herstellung eines Produktes, worin zumindest eine der nukleophilen Gruppen des Polymers durch Umsetzung mit dem 2-Halopyridin modifiziert worden ist, worin das 2-Halopyridin eine der nachfolgenden Formeln aufweist:
(i) allgemeine Formel A:
in der
X F, Cl oder Br,
Y F, Cl, Br, NO&sub2;, CH&sub3; oder CF&sub3; und
n 1 bis 4 sind; und
worin, wenn n größer als 1 ist, die durch Y bezeichneten Substituenten gleich oder verschieden sein können, zumindest eine der Y-Gruppen eine elektronenziehende Gruppe ist;
(ii) allgemeine Formel II
worin
jedes X&sub2; unabhängig Halogen, Trihalomethyl oder Nitro,
zumindest ein Y&sub2; Halogen und das andere Y&sub2; Halogen, Hydroxyl, Amino oder A&sub1;R&sub4;,
A&sub1; O, S oder NR&sub5;,
R&sub4; ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,
R&sub5; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind und
Z&sub2; eine geeignete Abgangsgruppe (im allgemeinen ein Halogen wie F oder Cl) ist, worin die basischen Bedingungen einen Überschuß einer Pyridinbase umfassen; oder
(iii) allgemeine Formel V
in der
X&sub2; und Y&sub2; wie vorstehend definiert sind,
jedes X&sub1; unabhängig Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,
zumindest ein Y&sub1; Wasserstoff und das andere Y&sub1; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,
R&sub1; Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl oder -NR&sub2;R&sub3; sind,
R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind, und
worin Z ein geeignetes Gegenion ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine neue Klasse von Verbindungen und deren Verwendung bei chromatographischen Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung verschiedener biologisch aktiver Materialien beschrieben. Insbesondere werden in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Bestandteile einer besonderen Klasse neuer Verbindungen, welche als das Umsetzungsprodukt eines polymeren Gels mit einer Pyridinbase, wie 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), und einem halogensubstituierten Pyridin, wie 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP), definiert werden, wobei das Reaktionsprodukt umgekehrt gegebenenfalls mit einer anderen spezifizierten niedermolekulargewichtigen Verbindung oder mit einer Hydroxidionenquelle umgesetzt werden kann, für die selektive und wirksame Bindung von Proteinen und anderen organischen Materialien von Interesse nicht-kovalent an die bis heute bevorzugten natürlichen Affinitätsliganden, wie Protein A-Gele, in einem vergleichbaren oder überlegenen Ausmaß verwendet werden
Insbesondere ist nun festgestellt worden, daß in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die nachfolgende Behandlung des Umsetzungsproduktes eines Sepharosegels, DMAP und DCTFP mit Ethylenglycol zu der Bildung eines Produkts (nachfolgend als "O-Gel" bezeichnet) führt, welches verwendet werden kann, um die Reinigung und Wiedergewinnung von Proteinen, wie Serumalbumin und Immunglobuline verschiedener Klassen aus Rohquellen, wie Serumproben aus verschiedenen Arten, zu erreichen.
Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Versuche zur Aufklärung der Struktur dieser Verbindungen und Ausnutzung ihrer außergewöhnlichen Verwendbarkeit in der Trennung und Reinigung von organischen Molekülen und insbesondere in der Wiedergewinnung von spezifischen Proteinen in relativ reiner Form aus Rohquellen, wie Serumproben, beschrieben.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert, in denen:
Fig. 1 eine vorläufige Einschätzung der Struktur der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bezogen auf die erhältliche Information hinsichtlich Zusammensetzung und einen vorgeschlagenen Umsetzungsweg zu deren Bildung zeigt,
Fig. 2 ein Chromatogramm des wiedergewonnen Eluents nach Behandlung des von verdünntem Humanserum an einer O-Gel-Säule zeigt,
Fig. 3 spezifische Sandwich-ELISA-Muster menschlichen Serums nach Chromatographie auf O-Gel zeigt,
Fig. 4 die Ergebnisse der SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von Fraktionen durch Elution auf einer O-Gel-Säule wiedergewonnenen menschlichen Serums zeigt,
Fig. 5 das durch Chromatographie auf O-Gel erhaltene Elutionsmuster von Mäuseserum (A) und Kaninchenserum (B) zeigt,
Fig. 6 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von Mäuse(A)- und Kanichen(B)-Seren zeigt,
Fig. 7 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Rinderserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 8 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Hühnchenserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 9 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Ziegenserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 10 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Mäuseserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 11 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Schweineserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 12 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Kaninchenserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 13 die SDS-Gradienten-Polyacrylamidgelelektrophorese von durch O-Gel-Chromatographie wiedergewonnenen Fraktionen einer Mischung aus Raffenserumalbumin und -IgG zeigt,
Fig. 14 ein Chromatogramm eines wiedergewonnenen Eluents nach Behandlung von verdünntem Ziegenserum mit DCTFP-DMAP aktiviertem, hydroxidbehandeltem Gel zeigt,
Fig. 15 ein Chromatogramm eines wiedergewonnenen Eluents nach Behandlung von verdünntem Kaninchenserum mit DCTFP-DMAP aktiviertem, glycinbehandeltem Gel zeigt,
Fig. 16 ein Chromatogramm eines wiedergewonnenen Eluents nach Behandlung von verdünntem Mäuseserum mit DCTFP-DMAP aktiviertem, glycinbehandeltem Gel zeigt, und
Fig. 17 ein Chromatogramm eines wiedergewonnenen Eluents nach Behandlung von verdünntem Kaninchenserum mit DCTFP-DMAP aktiviertem, ethylendiaminbehandeltem Gel zeigt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung in all ihren verschiedenen Ausführungsformen kann der polymere Träger eine wasserunlösliche oder eine wasserlösliche polymere Substanz sein. Ausgenommen wie nachfolgend angeführt, ist die Auswahl des Trägers nicht kritisch zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Im Prinzip kann jeder Typ von Träger verwendet werden, welcher eine polymere Natur aufweist und zumindest eine nukleophile Gruppe wie eine an ein Kohlenstoffatom gebundene Hydroxyl-, Amino- oder Sulfhydrylgruppe enthält, welche zur Aktivierung und Kopplung fähig ist. Der Träger wird hinsichtlich den Anforderungen an die individuellen Gegebenheiten ausgewählt, primär hinsichtlich dem zu koppelnden Ligandentyp und der beabsichtigten Verwendung des Kopplungsproduktes. Der Träger kann aus natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen polymeren Materialien enthaltend nukleophile Gruppen zusammengesetzt sein. Beispiele von wichtigen natürlichen und halbsynthetischen Trägermaterialien sind Polysaccharid enthaltende Materialien, zum Beispiel Cellulose, Agarose, Dextran und quervernetzte Produkte davon. Beispiele synthetischer Träger sind Poly(ethylenglycol), Poly(vinylalkohol), Poly(hydroxyethylmethacrylat), Nylon und dergleichen. Es ist sicherlich ebenfalls möglich, Träger wie anorganische Träger zu verwenden, die normalerweise keine Hydroxylgruppen enthalten, aber welche durch geeignete Behandlung mit solchen Gruppen versehen werden können. Ein Beispiel sind Siliciumdioxidteilchen, an deren Oberfläche zumindest eine nukleophile Gruppe enthaltende Gruppen gebunden worden sind. Die Träger können in der Form verschiedener Feststoffe, wie Gele, Beads, Fasern, Gewebe oder Membranen, oder in Form eines löslichen Polymers verwendet werden.
Die substituierten 2-Halopyridine, welche als das Aktivierungsmittel in dem Aktivierungsverfahren gemäß einer ersten Ausführungsform dieser Erfindung verwendet werden können, sind Derivate der 2-Halopyridine, in welchen zumindest eine der Ringpositionen des 2-Halopyridins mit einer elektronenziehenden Gruppe substituiert ist. Das substituierte 2-Halopyridin kann durch die nachfolgende Strukturformel A dargestellt werden:
worin X F, Cl oder Br, Y F, Cl, Br, NO&sub2;, CH&sub3; oder CF&sub3; und n 1 bis 4 sind. Im Fall, daß n größer als 1 ist; können die durch Y bezeichneten Substituenten gleich oder verschieden sein. Zumindest einer der durch Y bezeichneten Substituenten muß eine elektronenziehende Gruppe sein.
Typische Verbindungen beinhalten Pentafluorpyridin (PFP), 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP), 3,6-Dinitro-2-chlorpyridin (CDNP), 2,3,5-Trichlorpyridin (TCP), 2,6-Difluorpyridin (DFP), 2-Chlor-5-trifluormethylpyridin (CTFMP), 2,3,5,6-Tetrafluor-4-methylpyridin (TFMP) und 2,3,5,6-Tetrafluorpyridin (TFP).
Die Aktivierung der nukleophilhaltigen polymeren Träger kann in Gegenwart eines leichten Überschusses eines tertiären Amins, wie Triethylamin, Tributylamin oder 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), in einem polaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Dimethylformamid (DMF), Acetonitril oder Tetrahydrofuran (THF) durchgeführt werden. Die substituierten 2-Halopyridine reagieren mit dem polymeren Träger in einem weiten Bereich von Bedingungen, zum Beispiel kann die Umsetzung bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 90ºC, vorzugsweise unter Raumtemperaturbedingungen wie 22 bis 35ºC, über einen Zeitraum von etwa 0,1 bis etwa 20 Stunden, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2 Stunden, bei atmosphärischem oder leicht erhöhtem Druck durchgeführt werden. Die erhaltenen aktivierten Polymere, die leicht mit primären oder sekundären Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen verschiedener organischer Liganden reagieren, waren stabil während zumindest vier Monaten, wenn sie bei 4ºC in Aceton gelagert wurden. Der aktivierte polymere Träger kann auch in verdünnten Mineralsäuren, wie 2 mM Phosphorsäure, oder in Trockenform, falls gewünscht, gelagert werden.
Das Kopplungsverfahren der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist allgemein anwendbar auf organische Liganden, die die gezeigten Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppen enthalten. Salze von sulfhydrylgruppenhaltigen Verbindungen wie deren Natriumsalze sind ebenfalls nützlich für diese Zwecke. Im allgemeinen sollte das zur Kopplung ausgewählte Produkt ein Nukleophil sein, so daß die Kopplungsreaktion glatt durchgeführt werden kann. So kann der Ligand jeden aliphatischen, aromatischen, heterocyclischen oder heteroaromatischen Rest oder jeden Rest aus einer Kombination der vorstehenden enthalten, solange der erhaltene Ligand funktionelle zur Kopplung zugängliche Gruppen haben wird.
Ein Ligandentyp von spezifischem Interesse beinhaltet biologisch aktive Liganden, zum Beispiel Proteine, Enzyme, Antikörper, Antigene, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Thiolverbindungen, Cofaktoren, Haptene und viele andere Typen biologisch aktiver Liganden, welche kovalent an den aktivierten polymeren Träger gebunden und zum Beispiel für affinitätschromatographische Zwecke oder Immunoassays oder bei der Biokatalyse verwendet werden können.
Ein weiterer Typ nützlicher Liganden ist eine niedermolekulargewichtige nukleophile Verbindung, welche kovalent an den aktivierten polymeren Träger gebunden und anschließend zur reversiblen Immobilisierung von verschiedenen biologisch aktiven Verbindungen über nicht-kovalente Interaktionen benutzt werden kann. 2-Mercaptoethanol, Ethylenglycol und Ethanolamin können zum Beispiel verwendet werden, um Gele zu bilden, welche Proteine nicht-kovalent binden werden. Eine solche Bindung kann unter relativ niederen Salzbedingungen, wie 0,15 M NaCl in 0,02 M bis 0,05 M Natriumphosphat, pH 7,4, oder 0,05 M Natriumbicarbonat, pH 8,5, erhalten werden. Diese Gele können auch für die Anreicherung der spezifischen Radioaktivität markierter Proteine, zum Beispiel I-125 markierten Rinderserumalbumins (BSA) oder menschlichem IgG verwendet werden. Die Umsetzung des aktivierten polymeren Trägers mit Hydroxidionen wie zum Beispiel durch Behandlung mit einer Base, zum Beispiel NaOH oder NaHCO&sub3; oder Na&sub2;CO&sub3;, erzeugt auch Gele, welche zur nicht-kovalenten Bindung verschiedener biologisch aktiver Materialien verwendet werden können.
Die Kopplung des Liganden an den aktivierten polymeren Träger kann unter verschiedenen Temperatur- und pH-Bedingungen erreicht und in wäßrigen Reaktionsmedien sowie in polaren organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die Reaktionsbedingungen sind nicht kritisch, weder für den Aktivierungsschritt noch den Kopplungsschritt, und werden primär hinsichtlich der Sensitivität des Reaktanten und den praktischen Überlegungen ausgewählt. Milde Reaktionsbedingungen werden bevorzugt. Zum Beispiel ist es oft geeignet, bei Umgebungstemperaturen und -drücken zu arbeiten. Der pH-Wert, bei dem die Kopplungsreaktion durchgeführt wird, kann von saurem pH, zum Beispiel einem pH-Wert von kleiner als etwa 4, bis zu einem alkalischen pH, zum Beispiel einem pH-Wert von etwa 10, liegen.
Die nach der Kopplung verbleibenden nicht-umgesetzten aktivierten Gruppen, welche die weitere Verwendung des gekoppelten Polymers behindern können, können durch Suspendierung des gekoppelten Polymers in 0,2 M Tris-HCl, pH 9, oder in 0,1 M NaOH, bei Raumtemperatur, während einiger Stunden desaktiviert werden. Andere Nukleophile wie Glycin oder Lysin können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werben.
Ein herausragender Vorteil des Aktivierungsverfahrens gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Chromatographiematrizen, die durch eine sehr stabile chemische Bindung zwischen dem Affinitätsliganden und der festen Matrix, an die er gebunden ist, gekennzeichnet sind. Wenn eine solche stabile chemische Bindung nicht gebildet wird, kann der Verlust des Affinitätsliganden von der Matrix zu einer Kontamination des durch die Verwendung einer solchen Chromatographiematrix erhaltenen gereinigten Materials führen und die nutzbare Lebenszeit der Matrix verkürzen. Das Verfahren gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung führt zu einer minimalen Ablösung der Affinitätsliganden, sogar nach nachfolgender Aussetzung mit basischen und nukleophilen Puffern, und stellt somit überlegene Chromatographiematrizen bereit.
Ein weiterer Vorteil ist die Realisierung einer signifikant größeren Ligandenbindungskapazität des aktivierten polymeren Trägers als im Fall der bis jetzt zugänglichen Verfahren.
In einer weiteren ihrer insbesonderen Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung auf eine neue Klasse von Erzeugnissen und deren Verwendung als hochselektive und wirksame Chromatographieadsorbenzien für die Wiedergewinnung und Reinigung von organischen Materialien, insbesondere solcher von biologischem Interesse, gerichtet. Diese Klasse von Materialien kann zum Beispiel in der Trennung und Reinigung von Immunglobulinen verschiedener Klassen und von verschiedenen Spezies eingesetzt werden, wobei die Wiedergewinnung der Immunglobuline in im wesentlichen gereinigter Form direkt aus den Rohquellen, wie verdünnten Serumproben, ermöglicht wird.
Gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt diese neue Klasse von Verbindungen polymere Träger mit daran gebundenen synthetischen Affinitätsliganden. Diese Verbindungen können als das Umsetzungsprodukt eines nukleophilhaltigen polymeren Trägers, eines halogensubstituierten Pyridins (wie nachfolgend definiert) und einer Pyridinbase (wie nachfolgend definiert) beschrieben werden. Während die absolute Struktur dieser neuen Verbindungen nicht mit Sicherheit gelöst worden ist, daß die Verbindungen durch die allgemeinen Formeln I(a) oder I(b) dargestellt werden:
worin
A O, S oder NR ist, in welchem R Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist,
jedes X unabhängig aus Halogen, Trihalogenmethyl und Nitro ausgewählt ist,
jedes Y unabhängig aus Halogen, Hydroxyl, Amino und -A&sub1;R&sub4; ausgewählt ist, in welchem A&sub1; O, S oder NR&sub5;, R&sub4; gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl, und R&sub5; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist, unter der Voraussetzung, daß zumindest ein Y in der allgemeinen Formel I(a) oder Y in Formel I(b) nicht Halogen ist;
jedes X&sub1; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist,
zumindest ein Y&sub1; Wasserstoff und das andere Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist,
R&sub1; Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl oder -NR&sub2;R&sub3; ist, in welchem R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden und gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind, und
- ein Polymer ist.
Im Kontext dieser Anmeldung bezieht sich "Alkyl" auf gerad- oder verzweigtkettiges Alkyl mit 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, sowie aliphatische cyclische Substituenten (wie Cyclopentyl und Cyclohexyl), "Aryl" auf aromatischen Kohlenwasserstoff (wie Benzyl, Naphthyl, Anthracyl, etc.) und heterocyclische Substituenten (wie Furanyl, Thiphenyl, Pyridyl, etc.), und "Aralkyl" auf Benzyl, Alkylphenyl, Alkylnaphthyl, etc. Mit "gegebenenfalls substituiert" ist hierin gemeint, daß die gegenständliche Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe einen oder mehrere Substituenten tragen kann, welche gleich oder verschieden sind und im wesentlichen inert gegenüber einer Addition oder nukleophilen Substitutionsreaktion mit den Hydroxyl-, Thiol- oder primären oder sekundären Aminogruppen der Verbindungen von biologischem Interesse sind, die durch Affinitätschromatographieverfahren unter Verwendung der Produkte der Formeln I(a) oder I(b) in den spezifizierten Chromatographiebedingungen wiedergewonnen werden. Im allgemeinen treten wahrscheinlich unerwünschte Nebenreaktionen mit den wiederzugewinnenden Molekülen nur mit hochreaktiven Disulfid- oder Thiolgruppen und Halogenen (allgemein wie sie in Strukturen gefunden werden, wo wesentliche elektronische und/oder sterische Faktoren zur Reaktivität beitragen) oder "aktivierten" Hydroxylgruppen (zum Beispiel FMP-behandelte Hydroxylgruppen gemäß US-A-4,582,875) eintreten. Demgemäß beinhalten geeignete Substituenten für die gegenständlichen Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen Hydroxyl und Hydroxyalkyl, primäres, sekundäres oder tertiäres Amino und Alkylamino, Sulfonyl und Alkylsulfonyl, Carboxyl und Carboxylat, Alkylcarbonyl, Acyl und Carboxyalkyl, Nitro und Nitroalkyl, Amido und Alkylamido und Thioalkyl.
Die Verbindungen dieser Ausführungsform der Erfindung, von deren Strukturen angenommen wird, daß sie durch eine der allgemeinen Formeln I(a) oder I(b) dargestellt werden, können durch eine Anzahl von verschiedenen synthetischen Wegen hergestellt werden. Gemäß einem ersten solchen Weg wird ein geeigneter polymerer Träger mit einem halogensubstituierten Pyridin und einer Pyridinbase, wie 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) umgesetzt. In einem alternativen Weg der Synthese wird das halogensubstituierte Pyridin zuerst mit der Pyridinbase umgesetzt, um ein Zwischenprodukt zu bilden, von denen einige selbst neue Verbindungen sind, und das Zwischenprodukt umgekehrt mit dem polymeren Träger umgesetzt, um die erfindungsgemäßen Verbindungen bereitzustellen.
Es ist nun festgestellt worden, daß im Gegensatz zum Typ der Aktivierung, welcher in der Gegenwart anderer Basen und/oder mit substituierten Halopyridinreaktanten des Typs gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung spezifiziert worden ist, ein verschiedener Reaktionsmechanismus involviert zu sein scheint in der Umsetzung eines nukleophilhaltigen polymeren Trägers mit einer Pyridinbase und einem halogensubstituierten Pyridin des gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung spezifizierten Typs. In der Tat, wenn die Reaktanten in Übereinstimmung mit dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden, wird angenommen, daß sowohl die Pyridinbase und das halogensubstituierte Pyridin in das Endprodukt eingearbeitet werden. Darüber hinaus wird weiter angenommen, daß die vorgeschlagene Struktur der allgemeinen Formel I(a) durch ein Öffnen des Pyridinbasisrings während der Synthese der Verbindungen der vorliegenden Erfindung gebildet werden, was zur Bildung eines verlängerten konjugierten Systems führt. Solch ein verlängertes konjugiertes System liegt auch in der alternativ vorgeschlagenen Struktur I(b) vor. Als Konsequenz davon sind die neuen Verbindungen gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stark fluoreszent, wohingegen weder die individuellen Reaktanten noch das Produkt eines Aktivierungs-/Kopplungs-Reaktionsschemas gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im allgemeinen keine solche Fluoreszenz zeigen.
Während bis jetzt noch nicht mit Gewißheit der aktuelle Mechanismus festgestellt wurde, wodurch die Verbindungen gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung gebildet werden und ob die Verbindungen in der Tat die vorgeschlagenen Strukturen der allgemeinen Formel I(a) oder I(b) zeigen, wird angenommen, daß die Bildung der Verbindungen gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Übereinstimmung mit dem Reaktionsweg gemäß Fig. 1 stattfindet. Dieser vorgeschlagene Reaktionsweg ist hinsichtlich der allgemeinen Formel I(a) in Übereinstimmung mit den Studien von Chambers et al. hergeleitet worden, wie des in der Umsetzung von Pentachlorpyridin mit einem Überschuß an Pyridin bei 50ºC involvierten Mechanismus, um ein Monopyridiniumsalz zu bilden, gefolgt durch eine Ringöffnung des Salzes mit einem Überschuß an Dimethylamin in Wasser bei Raumtemperatur [Chambers, R.D. et al., "Pyridinium salts of halogenated heterocyclic compounds", Chem. Ind. (London) 89 (1975)].
Die halogensubstituierten Pyridine, welche zur Herstellung der Chromatographieadsorbenzien gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aus geeigneten polymeren Trägern hergestellt werden können, umfassen eine Klasse von Pyridinverbindungen, die als verschieden von den für die allgemeine Verwendung in der Aktivierung nukleophilhaltiger Polymere in Übereinstimmung mit der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzten 2-Halopyridinen definiert sind. Für Aktivierungs- und Kopplungszwecke kann jedes 2-Halopyridin eingesetzt werden, in welchem zumindest eine der Ringpositionen des 2-Halopyridins mit einer elektronenziehenden Gruppe substituiert ist. Gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jedoch ein halogensubstituiertes Pyridin erforderlich, wie es durch die nachfolgende Formel II dargestellt wird:
worin
jedes X&sub2; unabhängig aus Halogen, Trihalomethyl und Nitro ausgewählt,
zumindest ein Y&sub2; Halogen und das andere Y&sub2; aus Halogen und A&sub1;R&sub4; ausgewählt, worin A&sub1; O, S oder NR&sub5;, R&sub4; gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl und R&sub5; gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl und
Z&sub2; eine geeignete Abgangsgruppe (im allgemeinen ein Halogen wie F oder Cl) sind.
Typische halogensubstituierte Pyridinverbindungen zur Verwendung gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhalten Pentafluorpyridin (PFP), 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) und Pentachlorpyridin (PCP).
Während die Aktivierung der nukleophilhaltigen polymeren Träger gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Gegenwart eines leichten Überschusses eines jeglichen tertiären Amins mit der gewünschten basischen Aktivität (wie Triethylamin, Tributylamin oder 4-Dimethylaminopyridin) in einem polaren organischen Lösungsmittel wie Aceton, Dimethylformamid (DMF), Acetonitril oder Tetrahydrofuran (THF) durchgeführt wird, ist gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Pyridinbase selbst ein in der Bildung der neuen chromatographischen Adsorbenzien involvierter Reaktant und wird in die Struktur des vorgeschlagenen Endproduktes eingearbeitet. Im allgemeinen hat die Pyridinbase zur Verwendung bei der Bildung des Produktes gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung die allgemeine Formel III:
worin
jedes X&sub1; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl;
zumindest ein Y&sub1; Wasserstoff und das andere Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,
R&sub1; Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl, oder -NR&sub2;R&sub3;, worin R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden und gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind.
Gemäß einem ersten synthetischen Weg zur Herstellung der Verbindungen dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Pyridinbase, der polymere Träger und das halogensubstituierte Pyridin zusammen in einer sogenannten Eintopf-Reaktion in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem polaren organischen Lösungsmittel, umgesetzt.
Ein weiter Bereich von Temperatur- und Druckbedingungen ist geeignet. Im allgemeinen kann die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 90ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur in der Größenordnung von etwa 22 bis 35ºC, über einen Zeitraum von etwa 0,1 bis etwa 20 Stunden, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 2 Stunden, bei atmosphärischem oder leicht erhöhtem Druck durchgeführt werden. Geeignete Lösungsmittel beinhalten Dimethylformamid (DMF), Acetonitril und Tetrahydrofuran (THF). Von den erhaltenen Erzeugnissen wird angenommen, daß sie die durch die allgemeinen Formeln IV(a) oder IV(b) dargestellten Strukturen aufweisen:
worin die Substituenten wie vorstehend definiert sind. Diese Verbindungen (in Abhängigkeit von dem Substitutionsmuster) sind entweder wirksam als Chromatographieadsorbenzien per se und/oder dienen als Precursor für solche Adsorbenzien (e.g. nach weiterer Reaktion mit einer geeigneten Base oder niedermolekulargewichtigen Verbindungen).
Gemäß einem alternativen synthetischen Weg werden die Verbindungen der allgemeinen Formeln II und III zuerst miteinander unter ähnlichen Reaktionsbedingungen, wie sie vorstehend für die Eintopf-Reaktion beschrieben sind, und in einem geeigneten Lösungsmittel gekoppelt, um ein Zwischenprodukt der allgemeinen Formel V:
zu bilden, worin Z ein geeignetes Gegenion (zum Beispiel Halogen) ist und die übrigen Substituenten wie vorstehend definiert sind. In diesem Fall ist ein besonders geeignetes Lösungsmittel Chloroform, da das Zwischenprodukt im allgemeinen aus der Lösung präzipitieren wird. Dieses Zwischenprodukt wird anschließend in einem geeigneten organischen Lösungsmittel unter basischen Bedingungen (i.e. in DMF in Gegenwart von Tributylamin) mit dem polymeren Träger umgesetzt, um eine Verbindung der allgemeinen Formel IV(a) oder IV(b) zu bilden. Diese Reaktion kann ebenfalls über einen relativ breiten Bereich von Temperaturen und Zeit (e.g. einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 90ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur in der Größenordnung von etwa 22 bis 35ºC, über einen Zeitraum von etwa 0,1 bis etwa 20 Stunden, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 2 Stunden, bei atmosphärischem oder leicht erhöhtem Druck) durchgeführt werden.
Gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Reaktionsprodukt der allgemeinen Formel IV(a) oder IV(b), d. h. das Reaktionsprodukt des polymeren Trägers mit einem geeigneten halogensubstituierten Pyridin und einer Pyridinbase, mit einer Base oder einer niedermolekulargewichtigen nukleophilen Verbindung umgesetzt werden, insbesondere in den Fällen, in denen zumindest ein Y&sub2; in Formel IV(a) oder Y&sub2; in Formel IV(b) Halogen ist. So ist es gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen, einen vorgegebenen Y&sub2;-Substituenten, welcher in oder auch nicht innerhalb die Definition von Y fällt, durch einen verschiedenen Substituenten zu ersetzen, der auch innerhalb die Definition von Y fällt, um so ein Endprodukt mit einer unterschiedlichen (e.g. selektiven oder erhöhten) Bindungsaktivität für ein gegebenes Material oder dessen Gruppen bereitzustellen. Die Herstellung des gewünschten Produktes kann durch die Gegenwart von Fluoreszenz in dem wiedergewonnenen Gel in wäßrigem und/oder anderem polaren Lösungsmittel angezeigt werden.
Geeignete niedermolekulargewichtige Verbindungen für die Herstellung der gewünschten Chromatographieadsorbenzien sind von der allgemeinen Formel VI:
R&sub6;-B-R&sub7;,
worin B ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und jedes R&sub6; und R&sub7; -OH, -SH oder -NR&sub8;R&sub9; sind, worin jedes R&sub8; und R&sub9; Wasserstoff oder gegebenenfalls Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind. Beispiele von geeigneten niedermolekulargewichtigen Verbindungen, die zur Bildung von Gelen, welche Proteine und andere organische Moleküle von Interesse nicht-kovalent binden, beinhalten 2-Mercaptoethanol, Ethylenglycol und Ethanolamin. Andere geeignete niedermolekulargewichtige Verbindungen behinhalten nicht-vicinale Diole und Glycole, Alkylendiamine, Dithiothreitol und Aminosäuren, wie Glycin.
Die Umsetzung eines Zwischenproduktes der allgemeinen Formel IV, worin Y&sub2; e.g. Halogen ist, mit Hydroxidionen wie durch die Behandlung mit einer Base (zum Beispiel NaOH, NaHCO&sub3; oder Na&sub2;CO&sub3;) erzeugt ebenfalls Gele, welche verwendet werden können, um verschiedene biologisch aktive Materialien nicht-kovalent zu binden.
Die Umsetzung der niedermolekulargewichtigen Moleküle mit dem Zwischenprodukt der allgemeinen Formel IV kann unter variierenden Bedingungen von Temperatur und pH-Wert erreicht werden und kann in wäßrigen Reaktionsmedien sowie in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Im allgemeinen kann jedes Lösungsmittel, welches zu den Reaktanten inert ist (i.e. jedes nicht-nukleophile Lösungsmittel) angewendet werden. Temperaturen in der Größenordnung von etwa 0 bis etwa 100ºC und Zeiten von etwa 10 Minuten bis etwa 20 Stunden sind allgemein geeignet. Die Reaktionsbedingungen sind nicht kritisch und werden primär hinsichtlich der Sensitivität der Reaktanten und den praktischen Überlegungen ausgewählt. Milde Reaktionsbedingungen werden bevorzugt. Es ist zum Beispiel oft geeignet, bei Umgebungstemperaturen und -drücken zu arbeiten. Der pH-Wert, bei welchem die Reaktionen durchgeführt werden können, kann von einem sauren pH-Wert, zum Beispiel einem pH-Wert kleiner als 4, bis zu einem alkalischen pH-Wert, zum Beispiel einem pH-Wert von etwa 10, reichen.
Die gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hergestellten Chromatographieadsorbenzien sind durch eine sehr stabile chemische Bindung zwischen dem Affinitätsliganden und der festen Matrix, an welchen er gebunden ist, gekennzeichnet. Wenn eine solche stabile chemische Bindung nicht gebildet wird, könnte die Ablösung des Affinitätsliganden von der Matrix zu einer Kontamination des durch Verwendung einer solchen chromatographischen Matrix erhaltenen gereinigten Materials und zu einer Verkürzung der nützlichen Lebensdauer der Matrix führen. Die beschriebenen Reaktionsschemen resultieren in einer minimalen Möglichkeit der Ablösung der Affinitätsliganden sogar nach nachfolgender Aussetzung an basische und nukleophile Puffer und stellen somit überlegene Chromatographieadsorbenzien bereit.
Ein weiterer Vorteil liegt in der Realisierung der signifikant höheren Affinitätsbindungskapazität des Chromatographieadsorbenz als im Fall mit vielen anderen bis heute bekannten Adsorbenzien, einschließlich der bevorzugten proteinogenen Adsorbenzien in der dauernden Verwendung wie gebundene Protein A-Gele. Ein primärer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindungen ist sicherlich, daß die organischen Moleküle von Interesse, insbesondere Proteine, hocheffizient und selektiv unter Verwendung eines synthetischen Affinitätsliganden von relativ niederem Molekulargewicht (in der Größenordnung von weniger als etwa 1000), anstelle des bis heute bevorzugten proteinogenen Liganden wie Protein A (Molekulargewicht 42.000) gebunden werden können.
Die neuen Gele dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind insbesondere nützlich für die nicht-kovalente Bindung von biologisch aktiven Liganden, zum Beispiel Proteine, Enzyme, Antikörper, Antigene, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Thiolverbindungen, Cofaktoren, Haptene und viele andere Arten von biologisch aktiven Liganden. Von besonderem Interesse ist die außerordentliche Affinität des durch 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin und 4-Dimethylaminopyridin mit Ethylenglycol (das "O-Gel") aktivierten Reaktionsproduktes von entweder Sepharose Cl-4B oder Fradogel TSK HW 75 F für IgG aus einer Varietät von verschiedenen Arten, einschließlich Ratten, Ziegen und Hühnchen (für welche Protein A keine signifikante Affinität zeigt). Eine solche Bindung kann unter relativ niederen Salzbedingungen, wie 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,5), 0,15 M NaCl in 0,02 M bis 0,05 M Natriumphosphat (pH 7,4) oder 0,05 M Natriumbicarbonat (pH 8,5) erreicht werden. Diese Gele können auch für die Anreicherung der spezifischen Radioaktivität markierter Proteine, zum Beispiel I-125 markiertes Rinderserumalbumin (BSA) oder menschliches IgG, verwendet werden.
Bezogen auf die detaillierte Analyse der Ergebnisse unter Verwendung einer exemplarischen Verbindung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (i.e. das vorstehend erwähnte O-Gel) für die Wiedergewinnung besonderer Proteine aus verdünnten Serumproben, die aus verschiedenen Spezies erhalten wurden, ist bestimmt worden, daß die Gele der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einige einzigartige Eigenschaften besitzen, welche sie von allen bekannten Chromatographieadsorbenzien unterscheiden und insbesondere von den thiophilen Gelen von Porath et al . . Erstens erfordert die Bindung des Proteins an dem O-Gel nicht die Gegenwart einer hohen Konzentration an wasserstrukturbildenden Salzen, wie es bei den thiophilen Gelen der Fall ist. Tatsächlich werden fast alle auf das O-Gel in Abwesenheit hoher Salzkonzentrationen aufgebrachten Serumproteine adsorbiert und etwas Albumin von dem Serum wurde wirklich durch die Gegenwart hohen Salzes desorbiert. In dieser Hinsicht kann das Chromatographieadsorbenz der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch von den Protein A-gebundenen Gelen unterschieden werden, hinsichtlich deren eine Erhöhung in der Bindung unter Verwendung erhöhter Konzentrationen eines Puffers enthaltend ein monovalentes Kation und ein polyvalentes Anion über einen spezifizierten pH-Wert-Bereich (wie er in der US-A-4,801,687 beschrieben wird) beobachtet wurde und angeblich beobachtet wurde bei Verwendung hoher Konzentrationen irgendeines anorganischen Salzes bei einem pH-Wert über 7,5 (vgl. US-A-4,704,366).
Darüber hinaus kann die Desorption des gebundenen IgG's von dem O-Gel durch eine Erniedrigung des pH-Wertes der Elutionslösung erreicht werden. Gemäß dem Verfahren von Porath et al. wird die Desorption durch Abnahmen in der Salzkonzentration erreicht. Vielleicht ist als Konsequenz dieses Unterschiedes die unter Verwendung des O-Gels erhaltene Albuminfraktion hochrein und fast vollständig frei von anderen Proteinkontaminationen im Gegensatz zu dem Produkt, wie es unter Verwendung des thiophilen Gels erhalten wird.
Schließlich ist die Chemie der nicht-kovalenten Bindung gemäß dieser zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vollkommen verschieden von der der thiophilen Gele. Thiophile Gele erfordern die Gegenwart von Sulfon- und thioetherfunktionellen Gruppen für die Bindung. Im Gegensatz dazu nimmt bei den O-Gelen kein Schwefelelement teil; überdies ist sogar in diesen Gelen, wo schwefelhaltige Liganden eingesetzt werden, die Natur der Interaktion zwischen dem Affinitätsliganden und dem daran gebundenen Molekül deutlich verschieden zu dem was im Fall der thiophilen Gele eintritt.
Die Details des Mechanismus der Proteinadsorption an die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wie dem O-Gel sind augenblicklich nicht bekannt. Die einzigartigen Adsorptionseigenschaften des O-Gels und seiner Analogen können jedoch mit der Bildung eines hochkonjugierten Systems verbunden werden, wie es durch die starke Fluoreszenz des O-Gels in wäßriger Lösung gezeigt wird. In jedem Fall sind die hohe Kapazität für die Adsorption der Proteine bei niederen Ionenstärken und die hohe Bindungsselektivität des Gels zusammen konträr zu den herkömmlichen bekannten nicht-selektiven Prozessen der hydrophoben Interaktionschromatographie. Darüber hinaus ist die Adsorption von Proteinen bei 0,5 M Salzkonzentrationen nicht konsistent mit der Ionenaustauschchromatographie. Die Abwesenheit jeglicher schwefelhaltiger Gruppen in dem O-Gel zeigt deutlich, daß das Verfahren nicht thiophil ist. Somit scheint es, bezogen auf die vorliegende Information, daß die Adsorption der Proteine und anderen organischen Moleküle von biologischem Interesse an die Verbindungen gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie dem O-Gel, einen bis heute weder gezeigten noch erkannten Proteinadsorptionsprozeß beinhaltet.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert, die nur zu Zwecken der Veranschaulichung gezeigt sind und nicht als auf irgendeine Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, der durch die Ansprüche definiert wird, beschränkend ausgelegt werden sollen.

Beispiel 1

Reaktion von Sepharose CL-4B mit Pentafluorpyridin (PFP) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP)

Sepharose CL-4B, ein quervernetztes Agarosegel von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, (100 ml), wurde fünfmal mit jeweils 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 100 ml destilliertem Wasser in einem 2 l-Becher auf einem bei 100 Upm rotierenden Schüttler 2 befestigt. Der Gelsuspension wurden 1 l Aceton während 30-minütiger Dauer zugesetzt. Das Gel wurde filtriert und in 1 l trockenem Aceton resuspendiert und bei Raumtemperatur während 15 Minuten nach dem Filtern kopfüber geschüttelt. Das Gel wurde anschließend in 200 ml trockenem Aceton suspendiert.
10 ml acetongewaschenes Gel wurden zu 30 ml trockenem DMF in einer Polypropylenflasche gegeben. Die Suspension wurde während 5 Minuten kopfüber geschüttelt. Nach dem Filtrieren wurde das Gel in 10 ml 5,5 mmol DMPA-haltiges trockenem DMF suspendiert. Zu der Gelsuspension wurden weiter 25 ml 5 mmol PFP-haltiges DMF gegeben. Nach Schütteln bei Raumtemperatur während 2 Stunden wurde das Gel mit 100 ml DMF und zweimal mit jeweils 100 ml Aceton gewaschen. Das gewaschene aktivierte Gel wurde in 30 ml Aceton bei 4ºC gelagert. Unter diesen Bedingungen kann es während einigen Wochen stabil gehalten werden.

Beispiel 2

Umsetzung von Sepharose CL-4B mit 3,5-Dichlor-2,4,4-trifluorpyridin (DCTFP)

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) wiederholt.

Beispiel 3

Umsetzung von Fradogel TSK HW 75F mit 3,5-Dinitro-2-chlorpyridin (CDNP)

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Fradogel TSK HW 75F, einem porösen semi-harten spherischen Gel, das aus einem hydrophilen Vinylpolymer synthetisiert wird und ausschließlich aus C-, H- und O-Atomen zusammengesetzt und von E. Merck, Darmstadt, Deutschland, geliefert wird, als der Matrix und 3,5-Dinitro-2-chlorpyridin (CDNP) wiederholt.
Andere verwendete 2-Halopyridine waren 2,3,5-Trichlorpyridin (TCP), 2,6-Difluorpyridin (DFP), 2-Chlor-5-difluormethylpyridin (CTFMP), 2,3,5,6-Tetrafluor-4-methylpyridin (TFMP) und 2,3,5,6-Tetrafluorpyridin (TFP).

Beispiel 4

Umsetzung von Papier mit 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) in Dimethylformamid (DMF)

20 Stücke eines Schleicher & Schüll 589 WH Filterpapiers (5 cm · 6,5 cm) wurden in 100 ml trockenes DMF während 10 Minuten getaucht. Die Papiere wurden entfernt und in 100 ml 10 mmol DMAP-haltiges trockenes DMF gelegt. Die Papiersuspension wurde auf einen bei 100 Upm rotierenden Schüttler während 5 Minuten bei Raumtemperatur gelegt. Zu dieser Suspension wurden 10 ml DCTFP in 100 mmol trockenes DMF gegeben und das Schütteln wurde fortgesetzt. Zu verschiedenen Zeitintervallen (0,5, 5, 10, 15, 30, 60, 90 Minuten) wurde ein Papierstück entfernt, auf verschiedenen Schichten Papierhandtüchern trockengelöscht, in 100 ml trockenes DMF gelegt und während 5 Minuten geschüttelt. Dieser Waschschritt wurde ein weiteres Mal mit trockenem Aceton anstelle von trockenem DMF wiederholt. Anschließend wurde das Papier in einem Abzugsschrank luftgetrocknet.

Beispiel 5

Umsetzung einer Nylonmembran mit 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP)

Zehn Nylonmembranscheiben (MicronSep Mag na Nylon 66 Typ 5 von Fisher Scientiflc Co.) wurden in 25 ml 13,75 mmol DMAP-haltigem DMF suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 62,5 ml 12,5 mmol DCTFP-haltiges DMF gegeben. Die Membransuspension wurde bei 150 Upm bei Raumtemperatur während 2 Stunden rotiert. Anschließend wurden die Membranen aufeinanderfolgend mit 200 ml DMF und 200 ml Aceton gewaschen. Die gewaschenen Membranen wurden bei Raumtemperatur luftgetrocknet und bei 4ºC trocken gelagert.

Beispiel 6

Kopplung von Rinderserumalbumin (BSA) an aktiviertes Gel

1 Volumen eines gemäß den Beispielen 1 bis 3 hergestellten aktivierten Gels wurde mit 10 Volumen destilliertem Wasser gewaschen. Unmittelbar nach dem Waschen wurde 1 Volumen des aktivierten Gels zu 1 bis 2 Volumen BSA gegeben und die Suspension bei Raumtemperatur während 20 Stunden kopfüber geschüttelt. Die nicht-umgesetzten aktivierten Gruppen wurde durch Umsetzung des Gels mit gleichen Volumina 0,2 M Ethanolamin in 0,1 M Tris, pH 9 bei Raumtemperatur während 8 Stunden desaktiviert. Die BSA-Lösung wurde in Puffer ohne Amino- oder andere nukleophile Gruppen hergestellt. Acetatpuffer wurde verwendet für pH-Wert 1 bis 4, Phosphatpuffer wurde verwendet für pH-Wert 5 bis 7 und Bicarbonatpuffer wurde verwendet für pH-Wert 8 bis 10.
Die Mengen des bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung verschiedener Aktivatoren und Gele gekoppelten BSA's sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Aktivator an Gel gekoppeltes BSA Kopplungs-pH Pentafluorpyridin 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin 3,5-Dinitro-2-chlorpyridin 2,3,5-Trichlorpyridin 2,6-Difluorpyridin 2-Chlor-5-trifluormethylpyridin 2,3,5,6-Tetrafluor-4-methylpyridin 2,3,5,6-Tetrafluorpyridin Fractogel Sepharose Sephacryl Sepharosel a Fradogel TSK HW 75, Marke der Firma E. Merck b Sepharose CL-4B, Marke der Firma Pharmacia c Sephacryl S 300, Copolymer aus Dextran und Acrylamid, Marke der Firma Pharmacia

Beispiel 7

Kopplung von Rinderserumalbumin (BSA) an aktiviertes Papier

Scheiben (Durchmesser 1,3 cm) des gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 hergestellten aktivierten Papiers wurden jeweils in 1 ml I-125 markiertem BSA (40 mg/ml in 0,5 M Natriumbicarbonat, pH 8,5) in eine Teströhre eingebracht. Die Röhren wurden bei Raumtemperatur während 20 Stunden über Kopf geschüttelt. Jede Scheibe wurde zweimal mit 10 ml einer der nachfolgenden Lösungen gewaschen: destilliertes Wasser, 1 M NaCl, 1,5 M KSCN, 8 M Harnstoff, phosphatgepuffertes Kochsalz (PBS), 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) und destilliertes Wasser. Die Radioaktivität einer jeden Scheibe wurde gemessen und die Menge des an jede Scheibe gebundenen BSA wurde bestimmt. Es wurde gefunden, daß 6 mg BSA pro cm² Papier nach 30-minütiger Aktivierung gebunden werden konnten. Sehr wenig des gebundenen BSA konnte durch die Behandlung des Papiers mit chaotropen Lösungen wie 15 M KSCN oder 8 M Harnstoff und einem starken Detergenz wie 10% SDS-Lösung eluiert werden.

Beispiel 8

Bindung von I-125 markiertem Rinderserumalbumin (BSA) an DCTFP-aktivierte Nylonmembran

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 hergestellte DCTFP-aktivierte Nylonmembran (1 cm · 1 cm) wurde in 2 ml I-125 markiertes BSA (40 mg/ml) suspendiert und bei Raumtemperatur während 20 Stunden über Kopf geschüttelt. Die Membran wurde nacheinander mit 8 ml PBS, 1 M NaCl, 1,5 M KSCN, 8 M Harnstoff, 10% SDS und destilliertem Wasser gewaschen. Es wurde gefunden, daß 2,80 mg I-125 BSA pro cm² Membran im Vergleich zu 0,85 mg/cm² für eine nicht-aktivierte Kontrollmembran gebunden wurden.

Beispiel 9

Kopplung von β-Galadosidase an DCTFP-aktivierte Sepharose CL-4B

DCTFP-aktiviertes Sepharose CL-4B-Gel (2,5 ml) wurde mit 25 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das gefilterte Gel wurde zu 1 ml β-Galadosidaselösung (5 mg Enzym in 1 ml PBS) gegeben. Die Gelsuspension wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden kopfüber geschüttelt. Das Gel wurde zweimal mit 5 ml PBS, viermal mit 5 ml PBS mit 0,5 ml NaCl und zweimal mit 5 ml PBS gewaschen. Das immobilisierte Enzym, das 14 mg Enzym pro ml Gel mit einer 40%-igen Retention der Enzymaktivität gebunden hatte, wurde in PBS bei 4ºC gelagert.

Beispiel 10

Immobilisierung von Pepsin durch 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) aktivierte Sepharose CL-4B

Aus Schweinemagenmucosa gereinigtes Pepsin (70 mg) mit einer spezifischen Aktivität von 3100 Einheiten pro mg Protein wurde in 2 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 3,4, gelöst. Anschließend wurden 5 ml DCTFP-aktiviertes Sepharose CL-4B-Gel der Enzymlösung zugesetzt und bei Raumtemperatur während 20 Stunden kopfüber geschüttelt. Das immobilisierte Pepsin wurde mit 50 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 3,5, 40 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 3,5, das 0,5 M NaCl und 50 ml 0,05 M HCl enthielt, gewaschen. Das immobilisierte Pepsin wurde anschließend in 50 ml 0,5 M Ethanolamin in Acetatpuffer, pH 3,5, suspendiert und bei 4ºC während 5 Stunden kopfüber geschüttelt. Nach Abfiltrieren des Überstandes wurde das immobilisierte Enzym in 50 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 3,5, resuspendiert und bei Raumtempratur während 15 Minuten kopfüber geschüttelt und mit 50 ml 0,05 M HCl gewaschen. Das immobilisierte Pepsin wurde in 10 ml 0,05 M HCl mit 50% Glycerin und 0,1% Natriumazid bei 4ºC gelagert.
Das immobilisierte Pepsin hatte eine Aktivität von 17.635 Einheiten pro ml Gel und enthielt 6 mg Protein pro ml Gel.

Beispiel 11

Kopplung von Ribonukleinsäure (RNA) an DCTFP-aktiviertes Sepharose CL-4B-Gel

1 Volumen DCTFP-aktiviertes Sepharose CL-4B-Gel wurde mit 10 Volumen destilliertem Wasser gewaschen. Unmittelbar nach dem Waschen wurden 0,5 ml aktiviertes Gel zu 2 ml einer Lösung von tritiummarkierter Kälberthymusnukleinsäure (10 mg H-3 RNA pro ml in 0,05 M Natriumbicarbonat, pH 8,5) gegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur während 20 Stunden kopfüber geschüttelt. Das Gel wurde nacheinander mit 8 ml PBS, 1 M NaCl, 8 M Harnstoff, 10% Natriumdodecylsulfat und destilliertem Wasser gewaschen. Das immobilisierte RNA-Gel (0,25 ml) wurde mit 4 ml flüssiger Szintillationsflüssigkeit gemischt und anschließend die Radioaktivität in einem β-Counter bestimmt. Es wurde gefunden, daß 2 mg RNA pro 1 mg Gel gebunden waren.

Beispiel 12

Herstellung eines immobilisierten Protein A-Gels

PFP-aktivierte Sepharose CL-4B (5 ml) wurde in 5 ml Protein A-Lösung suspendiert, die 10 mg Protein A pro ml 0,05 M NaHCO&sub3;, pH 8,5, enthielt. Die Gelsuspension wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden kopfüber geschüttelt. Das Gel wurde mit 50 ml 0,05 M NaHCO&sub3;, 50 ml 0,5 M NaCl und 50 ml 0,05 M NaHCO&sub3; gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 50 ml 0,1 M Ethanolamin in 0,05 M NaHCO&sub3;, pH 8,5, bei Raumtemperatur während 5 Stunden kopfüber geschüttelt. Das immobilisierte Protein A-Gel wurde mit 25 ml PBS, die 2 M NaCl enthielt, 25 ml 1 M Glycin, pH 2,8, und 25 ml PBS gewaschen.

Beispiel 13

Herstellung von 2-Mercaptoethanol-substituiertem DCTFP-aktiviertem Sepharose CL-4B-Gel

DCTFP-aktivierte Sepharose CL-4B (10 ml) wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9, gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 10% 2-Mercaptoethanol in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9, suspendiert und bei Raumtemperatur während 24 Stunden kopfüber geschüttelt. Das Gel wurde mit 100 ml Bicarbonatpuffer gewaschen und anschließend in 20 ml 0,1 M NaOH resuspendiert und bei Raumtemperatur während 14 Stunden kopfüber geschüttelt. Schließlich wurde das Gel aufeinanderfolgend mit 100 ml 1 M NaCl, 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml PBS gewaschen und in PBS bei 4ºC gelagert.
Auf die gleiche Weise wurde ein Affinitätsgel unter Verwendung von Ethanolamin oder 3-Mercaptopropionsäure anstelle des 2-Mercaptoethanols hergestellt.

Beispiel 14

Herstellung von 2-Mercaptoethanol-substituiertem PFP-aktiviertem Gel

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde unter Verwendung von PFP-aktivierter Sepharose CL-4B als dem aktivierten Gel wiederholt. Zusätzlich zu 2-Mercaptoethanol wurden Ethylenglycol und Ethanolamin als Liganden verwendet.

Beispiel 15

Herstellung von Ethylenglycol-substituiertem Gel (O-Gel)

Das Verfahren gemäß Beispiel 13 wurde unter Verwendung von 1 ml Ethylenglycol anstelle des 2-Mercaptoethanols durchgeführt. Nach Resuspension des Produktes in 20 ml 0,1 M NaOH und kopfüber schütteln bei Raumtemperatur während 14 Stunden wurde das Produkt nacheinander mit 100 ml destilliertem Wasser, 100 ml 1 M NaCl, 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml PBS gewaschen. Das Produkt wurde in PBS bei 4ºC, wenn es nicht gebraucht wurde, gelagert.

Beispiel 16

Kopplung von Dithiothreitol (DU) an mit 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) aktivierte Sepharose CL-4B

DCTFP-aktiviertes Sepharosegel (2 ml) wurde mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 15 ml 0,1 M DTT in 0,05 M Natriumbicarbonat, pH 8,5, suspendiert und heftig kurz auf einem Vortex-Mischer gemischt. Die Gelsuspension wurde bei Raumtemperatur während 48 Stunden stehen gelassen. Das umgesetzte Gel wurde mit 20 ml destilliertem Wasser, 1 M NaCl, 8 M Harnstoff, destilliertem Wasser und 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,5, gewaschen. Die Dichte der Thiolgruppe wurde unter Verwendung des Ellman-Reagens bestimmt (G.L. Ellman, Arch. Biochem. Bhiophys. 82, 70, (1959)) und sie wurde mit 42 bis 48 Micromol pro ml Gel bestimmt.

Beispiel 17

Herstellung von Iodacetamid-blockiertem Dithiothreitol-substituiertem Gel

Das Reaktionsprodukt gemäß Beispiel 16 wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in 0,1 M Iodacetamid (0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0) während 14 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert. Das Gel wurde mit destilliertem Wasser und 0,5 M NaCl-Lösung gewaschen und bei 4ºC in PBS gelagert.

Beispiel 18

Herstellung eines Glycin-substituierten Gels

Das Reaktionsprodukt gemäß Beispiel 1 (10 ml) wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 9) gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 1 M Glycin (0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9) suspendiert und kopfüber während 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gel wurde mit 100 ml Bicarbonatpuffer gewaschen und anschließend in 20 ml 0,1 M NaOH resuspendiert. Diese Suspension wurde während 14 Stunden bei Raumtemperatur kopfüber geschüttelt. Anschließend wurde das Gel mit 100 ml 1 M NaCl, 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml PBS gewaschen. Das Produkt wurde bei 4ºC in PBS gelagert.

Beispiel 19

Herstellung von Glutamat- und Ethylendiamin-substituierten Gelen

Das Reaktionsprodukt gemäß Beispiel 1 (10 ml) oder Beispiel 2 (10 ml) wurde mit 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 9) gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 1 M Glutamat (0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9) suspendiert und kopfüber während 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Gel wurde mit 100 ml Bicarbonatpuffer gewaschen und anschließend in 20 ml 0,1 M NaOH resuspendiert. Diese Suspension wurde während 14 Stunden bei Raumtemperatur kopfüber geschüttelt. Schließlich wurde das Gel mit 100 ml 1 M NaCl, 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml PBS gewaschen. Das Produkt wurde bei 4ºC in PBS gelagert.
Gemäß einem analogen Verfahren unter Verwendung von 1 M Ethylendiamin wurde auch das Ethylendiamin-substituierte Gel hergestellt.

Beispiel 20

Herstellung eines Hydroxidion-behandelten Gels

Das Verfahren gemäß den Beispielen 13 und 14 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 9, DCTFP- oder PFP-aktivierte Gele ohne Zugabe eines organischen Liganden suspendiert wurden.

Beispiel 21

Herstellung eines Addukts aus DMAP und DCTFP (Zwischenprodukt)

Je ein Äquivalent von 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP) gelöst in Chloroform wurden zusammen bei Raumtemperatur während etwa 14 Stunden umgesetzt und anschließend bei -20ºC während etwa 6 Stunden. Präzipitierte Feststoffe wurden entfernt und dreimal mit Diethylether gewaschen. Das Produkt wurde aus Tetrahydrofuran umkristallisiert. Die Gesamtausbeute betrug etwa 70%.

Beispiel 22

Herstellung eines Ethylenglycol-substituierten Gels über das Umsetzungsprodukt des DMAP-DCTFP-Adduktes mit Sepharose CL-4B

Sepharose CL-4B (25 ml) wurde mit Aceton gewaschen, um Wasser zu entfernen. Das gewaschene Gel wurde anschließend in 25 ml 55 mmol Tributylamin und 50 mmol des Adduktes gemäß Beispiel 21 haltigem DMF suspendiert. Die Suspension wurde kopfüber während etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Produkt wurde mit 250 ml DMF und anschließend zweimal mit 250 ml Aceton pro Waschung gewaschen. Das Produktgel wurde in Aceton gelagert. Um die Aktivierung des Gels zu zeigen, wurde die kovalente Bindung eines Serumproteins durchgeführt. Es wurde bestimmt, daß das Gel in der Lage war, 15 ml Rinderserumalbumin pro ml Gel kovalent zu binden.
Das aktivierte Gel (20 ml) wurde mit 100 ml destilliertem Wasser, anschließend mit 100 ml 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 9) gewaschen. Das gewaschene Gel wurde in 100 ml 10% Ethylenglycol haltigem 0,1 M NaHCO&sub3; (pH 9) suspendiert. Die Suspension wurde kopfüber bei Raumtemperatur während 24 Stunden geschüttelt. Das Gel wurde in 0,1 M NaOH resuspendiert und während 14 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur kopfüber geschüttelt. Schließlich wurde das Gel nacheinander mit jeweils 100 ml destilliertem Wasser, 1 M NaCl, destilliertem Wasser und PBS gewaschen.

Beispiel 23

Ligandenabgangs-Experimente

Die Experimente wurden unter Verwendung von I-125 markiertem BSA als dem an DCTFP aktivierter Sepharose CL-4B gekoppelten Liganden als aktivierten Träger durchgeführt. Nach extensivem Waschen, um so viel wie möglich ungebundenen Liganden zu entfernen, wurde das immobilisierte I-125 markierte BSA-haltige Gel in eine Säule (1 · 10 cm²) gepackt und bei Raumtemperatur mit 0,1 M Ethanolamin haltigem 0,01 M Tris, pH 9, äquilibriert. Sofort wurden 10 ml-Säuleneffluents gesammelt und die Menge des I-125 markierten BSA-Liganden quantifiziert. Der Säulenausfluß wurde verschlossen und bei Raumtemperatur in der vorstehend erwähnten Ethanolamin-Tris-Lösung stehen gelassen. Nach 24 Stunden wurden 10 ml der Äquilibrierlösung erlaubt durch die Säule hindurchzutreten und das Eluat wurde gemessen und die Menge des Ligandenabgangs aus dem Gel berechnet. Weniger als 0,75% des immobilisierten I-125 markierten Gesamt-BSA konnten aus dem Gel während jeder 24-Stunden-Inkubationsperiode austreten.

Beispiel 24

Nicht-kovalente Bindung von Serumproteinen

Die Gele der Beispiele 13 bis 20 (0,1 bis 1,0 ml) wurden mit 1 bis 2 ml Proteinlösung (20 bis 40 mg Protein/ml) in einer Teströhre gemischt und kopfüber bei Raumtemperatur während 5 Minuten geschüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das Gel zweimal mit PBS gewaschen. Die Menge des Proteins im Überstand und den Waschungen wurde bestimmt und wurde der ungebundenen Menge gleichgesetzt. In einigen Fällen wurden zusätzliche Waschschritte durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Gebundenes Serumprotein (mg Protein pro ml Gel) Halopyridin-Reaktant Ligand Rinderserumalbumin menschliches Serumalbumin menschliches IgG Ethylenglycol 2-Mercaptoethanol Ethanolamin Hydroxid (NaOH-behandelt) Glutamat Glycin Mercaptopropionat Dithiothreitol Dithiothreitoliodacetamid Ethylendiamin Mercaptopropionat Glycin a Rinderserumalbumin und menschliches Serumalbumin wurden in 0,05 M Natriumbicarbonat, pH 8,5, gelöst. b Menschliches Serum IgG wurde in PBS gelöst.

Beispiel 25

Anreicherung spezifischer Radioaktivität von I-125 markiertem Rinderserumalbumin (BSA) durch selektive Adsorption an durch 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP)-aktiviertem mit 2-Mercaptoethanol substituiertem Sepharose CL-4B-Gel

Eine Menge von 4 ml I-125 markiertem BSA mit einer spezifischen Aktivität von 1000 cpm pro mg Protein in einer Konzentration von 20 mg/ml wurde zu 0,5 ml durch mit DCTFP-aktiviertem 2-Mercaptoethanol-substituiertem Sepharose CL-4B-Gel bei Raumtemperatur während 5 Minuten gegeben. Anschließend wurde das Gel kurz zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Gel wurde dreimal mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, gewaschen, bevor das I-125 markierte BSA mit zwei 4 ml-Portionen 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,8, eluiert wurde. Die spezifische Aktivität des I-125 markierten BSA wurde auf 3.550 cpm pro mg Protein angereichert.

Beispiel 26

Anreicherung spezifischer Radioaktivität von I-125 markiertem menschlichem IgG durch selektive Adsorption an durch 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin (DCTFP)-aktiviertem mit Ethylenglycol substituiertem Sepharose CL-4B-Gel

Das Verfahren der Beispiele 24 und 25 wurde wiederholt unter Verwendung von I-125 markiertem menschlichem IgG mit einer spezifischen Aktivität von 5100 cpm pro mg Protein in einer Konzentration von 20 mg/ml. Die spezifische Aktivität wurde auf 12.200 cpm pro mg Protein angereichert.

Beispiel 27

Trennung von IgG und Serumalbumin aus menschlichem Serum durch Chromatographie auf O-Gel

3 ml des gemäß Beispiel 15 hergestellten Gels wurden mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, gewaschen. 1 ml gefiltertes menschliches Serum (auf 1 : 100 in 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, verdünnt) wurde durch die Säule bei Raumtemperatur mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,25 ml pro Minute geleitet. Die Säule wurde anschließend mit demselben Phosphatpuffer gewaschen.
Gebundene Proteine wurden zuerst mit 0,5 M K&sub2;SO&sub4;-haltigem 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), gefolgt durch 0,1 M Glycinpuffer mit fortschreitend niederen pH-Werten von 5,0, 4,0 und 2,8 eluiert, alle wie vorstehend bei derselben Fließgeschwindigkeit. Mit Ausnahme einer ersten Fraktion, die nicht-adsorbierte Proteine enthielt und ein Volumen von 60 ml aufwies, wurden 1,5 ml-Fraktionen bei jeder Waschung gesammelt und die OD bei 280 nm für jede Fraktion kontinuierlich durch ein LKB 2238 UV-Cord überwacht. Die Fraktionen wurden in einem LKB 2070 Ultrorac-Fraktionssammler gesammelt. Der pH-Wert wurde unter Verwendung eines LKB 2195 pH/Ionen-Monitors überwacht.
Wie in Fig. 2 veranschaulicht, gab das verdünnte menschliche Serum ein Chromatogramm mit fünf Proteinfraktionen. Peak I enthielt jegliche nicht-adsorbierten Proteine. Bezogen auf eine Absorption bei 280 nm, stellte das nicht-gebundene Protein 8% des auf die Säule aufgebrachten Gesamtproteins dar. Peak II enthielt das durch 0,5 M K&sub2;SO&sub4;-haltigem 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, desorbierte Material. Diese Fraktion enthielt das meiste des Serumalbumins und betrug 32% des Gesamtproteins. Das Peak Ill-Material wurde mit 0,1 M Glycin bei pH 5,0 desorbiert, das Peak IV-Material bei pH 4,0 und das Peak V-Material bei pH 2,8. Die Peak III-Fraktion enthielt das meiste des Immunglobulins G (mit sehr geringen Mengen von kontaminierendem Serumalbumin), wobei diese Fraktion 15% des gesamt aufgebrachten Proteins entsprach. Immunglobuline M und A wurden in den Fraktionen von Peak IV bzw. V gefunden.
Die Konzentrationen des Serumalbumins und der verschiedenen Immunglobuline in jeder Fraktion wurden unter Verwendung eines spezifischen Sandwich-ELISA bestimmt. Fig. 3 veranschaulicht die spezifischen Sandwich-ELISA-Muster des Serums nach Chromatographie unter den in Fig. 2 spezifizierten Bedingungen. Die Legenden identifizieren das Protein, für den jeder ELISA spezifisch ist.
Die Identität der verschiedenen Proteine wurde weiter durch 10 bis 15% Gradienten-SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) unter reduzierenden Bedingungen bestätigt. Das wie in Fig. 4 gezeigte entwickelte Gel enthielt 7 Spuren: Spur 1 (Molekulargewicht-Markerreferenzproteine), Spur 2 (nicht-fraktioniertes menschliches Serum), und die Spuren 3 bis 7 die Fraktionen I bis V der Fig. 2.
Ähnliche chromatographische Muster wurden für Kaninchen- und Mäuseserum (Fig. 5A bzw. 5B) beobachtet. Die Identifizierung der Hauptproteine einer jeden Peakfraktion der Kaninchen- und Mäuseseren durch PAGE (Fig. 6A bzw. 6B) war auch übereinstimmend bei der mit Humanseren beobachteten Trennung.
Darüber hinaus wurden ähnliche chromatographische Muster beobachtet, wenn die 0,5 M K&sub2;SO&sub4;-Waschlösung durch phosphatgepuffertes Kochsalz (PBS) ersetzt wurde. Im letzteren Fall jedoch war das Niveau der Albuminkontamination in der IgG-Fraktion höher.
Die Chromatogramme des Human-, Kaninchen- und Mäuseserums sowie die immunologischen und elektrophoretischen Analysen der Peakproteinfraktionen zeigen alle die außerordentliche Selektivität und Proteinbindungskapazität des Gels für Serumalbumin und für verschiedene Immunglobuline. Es ist insbesondere wert, festzustellen, daß keines der handelsüblich erhältlichen immobilisierten Staphylococcus Protein A-Gele IgG aus Rattenseren bindet. Mit dem erfindungsgemäßen Gel ist jedoch gezeigt worden, daß es so effektiv für Rattenseren wie für die anderen getesteten Arten ist.

Beispiel 28

Trennung von Rinderserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Rinderserumalbumin und 7,5 mg Rinderimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (1 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 7 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 29

Trennung von Hühnchenserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die-eine Mischung aus 7,5 mg Hühnchenserumalbumin und 7,5 mg Hühnchenimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 8 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 30

Trennung von Ziegenserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Ziegenserumalbumin und 7,5 mg Ziegenimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht.
2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 9 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 31

Trennung von Mäuseserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Mäuseserumalbumin und 7,5 mg Mäuseimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 10 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 32

Trennung von Schweineserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Schweineserumalbumin und 7,5 mg Schweineimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 11 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 33

Trennung von Kaninchenserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Kaninchenserumalbumin und 7,5 mg Kaninchenimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 12 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 34

Trennung von Raffenserumalbumin und -IgG

15 ml einer Lösung, die eine Mischung aus 7,5 mg Rattenserumalbumin und 7,5 mg Rattenimmunglobulin G in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt, wurde auf eine O-Gel-Säule (2 ml) bei einer Flußrate von 0,5 ml pro Minute aufgebracht. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Nach Waschen der Säule mit etwa 10 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde Serumalbumin mit 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, eluiert. Nachfolgend zu der Elution von Serumalbumin wurde Immunglobulin unter Verwendung von 0,1 M Glycin, pH 4, eluiert. Die Vollständigkeit der Trennung kann in dem Elektrophoretogramm der Fig. 13 gesehen werden, worin: Spur (1) die Molekulargewichtmarker enthält, Spur (2) eine Albuminprobe ist, Spur (3) eine IgG-Probe ist, Spur (4) die ungebundene Durchflußfraktion ist, die Spuren (5) und (6) die mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, eluierten Fraktionen sind, die 150 mM NaCl (Albumin enthaltend) enthalten, und die Spuren (7) und (8) die mit 0,1 M Glycin, pH 4, eluierten Fraktionen sind (IgG enthaltend).

Beispiel 35

Nicht-kovalente Bindung von Nichtserum-Proteinen

Das Gel gemäß Beispiel 15 (0,5 ml) wurde mit 3 ml Proteinlösung (etwa 1 mg Protein pro ml) in einer Teströhre gemischt und kopfüber während 15 Minuten geschüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und das Gel dreimal mit 3 ml Puffer pro Waschung gewaschen. Die Proteinmenge im Überstand und den Waschungen wurde bestimmt und mit der ungebundenen Menge gleichgesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Nicht-kovalente Bindung von Nichtserum-Proteinen auf O-Gel gelöste Protein an 1 ml Gel gebundenes Protein Proteinmenge Rinderserumalbumin menschliches IgG Ribonuklease A Fetuin Lysozym Papain Myoglobin Transferrin Pepsin Trpysin P* 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 A** 10% Ammoniumsulfatlösung

Beispiel 36

Fraktionierung von Humanserum-Proteinen unter Verwendung von Ethylenglycolsubstituiertem Gel, hergestellt via einem Reaktionsprodukt von DMAP-DCTFP-Addukt mit Sepharose CL-4B

Das Ethylenglycol-substituierte Gel gemäß Beispiel 22 (7 ml) wurde in eine Säule gepackt und mit 20 mM Natriumphosphat (pH 7,4) gewaschen. 1 ml mit dem gleichen Phosphatpuffer verdünntes Humanserum wurde auf die Säule bei einer Flußrate von 1,25 ml pro Minute aufgebracht. Die Säule wurde nacheinander mit dem Phosphatpuffer, 0,5 M K&sub2;SO&sub4;-haltigem Phosphatpuffer und 0,1 M Glycin (pH 5, 4 und 2,8) gewaschen. 3 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Absorption bei 280 nm aufgezeichnet. Vier Hauptfraktionen wurden erhalten: Serumalbumin wurde in dem ersten Fraktionspeak gesammelt, während die Immunglobuline und andere Serumproteine in den nachfolgenden drei Fraktionen gesammelt wurden.

Beispiel 37

Fraktionierung von nicht-humanen Serumproteinen

Gemäß dem allgemeinen in Beispiel 36 beschriebenen Verfahren wurden verschiedene nicht-humane Serumproben auch erfolgreich unter Verwendung des substituierten Gels, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, fraktioniert. Die eingesetzten Serumproben und DCTFP-DMAP-aktivierten Gelbehandlungsmittel (i.e. Liganden) sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die korrespondierenden Chromatogramme für die in Tabelle 4 identifizierten Proben sind in den Fig. 14 bis 17 gezeigt. In jedem Fall wurde die das angezeigte Gel enthaltende Säule nachfolgend nach Einbringung der Serumprobe mit dem Phosphatpuffer, dem 0,5 M K&sub2;SO&sub4;-haltigen Phosphatpuffer, 0,1 M Glycin bei pH 4,5 und 0,1 M Glycin bei pH 2,8 gewaschen. TABELLE 4 Fraktionierung von nicht-humanen Seren Art Lingand Chromatogramm-Figur Ziege Maus Kaninchen Hydroxid (NaOH-behandelt) Glycin Ethylendiamin

Beispiel 38

Affinitätschromatographie und Reinigung von Human-IgG

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 12 hergestelltes immobilisiertes Protein A-Gel (1 ml) wurde in eine kleine Säule (0,8 · 2,3 cm²) gepackt. Mit 2 Volumen (6 ml) PBS, pH 7,4, verdünntes Humanserum (3 ml) wurde auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 20 ml PBS gewaschen und das gebundene IgG mit 5 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 3,5, eluiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 gezeigt. Eine Menge von 14,7 mg menschliches IgG wurde pro ml Gel isoliert.
Aus der vorhergehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung ermitteln. Änderungen in der Form und Ersatz durch Äquivalente können als zweckmäßig erachtet werden und obwohl spezifische Begriffe hier verwendet worden sind, werden sie nur in beschreibendem Sinn und nicht zu Beschränkungszwecken verwendet.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Polymers durch Umsetzen eines zumindest eine nukleophile Gruppe enthaltenden Polymers unter basischen Bedingungen mit einem substituierten 2-Halopyridin zur Herstellung eines Produktes, worin zumindest eine der nukleophilen Gruppen des Polymers durch Umsetzung mit dem 2-Halopyridin modifiziert worden ist, worin das 2-Halopyridin eine der nachfolgenden Formeln aufweist:

(i) allgemeine Formel

in der

X F, Cl oder Br,

Y F, Cl, Br, NO&sub2;, CH&sub3; oder CF&sub3; und

n 1 bis 4 sind; und

worin, wenn n größer als 1 ist, die durch Y bezeichneten Substituenten gleich oder verschieden sein können, zumindest eine der Y-Gruppen eine elektronenziehende Gruppe ist;

(ii) allgemeine Formel II

worin

jedes X&sub2; unabhängig Halogen, Trihalomethyl oder Nitro,

zumindest ein Y&sub2; Halogen und das andere Y&sub2; Halogen, Hydroxyl, Amino oder A&sub1;R&sub4;,

A&sub1; O, S oder NR&sub5;,

R&sub4; ein gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,

R&sub5; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind und

Z&sub2; eine geeignete Abgangsgruppe (im allgemeinen ein Halogen wie F oder Cl) ist, worin die basischen Bedingungen einen Überschuß einer Pyridinbase umfassen; oder

(iii) allgemeine Formel V

in der

X&sub2; und Y&sub2; wie vorstehend definiert sind,

jedes X&sub1; unabhängig Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,

zumindest ein Y&sub1; Wasserstoff und das andere Y&sub1; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,

R&sub1; Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl oder -NR&sub2;R&sub3; sind,

R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sein können und gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl sind, und

worin Z ein geeignetes Gegenion ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polymer Cellulose, Agarose, Dextran oder ein quervernetztes Erzeugnis davon oder Poly(ethylen)glycol, Poly(vinylalkohol), Poly(hydroxyethylmethacrylat) oder Nylon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Polymer in einer festen Form, zum Beispiel ein Gel, Beads, Fasern, ein Gewebe oder eine Membran ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die basischen Bedingungen einen Überschuß eines tertiären Amins in einem polaren organischen Lösungsmittel umfassen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das 2-Halopyridin eine Verbindung der allgemeinen Formel A und das tertiäre Amin Triethylamin, Tributylamin oder 4-Dimethylaminopyridin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das substituierte 2-Halopyridin Pentafluorpyridin, 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin, 3,5-Dinitro-2-chlorpyridin, 2,3,5-Trichlorpyridin, 2,6-Difluorpyridin, 2-Chlor-5-trifluormethylpyridin, 2,3,5,6-Tetrafluor-4-methylpyridin oder 2,3,5,6-Tetrafluorpyridin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, welches weiter die Umsetzung des modifizierten Polymers mit einem organischen Liganden umfaßt, der zumindest einen primären Amin-, sekundären Amin-, primären Hydroxyl-, sekundären Hydroxyl- oder Sulfhydrylsubstituenten umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der organische Ligand ein(e) Protein, Enzym, Antikörper, Antigen, Aminosäure, Nukleinsäure, Thiol, Co-Faktor, Hapten oder niedermolekulargewichtige nukleophile Verbindungen wie 2-Mercaptoethanol, Ethylenglycol oder Ethanolamin ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das 2-Halopyridin eine Verbindung der allgemeinen Formel II wie vorstehend definiert ist und die Pyridinbase von der allgemeinen Formel III ist:

worin X&sub1;, X&sub2;, Y&sub1;, Y&sub2; und R&sub1; wie vorstehend definiert sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin in der allgemeinen Formel II A&sub1;R&sub4; -SCH&sub2;CH&sub2;OH, -OCH&sub2;CH&sub2;OH, -NHCH&sub2;CH&sub2;OH, -NHCH&sub2;COOH, -SCH&sub2;CH&sub2;COOH, -NHCH(COOH)CH&sub2;CH&sub2;COOH, -SCH&sub2;CHOHCHOHCH&sub2;SH, -SCH&sub2;CHOHCHOHCH&sub2;SCH&sub2;CONH&sub2;, -NHCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; oder -NHCH&sub2;CH&sub2;OH ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Verbindung der allgemeinen Formel II 3,5-Dichlor-2,4,6-trifluorpyridin, Pentafluorpyridin oder Pentachlorpyridin ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das 2-Halopyridin eine Verbindung der allgemeinen Formel V ist, oder ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches weiter die Umsetzung des Produkts mit Hydroxidionen oder einer Verbindung der allgemeinen Formel VI umfaßt:

R&sub6;-B-R&sub7; VI,

worin B ein gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Aryl- oder Aralkylbestandteil von 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen ist und jedes R&sub6; und R&sub7; -OH, -SH oder -NR&sub8;R&sub9; ist, worin jedes R&sub8; und R&sub9; Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist.

13. Durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9 bis 12 erhaltbares modifiziertes Polymer.

14. Modifiziertes Polymer der allgemeinen Formel Ia oder Ib:

worin

ein Polymer,

X&sub1;, Y&sub1; und R&sub1; wie vorstehend für die allgemeine Formel III definiert,

A O, S oder NR,

R Wasserstoff oder gegebenenfalls substituiertes Alkyl, Aryl oder Aralkyl,

jedes X unabhängig Halogen, Trihalomethyl oder Nitro,

jedes Y unabhängig Halogen, Hydroxyl, Amino oder -A&sub1;R&sub4; ist, worin -A&sub1;R&sub4; wie für die allgemeine Formel II definiert ist,

unter der Voraussetzung, daß zumindest ein Y in der allgemeinen Formel I(a) oder Y in der allgemeinen Formel I(b) nicht Halogen ist;

oder eine Verbindung der allgemeinen Formel IVa oder IVb

worin

ein Polymer,

und X&sub1;, Y&sub1;, R&sub1;, X&sub2;, Y&sub2;, A und Z wie vorherstehend definiert sind.

15. Verbindung nach Anspruch 14, worin Y -SCH&sub2;CH&sub2;OH, -OCH&sub2;CH&sub2;OH, -NHCH&sub2;CH&sub2;OH, -NHCH&sub2;COOH, -SCH&sub2;CH&sub2;COOH, -NHCH(COOH)CH&sub2;CH&sub2;COOH, -SCH&sub2;CHOHCHOHCH&sub2;SH, -SCH&sub2;CHOHCHOHCH&sub2;SCH&sub2;CONH&sub2;, -NHCH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; oder -NHCH&sub2;CH&sub2;OH ist.

16. Verbindung nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, worin X Cl oder F ist.

17. Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin R&sub1; -N(CH&sub3;)&sub2; ist.

18. Verbindung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, worin A Sauerstoff ist.

19. Verfahren zum Wiedergewinnen zumindest eines organischen Materials aus einer Zusammensetzung, in der es durch Affinitätschromatographie vorliegt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen des organischen Materials in einer geeigneten Pufferlösung mit dem durch ein Verfahren der Ansprüche 9 bis 12 oder Anspruch 14 erhaltbaren modifizierten Polymer umfaßt, zum Bilden eines Bindungskomplexes und Abtrennen der ungebundenen Komponenten der Zusammensetzung von dem Bindungskomplex.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das organische Material ein biologisch aktiver Ligand, zum Beispiel Protein, Enzym, Antikörper, Immunglobulin, Antigen, Aminosäure, Nukleinsäure, Thiolverbindung, Serumalbumin, Co-Faktor, Hapten oder Hormon, ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin das Immunglobulin Menschen-, Rinder-, Hühner-, Ziegen-, Mäuse-, Schweine-, Kaninchen- oder Ratten-IgG ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, worin das Serumalbumin Menschen-, Rinder-, Hühner-, Ziegen-, Mäuse-, Schweine-, Kaninchen- oder Ratten-Serumalbumin ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, worin der Puffer 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,5), 0,15 M NaCl in 0,02 M bis 0,05 M Natriumphosphat (pH 7,4) oder 0,05 M Natriumbicarbonat (pH 8,5) ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, welches weiter das Trennen des organischen Materials aus dem Komplex umfaßt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, worin die Zusammensetzung Gesamtserum umfaßt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, worin das Inkontaktbringen in einer Chromatographiesäule durchgeführt wird und weiter das Wiedergewinnen des organischen Materials in im wesentlichen gereinigter Form durch Elution aus der Chromatographiesäule umfaßt.