DE69419244T2 - Zusammensetzungen und methoden zur anwendung von reaktiven antiviralen polymeren - Google Patents
Zusammensetzungen und methoden zur anwendung von reaktiven antiviralen polymerenInfo
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Classifications
-
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- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen für die Behandlung sowie Verfahren zur Behandlung von Krankheiten, wie AIDS, die durch RNA-Viren verursacht werden. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen diese Krankheiten bereit. Des weiteren ist die Zusammensetzung geeignet, die Ribonuclease zu inhibieren.
- Trotz der weltweiten Bemühungen hat bis jetzt das menschliche Immunschwächevirus (HIV) alle Versuche, ein effektives Anti-AIDS-Mittel oder einen Impfstoff zu entwickeln, durch die Ausnutzung von Hypermutationstaktiken überstanden. Die Mutationstaktiken haben ebenfalls bis jetzt alle Versuche, wirkungsvolle Impfstoffe gegen andere durch RNA-Viren verursachte Krankheiten, wie Leukämie und Influenza, zu entwickeln behindert.
- Eine Strategie zur Bekämpfung von RNA-Viren, wie HIV AIDS-(erworbenes Immunschwächesyndrom)-Viren, ist, die reverse Transkriptase des HIV (HIV RT) zu inaktivieren. Unglücklicherweise hat die normalerweise hohe Mutationsgeschwindigkeit der Viren bisher die Entwicklung von effektiven Anti-AIDS-Mitteln oder Impfstoffen verhindert. Das hypermutationsfähige HIV kann schnell Resistenzen gegen alle bekannten Inhibitoren mit geringem Molekulargewicht (Mr < 1000 Dalton), wie AZT, ddc, ddl und Nevirapin (Larder et al., Science 1989, 243, 1731; Larder und Kemp, Science 1989, 246, 1155; St. Clair et al., Science 1991, 253, 1557; Shih et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88, 9878) entwickeln.
- Es ist bekannt (Chuan und Wang, J. Biol. Chem. 1981, 263, 13003), daß die Affinitäts-Reagenzien 3'-O-(5-Fluor-2,4- dinitrophenyl)-ADP-Ether und 3'-O-(5-Fluor-2,4-dinitrophenyl)-ATP-Ether fähig sind, das aktive Zentrum der mitochondrischen F&sub1;-ATPase zu markieren und die ATPase zu inhibieren. Der 3'-O-(5-Fluor-2,4-dinitrophenyl)-ADP- Ether und der entsprechende ATP-Ether benötigen jedoch eine millionenfach höhere molare Konzentration, um die reverse Transkriptase des HIV (HIV RT) zu inhibieren, noch können sie die HIV RT oder andere RNA-Viren in einer Weise inhibieren, die unempfindlich gegen Mutation ist.
- Es ist auch bekannt (Fukui und De Clercq, Biochem. J. 203, 755-760 und Shannon, Pan. N. Y. Acad. Sci. 284, 472- 507), daß antivirale Verbindungen, wie Poly-(2-fluoradenylsäure), Poly-(2-bromadenylsäure), Poly-(2-iodadenylsäure) und 1-(4-fluorbenzyl-oxy)-adenosinpolyadenylsäure, die reverse Transkriptase inhibieren. Alle diese Verbindungen sind durch das Anfügen eines Halogenatoms oder anderer Gruppen an die Adeninreste in den Polymeren derivatisiert. Die beste dieser Verbindungen ist (fl²A)n, welche die murine Leukämie RT mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 0.04 ug/ml inhibiert. Das erfindungsgemäße FDNP-Poly[A] inhibiert die gleiche RT mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 0.0017 ug/ml (bei einer 23fach niedrigeren Konzentration).
- In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Stoffzusammensetzung offenbart. Die Y-Poly[A]-enthaltende Stoffzusammensetzung ist gekennzeichnet durch die Formel: Mn(Y)mXi[A]n
- worin [A]n = Polyadenyisäure (5') mit n Adenylsäureresten,
- Y = FDNP, DNP oder partiell FDNP und partiell DNP,
- FDNP = 3-Fluor-4,6-dinitrophenylgruppen, über Etherbrücken kovalent mit m der n 2'-OH- Gruppen von [A]n verknüpft,
- DNP = 2,4-Dinitrophenylgruppen, über Etherbrücken kovalent mit m der n 2'-OH- Gruppen von [A]n verknüpft,
- X = Acylgruppe,
- i = 0 oder 1,
- M = ein Kation ist, ausgesucht um einen gewünschten Löslichkeitsgrad der Zusammensetzung zu erreichen,
- und eine dieser generischen Strukturen besitzt:
- oder
- und worin das Verhältnis von Y-Gruppen zu Adenineinheiten wenigstens 1 : 5 beträgt und worin n hinreichend groß ist, daß das Y-Poly [A] im wesentlichen vollständig das aktive Zentrum eines RNA-Virus RT ausfüllen kann, um wirkungsvoll die reverse Transcriptase und/oder wirkungsvoll die Ribonuclease zu inaktivieren.
- Eine andere Ausführungsform beinhaltet ein Verfahren zur Behandlung von Säugetieren, welche an einer Krankheit leiden, die durch RNA-Viren verursacht wird. Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung einer zur Behandlung wirkungsvollen Menge von Y-Poly[A] an die Säugetiere. Wieder eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum zeitweisen Schutz von gesunden Säugetieren vor RNA-Virusinfektionen. Das Verfahren beinhaltet die Verabreichung einer für die Prävention wirkungsvollen Menge von Y-Poly[A].
- Eine andere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet Verfahren zur Herstellung von Anti-RNA-Virus-Impfstoffen und zur Impfung, um Schutz gegen durch RNA-Viren verursachte Krankheiten zu erhalten. Das Verfahren beinhaltet das Einbringen eines Antigens in den Patienten, welches ein RNA-Virus enthält, das irreversibel durch Y-Poly[A] inaktiviert wurde, wobei Y wenigstens partiell FDNP bedeutet, wodurch der Patient einen oder mehrere Antikörper gegen das Antigen herstellt. Die Antikörper gegen das Antigen enthalten auch Antikörper gegen das RNA-Virus.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Sterilisation von RNA-Viren in zur Transfusion vorgesehener Blut-Aliquots. Das Verfahren beinhaltet die Hinzugabe einer für die Sterilisation wirkungsvollen Menge von Y-Poly[A], wobei Y wenigstens partiell FDNP bedeutet.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Entfernung von Ribonuclease aus einer Lösung, indem die Lösung durch eine Affinitätssäule geleitet wird, welche immobilisiertes FDNP-Poly[A] oder DNP- Poly [A] enthält.
- Die Ribonuclease kann auch irreversibel inhibiert werden durch Hinzugabe einer wirkungsvollen Menge an Y-Poly[A] zu einer Ribonuclease enthaltenden Lösung, wobei Y wenigstens partiell FDNP bedeutet.
- Ein anderes nützliches Verfahren in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung ist die irreversible Inaktivierung von RNA-Viren. Das Verfahren beinhaltet das in Kontakt bringen des RNA-Virus mit einer für die Inaktivierung des RNA-Virus wirkungsvollen Menge von FDNP- Poly [A].
- Eine neue Art von polymerem Inhibitor wird offenbart, der fest an die reverse Transcriptase (HIV RT) des HIV bindet und im wesentlichen vollständig die lange Bindungstasche des aktiven Zentrums der reversen Transcriptase (HIV RT) des HIV ausfüllt. Die neuen Inhibitoren wurden hergestellt und es wurde gefunden, daß sie schnell die HIV RT in einer Lösung inaktivieren und in dem Fall von Y- Poly[A] irreversibel inaktivieren, wobei wenigstens ein Teil von Y FDNP bedeutet und daß sie die empfindlichen Lymphozyten befähigen, ihr normales Wachstum nach der Zugabe von lebendem HIV zur Kulturplatte beizubehalten. Die Inhibitoren tragen DNP- und/oder FDNP-Gruppen kovalent verbunden mit den Riboseresten im Polymer. Diese Inhibitoren sind funktionsspezifisch und besitzen daher eine geringe Toxizität, sind aber nicht spezifisch für eine Spezies und zeigen sich daher unempfindlich gegenüber Mutation.
- Die Zusammensetzungen und Verfahren, welche diese neuen Verbindungen in fünf verschiedenen pharmazeutischen und biotechnologischen Anwendungen nutzen, werden offenbart. Eine Gruppe mutationsunempfindlicher Inhibitoren wurde auf der Grundlage folgender Prinzipien entwickelt.
- Die letzten kristallographischen Untersuchungen zeigen, daß die Polymeraseregion in der HIV RT aus einer geöffneten Tasche besteht, die lang genug ist, um ein RNA- Segment mit 25 bis 30 Resten in der Länge [K< i] unter zu bringen; et al., Science 1992, 256, 1783; Arnold et al., Nature 1992, 357, 85. Vermutlich bindet dieses aktive Zentrum bevorzugt Polyadenylsäure (5') (im folgenden als "Poly [A]" bezeichnet), weil der Komplex Poly [A] - [dT]&sub1;&sub2; erfolgreich und recht oft als Templatpromotor bei in-vitro reversen Transcriptionsversuchen gebraucht wurde. Daher wurden hydrophobe Gruppen an der 2'-OH Position des Poly[A] angebracht, um die Bindungsaffinität zur RT zu erhöhen, ohne die Templatfunktion zu beeinträchtigen. Das erhaltene Poly[A]-Derivat besitzt die Fähigkeit an die HIV RT zu binden, wobei im wesentlichen vollständig das aktive Zentrum ausgefüllt wird und wirkt als ein multifunktionales Affinitätsreagenz.
- In Hinsicht auf eine langjährige Praxis der Markierung nucleophiler Gruppen von Proteinen mit dem Sanger- Reagenz, 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol, wurden elektrophile 3-Fluor-4,6-dinitrophenyl (FDNP)-Gruppen über eine Etherbrücke an die 2'-OH-Position des Poly[A] entsprechend einem früher veröffentlichten Verfahren für Mononucleotide [Chuan und Wang, J. Biol. Chem. 1981, 263, 13003, die Offenbarung dessen ist in den hierin angegebenen Literaturstellen enthalten] angebracht. Diese elektrophilen FDNP- Gruppen erfüllen den Zweck irreversibel mit dem aktiven Zentrum zu reagieren und an die nucleophilen Gruppen des aktiven Zentrums zu binden, um somit die Funktion der reversen Transcriptase zu blockieren. Die Struktur des erhaltenen Polymerderivats, bezeichnet als FDNP-Poly[A], ist gekennzeichnet durch eine der unten gezeigten Strukturen der allgemeinen Formel: Mn(FDNP)mXi[A]n
- worin [A]" = Polyadenylsäure (5') mit n Adenylsäureresten,
- FDNP = 3-Fluor-4,6-dinitrophenylgruppen, über Etherbrücken kovalent mit m der n 2'-OH- Gruppen von [A]n verknüpft,
- X = Acylgruppe,
- i = 0 oder 1,
- M = ein Kation ist, ausgesucht um einen gewünschten Löslichkeitsgrad der Zusammensetzung zu erreichen,
- und eine dieser generischen Strukturen besitzt:
- oder
- Es wurde weiterhin gefunden, daß DNP-Poly [A] ebenfalls bei der Inaktivierung reverser Transcriptasen und Ribonucleasen wirksam ist. Während in der Tat die Wirkung von DNP-Poly[A] nicht irreversibel ist, wurde gefunden, daß bei einer DNP-Gruppe pro 1.5 Adeninresten letzteres ungefähr zwölfmal wirksamer ist (d. h. bei einer zwölftel Dosierung gleich wirksam ist) als FDNP-Poly[A]. Das Polymerderivat, bezeichnet als DNP-Poly[A], ist gekennzeichnet durch eine der unten gezeigten Strukturen der allgemeinen Formel: Mn (DNP)mXi[A]n
- worin [A]n = Polyadenylsäure (5') mit n Adenylsäureresten,
- DNP = 2,4-Dinitrophenylgruppen, über Etherbrücken kovalent mit m der n 2'-OH- Gruppen von [A]n verknüpft,
- X = Acylgruppe,
- i = 0 oder 1,
- M = ein Kation ist, ausgesucht um einen gewünschten Löslichkeitsgrad der Zusammensetzung zu erreichen,
- und eine dieser generischen Strukturen besitzt:
- oder
- In beiden Fällen ist n hinreichend groß, so daß das Y- Poly[A] (worin Y = DNP, FDNP oder worin ein Teil von Y DNP und der andere Teil FDNP ist) im wesentlichen vollständig das aktive Zentrum der RNA-Virus RT ausfüllt, um die reverse Transcriptase wirkungsvoll zu inaktivieren und/oder die Ribonuclease wirkungsvoll inaktivieren zu können. Normalerweise ist es bevorzugt, daß n relativ groß ist, geeignet sind 20 oder mehr und bevorzugt 25 oder mehr. Tatsächlich sind Versuche unternommen worden mit einem relativ hohen Molekulargewicht Y-Poly[A] (h- Mr) n 270, m 69, Mr 1.1 · 10&sup5; (wobei Mr Molekulargewicht bedeutet) und mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht Y-Poly[A] (1-Mr), n 28, m 9, Mr 1.2 · 10&sup4;.
- Die FDNP-Gruppen lassen sich im allgemeinen an das Poly [A] binden, um ein Verhältnis von FDNP-Gruppen zu [A] von nicht mehr als ca. 1 : 4 zu erhalten. DNP-Gruppen lassen sich an Poly[A] binden, um ein merklich höheres Verhältnis von ca. 1 : 1.5 zu erhalten. Gemischte FDNP/DNP Po ly[A] Polymere können ebenfalls hergestellt werden. Im allgemeinen wird zuerst 1,3-Difluor-2,4-dinitrobenzol (DFDB) mit Poly[A] umgesetzt, um ein Verhältnis von FDNP zu [A] von ca. 1 : 4 bis 1 : 10 zu erhalten. Dann wird das Produkt mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (FDNB) umgesetzt, so daß die erhaltene Zusammensetzung insgesamt ein Verhältnis von FDNP- und DNP-Gruppen zu [A] hat, welches so hoch wie erreichbar ist, im allgemeinen größer ahs 1 : 4, bevorzugt größer als 1 : 2.
- Das Kation M kann jedes Kation sein, das eine ausreichende Konzentration der Zusammensetzung liefert, um den gewünschten Zweck zu erzielen, d. h. die Ribonuclease zu inaktivieren, eine Krankheit entstanden durch ein RNA-Virus zu behandeln, inaktiviertes (totes) Virus zur Impfung herzustellen, Blut zur Lagerung zu sterilisieren usw. Das Kaliumsalz wurde bei den hier beschriebenen Versuchen verwendet, jedoch können auch beispielsweise das Ammonium-, Rubidium-, Zäsiumsalz oder ein anderes Salz an dessen Stelle verwendet werden.
- Eine wichtige Größe ist das molare Verhältnis der Y- Gruppen zu den [A] (Adenin) Gruppen. Im allgemeinen steigert sich die Wirksamkeit der einzelnen Y-Poly[A] Verbindung mit gesteigertem molaren Verhältnis von Y zu [A]. Dementsprechend ist es wünschenswert, daß dieses Verhältnis relativ hoch ist. Im allgemeinen sollte dieses Verhältnis wenigstens 1 : 10 sein. Höhere Verhältnisse, wie beispielsweise 1 : 5 und darüber sind bevorzugt. Die hier beschriebenen Experimente wurden mit Y-Poly [A] Verbindungen durchgeführt, welche Verhältnisse von 1 : 1.5, 1 : 3.9 und 1 : 4.8 aufwiesen. Sogar noch höhere Verhältnisse sind erwünscht.
- Es wurde herausgefunden, daß bei nanomolaren Konzentrationen Y-Poly[A] ein wirksamer Inhibitor von reversen Transcriptasen ist und daher wirkungsvoll für die Anti- Virus-Behandlung erscheint (und ist auch ein wirksamer und, wenn Y wenigstens partiell FDNP ist, irreversibler Inhibitor der Ribonuclease), aber dies sogar bei mikromolaren Konzentrationen und ess inhibiert nicht die essentiellen Enzyme der Wirtszelle, welche in-vitro untersucht wurden, einschließlich der RNA-Polymerase II, der cAMPabhängigen Proteinkinase, der Pyruvatkinase, der Hexokinase und der Adenylatkinase. Somit können Dosierungen formuliert werden, welche für die irreversible Inhibierung der reversen Transcriptase in den RNA-Viren wirksam sind, aber die essentiellen Zellenzyme nicht hemmen. Die Assoziation von Y-Poly[A] mit Ribonuclease kann benutzt werden, um Ribonuclease zu inaktivieren und/oder aus einer Lösung zu entfernen. Beispielsweise kann Y-Poly[A], worin wenigstens ein Teil von Y FDNP ist, zu einer Lösung von Ribonuclease gegeben werden, um die Ribonuclease irreversibel zu inhibieren.
- Alternativ und bevorzugt kann Y-Poly[A] mit einem Affinitätsmaterial verbunden werden, im allgemeinen mit einer Affinitätssäule, und eine Ribonuclease-enthaltende Lösung kann durch die Säule geleitet werden. Die Ribonuclease wird dann auf der Säule zurückgehalten und die aus der Säule austretende Lösung kann dadurch von Ribonuclease befreit werden. Bei der Verwendung der Säulentechik wird bevorzugt, daß Y-Poly [A] DNP-Poly [A] ist, da die FDNP- Gruppen im FDNP-Poly[A] auf der Säule hydrolysiert werden können, wogegen eine DNP-Poly[A]-Säule gewaschen und wiederverwendet werden kann. Das verwendete Säulenmaterial ist nicht bedenklich. Im wesentlichen kann es jedes Säulenmaterial sein, mit dem Y-Poly[A] verbunden werden kann. Beispielsweise wurde eine Cellulosesäule verwendet.
- Ein langes Inhibitormolekül, wie Y-Poly[A] mit vielen Stellen für eine kovalente Verknüpfung von FDNP-Gruppen oder eine nicht-kovalente Verknüpfung von DNP-Gruppen mit vielen spezifischen Aminosäureresten im aktiven Zentrum der HIV RT, wurde ausgewählt, um ein vermutlich mutationsunempfindlicher Inhibitor zu sein, da es für alle die se spezifischen Aminosäurereste höchst unwahrscheinlich ist, durch einen einzelnen Satz von Zufallsmutationen so verändert zu werden, daß das mutierte Enzym nicht länger fähig ist, Y-Poly[A] zu binden, aber immer noch das Templat Poly[A] binden würde. Um lebensfähig zu bleiben, muß das hypermutationsfähige HIV eine RT haben, welche eine langes aktives Zentrum besitzt. Für eine lebensfähige Mutante der HIV RT würde es sehr schwierig sein, die Bindung eines solchen Inhibitors zu verhindern. Diese Schlußfolgerung wurde durch die Beobachtung bestätigt, daß trotz der wesentlichen Unterschiede zwischen den Primärstrukturen der HIV RT, der avian myeloblastosis Virus RT (AMV RT) und der Moloney murine Leukämievirus RT (MLV RT), all drei reversen Transcriptasen in 10 Minuten oder weniger bei 25ºC und nanomolaren Konzentrationen von FDNP-Poly[A] inaktiviert wurden.
- Y-Poly [A] (h-Mr) und Y-Poly [A] (1-Mr) wurden auf unser Ersuchen hin als wirksame Anti-HIV-Medikamente in-vitro mit empfindlichen Lymphozyten in der Gegenwart von HIV in dem Developmental Therapeutics Program von der Division of Cancer Treatment des National Cancer Institute (NIC) untersucht. Diese reaktiven Polymeren wurden bei der Erhaltung der Lebensfähigkeit der Lymphocyten in der Gegenwart von HIV als wirksam erkannt (siehe Beispiel 5).
- Da diese Polymeren entwickelt wurden, um sämtliche reversen Transcriptasen zu inaktivieren, können sie auch zur Behandlung anderer durch RNA-Viren ausgelöste Krankheiten verwendet werden, beispielsweise T-Zellen-Leukämie/Lymphoma bei Erwachsenen, Hepatitis A, C, D und E, Influenza, Parainfluenza, Säuglings-Bronchiolitis und Säuglings- Lungenentzündung, Erkältung, Masern, Mumps usw. Somit können Krankheiten verursacht durch die RNA-Viren HTLV (T-Zellen-Leukämie/Lymphoma-Virus bei Erwachsenen), HAV (Hepatitis A Virus), HAC (Hepatitis C Virus), HDV (Hepatitis D Virus), HAC (Hepatitis E Virus), HEV (Influenza Virus), Parainfiuenza Virus, RSV (Atmungs synzytium Virus), Erkältung verursacht durch den Coronavirus oder Rhinovirus, Masernvirus und Mumpsvirus, ohne daß diese Beispiele einschränkend wären, durch die Verwendung der Erfindung kontrolliert werden. Durch andere RNA-Viren verursachte Krankheiten können ebenfalls durch die Verwendung der Erfindung kontrolliert werden.
- Die Erfindung wird besser durch den Verweis auf folgende Beispiele verstanden.
- Zehn Milligramm des Kalziumsalzes von Poly[A] (bezogen von Sigma, Mr 1.1 X 10&sup5;) wurden in 0.5 ml Wasser und 1.6 ml einer 0.2 M K&sub2;CO&sub3; + 1.5 M KHCO&sub3; Lösung (pH = 9.2) gelöst. Die Lösung wird gerührt und mit 0.80 ml einer Acetonlösung vermischt, welche einen zehnfachen Überschuß an 1,3-Difluor-2,4-dinitrobenzol (DFDB) enthält und welche in drei gleichen Aliquots in 12-Stunden Intervallen hinzugegeben wurde. Nachdem die Reaktion 48 Stunden bei Raumtemperatur fortgeschritten war, wurde das überschüssige DFDB durch wiederholte Extraktion mit einer Lösung aus Methylenchlorid und Dimethylsulfoxid 7 : 1 (v/v) entfernt. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-80 unter Zentrifugation unterzogen und anschließend lyophilisiert. Das molare Verhältnis von 3-Fluor-4,6-dinitrophenylgruppen zu Adeningruppen im Produkt wurde aus der beobachteten Absorption bei 330 bzw. 259 nm zu 1/3.9 berechnet, unter Verwendung von 3- Fluor-4, 6-dinitrophenylethylether (ε&sub2;&sub5;&sub9; = 3900, ε&sub3;&sub3;&sub0; = 6300) und AMP (ε&sub2;&sub5;&sub9; = 15400) als Standards. Folglich besitzt der durchschnittliche polymere Inhibitor 270 Adeninreste und 69 2'-O-FDNP-Gruppen pro Molekül. Die Absorption einer verdünnten Lösung von FDNP-Poly[A](h-Mr) ver ringert sich nicht merklich (< 5%), nachdem der pH-Wert von 9 auf 5 gesenkt wurde. Diese Beobachtung zeigt, daß der Anteil an 3-Fluor-4,6-dinitrophenylgruppen im Produkt, welche während der Herstellung zu den unreaktiven 3-Hydroxy-4,6-dinitrophenylgruppen hydrolysiert wurden, kleiner als 5% war. Produktausbeute = 3 mg.
- Zehn Milligramm des Kalziumsalzes von Poly[A] (bezogen von Sigma, Mr 1.1 · 10&sup5;) wurden in 0.5 ml Wasser und 0.1 ml einer 0.1 M K&sub2;CO&sub3; + 2.0 M KHCO&sub3; Lösung (pH = 8.8) gelöst. Die Lösung wird gerührt und mit 0.4 ml einer Acetonlösung gemischt, welche einen fünffachen Überschuß an 1,3-Difluor-2,4-dinitrobenzol (DFDB) enthielt und welche in vier Aliquots in 6-Stunden-Intervallen hinzugegeben wurde. Während der Reaktion wurde der pH-Wert der Reaktionslösung überprüft und durch Zugabe von K&sub2;CO&sub3; und KHCO&sub3; auf 8.8 gehalten. Der Reaktionsverlauf wurde mittels TLC- Analytik der Reaktionslösung als Funktion der Zeit auf einer Kodak Celluloseplatte mit Fluoreszenzindikator unter Verwendung von (20 mM K&sub2;HPO&sub4; + 20 mM KH&sub2;PO&sub4;): CH&sub3;CN = 2 : 1 (v/v) als Laufmittel verfolgt. Schließlich verblaßten alle Banden von Poly A bei Rf = 0.38 und eine neue Bande von FDNP-Poly A bei Rf = 0.77 nahm an Intensität zu. Nachdem die Reaktion bis zum Verschwinden der Bande bei Rf = 0.38 fortgeschritten war, gewöhnlich nach ca. 24 Stunden bei Raumtemperatur, wurde der Überschuß an DFDB durch wiederholte Extraktion mit einer Mischung aus Methylenchlorid und Dimethylsulfoxid 7 : 1 (v/v) entfernt. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-50-80 unter Zentrifugation unterzogen oder dialysiert und anschließend lyophilisiert. Das molare Verhältnis von 3-Fluor-4,6-dinitrophenyl- zu Adeningruppen im Produkt wurde aus der beobachteten Absorption bei 330 bzw. 259 nm zu 1/4.8 berechnet, unter Verwendung von 3-Fluor-4,6-dinitrophenylethylether (ε&sub2;&sub5;&sub9; = 3900, ε&sub3;&sub3;&sub0; = 6300) und AMP (ε&sub2;&sub5;&sub9; = 15400) als Standards. Das FDNP/Adenin-Verhältnis von 1/4.8 wurde durch ¹&sup9;F-NMR und ³¹P-NMR bestätigt.
- Während Schritt 1 ein Produkt mit einem gewünschten höheren Verhältnis von FDNP-Gruppen zu Adeningruppen als Schritt 2 lieferte, wurde gefunden, daß nach einer 48stündigen Reaktionszeit ca. 5% der Fluorgruppen zu OH- Gruppen hydrolysiert wurden. Hydrolyse konnte nicht nachgewiesen werden, wenn die Reaktionszeit auf 24 Stunden limitiert war. Das hydrolysierte Material konnte nicht vom Produkt getrennt werden. Dementsprechend ist Schritt 2 zu bevorzugen.
- DNP-Poly A wurde entsprechend Schritt 2 unter Austausch von DFDB gegen 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (FDNB) hergestellt. Bei der Synthese von DNP-Poly A durfte Poly A mit einem Überschuß an FDNB 48 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, und das molare Verhältnis von DNP-Gruppen zu Adeninresten im Produkt DNP-Poly A belief sich auf 1/1.5. Dieses Verhältnis war höher als das mit FDNP-Poly[A] beobachtete, weil in diesem Fall die Reaktion nach 48 Stunden abgebrochen wurde, um nennenswerte Hydrolyse der 5- Fluorgruppe zu vermeiden.
- Eine Mischung von ADP und AMP mit einem molaren Verhältnis von 28 : 1 wurde durch Auflösen von 867 mg ADP (K- Salz), 25 mg AMP (freie Säure) und 393 mg K&sub2;CO&sub3; in 4 ml Wasser hergestellt. Dann wurde die Lösung mit 20 ul einer 1 M MgCl&sub2;-Lösung und 8 Einheiten Polynucleotidphosphorylase (bezogen von Sigma; präpariert aus E. coli) gemischt. Nach Inkubation der Reaktionslösung über 48 Stunden bei 37ºC wurde sie einer Gelfiltration mit Sephadex G-25-80 unter Zentrifugation unterzogen, um sämtliches ADP, AMP und Oligonucleotide eines Molekulargewichts von kleiner als 5000 zu entfernen. Absorptionsmessungen bei 259 nm zeigten, daß das Filtrat 63 mg des Produktes FDNP- Poly[A](1-Mr) enthielt. Eine zweite Gelfiltration eines Aliquots dieser FDNP-Poly[A](1-Mr)-Lösung mit Sephadex G- 50-80 zeigte, daß 99.7% der auf diesem Wege hergestellten Oligomere einen Wert Mr < 10000 aufwiesen. Dieses FDNP- Poly[A](1-Mr) wurde nachfolgend benutzt, um mit FDNB in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, umgesetzt zu werden, um FDNP-Poly[A](1-Mr) zu bilden. Die molaren Verhältnisse von FDNP-Gruppen / Adeninresten = 1/3.9. FDNP-Poly[A](1-Mr) wurde auch nach Vorschrift 2 hergestellt und ergab ein Produkt mit einem molaren Verhältnis von FDNP/Adenin von 1/4. 8. DNP-Poly[A](1-Mr) wurde entsprechend hergestellt und besaß ein molares Verhältnis von DNP/Adenin von 1/1.5.
- Proben riverser Transcriptase von HIV (HIV RT) und vom Moloney murinen Leukämievirus (MLV RT) und vom avian Myeloblastenvirus (AMV RT) wurden getrennt mit FDNP-Poly[A] bei 25ºC in einem Tris-HCl Puffer (0.1 M, pH 8.2), welcher 1 mM MgCl&sub2; und 125 mM KCl enthielt, inkubiert und auf RT-Aktivität überprüft. In jedem Experiment wurde das ausgewählte Enzym 10 Minuten bei 25ºC in einer Inkubationslösung, welche das Kaliumsalz des Inhibitors bei einer gegebenen Konzentration enthielt, inkubiert. Nach zehn Minuten wurde die inkubierte Lösung unverzüglich zu einer Assaylösung gegeben und weitere 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, dann mittels Trichloressigsäure ausgefällt, gewaschen und auf radioaktive Polynucleotide mittels Scintillationsmessung vermessen. Die Assaylösung enthielt 125 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM MgCl&sub2;, 125 mlvi KCl, 250 uM [³H] dTTP als Substrat und 23 nM Poly [A] - [dT]&sub1;&sub2; als Templat.
- Für jede reverse Transcriptase wurde die beobachtete prozentuale Enzymaktivität nach 10 Minuten Vorinkubation mit FDNP-Poly[A] bei 25ºC als Funktion der Inhibitorkonzentration aufgezeichnet, und die Konzentration an Inhibitor, um eine 50%ige Enzyminhibierung zu erreichen (IC&sub5;&sub0;), wurde aus dem Graphen bestimmt. Die Resultate sind unten zusammengefaßt. Ähnliche Ergebnisse wurden mit DNP- Poly[A] beobachtet.
- Die beobachteten IC&sub5;&sub0;-Werte zeigen, daß DNP-Poly[A](h-Mr), FDNP-Poly[A](h-Mr) und FDNP-Poly[A](1-Mr) starke Inhibitoren einer reversen Transcriptase in Lösung sind. Kinetische Messungen zeigen, daß beide, DNP-Poly[A] und FDNP- Poly[A], mit dem Templatprimer, Polyadenylsäure-Dodecathymidylsäure (Poly[A] - [dT]&sub1;&sub2;), um dieselbe Bindungsstelle in dem HIV RT Molekül konkurrieren. Aufbringen der inkubierten Mischung auf eine Cellulose-oligo[dT]-Säule und anschließende Trennung mittles Elutionschromatographie zeigte, daß FDNP-Poly[A] kovalent an die reverse Transcriptase bindet. Daher ist die Inaktivierung des Enzyms irreversibel.
- Die obigen Werte zeigen auch, daß trotz der wesentlichen Unterschiede in der Primärstruktur die drei viralen reversen Transcriptasen, HIV RT, MLV RT und AMV RT, alle innerhalb von 10 Minuten bei 25ºC durch subnanomolare Konzentrationen an FDNP-Poly[A] inaktiviert werden. Diese ist ein bedeutendes Anzeichen, daß FDNP-Poly[A] unempfindlich gegen Mutation ist.
- Die Inhibierung verschiedener Mutanten der HIV RTs durch DNP-Poly[A] und FDNP-Poly[A] wurde freundlicherweise von Dr. Joe C. Wu an einer RT aus vier verschiedenen Stämmen des menschlichen Virus: HIV-1 RT (Wildtyp), HIV-2 (Wildtyp), HIV-141,215 RT (AZT-resistente Mutante, Thr 215 → Tyr, Met 41 → Leu), HIV-1181c RT (Nevirapinresistente Mutante) unter der Verwendung von Poly C-[dG]&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Templat und [³H]dGTP als Substrat gemessen. Die Assaybedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 3. Der beobachteten ungefähren IC&sub5;&sub0;-Werte sind in der unteren Tabelle zusammengestellt:
- In diesen Experimenten wurde gefunden, daß beide, DNP- Poly[A] und FDNP-Poly[A] wirkungsvolle Inhibitoren aller vier reversen Transcriptasen sind, aber Poly[A] selbst keine inhibierende Wirkung besitzt.
- FDNP-Poly [A](h-Mr), DNP-Poly[A](h-Mr) und FDNP-Poly[A](1- Mr) wurden als wirksame Anti-AIDS-Mittel in-vitro mit empfindlichen Lymphocyten in der Gegenwart von HIV im "Developmental Therapeutics Program" der Division of Cancer Treatment beim National Cancer Institute (NCI) untersucht. Es wurde bestätigt, daß alle drei Inhibitoren aktiv sind. Die Versuchsreihen des NCI beinhalten das Mischen verschiedener Konzentrationen an FDNP-Poly[A](h- Mr), DNP-Poly[A](h-Mr) oder FDNP-Poly[A](1-Mr) und empfindliche T4 Lymphocyten (CEM-SS Zellinie) mit oder ohne HIV in Mikrokulturplatten, das Inkubieren der Platten für sechs Tage, dann die Bestimmung der Anzahl verbleibender lebender Zellen unter Benutzung des kalorimetrischen Endpunkts [Verfahren beschrieben in Weislow, et al. J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81, 577-586].
- Die Testergebnisse zeigen, daß FDNP-Poly[A] und DNP- Poly[A] beide wirksam für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Lymphozyten in Gegenwart von HIV sind. Die beobachteten wirksamen Konzentrationen (EC&sub5;&sub0;) sind 2.65 ± 0.15 ug/ml oder 24 ± 2 nM für FDNP-Poly[A](h-Mr) und 0.2 ± 0.1 ug/ml oder 2 ± 1 nM für DNP-Poly [A](h-Mr). Daher sind diese Polymere wirkungsvolle antivirale Wirkstoffe. Das lösliche Salz beider Polymere kann direkt zur Behandlung von mit HIV infizierten Säugetieren verwendet werden, entweder in Form einer geeigneten Lösung zur parenteralen Verabreichung oder in Form von Pellets zur oralen Einnahme.
- Magensäure des Menschen enthält Pepsin und mäherungsweise 0.01 M HCl. Um die sauren Bedingungen im menschlichen Magen zu simulieren, haben wir FDNP-Poly[A] in 0.01 M HCl bei 37ºC inkubiert und fanden, daß seine Wirksamkeit als irreversibler Inhibitor der HIV RT nach vierstündiger Inkubation in 0.01 M HCl nur um 50% abnahm. DNP-Poly[A] war unter gleichen Bedingungen sogar noch stabiler. Die Ergebnisse für FDNP-Poly[A] sind in der folgenden Tabelle aufgelistet:
- In einem getrennten Experiment wurde FDNP-Poly[A](h-Mr) (34 nM) bei 37ºC in einer 0.01 M HCL Lösung inkubiert, welche 1.0 mg/ml Pepsin enthält. Es wurde gefunden, daß die Wirksamkeit des Inhibitors nach zweistündiger Inkubation noch unverändert war und erst nach 4 Stunden auf 65% abfiel. Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Wirksamkeit von FDNP-Poly[A] gegen HIV nicht innerhalb von 2 Stunden durch die Magensäure zerstört werden wird. Folglich kann das Salz von FDNP-Poly[A] zur oralen Verabreichung mit geeigneten Füllstoffen gemischt und zu Pillen gepreßt oder in Kapseln gefüllt werden.
- Eine gefrorene Probe menschlichen Blutserums (männlich, Typ AB, bezogen von Sigma) wurde aufgetaut und zur Auflösung von FDNP-Poly[A](h-Mr) (34 nM) verwendet. Die relative Aktivität dieses HIV RT Inhibitors wurde als Funktion der Inkubationszeit bei 37ºC bestimmt und wie folgt aufgelistet:
- Da die Wirksamkeit von FDNP-Poly[A] in menschlichem Serum nach 4 Stunden bei 37ºC um nicht mehr als 20% abnahm, kann die Verbindung in einer geeigneten Lösung zur parenteralen Verabreichung aufgelöst werden.
- Das HIV, das vollständig und irreversibel durch FDNP- Poly[A] (oder Y-Poly[A], worin Y partiell FDNP bedeutet) inaktiviert worden ist, ist auch als ein vollständiges Antigen zur Entwicklung eines wirkungsvollen Anti-AIDS Impfstoffs zu gebrauchen.
- Die weltweiten Bemühungen, einen wirksamen Impfstoff zur Verhütung von AIDS zu finden, waren bisher nicht erfolgreich. Impfstoffe, welche aus genetisch veränderten Segmenten eines AIDS Virus gewonnen wurden, erbringen nicht den ausreichenden Schutz vor AIDS, hauptsächlich wegen der extrem hohen Mutationsrate des Virus. Vor kurzem wurde über eine vielversprechende schützende Wirkung einer Impfung mit einem geschwächten, lebenden HIV mit einem Defekt in dem nef-Gen berichtet [Daniel et al., Science 1992, 258, 1938]. Diese neue Entdeckung erinnerte viele Forscher an die alte Vorgehensweise, eine geschwächte Variante eines vollständigen Virus zu verwenden, um die schützende Immunreaktion auszulösen. Beispielsweise kann das lebende Virus durch Behandlung mit Formaldehyd geschwächt werden und das geschwächte Virus kann dann als Antigen zum Auslösen der Immunreaktion gebraucht werden. Aber dies ist ein gefährliches Verfahren, da die Bildung einer Schiff'schen Base zwischen Aldehyd und Aminogruppe reversibel ist. Die Umkehrung der Kondensationsreaktion würde ein vollständig aktives Virus erzeugen, das für den Patienten tödlich sein könnte.
- Da die Inaktivierung von HIV durch Y-Poly[A], worin Y wenigstens partiell FDNP ist, kann 100%ig wirkungsvoll und irreversibel sein. Ein wahrhaft wirksamer Anti-AIDS Impfstoff für Menschen ist entwickelbar durch die Verwendung von Y-Poly[A] (worin Y wenigstens partiell FDNP ist), inaktiviertem HIV als Antigen und Verabreichung an den Patienten, beispielsweise durch Injektion.
- Die mögliche Anwesenheit von lebendem HIV selbst in Spuren in gespendetem Blut stellt eine dauerhafte Bedrohung für Personen dar, die Bluttransfusionen erhalten als auch für Personen, die Bluttransfusionen verabreichen. Sehr geringe, aber ausreichende Mengen an Y-Poly[A] (worin Y wenigstens partiell FDNP ist) können dem gespendeten Blut vor der Lagerung in Blutbänken beigegeben werden. Da für eine irreversible Inhibierung der IC&sub5;&sub0;-Wert mit der Zeit abnimmt [Kang and Wang, J. Biol. Chem. Mai 1994, im Druck], inaktiviert das als Vorsichtsmaßnahme zugegebene Y-Poly[A] Spuren von HIV, welche während der Lagerung zugegen sein könnten.
- Um die Wirksamkeit von Y-Poly[A] zu untersuchen, wurde HIV RT (57 nM) mit unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen (FDNP-Poly[A](h-Mr)) 10 Minuten bei 25ºC inkubiert. Der nach der Inkubationszeit noch vorhandene Prozentsatz an ursprünglicher Aktivität ist in folgender Tabelle aufgelistet:
- In der biotechnologischen Industrie und entsprechenden Forschungslaboratorien ist es des öfteren notwendig, große Segmente unbeschädigter RNA zu isolieren. Um versehentliche Spaltung der RNA-Produkte durch Spuren von exo gener Ribonuclease zu vermeiden, war es oft notwendig, alle Lösungen mit Diethylpyrocarbonat kurz aufzukochen oder einen Ribonucleaseinhibitor, normalerweise kommerziell erhältliches RNasin (erhältlich von Promega) zuzusetzen. Beides sind kostspielige Verfahren für eine Anwendung im Großmaßstab. Wir fanden, daß Y-Poly[A] (worin Y wenigstens partiell FDNP ist) ein wirksamer irreversibler Inhibitor der Ribonuclease ist. Die Zugabe kleiner aber ausreichender Mengen von solchem Y-Poly[A] inaktiviert irreversibel etwaige Spuren von Ribonuclease, welche in den Lösungen oder Behältern zugegen sein könnten, die bei dem Verfahren verwendet werden. Die Wirksamkeit von solchem Y-Poly [A] als wirkungsvollem Inhibitor für Ribonuclease wird in den folgenden Experimenten gezeigt.
- Die katalytische Aktivität der Ribonuclease A (Rnase A) wurde durch Messung der Absorptionsabnahme verursacht durch die katalytische Hydrolyse von Cytidin 2':3'- cyclomonophosphat (cCMP) in Lösung bei 25ºC bei 300 nm (A&sub3;&sub0;&sub0;) mit der Zeit bestimmt. Die Assaylösung enthielt 1.9 mM cCMP (Na-Salz) in 50 mM Acetatpuffer (pH 5.0). Die Referenzreaktion in Abwesenheit von FDNP-Poly[A] wurde durch Injektion von 10 ul einer 54.4 uM RNase A Stammlösung zu 2000 ml der Assaylcisung gestartet, gemischt und die Abnahme von A&sub3;&sub0;&sub0; mit der Zeit aufgezeichnet. Bei den Inhibitionsstudien wurde die RNase mit verschiedenen Konzentrationen an FDNP-Poly[A](h-Mr) für 1.0 min vorinkubiert und dann einer cCMP-Lösung injiziert, um den Assay zu starten. Die Ergebnisse sind unter zusammengefaßt. Die absolute Endkonzentration an RNase wurde konstant auf 268 nM und die Inhibitorkonzentration auf 54uM gehalten.
- Diese Werte zeigen, daß selbst bei submikromolaren Konzentrationen jedes FDNP-Poly[A] Molekül schnell viele Moleküle einer exogenen RNases inaktivieren kann.
- Es wurde gefunden, daß Doppelhelix-förmiges DNP-Poly A- Poly[dT] ein wirksamerer Inhibitor der HIV-1 RT als DNP- Poly A ist. Das Doppelhelix-förmige DNP-Poly[A] -Poly[dT] wurde durch Mischen der beiden Komponenten und Erhitzen für 5 Minuten auf 90ºC formuliert. Die in der folgenden Tabelle aufgelisteten Werte wurden durch Verwendung von C-[dG]&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als Templatpromotor und [³H] TTP als Substrat der HIV-1 RT erhalten.
- Das Doppelhelix-förmige DNP-Poly[A]-Poly[dT] ist eindeutig der wesentlich bessere Inhibitor der HIV-1 RT als das einsträngige DNP-Poly[A].
- Eine 100 ul Probe von Lymphocyten eines Erwachsenen (2 X 10&sup6; Zellen) wurden mit 100 ul RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Kulturmedium und 60 ul DNP [¹&sup4;C] Poly[A] (1.3 mg/ml, mit einer spezifischen Radioaktivität von 120 cpm/pmol) gemischt. Die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert und 50 ul Aliquots wurden nach bestimmten Zeitintervallen entnommen, gefiltert, gewaschen und auf Radioaktivität vermessen. Jedes Aliquot wurde auf ein Stück Membranfilter (FA 1.0 um, Millipore) getüpfelt, mittels eines Saugfilters filtriert und 8 mal mit wäßriger 100 mM KCl- Lösung gewaschen. Jeder getrocknete Filter mit Zellen wurde mit einem Flüssigscintillationszähler auf Radioaktivität vermessen. Die Werte eines typischen Experiments sind unten zusammengefaßt.
- Diese Werte zeigen, daß entweder durch Diffusion oder durch Endocytose das hydrophobe DNP [¹&sup4;C]Poly[A] spontan in die Lymphocyten eines Erwachsenen transportiert werden kann. Unter den gleichen Bedingungen kam [¹&sup4;C]Poly[A] keineswegs in diese Lymphocyten.
- Murine Moloney Leukämieviren und DNP-Poly[A] wurden in einem Modellexperiment zur Demonstration des spontanen Transports des Inhibitors in ein Retrovirus verwendet. Bei jedem Experiment wurden 5 ul der Virussuspension auf Eis mit 37.5 nM DNP-Poly[A] inkubiert. Nach einer bestimmten Zeit wurde die Mischung 10 Minuten bei 100.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt, und das Pellet (praktisch unsichtbar) wurde mit 200 ul Tris Puffer (50 nM Tris-HCl, pH 7.8) gewaschen. Das Pellet wurde dann in Assaypuffer homogenisiert (50 mM Tris- HCl, pH 7.8, 60 mM KCl, 2mM DTT und 0.6 mM Mn-acetat) und mit 0.02 U Poly[A]-oligo[dT], 1.5 mM [³H] dTTP und 0.1% Triton-100 für 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10%iger TCA abgebrochen und die katalytische Aktivität (A) der reversen Transcriptase wurde aus dem cpm-Wert des ausgefallenen radioaktiven Produkts [³H]Poly[dT] berechnet. Die experimentellen Werte sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt, wobei Aº für die ursprüngliche katalytische Aktivität vor der Inkubation mit dem Inhibitor steht.
- Diese Werte zeigen, daß DNP-Poly[A] die Hülle des murinen Leukämievirus durchdringen kann und innen die reverse Transcriptase inhibiert. Sie zeigen an, daß FDNP-Poly[A] auch die Hülle des HIV durchdringen kann und ein dauerhaft inaktiviertes HIV erzeugt, welches für den Gebrauch als ideales Antigen für einen Anti-AIDS-Impfstoff geeignet ist. Unter den gleichen Bedingungen gelangte [³H]Poly[dT] keineswegs in das Virus.
- Die vorliegende Erfindung stellt eine Stoffzusammensetzung bereit, die zur Behandlung von durch RNA-Viren verursachte Krankheiten, wie AIDS und zur Sterilisation von HIV in gelagertem Blut für Transfusionen nützlich ist und welche Impfstoffe gegen durch RNA-Viren verursachte Krankheiten bereitstellen kann.
- Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, sind weitere Modifizierungen zulässig, und diese Anmeldung beabsichtigt, jegliche Variationen, Verwendungen oder Anwendungen der Erfindung abzudecken, so wie sie bei den im vorherigen offenbarten essentiellen Merkmalen Anwendung finden könnten, und so wie sie in den Bereich der Erfindung und die Grenzen der beigefügten Ansprüche fallen.
Claims (14)
1. Y-Poly[A]-enthaltende Stoffzusammensetzung
gekennzeichnet durch die Formel:
Mn(Y)mXi[A]n
worin [A]n = Polyadenylsäure (5') mit n Adenyl
säureresten,
Y = FDNP, DNP oder partiell FDNP und
partiell DNP,
FDNP = 3-Fluor-4,6-dinitrophenylgruppen,
über Etherbrücken kovalent mit m der n
2'-OH- Gruppen von [A] n verknüpft,
DNP = 2,4-Dinitrophenylgruppen, über
Ether- brücken kovalent mit m der n 2'-
OH-Gruppen von [A]n verknüpft,
X = Acylgruppe,
i = 0 oder 1,
M = ein Kation ist, ausgesucht um
einen gewünschten Löslichkeitsgrad
der Zusammensetzung zu erreichen,
und eine dieser generischen Strukturen besitzt:
oder
und worin das Verhältnis von Y-Gruppen zu
Adenineinheiten wenigstens 1 : 5 beträgt und worin n hinreichend
groß ist, daß das y-Poly[A] im wesentlichen
vollständig das aktive Zentrum eines RNA-Virus RT ausfüllen
kann, um wirkungsvoll die reverse Transcriptase
und/oder wirkungsvoll clie Ribo-nuclease zu
inaktivieren.
2. Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß n wenigstens 20 beträgt.
3. Verwendung der Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1
oder 2 zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten verursacht
durch RNA-Viren.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das RNA-Virus ein HIV, HTLV, HAV, HCV,
Influenzaviren, Parainfluenzaviren, RSV, Coronavirus oder
Rhinovirus, Masern-Virus oder Mumps-Virus ist und die
Erkrankung Immunschwächesyndrom (AIDS), T-Zellen-
Leukämie/Lymphoma bei Erwachsenen, Hepatitis A,
Hepatitis C, Influenza, Parainfluenza, Säuglings-
Bronchiolitis und Säuglings-Lungenentzündung,
Erkältung, Masern oder Mumps ist.
5. Verwendung der Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1
oder 2 zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen zum zeitweiligen Schutz vor einer RNA-
Virusinfektion.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die RNA-Virusinfektion durch HIV, HTLV, HAV, HCV,
Influenzaviren, Parainfluenzaviren, RSV, Coronavirus
oder Rhinovirus, Masern-Virus oder Mumps-Virus
verursacht wurde, und die Erkrankung Immunschwächesyndrom
(AIDS), T-Zellen-Leukämie/ Lymphoma bei Erwachsenen,
Hepatitis A, Hepatitis C, Influenza, Parainfluenza,
Säuglings-Bronchiolitis und Säuglings-
Lungenentzündung, Erkältung, Masern oder Mumps ist.
7. Verwendung der Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1
oder 2 zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen zur Impfung gegen Erkrankungen verursacht
durch Anti-RNA-Viren, wobei die Impfung wie folgt
durchgeführt wird:
der Patient erhält eine Injektion eines Antigens,
welches einen RNA-Virus enthält, der durch Y-Poly[A]
inaktiviert wurde, wobei Y wenigstens partiell FDNP
bedeutet, wodurch der Patient einen oder mehrere
An
tikörper gegen das Antigen bildet, wobei die
Antikörper zum Antigen auch Antikörper zum RNA-Virus
enthalten.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das RNA-Virus ein HIV, HTLV, HAV, HCV,
Influenzaviren, Parainfluenzaviren, RSV, Coronavirus oder
Rhinovirus, Masern-Virus oder Mumps-Virus ist und die
Erkrankung Immunschwächesyndrom (AIDS), T-Zellen-
Leukämie/Lymphoma bei Erwachsenen, Hepatitis A,
Hepatitis C, Influenza, Parainfluenza, Säuglings-
Bronchiolitis und Säuglings-Lungenentzündung,
Erkältung, Masern oder Mumps ist.
9. Verfahren zur Sterilisierung von RNA-Viren in zur
Transfusion vorgesehener Blut-Aliquots, dadurch
gekennzeichnet, daß zu den Blut-Aliquots eine für die
Sterilisierung wirkungsvolle Menge von Y-Poly[A]
hinzugefügt wird, wobei Y wengistens partiell FDNP
bedeutet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das RNA-Virus HIV ist und die Erkrankung
Immunschwächesyndrom (AIDS) ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das RNA-Virus ein HIV, HTLV, HAV, HCV,
Influenzaviren, Para-influenzaviren, RSV, Coronavirus oder
Rhinovirus, Masern-Virus oder Mumps-Virus ist und die
Erkrankung Immun-schwächesyndrom (AIDS), T-Zellen-
Leukämie/Lymphoma bei Erwachsenen, Hepatitis A,
Hepatitis C, Influenza, Para-influenza, Säuglings-
Bronchiolitis und Säuglings-Lungenentzündung,
Erkältung, Masern oder Mumps ist.
12. Verfahren zur irreversiblen Inaktivierung der
Ribonuclease in Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Lösung eine zur Inaktivierung der Ribonuclease
wirkungsvolle Menge von Y-Poly[A] hinzugefügt wird,
wobei Y wenigstens partiell FDNP bedeutet.
13. Verfahren zur Entfernung von Ribonuclease aus einer
Ribo-nuclease-enthaltenden Lösung, dadurch
gekennzeichnet, daß die Lösung mit einem affinen Material,
welches immobilisiertes FDNP-Poly[A] oder DNP-
Poly[A] enthält, in Kontakt gebracht wird, und danach
die Lösung vom affinen Material getrennt wird.
14. Verfahren zur irreversiblen Inaktivierung eines RNA-
Virus, dadurch gekennzeichnet, daß das RNA-Virus mit
einer zur Inaktivierung des RNA-Virus wirkungsvollen
Menge von Y-Poly[A] in Kontakt gebracht wird, wobei Y
wenigstens partiell FDNP bedeutet.
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