DE3882797T2

DE3882797T2 - Schwach affinitives Adsorbens für Affinitätschromatographie.

Info

Publication number: DE3882797T2
Application number: DE88850057T
Authority: DE
Inventors: Sten Ohlson
Original assignee: Hyclone Laboratories LLC
Current assignee: Hyclone Laboratories LLC
Priority date: 1987-03-06
Filing date: 1988-02-19
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2008-02-20
Also published as: SE8700949L; EP0290406A1; JPS63249052A; SE468653B; SE8700949D0; US4879247A; DE3882797D1; EP0290406B1

Description

Stand der Technik

Die Affinitätschromatographie ist ein Trennverfahren, durch das die zu trennende(n) Substanz oder Substanzen (Ligaten) in spezielle und reversible Wechselwirkung mit einer komplementären Substanz (Ligand) treten sollen, die in ihrem aktiven Zustand an eine stationäre, feste Phase gebunden ist. In der Praxis wird einer beweglichen flüssigen Phase, die die zu trennenden Substanzen enthält, gestattet, eine feste Phase mit gebundenen Liganden zu durchlaufen, wobei die Trennung durch die gewünschten Substanzen stattfindet, die speziell an der stationären Phase adsorbiert sind, während andere Arten von Molekülen hindurchlaufen. Die gewünschten Substanzen werden schließlich durch Anwendung verschiedener chemischer und physikalischer Verfahren eluiert. Auf diese Weise war es möglich, die aktuelle Substanz vielmals (10 bis 100 mal) in einem einzigen Schritt zu reinigen.
Eine der ersten Anwendungen der Affinitätschromatographie war mit der Reinigung von α-Amylase an unlöslicher Stärke verbunden (Starkenstein, Biochem. Z., 24 (1910) 210). Die Affinitätschromatographie wurde jedoch erst Ende der 60er Jahre als Trennverfahren in Verbindung mit der Ax n-Synthese aktivierter Gele (Ax n at al., Nature 214 (1967) 1302) und den Cuatrecasas-Arbeiten (J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059) an einer Wechselwirkung zwischen einem gebundenen Liganden und einer reversiblen gewünschten Substanz etabliert.
Parallel zu diesen Fortschritten wurde die traditionelle Flüssigkeitschromatographie sehr rasch weiterentwickelt. Die Verwendung extrem kleiner Teilchen (von etwa 10 um) als stationäre Phase führte zu einer erheblichen Verbesserung der Trennkapazität, wobei gleichzeitig die Analysedauer erheblich verringert wurde. Dieses Verfahren, das häufig einen Hochdruckabfall bewirkt, wurde High Performance Liquid Chromatography (HPLC), das heißt Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, genannt. Die Einführung der Affinitätschromatographie in die HPLC Ende der 70er Jahre (Ohlson et al. FEBS Letters 93 (1978) 5), die HPLAC (High Performance Liquid Affinity Chromatography = Hochleistungs- Flüssigkeitsaffinitätschromatographie) bedeutete eine Optimierung der Affinitätstechnik, hauptsächlich hinsichtlich der Geschwindigkeit und des Auflösungsvermögens. Im Vergleich zu anderen Chromatographiearten, zum Beispiel einer hydrophobischen oder Ionenaustausch- Chromatographie, zeigte sich jedoch, daß der Wirkungsgrad der HPLAC etwa 10 mal niedriger als der der traditionellen HPLC war, die die Bildung von 10.000 bis 50.000 theoretischen Platten pro m ermöglicht, während das HPLAC-Verfahren etwa 100 bis 2.000 theoretischer Platten pro m ergibt. Die Verwendung eines effektiveren Trägermaterials bei der Affinitätschromatographie, zum Beispiel sehr kleiner Teilchen, könnte die Leistung bis auf einen Wert steigern, der durch die molekulare Wechselwirkung per se zwischen der Substanz und dem komplementären Liganden bestimmt wird.
Um den Wirkungsgrad zu optimieren, d. h. ein hohes Auflösevermögen zu erreichen, bei vollständiger Beibehaltung oder teilweiser verbleibender Spezifität, wäre eine völlig neue Strategie für die Wahl des Liganden sowie eine bessere Kenntnis hinsichtlich der Ausbildung des Trennsystems erforderlich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein isokratisches Affinitätschromatographiesystem anzugeben, das sich durch einen hohen Wirkungsgrad und geringe Trennzeit auszeichnet.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch das in den folgenden Patentansprüchen definierte System gelöst, das nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
In Biotechnolgy, Vol 4 (Juni 1986) S. 519-521 ist eine Matrix für eine rasche zweistufige Affinitätschromatographie mit einem Medium zur festen Verbindung des Stützmediums und der Liganden beschrieben. In der ersten Stufe bildet das Probenmolekül einen Gleichgewichtskomplex mit dem immobilisierten Liganden, und in der zweiten Stufe wird der Komplex dissoziiert und das freigesetzte Molekül eluiert.
Ein Verfahren zur Wiedergewinnung von Immunoglobulinen aus Milch und Blutserum ist aus der EP 0 059 598 A1 bekannt. In diesem Verfahren wird das Rohmaterial durch ein unlösliches Trägermaterial mit gebundenen monoklonalen Antikörpern geleitet, die für eines oder mehrere Milch-Immunoglobuline spezifisch sind. Die Eluierung wird ausgeführt durch Änderung des pH-Werts von etwa neutral bis etwa 2 bis zu etwa 10 bis 11 durch Änderung der Polarität mit Ethylenglycol oder wäßrigem Dioxan oder durch elektrophoretische Desorption. Bei dieser Art von Verfahren ist es wahrscheinlich, daß der Grad oder das Maß der Affinität im Bereich von mittel bis hoch liegt.
Im Gegensatz zu diesem traditionellen Verfahren mit Adsorption und anschließender Elution durch Änderung der Bedingungen auf irgendeine Weise macht die vorliegende Erfindung von einem neuen Trennverfahren Gebrauch, bei dem hochreversible schwache Wechselwirkungen ausgenutzt werden, um die Substanz ohne oder mit nur geringer Änderung der Bedingungen zu binden.

Beschreibung der Erfindung

Zum besseren Verständnis ist es wesentlich, kurz die Kinetik zur Bindung der Substanz (des Ligaten) an den Liganden und deren Einfluß auf die chromatographische Retention zu erläutern, beispielsweise ausgedrückt als Kapazitätsfaktor k'. Es seien die nachstehenden vereinfachten Bedingungen unterstellt, die in den meisten Fällen vorliegen: Die Substanz (S) ist reversibel und nicht-kovalent an dem kovalent gebundenen Liganden (L) an der Oberfläche der stationären Phase gebunden.
kass = Assoziationsgeschwindigkeitskonstante
kdiss = Dissoziationsgeschwindigskeitskonstante
SL = an der stationären Phase gebundene Substanz
Die thermodynamische Dissoziation (Kdiss) ist
CTOT = Konzentration der aktiven Liganden
CSL = Konzentration des SL-Komplexes
CS = Konzentration der freien Substanz
Es sei ferner angenommen, daß keine sekundären Gleichgewichte vorhanden sind. Auch sei angenommen, daß die Adsorptionsisotherme linear ist, was bedeutet, daß die chromatographischen Eigenschaften unabhängig von der Substanzkonzentration sind. Ferner nehmen wir an, daß bei dieser Ausführung CTOT-CSL = CTOT ist.
Der Kapazitätsfaktor k' hängt nach der folgenden Gleichung mit dem Gleichgewicht, den Konstanten der Geschwindigkeit und der Konzentration der Liganden zusammen:
Ein Teil der obigen Begründung ist aus Chaiken (Anal. Biochem. 97 (1979) 1) abgeleitet worden.
Um eine vernünftige Retention k&sub1; = 0,2-50 und vorzugsweise k' = 1-10 in Systemen zu erreichen, die durch eine schwache Wechselwirkung zwischen Ligand und Ligat gekennzeichnet sind, wäre eine hohe Ligandenkonzentration (siehe Gleichung 3) erforderlich, was normalerweise beispielsweise im Falle einer Ionenaustausch- oder hydrophobischen Chromatographie der Fall ist.
Die Bandverbreiterung in einem chromatographischen Prozeß wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, zum Beispiel die Diffusion der Probe in der mobilen und der stationären Phase. Die Theorie dieses Prozesses ist durch Horvath und Lin (J. Chromatogr., 149, 1978, 43) sorgfältig untersucht worden und wird nachstehend kurz diskutiert. Die totale Bandverbreiterung (Effizienz) einer Substanz, ausgedrückt in Htot (die Höhe einer theoretischen Platte), ist:
Htot = Hdisp + Hext diff + Hint diff + Hkinetic (4)
Die ersten drei Terme entsprechen den nicht-kinetischen Beiträgen zur Bandverbreiterung und stellen die Ausbreitung der Proben in der mobilen Phase Hdisp, an der Matrixoberfläche Hext diff und in den Matrixporen Hint diff dar. Diese Parameter sind eine Funktion der chromatographischen und strukturellen Bedingungen, zum Beispiel der Teilchengröße, Probendiffusität und Packungsspezifikationen. Mit anderen Worten, die Verwendung kleiner Teilchen, einer hohen Diffusität in Proben und einer gleichmäßigeren Matrixpackung sind Faktoren, die zu einem höheren Wirkungsgrad (verringerter Htot) beitragen. Der vierte Term Hkinetic stellt eine Bandverbreiterung dar, die durch Assoziation und Dissoziation des Ligaten aus seinem immobilisierten Liganden bewirkt wurde. Es läßt sich zeigen, daß Hkinetic proportional zur linearen Durchflußgeschwindigkeit in dem System und umgekehrt proportional jeweils zur Konstanten der Assoziations- und Dissoziations-Geschwindigkeit ist. Dies bedeutet, daß eine schwache Bindung (hohes Kdiss und hohes kdiss) eine verringerte Hkinetic zur Folge hat, d. h. die nicht kinetischen Bandverbreiterungseffekte bestimmen den Gesamtwirkungsgrad (Htot). Mit anderen Worten, das durch "schwache" Bindungen charakterisierte Affinitätssystem macht einen maximalen Wirkungsgrad (minimales Htot) möglich. In diesen Fällen wird die Bandverbreiterung durch nicht-kinetische Elemente bestimmt.
Bei derzeitigen affinitätschromatographischen Anwendungen werden moderate bis zu starken Affinitäten zwischen immobilisierten Liganden und der Wechselwirkungssubstanz angewandt. Die Dissoziationskonstante (Kdiss) liegt normalerweise im Bereich von 10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;¹&sup5; M. In den meisten Fällen führt dieser Umstand dazu, daß der chromatographische Prozeß zu einem Adsorptions/Desorptions- Verfahren wird. Mit anderen Worten, der Kapazitätsfaktor k' ist extrem groß, siehe Gleichung (3), und kann häufig zehntausende von Säulenvolumen erreichen. Bei Anwendung derart starker Affinitäten der HPLAC mit kleinen, etwa 10 um großen festen Teilchen zur Minimierung der nicht-kinetischen Effekte, wird der Wirkungsgrad beispielsweise in theoretischen Plattenzahlen ausgedrückt, die hauptsächlich von der inerten Kinetik zwischen Ligand und Ligat abhängen. Die langsame Dissoziation eines Ligaten aus einem immobilisierten Liganden spielt hier eine führende Rolle (die Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit: kdiss 10&supmin;&sup5;-10s&supmin;¹). Bei schwachen Affinitäten, Kdiss > 10&supmin;³, sind die Geschwindigkeitskonstanten rapide und gleich, während bei starken Affinitäten insbesondere die Diffusionsgeschwindigkeit allmählich abnimmt und die Dissoziationsgeschwindigkeit sich verzögert. Beispielsweise bei einer Ionenaustausch- oder hydrophobischen HPLC beruht die Wechselwirkung zwischen der stationären Phase und den Substanzen im allgemeinen auf schwachen, nicht kovalenten Bindungen (ungefähr 10&supmin;² > Kdiss > 0) mit hohen Dissoziationsgeschwindigkeiten.
In mehrfacher Hinsicht beruht die natürliche "Eigenkommunikation" zwischen verschiedenen Arten von Molekülen und Zellen auf schwachen Affinitäten. Als Beispiel derartiger molekularer Wechselwirkungen kann die Fähigkeit des komplementären Faktors C1Q zur Unterscheidung zwischen monomerischem Immunoglobulin (schwache Bindung: Kdiss 10&supmin;²-10&supmin;³ M) und einem Immunokomplex (starke Bindung: Kdiss 10&supmin;&sup6;-10&supmin;&sup9; M) genannt werden. In diesem Falle wird mit Vorteil von der Kooperativität einschließlich dem Zusammenwirken zwischen mehreren individuellen schwachen Bindungen, die zusammen eine hohe Bindungsstärke (hohe Avidität) erzeugen, Gebrauch gemacht. Ein weiteres Beispiel ist die Zelle-Zelle-Wechselwirkung, bei der eine hohe Oberflächendichte schwacher Bindungssitze per se (Kdiss 10&supmin;¹-10&supmin;² M) eine hinreichend hohe Bindungsstärke zwischen verschiedenen Arten von Zellen bewirken kann.
Erfindungsgemäß wird ein Affinitätschromatographiesystem erzielt, bei dem die Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Liganden und anderen Substanzen durch geringe Affinität (Kdiss > 10&supmin;³ M) charakterisiert ist. Die gewünschte Spezifität wird dadurch erreicht, daß die Anzahl der mehrfach schwachen Wechselwirkungen mit der stationären Phase hinreichend groß ist, um dem System zu ermöglichen, uninteressante Moleküle außer acht zu lassen, d. h. zwischen denjenigen, die völlig unfähig sind, eine Bindung mit dem Liganden einzugehen, und denjenigen mit Affinität zu unterscheiden. Um die erfindungsgemäßen Ergebnisse zu erreichen, sollten die Eigenschaften des Trägers beispielsweise so gewählt werden (siehe unten), daß sich ein hoher Wirkungsgrad in Form einer hochgradigen Diffusivität ergibt. Ferner ist wesentlich, daß die Art des Trägermaterials ihm ermöglicht, große Volumen des aktiven Liganden (> 1 mM) zu binden. Diese Forderung würde unter anderem dadurch erfüllt, daß eine geeignete Trägerporosität gewählt und für milde Immobilisierungsbedingungen gesorgt wird.
Erfindungsgemäß wird ein isokratisches Affinitätschromatographiesystem geschaffen, bei dem verschiedene Substanzen auf der Basis ihrer Retardation getrennt werden. Dies könnte bei einer vorbereitenden Affinitätschromatographie, die ein Vielfaches der Materialverluste durch die Anwendung von Elutionsverfahren verschiedener Stärken umfaßt, von vitalem Interesse sein. Der immobilisierte Ligand zeichnet sich dadurch aus, daß er auf einem mikropartikularen Träger aus vorzugsweise porösem Material immobilisiert wird, bei dem es sich beispielsweise um ein anorganisches Material, zum Beispiel Glas oder Siliciumdioxid, oder ein organisches Material, zum Beispiel verschiedene Arten von thermoplastischen Kunststoffen oder Polysacchariden, handeln kann. Erfindungsgemäß sollte die Matrix. mikropartikular mit einer Partikelgröße von bis zu 25 um, vorzugsweise 3-10 um, sein. Das Material kann eine Porengröße von bis zu 1.000 Å, vorzugsweise 10-500 Å, haben.
Der immobilisierte aktive Ligand ist nicht auf eine spezielle Art von Ligand jenseits der beschriebenen Anforderungen an die Eigenschaften beschränkt. Beispiele solcher Liganden sind Antikörper oder deren Fragmente, Antigene oder deren Fragmente, Kohlehydrate, Enzyme mit ihren Substraten und Inhibitoren und Rezeptorwechselwirkungssubstanzen.
Früher mittels Affinitätschromatographie untersuchte Liganden zeichneten sich gewöhnlich durch ihre hohe Affinität aus, wenn sie an Ligaten gebunden waren. In der Vergangenheit waren zur Anwendung mit der Erfindung geeignete Liganden schwer zu erhalten, doch mit der Entwicklung der sogenannten Hybridomtechnologie zur Erzeugung monoklonaler Antikörper (Köhler und Milstein, Nature, 256 (1975) 495) sind Affinitätsliganden mit einer vorbestimmten, geringen Affinität derzeit reproduzierbar und in großen Mengen verfügbar. In der Praxis ist das zur Ausführung der Erfindung erforderliche Werkzeug nunmehr zugänglich.
Das nach der Erfindung angewandte Immobilisierungsverfahren hat das kennzeichnende Merkmal einer effektiven kovalenten Bindung des Liganden bei gleichzeitiger Beibehaltung einer optimalen Funktion. Bezüglich alternativer Verfahren des Ankuppelns zur Immobilisierung des Liganden sei auf Methods in Enzymology, Vol. XLIV, 1976, verwiesen. Als beispielhafte Verfahren können erwähnt werden: das Ankoppeln von Liganden an eine isocyanat-, isothiocyanat-, mercapto-, epoxy-, aldehyd-, tosyl-, carbonyldiimidazol- und bromocyan-aktivierte Matrix und das Verbinden mit aktivierten Säure- und Estergruppen an die stationäre Phase.
Das erfindungsgemäße affinitätschromatographische System ist nicht auf Anwendungsfälle beschränkt, bei denen ausschließlich eine Trennung erfolgt, sondern Kombinationen mit anderen Chromatographiearten sind ebenfalls möglich, zum Beispiel sogenannte multidimensionale Chromatographieverfahren.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels beschrieben, bei dem immobilisierte monoklonale Antikörper zur Trennung von Kohlehydrat-Antigenen verwendet werden.
a) Erzeugung monoklonaler Antikörper, die kovalent an mikropartikularem Silica-Gel immobilisiert sind:
Der in diesem Beispiel einer Untersuchung unterzogene monoklonale Antikörper ist ein Maus-IgG2a, das auf eine spezielle Kohlehydrat-Determinante gerichtet ist. Der Antikörper ist so ausgewählt, daß er eine schwache Affinität zu seinem Epitop (seiner Antigen-Determinanten) aufweist. Die schwache Bindung (Kdiss 10&supmin;³-10&supmin;¹ M) ändert sich in Abhängigkeit von den physikalischen Bedingungen (pH-Wert, Temperatur usw.). Der Antikörper wird einer Maus (Ascites) entnommen und in mehreren Schritten (einschließlich einer Ammoniumsulphat-Präzipitation und einer Protein-A-Chromatographie) gereinigt. Der Reinigungsgrad wird auf > 95% (Elektrophorese) mit einer restlichen antigenspezifischen Aktivität von > 90% geschätzt.
Eine 10 cm·5 mm große I.D.-SelectiSphere-10-Activated-Tresyl-Säule (Perstorp Biolytica, Lund, Schweden) wurde mit 40 ml H&sub2;O und 40 ml 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,5 M NaCl, pH 7,5 (Kopplungspuffer) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min gewaschen. Die Immobilisation fand in einer Maschine vom Typ Shimadzu LC 4 HPLC (Japan) statt, die mit einem UV-Detektor ausgerüstet war.
Eine Lösung von 60 ml monoklonalem Maus-IgG2a mit 2 mg/ml in einem Kopplungspuffer, der 0,1 mg/ml Kohlehydrat-Antigen zur Verhinderung einer Verbindung mit dem Antigenbindungssitz des Antikörpers enthielt, wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min gepumpt. Die Säule wurde dann mit 40 ml des Kopplungspuffers und mit 60 ml 0,2 M tris-HCl, pH 8, bei 1 ml/min gewaschen. Schutz-Kohlehydrat-Antigen wurde eluiert mit 10 ml 0,1 M Citrat, pH 3,0, bei 1 ml/min. Alle Prozesse wurden bei Zimmertemperatur, 20-22ºC, ausgeführt. Eine Bezugssäule ohne monoklonales Maus- IgG2a wurde analog obigem hergestellt.
Das Volumen des immobilisierten Maus-IgG2a wurde auf 95 mg/g Siliciumdioxid (trocken) abgeschätzt. Der immobilisierte Antikörper war voll aktiv, wenn er an sein Kohlehydrat-Antigen gebunden war, was bedeutet, daß die Konzentration des aktiven immobilisierten Liganden etwa 0,8·10&supmin;³ M betrug (2 Kohlehydrat-Antigene binden offenbar jeden Antikörper).
b) Chromatographie mit monoklonalem Antikörper- Siliciumdioxid:
Die oben beschriebenen Säulen wurden in einer Varian LC 440 (USA) mit RI/UV-Detektor eingesetzt. Die gesamte Chromatographie wurde bei Zimmertemperatur, 20-22ºC, und Normaldruck von 30 atm bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min und Injektionsvolumen von 10 ul ausgeführt. Die angewandte mobile Phase war 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,5.
Eine Vielzahl verschiedener Kohlehydrat-Antigene mit verschiedenen Affinitätsgraden wurden in dem chromatographischen System untersucht. Diese Kohlehydrat-Antigene wurden durch die Säule retardiert und ergaben k' = 0,3-0,8. Die erreichten Retardationen entsprachen einem Kdiss von 10&supmin;²-10&supmin;³ M. Die Analysezeit betrug < 5 min. Der Säulen-Wirkungsgrad für diese Antigene wurde auf etwa 10&sup4; Platten pro m oder alternativ auf 0,1 mm Höhe der theoretischen Platte geschätzt.
Das erzielte Ergebnis bedeutet, daß das vorstehend als Beispiel beschriebene Affinitätssystem eine hohe Leistung, ausgedrückt in Diffusivität und Geschwindigkeit, aufweist. Das Ergebnis sollte mit einer herkömmlichen Affinitätschromatographie verglichen werden, die mit Plattenzahlen von etwa 10&supmin;²-10&supmin;³ Platten/m arbeitet.

Industrielle Anwendung

Die Anwendung eines Hochleistungs-Affinitätschromatographiesystems (HPLAC), das sich durch schwache Wechselwirkung mit inherenter erwünschter Selektivität auszeichnet, kann zu einer Verbesserung derzeitiger Chromatographieverfahren führen. Der Bereich der Anwendung zum Trennen im weitesten Sinne wird erheblich erweitert. In diesem Zusammenhang umfaßt das Anwendungsgebiet der Erfindung analytische und präparative Anwendungen, beispielsweise zur Diagnose und Charakterisierung molekularer Wechselwirkungen sowie zur milden und raschen Isolation beispielsweise medizinischer Substanzen und diagnostischer Reagenzien von verschiedenen Basismedien, zum Beispiel Fermentationslösungsmitteln, Synthesemedien und Blutseren.

Claims

1. Adsorbens für die Trennung von Substanzen mit isokratischer Affinitätschromatographie, bei dem Liganden von Antikörpern oder Fragmenten derselben, Antigene oder Fragmente derselben, Kohlenwasserstoffe, Enzyme mit Substraten und Inhibitoren, mit Rezeptoren in Wechselwirkung tretende Substanzen usw. mit einem stationären, mikropartikulären Träger aus anorganischem Material, zum Beispiel Glas oder Siliciumdioxid, oder organischem Material, zum Beispiel verschiedenen Polymeren, nach an sich bekannten Verfahren mit einer isocyanat-, isothiocyanat-, mercapto-, epoxyd-, aldehyd-, tosyl-, tresyl-, carbonyldiimidazol- und einer bromcyan-activierten Matrix verbunden und an aktivierte Säure- und Estergruppen in stationärer Phase gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden gleichermaßen geeignet sind zur Erzielung einer gleichen, schwachen und gleichförmigen Bindungsstärke zwischen Ligat und Ligand mit einer thermodynamischen Dissoziationskonstanten

Kdiss > 10&supmin;³ [M], wobei

wobei

kass = Konstante der Assoziationsgeschwindigkeit [M&supmin;¹s&supmin;¹]

kdiss = Konstante der Dissoziationsgeschwindigkeit [s&supmin;¹]

CTOT = Konz. der aktiven Liganden [M]

CSL = Konz. des SL-Komplexes [M]

CS = Konz. der freien Substanz [M]

SL = in der stationären Phase gebundene Substanz.

2. Adsorbens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Kapazitätsfaktor

wobei die Bezeichnungen die oben angegebene Bedeutung haben und k' = 0,2 bis 50 ist.

3. Adsorbens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kapazitätsfaktor k' = 1 bis 50 ist.

4. Adsorbens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand aus einem monoklonalen Antikörper oder Fragmenten desselben besteht.

5. Verfahren zum Herstellen eines Adsorbens nach Anspruch 1 mit einem festen, mikropartikulären Träger und einem kovalent mit diesem verbundenen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung in einem Bindungspuffer von genau gleichen Liganden und mit einer Bindungsfestigkeit zwischen Ligat und Ligand mit einer thermodynamischen Dissoziationskonstanten Kdiss > 10&supmin;³ [M] auf dem Träger immobilisiert wird.

6. Anwendung von Adsorbienten nach Anspruch 1 mit identischen Liganden, die kovalent mit einem festen, mikropartikulären Träger verbunden sind, der eine Bindungsfestigkeit zwischen Ligaten und Liganden mit einer thermodynamischen Dissoziationskonstanten > 10&supmin;³ zur Trennung dieser Substanzen aufweist, durch das Adsorbens verlangsamt und durch die Probenlösung allmählich eluiert werden.