DE68920140T2 - Gerät und verfahren zur schnellen qualitativen und quantitativen bestimmung der anwesenheit eines reaktiven liganden in einer flüssigkeit. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verf ahren zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit. Die Erfindung betrifft insbesondere, jedoch ohne eine Einschränkung darzustellen, den Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern oder Antigenen in einer biologischen Flüssigkeit, den Nachweis von toxischen Substanzen, Viren oder Bakterien in einer beliebigen Flüssigkeit (Wasser, flüssige Produkte der Nahrungsmittelindustrie, Industrieabwässer, biologische Flüssigkeiten etc.), die chemische Bestimmung von Substanzen (wie Hormone, Vitamine, Enzyme, Medikamente etc.), die in einer Flüssigkeit (insbesondere biologische Flüssigkeiten) vorhanden sind.
• Die Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von antigenen Substanzen in biologischen Flüssigkeiten auf immunologischem Wege sind gegenwärtig gut bekannt. Sie basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden antigenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern. Hierbei kann eine Komponente des Komplexes mit einem radioaktiven Element (wie beispielsweise ¹²&sup5;I) markiert sein, um seine Detektion und/oder seine quantitative Analyse nach der Trennung des markierten und komplexierten Antigens oder Antikörpers von dem markierten nicht-komplexierten Antigen oder Antikörper zu ermöglichen.
• Bei den immunologischen Bestimmungsverfahren nach dem Konkurrenzprinzip konkurriert die antigene Substanz, die in der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe enthalten ist, mit einer bekannten Menge an markiertem Antigen um eine begrenzte Anzahl an Fixierungsstellen des Antikörpers: Die Menge an markiertem Antigen, die an den Antikörper gebunden ist, ist umgekehrt propor- tional zu der Menge an Antigen, die in der Probe enthalten ist.
• Bei immunometrischen Tests wird ein markierter Antikörper eingesetzt: Die Menge an markiertem Antikörper, die an dem Komplex beteiligt ist, ist proportional zu der Menge der antigenen Substanz, die in der Probe enthalten ist.
• Bei immunometrischen Tests, die speziell für den Nachweis polyvalenter Antigene, d.h. antigener Substanzen, die in der Lage sind, mit mindestens zwei Antikörpern gleichzeitig einen Komplex zu bilden, geeignet sind, wird eine Menge an nicht-markiertem Antikörper, verbunden mit einem in der zu analysierenden Flüssigkeit unlöslichen Feststoff verwendet sowie eine Menge eines löslichen Antikörpers, der einen Marker wie ein radioaktives Isotop trägt, der die Detektion oder die quantitative Bestimmung des ternären Komplexes erlaubt, der sich zwischen dem Antikörper in fester Phase, dem Antigen und dem markierten Antikörper gebildet hat. Bei diesen Verfahren wird zunächst der mit der festen Phase verbundene Antikörper mit der Analysenprobe in Kontakt gebracht, um durch Bildung eines binären Komplexes zwischen dem Antikörper der festen Phase und dem Antigen das Antigen aus der Probe zu extrahieren. Nach einer Inkubationsperiode wird der feste Träger gewaschen, um daraus den Rest der flüssigen Probe, worin möglicherweise nicht-umgesetztes Antigen enthalten ist, zu entfernen, anschließend wird er mit einer Lösung, die eine bekannte Menge des markierten Antikörpers enthält, in Kontakt gebracht. Nach einer zweiten Inkubationsperiode, um dem markierten Antikörper die Komplexbildung mit dem Antigen zu erlauben, das über den intermediären nicht-markierten Antikörper mit dem festen Träger verbunden ist, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um markierten Antikörper, der nicht reagiert hat, zu entfernen. Anschließend wird die Anwesenheit des markierten Antikörpers auf dem gewaschenen festen Träger detektiert (beispielsweise durch Messung der emittierten Strahlung, wenn der Marker ein radioaktives Element ist) und gegebenfalls einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung unterworfen.
• Diese Verfahren sind unter den Bezeichnungen "sandwich" oder "bi-site" bekannt, aufgrund der Tatsache, daß das Antigen zwei Antikörper trägt, die an zwei verschiedenen Stellen mit seiner Oberfläche verbunden sind. Sie werden von WIDE in "Radioimmuno assay Methods" (Kirkham und Hunter, E. und S. Livingston Herg., Edinbourgh, 1970, S. 199- 206) beschrieben. Spezielle Anwendungen (Suchtest für das Hepatitis betreffende Antigen) sind in der amerikanischen Patentschrift Nr. 3 867 517 beschrieben, Varianten dieser Verfahren ("simultan" oder "invers") werden von JEONG et al. in "Comparison of RIA with a single-incubation two-site immunoradiometric assay (IRMA) as applied to the determination of human thyroid stimulating hormone (HTSH)", Bio-Rad Laboratories, 1979; in dem amerikanischen Patent Nr. 4 174 384 (Markierung von zwei Antikörpern durch einen Fluoreszenzchromophor (Fluorescein) und durch einen Chromophor, der das von Fluorescein emittierte Licht absorbiert); und im amerikanischen Patent Nr. 4 098 876 beschrieben. Für diese Verfahren wurden ursprüngliche polyklonale Antikörper verwendet, deren Empfindlichkeit unzureichend ist, weil eine Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen besteht. In dem französischen Patent HYBRITECH Nr. 81 15030, veröffentlicht unter der Nummer 2 487 983, wurde vorgeschlagen, in diesen immunometrischen Tests die polyklonalen Antikörper durch monoklonale Antikörper zu ersetzen, um in erheblichem Maße die Empfindlichkeit dieser Verfahren zu steigern.
• In dem französischen Patent LIOTTA Nr. 82 16973, veröffentlicht unter der Nummer 2 514 511, werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, und zwar durch das ELISA-Verfahren, wobei auf die erforderlichen Verdünnungs- und Waschoperationen vollständig verzichtet wurde, und die Dauer der Inkubationsperiode verringert wurde. Die vorgeschlagene Vorrichtung umfaßt eine Matrix aus einem Streifen aus Nitrozellulose- oder Diazobenzyloxymethyl (DBM)-Papier, einem porösen Gel, Polyacrylamid, Agarose oder Collagen, in dessen Poren das Antigen eingeschlossen bzw. festgehalten wird, oder es kann mit dem Gel über die Aminogruppen des Liganden und die in der Matrix vorhandenen Carboxylgruppen vernetzt werden, oder auch aus einem Zellulosestreifen oder aus Kunststoffasern, in deren Innerem Teilchen oder Kugeln, die den Liganden enthalten, eingeschlossen sind bzw. festgehalten werden. Gemäß diesem Patent von LIOTTA umfaßt die Vorrichtung: - eine erste Zone, die Antigene oder Antikörper, verknüpft mit einem Enzym, enthält, wobei diese Antikörper in dieser ersten Zone so angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone eliminiert werden, wenn sie mit den Antigenen (nicht-verknüpft) reagiert haben, die in der zu testenden Probe, die die erste Zone durchdringt, enthalten sind, daß sie aber in Abwesenheit solcher Antigene nicht elimiert werden, - eine zweite Zone, enthaltend eine Substanz, die in der Lage ist mit den Antikörpern zu reagieren, die mit einem Enzym verknüpft sind, das zu einer Farbreaktion führt, wodurch die Anwesenheit der Antikörper nachgewiesen wird. Genauer gesagt, umfaßt die immunologische Analysenvorrichtung, die in dem Patent von LIOTTA beschrieben wird, ein Schichtmaterial mit drei porösen Matrixschichten, wobei die erste mit einem spezifischen Antikörper, verknüpft mit einem Enzym imprägniert ist, die zweite poröse Schicht ein immobilisiertes (gebundenes) Referenzantigen enthält, und die dritte Schicht ein Substrat zur Farbbildung enthält, das mit dem an den Antikörper gebundenen Enzym reagiert. Das zu analysierende freie Antigen, das in der Analysenprobe vorhanden ist, diffundiert nachdem es mit der ersten Schicht in Kontakt gebracht worden ist, in die zweite und anschließend in die dritte Schicht. Das in der Probe vorhandene freie Antigen konkurriert mit dem in der zweiten Schicht gebundenen und immobilisierten Referenzantigen, um die Bindung an den mit einem Enzym verknüpften Antikörper. Wenn der mit einem Enzym verknüpfte Antikörper sich mit dem freien Antigen verbindet, diffundiert er frei in die dritte Schicht und führt zu einer Farbreaktion. Wenn im Gegensatz dazu die zu analysierende Probe kein Antigen enhält, besitzen alle mit einem Enzym verknüpften Antikörper freie Bindungsstellen, und sie binden an das immobilisierte Antigen, das in der zweiten Schicht vorhanden ist: Der mit einem Enzym verknüpfte Antikörper, der an ein immobilisiertes Antigen in der zweiten Schicht bindet, diffundiert nicht in die dritte Schicht und es findet keine Farbreaktion statt. In dem französischen Patent LIOTTA 87 08007, veröffentlicht unter der Nummer 2 599 845 wird eine Variante dieser Vorrichtung beschrieben, die nur zwei Schichten umf aßt, wobei die obere Schicht das Antigen mit den zwei reaktiven Antikörpern trägt und die untere Schicht ein farbbildendes Substrat enthält, wobei die zwei Zonen, die Einfangzone und die Substratzone, ebensogut nebeneinander angeordnet sein können. Die porösen Schichten durch die das Antigen der Probe, verbunden mit dem mit einem Enzym verknüpften Antikörper, diffundiert haben daher die Aufgabe eines selektiven Filters, der nur das Antigen, gebunden and den mit einem Enzym markierten Antikörper, passieren läßt, der jedoch nicht funktioniert, wenn der Antikörper nicht mit dem Antigen verbunden ist, d.h. in Abwesenheit des Antigens.
• In dem amerikanischen Patent HYBRITECH Nr. 4 632 901 und der entsprechenden internationalen PCT-Anmeldung Nr. 85/05451 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von Immunoassays beschrieben, bei denen das Zurückgreifen auf lange Inkubationszeiten in Verbindung mit mehreren Waschvorgängen nicht notwendig ist und die aufgrund ihrer Einfachheit die Durchführung durch den Arzt während der Sprechstunde oder sogar zuhause durch den Patienten erlauben. Die fragliche Vorrichtung umfaßt ein erstes Element, das porös ist, und der aus einer Membran oder einem Filter an die oder an das ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gebunden ist, der das Antigen, das identifiziert werden soll erkennt, und ein zweites Element, welches absorbiert und das senkrecht zur oberen und unteren Oberfläche Kapillarpassagen enthält. Dieses zweite Element steht in kapillarer Verbindung mit der porösen Membran oder dem Analogen, die das erste Element der Vorrichtung darstellen und es weist eine solche Porendimension auf, daß sie das Hindurchtreten der Flüssigkeit durch das erste Element ohne Anwendung äußerer Mittel induziert. Die poröse Filtermembran kann aus Nylon bestehen, das NH&sub2;-Gruppen trägt, mit denen die Antikörper durch Kupplung mittels Glutaraldehyd kovalent verknüpft sind, und das Absorptionselement kann ein faseriges Filtriermaterial sein, wie Acetatzellulosefasern, Polyesterfasern, Polyolef infasern etc. Diese zwei Elemente können durch ein weiteres poröses Element (beispiels- weise aus Polyethylen) getrennt sein, das den Antikörper nicht auf unspezifische Weise fixiert und das verhindert, daß markierter Antikörper auf unspezifische Weise an der oberen Oberfläche des Absorptionselements fixiert wird.
• Genauso wird in der europäischen Patentanmeldung ABBOTT LABORATORIES Nr. 186 100 eine Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit und der Menge einer Substanz in einer Testprobe beschrieben, die eine poröse nicht-absorbierende Fasermatrix, beispielsweise aus Glas, umfaßt, imprägniert mit einem hydrophoben Polymeren, das einen Oberflächenüberzug auf mindestens einem Teil der Matrix bildet und an das ein Reagens, beispielsweise ein Antikörper oder ein Antigen gebunden ist, das mit der gesuchten Substanz in der Probe reagieren kann, wobei die Vorrichtung weiterhin eine darunterliegende Schicht aus einem absorbierenden Material und/oder eine Schicht aus einem Fasermaterial, wie Glasfasern oder Zellulosefilterpapier umfassen kann, die die Fasermatrix bedeckt und die Rolle eines "Vorfilters" spielen kann.
• In der europäischen Patentanmeldung MUREX CORPORATION Nr. 206 561 wird gleichermaßen eine diagnostische Vorrichtung beschrieben, die ein Filterelement, enthaltend mindestens eine Reaktionszone in Verbindung mit einer periphären Zone ein Absorptionselement, das auschließlich mit der periphären Zone des ersten Elements in Verbindung steht und ein Element, das den Filter in der geeigneten Position hält, umfaßt. Die "Reaktion", die in der Reaktionszone stattfindet, kann genausogut eine Trennung durch Filtration wie eine immunologische Kupplung sein, und in dieser Zone erscheinen auch die registrierbaren Signale der Reaktion. Die zu testende flüssige Probe gelangt durch einen Trichter auf das Filter, dessen Auslaßöffung so berechnet ist, daß ihr Durchmesser in Kombination mit dem Druck der Flüssigkeit in dem Trichter ausreicht, daß die Flüssigkeit sich auf die obere Oberfläche des Filters entleert, diese letztere aber nicht durchdringt, wobei anschließend der hydrostatische Druck so eingestellt wird, daß die Flüssigkeit aufgrund der Schwerkraft in das Filter eindringt und durch die Kapillarwirkung durch letzteres hindurchdiffundiert, ohne senkrecht von Teil zu Teil hindurchzudringen.
• Allen diesen Vorrichtungen ist das Vorhandensein eines porösen Filterelements gemeinsam, durch die die flüssige Testprobe strömt, wobei gegebenenfalls Mittel vorgesehen sind, um das Strömen der Flüssigkeit zu verlangsamen. Ein solches Filterele- ment läßt jedoch keine ausreichende Kontaktzeit zwischen dem an das Filterelement gebundenen Reagens und der gesuchten Substanz in der flüssigen Probe zu, und sie erlaubt aus diesem Grunde nicht eine Reaktion zu erhalten mit einer Empfindlichkeit wie sie für den Nachweis sehr geringer Konzentrationen der genannten Substanz in der Probe geeignet wäre; darüberhinaus kann das Strömen der Probe, die gegebenenfalls einen Ligand-Rezeptor-Komplex, wie insbesondere einen Antigen-Antiköper-Komplex enthält durch ein Filterelement Ablesefehler verursachen.
• Die vprliegende Erfindung hat folglich die Aufgabe, eine Vorrichtung oder ein Verfahren zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit bereitzustellen, die den Erfordernissen der Praxis besser entsprechen als die Vorrichtungen und Verfahren mit demselben Ziel, die im Stand der Technik vorgeschlagen wurden, und zwar insbesondere indem die erfindungsgemäße Vorrichtung einer gegenüber dem im Stand der Technik angegebenenen stark überlegene Empfindlichkeit aufweist, weil sie sehr geringe Ligandenkonzentrationen, insbesondere von Antigenen in einer Flüssigkeit, insbesondere in biologischen Flüssigkeiten, nachweisen kann, die so niedrig wie 5 Picogramm sein können, während die Verfahren des Standes der Technik den Nachweis so geringer Konzentrationen nicht zulassen und erst ab einigen ug empfindlich sind; indem sie es erlaubt zwei Reaktionen zwischen einem Reagens und einer nachzuweisenden Substanz an zwei vollständig getrennten Stellen durchzuführen, was zu sehr spezifischen Reaktionen führt, und auf diese Weise mit Sicherheit Kreuzreaktionen und falsche positive oder negative Ergebnisse verhindert, ohne auf die Konkurrenzverfahren zurückzugreifen; indem bei ihr mehrere Typen monoklonaler Antikörper gleichzeitig eingesetzt werden können, und sie sich für alle Arten des Lesens der Ergebnisse, wie Kolorimetrie, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Radioaktivität etc. eignet, und indem sie erlaubt, quantitative Analysen zu realisieren.
• Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, des Typs, umfassend eine Reaktionszone, die ein markiertes Reagens, insbesondere einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen, der bzw. das mit dem gesuchten Liganden reagieren kann, enthält und eine Nachweiszone, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Kombination umfaßt:
• - eine erste Reaktionszone, die eine zumindest zeitweilig undurchlässige Membran umfaßt, wobei die Zone für die Aufnahme einer zu testenden Flüssigkeitsprobe vorgesehen ist und wobei die Membran zur Assoziation mit mindestens einem in geeigneter Weise markierten Reagens, das den bzw. die gesuchten Liganden, der bzw. die gegebenenfalls in der Probe enthalten ist bzw. sind, erkennen kann und mit Mitteln, um die Membran permeabel zu machen, vorgesehen ist,
• - eine zweite Reaktionszone, die sich von der ersten unterscheidet, und mindestens zeitweise von dieser durch die vorstehend erwähnte Membran isoliert ist, umfassend eine feste Phase, die ein nicht-markiertes Referenzreagens enthält, das den bzw. die Liganden, die identifiziert werden sollen, erkennen kann und die mindestens zeitweise gegen die Seite, die derjenigen, in der sich die erste Membran befindet, gegenüberliegt durch eine zweite Membran, die mindestens zeitweise undurchlässig ist, abgeschlossen ist und
• - eine dritte Reaktionszone, die mindestens zeitweise gegen die vorstehend erwähnte zweite Reaktionszone durch die zweite Membran isoliert ist, die Mittel zum Nachweis der Reaktion, die gegebenenfalls in der ersten oder zweiten Reaktionszone abgelaufen ist, enthält, wobei die Vorrichtung weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine der beiden vorstehend erwähnten Membranen aus einem Material hergestellt ist, das während einer ersten Zeitspanne, die ausreicht, die Reaktion, die in der Reaktionszone von Interesse ablaufen soll, ablaufen zu lassen, undurchlässig ist, wobei das Material so ist, daß es nach dieser ersten Zeitspanne permeabel gemacht wird, um Produkte der abgelaufenen Reaktion gegen die nachfolgende Reaktionszone fließen zu lassen, wobei die Mittel, um die Membran bzw. die Membranen permeabel zu machen, eine Substanz zur Auflösung oder ein Mittel zur Lyse der Membran bzw. der Membranen sind.
• Gemäß einer Ausführungsform der erf indungsgemäßen Vorrichtung sind die Mittel, um die Membran bzw. die Membranen permeabel zu machen, von der betroffenen Membran unabhängig. Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Mittel, um die Membran bzw. die Membranen permeabel zu machen, in die betroffene Membran eingearbeitet. Gemäß einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die zur Realisierung der vorstehend erwähnten Membran bzw. der vorstehend erwähnten Membranen verwendeten mindestens teilweise undurchlässigen Materialien, ausgewählt aus der Gruppe, die insbesondere Kohlenhydrate, Proteine, insbesondere Gelatine, Lipide und Kunststoffmaterialien, umfaßt.
• Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, ist die erste Reaktionszone geeignet für die Aufnahme einer festen Phase, die bevorzugt auf der ersten Membran aufgebracht ist, die mindestens ein in geeigneter Weise markiertes Reagens enthält, das gegebenenfalls mit einem Mittel zur Lyse der Membran assoziiert ist.
• Erfindungsgemäß ist das markierte Reagens auf geeignete Weise markiert, insbesondere durch ein Enzym, durch ein Radioisotop, durch ein chemisches Produkt mit einem Fluoreszenzchromophor oder einem Chemilumineszenzchromophor und es kann sich bevorzugt um einen Antikörper oder ein Antigen handeln.
• Gleichermaßen ist erfindungsgemäß das Material, aus dem mindestens die erste Membran besteht, so geschaffen, daß diese nach einer geeigneten Zeit durch die wäßrige flüssige Phase der zu testenden Probe aufgelöst wird.
• Erfindungsgemäß besteht das Mittel zur Erreichung der Permeabilität aus einem Mittel zur Lyse, wie einem geeigneten Enzym, der betreffenden Membran, das entweder in diese eingearbeitet sein kann oder durch Einführen in die erfinddungsgemäße Vorrichtung mit der Membran assoziiert sein kann oder mit der festen Phase, die das vorstehend erwähnte Reagens enthält, assoziiert sein kann.
• Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht die feste Phase, die ein nicht-markiertes Referenzreagens enthält und die sich in der zweiten Reaktionszone befindet, aus einem unlöslichen Träger, auf dem das Reagens, insbesondere ein Antikörper oder ein Antigen, das nicht markiert ist, fixiert ist, das dem nachzuweisenden Liganden entspricht, wobei der unlösliche Träger ausgewählt ist, aus der Gruppe, umfassend insbesondere Mikrokugeln, Mikroplatten bzw. Mikroplaques und andere.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, enthält die dritte Reaktionszone ein chromogenes Substrat, wenn das Ablesen der Reaktion kolorimetrisch vorgenommen werden soll. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthält die Vorrichtung zwischen der ersten und der zweiten Reaktionszone eine intermediäre Zone, die ein markiertes Reagens enthält, wobei in diesem Fall die erste Reaktionszone ein nicht-markiertes Reagens enthält.
• Bei einer bevorzugten Vorrichtung dieser Ausführungsform umfaßt die intermediäre Zone mindestens eine Schicht aus mehrschichtigen vesikulären Strukturen, in die mindestens ein Reagens, das nach Ablauf einer geeigneten Zeit durch ein geeignetes Lysemittel, insbesondere ein Enzym, freigesetzt werden kann, eingearbeitet ist. Bei einer weiteren bevorzugten Vorrichtung dieser Ausführungsform wird die intermediäre Zone aus einer intermediären Membran gebildet, die zwischen der ersten Membran und der zweiten Reaktionszone angebracht ist, wobei an die intermediäre Membran bevorzugt ein markiertes Reagens gebunden ist und in diesem Fall an die erste Membran ein Reagens der gleichen Art wie die intermediäre Membran gebunden ist.
• Die Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die drei Reaktionszonen umfaßt, erlaubt qualitative Bestimmungen des Vorhandenseins oder Nicht-Vorhandenseins von reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit durchzuführen, inbesondere von Antigenen oder Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit.
• Die Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die eine ergänzende Schicht umfaßt, erlaubt es, semi-quantitative Analysen solcher Liganden durchzuführen.
• Erfindungsgemäß ist es gleichermaßen möglich quantitative Analysen zu realisieren, indem die dritte Zone der Vorrichtung mit einer an sich bekannten Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung, wie eine RIA, einem Spektrophotometer etc. verbunden wird.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, sind die Reaktionszonen übereinander angeordnet, um eine obere Schicht, die die erste Reaktionszone enthält, eine mittlere Schicht, die die zweite Reaktionszone enthält, und eine untere Schicht, die die dritte Reaktionszone enthält, und gegebenenfalls eine Zwischenschicht zwischen der oberen und der mittleren Schicht, die die intermediäre Reaktionszone enthält, zu bilden.
• Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlauf einer ersten Stufe eine zu analysierende Probenflüssigkeit mit einem markierten Reagens, insbesondere einem markierten Antikörper oder einem markierten Antigen in einer zeitweise gegen die Zonen, in denen die nachfolgenden Verfahrensstufen stattfinden, isolierten Zone, eine ausreichende Zeitlang in Kontakt gebracht wird, um den Ablauf der Reaktion zwischen dem Liganden und dem Reagens zu gestatten, wobei nach Ablauf dieser Zeit die Isolierung der Zone, in der die Reaktion stattgefunden hat, mit Hilfe einer geeigneten Substanz zur Auflösung oder eines geeigneten Lysemittels, die bzw. das in der Zone vorhanden ist, die bzw. das gleichzeitig mit der Flüssigkeit gegen eine zeitweise undurchlässige Membran, die bei Kontakt mit der Substanz oder dem Mittel aufgelöst wird, transportiert wird, aufgehoben wird - die schrittweise und programmierte Auflösung oder Lyse der Isolierungsmembran findet gleichzeitig mit der Reaktion statt - um zu gestatten, daß das gegebenenfalls vorhandene Reaktionsprodukt im Verlauf einer zweiten Stufe mit einem zweiten nicht-markierten Reagens, das dem Liganden, der in der Flüssigkeitsprobe nachgewiesen werden soll, entspricht in einer zweiten Zone, die zeitweise gegen die Zone, die darauffolgt isoliert ist, in Kontakt tritt, wonach die Isolierung der zweiten Zone schrittweise, programmiert und gleichzeitig mit Hilfe der Substanz zur Auflösung oder des Lysemittels aufgehoben bzw. unterbrochen wird, um zu gestatten, daß das Produkt der ersten oder der zweiten Reaktion im Verlauf der dritten Verfahrensstufe mit Mitteln zum Nachweis des Vorhandenseins - oder des Fehlens - des nachzuweisenden Liganden in Kontakt tritt.
• Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wird die Flüssigkeitsprobe im Verlauf der ersten Verfahrensstufe mit einem nicht-markierten Reagens in Kontakt gebracht und der zweiten Verfahrensstufe geht eine intermediäre Stufe voraus, im Verlauf derer der im Verlauf der ersten Stufe gebildete Komplex aus Ligand und nicht-markiertem Reagens mit einem markierten Reagens der gleichen Art wie das in der ersten Stufe verwendete Reagens in einer zeitweise gegen die nachfolgende Stufe isolierten Zone in Kontakt gebracht wird.
• Gemäß einer bevorzugten Form dieser Ausführungsform, wird das während der ersten Verfahrensstufe mit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe in Kontakt gebrachte nicht-markierte Reagens in einer bestimmten Menge, die einer bekannten Menge des Liganden, wie dem der nachgewiesen werden soll, entspricht, eingebracht, wobei der Ligand der im Überschuß vorhanden ist, d.h. der an das Reagens im Verlauf der ersten Stufe nicht gebunden worden ist, im Verlauf der intermediären Verfahrensstufe durch das markierte Reagens eingefangen wird, auf dem der Überschuß des Liganden gebunden wird, woraus folgt, daß die Reaktion zum Nachweis des eventuellen Vorhandenseins des Liganden in der Analysenflüssigkeit nur dann positiv ist, wenn der Gehalt des Liganden in der Flüssigkeit größer als diese Menge ist, was somit eine semi-quantitative Bestimmung des in der Flüssigkeit vorhandenen Liganden gestattet.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, ist die erste Verfahrensstufe eine Phase der Absorption und die zweite Verfahrensstufe eine Phase der Desorption, während die dritte Verfahrensstufe eine Phase der Absorption ist.
• Wenn das erfindungsgemäße Verfahren eine intermediäre Stufe zwischen der ersten und der zweiten Verfahrensstufe umfaßt, ist diese intermediäre Stufe, wie die erste Stufe, eine Absorptionsphase.
• Von den vorstehend angegebenen Vorrichtungen abgesehen, umfaßt die Erfindung noch weitere Vorrichtungen, die aus der nachfolgenden Beschreibung deutlich werden.
• Mit Hilfe der nachfolgenden ergänzenden Beschreibung, ist die Erfindung leichter zu verstehen. Es wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, worin
• - Figur 1 eine schematische Darstellung eines senkrechten Schnittes durch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist,
• - Figur 2 ein Schema der Verfahrensstufen der qualitativen Bestimmung des Vorhandenseins von Antigenen wiedergibt,
• - Figur 3 ein Schema der Verfahrensstufen der qualitativen Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern wiedergibt und
• - Figur 4 die Kurve der quantitativen Analyse von ACE wiedergibt, das im menschlichen Serum vorhanden.
• Selbstverständlich sind jedoch diese Zeichnungen und die entsprechenden Teile der Beschreibung nur zur Erläuterung des Erfindungsgegenstandes angegeben, und sie stellen in keiner Weise eine Einschränkung dar.
• Die erfindungsgemäße Vorrichtung, dargestellt in Figur 1, umfaßt von unten nach oben einen Träger 7, der eine Tablette des chromogenen Substrats 6 trägt, über dieser ist eine Membran 3' angeordnet, die weiter unten genauer beschrieben wird. Über dieser Membran 3' ist eine Schicht von Mikrokugeln 5 angeordnet, die später in dieser Beschreibung genauer beschrieben werden. Die Mikrokugeln sind vorteilhafterweise, aber nicht notwendigerweise, gegenseitig durch Schutzschichten geschützt, die aus geeigneten Materialien bestehen können, insbesondere aus Textil. Eine zweite Membran 3 ist oberhalb der Mikrokugelschicht 5 angebracht, die Struktur 2 bildet zusammen mit dem Träger 7 und einem intermediären Rahmen 8 das Gerüst der Vorrichtung. In die Ausbuchtung 9, in der Form eines Ausschnittes in der Struktur 2, wird eine Tablette 1, bevorzugt lyophilisiert, eines Reagens eingesetzt, das den Liganden erkennt, der mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung nachgewiesen werden soll.
• Die Liganden, die mit Hilfe dieser Vorrichtung nachgewiesen werden sollen, sind Antigene und Antikörper aber auch alle Arten von chemischen oder biologischen Substanzen. Die Anwendungsmöglichkeiten für das Verfahren und die Vorrichtung gemäß dieser Erfindung sind zahlreich, unter anderem können angegeben werden: Die Diagnose von Viruserkrankungen und mikrobiellen Erkrankungen, Enzymanalysen, die Erkennung von Autoimmunerkrankungen und der Alzheimer'schen Krankheit, die Krebsfrüherkennung, die rasche Blutgruppenbestimmung, die Analyse zirkulierender Medikamente, der Nachweis von Allergenen und die Diagnose von Allergien, die Analyse von Membranrezeptoren, die Analyse von Hormonen, die Analysen von chemischen Elementen, insbesondere der Anionen und der Kationen des Ionogramms. Selbstverständlich ist diese Aufzählung weder erschöpfend noch einschränkend.
• Die Reagentien, die den nachzuweisenden Liganden erkennen, sind im wesentlichen Antikörper oder Antigene, die bevorzugt im lyophilisierten Zustand, in Form der Tabletten 1 eingesetzt werden.
• Die Antikörper oder die Antigene, die in der Tablette 1 enthalten sind, sind Antikörper oder Antigene, die mit einem geeigneten Marker, wie einem Radio-Isotop, einem Enzym, einer fluores- zierenden Substanz, einem chemischen Produkt, das in der Lage ist, mit einem geeigneten Substrat eine Farbreaktion zu ergeben etc., markiert.
• Die Membran 3, die die obere Schicht der Vorrichtung bildet, wird aus einem Material hergestellt, das zeitweise undurchlässig ist, und zwar während eines Zeitraums der ausreicht, um einen Tropfen der zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe, der mit Tablette 1 in Kontakt gebracht worden ist, reagieren zu lassen, um, falls die Flüssigkeit tatsächlich den nachzuweisenden Liganden enthält, einen Komlex des Liganden mit dem markierten Antikörper oder dem markierten Antigen zu bilden. Hierbei verliert die Membran 3 am Ende dieses Zeitraums ihre Undurchlässigkeit, um die gesamte Flüssigkeit, die gegebenenfalls den genannten Komplex enthält, passieren zu lassen, und zwar bis zur mittleren Schicht.
• Es ist günstig, die Membran 3 aus einem solchen Material herzustellen, das unter normalen Bedingungen undurchlässig ist, das jedoch im Bereich von 20 Sekunden bis 10 Minuten durch ein geeignetes Enzym aufgelöst wird. Falls die Membran 3 aus Gelatine besteht, ist das eingesetzte Enzym zur Lyse günstigerweise Kollagenase. Es ist vorteilhaft, wenn das Enzym zur Lyse der Gelatine in der Tablette 1 des Antikörpers oder des Antigens enthalten ist, wobei der notwendige Zeitraum, damit der Ligand und das in der Tablette 1 enthaltene Reagens (Antikörper oder Antigen) miteinander reagieren in der gleichen Größenordnung liegt wie der Zeitraum, den das Lyseenzym für das Auflösen der Membran 3 benötigt. Es kann günstig sein, die Membran 3 aus Gelatine zu verstärken, indem man eine Struktur aus Glasfasern darin einbettet, die nach dem Auflösen der Gelatine das Skelett der Membran 3 darstellt. Weiter unten sind noch weitere Beispiele für Membranen angegeben, die sich für den Einsatz im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen.
• Die mittlere Schicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfaßt eine Schicht 5 aus Mikrokugeln, die aus allen geeigneten Materialien, wie Metallen oder ihren Legierungen, Polyacrylamid etc. hergestellt sein können, die Variabeldurchmesser im Bereich von 10 bis 250 um aufweisen können, und die ein Reagens (Antigen oder Antikörper), das dem nachzuweisenden Liganden ähnlich oder mit diesem identisch ist, tragen, das dazu bestimmt ist, die markierten Reagentien zurückzuhalten, die in der obersten Schicht frei bzw. ungebunden geblieben sind.
• Wenn man unter diesen Bedingungen ein Antigen in einem Tropfen einer biologischen Flüssigkeit sucht, bindet im Fall der positiven Reaktion das in der Flüssigkeit vorhandene Antigen an den in der Tablette 1 auf der Membran 3 enthaltenen Antikörper. Die Membran wird durch ein geeignetes Enzym aufgelöst, sobald die vorstehend genannte Reaktion stattgefunden hat; die Flüssigkeit, die den Komplex aus Antigen und Antikörper enthält, tritt durch die Mikrokugelschicht 5, ohne von letzteren zurückgehalten zu werden. Anschließend erreicht sie die Membran 3', die von ihr durch das vorstehend angegebene Enzym, das in der Flüssigkeit enthalten ist, aufgelöst wird, wodurch der Flüssigkeit gestattet wird, in die Nachweiszone zu gelangen, die ein Substrat 8 enthält, welches bei Kontakt mit der untersuchten Flüssigkeit farbig wird.
• Bei einer negativen Reaktion, d.h., wenn die untersuchte Flüssigkeit kein Antigen enthält, wird der markierte Antikörper der obersten Schicht, durch das auf den Mikrokugeln fixierte nicht-markierte Antigen zurückgehalten, und verfärbt daher das Substrat nicht. Mutatis Mutandis sind die vorgänge dieselben, wenn das ein Antikörper ist, der in der Flüssigkeit gesucht wird. Wenn man eine semi-quantitative Bestimmung erhalten möchte, ist das Reagens der obersten Schicht nicht markiert, während auf die oberste Schicht eine Zwischenschicht folgt, die vesikuläre Mehrschichtstrukturen oder Mikrokapseln umfaßt, in deren Inneres markierte Reagentien eingearbeitet sind. Das mit der Membran assoziierte Reagens, beispielsweise ein Antikörper, wird in einer Menge eingebracht, die einer bestimmten Menge an Antigen, also x ng/ml Antigen, beispielsweise 10 ng/ml Antigen entspricht. Wenn die getestete Flüssigkeit eine größere Menge an Antigen enthält, wird der Überschuß an den markierten Antikörpern gebunden, die in die vesikulären Strukturen der intermediären Schicht eingearbeitet sind, und zwar schon bei der Öffnung dieser unter Einwirkung des Lyseenzyms, in der Weise, daß man Ergebnisse mit Bezug auf einen Schwellenwert erhält, d.h. semi-quantitative Ergebnisse.
• Figur 2 erläutert die qualitative Analyse von Antigenen, wobei eine positive Reaktion erhalten wird: Man erkennt den gebildeten Komplex aus Antikörper und Antigen, mit dem Bezugszeichen 10, der die mittlere Schicht passiert, ohne von den Mikrokugeln zurückgehalten zu werden; hierdurch ergibt sich eine positive Reaktion. Tatsächlich werden die gesamten markierten Antikörper aus der Tablette 1 durch die in dem Serum vorhandenen Antigene nach etwa 30 Sekunden gesättigt, und zwar in der Art, daß der gesättigte Komplex nach der Lyse der obersten Membran 3 nach diesen 30 Sekunden bei den Mikrokugeln der Schicht 5, auf denen die Antigene der gleichen Art wie diejenigen, die in dem Serum gesucht werden, ankommt, wobei die Mikrokugeln diese gesättigten Komplexe nicht binden können, die über die lysierte Membran 3' in die Nachweiszone gelangen. Genauer gesagt, betrifft die in Figur 2 dargestellte Analyse die qualitative Analyse auf die Anwesenheit von Syphilis-Antigenen.
• Die markierten Antikörper, die das Reagens der obersten Schicht 13 ausmachen, sind menschliche IgG (500 pg), die aus positiven Kontrollseren stammen, und die mit Peroxydase (Merck) auf Concanavalin A markiert sind (Verfahren von GUESDON und AVRANEAS, 1980). Die Tablette, die das Reagens enthält, enthält ebenfalls das Enzym für die Membranlyse, bei dem es sich, wenn letztere aus Gelatine besteht, um Kollagenase handelt. In diesem Fall enthält die Tablette bevorzugt 5 Einheiten Kollagenase (Kollagenase Clostridium von Calbiochem). Die Membran 3 kann auch eine Polycarbonat- DMF-Membran mit einer Dicke von 10 um sein, die 3 um-Poren besitzt, welche in der Hitze durch eine 3%ige ethanolische Gelatinelösung verschlossen worden sind. Die Gelatine, die die Poren verschließt, ist von Kollagenase nach 30 Sekunden lysiert. Die Membran 3 wird von einer Glasfaserstruktur gestützt. Die als Reagentien verwendeten polyklonalen Antikörper 14, die mit dem Serum-Antigenen 15 in Kontakt gebracht werden, die in dem Serumtropfen, der mit der Tablette, enthaltend das Reagens 14, in Kontakt gebracht worden ist, bilden einen Komplex aus markiertem Antikörper und Antigen 10. Da Blut, das bezüglich der VDRL-Antigene positiv ist, davon pro 50 Mikroliter-Tropfen etwa 200 pg enthält, reichen die 500 pg markierter Antikörper, die in der obersten Schicht 13 eingebracht worden sind, aus, um die Serumantigene 15 einzufangen; dieser Überschuß an Antikörpern hat im übrigen eine Auswirkung auf die Beschleunigung der Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion. Tatsächlich binden von 500 pg an markierten Antikörpern 14 der obersten Schicht 13, 200 pg Serumantigene 15 unter Bildung des Ag-Ak-Komplexes 10, der nicht an die feste Phase, bestehend aus den Mikrokugeln 5 der Zwischenschicht 11, bindet. Diese Mikrokugeln (5 ul) aus "Magnogel" (IBF) umfassen einen Antigenüberzug von VDRL-LATEX (1 ng/5 ul) auf Protein A + Glutaraldehyd (Reagens IBF) und VDRL (Diag. Pasteur Code 52675). Sobald die Gelatine der Membran 3 lysiert ist, binden 300 pg an markierten Antikörpern, die freigeblieben sind, an die von den Mikrokugeln 5 der Zwischenschicht 11 getragenen Antigene VDRL-LATEX, wohingegen 200 pg an markierten Antikörpern, die mit den Serumantigenen 10 gesättigt sind, die untere Membran 3' (identisch mit der Membran 3) passieren, sobald die Gelatine, die gemäß dem gegenwärtig beschriebenen Beispiel ihre Poren verschließt, lysiert ist, um in der unteren Schicht 16 einzutreffen. Diese ist die Nachweiszone, die das Substrat (S) enthält, das günstigerweise aus stabilisierten 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin (ICN-LAB. MILES) auf einem geeigneten Träger, wie beispielsweise Whatman-Papier Nr. 1 besteht; beim Zusammentreffen mit dem Substrat (S) ergibt der Komplex 10 eine Farbreaktion 12. Die Färbung kann mit nur 20 pg auftreten, wenn, abgesehen von 3,3',5,5'-TMB, das Substrat den Glucoseoxydase/ß-D-Glucose-Komplex enthält, der in Kontakt mit dem Serum, Wasserstoffperoxyd ergibt, und somit die Amplifizierung der Färbung gestattet.
• Figur 3 erläutert die qualitative Analyse von Antikörpern unter Erhalt einer positiven Reaktion: Nach etwa 30 Sekunden sind alle markierten Antigene mit den Serumantikörpern markiert. Dann wird die obere Membran 3 lysiert, so daß alle Komplexe aus Antikörper und markiertem Antigen passieren können, und zwar in Richtung der Mikrokugeln der mittleren Schicht an die nicht-markierte Antikörper derselben Art wie die gesuchten Antikörper gebunden sind. Da die Epitope (antigene Stellen) mit den Serumantikörpern gesättigt sind, werden sie nicht von den an die Mikrokugeln gebundenen Antikörper erkannt und gelangen in die Nachweiszone, wo sie mit dem Substrat reagieren und eine Farbreaktion ergeben.
• Das in Figur 3 dargestellte Beispiel betrifft insbesondere den Nachweis von Antikörpern der Toxoplasmose.
• Als Reagens, bestehend aus markierten Antigenen, erhält die oberste Schicht 13 Toxoplasmose-Antigene (Code 52721 Diag. Pasteur), vorteilhafterweise lyophilisiert (250 pg), die mit Peroxydase (Merck) markiert sind. Die lyophilisierte Tablette, die die Ag 17 enthält, enthält ein Lyseenzym, bei dem es sich im Fall einer wie weiter oben mit Bezug auf Figur 2 beschriebenen Membran, speziell um Kollagenase, handelt (5 Einheiten Kollagenase Clostridium von Calbiochem). Die als Reagens verwendeten markierten Antigene 17, die mit den Serumantikörpern (polyklonal) 18 in Kontakt gebracht werden, die in dem Serumtropfen, der mit der Tablette 17, die das Reagens enthält, in Kontakt gebracht wird, bilden einen Komplex aus markiertem Antigen und Serumantikörper 19. Da ein bezüglich der Antitoxoplasmose-Antikörper positives Blut davon 100 bis 150 pg enthält, sättigen die 250 pg an markierten Antigenen 17 diese Serumantikörper 18 und verhindern, daß diese an die Mikrokugeln 20 (5 ul) binden - wie Mikrokugeln aus "Magnogel" (IBF), umfassend einen Überzug aus Antitoxoplasmose-Antikörpern (1 ng/5 ul) auf Protein A + Glutaraldehyd (Reagentien IBF, Antikörper Institut Pasteur) - die sich in der Zwischenschicht 11 befinden. Sobald durch die Lyse der Gelatine, die die Poren der Polycarbonat-Membran verschließt, die Membran 3 durchlässig geworden ist, wie weiter oben als nicht einschränkendes Beispiel beschrieben wurde, binden die markierten Antigene 17, die nicht durch die Serumantikörper 18 gesättigt worden sind, an die von den Mikrokugeln 20 getragenen Antikörper, während die Komplexe aus markiertem Antigen und Antikörper 21 die untere Membran 3' überwinden, sobald sie ihrerseits durchlässig geworden ist, um sich mit dem Substrat (S) zu vermischen, das dasselbe sein kann wie weiter oben mit Bezug auf Figur 2 beschrieben wurde. Dies ergibt eine Färbung, die gegebenenfalls verstärkt werden kann, wie ebenfalls mit Bezug auf Figur 2 beschrieben worden ist.
• Die vorstehend gegebenen Beschreibungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bezogen sich auf die in den Figuren 1 bis 3 wiedergegebenen Ausführungsformen. Als Membranen zur programmierten Lyse wurden im wesentlichen Membranen angegeben, die aus Gelatine bestehen oder diese enthalten. Es ist jedoch klar, daß die Membranen zur programmierten Lyse erfindungsgemäß mit anderen Materialien realisiert werden können. Die nicht-einschränkenden Beispiele, die folgen, sollen zum einen weitere Membranen zur programmierten Lyse, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, beschreiben und andererseits sollen sie die Anwendung der Vorrichtung und des Verfahrens zur Analyse, gemäß der vorliegenden Erfindung, bei der Analyse bzw. Bestimmung von Antigenen, die in Serum oder in Urin vorkommen, beschreiben.
Beispiel 1 Herstellung von Lipidmembranen
• Lipidmembranen können aus einer großen Auswahl von amphiphilen Lipiden oder aus Lipidmischungen hergestellt werden.
• Die Lipide, die sich am besten für die Bildung von undurchlässigen Membranen eigenen, sind die Phospholipide, gegebenenfalls in Verbindung mit Cholesterin, welche die Basisbestandteile der Zellmembranen sind.
• Die natürlichen Phospholipide (nicht-synthetisch) haben einen gleichen Rest R gemeinsam - aber sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Endgruppe:
• R-H Phosphatidsäure
• R - CH&sub2; - CH&sub2; - N - (CH&sub3;)&sub3; Phosphatidylcholin
• R - CH&sub2; - CH&sub2; - NH&sub3; Phosphatidylethanolamin
• Phosphatidylserin
• R - CH&sub2; - CHOH - CH&sub2; - OH Phosphatidylglycerin
• R - CH&sub2; - CHOH - CH&sub2; - O - R' Cardiolipin
• R - R&sub1; - Komplex Sphingomyelin
• Es gibt synthetische Phospholipide, die bessere Eigenschaften hinsichtlich der Beständigkeit, der Haltbarkeit etc. besitzen. Diese sind:
• DMPC Dimyristoyl-Phosphatidylcholin
• DPPC Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin
• DSPC Distearoyl-Phosphatidylcholin
• 1. Herstellung der Lipidlösung:
• - Phospholipid 10 umol
• - Benzol 1 ml
• Man mischt 1 Minute im Vortex.
• 2. Man erwärmt einige Minuten auf 40ºC im Wasserbad.
• 3. Man bringt 12 ul auf einen der folgenden Träger mit einem Durchmesser von 13 mm auf: Nylon, Nitrozellulose, Zellulosepapier, Polyester, mit einer Porosität von mindestens 0,45 u und einer Dicke von 100 u.
• 4. Abdampfen des Benzols im Feinvakuum (- 60 mm Hg) und sofortige Lagerung im Vakuum oder unter Argon.
• 5. Die Lyse dieses Membrantyps wird mit Hilfe eines geeigneten Detergens und/oder von Peroxydase durchgeführt.
• Lysetest:
• Man bringt auf eine Tablette in ul Wasser auf: Der Tropfen bleibt mindestens 1 Stunde unbeweglich.
• Man bringt auf eine Tablette 10 ul Tween 20 oder Triton X-100 als 0,02%ige Lösung und/oder Peroxydase 1 ng/ul auf:
• Der 10 ul-Tropfen bleibt 45 Sekunden lang unbeweglich, bevor er unvermittelt die Membran des Trägers durchdringt.
• 6. Eichen der Membranen: Man kann die Verzögerung der Lyse verändern, indem man die Phospholipidkonzentration oder die Detergens-Peroxydase-Konzentration variiert, wobei man auf eine der nachfolgend beschriebenen Weisen vorgeht:
• 6.1 Membran, hergestellt mit einer Lösung von 15 umol Phospholipid in 1 ml Benzol: Der Tropfen mit 0,02 % Triton X-100 dringt erst nach 90 Sekunden ein.
• 6.2 Wenn man 0,01 % Triton X-100 für dieselbe Phospholipidkonzentration verwendet, tritt die Lyse nach 5 Minuten ein.
• 6.3 Membran, hergestellt mit einer Lösung von 5 umol Phospholipid in 1 ml Benzol: 0,02 % Triton X-100 durchdringt die Membran in 15 Sekunden, während bei 0,01 % die Verzögerung 50 Sekunden beträgt.
• Wichtige Anmerkung: Während die nicht-ionischen Detergentien einen guten Schutz bestimmter Lösungen (beispielsweise mit Peroxydase markierte Antikörper) sicherstellen, assoziieren sie mit dieser gleichen Peroxydase, um die Membran zu lysieren.
Beispiel 2 Herstellung von Membranen aus Acrylat-Copolvmeren
• 1. Man stellt die folgende Stammlösung her:
• - 2-Propanol(isopropanol) 30 %
• - Acryl/Acrylat-Copolymer 40 %
• - Hydroxypropyl-methylcellulose 20 %
• - Acetyl-trietylcitrat 5 %
• - Aluminium-chlorhydrat 5 %
• Man erhitzt im Wasserbad 10 Minuten auf 40ºC. Man mischt 1 Minute im Vortex. Man lagert unter luftdichtem Abschluß.
• 2. Vor dem Aufbringen auf einen der Träger, die im vorstehenden Beispiel beschrieben wurden, verdünnt man die Stammlösung mit reinem Alkohol in einer Menge von:
• 1 Volumen der Acrylstammlösung
• 5 Volumen reines Ethanol
• 3. Man bringt 10 ul auf den Träger mit 13 mm Durchmesser auf.
• 4. Man trocknet im Vakuum. Man lagert im Vakuum in Gegenwart eines Trockenmittels.
• 5. Dieser Membrantyp wird von PBS bei pH 7,2 lysiert.
• Lysetest:
• Man bringt einen 10-ul-Tropfen des PBS-Puffers pH 7 auf: Das Durchdringen der Membran ist langsam (etwa 1 Minute).
• Man bringt 10 ul PBS pH 7,2 auf: Das Durchdringen des Trägers findet nach wenigen Sekunden statt.
• 6. Es ist möglich, die Verzögerung der Lyse des Acrylfilms zu verkürzen oder zu verlängern, indem man variiert:
• - die Zusammensetzung der Stammlösung (beispielsweise mehr oder weniger 2-Propanol),
• - den Anteil an Ethanol: Beispielsweise ist bei 9 Volumen Ethanol von 10 der Film sehr schnell durchlässig, bei 4 Volumen von 5 ist das Hindurchtreten langsamer.
• 7. Es ist möglich, den pH-Wert der Lyse zu variieren, indem man die Konzentraton des Acetyl-triethylcitrats variiert.
Beispiel 3 Herstellung von Proteinmembranen
• Die Gelatinemembranen, auf die im Zusammenhang mit der Beschreibung der in den Figuren 1 bis 3 dargestellten Vorrichtung Bezug genommen wurde, werden günstigerweise wie folgt hergestellt:
• Man stellt die folgende Stammlösung her:
• - Pflanzengelatine 5 mg
• - Entmineralisiertes Wasser 95 ml
• Man erhitzt unter magnetischem Rühren auf 50ºC. Man bringt 10 ul auf einen solchen Träger, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf.
• Man trocknet im Feinvakuum. Man lagert im Vakuum in Gegenwart eines Trockenmittels. Pflanzengelatine wird von Kollagenase lysiert.
• Lysetest:
• Man bringt 10 ul Wasser auf die so hergestellte Tablette auf. Das Wasser bleibt mehr als eine Stunde unbeweglich. Man bringt 10 ul einer Kollagenaselösung mit 1 IE/ul auf: der Tropfen durchdringt den Träger in 45 Sekunden.
• Es ist möglich, das Hindurchtreten der Flüssigkeiten durch die Proteinmembran zu verzögern, indem man der Lösung, die durch sie hindurchtritt, Kollagenase oder jedes andere proteolytische Enzym zusetzt. Kollagenase wird hier aus dem Grund ausgewählt, weil sie mit den über oder unter der Membran erwarteten biologischen Reaktionen kompatibel ist, während andere proteolytische Enzyme toxisch sind, insbesondere für die Antikörper und die Markierungsproteine.
• Es ist ebenfalls möglich, die Verzögerung des Durchdringens dieser Membran zu variieren, indem man die Gelatinekonzentrationen oder die Kollagenasekonzentrationen variiert. So verringert man die Verzögerung mit weniger Gelatine oder mehr Kollagenase, und man verlängert sie mit mehr Gelatine oder weniger Kollagenase.
Beispiel 4 Herstellung von Kohlenhydratmembranen
• Man stellt die folgende Stammlösung her:
• D-Glucose 10 g
• Man erhitzt 5 ml entmineralisiertes Wasser auf 70ºC; unter Mischen im Vortex gibt man in kleinen Mengen 10 g D-Glucose zu, wobei zwischen zwei D-Glucose-Zugaben gerührt wird. Man erhält eine dicke Lösung von sirupöser Konsistenz.
• Man verdünnt 1 Volumen des Sirups mit 1 Volumen reinem Ethanol 99º, dann bringt man 10 ul dieser Lösung auf einen der in Beispiel 1 beschriebenen Träger auf. Man trocknet im Vakuum bei 37ºC. Man lagert in Gegenwart eines Trockenmittels. Dieser Membrantyp wird in Gegenwart von Wasser lysiert.
• Lysetest:
• Man bringt 10 ul Wasser auf:
• 1. denselben Träger ohne D-Glucose auf: sofortiges Durchdringen,
• 2. den mit D-Glucose hergestellten Träger auf: um 35 Sekunden verzögertes Hindurchdringen.
• Rohe D-Glucose eignet sich besonders, weil sie gestattet, im Kontakt mit Glucoseoxydase das Peroxyd zu erhalten, wodurch das Signal bei den Analysen, bei denen Peroxydase als Marker verwendet wird, amplifiziert.
Beispiel 5 Nachweis von im Serum vorhandenem ACE
• Figur 4 stellt eine Analysenkurve für ACE dar, das in den Proben von menschlichem Serum enthalten ist.
• Die getesteten Proben haben ein Volumen von 50 ul. 10 Proben mit gleichem Volumen von zu testendem menschlichem Serum und eine Testprobe von menschlichem Serum, die keine ACE enthält, wurden wie folgt behandelt: Man gibt eine Probe auf die lyophilisierte Tablette 1, die von der Membran 3 gestützt wird, und die 1250 pg Maus IgG1 Anti-Epitop 328.C von ACE, markiert mit Peroxydase, enthält.
• Nach 30 Sekunden waren alle markierten Antikörper mit den Serumantigenen gesättigt. Die Lyse der Membran 3, die beispielsweise aus Gelatine besteht (verstärkt durch ein Glasfasernetz), durch Kollagenase findet erst nach diesen 30 Sekunden statt, dies bewirkt das Einströmen des Serums, das die markierten Antikörper, die mit den Serumantigenen gestättigt sind, enthält, in die zweite Reaktionszone, in der sie mit den Mikrokugeln der Schicht 5 in Kontakt kommen, die mit den gleichen Antigenen versehen sind. Sie werden nicht von den Antigenen, mit denen die Mikrokugeln 5 versehen sind, zurückgehalten, weil die Fab-Stellen der markierten Antikörper durch die Serumantigene gesättigt sind. Das Enzym, das in der Flüssigkeit, die die zweite Reaktionszone durchdringt, vorhanden ist, lysiert also die zweite Membran 3', was zum Einströmen der Flüssigkeit in die dritte Reaktionszone führt. In dieser Zone kommen alle markierten Antikörper, die mit Serumantigenen verknüpft sind, mit der Tablette des Substrats, das beispielsweise 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin ist, in Kontakt und sie bewirken quasi sofort eine Färbung in Gegenwart der Peroxydase. Ein unter der erfindungsgemäßen Vorrichtung angebrachter Streifen nimmt das Filtrationsprodukt auf und offenbart somit das Antwortsignal, das den Gehalt an markiertem Material, das die Mikrokugeln passiert, angibt. Die verschiedenen ACE-Konzentrationen der analysierten Probe, die 0,5 - 1 - 1,5 - 2 - 2,5 - 5 - 10 - 15 - 20 Nanogramm ACE/ml Serum betragen, entsprechen 25-50-75-100-125-250- 500-750-1000 Picogramm ACE in der 50 ul-Analysenprobe und sind in der Figur 4 dargestellt.
• Da die Vorrichtung und das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sehr niedrige Nachweisschwellenwerte zulassen, ist es möglich, Bestimmungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit einem einzelnen Blutstropfen von 50 ul durchzuführen.
• Es ist ebenfalls möglich, eine Vielzahl von Diagnosen zusammen durchzuführen, indem man Mikrokugeln verwendet, die verschiedene diagnostische Marker tragen.
• Die Empfindlichkeit der Analysen ist in der Größenordnung von 5 bis 125 pg, entsprechend der Empfindlichkeit des eingesetzten monoklonalen Antikörpers: Es wird daher empfohlen, ultraspezifische monoklonale Antikörper zu verwenden.
• Wie weiter oben erwähnt, handelt es sich bei den aufeinanderfolgenden Schichten der erf indungsgemäßen Vorrichtung um Phasen, die gegenüber Wasser verschiedene Affinitäten aufweisen, so ist die oberste Schicht eine Absorptionsphase, die Zwischenschicht eine Desorptionsphase und die unterste Schicht eine Absorptionsphase. Dieser Wechsel wird im beschriebenen Beispiel durch das Herstellen eines osmotischen Glucosegradienten erhalten. Dies führt dazu, daß alle Flüssigkeiten zum Substrat der untersten Schicht gezogen werden, während bei einer negativen Reaktion nur das markierte Material auf den Mikrokugeln zurückgehalten wird.
Beispiel 5 Qualitativer Test des Nachweises von Anti-HIV-Antikörpern in Vollblut 6. Vorrichtung für den Nachweis von Anti-HIV-Antikörpern in Vollblut 6.2 Funktionsweise der Vorrichtung
• Das D 122-Papier wird mit Hilfe der folgenden Lösung behandelt:
• - entrahmte Milch 10 % Gew./Vol.
• - Gelatine 1 %
• - Exc. steriles destilliertes Wasser.
• Der auf den Tablettenstapel aufgebrachte Vollbluttropfen blieb aufgrund der ersten MLP 30 Sekunden lang unbeweglich. Letztere wird nach 30 Sekunden durch das in der aufgebrachten Lösung der markierten Antigene (0,1 % Tween 20) lysiert, die im übrigen 3 weitere sehr wichtige Funktionen hat:
• - Schutz der Peroxydase der Antigene,
• - Beschleunigung der Hämolyse
• - Wirkung als Blockierungsmittel: Sie verhindert, daß die markierten Antigene während einer langen Lagerung an das D 122 binden.
• Die eventuell vorhandenen Serumantikörper verbinden sich mit den markierten Antigenen, die in der Depotlösung des D 122-Papiers enthalten sind:
• - Tween 20 0,1 %
• - Gelatine 1 %
• - Antigene, markiert mit Glucoseoxydase 10 ng/ul
• - Exc. PBS
• Es werden 5 ul dieser Lösung aufgebracht.
• Im negativen Fall verfügen die markierten Antigene über 30 Sekunden (Lysezeit der zweiten MLP), um an die Antikörper der festen Phase zu binden.
• Im positiven Fall bindet der Komplex aus Serumantikörpern und markierten Antigenen nicht an die feste Phase und die Glucoseoxydase, mit der die Antigene markiert sind, produziert im Kontakt mit der D-Glucose, der Nachweistablette, Wasserstof fperoxyd, wodurch die Peroxydase des Hämoglobins mit ihrem Substrat (H&sub2;O&sub2;) versorgt wird, um das TMB zu färben.
• Nach 30 Sekunden wird die zweite MLP lysiert und die Komplexe aus gesuchten Antikörpern und mit Glucoseoxydase markierten Antigenen erreichen die Nachweistablette.
Beispiel 7 Semi-qualitativer Test der ACE-Analyse in Vollblut
• Wie weiter oben mit Bezug auf Figur 1 angegeben, umfaßt bei den erfindungsgemäßen semi-qualitativen Tests die Vorrichtung eine erste feste Phase, die eine vorher bestimmte Menge an Antigenen einfängt, die einem normalen Wert entspricht, während die über diesen als normal bezeichneten Wert hinaus in dem Blut vorhandenen Antigene von der zweiten festen Phase eingefangen werden.
• In diesem Test wird die folgende Vorrichtung eingesetzt: Beschreibung der Vorrichtung Feste Phase Behandeltes Nylon Erste MLP aus Lipiden Zweite feste Phase Dritte MLP aus Lipiden Nylonträger Antikörper Anti-ACE, gebunden, Einfangreagens Blut Antikörper Anti-ACE, markiert mit Glucoseoxydase, binden an überschüssige ACE Gebundene Antikörper, fangen die markierten Antikörper, die nicht mit ACE gesättigt sind 1M Citratpuffer D-Glucose
Beispiel 8 Qualitativer Test des HCG-Nachweises im Urin (qualitativer Schwangerschaftstest)
• Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist die folgende Struktur auf: Verwendete Materialien Enthaltene Substanz Menge 1 - Durieux 122-Papier 2 - Behandeltes Papier 1M-Phosphatpuffer Markierte Antikörper 3 - Membran für die programmierte Lyse 4 - Mikrokugeln aus Gel auf Nylon 5 - Membran für die programmierte Lyse - D 122-Papier 8 - Nylon, 0,65 um-Poren behandelt mit Acrylatcopolymer gesuchtes Antigen Acrylatcopolymer trockene D-Glucose Glucoseoxydase Citratpuffer pH 3,5 Überschuß, dann Waschen und Blockieren
• Die beschriebenen acht Schichten werden übereinander angeordnet und mit einem sauberen Plexiglasplättchen, das eine Öffnung mit einem Durchmesser von 2 bis 8 mm besitzt, zusammengepreßt.
• Mit einer Gilson-Pipette entnimmt man 90 ul aus frisch erhaltenem Urin und bringt ihn vorsichtig in der Öffnung auf.
• Ein geringer Anteil des Urins wird sofort absorbiert und der aufgebrachte Tropfen bleibt während 20 Sekunden unbeweglich, dann sickert er plötzlich und teilweise ein: Die oberen Pastillen bleiben feucht. Nach 20 Sekunden tritt ein erneutes Absinken des Urinniveaus auf und von oben gesehen erschien die Vorrichtung vollständig trocken.
• Diese zwei Stufen verdeutlichen gut die programmierte Lyse der zwei Membranen, von denen die eine unter dem markierten Antikörper angeordnet ist, und die andere unter der festen Phase.
• Bei negativem Resultat führt das gebildete Wasserstoffperoxyd in Abwesenheit der Antikörper - Peroxydase nach 1 bis 2 Minuten zu einer lachsfarbenen Färbung (Ergebnis der Einwirkung von Licht und H&sub2;O&sub2; auf das TMB).
• Bei positiver Reaktion tritt augenblicklich ein intensiv azzurblauer Fleck auf.
• Um die Farben zu konservieren, ist es notwendig, sie trocken und vor allem dunkel aufzubewahren. In der Praxis muß der Test einfach wieder in seine Verpackung gegeben und gut verschlossen werden, wenn man das Ergebnis später zeigen möchte. Unter diesen Bedingungen überdauert die Färbung mehrere Tage.
Beispiel 9 Semi-quantitativer Test des Nachweises des LH-Peaks im Urin
• Im Urin ist LH während des gesamten Cyclus in einer Grundkonzentration vorhanden. Kurz vor und während des Eisprungs gibt es einen wichtigen Peak. Ziel des Tests ist es daher, im Fall der Konzentration an LH keine Färbung zu ergeben und im Fall des LH-Peaks zu einem Farbsignal zu führen.
• Um dies zu erreichen, wird dem oberen Teil eine Schicht oberhalb der markierten Antikörper zugefügt. Diese Schicht umfaßt:
• - eine feste Phase, hergestellt mit Anti-LH-Antikörpern in der Weise, daß nur die der Grundkonzentration entsprechende LH-Menge aus diesem Niveau eingefangen wird,
• - eine Membran für die programmierte Lyse, die in Anti-LH-Antikörpern dieser festen Phase Zeit läßt, die Grundkonzentration an LH einzufangen.
• Der Rest der Vorrichtung ist mit der qualitativen identisch. Vorrichtung Durieux 122-Papier Erste feste Phase: Gel aus Mikrokugeln 1M Phosphatpuffer Anti-LH-Antikörper Grundkonzentration Erste Membran für die programmierte Lyse (abgekürzt: MLP) Präpariertes D 122- Papier Zweite MLP Zweite feste Phase: Gel aus Mikrokugeln Nylon Acrylatcopolymer Anti-LH-Antikörper, markiert mit Peroxydase LH (Antigen) D-Glucose und Glucoseoxydase + 1M Citratpuffer Überschuß anschließend Wa- Waschen und Blockieren Fleck von bis
• Als Variante können markierte Anti-LH-Antikörper auf der Höhe der PS-Nr. 1 in Liposomen eingeschlossen werden, um zunächst die Anti-LH-Antikörper der PS-Nr. 1 die LH-Grundkonzentration einfangen zu lassen.

Claims (16)

1. Vorrichtung zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, des Typs umfassend eine Reaktionszone, die ein markiertes Reagens, insbesondere einen Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das so markiert ist, daß es mit dem gewünschten Liganden reagieren kann, enthält und eine Nachweiszone, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Kombination umfaßt:

- eine erste Reaktionszone (13), die eine Membran (3) umfaßt, die mindestens zeitweise undurchlässig ist, wobei die Zone für die Aufnahme einer zu testenden Probenflüssigkeit vorgesehen ist, und wobei die Membran zur Assoziation mit mindestens einem in geeigneter Weise markierten Reagens, das den bzw. die gesuchten Liganden, der bzw. die gegebenenfalls in der Probe enthalten ist bzw. sind, erkennen kann, und mit einer Substanz zur Auflösung oder einem Mittel zur Lyse der Membran vorgesehen ist;

- eine zweite Reaktionszone (11), die sich von der ersten unterscheidet und mindestens zeitweise von dieser durch die Membran (3) isoliert ist, umfassend eine feste Phase, die ein nicht-markiertes Referenzreagens (5 oder 20) enthält, das den bzw. die Liganden, die identifiziert werden sollen, erkennen kann und die mindestens zeitweise gegen die Seite, die derjenigen, in der sich die erste Membran befindet, durch eine zweite Membran (3'), die mindestens zeitweise undurchlässig ist, abgeschlossen ist, und

- eine dritte Reaktionszone (16), die mindestens zeitweise gegen die zweite Reaktionszone durch die zweite Membran (3') isoliert ist, die Mittel zum Nachweis der Reaktion, die gegebenenfalls in der ersten oder der zweiten Reaktionszone abläuft, enthält, wobei die Vorrichtung weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß die zwei Membranen (3, 3') aus einem Material hergestellt sind, das während einer ersten Zeitspanne, die ausreicht, die Reaktion, die in der Reaktionszone von Interesse abläuft, ablaufen zu lassen, undurchlässig ist, wobei das Material so ist, daß es mit Hilfe der Substanz zur Auflösung oder dem Lysemittel im Verlauf dieser ersten Zeitspanne aufgelöst wird, um evtl. vorhandene Reaktionsprodukte gegen die nachfolgende Reaktionszone fließen zu lassen, wobei die Auflösung oder Lyse gleichzeitig mit der Reaktion, die in der Reaktionszone von Interesse ablaufen soll, beginnt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz zur Auflösung oder Lyse der Membran unabhängig von der betroffenen Membran ist.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz zur Auflösung oder zur Lyse der Membran(en) in die betroffene Membran eingearbeitet ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Reaktionszone (13) für die Aufnahme einer festen Phase (1), die bevorzugt auf der ersten Membran (3) aufgebracht ist, geeignet ist, die mindestens ein in geeigneter Weise markiertes Reagens enthält, das gegebenenfalls mit einem Mittel zur Lyse der Membran assoziiert ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die feste Phase, die ein nicht-markiertes Referenzreagens enthält, in der zweiten Reaktionszone (11) befindet und aus einem unlöslichen Träger (5 oder 20) besteht, auf den das Reagens (insbesondere ein Antikörper oder ein Antigen), das nicht markiert ist, fixiert ist, das dem nachzuweisenden Liganden entspricht.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Reaktionszone (16) ein chromogenes Substrat enthält, wenn das Ablesen der Reaktion colorimetrisch vorgenommen werden soll.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zwischen den ersten und zweiten Reaktionszonen eine intermediäre Zone enthält, die ein markiertes Reagens enthält, wobei in diesem Falle die erste Reaktionszone ein nicht-inarkiertes Reagens enthält.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die intermediäre Zone mindestens eine Schicht aus mehrschichtigen vesikulären Strukturen umfaßt, in die mindestens ein Reagens, das im Verlauf einer geeigneten Zeit durch ein geeignetes Lysemittel, insbesondere ein Enzym, freigesetzt werden kann, eingearbeitet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die intermediäre Zone aus einer intermediären Membran gebildet ist, die zwischen der ersten Membran und der zweiten Reaktionszone angebracht ist, wobei an die intermediäre Membran bevorzugt markiertes Reagens gebunden ist, und in diesem Falle an die erste Membran ein Reagens der gleichen Art wie die intermediäre Membran gebunden ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Zone der Vorrichtung mit einer an sich bekannten Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung, wie u.a. einem RIA, einem Spektrophotometer, verbunden ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszonen übereinander angeordnet sind1 um eine obere Schicht, die die erste Reaktionszone enthält, eine mittlere Schicht, die die zweite Reaktionszone enthält und eine untere Schicht, die die dritte Reaktionszone enthält und gegebenenfalls eine Zwischenschicht zwischen der oberen und der mittleren Schicht, die die intermediäre Reaktionzone enthält, zu bilden.

12. Verfahren zur raschen qualitativen und quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines reaktiven Liganden in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß im Verlauf einer ersten Stufe eine zu analysierende Probenflüssigkeit mit einem markierten Reagens, insbesondere einem markierten Antikörper oder einem markierten Antigen in einer zeitweise gegen die Zonen, in denen die nachfolgenden Verfahrensstufen stattfinden, isoliert ist, eine ausreichende Zeit lang in Kontakt gebracht wird, um den Ablauf der Reaktion zwischen dem Liganden und dem Reagens zu gestatten, wobei im Verlauf dieser Zeit die Isolierung der Zone, in der die Reaktion stattgefunden hat, mit Hilfe einer geeigneten Substanz zur Auflösung oder eines geeigneten Lysemittels, die bzw. das in der Zone vorhanden ist, die bzw. das gleichzeitig mit der Flüssigkeit gegen eine zeitweise undurchlässige Membran, die bei Kontakt mit der Substanz oder dem Reagens aufgelöst wird, transportiert wird, unterbrochen wird - die schrittweise und programmierte Auflösung oder Lyse der Isolierungsmembran findet gleichzeitig mit der Reaktion statt - um zu gestatten, daß das gegebenenfalls vorhandene Reaktionsprodukt im Verlauf einer zweiten Stufe mit einem zweiten nicht-markierten Reagens, das dem Liganden, der in der Flüssigkeitsprobe nachgewiesen werden soll entspricht, in einer zweiten Zone, die zeitweise gegen die Zone, die darauf folgt, isoliert ist, in Kontakt tritt, wonach die Isolierung der zweiten Zone schrittweise programmiert und gleichzeitig mit Hilfe der Substanz zur Auflösung oder des Lysemittels unterbrochen wird, um zu gestatten, daß das Produkt der ersten oder der zweiten Reaktion im Verlauf der dritten Verfahrensstufe mit Mitteln zum Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens des nachzuweisenden Liganden in Kontakt tritt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitsprobe im Verlauf der ersten Verfahrensstufe mit einem nicht-markierten Reagens in Kontakt gebracht wird, und daß der zweiten Verfahrensstufe eine intermediäre Stufe vorausgeht, im Verlauf derer der im Verlauf der ersten Stufe gebildete Komplex aus Ligand und nicht-markiertem Reagens mit einem markierten Reagens der gleichen Art wie das in der ersten Stufe verwendete Reagens in einer zeitweise gegen die nachfolgende Stufe isolierten Zone in Kontakt gebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-markierte Reagens, das mit der zu analysierenden Flüssigkeitsprobe in Kontakt gebracht wird, im Verlauf der ersten Verfahrensstufe, bezogen auf eine bestimmte Menge, die einer bekannten Menge des Liganden, wie dem, der nachgewiesen werden soll, entspricht, eingebracht wird, wobei der Ligand, der im Überschuß vorhanden ist, d.h. der an das Reagens im Verlauf der ersten Stufe nicht gebunden wird, im Verlauf der intermediären Verfahrensstufe durch das markierte Reagens eingefangen wird, auf dem ein Überschuß des Liganden gebunden wird, woraus folgt, daß die Reaktion zum Nachweis des eventuellen Vorhandenseins des Liganden in der Analysenflüssigkeit nicht positiv ist, wenn der Gehalt des Liganden in der Flüssigkeit größer als diese Menge ist, was so eine semi-quantitative Bestimmung des in der Flüssigkeit vorhandenen Liganden gestattet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Verfahrensstufe eine Phase der Absorption ist, und daß die zweite Verfahrensstufe eine Phase der Desorption ist, während die dritte Verfahrensstufe eine Phase der Absorption ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß wenn eine intermediäre Stufe zwischen den ersten und zweiten Verfahrensstufen vorhanden ist, diese intermediäre Stufe, wie die erste Stufe, eine Absorptionsphase ist.