DE3889833T2

DE3889833T2 - Diagnostische Vorrichtung und Verfahren, gekennzeichnet durch einen gezielten Durchfluss.

Info

Publication number: DE3889833T2
Application number: DE3889833T
Authority: DE
Inventors: Albert E Chu; Peter K Chun; Siu Chin C Yeung
Original assignee: E Y LAB Inc
Current assignee: E Y LAB Inc
Priority date: 1987-10-01
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-10-01
Also published as: ES2053753T3; EP0310406A3; ATE106569T1; JPH01140066A; US5006464A; DE3889833D1; EP0310406A2; JP2644004B2; EP0310406B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Untersuchung eines Analyten in flüssigen Proben. Die Erfindung betrifft insbesondere Vorrichtungen und Verfahren, welche immobilisierte, für Analyten, die in von biologischen Proben herrührenden flüssigen Proben vorliegen, spezifische Bindungsrezeptoren verwenden.
Lange Zeit bestand ein Interesse in der Entwicklung von Untersuchungssystemen, mit denen man die Anwesenheit oder die Menge spezifischer Substanzen in von biologischen Proben herrührenden Proben bestimmen kann. Während der letzten zwei Jahrzehnte lieferten Imunoassays, welche natürlich vorkommende, gegen spezifische Zielsubstanzen gerichtete Rezeptoren verwenden, wertvolle diagnostische Werkzeuge zum Nachweis von Substanzen klinischer Bedeutung. Im Stand der Technik finden sich zahlreiche Immunoassays, bei denen eine Komponente eines immunologischen Paares, beispielsweise ein Antigen oder ein Antikörper, mit dem mit einer ein nachweisbares Signal liefernden Sonde markierten, komplementären Partner nachgewiesen oder gemessen wird.
In einem, als kompetetives Bindungsverfahren bekanntes Assay-Verfahren, konkurriert die nachzuweisende Substanz mit einem markierten Reagenz der gleichen Substanz um eine begrenzte Anzahl von Rezeptorstellen. Zum Nachweis einer unbekannten Menge eines gewählten Antigen in einer flüssigen Probe, wird beispielsweise eine bekannte Menge des markierten Antigens der Probe zugesetzt und dann mit dem für das Antigen spezifischen Rezeptor-Antikörper in Kontakt gebracht. Die Menge des markierten Antigens, die an den Antikörper bindet, ist zu der Menge des unbekannten Antigen in der Probe umgekehrt proportional.
In einer anderen, als Sandwich-Assay bekannten Untersuchung, wird ein Rezeptor auf eine feste Oberfläche gebunden und das gewählte Antigen in der Probe bindet an den Antikörper. Ein zweiter, markierter, mit dem gebundenen Antigen bindungsfähiger Antikörper, wird dann mit dem Antigen unter Bildung eines iminobilisierten Reaktionsproduktes umgesetzt. Die Sonde in dem Reaktionsprodukt wird als Anzeichen der Anwesenheit des Antigens in der Probe nachgewiesen.
Viele Jahre wurden zum Nachweis oder zur Messung eines Antigens gemäß dem Sandwich-Verfahren für den markierten Antikörper als auch für den Rezeptor-Antikörper auf der Oberfläche Antiseren verwendet. Erst kürzlich wurden in derartigen Assays anstelle der Antiseren monoklonale Antikörper verwendet. In einem derartigen, in Wada et al., Clin, Chem, 28 (9) (1982), 1986-1966 beschriebenen System, wurde der Rezeptor-Antikörper auf eine Untereinheit eines bestimmten Antigens, hCG, gerichtet, während ein mit einem Enzym markierter, monoklonaler Antikörper gegen eine andere Untereinheit gerichtet war. In diesem Assay ist der Rezeptor-Antikörper auf der Innenseite des Test- Röhrchens, in das die Probe gegeben wird, immobilisiert.
Da der Kontakt zwischen dem immobilisierten Reagenz und dem Analyten in der Probe begrenzt ist, kann die Reaktion auf der festen Oberfläche relativ langsam verlaufen. Die Zeit für den Assay wurde durch Immobilisieren des Rezeptor-Antikörpers in einer porösen Membran verkürzt, wodurch die Antikörpermoleküle in einer dreidimensionalen Matrix ausgesetzt werden. In vielen derartigen Systemen wird die flüssige, das Zielantigen enthaltende Probe durch die Membran in ein darunterliegendes, absorbierendes Material gezogen. Ein derartiges, zur Verwendung in einem kompetetiven Bindungs-Assay geeignetes System wird in US-P 3 888 629 offenbart. Andere, zur Verwendung in kompetitiven- oder Sandwich-Assays geeigneten Systeme, werden beispielsweise in US-P 4 246 339, US-P 4 366 241 und US-P 4 632 901 offenbart.
Die meisten derartigen Assay-Systeme führen jedoch zu einer Ablagerung von Teilchen auf der Oberfläche des Filters, was die Ergebnisse bei Verwendung beispielsweise einer chromophoren Sonde verfälscht. Diese Systeme liefern darüber hinaus kein Mittel die Flußrate der Flüssigkeit in der Probe zu kontrollieren. Das System aus US-P 4 623 461 versucht diese Probleme zu lösen, indem die flüssige Probe dazu gebracht wird, transversal zu dem Rand des Filters zu fließen. Dies wird dadurch erreicht, daß das absorbierende Material nur mit dem Randbereich des Filters in Kontakt tritt. Es wird behauptet, daß dieses System zu einer verringerten Ablagerung von Teilchen auf der Filteroberfläche und zu einer verbesserten Trennung des Analyten führt.
Da jedoch die vordere Oberfläche des transversalen Querschnittes der Membran ziemlich klein ist, benötigt die Flüssigkeit notwendigerweise mehr Zeit vollständig hindurch in das absorbtionsfähige Material zu fließen. Darüber hinaus ist es nicht möglich die Fließcharakteristika zu ändern ohne eine andere Membran zu verwenden.
Es ist daher wünschenswert, die Sensitivität und Trennung eines membrangebundenen Rezeptor-Assays zu verbessern, während die Fließcharakteristika des Assays-Systems kontrolliert werden.
Es ist ebenfalls wünschenswert, die Fließcharakteristika eines Systems mit anderen Mitteln als der Dicke und der Porengröße der Membran, die den Reaktanden immobilisiert, zu kontrollieren.
Die Erfindung liefert eine Assay-Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, insbesondere einer von einer biologischen Probe herrührenden Probe. Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält im allgemeinen eine poröse Reaktionsmembran mit einem immobilisierten Rezeptor, der die Zielsubstanz direkt oder indirekt binden kann. Die Vorrichtung enthält darüber hinaus einen Formkörper eines absorbierenden Materials, der neben der porösen Reaktionsmembran angeordnet ist und der die flüssige Probe absorbieren kann. Zwischen diesen Komponenten ist eine Trennvorrichtung oder Septum angeordnet, im allgemeinen in Form einer Folie mit einem oder mehreren ausgewählten Durchlässen, das die poröse Membran von dem absorbierenden Formkörper im wesentlichen trennen und den Fluß der flüssigen Probe von der porösen Membran zu dem absorbierenden Formkörper leiten kann.
Eine erfindungsgemäße Lager- und Reaktionsvorrichtung zur Verwendung in Assays zur Erfassung und/oder Bestimmung einer bindungsfähigen Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, eine derartige Substanz zu enthalten, enthält insbesondere:
(a) eine flüssigkeitsdurchlässige, poröse Reaktionsmembran mit einer oberen und einer unteren Oberfläche, wobei mindestens eine definierte Region der Membran oder mindestens die obere Oberfläche davon einen darauf immobilisierten Rezeptor besitzt, der direkt oder indirekt an die bindungsfähige Zielsubstanz binden kann,
(b) einen Formkörper eines absorptionsfähigen Materials, das in der Lage ist eine Flüssigkeit zu absorbieren, wobei der Formkörper eine Oberfläche besitzt, die der unteren Oberfläche der porösen Membran benachbart ist,
(c) eine Trennvorrichtung zwischen der unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials, um einen Flüssigkeitsfluß dazwischen im wesentlichen zu unterbinden, und
(d) Öffnungen durch die Trennvorrichtung, wobei der Flüssigkeitsfluß im wesentlichen von der unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran durch die Trennvorrichtung geleitet wird,
wobei die auf die obere Oberfläche der porösen Reaktionsmembran aufgebrachte flüssige Probe in einem ausgewählten Fließmuster zu deren unteren Oberfläche durchdringt und im wesentlichen zu mindestens einem ausgewählten Teil der Oberfläche des Formkörpers des absorbierenden Material geleitet wird.
Die flüssige Probe wird unter Bildung eines nachweisbaren Reaktionsproduktes auf der Membran untersucht. In bevorzugten Ausführungsformen des Assays, wird eine biologische flüssige Probe verwendet (beispielsweise Urin oder Serum), wobei diese die Zielsubstanz, gewöhnlich ein Antigen, ein Antikörper oder Hapten, die von dem auf der Membran immobilisierten Rezeptor gebunden werden können, vermutetermaßen enthält.
Bei dem Nachweis eines ausgewählten Antigens in einem Sandwlch-Assay wird ein Rezeptor-Antikörper-Reagenz (das das Antigen bindet) auf der Membran immobilisiert. Das Ziel-Antigen in einer flüssigen Probe bindet an den Rezeptor-Antikörper. Anschließend reagiert ein zweites Reagenz, ein löslicher, markierter Antikörper, der das Zielantigen binden kann, mit dem gebundenen Antigen unter Bildung eines nachweisbaren Reaktions produktes auf der Membran. Diese Reaktionen können gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Vorrichtung ein Trennmittel, das ein Septum aus einer flüssigkeitsundurchlässigen Membran oder eine Folie ist, das/die im wesentlichen die poröse Membran von dem absorbierenden Formkörper trennt. Dieses Septum enthält Durchlässe oder Öffnungen, die so angeordnet sind, daß der Flüssigkeitsstrom vorzugsweise auf das Zentrum der porösem Membran hin oder von diesem weg gerichtet wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Septum in mindestens einem der Kanäle des Undurchlässigen Membran-Septums einen Formkörper eines porösen Materials. Dieser Formkörper liefert einen Kanal oder eine Leitung, um nur an den Kontaktpunkten den Flüssigkeitsstrom zwischen der porösen Membran und dem absorbierenden Formkörper zu verstärken.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Rezeptor-Reagenz in mindestens einem definierten Bereich, wie einen Punkt auf der Membran, konzentriert, wobei sich das nachweisbare Reaktionsprodukt an diesem Punkt bildet. Unter Bezug zu einem Sandwich-Assay für ein ausgewähltes Antigen, wird der Rezeptor-Antikörper beispielsweise an einem Punkt der Membran immobilisiert, um das Antigen zu binden. Das gebundene Antigen reagiert wiederum mit einem markierten, das gebundene Antigen bindenden Antikörper. Es können gleichfalls viele Punkte mit Antikörpern (oder Antigenen), die mit Unterschiedlichen Antigenen (oder Antikörpern) Spezifisch reagieren, verwendet werden, um Unterschiedliche Antigene in der Probe gleichzeitig zu untersuchen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Rezeptor-Reagenz auf einer porösen Membran immobilisiert, die mit Papier oder anderem Material, wie Polyester oder Fiberglas, unterstützte Nitrozellulose enthält.
In einem zweiten Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein Assay-Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung einer bindungsfähigen Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie derartige Substanzen enthält, wobei als eine Assay-Vorrichtung ein Apparat verwendet wird, welcher umfaßt:
(a) eine flüssigkeitsdurchlässige, poröse Reaktionsmembran mit einer oberen und einer unteren Oberfläche, wobei mindestens eine definierte Region der Membran oder mindestens die obere Oberfläche davon einen darauf immobilisierten Rezeptor besitzt, der direkt oder indirekt an die bindungsfähige Zielsubstanz binden kann,
(b) einen Formkörper eines absorptionsfähigen Materials, das in der Lage ist eine Flüssigkeit zu absorbieren, wobei der Formkörper eine Oberfläche besitzt, die der Unteren Oberfläche der porösen Membran benachbart ist,
(c) eine Trennvorrichtung zwischen der unteren Oberfläche der prösen Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials, um einen Flüssigkeitsfluß dazwischen im wesentlichen zu unterbinden, und
(d) Öffnungen durch die Trennvorrichtungen, um den Flüssigkeitsfluß im wesentlichen von der Unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran durch die Trennvorrichtungen zu leiten, wobei das Verfahren Aufbringen der Probe, einer visuell markierten Substanz und weiterer Reagenzien auf die obere Oberfläche der durchlässigen Reaktionsmembran umfaßt, wobei die aufgebrachte Flüssigkeit durch die Öffnungen von der unteren Oberfläche der Membran hindurchgehen und im wesentlichen auf mindestens einen ausgewählten Teil der benachbarten Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials gerichtet wird und anschließend die markierte Substanz, die an die obere Oberfläche als Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens der Zielsubstanz, die an die bindungsfähige Substanz auf der Oberfläche gebunden ist, nachzuweisen.
Die Erfindung wird nun durch Beispiele unter Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in welchen:
Figur 1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist;
Figur 2 ein Querschnitt mit fehlenden Teilen einer erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist;
Figuren 3a, 3b und 3c Grundrisse von alternativen Ausführungsformen eines Septums der Vorrichtung aus Figur 2 ist;
Figur 4 ein Querschnitt mit fehlenden Teilen einer anderen erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung ist;
Figuren 5a, 5b und 5c alternative Ausführungsformen des Septums sind darstellen;
Figuren 6, 7, 8 und 9 Querschnitte mit fehlenden Teilen von erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtungen sind.
Die Erfindung liefert eine neue und verbesserte Assay-Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten oder einer Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, insbesondere einer von einer biologischen Probe herrührenden Probe. Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält eine poröse Reaktionsmembran mit einem immobilisierten Rezeptor, der die Zielsubstanz direkt oder indirekt binden kann. Die Vorrichtung enthält darüber hinaus einen Formkörper eines absorbierenden Materials, das neben der porösen Membran angeordnet ist und die flüssige Probe absorbieren kann. Zwischen diesen Komponenten befindet sich ein Trennmittel in der Form eines Septums oder einer Folie, das/die die poröse Membran von dem absorbierenden Formkörper im wesentlichen trennt, während es/sie im wesentlichen den Fluß der flüssigen Membran von der porösen Membran zu dem absorbierenden Formkörper durch Öffnungen oder Kanäle durch das Septum leitet.
Bezug nehmend auf die Zeichnungen zeigt die Figur 1 eine beispielhaft dargestellte erfindungsgemäße Assay-Vorrichtung (10). Obwohl die Vorrichtung eine rechteckige Form aufweist, kann jede andere geeignete Formen verwendet werden und mit einer Öffnung zur Aufnahme und zeitweiligen Lagerung von Flüssigkeit versehen werden. Die Öffnung kann zweckmäßig in Form einer durch eine Wand engegrenzten, umgekehrt kegelförmigen Vertiefung sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird in Figur 2, die einen vertikalen Querschnitt der Vorrichtung aus Figur 1 zeigt, ausführlicher offenbart. Wie hier gezeigt, liegt die Vorrichtung in Form eines Behälters vor, der einen hohlen Aufnahmeraum oder eine Kammer (26) umgrenzt. Die Begrenzungen dieses Raums werden hier durch zwei Komponenten, (14) und (12), zur Verfügung gestellt. Diese werden hier der Einfachheit halber als Basis bzw. Abdeckung bezeichnet. Diese Komponenten werden zweckmäßig aus einem Einweg-Plastikmaterial, wie Polycarbonatpolyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Polyvinylchlorid oder aus einem haltbaren Material, wie Metall (beispielsweise Aluminium), das, wenn gewünscht, die erneute Verwendung der Vorrichtung (10) erlaubt, gebildet.
Wie gezeigt enthält der aufnehmende Raum (26) einen Formkörper aus einem absorbierenden Material (24), das von der porösen Reaktionsmembran (18) mittels eines Septums (20), dessen Funktionen nachstehend ausführlicher beschrieben werden, getrennt ist. Wie gezeigt enthält die Abdeckung (12) eine Vertiefung (16), die durch einen Flüssigkeit-zurückhaltenden Ring oder -Wand, die zweckmäßig zur Aufnahme der flüssigen Probe zum Erleichtern dessen Kontakts mit der Membran (18) geformt sind, begrenzt ist. Durch selektives Anpassen der Größe der Vertiefung (16) an den aufnehmenden Raum (26) und an den absorbierenden Formkörper (24) kann das Verfahren des vorliegenden Apparates vereinfacht werden, so daß beispielsweise die gesamte flüssige Probe oder wahlweise die Waschflüssigkeit in einem einzigen Vorgang in die Vertiefung (16) überführt werden kann.
Das Membranmittel (18) enthält, wie gezeigt, eine poröse Reaktionsmembran mit einer von außen sichtbaren oberen Oberfläche. Die Reaktionsmembran kann von jedem Typ sein, der dazu befähigt ist, das Reaktionsprodukt der Reagenzien und die Proben-Komponente zu immobilisieren ohne die Reaktion nachteilig zu beeinflussen, und den Durchgang der verbleibenden flüssigen Probe oder einer Waschlösung zu ermöglichen. Geeignete Membranen können aus jedem Material bestehen, die das in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendete Rezeptor-Reagenz immobilisieren, wie Nylon, Glasfasern oder andere natürliche oder synthetische Materialien, die an den ausgewählten Rezeptor direkt oder indirekt gekuppelt werden können. Die Porösität der Membran variiert vorzugsweise von etwa 0,2 bis 12 um.
In einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Membranmittel 18 jedoch mit Papier unterstützte Nitrozellulose oder andere Typen von Nitrozellulosemembranen mit ähnlichen Merkmalen. Diese Ausführungsform umfaßt eine mit einem porösem Papier unterstützte Nitrozellulosemembran, die einem Filterpapier ähnelt. Ein erläuterndes Beispiel dafür ist im Handel von Schleicher und Schüll unter dem Handelsnamen BAC-T- KOTE erhältlich. Diese bevorzugte Membran hält im wesentlichen länger als Nitrozellulose allein und kann ohne andere Träger-Komponenten verwendet werden. Sie liefert darüber hinaus für die Reaktion eine verstärkte Sensitivität. Mit Polyester unterstützte Nitrozellulose kann ebenfalls verwendet werden, wie sie unter dem Namen NITROPLUS von Mikron Separation Inc. vertrieben wird.
Wie nachstehend beschrieben, wird in einem typischen System zuerst ein Bindungsreagenz auf der Membran immobilisiert. Das Reagenz reagiert mit und fängt die vorbestimmte Zielsubstanz der zu untersuchenden flüssigen Probe. Ein derartiges Reagenz, gewöhnlich ein immunologisches Protein, wie ein Antikörper oder ein Antigen, kann auf derartigen Membranen, wie Nitrozellulose, durch Absorption oder kovalentes Binden direkt oder indirekt immobilisiert werden.
Die Tiefe oder Dicke der Membran wird so gewählt, daß eine ausreichende Menge des Bindungs-Reagenz zum Abfangen der Proben-Komponente immobilisiert werden kann. Die Dicke sollte jedoch nicht so groß sein, daß eine unverhältnismäßige Verzögerung des Durchgangs der flüssigen Probe durch die Membran bewirkt wird.
Der absorbierende Formkörper (24) der vorliegenden Vorrichtung, kann jede der bekannten und herkömmlich verwendeten Absorptionsmaterialien verwenden, die zum Ziehen einer Flüssigkeit durch eine poröse Membran, wie beispielsweise mittels Kapillarkräfte dienen. Als zweckmäßig bekannte Materialien sind beispielsweise Zelluloseacetatfasern, Polyester, Polyolefin und andere derartige Materialien. Es erwies sich ebenso als zweckmäßig, Schichten von im Handel erhältlichem Filterpapier, oder sogar Toilettenpapier zu verwenden, wobei diese so ausgewählt werden können, um ein ausreichendes Volumen zur Absorption der während des erfindungsgemäßen Assays verwendeten Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen.
Wie aus Figur 2 ersichtlich, liegt die Trennvorrichtung, die im wesentlichen das Membranmittel (18) von dem absorbierenden Formkörper (24) isoliert, in Form eines Septums (20) vor. Das Septum (20) besitzt äußere Formen, die für den in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Behälter geeignet sind. Das Septum (20), wie in Figur 3a gezeigt, kann beispielsweise aus einer Membran bestehen, die eine ausreichende Größe aufweist, so daß sie in einer Position zurückgehalten wird und durch die gegenüberliegende Abdeckung 12 auf der Basis 14 in Figur 2 versiegelt wird. Auf diese Art und Weise wird eine Versiegelung gebildet, die einen Flüssigkeitsfluß um die Reaktionsmembran (18) herum verhindert und den Fluß durch die Öffnungen oder Durchgänge (22) im Septum (20) kanalisiert. Geeignete Septum-Membrane können aus jedem Material gebildet werden, das für Flüssigkeiten im wesentlichen undurchlässig ist und wünschenswert nicht mit dem in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagenzien reagiert oder diese nicht schädigt, wie Membranen aus Plastikmaterial, wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder dergleichen.
Unter Bezug weiter zu Figur 3a besitzt das Septum aus der undurchlässigen Membran (20) eine darauf angeordnete Zone (21), deren Grenze eine imaginäre Linie darstellt, die mit den Abmessungen der darunterliegenden kegelförmigen Vertiefung (16) in etwa übereinstimmt. Dies ist die Zone, durch welche die Flüssigkeit von der unteren Oberfläche der porösen Membran (18) zu dem Absorptions-Formkörper (24) fließt. Innerhalb oder auf das Zentrum von Zone (21) in dem Septum der Ausführungsform von Figur 3a gerichtet, befinden sich Durchgänge oder Öffnungen (22a), die mit einem absorptionsfähigen, permeablen Material gefüllte Öffnungen darstellen, durch das die Flüssigkeit fließen kann. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie in Figuren 3a und 3c dargestellt, sind diese Durchgänge (22a) bzw. (22c) vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors ausgehend radial verteilt oder typischerweise im Zentrum von Zone (21), um den Flüssigkeitsfluß vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors weg auf die Ränder zuzuleiten. In einer alternativen Ausführungsform in Figur 3b wird die Vorrichtung mit einem Durchgang (22b) versehen, der nahe dem Zentrum des immobilisierten Rezeptors liegt und der den Flüssigkeitsstrom auf das Zentrum von Zone (21) hin leitet. Dieses Phänomen wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Figuren 4 und 5a-c zeigen alternative Septum-Mittel (20), wobei verschiedene Kombinationen eines ringförmigen Rings (23) aus einem absorptionsfähigem Material, das gleich oder von dem Material des absorptionsfähigen Formkörpers (24) verschieden sein kann, verwendet werden. Dieser Ring (23) in Figur 4 stellt die einzige Trennung zwischen dem Membran (18) und dem Formkörper (24) dar und ermöglicht einen ausgewählten Flüssigkeitsstrom-Kontakt zwischen begrenzten Bereichen der gegenüberliegenden Oberflächen des absorptionsfähigen Formkörpers. Der Ring wird durch Druck zwischen der Membran (18) und dem Formkörper (24) an seiner Stelle gehalten. Das Septum oder das Trennungsmittel ist der offene Bereich um oder innerhalb des Rings (23), der als Öffnung durch das offene Septum dient.
Figur 5a stellt einen Grundriß eines Rings (23a) in der Form, wie sie in der Vorrichtung in Figur 4 verwendet wird, dar. Die äußeren Abmessungen des Rings (23a) stimmen im Großen und Ganzen mit den Grenzen der Zone (21) überein oder sind kleiner. In dieser Ausführungsform wird der Flüssigkeitsstrom durch die poröse Membran (18) vom Zentrum der Zone (21) weg und durch den durch den Ring (23a) gebildeten Durchgang geleitet.
Unter Bezugnahme zu Figur 5b als eine alternative Ausführungsform, ist das Septum (20) in Form eines Rings (23b), das einen internen Anteil oder eine Scheibe (25b) aus dem im wesentlichen flüssigkeitsundurchlässigem Material beinhaltet, daß das gleiche sein kann, wie die vorstehend beschriebene Folie des Septums (20). Die Scheibe (25b) verstärkt die Fließrichtungsmöglichkeiten des Rings (23b), indem ein unbeabsichtigter Kontakt zwischen den Zentrumbereichen der Membranmittel (18) und des Formkörpers (24) und somit ein nichtgerichteter Flüssigkeitsstrom verhindert wird. Das Trennungsmittel ist hier die Kombination der offenen Bereiche außerhalb von Ring (23b) und der Scheibe (25b).
Als eine weitere alternative Ausführungsform ist das Septum (20) in Figur 5c als eine Membran eines Flüssigkeitsundurchlässigen Materials, ähnlich wie das in der Ausführungsform in Figur 3a, gezeigt. Das absorptionsfähige Material wird hier in eine undurchlässige Septum-Folie (20) inseriert und hält die undurchlässige Scheibe (25c) zurück. Dieses vollständige Septum ermöglicht eine weitere Kontrolle des Flüssigkeitsstroms in der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Unter Bezug zu Figur 6 enthält eine andere Ausführungsform der Vorrichtung eine Einheit oder ein Gehäuse oder eine Begrenzung (14), welche eine relativ breite Einfassung zum Kanalisieren der Flüssigkeit begrenzt. Darüber hinaus erstrecken sich die Membran (18) und der Absorptions-Formkörper (24) über das gesamte Innere des offenen Raums, wobei keine ringförmige Öffnung wie in der Ausführungsform von Figur 4 freigelassen wird. Das Septum (20) ist vom gleichen Typ wie in Figur 5c dargestellt. Die Flüssigkeit fließt hier, wie durch die Pfeile dargestellt, durch die Reaktionsmembran (18), vorzugsweise weg vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors, der gewöhnlich im Zentrum der oberen Oberfläche von Membran (18) die der Flüssigkeit ausgesetzt ist, angeordnet ist. Dies wird durch den das undurchlässige Septum (20) umgebenden Ring aus absorptionsfähigen Material (20b), das wiederum die undurchlässige Scheibe (20c) in ihrem Zentrum hält, bewirkt. Die Flüssigkeit auf der oberen Oberfläche der Membran (18) kann daher nur durch die Öffnungen (20b) fließen, was zu einem Fluß weg vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors führt.
Die Vorrichtung aus Figur 7 ist ähnlich der aus Figur 6, mit der Ausnahme, daß das Septum ähnlich wie das in Figur 4 ist. Das Septum umfaßt hier einen Ring (23a) mit einem gesamten offenen Bereich zum Zentrum hin und außerhalb des Ringes. Ein wirksamer Flüssigkeitskontakt zwischen der Membran (18) und dem Absorptionsmaterial (24) wird über den Ring (23a) hergestellt, durch den die Flüssigkeit vergleichbar dem Muster der Vorrichtung in Figur 6 fließt. Wie in Figur 4 zeigt dies, daß ein offener Bereich ein wirksames Trennmittel darstellen kann, wenn die Flüssigkeit einen Weg durch ein absorptionsfähiges Material, das dem Fluß weniger Widerstand entgegensetzt, finden kann.
Unter Bezug zu Figur 8 wird eine Vorrichtung ähnlich der in Figur 6 gezeigt, jedoch mit bestimmten wichtigen Unterschieden. Die Membran (18) liegt in Form einer Scheibe mit einem kleineren Durchmesser als die der Membran (18) in Figur 7 vor. Der wichtigste Unterschied ist, daß das Septum (20) so ausgebildet ist, daß die Flüssigkeit auf das Zentrum des immobilisierten Rezeptors (oder das Zentrum der Membran (18)) und nicht weg von diesem fließt. Dies wird durch Ausbilden einer Öffnung (20a) in einem Bereich direkt unterhalb des Zentrums des immobilisierten Rezeptors bewirkt. In der dargestellten Ausführungsform ist die Öffnung (20a) eine runde Scheibe mit einem Durchmesser, der im wesentlichen kleiner ist als der der Ausdehnung der exponierten oberen Oberfläche von Membran (18). Die Öffnung (20a) ist hier offen, wobei jedoch, wie in anderen Ausführungsformen ein absorptionsfähiges Material in die Öffnung gesetzt werden kann, um als Durchgang zu dienen.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist in Figur 9 gezeigt. Wie andere Vorrichtungen ist der Formkörper des Absorptionsmaterials (24) biegsam. Die Vorrichtung umfaßt weiter eine Plattform, zweckmäßig in Form eines Sockels oder eines Stöpsels (30), der aufwärts in das absorptionsfähige Material in Richtung auf das Zentrum des immobilisierten Rezeptors hin ragt. Der Stöpsel (30) ist vorzugsweise, wie gezeigt, ausreichend groß, so daß er, wenn er gegen das absorptionsfähige Material (24) gepreßt wird, ausreichend aufwärts gerichteten Druck gegen das absorptionsfähige Material weiter gibt, um ein Biegen des biegsamen, undruchlässigen Blattes (20) in eine leicht konvexe Form zu bewirken und infolgedessen die ungebogene Gestalt der Öffnung gegen das Zentrum hin ändert. Umfaßt das Absorptionsmaterial mehrere Schichten von Fasern (32), wie Filterpapier oder Papiertücher, neigen die Schichten oberhalb des Stöpsels (30) dazu, wie Schmetterlingsflügel auseinanderzufallen. Auf diese Art und Weise wird ein Raum zwischen dem Filterpapier in Form von Kanälen hergestellt, was im Vergleich zu dem eng zusammengepreßten, absorptionsfähigen Papier einen verbesserten Fluß ergibt.
Ein wichtiges Kennzeichen der Erfindung ist die Fähigkeit, die Kinetik der Reaktion durch Ausrichten des Flusses der untersuchten Probe entweder weg vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors oder auf ihn zu durch Wahl der Orte und des Typs der Öffnungen durch das Septum zu optimieren. Die Flußrate wird für den Verwender zweckmäßig schnell eingestellt, jedoch langsam genug, damit die Zielsubstanz abgefangen wird. Bei einigen stark viskosen Proben, wie Serum, die andernfalls die Reaktionsmembran verstopfen könnten, ist es darüber hinaus wünschenswert vom Zentrum weg zu fließen. Umgekehrt ist es für Proben niedriger Viskosität, wie Urin, bei denen ein Verklumpen kein Problem darstellt und bei denen die Ziel Substanz in einer geringen Konzentration vorkommen kann, wünschenswert, die Flüssigkeit auf das Zentrum der Reaktionsmembran fließen zu lassen.
Beim Betrieb wird die Assay-Vorrichtung des vorliegenden Systems zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer flüssigen Probe breit verwendet, wobei mindestens ein Reagenz zur Bildung eines nachweisbaren Produktes auf der Membran (18) als ein Indikator für die Anwesenheit des Analyten in der Probe verwendet wird. Die flüssige Probe wird auf einer Seite der Membran (18) mittels Einbringen durch die Öffnung in die Vertiefung (16) aufgebracht Nach Durchgehen durch die Membran (18) wird die Flüssigkeit durch und in den absorbierenden Formkörper (24) gezogen. Aufgrund der Wirkung des Septums (20) der Vorliegenden Vorrichtung kann die Flußrate und die Richtung dieser Flüssigkeit, da der Flüssigkeitsfluß zwischen der unteren Oberfläche der Membran (18) und der Oberfläche des absorbierenden Formkörpers (24) eingeschränkt ist, kontrolliert und entweder durch die Öffnungen (22) oder die durch das absorbierende Teil (24) gelieferte Leitung gerichtet werden. Die erfindungsgemäße Durchführung der Assays werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Bei den Spezifischen Vorrichtungen der Figuren 2-7 und 9 wird der Fluß vom Zentrum des immobilisierten Rezeptors weggeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich der Rezeptor in einem kleinen Bereich (beispielsweise einem Punkt), der insgesamt verfügbaren oberen Oberfläche der Membran (18) Es ist hier bevorzugt, daß sich der Probenfluß hauptsächlich in einem zu den äußeren Grenzen dieses kleinen Bereiches proximalen Musters abspielt. Auf diese Art und Weise tritt das meiste der (vorzugsweise im wesentlichen die gesamte) flüssigen Probe mit dem gesamten Umfang der Probe in Kontakt und wird nicht im Zentrum des Bereichs konzentriert, wie dies der Fall wäre, wenn die Öffnung durch das Septum ein offenes Zentrum wäre. Die letztgenannte Form einer Öffnung kann zum Verstopfen des Zentrums mit einer viskosen Flüssigkeit, wie Blutserum, führen. Andererseits werden die Öffnungen so ausgebildet, daß im wesentlichen die gesamte Probe mit dem Rezeptor-Bereich in Kontakt tritt und nicht ein größerer Teil die Ränder der Region umgeht, wie dies der Fall wäre, wenn gar kein Septum verwendet werden würde. Zu diesem Zweck ist eine bevorzugte Form einer Septumöffnung ein kontinuierlicher oder unterbrochener Ring, oder sein Aquivalent, der diesen ringförmigen Fluß bewirkt. Durch diese Einstellung des Flußmusters wird die Sensitivität des Systems für Proben niedriger Konzentration (beispielsweise HIV-Antikörper in Serum) ohne Verstopfen der Membran vergrößert.
Bei der Vorrichtung aus Figur 8 wird der Fluß auf das Zentrum des immobilisierten Rezeptors hin, beispielsweise in Form eines Punktes, durch Verwendung eines Septums mit einem offenen Zentrum, geleitet. Das offene Zentrum besitzt vorzugsweise einen äußeren Umfang, der dem äußeren Umfang des Punktes entspricht. Diese Ausführungsform ist besonders zur Erhöhung der Kinetik und Sensitivität für Proben niedriger Viskosität und einer Zielsubstanz niedriger Konzentration geeignet.
Das System ist insbesondere für einen Immunoassay geeignet, bei dem die Probe eine Komponente eines immonulogischen Paars ist, einschließlich Antigene, Antikörper oder Haptene. Das immonulogische Paar umfaßt zwei Komponenten, die immunologisch miteinander binden. Spezifische immonulogische Paare sind beispielsweise Antigene und ihre Antikörper (monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper), biologisch funktionelle Haptene und ihre Antikörper, Enzyme und ihre Substrate, Hormone und ihre Rezeptoren, Vitamine und ihre Rezeptoren, Biotin und entweder Avidin oder ein Antikörper gegen Biotin, und Lektin und seine spezifisch bindenden Mono-, Di- oder Trisaccharide.
Um die Beschreibung zu vereinfachen, wird das System mit Bezug zu Immunoassays beschrieben, die das immonulogische Paar Antigen-Antikörper verwenden. Die flüssige Probe ist biologischen Ursprungs (beispielsweise Urin oder Serum) und der das Reagenz umfaßt ein markiertes Antigen oder einen markierten Antikörper.
Mit Bezug zuerst zu einem Sandwich-Assay zum Nachweis eines Antigens ist das Reagenz ein markierter Antikörper, der für das vorbestimmte Antigen in der Probe spezifisch ist. In diesem System wird ein zweites Reagenz verwendet, einen abfangenden Antikörper, der ebenfalls für das vorbestimmte Antigen spezifisch und vor Zugabe der flüssigen Probe zu der Vorrichtung auf der Membranscheibe (24a) immobilisiert wurde. Die Verfahren zum Immobilisieren von Proteinen- wie monoklonale oder polyklonale Antikörper, auf festen Oberflächen, wie einer Membranscheibe (24a), ohne deren Desaktivierung sind wohl bekannt. Siehe beispielsweise Schuurs US-P-3 551 555 und Hendry et al., J. Immun. Methods 35 (1980), 285. Derartige Proteine können an Plastikmaterialien, wie Nylon, durch kovalentes Binden, wie beispielsweise in US-P- 3 720 760 beschrieben, immobilisiert werden. Die Menge des pro Einheitsbereich Nylon immobilisierten Proteins ist größer als die für Nitrozellulose.
Der markierte Antikörper oder das markierte Antigen, das unter Bezug zu dem Sandwich-Assay beschrieben wurde, kann von jedem herkömmlichen Typ sein, einschließlich eine radioaktive, Enzym- oder eine Metallkomplex-Sonde, die an den Antikörpern gebunden ist. Die Bildung von Konjugaten zwischen derartigen immunulogischen Substanzen und Sonden sind wohl bekannt. Siehe beispielsweise (a) radioaktive Sonden - US-P 3 646 346, Hunter et al., Nature 142 (1962), 945, (b) Enzym-Ssonden - US-P 3 654 090, US-P 3 791 931 und US-P 3 817 838, Wilson et al., Immunofluorescence and related staining techniques, Knapp, W. et al., Hrsg. L. Sevier-North Holland, Bio-Medical Press, New York- Amsterdam (1978), 215-224, (c) Fluoreszenz-Quenschsonden - US- P 3 996 345, (d) radioaktive Sonden - US-P 4 062 733, (e) Fluoreszenz- oder Enzym-Sonden - US-P 4 067 959, (f) Chemoluminiszenz-Sonden - US-P 4 104 029, (g) nicht-enzymatische Katalysatorsonden - US-P 4 160 645, (h) Enzympaar-Sonden-US-P 4 233 402, chemisch induzierte Fluoreszenz-Sonden - US-P 4 720 450 und (i) Enzym-nicht ionische Ladungs-Sonden - US-P 4 287 300.
Darüber hinaus können die in US-P 4 366 241 beschriebenen Sonden verwendet werden. Koloidale Goldsonden werden zudem nachstehend ausführlicher beschrieben.
Koloidale Gold-Konjugate, die für Sonden, wie zytochemische Sonden zweckmäßig sind, sind in der Mikroskopie wohl bekannt. Siehe beispielsweise Scanning Electorn Microscopy (1981) II, 9-31, Immunocytochemistry, Hrsg. Polak, J.N. et al., Bristol, London, Boston (1982), 82-112 und Journal of Neuroscience Methods 7 (1983), 1-18. Im Vergleich zu anderen herkömmlichen Sonden sind koloidale Goldteilchen-Sonden einfach zu verwenden. Sie erfordern beispielsweise keine zum Nachweis anderer Sonden, wie radioaktiver Isotope, notwendigen Instrumente. Darüber hinaus erfordern sie nicht, wie Enzyme, einen zusätzlichen Schritt der Zugabe eines Substrats. Sie wurden jedoch nicht für im Handel erhältliche Immunoassay-Kits genutzt, höchstwahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Sichtbarkeit bei Verwendung herkömmlicher Techniken zum Mischen von Reaktanten. Die Sensitivität eines Assays mit kolloidalen Gold- Konjugaten in einem Membransystem des Standes der Technik wurde bis jetzt als unzureichend erachtet, den gewünschten Grad an Sensitivität zur Verfügung zu stellen. Es wurde gefunden, daß durch Leiten des Flusses der flüssigen Probe und der Reagenzien durch die Membran die Sensitivität so erhöht wird, daß kolloidale Goldteilchen-Konjugates, ohne das Erfordernis teuere Mikroskope zu verwenden, nützliche für Immunoassay-Kit Reagenzien darstellen.
Wenn die Sensitivität des immunologischen Gold-Reagenz- Konjugat unzureichend ist, sogar mit der Verbesserung durch das vorliegende System, kann ein Verfahren zum Verstärken der Sensitivität des Gold-Komplexes verwendet werden, wie es in Holgate, C.S. et al., J. Histochem. Cytochem. 31:938 (1983) und in Dancher, G. et al. J. Histochem. Cytochem. 31:1394 (1983) beschrieben ist. Dieses System ist ein "indirektes" Verfahren, das eine Technik verwendet, bei der ein imunologisches Reagenz, ein an kolloidales Gold absorbiertes Immunoglobulin eingesetzt wird. Die Gold-Teichen werden durch Silber-Präpzipitations- Reaktion sichtbar gemacht. Die Silber-Verstärkung benutzt den Vorteil der katalytischen Verstärkung von Gold, den Umwandlungsprozess des photographischen Entwicklers, der Silberionen zu silbermetall reduziert, zu katalysieren. Die geeignete Teilchengröße des kolloidalen Golds oder Gold-Sols beträgt 3 nm bis 150 nm. Dieses Immuno-Gold-Silber-Färbeverfahren kann, verglichen mit der Verwendung von Gold-teilchen ohne Silber-Anfärbung eine Verstärkung von bis zu 200 fach erbringen.
Die Wirkung des gerichteten Flusses ist besonders ersichtlich, wenn das immunologische Reagenz in einer spezifischen Region konzentriert ist, wie in einem Punkt auf der Membran, wie nachstehend beschrieben wird. In diesem Fall ist der immobilisierte Antikörper nur auf diesem Punkt abgelagert. Bei herkömmlichen Verfahren kommt nur das Antigen in der Probe, das sich in einer immaginären Säule über dem Punkt befindet, mit dem Antikörper in Kontakt. Das restliche Antigen in der Probe passiert die Membran ohne einen derartigen Kontakt. Im Gegensatz dazu führt das Leiten des Flusses der flüssigen Probe, die das Antigen enthält dazu, daß deutlich mehr Antigen dem immobilisierten Antikörper auf der Membran ausgesetzt wird, was zu den vorstehend beschriebenen, vorteilhaften Ergebnissen führt. Dieses Prinzip erhöhter Effizienz läßt sich auf jeden herkömmlichen Immunoassay anwenden, bei dem das vorliegende System verwendet werden kann. Darüber hinaus steigert die erhöhte Effizienz oder Interaktion die lokale Konzentration der Reaktanten was wiederum die Reaktionskinetik erhöht.
Die vorliegende Erfindung läßt sich auch auf die kompetitive Bindungstechnik anwenden. In einem derartigen System zum Nachweis von Antigenen in einer flüssigen Probe, wird der entsprechende Partner des immunologischen Paars, daß heißt der Antikörper, auf der Membranoberfläche immobilisiert. Das in der gleichen Art und Weise wie vorstehend beschrieben markierte Antigen vom gleichen immunologischen Typ wie das in der Probe zu analysierende Antigen wird mit dem immobilisierten Antikörper auf der Membran in Kontakt gebracht. Der immobilisierte Antikörper liegt in begrenzter Menge vor, wobei sich eine Konkurrenz zwischen dem Antigen in der Probe und dem markierten Antigen ergibt. Das von dem Marker ausgesendete Signal ist somit umgekehrt proportional zur Menge des Antigens in der Probe. Wie bei dem Sandwich-Assay kann der kompetitive Bindungsassay durchgeführt werden, indem die Rollen des Antigens und des Antikörpers vertauscht werden. In diesem Fall ist der immobilisierte Partner des immunologischen Paars das Antigen zum Nachweis des Antikörpers in der Probe der mit markiertem Antikörper konkurriert.
Die beschriebenen Immunoassays sind der Sandwich-Assay und der kompetitive Bindungs-Assay. Es sollte klar sein, daß das System auch für andere Immunoassays, wie beispielsweise das in US-P 4 366 241 beschriebene, eingesetzt werden kann.
Die zu analysierenden Substanzen umfassen einen weiten Bereich Substanzen biologischer Natur, wie beispielsweise Proteine. Nachfolgend wird eine Liste von einigen dieser Substanzen gegeben. (Die aufgelisteten Substanzen umfassen auch immunologisch reaktive Antikörper und Fraktionen der Substanzen).

Immunglobuline

IgE
IgA
Igm
IgD

Microorganismen

Aerobacter aerogenes
Aerobe Sporen-bildende Bacillen
Bacillus anthracis
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Anaerobe Sporen-bildende Bacillen
Clostridium botulinum
Clostridium tetani
Clostridium perfringens
Brucellae
Brucella melitensis
Brucella abortus
Brucella suis
Chlamydia (nicht-klassifizierbare Parasiten/Bacterien/Viren)
Chlamydia agents (Bezeichnung unsicher)
Chlamydia trachomatis
Corynebacterien
Corynebacterium diptheriae
Escherichia coli
Pilze
Cryptococcus neoformans
Histoplasma capsulatum
Coccidioides immitis
Candida albicans
Mucor corymbifer (absidia corymbifera)
Hemophilus-Pordetella Gruppe
Heinophilus influenzae
H. ducreyi
H. hemophilus
H. aegypticus
H. parainfluenzae
Keibsiella pneumoniae
Mycobacterien
Mycobacterium tuberculosis hominis
Mycobacterium bovis
Mycobacterium avium
Mycobacterium leprae
Mycobacterium paratuberculosis
Mycoplasmen
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma hominis
Neisseriae
Neisseria meningitidis
Neisseria gonorrheae
Andere Pathogene
Listeria monocytogens
Pasteurellae
Pasteurella pestis
Pasteurella multocida
Pneumococcen
Diplococcus pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Rickettsiae (Bacterien-ähnliche Parasiten)
Rickettsia prowazekii
Rickettsia mooseri
Rickettsia rickettsii
Rickettsia conori
Rickettsia australis
Rickettsia tsutsugamushi
Rickettsia burnetii
Salmonella choleraesus
Salmonella typhimurtum
Salmonella tvphosa
Shigella arabinotardo
Shigella boydii
Shigella dysenteriae
Shigella flexneri
Shigella schmitzii
Shigella Sonnei
Staphylococcen
Staphylococcus aureus
Staphylococcus albus
Streptococcen
Streptococcus pyogenes
Groups B, C, D, F, G
Die Spirocheten
Treponema pallidum
Borrelia recurrentis
Leptospira icterohemorrhagiae
Leptospira canicola
Toxoplasma gondii

Peptid- und Protein-Hormone

Corticotropin (ACTH) (Adrenocorticotropin Hormon)
Follicle-stimulierendes Hormon
Luteinotropes Hormon (interstitialles Zellen-stimulierendes Hormon)
Parathyroid Hormon
Prolactin
Chorion Gonadotropin
Insulin
Glucagon
Relaxin
Somatropin
Triiodothyronine
Thyrocalcitonin
Thyroxine

Gewebs-Hormone

Angiotensin I and II
Bradykinin
Gastrin
Humanes Placenta-Lactogen
Secretin

Peptid-Hormone

Oxytocin
Vasopressin

Viren

Adenoviren
Arboviren
Eastern Equine Encephalitis-Virus
Western Equine Encephalitis-Virus
Sindbis-Virus
Semliki Forest-Virus
St. Louis Encephalitis-Virus
California Encephalitis-Virus
Colorado Zecken Fieber-Virus
Gelbfieber-Virus
Dengue-Virus
Hepatitis
Hepatitis A Virus
Hepatitis B Virus
Herpes-Viren
Herpes simplex, Typ I und II
Varicella (Hühnerpocken)
Cytomegalovirus
Myxoviren
Influenza (A, B, and C)
Parainfluenza (1-4)
Mumps-Virus
Newcastle-Krankheit Virus
Muskel-Virus
Canine Distemper-Virus
Atem-Syncytia-Virus
Rubella-Virus
Picornaviren
Poliovirus
Coxsackievirus
Echovirus
Rhinovirus
Pocken-Viren
Vaccinia
Molluscum contagiosum
Das System kann bei anderen Assay-Systemen verwendet werden, die nicht als Immunoassays klassifiziert sind, beispielsweise beim Nachweis unbekannter DNA-Sequenzen. Eine flüssige Probe, die die unbekannte DNA-Sequenz enthält wird beispielsweise durch die Membran geleitet und auf der Membran durch Kontakt mit DNA die zuvor auf der Membran immobilisiert wurde immobilisiert. Dann wird eine markierte DNA-Probe in einer Flüssigkeit durch die Membran geleitet. Bei Hybridisierung wird die markierte DNA-Probe in nachweisbarer Form auf der Membranoberfläche festgehalten. Dieses System ist in Polsky-Cynkin R., et al., Clin. Chem. 31/9 (1985), 1438 beschrieben.
Wie vorstehend erwähnt, wird in einem besonders wirksamen Assay das immonulogische Reagenz in mindestens einer definierten Region auf der Membran, die als ein Punkt erscheint, tatsächlich jedoch eine Säule mit dem Durchmesser von etwa dem Punkt durch die Membran darstellt, konzentriert. Mit Bezug zu einem Sandwich- oder kompetitiven Bindungs-Verfahren wird dies beispielsweise durch Immobilisieren des immunologischen Anfangreagenzes, beispielsweise des Antigens oder des Antikörpers, erreicht, indem das Reagenz, das immobilisiert werden soll, nur in dieser Region durch die Membran in ihrer Dicke fließen gelassen wird. Die Reaktion mit der Probenkomponente und dem markierten Reagenz erfolgt nur in dieser Region.
Der Ansatz in einem Punkt hat bestimmte Vorteile, wie die Durchführung mehrerer Untersuchungen gleichzeitig mit einer einzigen Vorrichtung. Dies wird nachstehend beschrieben. Er liefert zudem ein ausgeprägteres Endprodukt-Signal, da er in einer einzigen Region konzentriert ist.
Ein anderer Vorteil des Ansatzes in einem Punkt ist, daß er den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Komponenten in einer Probe erlaubt. Beispielsweise können mit einer einzigen Assay- Vorrichtung zwei unterschiiedliche, für vorbestimmte verschiedene Antigene spezifische Antikörper, auf einzelnen Stellen auf der Membran immobilisiert werden. Die Probe, von der angenommen wird, daß sie eines der Antigene enthält, wird dann mit der Membran und dem markierten, für die zwei verschiedenen Antigen spezifischen Antikörper, in Kontakt gebracht. Ein durch die Sonden an dem einen oder dem anderen der Punkte erzeugtes Signal weist auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder beider Antigene hin. Die Punkte können durch ihren Ort oder durch eine Identifizierung neben jedem Punkt mit dem immobilisierten Antikörper voneinander unterschieden werden. Wenn daher beispielsweise an dem ersten Punkt eine Färbung auftritt, jedoch nicht bei dem zweiten, ist das erste Antigen nicht jedoch das zweite vorhanden. Wenn beide Punkte sichtbar werden, sind beide Antigene vorhanden und werden keine Punkte sichtbar, ist keines der Antigene vorhanden. Alternativ kann die Sonde so ausgewählt werden, daß sich an jedem der Punkte verschiedene Farben ergeben.
Dieses System könnte erweitert werden, um die gleichzeitige Erfassung von mehr als zwei Komponenten der flüssigen Probe durch eine entsprechende Anzahl immobilisierter immunologischen Reagenzien auf der Membran zu ermöglichen. In einigen Fällen ist ein erster Antikörper mit einer bestimmten Untereinheit einer Anzahl verschiedener Antikörper reaktiv. Ist ein zweiter Antikörper für eine Untereinheit nur eines Antigens spezifisch, kann ein derartiger Antikörper als der immobilisierte Antikörper verwendet werden. Damit kann ein einziger markierter erster Antikörper als der universelle, markierte Antikörper für das Antigen von Interesse verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung können die Standardprotokolle für herkömmliche Immunoassays verwendet werden. In einem Sandwich-Assay beispielsweise kann die Zugabe der Probe und des markierten Reagenz gleichzeitig oder nacheinander erfolgen.
Während monoklonale Antikörper gegenüber polyklonalen Antikörpern bekannte Vorteile und Reinheit aufweisen, kann erfindungsgemäß jeder Typ von immunologischen Reagenzien verwendet werden.
Während das vorstehende System im Sinne von ja/neinquantitativen Untersuchungen beschrieben ist, sollte klar sein, daß es auch als semiquantitative Untersuchung unter Verwendung geeigneter Signale, wie Farben, die jeweils bei bestimmten bekannten Konzentrationen der zu analysierenden Komponente gebildet werden, geeignet ist. Das System kann daher beispielsweise zur Analyse eines Antigens mittels eines Sandwich-Verfahrens mit fortschreitender Verdünnung durchgeführt werden, um eine Annäherung der für eine bestimmte Verdünnung zu erwartenden Farbe zu erhalten. Die unbekannte Konzentration eines Antigens wird mit diesen Farben verglichen, um eine Annäherung der Konzentration des in der Probe vorhandenen Antigens zu ergeben.
Eine weitere Offenbarung der Natur der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden spezifischen Beispiele geliefert. Es sollte klar sein, daß die offenbarten Beispiele nicht dazu gedacht sind, den Bereich der Erfindung zu begrenzen.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird eine Vorrichtung vom in Figur 8 gezeigten Typ verwendet, bei der eine Probe vorzugsweise zum Zentrum des immobilisierten Rezeptors fließt. Für das Antigen humanes Chriongonadotropin (hCG) in einer Unrinprobe die eine bekannte Menge hCG enthält, wird ein Sandwich-Immunoassay erläutert. Monoklonale und polyklonale Antikörper wurden als irnrnobilisiertes Reagenz bzw. als das markierte Reagenz verwendet. Das markierten Konjugat enthält ein Goldsol das gemäß der von Faulk, W. P. et al., Immunochem. 8 (1981), 1081 beschrieben Verfahren hergestellten wurde. Kurz zusammengefaßt, 100 ml destilliertes Wasser das 0,01% Gold (I)-Chlorwasserstoffsäure enthält, wird mit 4 ml 1% Trinatriumcitrat gemischt und 15 Minuten gekocht. Die Farbe der Lösung verändert sich von gelb zu rot bei einer optischen Dichte bei 520 nm von etwa 1 n.
Das gebundene immunologische Reagenz ist ein von Medix gelieferter anti-α-Untereinheit-hCG-monoklonaler Antikörper. Eine Membran (18) aus einer mit Papier unterstützten Nitrozellulose (geliefert von Schleicher und Schuell) wird verwendet. Der Anti-α-hCG-Antikörper wird drei mal in einer Menge von 5 ul bei einer Konzentration von 1-2 mg/ml auf einen begrenzten Bereich mit einem Durchmesser von etwa 9 mm auf die angefeuchtete Scheibe aufgebracht. Nach Trocknen wird die angeimpfte Scheibe mit einer blockierenden Lösung, die 5% DSA und 0,01% Natriumazid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthält, inkubiert, wobei die unspezifische Bindung an die Nitrozellulose vermindert wird, und in die vorstehend beschriebene Vorrichtung gelegt.
Ein monoclonaler Anti-β-Untereinheit-hCG-Antikörper (von Medix geliefert) wird gemäß dem vorstehenden Verfahren von Roth mit diesem Goldsol konjugiert und in einem Bad mit einer Temperatur von -50º Fahrenheit eingefroren. Danach wird es gefriergetrocknet. Eine 140ul Urinprobe wird in die Vertiefung (16), auf die obere Oberfläche von Membran (18), eingebracht. Die Probenlösung wird dann mittels des Absorbtionskörpers (24) entweder durch die Durchgänge (22) oder durch die Röhre aus dem kreisförmigen Ring (23) durch die Membran (18) gezogen.
Der Flüssigkeitsfluß wird beispielsweise beim Durchgang durch die Membran (18) durch Durchgänge (22), die in der Scheidewand (20) angeordnet sind zur unteren Oberfläche der Membran (18) geleitet. Auf diese Art und Weise wird die Sensitivität des Assays erhöht, da die Flüssigkeit dazu gebracht wird, sowohl transversal als auch vertikal durch die Membran zu fließen. Zusätzlich wird die Flußrate der Flüssigkeit durch die Größe der Durchgänge kontrolliert, was die Entwicklung einer optimalen Inkubationszeit für die Assay-Reaktion erlaubt. Dies ermöglicht die visuelle Ablesung eines roten Punktes auf der Membran unter Verwendung kolloidaler Goldpartikel bei Antigenkonzentrationen, bei denen dies normalerweise nicht möglich wäre.
In diesem Beispiel wurden 102 klinische Urinproben (51+ und 51-) getestet. Diese stiimten zu 100% mit den klinischen Ergebnissen der Probenquellen überein. Die Sensitivität wurde zu 25 mIU hCG/ml bestimmt.

Beispiel 2

In diesem Fall wurde eine Vorrichtung vom in Figur 9 gezeigten Typ verwendet, bei der die Probe vorzugsweise vom Zentrum des irninobilisierten Rezeptors weg fließt. Ein Sandwich- Assay wurde durchgeführt bei dem das Antigen auf der Membran immobilisiert wurde, ein Antikörper-Analyt aus einer Serumprobe analysiert werden sollte und der markierte Antikörper ein Konjugat eines Anti-Antikörpers gegen den in der vorstehend beschriebenen Art und Weise mit kolloidalem Gold markierten Proben-Antikörper war. In diesem Fall war der verwendete Anti- Antikörper Staphylococcus aureus A-Protein, das als universeller Anti-Antikörper dient.
Das Antigen, ein HIV-Lysat (E.I. DuPont de Wilmington, DE) mit 2mg/ml in einem DuPont-Puffer, der Detergens und Ethylenglycol enthielt, wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf eine Nitrozellulosemembran-Scheibe aufgebracht. Die blockierende Reaktion wurde mit 100ul des geschützten DuPont-Puffers oder einem äquivalenten Puffer, der 5% BSA, 0,05% Tween-20, 0,1% Natriumazid und 10% Ziegenserum in PBS enthielt, durchgeführt.
Eine Probe des Serums, von dem angenommen wird, daß es Antikörper gegen das Antigen enthält, wird durch eine 1:4 Verdünnung mit dem DuPont-Puffer hergestellt. 50ul werden in die Vertiefung (16) eingebracht und wie vorstehend beschrieben durch die Membran (18) fließen gelassen. Die Membran (18) wird dann mit 50ul DuPont-Puffer oder PBS gewaschen. Anschließend werden 50ul des markierten Protein A (zweiter Antikörper), mit einem OD&sub5;&sub2;&sub0;-Wert von 3,5, in ähnlicher Weise durch die Membran geleitet, und zusätzlich mit weiteren 50ul gewaschen. Eine positive Reaktion wird durch einen deutlichen roten Punkt auf der Membran angezeigt.
In diesem Beispiel wurden 200 Proben (31+ und 169-) getestet, und stimmten zu 100% mit den berichteten Befunden der Probenquellen überin, wie durch DuPont ELISA bestimmt worden wra. Die positiven Proben wurden durch Westernblot-Analyse bestätigt.
Nach Betrachten der vorliegenden Offenbarung sind offensichtlich viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich. Es ist daher klar, daß die Erfindung innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche in anderer Art und Weise als spezifisch beschrieben verwendet werden kann.

Claims

1. Lager- und Reaktions-Vorrichtung zur Verwendung in Untersuchungen zur Erfassung und/oder Bestimmung einer bindungsfähigen Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie eine derartige Substanz enthält, umfassend:

(a) eine flüssigkeitsdurchlässige, poröse Reaktionsmembran mit einer oberen und einer unteren Oberfläche, wobei mindestens eine definierte Region der Membran oder mindestens die obere Oberfläche davon einen darauf immobilisierten Rezeptor besitzt, der direkt oder indirekt an die bindungsfähige Zielsubstanz binden kann,

(b) einen Formkörper eines absorptionsfähigen Materials, das in der Lage ist eine Flüssigkeit zu absorbieren, wobei der Formkörper eine Oberfläche besitzt, die der unteren Oberfläche der porösen Membran benachbart ist,

(c) eine Trennvorrichtung zwischen der unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials, um einen Flüssigkeitsfluß dazwischen im wesentlichen zu unterbinden, und

(d) Öffnungen durch die Trennvorrichtung, wobei der Flüssigkeitsfluß im wesentlichen von der unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran durch die Trennvorrichtung geleitet wird,

wobei die auf die obere Oberfläche der porösen Reaktionsmembran aufgebrachte flüssige Probe in einem ausgewählten Fließmuster zu deren unteren Oberfläche durchdringt und im wesentlichen zu mindestens einem ausgewählten Teil der Oberfläche des Formkörpers des absorbierenden Material geleitet wird.

2. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 1, worin die Menge der an die obere Oberfläche der Membran bindenden Substanz, wenn sie zusammen mit einer entsprechenden, visuell markierten Substanz gebunden ist, ausreicht, eine direkte, visuelle Erfassung oder Bestimmung der Zielsubstanz zu ermöglichen.

. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, worin die poröse Membran Nitrocellulose umfaßt.

4. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 3, worin die Nitrocellulose-Membran weiter mindestens ein flüssigkeitsdurchlässiges, in engen Kontakt damit gebundes Trägermaterial umfaßt.

5. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 4, worin das Trägermaterial Papier, Fiberglas oder Polyester ist.

6. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Öffnungen radial vom Zentrum des Bereichs, an dem der Rezeptor immobilisiert ist, entfernt sind und dazu dienen, den Flüssigkeitsfluß vom Zentrum des Bereichs, an dem der Rezeptor immobilisiert ist, radial wegzuleiten.

7. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 6, worin die Öffnungen einen Ring oder einen Teil davon umfassen, der vom Zentrum des Bereichs, an dem der Rezeptor immobilisiert ist, radial entfernt ist.

8. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Öffnungen mindestens einen Durchgang in der Nähe des Zentrums des Bereichs, an dem der Rezeptor immobilisiert ist, umgeben von der Trennvorrichtung, umfaßt, und dazu dient, den Flüssigkeitsfluß zum Zentrum des Bereichs, an dem der Rezeptor immobilisiert ist, zu leiten.

9. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in der der immobilisierte Rezeptor in einem begrenzten Bereich der oberen Oberfläche der Reaktionsmembran konzentriert ist.

10. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 9, worin sich die Öffnungen in der Nähe des Randes des begrenzten Bereichs befinden.

11. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Trennvorrichtung eine flüssigkeitsundurchlässige Schicht enthält.

12. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Öffnungen mindestens eine Öffnung durch die undurchlässige Schicht enthalten.

13. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 11, worin die Öffnungen mindestens einen flüssigkeitsdurchlässiges Material enthaltenden Durchlaß in die undurchlässige Schicht umfaßt.

14. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche ein Dichtungsmittel umfaßt, das dazu dient, daß im wesentlichen die gesamte, auf die obere Oberfläche der porösen Membran aufgebrachte Flüssigkeit in einem durch das Dichtungsmittel radial begrenzten Bereich durch die Membran fließt.

15. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das absorptionsfähige Material geschmeidig ist und die Vorrichtung außerdem Mittel umfaßt, die das absorptionsfähige Material definieren und die eine Grundwand und eine Plattform enthält, die auf der Grundwand nach oben gerichtet in das absorptionsfähige Material in das Zentrum der Region des immobilisierten Rezeptors, angeordnet ist.

16. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die Plattform genügend aufwärts gerichteten Druck auf das absorbierende Material ausübt, um die undurchlässige Schicht zu biegen und die ungebogene Form der Öffnungen zu verändern.

17. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 16, worin die Öffnungen radial vom Zentrum des Bereichs des immobilisierten Rezeptors entfernt sind.

18. Lager- und Reaktions-Vorrichtung nach Anspruch 17, worin sich das Innere des Formkörpers des absorbierenden Materials unter dem der durch die Plattform ausgeübten Druck verbreitert und Kanäle bildet, wobei vom Zentrum des Bereichs des immobilisierten Rezeptors Flüssigkeit durch diese Kanäle nach außen fließen kann.

19. Untersuchungsverfahren zur Erfassung und/oder Bestimmung einer bindungsfähigen Zielsubstanz in einer flüssigen Probe, von der angenommen wird, daß sie derartige Substanzen enthält, wobei als Untersuchungsvorrichtung ein Apparat verwendet wird, welcher umfaßt:

(c) eine Trennvorrichtung zwischen der unteren Oberfläche der prösen Reaktionsmembran und der oberen Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials, um einen Flüssigkeitsfluß dazwischen im wesentlichen zu unterbinden, und

(d) Öffnungen durch die Trennvorrichtungen, um den Flüssigkeitsfluß im wesentlichen von der unteren Oberfläche der porösen Reaktionsmembran durch die Trennvorrichtungen zu leiten,

wobei das Verfahren Aufbringen der Probe, einer visuell markierten Substanz und weiterer Reagenzien auf die obere Oberfläche der durchlässigen Reaktionsmembran umfaßt, wobei die aufgebrachte Flüssigkeit durch die Öffnungen von der unteren Oberfläche der Membran hindurchgehen und im wesentlichen auf mindestens einen ausgewählten Teil der benachbarten Oberfläche des Formkörpers des absorptionsfähigen Materials gerichtet wird und anschließend die markierte Substanz, die an die obere Oberfläche als Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens der Zielsubstanz, die an die bindungsfähige Substanz auf der Oberfläche gebunden ist, nachzuweisen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Menge der bindenden Substanz auf der oberen Oberfläche der porösen Reaktionsmembran ausreicht, den direkten visuelle Nachweis oder die Bestimmung der markierten Substanz zu ermöglichen.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin mindestens eines der bindungsfähigen und bindenden Substanzen eine immunochemische Substanz ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, worin die poröse Reaktionsmembran der Vorrichtung Nitrocellulose umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die poröse Nitrocellulosemembran weiter mindestens ein Trägermaterial umfaßt, das in engem Kontakt damit gebunden ist.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, worin die Zielsubstanz durch Verwendung einer markierten Substanz mit einer Sonde erfaßt wird, die kolloidale Gold-Teilchen oder chelatierte Goldteilchen enthält.