DE3782597T2

DE3782597T2 - Immunodiagnostische vorrichtung.

Info

Publication number: DE3782597T2
Application number: DE8787308227T
Authority: DE
Inventors: Fon-Chiu Mia Chen; Eugene Fan; Siu-Yin Wong
Original assignee: Pacific Biotech Inc
Current assignee: Pacific Biotech Inc
Priority date: 1986-09-18
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2007-09-18
Also published as: DE3783920D1; CA1340320C; EP0260965B2; DE3783920T2; DE3782597D1; EP0260965A3; DE3782597T3; JP2638600B2; EP0260965B1; EP0342771B1; EP0342771A3; EP0342771A2; JPS6388460A; EP0260965A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die hier beschriebene Vorrichtung und das hier beschriebene Verfahren erleichtern diagnostische Analysen, die die Bildung und den Nachweis von Partikelkomplexen, insbesondere von Immunkomplexen umfassen und die schwer oder unpraktisch durchzuführen sind. Traditionelle Testmethoden für Partikelkomplexe sind vor allem wegen der zur Durchführung der Analyse erforderlichen Wiederholungsschritte, aber auch wegen der Komplexität der zur Ausführung der Analyse benötigten Laborausstattung zeitaufwendig und kostspielig. Darüber hinaus erfordern diese Tests oft Extraktions- und Waschschritte als Zwischenschritte, um störende Substanzen in der Probe zu entfernen.
Ein Hauptziel in der Entwicklung von immunodiagnostischen Testsystemen ist es, die Zeit zu verringern, die der Benutzer zur Vollendung der Analyse benötigt. Infolgedessen wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um die Anzahl der zur Durchführung der Analyse erforderlichen Schritte zu reduzieren mit dem endgültigen Ziel, eine Analyse zu haben, die in einem einzigen Bearbeitungsschritt durchzuführen ist. Letztere gibt es zur Zeit nicht.
Zusätzlich zur Verringerung der Zeit, die benötigt wird, um die diagnostischen Tests durchzuführen, ist es eine weitere wünschenswerte Eigenheit dieser Systeme, daß sie längere Zeit bei Raumtemperatur stabil bleiben. Im allgemeinen enthalten Diagnosevorrichtungen verschiedene Reagenzien, die unterschiedliche Temperaturstabilitäten aufweisen. Einige dieser Reagenzien sind für kurze Zeit bei Raumtemperatur stabil, während andere sogar weniger stabil oder überhaupt nicht stabil sind. Die Einwirkung von Temperatur auf die Reagenzien vermindert die Empfindlichkeit sowie die Zuverlässigkeit dar Analyse und verstärkt den Hintergrund. Die meisten handelsüblichen Diagnosevorrichtungen, die zur Zeit verfügbar sind, erfordern, daß eines oder mehrere der zur Ausführung der Analyse verwendeten Reagenzien bei niedriger Temperatur aufbewahrt werden, um ihre Stabilität zu gewährleisten. Tatsächlich zeigt Tabelle 1, daß entweder die gesamte Diagnosetestausrüstung, oder die in der Testausrüstung enthaltenen Reagenzien der drei Hauptlieferanten, die hormonale Schwangerschaftstestausrüstungen herstellen, bei niedriger Temperatur aufbewahrt werden müssen, um wirksam zu sein. Aus diesem Grund hätte ein diagnostisches Testsystem, das für längere Zeit bei Raumtemperatur stabil bleibt, einen deutlichen Vorteil gegenüber Vorrichtungen, die dem Stand der Technik entsprechen.
Die meisten Diagnosevorrichtungen, die gegenwärtig im Gebrauch sind, basieren auf der "Sandwich"-Analyse. Hier wird das Analysematerial oder die zu analysierende Substanz mit einem Überschuß an Antikörpermolekülen, die an festes Matrixmaterial gebunden sind, inkubiert. Danach wird ein zweiter, markierter Antikörper, der jedoch gegen eine zweite Determinante auf dem Analysematerial gerichtet ist, ebenfalls im Überschuß mit dem Immunkomplex inkubiert, der sich mit dem ersten, an dem festen Matrixmaterial haftenden Antikörper gebildet hat. Das Vorhandensein von markiertem Antikörper auf der Oberfläche des Immunkomplexes wird durch geeignete Mittel, abhängig von der Art der verwendeten Markierung, nachgewiesen. Diese Art der Analyse wird allgemein als eine "Sandwich"- oder "2-Stellen"-Analyse bezeichnet, da das Antigen zwei Antikörper an zwei verschiedenen Regionen oder Epitopen gebunden hat.
Mehrere "Sandwich"-Analysen wurden patentiert (siehe zum Beispiel U.S. Patent 4,361,647 oder 4,497,899). Trotz ihres weitverbreiteten Gebrauchs ist ihre Durchführung nicht ohne Schwierigkeit. Wie bereits oben angesprochen, erfordern sie aufeinanderfolgende Bearbeitungsschritte und besitzen nur geringe Empfindlichkeit. Ein allgemein angewandtes Verfahren zur Durchführung einer Immunanalyse in der "Sandwich"-Technik umfaßt zum Beispiel:
1. Bestimmung der Arbeitslösungen für den Antikörper;
2. Entfernen von jeglichem überschüssigen Antikörper, der zur Sensibilisierung des festen Matrixmaterials verwendet wird;
3. Waschen der festen Stützmatrix, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen;
4. Kontaktieren der Matrix mit der Lösung der Testanalyse;
5. Inkubieren des Analysematerials, das in der Probe der Testanalyse nachgewiesen werden soll, für längere Zeit, um dem Analysematerial die Bindung an den Antikörper zu ermöglichen;
6. Waschen der Matrix, um jegliches Material, das nicht reagiert hat, zu entfernen;
7. Kontaktieren der Matrix mit dem markierten zweiten Antikörper;
8. Waschen des festen Matrixmaterials um jeglichen zweiten Antikörper, der nicht reagiert hat, zu entfernen;
9. Bestimmung des Vorhandenseins des Immunkomplexes, entweder direkt, wenn der zweite Antikörper radioaktiv markiert ist, mit Hilfe einer geeigneten Zähltechnik oder, wenn es sich um eine enzymatische Markierung handelt, durch Hinzufügen eines Substrats, das einen nachweisbaren Farbwechsel in Folge der Reaktion liefert;
10. In dem Fall, in dem der zweite Antikörper eine enzymatische Markierung trägt, wird die Reaktion nach einer Zeitspanne, die die Entwicklung einer ausreichenden Farbintensität ermöglicht, durch ein starkes Alkali oder eine starke Säure gestoppt.
Beispiele für Versuche zur Verbesserung von "Sandwich"-Analysen schließen die der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 186,100 zu entnehmende Analyse ein, die eine Festphasen-Analysiervorrichtung offenbart, bestehend aus einer porösen Fasermatrix, die mit einem hydrophoben Polymer imprägniert ist, das eine Oberflächenschicht auf den Fasern bildet. Ein Reagenz könnte an die Teilchen gebunden und auf diese Weise in die Matrix eingefügt werden. Überschüssige Flüssigkeit muß durch gesonderte Mittel aufgesaugt werden, wie zum Beispiel einen eine Aufsaugvorrichtung enthaltenden Behälter für die Analysevorrichtung. Ein weiteres Beispiel kann der veröffentlichen Europäischen Patentanmeldung Nr. 217,403 entnommen werden, die eine Festphasen-Analysiervorrichtung offenbart, die eine poröse, faserartige Matrix enthält, auf der kugelförmige Teilchen unbeweglich befestigt sind und ein Reagenz an die Teilchen gebunden ist. Die hier beschriebene Vorrichtung enthält absorbierendes Material zur Aufnahme von Flüssigkeit, die durch die Matrix fließt. Die zuvor erwähnten Analysen und Vorrichtungen scheitern jedoch alle daran, daß sie die durch die vorliegende Erfindung gelösten Probleme nicht in ausreichender Weise ansprechen und ihnen abhelfen.
Zusätzlich zur Tatsache, daß sie zeitaufwendig und relativ unempfindlich sind, sind "Sandwich"-Analysen außerdem in zwei weiteren Punkten eingeschränkt: Erstens sind sie nicht sofort anwendbar für den Gebrauch mit Vorrichtungen zum Nachweis von mehr als einer antigenischen Substanz in der Probe. So müssen, wenn man eine Probe auf mehrere Antigene hin untersuchen will, gesonderte Aliquots der Probe unabhängig voneinander analysiert werden. Zweitens nutzen sie die Analyseprobe oft nicht wirksam aus, dadurch wird erforderlich, daß große Volumina der Probe analysiert werden müssen, um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten.
Zum Teil liegt das daran, daß die Probe über ein großes Oberflächengebiet von festem Matrixmaterial verteilt wird. So würde eine Vorrichtung, die auf der Sandwich-Technik basiert, die die Analyse von mehreren Antigenen erleichtert und die wirksameren Gebrauch von Probeflüssigkeit macht, ein deutlicher Vorteil gegenüber Vorrichtungen sein, die dem Stand der Technik entsprechen.
Wie bereits oben angesprochen, ist eine für lange Zeit anhaltende Stabilität bei Raumtemperatur ein gesuchtes Merkmal, das Diagnosevorrichtungen zur Zeit fehlt. Gegenwärtig wurden alle Ursachen der Instabilität noch nicht nachgewiesen. Es erscheint jedoch so, daß ein Teil der Ursache in der Instabilität des an die feste Stützmatrix gebundenen Antikörpers und in der Aggregatbildung im Antikörper-Enzym-Konjugat begründet ist, das zum Nachweis des Vorhandenseins von Antigen verwendet wird. Das ersterwähnte Problem wurde noch nicht befriedigend behandelt, während die Aggregatbildung durch Aufbewahrung des Konjugats bei Temperaturen in dem Bereich zwischen zwei und acht Grad Celsius kontrolliert werden kann. Bei diesen Temperaturen ist die Aggregatbildung eingeschränkt. Da es jedoch unpraktisch und teuer ist, die Diagnosevorrichtung bei niedriger Temperatur aufzubewahren, wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen, um Antikörper-Enzym-Konjugate zu entwickeln, die bei Raumtemperatur stabil sind, oder Methoden zur Verringerung des Hintergrundes, der durch die Aggregate entsteht. Bis jetzt waren diese Versuche nicht erfolgreich.
Ein weiteres Anliegen bei der Durchführung von diagnostischen Analysen ist es, die Immunreaktanden, die das Antigen nicht binden und so nicht Teil des Immunkomplexes sind, von den gebundenen Reaktanden, die den Komplex bilden, zu trennen. Das Vorhandensein von nicht gebundenen Reaktanden kann den Hintergrund der Analyse verstärken. Während durch das Waschen des Immunkomplexes das Hintergrundsignal, das durch nicht gebundene Reaktanden verursacht wird, größtenteils entfernt werden kann und tatsächlich entfernt wird, wird bei den meisten Analysen ein sogenannter Blockierschritt zur Verringerung des Hintergrunds durchgeführt. Der Blockierschritt umfaßt die Beschichtung der festen Unterlage mit proteinartigen Substanzen, nachdem sie mit dem Antikörper abgedeckt wurde. Das Blockiermaterial bindet an Stellen auf dem festen Matrixmaterial, die nicht von dem Antikörper abgedeckt wurden, und verhindert so eine spätere, nicht-spezifische Bindung der Immunreaktanden, die nicht Teil des Immunkomplexes sind. Im allgemeinen wird der Blockierschritt entweder vor der Vollendung der Analyse durchgeführt und erfordert daher einen zusätzlichen, zeitaufwendigen Schritt oder, wie es im U.S. Patent Nr. 3,888,629 beschrieben ist, wird das feste Matrixmaterial mit dem Blockiermaterial imprägniert, dann gefriergetrocknet und vor dem Gebrauch in diesem Zustand aufbewahrt. Die Unannehmlichkeit, die feste Oberfläche mit dem Blockiermaterial vorbehandeln zu müssen oder gefriergetrocknete Filter, die blockierende Proteine enthalten, zu benutzen, ist lästig, zeitaufwendig und teuer. So würde ein Verfahren, das diese beiden Prozeduren vermeidet, eine wünschenswertere Diagnosevorrichtung liefern.
Da es viele immunodiagnostische Vorrichtungen gibt, ist es im Hinblick auf das oben erwähnte zweifellos wünschenswert, daß sowohl ihre Empfindlichkeit, die Bequemlichkeit und Geschwindigkeit der Durchführung, als auch ihre Langzeitstabilität bei Raumtemperatur verbessert werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß ist eine Immuno-Analysiervorrichtung vorgesehen mit einem Gehäuse mit wenigstens einer Öffnung zum Einführen einer flüssigen Probe in das Gehäuse, einer von der flüssigen Probe kontaktierbare Matrix aus porösem Material in dem Gehäuse, absorbierendem Material in Kontakt mit der Matrix und wenigstens einem immunologischen Reagenz auf der Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung weiter ein Trockenmittel im Gehäuse aufweist.
Es wird eine immunodiagnostische Analysiervorrichtung beschrieben, die beträchtliche Vorteile gegenüber Vorrichtungen aufweist, die dem Stand der Technik entsprechen, und die zur Durchführung sowohl von "Sandwich"-Analysen als auch von andersartigen Analysen verwendet werden kann. Sie besitzt verschiedene Merkmale, die zusammen eine Vorrichtung ergeben, die für lange Zeit bei Raumtemperatur stabil bleibt, die schnell Ergebnisse liefert, die hochempfindlich ist und die außerdem in der Lage ist, gleichzeitig mehr als ein Antigen in derselben Analysenlösung nachzuweisen.
Während die hier beschriebene Diagnose-Analysiervorrichtung hauptsächlich dazu vorgesehen ist, entweder Antigene oder Antikörper durch die Bildung eines Immunkomplexes zu analysieren, wird es von Fachleuten geschätzt werden, daß ihre Anwendbarkeit in Wirklichkeit beträchtlich breiter ist und nicht auf diese Moleküle beschränkt ist. Als Minimum erfordert die Vorrichtung lediglich ein erstes Molekül, das ein zweites Molekül erkennt und bindet. Das erste Molekül kann bequemerweise als Liganden-Erkennungsmolekül und das letztere als Ligand bezeichnet werden. Während Antikörper und Antigen bevorzugte Ausführungen eines Liganden-Erkennungsmoleküls beziehungsweise eines Liganden darstellen, kann die Vorrichtung für verschiedene Liganden und Liganden-Erkennungsmoleküle verwendet werden. Hormonrezeptormoleküle sind zum Beispiel eine Art von Liganden-Erkennungsmolekülen und können an das feste Matrixmaterial gebunden und zur Analyse des entsprechenden Hormonliganden verwendet werden. Andererseits könnte ein Hormon an das Matrixmaterial gebunden und zur Analyse des Hormonrezeptors verwendet werden. Fachleuten wird es klar sein, daß es viele derartige Kombinationen von Liganden-Erkennungsmolekülen und Liganden gibt, die geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Vorrichtung sind.
Wenn entweder eine Sandwich-Analyse oder eine andersartige Analyse in der vorliegenden Vorrichtung durchgeführt wird, wird mit Hilfe einer neuartigen Printer-Coder-Technik, bei der ein oder mehrere verschiedene Antikörper durch direktes Sprühen auf die Matrix aufgetragen werden, Matrixmaterial mit Antikörper imprägniert. Durch den Gebrauch dieser Technik ist es möglich, schnell Antikörper in getrennten Kreisen, Linien oder anderen geometrischen Formen zur Bindung von einem oder mehreren Antigenen aufzutragen. So ist die Anzahl der Antigene, die analysiert werden kann, eine Funktion der Anzahl der verschiedenen Antikörper, die in gesonderten Mustern aufgetragen werden können.
Unter dem mit dem Antikörper imprägniertem Matrixmaterial befinden sich zwei getrennte Schichten aus absorbierendem Material. Direkt unterhalb des Matrixmaterials befindet sich eine Mittelschicht mit Material, das den Hintergrund reduziert. Weiter entfernt vom Matrixmaterial befindet sich eine zweite Schicht aus absorbierendem Material. Ihre Funktion ist es, Analyse- oder Waschflüssigkeiten zu absorbieren und zu halten, und sie kann aus vielen verschiedenen absorbierenden Materialien zusammengesetzt sein.
Ein weiterers Merkmal der hier beschriebenen Erfindung zur Reduzierung der Hintergrundaktivität ist ein Vorfilter, das mit geeignetem Blockiermaterial, hauptsächlich, jedoch nicht ausschließlich, mit proteinartigem Material imprägniert ist. Das Vorfilter ist über dem Matrixmaterial angeordnet und wird mit Blockiermaterial durch Kontaktieren des Filters unter definierten Bedingungen mit dem proteinartigen Material imprägniert. Nach der Durchführung der Analyse wird eine geeignete Menge der Analysenflüssigkeit auf das Vorfilter gegeben, die durch das Vorfilter fließt und dabei Blockiermaterial befördert. Die Analysenflüssigkeit und die darin enthaltenen Blockiermaterialien kontaktieren das mit dem Antikörper imprägnierte Matrixmaterial, wobei das Blockiermaterial an nicht-spezifische, reaktive Stellen auf dem Matrixmaterial bindet und diese Stellen dadurch für die Bindung von überschüssigen Immunchemikalien, die auf die Analyse einwirken, unzugänglich macht. Ein zusätzliches Merkmal der vorliegenden Erfindung, das zu ihrer Empfindlichkeit und langanhaltenden Stabilität bei Raumtemperatur beiträgt, ist, daß sie in einer Kammer mit wenigstens zwei Abteilungen ausgeführt werden kann. Eine Abteilung enthält das mit dem Antikörper imprägnierte Matrixmaterial, während die zweite Abteilung Feuchtigkeit absorbierende Chemikalien enthalten kann. Die letztere steht in Verbindung mit der ersten und erhöht die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der Analyse, da sie ein trockenes Milieu in der ersten Abteilung aufrechterhält. Dies hält günstigerweise die Stabilität des Blockieragens im Vorfilter und des mit dem Matrixmaterials verbundenen Antikörpers für längere Zeit des Nichtgebrauchs aufrecht. Die gleiche Wirkung kann, wenn es auch nicht so bequem ist, dadurch erzielt werden, daß die Feuchtigkeit absorbierenden Chemikalien mit dem Vorfilter und dem Matrixmaterial auf andere Weise verbunden werden.
Eine weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist eine trichterförmige Öffnung im Dach der Vorrichtung, die der Analsyenflüssigkeit Zutritt zum Matrixmaterial gewährt. Diese Anordnung macht wirksamen Gebrauch von der Analysenprobe und den nachfolgenden Waschungen, indem sie diese über ein kleines Oberflächengebiet von Matrixmaterial verteilt.
Wenn auch die immunodiagnostische Vorrichtung in bezug auf die Analyse eines Antigens mit Hilfe der Bindung des Antikörpers an das Matrixmaterial beschrieben wurde, wird es Fachleuten verständlich sein, daß ihre Verwendungsfähigkeit nicht darauf beschränkt ist. Es wird anerkannt werden, daß sie zur Analyse von Antikörpern in der Analysenflüssigkeit verwendet werden kann, wobei die entsprechenden Antigene an das Matrixmaterial gebunden werden. Dieser Aspekt der Erfindung könnte beim Nachweis und der Diagnose von Autoimmunkrankheiten helfen. Die Kombination von Eigenschaften, die mit der hier beschriebenen Diagnosevorrichtung verbunden ist, ergibt ein System, das empfindlicher ist als solche, die zur Zeit verwendet werden; das zuverlässig ist, bequem im Gebrauch, das eine breite Anwendbarkeit hat und das vor allem für lange Zeit ohne Aktivitätsverlust bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt: eine perspektivische Ansicht der diagnostischen Einheit dar.
Fig. 2 stellt eine Explosionsdarstellung der verschiedenen Bestandteile dar, und
Abbildung 3 stellt eine vergrößerte Schnittansicht entlang der Linie 3-3 aus Abbildung 1 dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Fachleuten wird es ersichtlich sein, daß die wesentlichen Teile der vorliegenden Erfindung ein mit einem Blockieragens imprägniertes Filter, Matrixmaterial, das in geeigneter Weise mit Antikörper imprägniert ist, eine absorbierende Schicht zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit und ein Behältnis sind, das alle oben genannten Elemente zur Ausführung einer Immunanalyse trägt und verbindet. Obwohl die Erfindung unten sehr detailliert beschrieben wird, stellt diese Beschreibung die bevorzugte Aufführung der Erfindung dar und sollte nicht als Einschränkung der Erfindung angesehen werden.
Fig. 1 und 2 zeigen ein repräsentatives Beispiel einer geeigneten immundiagnostischen Testvorrichtung, die in der vorliegende Erfindung verwendbar ist. Fig. 1 zeigt eine vollständig zusammengebaute Vorrichtung und Fig. 2 eine Explosionsdarstellung der Vorrichtung. Wie in Fig. 1 gezeigt wird, weist sie ein Behältnis 10 auf, das einen abtrennbaren Kopfteil 12, einen Bodenteil 14 und eine Filtervorrichtung 28 besitzt. Fig. 2 enthüllt weiter das Behältnis 10, den Kopfteil 12 und den Bodenteil 14. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Bodenteil 14 in zwei Kammern 16 und 18 unterteilt. In Kammer 16 befindet sich absorbierendes Material 20, das Flüssigkeit von der Mittelschicht 22 aufnimmt. Die Mittelschicht 22 nimmt ihrerseits Flüssigkeit vom Matrixmaterial 24 auf. In Abbildung 2 sind außerdem die Einkerbungen 40 zu sehen, die als Öffnungen für den Druckausgleich fungieren, wenn der Kopfteil 12 und der Bodenteil 14 verbunden sind. Die letzteren verringern die Zeit, die zur Durchführung der Analyse benötigt wird, sind aber nicht wesentlich für die Ausführung der Analyse.
Der Kopfteil 12 des Behältnisses 10 enthält eine Öffnung 16. Wenn der Kopfteil 12 mit Hilfe der an dem Kopfteil befestigten Stifte 13, die in die Löcher 15 des Bodenteils passen, auf das Bodenteil 14 ausgerichtet ist, liegt die Öffnung über dem Matrixmaterial 24. Außerdem ist mit dem Kopfteil 12 eine Filtervorrichtung 28 verbunden. Die Filtervorrichtung 28 ist so über der Öffnung 26 angeordnet, daß, wenn Flüssigkeit auf die Filtervorrichtung 28 gegeben wird, das Filtrat durch die Öffnung 26 fließt und das Matrixmaterial 24 kontaktiert. Die Filtervorrichtung 28 kann mit dem Kopfteil 1.2 durch viele Elemente verbunden werden. Dies ist zweckdienlich so durchzuführen, daß die Stifte 30 an den Ecken der Vorrichtung 28 in die Aufnahmen 32 paßt, die sich am Kopfteil 12 befinden.
Sowohl die Öffnung 26, als auch die Filtervorrichtung 28 haben vorzugsweise eine trichterförmige Gestalt. Dies erlaubt es, daß eine große Menge der Probenflüssigkeit durch eine kleine Oberflächenregion des Matrixmaterials 24 fließen kann. Während die Abmessungen sowohl der Öffnung 26, als auch der Filtervorrichtung 28 beträchtlich verändert werden können, ohne die Leistungsfähigkeit der Vorrichtung zu beeinflussen, haben wir die folgenden durchschnittlichen Abmessungen für zufriedenstellend gehalten; 1.0 cm Bodendurchmesser, 2.0 cm Kopfdurchmesser und 0.3 cm Tiefe.
Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, das eine lange Aufbewahrung der Reagenzien, die sich in der Filtervorrichtung 28 oder dem Matrixmaterial 24 befinden, erlaubt, ohne daß sie verderben, ist eine Feuchtigkeit absorbierende Chemikalie in der Kammer 18. Derartige Chemikalien verhindern, daß die Reagenzien mit Feuchtigkeit in Berührung kommen und dadurch an Aktivität verlieren. Verschiedene Chemikalien, die Fachleuten bekannt sind, sind zu diesem Zweck verwendbar. Es sollte ersichtlich sein, daß die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung nicht allein von einer Vorrichtung abhängt, die eine Kammer 18 zur Aufbewahrung von Feuchtigkeit absorbierenden Chemikalien hat. Eine einzige Kammer wird in angemessener Weise funktionieren, vorausgesetzt, daß die Chemikalien auf eine andere Weise mit ihr verbunden sind, zum Beispiel durch ihre Anordnung an der Außenseite.
Fig. 3 zeigt; eine vergrößerte Teilansicht der vorliegenden Erfindung. Die Filtervorrichtung 18 ist durch die Stifte 30, die sich in den Löchern 32 befinden, an dem Kopfteil befestigt. Der Kopfteil 12 und der Bodenteil 14 sind ebenfalls durch die am Kopfteil befindlichen Stifte 13, die in die Löcher 15 des Bodenteils passen, verbunden.
Von Fachleuten wird anerkannt werden, daß, obwohl das in den Fig. 1-3 gezeigte Behältnis, das die Diagnosevorrichtung bildet, eine flache Form aufweist, die Erfindung nicht auf diese Form beschränkt ist. Im Grunde genommen wird jede Form in angemessener Weise funktionieren, vorausgesetzt, daß sie mit den oben beschriebenen Elementen bestückt ist.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich zum Nachweis eines Komplexes aus Liganden und Liganden-Erkennungsmolekül auf einer festen Oberfläche. Es ist wichtig anzumerken, daß sowohl der Ligand als auch das Liganden-Erkennungsmolekül an das Matrixmaterial 24 gebunden und zum Nachweis des entsprechenden Komplexpartners verwendet werden können. Das heißt, daß, wenn das Liganden-Erkennungsmolekül an das Matrixmaterial gebunden ist, gewöhnlich der Ligand analysiert werden kann; wenn jedoch der Ligand an das Matrixmaterial 24 gebunden ist, dann kann das Liganden-Erkennungsmolekül analysiert werden.
Liganden sind gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, Moleküle mit geringem Molekulargewicht, wie Narkotika, Peptidhormone und andere bioaktive Moleküle. Andererseits sind Liganden-Erkennungsmoleküle gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, Moleküle mit hohem Molekulargewicht und sind meistens Proteine, insbesondere Antikörpermoleküle. So wird es von Fachleuten verstanden werden, daß, wenn auch Antigen und Antikörper (mono- oder polyklonal) als Ligand beziehungsweise als Liganden-Erkennungsmolekül die bevorzugte Ausführung der vorliegenden Vorrichtung sind, die Erfindung nicht auf die Anwendung dieses Paares von Liganden und Liganden- Erkennungsmoleküls beschränkt ist. Da diese jedoch am häufigsten in diagnostischen Analyseverfahren verwendet werden, wird die Erfindung in bezug darauf beschrieben.
Die hier beschriebene Diagnosevorrichtung wird am häufigsten zum Nachweis eines "Sandwich"-Immunkomplexes, bestehend aus Antigen und Antikörper, angewendet werden und wird ein Stützmaterial wie die Matrix 24, das zur Bindung eines nichtmarkierten ersten Antikörpers geeignet ist, gebrauchen. Es wird dennoch anerkannt werden, daß die Vorrichtung ebenso zur Durchführung einer anderartigen Analyse, insbesondere einer kommpetitiven Bindungsanalyse verwendet werden kann. Die letzteren werden oft zur Analyse von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht angewendet, die entweder eine einzige Antikörperbindungsstelle besitzen oder die, wegen ihrer Größe, die Bindung von mehr als einem Antikörper aufgrund von sterischer Behinderung verhindern. So kann die Erfindung zur Analyse von Narkotika, Steroiden und ähnlichem verwendet werden. Die Anbringung des Antikörpers auf dem festen Matrixmaterial kann durch Absorption oder durch kovalente Bindung, direkt oder mit Hilfe eines in Fachkreisen bekannten Linkers, stattfinden. Verschiedene geeignete Methoden zur Durchführung dieser Verfahren werden zum Beispiel von Iman und Hornby in Biochemical Journal (1972), Band 129; Seite 255; Campbell, Hornby und Morris in Biochemical Biophysical Acta (1975), Band 384; Seite 307; und Mattisson und Nilsson in F.E.B.S. letters (1977), Band 104, Seite 78 vorgestellt. Außerdem können chemisch vorbehandelte Materialien, die zur Bindung von Antikörpern geeignet sind, im Handel erworben werden.
Zahlreiche Materialien können zur Herstellung von Stützmaterialien verwendet werden. Derartige Materialien sind im allgemeinen entweder synthetische oder natürliche Polymere, wobei Polyethylen, Polyacrylamid, Nylon, Kunstharze, Polyvinylchlorid und Polystyrol Beispiele von nutzbaren synthetischen Polymeren sind. Typische natürliche Polymere, die benutzt werden, sind Cellulose, Polysaccharide, Sepharose, Agarose und verschiedene Dextrane. Zusätzliche Materialien, die zur Herstellung von Stützmaterial verwendet werden können, sind Silicate, insbesondere Glas, Kollagen und Polynukleotide. Während verschiedene der oben beschriebenen Materialien in der vorliegenden Erfindung in angemessener Weise einsetzbar sind, wird in der bevorzugten Ausführung ein aus Nylon bestehendes Material verwendet.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Diagnosevorrichtung ist der Auftrag des Antikörpers auf das feste Matrixmaterial 24. Die meisten gegenwärtigen Methoden verteilen den Antikörper nicht-selektiv über die gesamte Oberfläche des Matrixmaterials 24. Dadurch wird Antikörper verschwendet, der oft teuer ist oder schwierig zu bekommen, und die Analyse von mehr als einem Antigen in derselben Probe wird ausgeschlossen. Wir haben herausgefunden, daß beide Probleme durch Aufsprühen des Antikörpers in einem dünnen Flüssigkeitsstrom auf das Matrixmaterial 24 gelöst werden. Dies wird am besten dadurch erreicht, daß man eine Lösung mit dem Antikörper durch eine Düse mit feiner Bohrung preßt, worauf die Lösung mit Hilfe von Schallschwingung oder anderer Mittel in einzelne Tröpfchen zerlegt wird. Die Tröpfchen werden daraufhin, indem sie durch ein elektrisches Feld fließen, geladen und dann auf das Matrixmaterial 24 gelenkt. Die Verfahren zur Ausführung dieser Methode sind in den U.S. Patenten 3,281,860 und 4,121,222 beschrieben.
Der oben beschriebene Prozeß wird am einfachsten durch die Verwendung einer von Videojet International hergestellten kommerziellen Druckvorrichtung ausgeführt. Die Vorrichtung wird Videojet Coder/Printer genannt und liefert einen Antikörperstrom unter verschiedenen Bedingungen und mit unterschiedlichen Strombreiten. Durch den Gebrauch dieser Vorrichtung ist es möglich, eine Reihe von Linien oder andere Muster auf dem Matrixmaterial 24 anzuordnen, wobei jedes einen Antikörper mit unterschiedlicher Antigenspezifität enthält.
Es wird anerkannt werden, daß das Aufsprühen des Antikörpers auf das Matrixmaterial 24 sowohl geeignet ist, wenn der Antikörper durch einfache Absorption mit dem Matrixmaterial verbunden werden soll, als auch bei kovalenter Bindung an chemisch vorbehandeltes Matrixmaterial.
Fig. 2 zeigt, daß sich unterhalb des festen Matrixmaterials eine Mittelschicht aus Material 22 befindet. Die Mittelschicht befindet sich zwischen dem absorbierenden Material 20 und dem Matrixmaterial 24 und ist dazu da, den Hintergrund der Analyse zu verringern. Nachdem die Analysenflüssigkeiten durch das Matrixmaterial 24 geflossen sind, kontaktieren sie die Mittelschicht 22 und werden durch sie filtriert. Durch das letztere wird der Hintergrund der Analyse ziemlich verringert, indem der Rückfluß von Reagenzien, die nicht reagiert haben, reduziert wird und diese so am erneuten Kontakt mit dem Matrixmaterial 24 gehindert werden. Viele verschiedene Materialien sind zur Bildung der Mittelschicht 22 geeignet. Besonders geeignet ist Material aus ungewebtem Polypropylen, das gewöhnlich in Wegwerfwindeln, wie beschrieben in den U.S Patenten 3,860,003, 4,081,301 und 4,515,595, gefunden wird.
Zusätzlich zur Mittelschicht 22 ist ein weiteres Merkmal der vorliegenden Diagnosevorrichtung, das einen niedrigen Hintergrund zur Folge hat und die Einfachheit des Gebrauchs vergrößert, die Filtervorrichtung 28, die mit dem Kopfteil 12 verbunden ist. Er enthält eine trichterförmige Zentralregion 38, die schnell eine zur einmaligen Durchführung der Analyse benötigte Menge an Analysenflüssigkeit aufnimmt, sowie einen Griff 34, der es dem Benutzer erlaubt, die Vorrichtung 28 zu ergreifen und zu entfernen. Am Boden der Filtervorrichtung 28 befindet sich Filtermaterial 36. Dieses Material ist mit einem oder mehreren Reagenzien imprägniert, die zur Ausführung der Analyse benötigt werden und die mit der Analysenflüssigkeit, nachdem diese auf die Filtervorrichtung 28 aufgetragen wurde, nach unten zum Matrixmaterial 24 befördert werden.
Verschiedene Materialien können zur Herstellung des Filtermaterials 36 in der Filtervorrichtung 28 verwendet werden. Tatsächlich eignen sich die oben beschriebenen Materialien, aus denen das Matrixmaterial 24 besteht, größtenteils zur Verwendung für das Filtermaterial 36. Wir haben herausgefunden, daß Glasfaser besonders geeignet ist, wie zum Beispiel Ultipor GF Filter U6-40 der Pall Corporation.
Verschiedene Reagenzien können das Filtermaterial 36 imprägnieren, auf ihm zerstäubt oder auf andere Weise mit ihm verbunden werden. Es ist besonders vorteilhaft, wenn proteinartige Blockieragenzien mit dem Filtermaterial 36 verbunden sind. Die Art des Blockieragens ist nicht entscheidend. Das heißt, daß verschiedene proteinartige Materialien, Aminosäuren, Peptide zur Verwendung geeignet sind. Wir haben dennoch herausgefunden, daß Milchprotein zufriedenstellend ist und verwenden routinemäßig Magermilchpulver, das von der Carnation Corporation verkauft wird. In dem Falle in dem das feste Matrixmaterial 24 zur kovalenten Bindung von Antikörper chemisch vorbehandelt ist, könnte es wünschenswert sein, aminoreaktive Reagenzien mit niedrigem Molekulargewicht, wie Glycin, als Blockieragens zu verwenden.
Um das Blochieragens so mit dem Filtermaterial 36 zu verbinden, daß es wieder entfernt werden kann, ist es wünschenswert, das Filtermaterial 36 mit trockenem Material eine Zeit lang zu kontaktieren, die ausreicht, um das Material einheitlich zu beschichten. Dies kann durchgeführt werden durch Kontaktieren des Filtermaterials mit dem Blockieragens und durch anschließendes Entfernen von jeglichem Material, das nicht fest mit dem Filter verbunden ist. Es wird anerkannt werden, daß eine alternative Methode zur Bindung des Blockieragens an das Filtermaterial 36 darin besteht, das Material mit einer das Blockieragens enthaltenden Lösung zu kontaktieren und dann das Material zu lyophilisieren. Dies ist besonders nützlich, wenn Blockieragenzien mit niedrigem Molekulargewicht (z. B. Glycin) verwendet werden. Obwohl das so behandelte Filtermaterial in der vorliegenden Vorrichtung in angemessener Weise funktioniert, ist es keine bevorzugte Methode, da das Lyophilisieren den Filter erhärten läßt, wodurch dann die Zeit, die die Lösung benötigt, um durch das Filtermaterial zu fließen, verlängert wird. Dies hat eine ungleichmäßige Verteilung des Blockieragens auf dem Matrixmaterial 24 zur Folge und verstärkt den Hintergrund.
Zusätzlich zur Bindung von Blockieragenzien an das Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 könnte es auch wünschenswert sein, das Material mit anderen in der Analyse benutzten Reagenzien zu imprägnieren, und man würde dadurch vermeiden, daß diese Reagenzien in getrennten Schritten zugefügt werden müssen. Es ist zum Beispiel vorauszusehen, daß Reagenzien, die zur Aufdeckung des Vorhandenseins des Antikörper-Antigen-Komplexes verwendet werden, das heißt Antikörper-Enzymkonjugate oder Enzymsubstrate, in ähnlicher Weise mit dem Filtermaterial 36 verbunden werden können.
Ein zweites, bereits oben angesprochenes Merkmal der vorliegenden Erfindung, das wichtig für die Errichtung der Langzeitstabilität der Diagnosevorrichtung bei Raumtemperatur ist, ist die Verwendung eines geeigneten chemischen Trockenmittels, das sich in Kammer 18 im Bodenteil 14 befindet. Die Stabilität oder nutzbare Lebensdauer der Materialien im Matrixmaterial 24 oder Filtermaterial 36 ist eine Funktion des Feuchtigkeitsgehalts, dem die Vorrichtung ausgesetzt ist. Zur Zeit verwendete Immuno-Diagnosevorrichtungen haben eine nutzbare Haltbarkeit von weniger als 6 Monaten, während die vorliegende Vorrichtung ein Haltbarkeit bei Raumtemperatur von bis zu einem Jahr hat. Wir haben herausgefunden, daß die Reagenzien durch Vereinigung der Diagnosevorrichtung mit einem Trockenmittel stabil bleiben und während dieser Zeit eine hervorragende Leistung erbringen. Verschiedene Trockenmittel sind in Fachkreisen bekannt und werden für brauchbar gehalten.
Zum Nachweis des Vorhandenseins des Immunkomplexes auf dem Matrixmaterial 24 ist es im allgemeinen erforderlich, daß ein markiertes zweites Nachweismolekül verwendet wird. In den Fällen, in denen der Komplex ein Immunkomplex ist, ist das Nachweismolekül ein zweiter Antikörper, der spezifisch für das an den ersten Antikörper gebundene Antigen ist, der aber das Antigen an einer Stelle bindet, die von der Bindungsstelle des ersten Antikörpers entfernt ist. Traditionelle Methoden zum Nachweis des Vorhandenseins des Antikörpers benutzten einen markierten zweiten Antikörper, wobei es sich oft um eine radioaktive Markierung handelte oder, in letzter Zeit, um ein Enzym, das in der Lage ist, ein farbloses Substrat zu hydrolysieren, um einen nachweisbaren Farbwechsel zu erzeugen und dadurch den Immunkomplex aufzudecken. Verschiedene Enzyme können in Verbindung mit geeigneten Substraten verwendet werden. Zum Beispiel Meerrettichperoxidase, beta-Galaktosidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase und andere Fachleuten bekannte Enzyme sind zur Verwendung geeignet. Die meisten dieser Enzyme benutzen Diazonium- oder Tetrazoliumsalze als Substrate. Beispiel für das erste sind Naphtol-AS-MX-phosphat und Diazo-2-amino-5-chloro-Anisol, die als Substrate für alkalische Phosphatase benutzt werden.
Methoden zur Verbindung von Enzymen mit einem zweitem Antikörper sind Fachleuten bekannt und beinhalten hauptsächlich die chemische Kopplung des Enzyms an den Antikörper. Verfahren zur Kopplung des Antikörpers durch chemische Quervernetzung werden von O'Sullivan und Marks beschrieben in Methods in Enzymology, (1981) (73:147) Academic Press, New York. Wenn Meerrettichperoxidase verwendet wird, ist eine geeignete Kopplungsmethode die von Nakane und Kanaoi, beschrieben im Journal of Histology and Cytochemistry (1974) (82:1084). Diese Methode vereinigt wirkungsvoll und direkt das Enzym mit dem Antikörper; dennoch sind andere Methoden bekannt, es kann zum Beispiel eine Biotin-Avidin-Brücke auf dem zweiten Antikörper gebildet werden, die Meerrettichperoxidase an Avidin gebunden hat.
Anstatt das Enzym chemisch an das Antikörper-Enzymkonjugat zu koppeln, könnte es vorgezogen werden, daß das Enzym in den Antikörper integriert wird. Dies kann zum Beispiel durch die gentechnologische Herstellung von hybriden Molekülen, die sowohl eine Antikörperbindungsstelle als auch ein enzymatisch aktives Zentrum besitzen, erreicht werden. Antikörper können zum Beispiel durch rekombinante DNA-Techniken verändert werden, wie sie von Neuberger et al in Rekombinant Antibody Possessing Novel Efector Funktion, Nature (1984) (312:604) beschrieben werden. Es wird erwartet, daß diese Art von Enzymkonjugat direkt in das Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 inkorporiert werden kann oder in einem nachfolgenden Schritt zugefügt werden kann, um den auf dem Matrixmaterial 24 gebildeten Immunkomplex nachzuweisen.
Es wird von Fachleuten anerkannt werden, daß die Antikörper, die auf dem Matrixmaterial 24 verteilt sind oder die im Antikörper-Enzymkonjugat enthalten sind, sowohl monoklonal als auch polyklonal sein können. Nachdem das Antikörper-Enzymkonjugat dem Matrixmaterial 24 zugefügt wurde und genügend Zeit zur Maximierung der Bindung des Antikörper-Enzymkonjugats an das gebundene Antigen verstrichen ist, wird eine Lösung mit einem geeigneten Enzymsubstrat zugefügt und das Sichtbarwerden der Farbe wird als Indikator für das Vorhandensein des Antigens in der Analysenprobe vermerkt. In den meisten Fällen wird es nicht notwendig sein, einen Waschschritt nach der Zugabe des Konjugats und vor der Zugabe des Substrats einzufügen. Das liegt daran, daß die trichterförmige Gestalt der Öffnung 26 einer großen Menge Substratlösung ermöglicht, durch eine kleine Oberflächenregion des Substratmaterials zu fließen. So stellt die Zugabe der Substratlösung tatsächlich einen Waschschritt dar. Nichtsdestoweniger könnte es bei einigen Anwendungen dennoch wünschenswert sein, daß ein Waschschritt zum Entfernen von unerwünschtem Hintergrund durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch folgende Beispiele veranschaulicht werden. Fachleuten wird es ersichtlich sein, daß es verschiedene Ersatzmöglichkeiten für das verwendete Material und die verwendeten Methoden gibt. Folglich sollten die vorliegenden Beispiele als exemplarisch und nicht als Einschränkung der Erfindung auf die einzelnen, beschriebenen Materialien oder Methoden angesehen werden.

Beispiel 1

Nachweis des Choriongonadotropins (HCG)

Dieses Beispiel wird in bezug auf die Fig. 1 und 2 beschrieben. Eine Menge Urin, die ungefähr 0.5 Milliliter entspricht und 25 mIU/ml HCG enthält, wird auf die Filtervorrichtung 28 gegeben. Der Urin kontaktiert das Filtermaterial 36 der Filtervorrichtung 28 und fließt durch das Filtermaterial, wobei er ein proteinartiges Blockierreagens, Milchprotein befördert, das im Filtermaterial 36 enthalten ist. Das Filtrat, das das Blockierreagens enthält, fließt durch die Öffnung 26, die sich im Kopfteil 12 befindet, und kontaktiert das Matrixmaterial 24. Das Matrixmaterial 24 ist mit Antikörpern gegen menschliches HCG imprägniert. Das Matrixmaterial besteht aus einer Nylonart, die bekannt ist und routinemäßig von Fachleuten verwendet wird.
Das Imprägnieren des Matrixmaterials 24 wurde mit Hilfe einer Printer/Coder-Maschine, wie sie in den U.S. Patenten 3,281,860 und 4,121,222 beschrieben ist, verwirklicht, wobei ein schmaler Flüssigkeitsstrom, der den monoklonalen, gegen die alpha-Kette des HCG gerichteten Mausantikörper enthält, auf das Matrixmaterial 24 aufgetragen wurde. Der Antikörper wurde in ungefähr 1.5 Millimeter breiten Linien aufgetragen. Zur Bequemlichkeit dem endgültigen Benutzers der Vorrichtung wurde der Antikörper in einer vertikalen Linie aufgetragen, die eine horizontale Linie eines zuvor aufgetragenen Ziege-anti-Maus-Antikörpers der IgG-Klasse kreuzt. Das letztere wird unten eingehender beschrieben werden. Der Auftrag des Antikörpers besteht in dem Aufsprühen einer Lösung, die 4 Milligramm pro Milliliter eines monoklonalen Mausantikörpers, der gegen die alpha-Kette des HCG gerichtet ist, in einem geeigneten Puffer, Phosphat-gepufferte-Saline ist zufriedenstellend, enthält. Diese besteht aus 10 mM Natriumphosphat mit 150 mM Natriumchlorid, pH 7.1. Zusätzlich enthält die Lösung 100 Microgramm pro Milliliter Fluorescein und ein Bakteriostatikum, wie z. B. 0.1% Natriumazid. Fluorescein wird der Lösung zugesetzt, um ein sichtbares Mittel zur Abschätzung des Antikörpermusters, das sich auf dem Matrixmaterial 24 gebildet hat, zu liefern.
Nachdem das Filtrat durch das Filtermaterial 36 geflossen ist, kontaktiert es das Matrixmaterial 24. In dem Filtrat befindliches HCG bindet an das mit HCG-Antikörpern imprägnierte Matrixmaterial 24. Gleichzeitig zu diesem Vorgang bindet zusätzlich das im Filter 36 befindliche Blockierreagens das Matrixmaterial 24 an Stellen, an die der monoklonale Antikörper nicht gebunden hat. Durch diesen Vorgang werden diese Stellen unzugänglich für die Reaktion mit später zugefügten Reaktanden gemacht. Eine kurze Zeit, nachdem das Filtrat das Matrixmaterial 24 kontaktiert hat, werden zwei Tropfen einer Lösung, die ein zweites monoklonales Maus-Antikörper-Enzymkonjugat enthält, zugefügt. Der zweite Antikörper ist gegen die beta-Untereinheit des HCG gerichtet und bindet an ein anderes Epitop als das, an das der erste, an dem Matrixmaterial haftende Antikörper gebunden ist. Die Enzymkomponente des Konjugats war alkalische Phosphatase. Das Antikörper-Enzymkonjugat fließt durch das Filtermaterial 36 und kontaktiert das Matrixmaterial 24 eine ausreichende Zeit lang, die dem Konjugat die Reaktion und die Verbindung mit dem an den ersten Antikörper gebundenen HCG ermöglicht. Gewöhnlich dauert dies ungefähr eine Minute.
Zum Nachweis des Komplexes, der sich auf dem Matrixmaterial 24 gebildet hat, wurde eine Lösung mit Indoxylphosphat, dem Substrat für alkalische Phoshpatase, direkt auf das Matrixmaterial 24 gegeben. Innerhalb einer Minute etwa bildete sich eine blaue Farbe auf dem Matrixmaterial 24 in einem "+"-Muster, das anzeigte, das die Analysenprobe HCG enthielt. Sollte ein "-"-Zeichen erscheinen, enthält die Probe unbedeutende Mengen HCG. Es reicht aus, wenn ungefähr 0.5 Milliliter der Substratlösung mit 4 mM Indoxylphosphat verwendet werden.
Schließlich wird eine Menge einer geeigneten Reaktionsstoplösung dem Matrixmaterial 24 zugegeben. 0.5 ml einer Lösung, die 0.1% Essigsäure enthält, funktionieren zufriedenstellend
Wie bereits oben angesprochen, entsteht das "+"-Muster dadurch, daß der erste anti-HCG-Antikörper in einer vertikalen Linie über einer horizontalen Linie verteilt wird, die entweder aus dem Enzymkonjugat mit dem zweiten Antikörper, aus dem Enzym alleine oder dem Ziege-anti-Maus-Antikörper besteht. Das letztere wird vorgezogen, da die Art des Reagenzes (z. B. Proteinantikörper), das zur Bildung der vertikalen Linie benutzt wird, übereinstimmt. So wird jeglicher Aktivitätsverlust eines Reagenzes mit der Zeit durch einen entsprechenden Verlust des anderen ausgeglichen. Unabhängig von der Art des Reagenzes, das zur Bildung der horizontalen Linie verwendet wird, kennen sie durch Aufsprühen auf das Matrixmaterial 24, wie oben beschrieben, aufgetragen werden.

Beispiel 2

Stabilität bei Raumtemperatur

Die in Beispiel 1 benutzten Materialien und Methoden können hier in ähnlicher Weise angewendet werden. Nach der Aufbewahrung einer Diagnosevorrichtung für ein Jahr bei Raumtemperatur, wurde sie erfolgreich zur Analyse einer Probe mit 25 mIU/ml HCG verwendet.

Beispiel 3

Imprägnieren des Matrixmaterials mit Antigen

Fachleuten wird es ersichtlich sein, daß die vorliegende Diagnosevorrichtung nicht auf den Nachweis von Antigenen beschränkt ist. Es ist ebenso möglich, zirkulierende Antikörper in den Körperflüssigkeiten eines Patienten, dessen Immunsystem angegriffen wurde nachzuweisen. Dies wird durchgeführt, indem das Antigen, das für die Auslösung der Immunantwort verantwortlich ist, an das Matrixmaterial gebunden wird und dann das Vorhandensein des Antikörpers analysiert wird. Dieser Aspekt der Diagnosevorrichtung ist zum Beispiel anwendbar auf den Nachweis oder die Überwachung von Autoimmunkrankheiten oder Allergien.
Inaktivierter Rubellavirus kann, zur Veranschaulichung dieses Aspektes der Erfindung, mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Printer-Coder-Maschine an das in Fig. 2 gezeigte Matrixmaterial 24 gebunden werden. Daraufhin wird eine Lösung mit dem nachzuweisenden anti-Virus-Antikörper der in Fig. 2 gezeigten Filtervorrichtung 28 zugegeben, fließt durch das Filtermaterial 36 und erzeugt dabei ein Filtrat, das durch die Öffnung 26 fließt. Das Filtrat kontaktiert das Matrixmaterial 24, das den gebundenen Virus enthält. Anti-Rubellavirus-Antikörper bindet an den Virus auf der Matrix und der Nachweis des anti-Rubella-Antikörpers im Filtrat wird dadurch erreicht, daß eine Lösung mit Antikörper-Enzymkonjugat, in der der Antikörper gegen gebundenen anti-Rubella-Antikörper gerichtet ist, zugegeben wird. Die Antikörperkomponente des Konjugats muß, um wirksam zu sein, lediglich in der Lage sein, ein Epitop auf den anti-Rubella-Antikörper zu erkennen. Angenommen es wird ein menschlicher anti-Rubella-Antikörper analysiert, dann sollte die Antikörperkomponente des Konjugats ein nichtmenschlicher Antikörper sein. Die verbleibenden Schritte dieser Analyse sind analog zu denen, die in Beispiel 1 beschrieben werden. Das Endergebnis ist das Erscheinen der Farbe auf dem Matrixmaterial 24 als Indikator für das Vorhandensein von anti-Rubella-Antikörper in der Analysenflüssigkelt.

Beispiel 4

Imprägnieren des Filtermaterials mit Analysereagenzien

Eines der Ziele bei diagnostischen Untersuchungen ist es, eine Testvorrichtung zu entwickeln, die wenige Handhabungsschritte erfordert. Durch Verbindung der Analysereagenzien mit dem Filtermaterial 36 ist es möglich, solche Schritte auszuschließen, bei denen die Reagenzien dem Matrixmaterial 24 zur Durchführung der Analyse gesondert zugefügt werden.
Das Imprägnieren des Filtermaterials 36 mit proteinartigen Blockierreagenzien wurde durch Pulverisierung von Milchpulver erreicht, das aus Trockenmagermilch (Carnation Corporation) gewonnen und zur Entfernung jeglicher noch vorhandener großer Körnchen gesiebt wurde. Darauf wurde das aus Glasfaser gefertigte Filtermaterial (Pre-filter grade Ultipor GF Filter U6-40, Pall Corporation) in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate geschnitten und diese wurden in einem geschlossenen Behälter mit einem geeigneten Trockenmittel aufbewahrt. Die Papiere wurden dann mit dem pulverisierten Milchpulver eine Zeit lang, die ausreichte, um die Filter mit dem Milchpulver zu imprägnieren, gemischt, dies dauert gewöhnlich ungefähr drei Stunden. Eine gleichmäßige Verbindung des Milchpulvers mit den Filtern wurde dadurch erreicht, daß die Filter, während sie im Kontakt mit dem Pulver waren, geschwenkt oder andersartig bewegt wurden.
Überschüssiges Milchpulver wurde von den Filterquadraten durch Sieben durch ein Mehlsieb entfernt und die Filter wurden dann in einen Behälter transferiert, in dem sie eine ausreichende Zeit zur Entfernung von jeglichem vorhandenen, losen Milchpulvers geschüttelt wurden. Dies dauert gewöhnlich eine Stunde. Diesem Schritt folgte ein zweiter Siebschritt zur Entfernung jeglichen überschüssigen Milchpulvers, das zuvor nicht entfernt wurde. Die Filter wurden in Gegenwart eines geeigneten Trockenmittels in einem Behälter aufbewahrt. Filter, die mit Hilfe dieser Technik präpariert wurden, sind direkt in der Diagnose-Testvorrichtung verwendbar.

Beispiel 5

Nachweis von verschiedenen Antigenen

Die Materialien und Methoden, die in diesem Beispiel beschrieben werden, gleichen denen aus Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen: Das Matrixmaterial 24 wird mit 2 Antikörpern behandelt, die verschiedene Antigenspezifitäten haben, einer ist gegen die beta-Untereinheit des Lutropins (LH) und der andere gegen die beta-Untereinheit des Follitropins (FSH) gerichtet. Durch den Gebrauch einer Printer-Coder-Maschine, wie im Beispiel 1 beschrieben, können die Antikörper in getrennten Mustern auf dem Matrixmaterial 24 verteilt werden. Der zweite Antikörper, der im Antikörper-Enzymkonjugat zum Nachweis von entweder LH oder FSH enthalten ist, kann entweder ein einziger monoklonaler Antikörper sein, der ein gemeinsames Epitop auf LH und FSH erkennt, oder es können zwei monoklonale Antikörper sein, die verschiedene Epitope auf LH und FSH binden. Im letzteren Fall können zwei verschiedene Enzyme, die unterschiedliche Farbreaktionen liefern, an die monoklonalen Antikörper gebunden werden, um verschiedenfarbige "+"-Zeichen zu erzeugen. Es können zum Beispiel alkalische Phosphatase und beta-Galactosidase verwendet werden, die erste ergibt eine rote Farbe mit einem geeigneten Substrat und die letztere eine blaue Farbe.
Die Horizontallinienkomponente des "+"-Zeichens für LH und FSH kann schließlich, wie in Beispiel 1 beschrieben, gebildet werden.

Beispiel 6

Empfindlichkeit der Diagnosevorrichtung

Die in Beispiel 1 beschriebenen Materialien und Methoden werden hier zum Vergleich der Empfindlichkeit und der Bearbeitungszeit der vorliegenden Vorrichtung mit zur Zeit benutzten handelsüblichen Vorrichtungen verwendet. Bei jeder der handelsüblichen Vorrichtungen wurden die Vorgehensweisen des Herstellers befolgt. Lösungen mit unterschiedlichen Mengen HCG wurden getestet und Tabelle 2 zeigt den nachweisbar niedrigeren Grenzwert oder die nachweisbar niedrigere Empfindlichkeit der Vorrichtungen. In der Tabelle werden außerdem die Methode, auf der die Analyse basiert, die Antikörpertypen und die Bearbeitungszeit der Analyse gezeigt.

Tabelle 1

ICON (Hybritech, Inc.), HCG Testausrüstung erfordert Aufbewahrung bei 2-8ºC
TEST PACK (Abbott Labs, Inc.), HCG Antikörper-Enzymkonjugat sollte bei 2-8ºC aufbewahrt werden
RAMP (Monoclonal Antibodies, Inc.), HCG Testausrüstung sollte bei 2-8ºC aufbewahrt werden. Tabelle 2 Diagnoseempfindlichvorrichtung Methode Herkunft des Antikörpers Reaktionszeit vorliegende Vorrichtung Testpack hCG-Urine Abbott LaboratoriesICON® HCG-Urine Hybritech Tandem Visual HCG (Urine) RAMPTM Urine hCG Assay Antibodies Inc. DUOCLONETM Slide Organon BETA Quik Stat Pacific Biotech, Inc. EIA, beschichtete Membran EIA, beschichteter Filter EIA, beschichtetes Kügelchen Latex Agglutination EIA, beschichtete Röhre Maus Monoklon

Claims

1. Immunanalysiervorrichtung mit einem Gehäuse (10) mit wenigstens einer Öffnung (26) zum Einführen einer flüssigen Probe in das Gehäuse (10), einer von der flüssigen Probe kontaktierbaren Matrix (24) aus porösem Material in dem Gehäuse (10), absorbierendem Material (20, 22) in Kontakt mit der Matrix (24) und wenigstens einem immunologischen Reagenz auf der Matrix (24), dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung weiter ein Trockenmittel in dem Gehäuse aufweist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das immunologische Reagenz ein Antigen oder einen Antikörper enthält.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, welche weiter ein entfernbares Vorfilter (28) aufweist, das über der Matrix (24) angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, bei welcher das Vorfilter (28) mit wenigstens einem Reagenzmaterial zur Verwendung bei der Analyse zum Verhindern eines nicht-spezifischen Bindens von Reagenzien oder Komponenten der Flüssigkeit an die Matrix (24) imprägniert ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, bei welcher das Reagenzmaterial ein Blockiermaterial ist, das eine derartige Affinität für die Matrix (24) hat, daß es während der Durchführung der Analyse an die Matrix gebunden wird.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei welcher das Blockiermaterial ein Protein ist.

7. Vorrichtung nach einem der vorherstehenden Ansprüche, welche weiter eine Mittelschicht zwischen dem absorbierenden Material und der Matrix zum Abziehen von Flüssigkeit aus der Matrix und in das absorbierende Material aufweist.

8. Vorrichtung nach einem der vorherstehenden Ansprüche, bei welcher das wenigstens eine immunologische Reagenz auf der Matrix unbeweglich in einem vorbestimmten Muster verteilt ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, bei welcher das Muster durch ein kreuzförmiges Symbol charakterisiert ist.

10. Vorrichtung nach einem der vorherstehenden Ansprüche, bei welcher das Gehäuse eine erste und eine zweite Kammer (16, 18) aufweist, wobei die Öffnung (26) an der ersten Kammer (16) ausgebildet ist und die zweite Kammer (18) das Trockenmaterial aufnimmt.

11. Verfahren zum Auswerten von Immunproben unter Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei welchem:

wenigstens ein immunologisches Reagenz, spezifisch für eine Stelle eines Analysematerials auf der Matrix (24), vorgesehen wird, an welcher die Matrix die Fähigkeit hat, Proteine zu binden;

eine Flüssigkeitsprobe durch eine Öffnung (26) in das Gehäuse (10) auf die Matrix eingeführt wird, wobei die Matrix von der Flüssigkeitsprobe kontaktierbar ist; und

die Bereiche der Matrix festgestellt werden, an welche das Analysematerial gebunden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Verfahrensschritt zum Einführen der Flüssigkeit auf die Matrix Schritte aufweist, bei welchen die Flüssigkeit auf das über der Matrix angeordnete Vorfilter gegossen wird, das in dem Vorfilter imprägnierte, trockene Blockiereagenz aufgelöst wird, und ermöglicht wird, daß die Flüssigkeit und das Blockieragenz durch das Vorfilter auf die Matrix fließen.