JP3350533B2 - Ｄｎａ含有プラスミド - Google Patents
Ｄｎａ含有プラスミドInfo
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- JP3350533B2 JP3350533B2 JP2001320159A JP2001320159A JP3350533B2 JP 3350533 B2 JP3350533 B2 JP 3350533B2 JP 2001320159 A JP2001320159 A JP 2001320159A JP 2001320159 A JP2001320159 A JP 2001320159A JP 3350533 B2 JP3350533 B2 JP 3350533B2
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- Japan
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- epidermin
- plasmid
- polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プレエピデルミン
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミ
ドに関する。
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミ
ドに関する。
【従来の技術】若干のポリペプチド抗生物質例えばナイ
シン、スブチリン、ズラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉ
ｎ）、シンナマイシン（ｃｉｎｎａｍｙｃｉｎ）、アン
コベニン（ａｎｃｏｖｅｎｉｎ）、Ｒｏ０９−０１９８
およびエピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）はデヒドロ
アミノ酸およびランチオニン架橋を含む。これらのポリ
ペプチドは種々のそれぞれの株の微生物により生成され
る。例えばナイシンはストレプトコッカス・ラクチン
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）の株の
培養により、スブチリンはバシラス・サチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養により製造する
ことができる。これらの抗生物質の生合成に対する遺伝
学根拠はこれまで明らかにされなかった。従って、例え
ばそのような抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出
された異常なアミノ酸の形成がリボソーム合成を経由す
るかまたは多酵素複合体を経由して生ずるか知られなか
った。
シン、スブチリン、ズラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉ
ｎ）、シンナマイシン（ｃｉｎｎａｍｙｃｉｎ）、アン
コベニン（ａｎｃｏｖｅｎｉｎ）、Ｒｏ０９−０１９８
およびエピデルミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）はデヒドロ
アミノ酸およびランチオニン架橋を含む。これらのポリ
ペプチドは種々のそれぞれの株の微生物により生成され
る。例えばナイシンはストレプトコッカス・ラクチン
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｎ）の株の
培養により、スブチリンはバシラス・サチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養により製造する
ことができる。これらの抗生物質の生合成に対する遺伝
学根拠はこれまで明らかにされなかった。従って、例え
ばそのような抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出
された異常なアミノ酸の形成がリボソーム合成を経由す
るかまたは多酵素複合体を経由して生ずるか知られなか
った。
【０００２】さらに、そのような抗生物質の前駆物質タ
ンパク質が明瞭な構造遺伝子によりコードされるかまた
はより大きいタンパク質の分解生成物であるか知られな
かった。エピデルミンの構造遺伝子を確証するために行
なった研究の過程において、我々は意外にも前記抗生物
質、殊にエピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコード
されること、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシ
ングがデヒドロアミノ残基および（または）チオエーテ
ル架橋の形成を行なう酵素複合体により行なわれること
を確証することができた。さらに、多酵素複合体が細胞
膜を通る培養上澄み中へのタンパク質の分泌、並びにプ
レポリペプチドのプロセッシングに関連されることがで
きる。これに関連して、そのような活性が例えば後記す
るプレ−エピデルミンの−３０〜−１配列の場合のよう
に、プレ−ポリペプチドにより所有されるプレ−配列に
関連させることができる。
ンパク質が明瞭な構造遺伝子によりコードされるかまた
はより大きいタンパク質の分解生成物であるか知られな
かった。エピデルミンの構造遺伝子を確証するために行
なった研究の過程において、我々は意外にも前記抗生物
質、殊にエピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコード
されること、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシ
ングがデヒドロアミノ残基および（または）チオエーテ
ル架橋の形成を行なう酵素複合体により行なわれること
を確証することができた。さらに、多酵素複合体が細胞
膜を通る培養上澄み中へのタンパク質の分泌、並びにプ
レポリペプチドのプロセッシングに関連されることがで
きる。これに関連して、そのような活性が例えば後記す
るプレ−エピデルミンの−３０〜−１配列の場合のよう
に、プレ−ポリペプチドにより所有されるプレ−配列に
関連させることができる。
【０００３】
【発明の開示】概括的に記載すると、一観点においてプ
ラスミドが宿主により通常生成されないポリペプチドを
コードし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、
それにより少くとも１つのデヒドロアミノ酸および（ま
たは）少くとも１つのランチオニン架橋を含むポリペプ
チドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記宿主にと
って外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供す
る。適当な多酵素複合体は、次の作用、すなわち水脱離
およびスルフィド架橋形成、の少くとも１つを行なうこ
とができ；複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行
なうことができる。
ラスミドが宿主により通常生成されないポリペプチドを
コードし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、
それにより少くとも１つのデヒドロアミノ酸および（ま
たは）少くとも１つのランチオニン架橋を含むポリペプ
チドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記宿主にと
って外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供す
る。適当な多酵素複合体は、次の作用、すなわち水脱離
およびスルフィド架橋形成、の少くとも１つを行なうこ
とができ；複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行
なうことができる。
【０００４】本発明はまた、以下のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡを含有するプラスミドを提供する。
ドするＤＮＡを含有するプラスミドを提供する。
【化２】
【０００５】
【発明の実施の形態】方法の実施に適する宿主は、それ
らの遺伝物質の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および
（または）ランチオニン架橋並びに（または）メチルラ
ンチオニン架橋を含むポリペプチドを生成することがで
きる。そのような宿主の例はストレプトコッカス・ラク
チス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレ
プトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓ
ｐ．）、ストレプトベルティカラム・グリセオベルティ
シラム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒ
ｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スタヒロコッカス
・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｓ）、スタヒロコッカス・エピデルミン
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｎ）株５またはスタヒロコッカス・ガリナラム（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）であ
る。
らの遺伝物質の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および
（または）ランチオニン架橋並びに（または）メチルラ
ンチオニン架橋を含むポリペプチドを生成することがで
きる。そのような宿主の例はストレプトコッカス・ラク
チス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレ
プトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓ
ｐ．）、ストレプトベルティカラム・グリセオベルティ
シラム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ ｇｒ
ｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スタヒロコッカス
・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｓ）、スタヒロコッカス・エピデルミン
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｎ）株５またはスタヒロコッカス・ガリナラム（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）であ
る。
【０００６】殊に関心のある株は、１９８８年５月１８
日にブダペスト条約の条件下にドイッチェ・ザムルング
・フォン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ４６１６を受けた
スタヒロコッカス・ガリナラム（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｉ
ｉ ３９２８および本出願人により１９８４年１０月２
６日ブダペスト条約の条件下にドイッチェ・ザムルング
・フォン・ミクロオルガニスメンに寄託されたスタヒロ
コッカス・エピデルミスＤＳＭ３０９５である。適当な
宿主を形質転換するために適当なプラスミドを公知遺伝
子工学技術により修飾することができる。
日にブダペスト条約の条件下にドイッチェ・ザムルング
・フォン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ
Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ４６１６を受けた
スタヒロコッカス・ガリナラム（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｉ
ｉ ３９２８および本出願人により１９８４年１０月２
６日ブダペスト条約の条件下にドイッチェ・ザムルング
・フォン・ミクロオルガニスメンに寄託されたスタヒロ
コッカス・エピデルミスＤＳＭ３０９５である。適当な
宿主を形質転換するために適当なプラスミドを公知遺伝
子工学技術により修飾することができる。
【０００７】望ましくは少くとも１つのデヒドロアミノ
酸残基および（または）少くとも１つのスルフィド架橋
を含むポリペプチドを生成する宿主のプラスミドを、プ
レ−ポリペプチドをコードする遺伝子の修飾または置換
により処理して前記宿主にとって外来のポリペプチドを
コードするプラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プ
ラスミドで形質転換する。種々の方法のいずれもプレ−
ポリペプチドをコードする遺伝子の置換または修飾に使
用することができる。所望化合物のプレ−ポリペプチド
配列をコードするＤＮＡは化学合成により製造すること
ができる。適当な化学合成はアナリティカル・バイオケ
ミストリー（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１２
１，３６５（１９８２）中に開示されている。公知技術
は例えば６０〜１００塩基までのポリヌクレオチドの調
製物の製造を可能にする。
酸残基および（または）少くとも１つのスルフィド架橋
を含むポリペプチドを生成する宿主のプラスミドを、プ
レ−ポリペプチドをコードする遺伝子の修飾または置換
により処理して前記宿主にとって外来のポリペプチドを
コードするプラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プ
ラスミドで形質転換する。種々の方法のいずれもプレ−
ポリペプチドをコードする遺伝子の置換または修飾に使
用することができる。所望化合物のプレ−ポリペプチド
配列をコードするＤＮＡは化学合成により製造すること
ができる。適当な化学合成はアナリティカル・バイオケ
ミストリー（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１２
１，３６５（１９８２）中に開示されている。公知技術
は例えば６０〜１００塩基までのポリヌクレオチドの調
製物の製造を可能にする。
【０００８】適当に保護されたヌクレオチドをホスホジ
エステル法〔アガルウォル（Ａｇａｒｗａｌ）ほか、ア
ンゲバンテ・ヘミー（Ａｎｇｅｗ， Ｃｈｅｍ．），８
４，４８９（１９７２）〕、ホスホトリエステル法〔リ
ーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ），３９，３（１９８３）〕またはホスフ
ィツトトリエステル法〔レッツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎ
ｇｅｒ）ほか、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイアティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．），９８，３６５５（１９７６）〕あるいはホスホ
ルアミジット法により連結させることができる。固相法
はポリヌクレオチドの合成の単純化を可能にする。
エステル法〔アガルウォル（Ａｇａｒｗａｌ）ほか、ア
ンゲバンテ・ヘミー（Ａｎｇｅｗ， Ｃｈｅｍ．），８
４，４８９（１９７２）〕、ホスホトリエステル法〔リ
ーセム（Ｒｅｅｓｅｍ）、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａ
ｈｅｄｒｏｎ），３９，３（１９８３）〕またはホスフ
ィツトトリエステル法〔レッツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎ
ｇｅｒ）ほか、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサイアティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．），９８，３６５５（１９７６）〕あるいはホスホ
ルアミジット法により連結させることができる。固相法
はポリヌクレオチドの合成の単純化を可能にする。
【０００９】二本鎖ＤＮＡは化学的に製造した短かい
が、しかし重なりセグメントから酵素的に構築すること
ができる。例えば、両ＤＮＡ鎖の重なりポリヌクレオチ
ド配列を用いることができ、それらは塩基対合により正
しい配座中にともに保持され、酵素ＤＮＡリガーゼによ
り化学的に連結される（コラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）ほ
か、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５１，５６５（１９
７６）〕。他の可能性には、それぞれの場合に短かい重
なり配列を有する２つのＤＮＡ鎖の１ポリヌクレオチド
配列を４所要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下
に、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４
ＤＮＡポリメラーゼとともに、あるいは逆転写酵素とと
もにインキュベートすることが含まれる。２つのポリヌ
クレオチド配列がそれにより塩基対合により正しい配列
に保持され、酵素により所要ヌクレオチドを補足されて
完全二本鎖ＤＮＡを与える〔ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）
ほか、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１２１，３６５（１９８
２）〕。
が、しかし重なりセグメントから酵素的に構築すること
ができる。例えば、両ＤＮＡ鎖の重なりポリヌクレオチ
ド配列を用いることができ、それらは塩基対合により正
しい配座中にともに保持され、酵素ＤＮＡリガーゼによ
り化学的に連結される（コラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）ほ
か、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５１，５６５（１９
７６）〕。他の可能性には、それぞれの場合に短かい重
なり配列を有する２つのＤＮＡ鎖の１ポリヌクレオチド
配列を４所要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下
に、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４
ＤＮＡポリメラーゼとともに、あるいは逆転写酵素とと
もにインキュベートすることが含まれる。２つのポリヌ
クレオチド配列がそれにより塩基対合により正しい配列
に保持され、酵素により所要ヌクレオチドを補足されて
完全二本鎖ＤＮＡを与える〔ナラニー（Ｎａｒａｎｙ）
ほか、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１２１，３６５（１９８
２）〕。
【００１０】ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る他
の適当な方法は微生物の組織または細胞培養のゲノムＤ
ＮＡから前記ＤＮＡを分離し、細胞を例えばＳＤＳまた
はプロテイナーゼＫで、または望むならば機械的に、溶
解し、ＤＮＡをフェノールによる反復抽出により除タン
パクすることを含む。ＲＮＡは好ましくはＲＮase で消
化することができる。得られたＤＮＡは適当な制限酵素
例えばＨaeIII およびＡｌｕＩＩで部分消化され、フラ
グメントが分離され、適当なファージまたはコスミド
中、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３ファージ中
で増殖され、例えば放射性標識ＤＮＡプローブで所望配
列について検定される。
の適当な方法は微生物の組織または細胞培養のゲノムＤ
ＮＡから前記ＤＮＡを分離し、細胞を例えばＳＤＳまた
はプロテイナーゼＫで、または望むならば機械的に、溶
解し、ＤＮＡをフェノールによる反復抽出により除タン
パクすることを含む。ＲＮＡは好ましくはＲＮase で消
化することができる。得られたＤＮＡは適当な制限酵素
例えばＨaeIII およびＡｌｕＩＩで部分消化され、フラ
グメントが分離され、適当なファージまたはコスミド
中、例えばシャロン４ＡまたはＥＭＢＬ−３ファージ中
で増殖され、例えば放射性標識ＤＮＡプローブで所望配
列について検定される。
【００１１】所望ポリペプチドをコードするＤＮＡはま
た分離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡ中へ逆転写することに
より得ることができる。これはＤＮＡ構造が知られてい
なければ好ましい方法であろう。この方法においてＤＮ
ＡはｃＤＮＡライブラリー中のゲノムＤＮＡからｍＲＮ
Ａを経て得られる。ｃＤＮＡライブラリーは細胞から分
離されたｍＲＮＡに相補的である遺伝子情報を含む。ｃ
ＤＮＡライブリーを得るためにｍＲＡＮが所望の塩基
（できる限り非修飾）タンパク質を発現する細胞から分
離される。このｍＲＮＡが二本鎖ｃＤＮＡに転化され
る。
た分離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡ中へ逆転写することに
より得ることができる。これはＤＮＡ構造が知られてい
なければ好ましい方法であろう。この方法においてＤＮ
ＡはｃＤＮＡライブラリー中のゲノムＤＮＡからｍＲＮ
Ａを経て得られる。ｃＤＮＡライブラリーは細胞から分
離されたｍＲＮＡに相補的である遺伝子情報を含む。ｃ
ＤＮＡライブリーを得るためにｍＲＡＮが所望の塩基
（できる限り非修飾）タンパク質を発現する細胞から分
離される。このｍＲＮＡが二本鎖ｃＤＮＡに転化され
る。
【００１２】よく知られた標準法がｍＲＮＡの製造に適
用される。細胞膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、
それからｍＲＮＡが分離される。細胞膜は、好ましくは
物理的方法または洗剤例えばＳＤＳ、グアニジンチオシ
アネート、一定塩条件または均質化による溶解により、
好ましくは混合により破壊される。ｍＲＮＡはフェノー
ル抽出、エタノール沈殿、遠心分離およびクロマトグラ
フィーの標準的方法、好ましくは若干の方法の組合せ、
により分離される。遠心分離は好ましくは勾配で、例え
ばＣｓＣｌ勾配で行なわれる。クロマトグラフィーには
好ましくはカラム、殊にオリゴーｄＴカラムが使用され
る。全ｍＲＮＡは該技術の方法に従い直接Ｄｓ−ｃＤＮ
Ａに転化することができる。好ましくは、所望ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡは若干の技術例えば電気泳動
法、クロマトグラフ法および遠心分離法、好ましくはシ
ョ糖勾配遠心分離法を用いてさらに濃縮される。
用される。細胞膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、
それからｍＲＮＡが分離される。細胞膜は、好ましくは
物理的方法または洗剤例えばＳＤＳ、グアニジンチオシ
アネート、一定塩条件または均質化による溶解により、
好ましくは混合により破壊される。ｍＲＮＡはフェノー
ル抽出、エタノール沈殿、遠心分離およびクロマトグラ
フィーの標準的方法、好ましくは若干の方法の組合せ、
により分離される。遠心分離は好ましくは勾配で、例え
ばＣｓＣｌ勾配で行なわれる。クロマトグラフィーには
好ましくはカラム、殊にオリゴーｄＴカラムが使用され
る。全ｍＲＮＡは該技術の方法に従い直接Ｄｓ−ｃＤＮ
Ａに転化することができる。好ましくは、所望ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡは若干の技術例えば電気泳動
法、クロマトグラフ法および遠心分離法、好ましくはシ
ョ糖勾配遠心分離法を用いてさらに濃縮される。
【００１３】所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
を含む画分は種々の方法、例えば生体内または試験管内
翻訳、次いで適切な活性の検出または、ヌクレオチド配
列が知れているときにオリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリッド形成により検出することができる。生体内
翻訳系は原核または真核系であることができる。好まし
い生体内翻訳系はアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞系である〔マニアティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ほか、分子クローニング、実験室マニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９
８２）参照〕。試験管内系は例えば小麦胚およびウサギ
網状赤血球溶解物であり、それらのいずれも市販されて
いる。
を含む画分は種々の方法、例えば生体内または試験管内
翻訳、次いで適切な活性の検出または、ヌクレオチド配
列が知れているときにオリゴヌクレオチドプローブとの
ハイブリッド形成により検出することができる。生体内
翻訳系は原核または真核系であることができる。好まし
い生体内翻訳系はアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞系である〔マニアティス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ほか、分子クローニング、実験室マニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９
８２）参照〕。試験管内系は例えば小麦胚およびウサギ
網状赤血球溶解物であり、それらのいずれも市販されて
いる。
【００１４】非分画または分画ｍＲＮＡ由来ｍＲＮＡの
任意のプールから、よく知られた方法によりｄＳ−ｃＤ
ＮＡを得ることができる〔好ましい一般法はマニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか（前掲）、オカヤムほか
（Ｏｋａｙａｍ ａｎｄ Ｂｅｒｇ），モレキュラー・
アンド・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２，１６１〜１７
０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋｅ
ｒ），ニュクリーク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１１，４８９１〜
４９０６（１９８３）中に記載されている〕。一般に、
ｍＲＮＡは初めにリバーストランスクリプターゼまたは
ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラ
グメント〕を用いてｓｓ−ｃＤＮＡに転化される。２つ
の方法がｄｓ−ｃＤＮＡの合成の開始に択一的に使用さ
れる。第１法はｓｓ−ｃＤＮＡの自然ループ形成であっ
た。第２法はｓｓ−ｃＤＮＡをホモポリマーテール例え
ばｄＣまたはポリＤＴでテーリングすることである。
任意のプールから、よく知られた方法によりｄＳ−ｃＤ
ＮＡを得ることができる〔好ましい一般法はマニアティ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか（前掲）、オカヤムほか
（Ｏｋａｙａｍ ａｎｄ Ｂｅｒｇ），モレキュラー・
アンド・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２，１６１〜１７
０（１９８２）およびハイデッカー（Ｈｅｉｄｅｃｋｅ
ｒ），ニュクリーク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１１，４８９１〜
４９０６（１９８３）中に記載されている〕。一般に、
ｍＲＮＡは初めにリバーストランスクリプターゼまたは
ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラ
グメント〕を用いてｓｓ−ｃＤＮＡに転化される。２つ
の方法がｄｓ−ｃＤＮＡの合成の開始に択一的に使用さ
れる。第１法はｓｓ−ｃＤＮＡの自然ループ形成であっ
た。第２法はｓｓ−ｃＤＮＡをホモポリマーテール例え
ばｄＣまたはポリＤＴでテーリングすることである。
【００１５】相当するポリペプチドが検出系中で最高の
活性を示すｍＲＮＡ画分はよく知られた方法により相補
的ｃＤＮＡ中へ転写される。ｍＲＮＡおよびオリゴーｄ
Ｔがプライマーとして混合され、次いでｄＮＴＰs が出
発物質として添加され、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッ
ド分子の合成が酵素リバーストランスクリプターゼによ
り実現される。ＲＮＡ分子はＮａＯＨの添加により分解
される。ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウフラグメントが混合され、混合物が
適当な温度、好ましくは１２〜１５℃でインキュベート
される。混合物はヌクレアーゼＳ１とともにインキュベ
ートされ、所望ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相
当するｄｓ−ｃＤＮＡが得られる。増幅のために、得ら
れたｄｓ−ｃＤＮＡは適当なベクター、例えばプラスミ
ドｐＵＣ−ＫＯにスプライシングすることができ、得ら
れたハイブリッドベクターを適当な宿主、例えばＥ、コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１の使用により増殖させる
ことができる。ハイブリッドベクターの再分離およびそ
れから分離されたｃＤＮＡの回収が所望ポリペプチドを
コードするＤＮＡの構造決定を可能にする。
活性を示すｍＲＮＡ画分はよく知られた方法により相補
的ｃＤＮＡ中へ転写される。ｍＲＮＡおよびオリゴーｄ
Ｔがプライマーとして混合され、次いでｄＮＴＰs が出
発物質として添加され、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッ
ド分子の合成が酵素リバーストランスクリプターゼによ
り実現される。ＲＮＡ分子はＮａＯＨの添加により分解
される。ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメ
ラーゼＩのクレノウフラグメントが混合され、混合物が
適当な温度、好ましくは１２〜１５℃でインキュベート
される。混合物はヌクレアーゼＳ１とともにインキュベ
ートされ、所望ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相
当するｄｓ−ｃＤＮＡが得られる。増幅のために、得ら
れたｄｓ−ｃＤＮＡは適当なベクター、例えばプラスミ
ドｐＵＣ−ＫＯにスプライシングすることができ、得ら
れたハイブリッドベクターを適当な宿主、例えばＥ、コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１の使用により増殖させる
ことができる。ハイブリッドベクターの再分離およびそ
れから分離されたｃＤＮＡの回収が所望ポリペプチドを
コードするＤＮＡの構造決定を可能にする。
【００１６】ハイブリッドベクターの調製 本発明のハイブリッドベクターは、所望配列のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより調製することができる。適当なベク
ターは宿主微生物の形質転換に使用できる組込まれたパ
ッセンジャーＤＮＡに対する担体である。非形質転換状
態でデヒドロアミノおよび（または）スルフィド基を含
むポリペプチドを生ずる微生物から誘導されたプラスミ
ドがベクターとして適当である。適当なベクターは挿入
断片ＤＮＡを一定の位置に保持する。一般に、そのよう
なベクターはレプリコンおよび制御配列、すなわちプロ
モーター、を含むことができ、それらは、それらが使用
される宿主細胞と適合する宿主細胞または種から誘導さ
れる。ベクターは通常レプリコン部位を保持し、形質転
換された細胞中に表現型選択を与えることができる配列
（標識遺伝子）を含むことができる。適当な標識遺伝子
は抗生物質耐性または重金属に対する耐性を与えること
ができ、あるいはそれらが宿主の遺伝欠損を補足するこ
とができる。そのようなベクター中のさらに有用な配列
はエンハンサーおよびアクチベーター配列である。
チドをコードするＤＮＡを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより調製することができる。適当なベク
ターは宿主微生物の形質転換に使用できる組込まれたパ
ッセンジャーＤＮＡに対する担体である。非形質転換状
態でデヒドロアミノおよび（または）スルフィド基を含
むポリペプチドを生ずる微生物から誘導されたプラスミ
ドがベクターとして適当である。適当なベクターは挿入
断片ＤＮＡを一定の位置に保持する。一般に、そのよう
なベクターはレプリコンおよび制御配列、すなわちプロ
モーター、を含むことができ、それらは、それらが使用
される宿主細胞と適合する宿主細胞または種から誘導さ
れる。ベクターは通常レプリコン部位を保持し、形質転
換された細胞中に表現型選択を与えることができる配列
（標識遺伝子）を含むことができる。適当な標識遺伝子
は抗生物質耐性または重金属に対する耐性を与えること
ができ、あるいはそれらが宿主の遺伝欠損を補足するこ
とができる。そのようなベクター中のさらに有用な配列
はエンハンサーおよびアクチベーター配列である。
【００１７】適当な出発ベクターの１つは株スタヒロコ
ッカス・エピデルミスＤＳＭ３０９５からの５４Ｋｂｐ
プラスミドｐＥｐｉ３２である。このプラスミドは下記
特徴を有し、５２−プレペプチドをコードするｅｐｉＡ
遺伝子を含み、それは四環２１−ペプチドアミド抗生物
質にプロセッシングされる。パッセンジャーＤＮＡを保
持するベクターはハイブリッドベクターと称される。所
望ＤＮＡは常法により出発ベクターにスプライシングさ
れる。
ッカス・エピデルミスＤＳＭ３０９５からの５４Ｋｂｐ
プラスミドｐＥｐｉ３２である。このプラスミドは下記
特徴を有し、５２−プレペプチドをコードするｅｐｉＡ
遺伝子を含み、それは四環２１−ペプチドアミド抗生物
質にプロセッシングされる。パッセンジャーＤＮＡを保
持するベクターはハイブリッドベクターと称される。所
望ＤＮＡは常法により出発ベクターにスプライシングさ
れる。
【００１８】例えば出発プラスミドは初めに適当な制限
酵素により、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２をＨｉｎｄ
III 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより、線状化し、
次いでｄＧＴＰおよび末端デオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼの存在下にｄ／Ｇテーリングすることが
できる。二本鎖ｃＤＮＡ挿入断片はｄＣＴＰおよび末端
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下に
ｄＣ−テーリングされる。両ｃＤＮＡおよびベクターを
結合させるとハイブリッドベクターを生ずる。バクテリ
オファージ例えばラムダはゲノムライブラリーの構築に
好ましい。ラムダクローニング系はマニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）により記載されている（前掲）。適当な
ベクターＤＮＡは適当な制限酵素で完全に消化され、左
右のアームが中心フラグメントから速度勾配遠心分離ま
たはゲル電気泳動により分離される。他の方法は左右の
アーム中に認識部位を欠く制限酵素でスタッファーフラ
グメントの部位を消化することである。分離されたゲノ
ムＤＮＡは長さ１３〜２０ｋｂのフラグメントに部分的
に消化されることができる。その後アームはアームの末
端と適合する末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントと
連結される。
酵素により、例えばプラスミドｐＥｐｉ３２をＨｉｎｄ
III 、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩにより、線状化し、
次いでｄＧＴＰおよび末端デオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼの存在下にｄ／Ｇテーリングすることが
できる。二本鎖ｃＤＮＡ挿入断片はｄＣＴＰおよび末端
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下に
ｄＣ−テーリングされる。両ｃＤＮＡおよびベクターを
結合させるとハイブリッドベクターを生ずる。バクテリ
オファージ例えばラムダはゲノムライブラリーの構築に
好ましい。ラムダクローニング系はマニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）により記載されている（前掲）。適当な
ベクターＤＮＡは適当な制限酵素で完全に消化され、左
右のアームが中心フラグメントから速度勾配遠心分離ま
たはゲル電気泳動により分離される。他の方法は左右の
アーム中に認識部位を欠く制限酵素でスタッファーフラ
グメントの部位を消化することである。分離されたゲノ
ムＤＮＡは長さ１３〜２０ｋｂのフラグメントに部分的
に消化されることができる。その後アームはアームの末
端と適合する末端を有する外来ＤＮＡのフラグメントと
連結される。
【００１９】適当なＤＮＡ挿入断片は初めのクローニン
グに使用された初めのベクターから適当な発現ベクター
中へ再クローニングされる。この目的のために適当な制
限酵素が、おそらくオキソヌクレオン（ｏｘｏｎｕｃｌ
ｅｏｎｅｓ）と組合せて使用され、所望ＤＮＡフラグメ
ントが生成される。ＤＮＡ挿入断片は適当なよく知られ
たプラスミドベクター例えばｐＣ１９４、ｐＴＩ８１お
よびｐＵＢ１１０の誘導体の多部位中へ制限部位Ｈｉｎ
ｄIII ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでサブクローニングす
ることができる。従って方法は、非修飾ペプチド中のシ
ステイン残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換さ
れ、セリンおよびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸
残基により置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘
導体の製造に使用できる。
グに使用された初めのベクターから適当な発現ベクター
中へ再クローニングされる。この目的のために適当な制
限酵素が、おそらくオキソヌクレオン（ｏｘｏｎｕｃｌ
ｅｏｎｅｓ）と組合せて使用され、所望ＤＮＡフラグメ
ントが生成される。ＤＮＡ挿入断片は適当なよく知られ
たプラスミドベクター例えばｐＣ１９４、ｐＴＩ８１お
よびｐＵＢ１１０の誘導体の多部位中へ制限部位Ｈｉｎ
ｄIII ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでサブクローニングす
ることができる。従って方法は、非修飾ペプチド中のシ
ステイン残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換さ
れ、セリンおよびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸
残基により置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘
導体の製造に使用できる。
【００２０】これらのフラグメントは粘着末端を用いる
ことにより直接、または適当な化学合成オリゴヌクレオ
チド架橋の付加により適当な発現ベクター中へ取込まれ
る。末端の修飾には、例えばＨｉｎｄIII およびＢｇＬ
IIを用いることができる。方法は任意の特異制限酵素に
限定されない。適当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレ
オチドと組合せて用いて任意の所望連鎖を発現ベクター
とＤＮＡ挿入断片との間に作ることができる。部分特異
的変異誘発を有するポリペプチドをコードする適当なＤ
ＮＡ挿入断片もまた得ることができる。種々の方法を基
礎となるＤＮＡの変異の誘発に用いて所望変異体を調製
することができる。
ことにより直接、または適当な化学合成オリゴヌクレオ
チド架橋の付加により適当な発現ベクター中へ取込まれ
る。末端の修飾には、例えばＨｉｎｄIII およびＢｇＬ
IIを用いることができる。方法は任意の特異制限酵素に
限定されない。適当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレ
オチドと組合せて用いて任意の所望連鎖を発現ベクター
とＤＮＡ挿入断片との間に作ることができる。部分特異
的変異誘発を有するポリペプチドをコードする適当なＤ
ＮＡ挿入断片もまた得ることができる。種々の方法を基
礎となるＤＮＡの変異の誘発に用いて所望変異体を調製
することができる。
【００２１】１つの方法は初めに変異させる領域をコー
ドする配列を含む自生または基礎遺伝子のフラグメント
を複製形態のファージ例えばＭＩ３ｍｐ８中に挿入して
ＭＩ３ｍｐ８ＰＡを形成することを含むことができる。
従って挿入配列に相補的な、しかし置換されるアミノ酸
をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチドトリプ
レットを含む合成オリゴヌクレオチドを一本鎖形態のＭ
Ｉ３ｍｐ８Ａにアニールして二本鎖領域を形成させる。
この領域は残留相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成に対
するプライマーとして役立つ。複製および確認後、変異
体配列をさらに修飾するかまたはそれを用いて変異ポリ
ペプチドを発現する適当なベクターを構築することがで
きる。
ドする配列を含む自生または基礎遺伝子のフラグメント
を複製形態のファージ例えばＭＩ３ｍｐ８中に挿入して
ＭＩ３ｍｐ８ＰＡを形成することを含むことができる。
従って挿入配列に相補的な、しかし置換されるアミノ酸
をコードする１つまたはそれ以上のヌクレオチドトリプ
レットを含む合成オリゴヌクレオチドを一本鎖形態のＭ
Ｉ３ｍｐ８Ａにアニールして二本鎖領域を形成させる。
この領域は残留相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成に対
するプライマーとして役立つ。複製および確認後、変異
体配列をさらに修飾するかまたはそれを用いて変異ポリ
ペプチドを発現する適当なベクターを構築することがで
きる。
【００２２】エピデルミンで行なった研究において、対
合を緩めたＤＮＡプローブ、５′−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ
（Ｇ／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３′がエピ
デルミンの提案プレ−配列の適当なペンタペプチドセグ
メントから演繹された。ＬｙｓＰｈｅＩｌｅＣｙｌＴｈ
ｒが調製された。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミ
ンＤＳＭ３０９５からのプラスミドＤＮＡに対してハイ
ブリッド形成させた。分離したプラスミドの制限分析は
ＥｃｏＲＩによる７ＤＮＡフラグメント（１６、１１、
１０、6.５、5.５、3.５および2.５kbp ）、ＨｉｎｄII
I による９ＤＮＡフラグメント（１７、１４、１０、5.
３、2.８、1.８、0.８、0.６および0.５kbp ）並びにＢ
ａｍＨＩによる５ＤＮＡフラグメント（２０、１９、１
０、３および１kbp ）を示す。
合を緩めたＤＮＡプローブ、５′−ＧＴＧ（Ａ）ＣＡＴ
（Ｇ／Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＡＡＴ（Ｃ）ＴＴ−３′がエピ
デルミンの提案プレ−配列の適当なペンタペプチドセグ
メントから演繹された。ＬｙｓＰｈｅＩｌｅＣｙｌＴｈ
ｒが調製された。このＤＮＡプローブをＳ．エピデルミ
ンＤＳＭ３０９５からのプラスミドＤＮＡに対してハイ
ブリッド形成させた。分離したプラスミドの制限分析は
ＥｃｏＲＩによる７ＤＮＡフラグメント（１６、１１、
１０、6.５、5.５、3.５および2.５kbp ）、ＨｉｎｄII
I による９ＤＮＡフラグメント（１７、１４、１０、5.
３、2.８、1.８、0.８、0.６および0.５kbp ）並びにＢ
ａｍＨＩによる５ＤＮＡフラグメント（２０、１９、１
０、３および１kbp ）を示す。
【００２３】5.４kbp ＨｉｎｄIII フラグメントをサブ
クローンし、再ハイブリッド化させ、それにより構造遺
伝子ｅｐｉＡを2.２kbp ＥｃｏＲＩ／ＢａｌIIフラグメ
ント内に位置させた。２４の混合物として異なる１４−
マーをハイブリッド形成プローブとして用いた。プロー
ブは、ノビック（Ｎｏｖｉｃｋ）ほか、アナルズ・オブ
・ザ・ニュー・ヨーク・アカデミィ・オブ・サイエンス
（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），１８２，２
７９〜２９４（１９７１）、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），９８，５０３〜５１７
（１９７５）およびハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）
ほか、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジネティクス
（Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），２０９，
５６３〜５６９（１９８７）中に記載された方法に従っ
て配列決定プライマーとして３０倍過剰に適用した。エ
ピデルミンのペプチド配列はオープン読み枠の確認を可
能にした。単メチオニンコドンはシャイン・ダルガルノ
配列に対して適当な距離中にある。プレ−エピデルミン
の構造遺伝子はＴＡＡ終止コドンで終結し、従ってプレ
−エピデルミンは５２アミノ酸からなり（図１）、それ
はＡｒｇ-1とＩｌｅ+1との間でエピデルミンにプロセッ
シングされる。従って、明らかに認められるように、プ
レ−エピデルミンは大タンパク質の分離生成物ではなく
て明らかな構造遺伝子によりコードされる。
クローンし、再ハイブリッド化させ、それにより構造遺
伝子ｅｐｉＡを2.２kbp ＥｃｏＲＩ／ＢａｌIIフラグメ
ント内に位置させた。２４の混合物として異なる１４−
マーをハイブリッド形成プローブとして用いた。プロー
ブは、ノビック（Ｎｏｖｉｃｋ）ほか、アナルズ・オブ
・ザ・ニュー・ヨーク・アカデミィ・オブ・サイエンス
（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），１８２，２
７９〜２９４（１９７１）、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），９８，５０３〜５１７
（１９７５）およびハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）
ほか、モレキュラー・アンド・ゼネラル・ジネティクス
（Ｍｏｌｅｃｕｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．），２０９，
５６３〜５６９（１９８７）中に記載された方法に従っ
て配列決定プライマーとして３０倍過剰に適用した。エ
ピデルミンのペプチド配列はオープン読み枠の確認を可
能にした。単メチオニンコドンはシャイン・ダルガルノ
配列に対して適当な距離中にある。プレ−エピデルミン
の構造遺伝子はＴＡＡ終止コドンで終結し、従ってプレ
−エピデルミンは５２アミノ酸からなり（図１）、それ
はＡｒｇ-1とＩｌｅ+1との間でエピデルミンにプロセッ
シングされる。従って、明らかに認められるように、プ
レ−エピデルミンは大タンパク質の分離生成物ではなく
て明らかな構造遺伝子によりコードされる。
【００２４】従って、意外にも抗生物質の前駆物質タン
パク質が明白な構造遺伝子によりコードされることが明
らかである。二次構造（α、β、折返し）、屈曲性、ヒ
ドロパシー、親水性およびヘリックスホィールプロット
に対する予想プロフィルの組合せがハイコン（Ｈｙｃｏ
ｎ）プログラムを用いて作られた（図２）。高α−ヘリ
ックス確率はプレ−エピデルミン−３０〜−８に対し予
想され、一方プレ−エピデルミンに相当するＣ末端部１
〜２２は非常に高い折返し確率を示す。さらに予想プロ
ットは明らかにＮ末端−３０〜−１が非常に親水性であ
り、Ｃ末端部が一層親油性であることを示す。Ｎ末端部
−３０〜−８は部分的に両親媒性α−ヘリックスに折り
たゝまれると思われる。
パク質が明白な構造遺伝子によりコードされることが明
らかである。二次構造（α、β、折返し）、屈曲性、ヒ
ドロパシー、親水性およびヘリックスホィールプロット
に対する予想プロフィルの組合せがハイコン（Ｈｙｃｏ
ｎ）プログラムを用いて作られた（図２）。高α−ヘリ
ックス確率はプレ−エピデルミン−３０〜−８に対し予
想され、一方プレ−エピデルミンに相当するＣ末端部１
〜２２は非常に高い折返し確率を示す。さらに予想プロ
ットは明らかにＮ末端−３０〜−１が非常に親水性であ
り、Ｃ末端部が一層親油性であることを示す。Ｎ末端部
−３０〜−８は部分的に両親媒性α−ヘリックスに折り
たゝまれると思われる。
【００２５】プレ−エピデルミン−３０〜−１のＮ末端
セグメントはシステイン残基を含まず、Ｃ末端セグメン
ト１〜２２はスルフィド架橋形成に含まれる４システイ
ン残基を含む。配列−３０〜−１はエンドプロテアーゼ
に対する多くの切断部位を含み、一方プレ−エピデルミ
ン状態においても配列１〜２２はタンパク質加水分解に
対して非常に耐性である。成熟抗生物質は単に位置１３
中のＬｙｓでトリプシンにより攻撃されることができ
る。プロセッシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ+1は折返し形
成Ｐｒｏ-2残基のために親水性であり、接近できる。抗
生物質例えばエピデルミンの生成中に生ずる種々の酵素
反応はプロ−ポリペプチド部１〜２２の修飾；Ｎ末端プ
レペプチドフラグメント−３０〜−１の切断および成熟
抗生物質の分泌を含む（図３および図４参照）。
セグメントはシステイン残基を含まず、Ｃ末端セグメン
ト１〜２２はスルフィド架橋形成に含まれる４システイ
ン残基を含む。配列−３０〜−１はエンドプロテアーゼ
に対する多くの切断部位を含み、一方プレ−エピデルミ
ン状態においても配列１〜２２はタンパク質加水分解に
対して非常に耐性である。成熟抗生物質は単に位置１３
中のＬｙｓでトリプシンにより攻撃されることができ
る。プロセッシング部位Ａｒｇ-1−Ｉｌｅ+1は折返し形
成Ｐｒｏ-2残基のために親水性であり、接近できる。抗
生物質例えばエピデルミンの生成中に生ずる種々の酵素
反応はプロ−ポリペプチド部１〜２２の修飾；Ｎ末端プ
レペプチドフラグメント−３０〜−１の切断および成熟
抗生物質の分泌を含む（図３および図４参照）。
【００２６】酵素修飾はプレペプチドフラグメントの切
断前に生ずる。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンお
よびデヒドロブチリン残基を形成する位置５、１６、１
９、および８、１４中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基からの
水の脱離を含む。位置２、１１、２１および２２中のＣ
ｙｓ残基のチオール基のＣ＝Ｃ二重結合に対する付加も
また生じ、メソ−ランチオニンまたは（２Ｓ、３Ｓ、６
Ｒ）−３−メチル−ランチオニン架橋を生ずる。さら
に、残基２２の脱炭酸および二重結合形成がＣ−末端Ｓ
−（２−アミノビニル）−Ｄ−システインを生ずる。Ｃ
末端に位置するシステインチオール基のＮ−末端に位置
するデヒドロアミノ酸との反応がエピデルミン、ナイシ
ンおよびスブチリン中に完全な立体特異性で生ずる。従
って、修飾の間にこれらの脱離−付加反応がプレ−エピ
デルミン残基Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−ＴｈｒにおけるＣα
炭素原子の配置のＤ配置Ｃα原子を与える反転を意味す
る。一方、システインの半分のＬ配置がなお維持され
る。
断前に生ずる。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンお
よびデヒドロブチリン残基を形成する位置５、１６、１
９、および８、１４中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基からの
水の脱離を含む。位置２、１１、２１および２２中のＣ
ｙｓ残基のチオール基のＣ＝Ｃ二重結合に対する付加も
また生じ、メソ−ランチオニンまたは（２Ｓ、３Ｓ、６
Ｒ）−３−メチル−ランチオニン架橋を生ずる。さら
に、残基２２の脱炭酸および二重結合形成がＣ−末端Ｓ
−（２−アミノビニル）−Ｄ−システインを生ずる。Ｃ
末端に位置するシステインチオール基のＮ−末端に位置
するデヒドロアミノ酸との反応がエピデルミン、ナイシ
ンおよびスブチリン中に完全な立体特異性で生ずる。従
って、修飾の間にこれらの脱離−付加反応がプレ−エピ
デルミン残基Ｌ−ＳｅｒおよびＬ−ＴｈｒにおけるＣα
炭素原子の配置のＤ配置Ｃα原子を与える反転を意味す
る。一方、システインの半分のＬ配置がなお維持され
る。
【００２７】次に同一触媒部位に４スルフィド環もまた
形成され、それはＮ末端両親媒性α−ヘリックスとの相
互作用により支持される。Ｔｈｒ+14 のみがシステイン
を見出すことなく脱水する。この位置（Ｌｙｓ+13 −Ｄ
ｈｂ+14 ）は、トリプシンが抗生物質エピデルミンを不
活性化する酵素切断部位を構成する。スルフィド環形成
の間にＣ末端の硬さおよび疎水性が増大し、プレ−エピ
デルミンと脂質二重層との相互反応を容易にすることが
でき、トランスロケーションを誘発することができる。
最後に、親水性α−ヘリカルＮ末端−３０〜−１が特異
プロテアーゼにより前記特有切断部位で切断される。
形成され、それはＮ末端両親媒性α−ヘリックスとの相
互作用により支持される。Ｔｈｒ+14 のみがシステイン
を見出すことなく脱水する。この位置（Ｌｙｓ+13 −Ｄ
ｈｂ+14 ）は、トリプシンが抗生物質エピデルミンを不
活性化する酵素切断部位を構成する。スルフィド環形成
の間にＣ末端の硬さおよび疎水性が増大し、プレ−エピ
デルミンと脂質二重層との相互反応を容易にすることが
でき、トランスロケーションを誘発することができる。
最後に、親水性α−ヘリカルＮ末端−３０〜−１が特異
プロテアーゼにより前記特有切断部位で切断される。
【００２８】前記技術を用いてランチバイオティックス
（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）をコードするプラスミド
を、それぞれのポリペプチドをコードする遺伝子の変異
によるかまたはそのような遺伝子を異なるポリペプチド
をコードする遺伝子により置換することにより修飾し、
原宿主または異なる宿主の形質転換に、そのような宿主
がまたその自生状態においてランチバイオティックスを
発現できれば、使用することができる。一般的に言え
ば、原機能性遺伝子がプレ−配列をコードする場合に、
例えばエピデルミンの場合に記載したように、そのよう
なプレ−配列をコードするＤＮＡ配列が修飾されたプラ
スミド中に保持されることができ；この場合に新または
変異プロ−ポリペプチドに対するＤＮＡ配列が原プロ−
ポリペプチド配列と同様にプレ−配列ＤＮＡのすぐ上流
に位置するであろう。
（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）をコードするプラスミド
を、それぞれのポリペプチドをコードする遺伝子の変異
によるかまたはそのような遺伝子を異なるポリペプチド
をコードする遺伝子により置換することにより修飾し、
原宿主または異なる宿主の形質転換に、そのような宿主
がまたその自生状態においてランチバイオティックスを
発現できれば、使用することができる。一般的に言え
ば、原機能性遺伝子がプレ−配列をコードする場合に、
例えばエピデルミンの場合に記載したように、そのよう
なプレ−配列をコードするＤＮＡ配列が修飾されたプラ
スミド中に保持されることができ；この場合に新または
変異プロ−ポリペプチドに対するＤＮＡ配列が原プロ−
ポリペプチド配列と同様にプレ−配列ＤＮＡのすぐ上流
に位置するであろう。
【００２９】細菌宿主の培養は、例えば１９８８年５月
１８日に提出された我々の同時係属英国特許出願第８８
１１７６0.１号および欧州特許出願公表第０ １８１
５７８号中に記載された普通に使用される培養条件下に
行なうことができる。所望タンパク質の精製および分離
もまた、吸着剤、イオン交換樹脂、および望むならばＨ
ＰＬＣの使用を含めて、前記特許出願中にエピデルミン
およびガリデルミンについて記載された技術またはその
改変を用いて行なうことができる。
１８日に提出された我々の同時係属英国特許出願第８８
１１７６0.１号および欧州特許出願公表第０ １８１
５７８号中に記載された普通に使用される培養条件下に
行なうことができる。所望タンパク質の精製および分離
もまた、吸着剤、イオン交換樹脂、および望むならばＨ
ＰＬＣの使用を含めて、前記特許出願中にエピデルミン
およびガリデルミンについて記載された技術またはその
改変を用いて行なうことができる。
【００３０】方法は実験目的に対する新規化合物の形成
に、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の
誘導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッ
カス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミ
ンを生成させるために用いることができ、またはガリデ
ルミン（前に参照した我々の同時係属英国特許出願参
照）をコードする遺伝子を、例えばプラスミドｐＥｐｉ
３２中のエピデルミンに対するプロ−ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピ
デルミスＤＳＭ３０９５を形質転換してこの宿主からガ
リデルミンを生成させるのに使用することができる。同
様に、デヒドロアミノ酸残基および（または）ランチオ
ニン架橋あるいは（または）メチルランチオニン架橋を
含む他の生物活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例
えばヒトインシュリン、オキシトシン、バソプレッシ
ン、ペプチド抗生物質、ホルモン抑制物質例えばエラス
ターゼ抑制物質および線維素溶解活性物質例えばヒト組
織プラスミノーゲン活性化物質を生成させることができ
る。そのような誘導体並びに親化合物の保持生物活性が
高い安定性および改良された半減期を有することができ
る。
に、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の
誘導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッ
カス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミ
ンを生成させるために用いることができ、またはガリデ
ルミン（前に参照した我々の同時係属英国特許出願参
照）をコードする遺伝子を、例えばプラスミドｐＥｐｉ
３２中のエピデルミンに対するプロ−ポリペプチドをコ
ードする遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピ
デルミスＤＳＭ３０９５を形質転換してこの宿主からガ
リデルミンを生成させるのに使用することができる。同
様に、デヒドロアミノ酸残基および（または）ランチオ
ニン架橋あるいは（または）メチルランチオニン架橋を
含む他の生物活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例
えばヒトインシュリン、オキシトシン、バソプレッシ
ン、ペプチド抗生物質、ホルモン抑制物質例えばエラス
ターゼ抑制物質および線維素溶解活性物質例えばヒト組
織プラスミノーゲン活性化物質を生成させることができ
る。そのような誘導体並びに親化合物の保持生物活性が
高い安定性および改良された半減期を有することができ
る。
【００３１】理想的には、所望プロ−ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡはシステインおよびセリンに対して、並
びに（または）システインおよびトレオニンに対してチ
オエーテル架橋を形成するコドンを含むべきである。比
較的短鎖のポリペプチドに対し、これらのそれぞれのコ
ドンは通常８個を越えず、好ましくは６個を越えないコ
ドン、離れているべきであるが、しかし最終ポリペプチ
ド分子の立体配座により一層大きい間隔が可能であるこ
とが計画される。デヒドロアミノ酸の形成に関して、こ
れらは通常セリンおよびトレオニンから誘導され、従っ
て所望プロ−ペプチドをコードするＤＮＡはそのような
アミノ酸に対するコドンを含む。
ードするＤＮＡはシステインおよびセリンに対して、並
びに（または）システインおよびトレオニンに対してチ
オエーテル架橋を形成するコドンを含むべきである。比
較的短鎖のポリペプチドに対し、これらのそれぞれのコ
ドンは通常８個を越えず、好ましくは６個を越えないコ
ドン、離れているべきであるが、しかし最終ポリペプチ
ド分子の立体配座により一層大きい間隔が可能であるこ
とが計画される。デヒドロアミノ酸の形成に関して、こ
れらは通常セリンおよびトレオニンから誘導され、従っ
て所望プロ−ペプチドをコードするＤＮＡはそのような
アミノ酸に対するコドンを含む。
【００３２】本発明により生成されるポリペプチド中に
存在できる異常なアミノ酸にはデヒドロアラニン、２，
３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、
（２Ｓ、３Ｓ、６Ｒ）−３−メチルランチオニン、Ｓ−
（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システイン、リシ
ノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギン酸があ
り、これらの残基の構造は図５中に示される。
存在できる異常なアミノ酸にはデヒドロアラニン、２，
３−デヒドロ−２−アミノ酪酸、メソ−ランチオニン、
（２Ｓ、３Ｓ、６Ｒ）−３−メチルランチオニン、Ｓ−
（２−（Ｚ）−アミノビニル）−Ｄ−システイン、リシ
ノアラニンおよびβ−ヒドロキシアスパラギン酸があ
り、これらの残基の構造は図５中に示される。
【実施例】実施例１ １．ガリデルミンの過剰生成 ガリデルミンのオープン読み枠を含むＤＮＡフラグメン
トをスタヒロコッカス・エピデルミディスＤＳＭ３０９
５、エピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド
例えばｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＴ１
８１またはｐＭＫ１４８ガリデルミンの使用によりクロ
ーニングすることができる。遺伝子量の増加は通常生成
物生成の増加と相関し；相関は必らずしも直線的ではな
い。ｐＣ１９４またはｐＴ１８１の高コピー数プラスミ
ド誘導体はまたクローニングビヒクルとして使用でき
る。
トをスタヒロコッカス・エピデルミディスＤＳＭ３０９
５、エピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド
例えばｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＴ１
８１またはｐＭＫ１４８ガリデルミンの使用によりクロ
ーニングすることができる。遺伝子量の増加は通常生成
物生成の増加と相関し；相関は必らずしも直線的ではな
い。ｐＣ１９４またはｐＴ１８１の高コピー数プラスミ
ド誘導体はまたクローニングビヒクルとして使用でき
る。
【００３３】２．リーダー配列の交換 アミノ酸−１〜−３０に相当するエピデルミンのリーダ
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
Ｓ．エピデルミディス中の他のペプチド例えばガリデル
ミンの分泌に使用できる。リーダー配列ＤＮＡはそれぞ
れのリンカーをその配列の初めおよび末端に挿入するこ
とにより移動可能にすることができる。従ってリーダー
配列ＤＮＡはプラスミドから多量に分離することがで
き、他のペプチドおよびタンパク質のそれぞれの位置に
挿入することができる。リーダー配列ＤＮＡはまた化学
合成により生成されることができる。
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
Ｓ．エピデルミディス中の他のペプチド例えばガリデル
ミンの分泌に使用できる。リーダー配列ＤＮＡはそれぞ
れのリンカーをその配列の初めおよび末端に挿入するこ
とにより移動可能にすることができる。従ってリーダー
配列ＤＮＡはプラスミドから多量に分離することがで
き、他のペプチドおよびタンパク質のそれぞれの位置に
挿入することができる。リーダー配列ＤＮＡはまた化学
合成により生成されることができる。
【００３４】実施例２ Ｓ．エピデルミスを宿主として用いたガリデルミンの製
造 （1) プラスミドの調製（図６参照） ａ） ミュンヘン工科大学の図書館で閲覧可能なローセ
ンスタイン（Ｄｒ．Ｒａｌｆ Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）
の学位論文「スタヒロコッカスによるプラスミドコード
化アルセニットおよびアルセナートレスティステントの
分子遺伝学的研究（Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｔｉｓ
ｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕ−ｎｇｅｎ ｚｕ
ｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉ
ｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂ
ｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｅｎ）」中に記載され
たようにＰｓｔ １消化ｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ
１消化ｐＵＣ１８をクレノウを用いて連結することによ
りプラスミドｐＣＵＩを調製した。得られたプラスミド
を次にＥｃｏＲ1 で消化した。
造 （1) プラスミドの調製（図６参照） ａ） ミュンヘン工科大学の図書館で閲覧可能なローセ
ンスタイン（Ｄｒ．Ｒａｌｆ Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）
の学位論文「スタヒロコッカスによるプラスミドコード
化アルセニットおよびアルセナートレスティステントの
分子遺伝学的研究（Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ ｇｅｎｔｉｓ
ｔｉｓｃｈｅ Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕ−ｎｇｅｎ ｚｕ
ｒ ｐｌａｓｍｉｄｋｏｄｉｅｒｔｅｎ Ａｒｓｅｎｉ
ｔ ｕｎｄ Ａｒｓｅｎａｔｒｅｓｔｉｓｔｅｎｔ ｂ
ｅｉ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｅｎ）」中に記載され
たようにＰｓｔ １消化ｐＣＬＰ１００およびＮｄｅ
１消化ｐＵＣ１８をクレノウを用いて連結することによ
りプラスミドｐＣＵＩを調製した。得られたプラスミド
を次にＥｃｏＲ1 で消化した。
【００３５】ｂ） 染色体ＤＮＡをＳ．ガリナラム（Ｄ
ＳＭ４６１６）から分離し、ＥｃｏＲＩで消化した。Ｈ
ｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ制限部位間の2.４kb長配列
中のガリデルミン構造遺伝子を含む4.７kbフラグメント
をプライマーとして配列 ５′ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３′ を用いて分離した。 ｃ） 次いで4.７kbフラグメントを段階ａ）からの消化
したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＥＩ部位中へ連結し、
ｐＣＵｇｄｍｌと称されるプラスミドが得られた。
ＳＭ４６１６）から分離し、ＥｃｏＲＩで消化した。Ｈ
ｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩ制限部位間の2.４kb長配列
中のガリデルミン構造遺伝子を含む4.７kbフラグメント
をプライマーとして配列 ５′ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＴＡＣ ３′ を用いて分離した。 ｃ） 次いで4.７kbフラグメントを段階ａ）からの消化
したｐＣＵＩプラスミドのＥｃｏＥＩ部位中へ連結し、
ｐＣＵｇｄｍｌと称されるプラスミドが得られた。
【００３６】（2) Ｓ．エピデルミス宿主の調製 この実施例において、エピデルミンを生成できるＳ．エ
ピデルミスＤＳＭ３０９５の変異株が分離された。変異
誘発は染色体にコードしたリファンピシン耐性を特徴と
する株（２０μｇ／ml）に行なった。寒天平板上で増殖
したＳ．エピデルミスＤＳＭ３０９５を用いて３０ml基
礎ブロス培地に接種し、それを一夜培養した。次いで一
夜培養物0.５mlを用いて生産培地５０mlに接種し、それ
を３７℃で３時間振とう培養した。細胞を培地から移
し、4.５ml前加温ＴＭ緩衝液（３０ｍＭトリスーマレア
ートｐＨ6.５）中に懸濁した（生じた溶液を溶液Ａと称
する）。溶液Ａを自然変異および細胞数について調べた
（1.２５×１０10細胞／ml）。
ピデルミスＤＳＭ３０９５の変異株が分離された。変異
誘発は染色体にコードしたリファンピシン耐性を特徴と
する株（２０μｇ／ml）に行なった。寒天平板上で増殖
したＳ．エピデルミスＤＳＭ３０９５を用いて３０ml基
礎ブロス培地に接種し、それを一夜培養した。次いで一
夜培養物0.５mlを用いて生産培地５０mlに接種し、それ
を３７℃で３時間振とう培養した。細胞を培地から移
し、4.５ml前加温ＴＭ緩衝液（３０ｍＭトリスーマレア
ートｐＨ6.５）中に懸濁した（生じた溶液を溶液Ａと称
する）。溶液Ａを自然変異および細胞数について調べた
（1.２５×１０10細胞／ml）。
【００３７】溶液Ａ４mlを１mlエチルメチルスルホナー
トとともに（最終濃度４７μｇ／ml）十分振とうし、次
いで振とう下に３７℃で１時間維持した。次いで細胞を
培養ブロスから抽出し、２回ＴＭ緩衝液で洗浄し、５ml
ＴＭ緩衝液中に再懸濁した（生じた溶液は溶液Ｂと称さ
れ、変異細胞を含有した）。溶液Ｂは２×１０8 細胞／
mlを含み、1.６％の生存率に相当する。溶液Ｂ５０μｌ
を５ml生産培地に加え、３７℃で一夜増殖させた（表現
型発現）。生じた溶液を溶液Ｃと称した。細胞数は7.３
×１０8 細胞／mlを示した。溶液をＢＭ寒天平板上で培
養し、個々のクローンを採集した。これを用いて試験平
板（ミクロコッカス・ルテウスを表面上に置いたＢＭ寒
天からなる）に接種した。Ｍ．ルテウスに関する阻止効
果を有しなかったコロニーをエピデルミン非生産体とし
て選んだ。
トとともに（最終濃度４７μｇ／ml）十分振とうし、次
いで振とう下に３７℃で１時間維持した。次いで細胞を
培養ブロスから抽出し、２回ＴＭ緩衝液で洗浄し、５ml
ＴＭ緩衝液中に再懸濁した（生じた溶液は溶液Ｂと称さ
れ、変異細胞を含有した）。溶液Ｂは２×１０8 細胞／
mlを含み、1.６％の生存率に相当する。溶液Ｂ５０μｌ
を５ml生産培地に加え、３７℃で一夜増殖させた（表現
型発現）。生じた溶液を溶液Ｃと称した。細胞数は7.３
×１０8 細胞／mlを示した。溶液をＢＭ寒天平板上で培
養し、個々のクローンを採集した。これを用いて試験平
板（ミクロコッカス・ルテウスを表面上に置いたＢＭ寒
天からなる）に接種した。Ｍ．ルテウスに関する阻止効
果を有しなかったコロニーをエピデルミン非生産体とし
て選んだ。
【００３８】ＢＭ寒天は毎リットル当り １０ｇ ペプトン NO.１４０ ５ｇ 酵母エキス １mg グルコース ５mg ＮａＣｌ １mg Ｋ2 ＨＰＯ4 ｐＨ 7.５ を含有する。約３％の変異率が認められた。見出された
４５非生産体を２０回サブクローンし、１６安定非生産
体が得られた。安定非生産体はすべて野生型プラスミド
ｐＥｐｉ３２を含むと認められた。制限パターンから、
これは野生型株中のプラスミドに等しいと同定される。
４５非生産体を２０回サブクローンし、１６安定非生産
体が得られた。安定非生産体はすべて野生型プラスミド
ｐＥｐｉ３２を含むと認められた。制限パターンから、
これは野生型株中のプラスミドに等しいと同定される。
【００３９】非生産性Ｓ．エピデルミスの形質転換 ＢＭ培地７５０mlを安定非生産性株の一夜培養により得
た培地５mlで接種し、接種した培地を２リットルフラス
コ中で３７℃で１２０rpm の振とう速度で振とう培養し
た。接種したＢＭ培地の初期光学濃度は0.０３〜0.０４
であった。光学濃度が0.４５〜0.５５に達したとき、細
胞をＧＳ−３−ローター中、８５００rpm で４℃で１５
分間の遠心分離により除去した。分離した細胞を次い
で、順次７５０、３５０、４０および１０mlの１０％グ
リセリン中で洗浄し、２〜３mlの１０％グリセリン中に
懸濁し、ＥＲＧ中に１１０μｌ部中で−７０℃で凍結し
た。細胞数は１５×１０10／mlになった。
た培地５mlで接種し、接種した培地を２リットルフラス
コ中で３７℃で１２０rpm の振とう速度で振とう培養し
た。接種したＢＭ培地の初期光学濃度は0.０３〜0.０４
であった。光学濃度が0.４５〜0.５５に達したとき、細
胞をＧＳ−３−ローター中、８５００rpm で４℃で１５
分間の遠心分離により除去した。分離した細胞を次い
で、順次７５０、３５０、４０および１０mlの１０％グ
リセリン中で洗浄し、２〜３mlの１０％グリセリン中に
懸濁し、ＥＲＧ中に１１０μｌ部中で−７０℃で凍結し
た。細胞数は１５×１０10／mlになった。
【００４０】凍結細胞を室温で５分間融解させ、次いで
細胞懸濁液５０μｌをＥＲＧ中でＴＥ緩衝液中の２μｌ
のプラスミドｐＣＵｇｄｍｌとともに室温で３０分間イ
ンキュベートした。次いで混合物を0.２cm電極間隙を有
する電気泳動セル中へ導入して直ちに電気泳動した。そ
の後細胞を速やかに９５０μｌＳＭＭＰ５０培地中に再
懸濁し、2.５mlＥＲＧ中へ移し、３７℃で９０分間振と
うした。ＥＲＧは培地の良好な通気を与えるために４５
°に傾斜させた。ＳＭＭＰ５０培地は１００ml当り、５
５ml２ＳＭＭ、４０ml４ＰＡＢおよび５モル５％ＢＳＡ
を含有する。２ＳＭＭは１モルサッカロース、0.０４モ
ルマレイン酸、0.０４モルＭｇＣｌ2 およびＮａＯＨｐ
Ｈ6.５までを含み、４ＰＡＢは７ｇ／１００mlギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）抗生物質培地３の溶液である。
細胞懸濁液５０μｌをＥＲＧ中でＴＥ緩衝液中の２μｌ
のプラスミドｐＣＵｇｄｍｌとともに室温で３０分間イ
ンキュベートした。次いで混合物を0.２cm電極間隙を有
する電気泳動セル中へ導入して直ちに電気泳動した。そ
の後細胞を速やかに９５０μｌＳＭＭＰ５０培地中に再
懸濁し、2.５mlＥＲＧ中へ移し、３７℃で９０分間振と
うした。ＥＲＧは培地の良好な通気を与えるために４５
°に傾斜させた。ＳＭＭＰ５０培地は１００ml当り、５
５ml２ＳＭＭ、４０ml４ＰＡＢおよび５モル５％ＢＳＡ
を含有する。２ＳＭＭは１モルサッカロース、0.０４モ
ルマレイン酸、0.０４モルＭｇＣｌ2 およびＮａＯＨｐ
Ｈ6.５までを含み、４ＰＡＢは７ｇ／１００mlギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）抗生物質培地３の溶液である。
【００４１】細胞懸濁液を希釈し、ガリデルミンを含む
ＢＭ寒天上に広げ、それを３７℃で２０分間インキュベ
ートした。ガリデルミンを生ずる増殖株の試験を、Ｍ．
ルテウス試験平板からのコロニーの選択により、それぞ
れの選択コロニーを培養し、ＨＰＬＣによりガリデルミ
ンの存在を測定することにより行なった。ガリデルミン
を生成できる３ｐＣＵｇｄｍ１形質転換変異体が突きと
められた。
ＢＭ寒天上に広げ、それを３７℃で２０分間インキュベ
ートした。ガリデルミンを生ずる増殖株の試験を、Ｍ．
ルテウス試験平板からのコロニーの選択により、それぞ
れの選択コロニーを培養し、ＨＰＬＣによりガリデルミ
ンの存在を測定することにより行なった。ガリデルミン
を生成できる３ｐＣＵｇｄｍ１形質転換変異体が突きと
められた。
【００４２】ｐＣＵｇｄｍ１形質転換Ｓ．エピデルミン
により生成されたガリデルミンの存在の決定 ａ）生物検定 ＦＰ寒天をＭ．ルテウスＡＴＣＣ９３４１で接種し、３
７℃で１８時間インキュベートした。生じた培養株の 1
／2 をループで移し、１００mlＦＰ培地中に懸濁し、３
６℃で８時間培養した。光学濃度が1.０に達したときに
培養を止めた。ＦＰ寒天をこの懸濁液0.５％で接種し、
各１０mlをペトリ皿に入れ、４℃で３週間貯蔵した。プ
レート拡散試験をツァーナーほか（Ｚａｈｎｅｒ ａｎ
ｄ Ｍａａｓ）、「抗生物質の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、スプリンガー・
フエルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅ
ｒｌｉｎ）１９７２中に記載のように行ない、形質転換
したＳ．エピデルミンの培養の培養濾液１０μｌを濾紙
上に捕捉し、乾燥した。濾紙を試験プレート上に置き、
次いでそれを３７℃で２４時間インキュベートした。
により生成されたガリデルミンの存在の決定 ａ）生物検定 ＦＰ寒天をＭ．ルテウスＡＴＣＣ９３４１で接種し、３
７℃で１８時間インキュベートした。生じた培養株の 1
／2 をループで移し、１００mlＦＰ培地中に懸濁し、３
６℃で８時間培養した。光学濃度が1.０に達したときに
培養を止めた。ＦＰ寒天をこの懸濁液0.５％で接種し、
各１０mlをペトリ皿に入れ、４℃で３週間貯蔵した。プ
レート拡散試験をツァーナーほか（Ｚａｈｎｅｒ ａｎ
ｄ Ｍａａｓ）、「抗生物質の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」、スプリンガー・
フエルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅ
ｒｌｉｎ）１９７２中に記載のように行ない、形質転換
したＳ．エピデルミンの培養の培養濾液１０μｌを濾紙
上に捕捉し、乾燥した。濾紙を試験プレート上に置き、
次いでそれを３７℃で２４時間インキュベートした。
【００４３】ｂ）ＨＰＬＣ 選んだ形質転換株を生産培地中で２６時間培養した。培
養ブロスを１０分間１3,０００rpm で遠心分離した。分
離培養液を次いでＳＰ8.７００液体クロマトグラフィー
装置〔スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｙｓｉｃｓ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）〕上で移
動相として、Ａ）0.５％７０％過塩素酸を有するＨ2 Ｏ
およびＢ）アセトニトリルを用いてＨＰＬＣにかけた。
カラム充填物は粒径７μｍのヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｌ）−１００Ｃ１８であり、カラムサイズは１２
５mm×4.６mmＩ．Ｄ．およびプレカラムに対する２０mm
×4.６mmＩ．Ｄ．であった。
養ブロスを１０分間１3,０００rpm で遠心分離した。分
離培養液を次いでＳＰ8.７００液体クロマトグラフィー
装置〔スペクトラ・フィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐ
ｈｙｓｉｃｓ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ＦＲＧ）〕上で移
動相として、Ａ）0.５％７０％過塩素酸を有するＨ2 Ｏ
およびＢ）アセトニトリルを用いてＨＰＬＣにかけた。
カラム充填物は粒径７μｍのヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｌ）−１００Ｃ１８であり、カラムサイズは１２
５mm×4.６mmＩ．Ｄ．およびプレカラムに対する２０mm
×4.６mmＩ．Ｄ．であった。
【００４４】勾配は次のとおりであった： 時間（分） Ａ〔％〕 Ｂ〔％〕 ０ ７7.５ ２2.５ ８ ６3.０ ３7.０ 8.５ ０ １００ 9.５ ０ １００ １０ ７7.５ ２2.５ １４ ７7.５ ２2.５
【００４５】生じたクロマトグラムは図７Ａ中に示され
る。標準曲線は図７Ｂ中に示され、ガリデルミンが7.５
４分で溶出することを示す。次のものが培地として使用
された。 １．ＦＰ寒天 肉エキス ４ｇ ペプトン １０ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５ｇ グルコース １０ｇ 複合寒天 １５ｇ 水 １リットル ｐＨ 7.２
る。標準曲線は図７Ｂ中に示され、ガリデルミンが7.５
４分で溶出することを示す。次のものが培地として使用
された。 １．ＦＰ寒天 肉エキス ４ｇ ペプトン １０ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５ｇ グルコース １０ｇ 複合寒天 １５ｇ 水 １リットル ｐＨ 7.２
【００４６】２．ＦＰ培地 肉エキス ４ｇ ペプトン １０ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ５ｇ グルコース １０ｇ 水 １リットル ｐＨ 7.２ ３．生産培地 肉エキス ３３ｇ 麦芽エキス ３０ｇ ＮａＣｌ ４０ｇ 水酸化カルシウム 3.８ｇ 水 １リットル ｐＨ 6.５
【図１】図１はプレ−エピデルミンのアミノ酸配列を示
す図である。
す図である。
【図２】図２は二次構造、屈曲性、ヒドロパシー、親水
性およびヘリックスホィールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図である。
性およびヘリックスホィールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図である。
【図３】図３抗生物質の生成中に生ずる酵素反応を示す
図である。
図である。
【図４】図４は抗生物質の生成中に生ずる酵素反応を示
す図である。
す図である。
【図５】図５はタンパク質プロ抗生物質から誘導された
ランチオニンペプチド抗生物質（ランチバイオティック
ス）中に認められる異常アミノ酸を示す図である。
ランチオニンペプチド抗生物質（ランチバイオティック
ス）中に認められる異常アミノ酸を示す図である。
【図６】図６はプラスミドｐＣＵｄｇｍ１の調製を示す
図である。
図である。
【図７】図７はｐＣＵｇｄｍ１形質転換Ｓ．エピデルミ
ン分泌物のＨＰＬＣクロマトグラム（図７Ａ）および標
準曲線（図７Ｂ）を示す図である。
ン分泌物のＨＰＬＣクロマトグラム（図７Ａ）および標
準曲線（図７Ｂ）を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 ローラント ケルナー ドイツ連邦共和国 デー6148 ヘッペン ハイム ドクトル ハー ヴィンター シュトラーセ 17 (72)発明者 カルル ディーテル エンティアン ドイツ連邦共和国 デー7406 メッシン ゲン アホールンヴェーク 12 (72)発明者 ノルベルト シュネル ドイツ連邦共和国 デー8630 コーブル ク ザイトマンスドルフェル シュトラ ーセ 148 (72)発明者 コルティナ カレッタ ドイツ連邦共和国 デー7403 エントリ ンゲン グレッチェンシュトラーセ ９ (72)発明者 フリートリッヒ ゲーツ ドイツ連邦共和国 デー7400 テュービ ンゲン バイム ヘルプシュテンホフ 31 (72)発明者 ロルフ ゲー ヴェルナー ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッ ハ フーゴ ヘリンク シュトラーセ 72 (72)発明者 ヘルマン アルガイエル ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッ ハ ケーレスライン 105 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．160，Ｎｏ．１，ｐ．９−22，1986 年 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/31 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 以下のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を含有するプラスミド。 【化１】
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