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Die
Erfindung liegt auf dem Gebiet der Bestimmung oder Quantifizierung
der Aktivität
eines proteolytischen Enzyms in einer Probe, und sie betrifft Substrate,
die dafür
verwendet werden sollen, sowie ein Assay-Verfahren und ein Assay-Kit
und eine Vorrichtung dafür.
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Proteolytische
Enzyme oder Proteasen katalysieren die Hydrolyse von Peptid-Bindungen
in Proteinen oder Peptiden. Diese Enzyme treten in der Natur vom
Virus bis hin zum Menschen auf, und sie haben zahlreiche unterschiedliche
Funktionen. Sie sind an Verdauungsvorgängen beteiligt, sowohl auf
der Ebene des Organismus (Enzyme des Verdauungstraktes, z.B. Trypsin,
Chymotrypsin und Pepsin) als auch auf der Ebene einzelner Zellen
(lysosomale Enzyme, z.B. Cathepsine).
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Sie
spielen eine Rolle bei der Migration und Invasion sowohl von Mikroorganismen
als auch von Zellen in multizellulären Organismen. In letzteren
sind sie am Wachstum und Entwicklung beteiligt (z.B. Plasmin, Plasminogenaktivatoren
und Matrix-Metalloproteasen).
Neben diesen ersichtlichen Verdauungsvorgängen spielen proteolytische
Enzyme in zahlreichen regulatorischen Netzwerken eine entscheidende
Rolle, wie beispielsweise bei der Blutgerinnung, bei der Fibrinolyse,
bei der Blutdruckregulation sowie bei der Prozessierung von Pro-Hormon
und Wachstumsfaktor. Kürzlich
ist entdeckt worden, dass Proteasen eine wichtige Rolle bei der
zellulären
Signalübertragung
und beim programmierten Zelltod (Apoptose) spielen. Neben diesen
(patho-)physiologischen Funktionen werden proteolytische Enzyme
in zunehmendem Maße
in der Biotechnologie verwendet, beispielsweise in Bereichen, die
von der pharmazeutischen Synthese bis hin zur Herstellung von Lebensmitteln
(z.B. Käse)
reichen, und in sehr starkem Maße
in Tensiden für
die allgemeine und die spezielle Verwendung. Die Proteasen selbst
können
als Pharmazeutika verwendet werden (z.B. Plasminogenaktivatoren
als thrombolytische Mittel), oder sie können das Zielmolekül für Wirkstoffe
sein (z.B. HIV-Protease und Angiotensinumwandelndes Enzym).
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Alle
proteolytischen Enzyme katalysieren dieselbe Basisreaktion:
d.h. eine Peptidbindung wird
unter milden Bedingungen hydrolysiert, üblicherweise bei einem pH-Wert
von zwischen 5-8 und bei einer Temperatur von zwischen 25-40°C. Ohne Enzym
sind wesentlich härtere
Bedingungen erforderlich, wie beispielsweise ein Kochen in 6 M Salzsäure. Der
Unterschied zwischen enzymatischer und nicht-enzymatischer Hydrolyse
von Peptidbindungen ist nicht nur eine Frage der Bedingungen; enzymatische Vorgänge können sehr
viel schneller sein, und sie sind im Allgemeinen sehr viel selektiver
als eine nicht-enzymatische Hydrolyse.
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Es
sind Beispiele bekannt, in denen lediglich ein spezifisches Protein
innerhalb einer Mischung hydrolysiert wird, und manchmal wird lediglich
eine spezifische Peptidbindung innerhalb eines solchen Proteins
angegriffen. Der allgemeine Mechanismus hinter dieser enormen Verbesserung
von Wirksamkeit und Selektivität besteht
darin, dass ein Enzym ein aktives Zentrum enthält, das üblicherweise 2 bis 3 Aminosäurereste
betrifft, welche unmittelbar an dem katalytischen Schritt beteiligt
sind, sowie zusätzlich
oftmals mehrere erweiterte Substraterkennungsstellen, die zur Erkennung
des Substrats oder der Peptidbindung beitragen und auf diese Weise
dem Enzym Spezifität
verleihen.
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Die
bekannten proteolytischen Enzyme können nahezu alle basierend
auf ihrem katalytischen Mechanismus und den an der Kata lyse beteiligten
Aminosäureresten
(Tabelle I) in vier verschiedene Klassen eingeteilt werden.
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Innerhalb
jeder Klasse treten Enzyme auf, die unterschiedliche Substratspezifitäten und
Eigenschaften aufweisen. Zahlreiche proteolytische Enzyme werden
in Form eines inaktiven Proenzyms oder eines Zymogens synthetisiert.
Die Aktivierung (die Umwandlung der inaktiven Proenzym-Form in das
aktive proteolytische Enzym) ist in den meisten Fällen selbst
ein proteolytischer Vorgang. Daher kann eine positive oder negative
Rückkopplungsregultion
auftreten, die für
proteolytische Kaskaden wichtig ist, wie beispielsweise für solche,
die bei der Blutgerinnung und der Apoptose vorkommen.
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Aufgrund
ihrer Beteiligung an vielen (patho-)physiologischen Vorgängen spielen
proteolytische Enzyme eine Rolle bei zahlreichen Erkrankungen, und
die Messung der Aktivität
von bestimmten proteolytischen Enzymen kann für die Diagnose, Prognose oder
bei der Verfolgung einer Therapie von Bedeutung sein (siehe Tabelle
II). Die Verwendung von Verbindungen, die mit einer Proteaseaktivität interferieren,
als Wirkstoffe bei einer Vielzahl von Erkrankungen nimmt zu (z.B.
Antikoagulantien, HIV-Wirkstoffe).
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Aktivitätsmessungen
von klinisch bedeutenden proteolytischen Enzymen befinden sich in
allgemeiner Anwendung. In der klinischen Praxis werden insbesondere
täglich
Assays für
mehrere Schlüsselenzyme
verwendet, die an der Gerinnungskaskase und an der Fibrinolyse-Kaskade
beteiligt sind.
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Die
Messung der Aktivität
einer Protease unter Verwendung ihres natürlichen Substrats ist nicht
immer möglich
oder führt
zu aufwendigen, komplizierten oder unspezifischen Assays, die für die Routineanwendung nicht
geeignet sind. Die Entwicklung der Peptidsynthese hat zur Verwendung
von synthetischen Pepti den (Derivaten) als Substrate für proteolytische
Enzyme geführt.
Insbesondere für
zahlreiche Serin-Proteasen sind chromogene oder fluorogene Peptidsubstrate
entwickelt worden. Diese Substrate sind oftmals kommerziell erhältlich und
bilden die Basis für
vollständige
Assaykits. Die Entwicklung solcher Substrate für Serin-Proteasen ist verhältnismäßig einfach,
da diese Enzyme die Sequenz, welche sich C-terminal von der zu hydrolysierenden
Bindung befindet, nicht erkennen. Dieser C-terminale Teil kann durch
eine chromogene oder fluorogene Abspaltungsgruppe, wie beispielsweise
p-Nitroanilin (pNA), β-Naphtylamin
(β-NA),
Aminomethylcumarin (AMC) oder 7-Amino-4-trifluormethylcumarin (AFC), ersetzt
werden. Zahlreiche kommerziell erhältliche Substrate und Assay-Kits
basieren auf diesem Prinzip, und Assays, die solche Verfahren betreffen,
können
problemlos automatisiert werden.
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In
zahlreichen Fällen
ist die Spezifität
und Sensitivität,
die mit diesen Peptidsubstraten erhalten wird, ausreichend, um den
Nachweis und die Quantifizierung von physiologisch relevanten Konzentrationen
von proteolytischen Enzymen in biologischen Flüssigkeiten oder Gewebeextrakten
zu ermöglichen.
Manchmal kann die Sensitivität
weiter gesteigert werden, indem zwei gekoppelte Reaktionen verwendet
werden, wie es für
die Plasminogen-Aktivatoren beschrieben worden ist (Drapier et al.
(1979) Biochimie 61, 463-471). Ähnliche
Verfahren können
auch für
die Messung der Aktivität
von Cystein-Proteasen verwendet werden. In den vergangenen Jahren
sind zahlreiche Peptidsubstrate für die Kaspase-Familie der Cystein-Proteasen,
die an der Apoptose beteiligt ist, entwickelt worden.
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Die
Messung der Aktivität
von Metalloproteasen und Asparagin-Proteasen ist schwieriger. Diese Enzyme
erkennen im Gegensatz zu Serin-Proteasen und Cystein-Proteasen die
Aminosäuresequenz
auf beiden Seiten der Bindung, die gespalten werden soll (P3-P2-P1
^ P1'-P2'-P3') (1).
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Demgemäß können Substrate,
in denen eine Nicht-Peptidbindung gespalten wird, wie beispielsweise die
für die
Bestimmung von Serin-Proteasen oder Cystein-Proteasen verwendeten
chromogenen oder fluorogenen Substrate, nicht für die Bestimmung von Metalloproteasen
oder Aspartyl-Proteasen verwendet werden.
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Drei
verschiedene Arten von synthetischen Peptidsubstraten zur Verwendung
für die
Messung dieser Enzyme existieren gegenwärtig: (1) Peptide, die lediglich
die notwendige Erkennungssequenz für die Protease enthalten. In
diesem Fall schließen
sich der Hydrolyse physikochemische Verfahren wie HPLC oder Massenspektrometrie
an; (2) Peptide, die an der Hydrolysestelle ein Peptidbindungsäquivalent
enthalten, welches Schwefel enthält.
Die anschließende
Freisetzung einer Thiolatgruppe wird durch ein Farbreagenz verfolgt;
(3) Peptide, die neben der Erkennungssequenz auch eine potentiell
fluoreszente Gruppe zusammen mit einer Quenching-Gruppe enthalten.
Wenn beide Gruppen in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander sind,
wird die Fluoreszenz abgeschwächt
(Quenching). Nach der Hydrolyse der spaltbaren Peptidbindung werden
die fluoreszente Gruppe und der Quencher getrennt, und es wird eine
Fluoreszenz beobachtet. Assays, die auf Prinzip (1) basieren sind
im Allgemeinen aufwendig, sind schwierig einzustellen, erfordern
ein spezielles Wissen und spezielle Ausrüstung, sind schwierig zu automatisieren
und können
nicht problemlos in kinetischer Weise durchgeführt werden. Assays, die auf
den Prinzipien (2) und (3) basieren, werden verwendet, weisen jedoch eine
begrenzte Sensitivität
und Spezifizität
auf.
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Vor
einigen Jahren wurde ein neues Prinzip zum Nachweis der Proteaseaktivität entwickelt
(siehe
EP 691 409 ). Bei
diesem Prinzip wird ein Proenzym verwendet, das in einer solchen
Weise modifiziert ist, dass seine normale Aktivierungserkennungsequenz
ersetzt oder derart angepasst ist, dass sie von einer ausgewählten Protease
gespalten werden kann. Die Spaltung dieser Sequenz führt zu einem
aktiven Enzym, das unter Verwendung herkömmlicher Substrate nachgewiesen
werden kann (
2). Sehr geeignete Proenzyme bei
diesem Prinzip sind Proenzyme der Serin-Proteasefamilie und insbesondere
Pro-Urokinase. Basierend auf Pro-Urokinase als Proenzym sind Assays
für zahlreiche
Matrix-Metalloproteasen (MMPs), Granzym B, verschiedene Cathepsine
usw., entwickelt worden. Aufgrund der Beteiligung einer zweistufigen
Reaktion sind sehr sensitive Assays entwickelt worden, die im Bereich
von ng/ml oder sogar pg/ml messen. Die erste Gruppe von Substraten,
die auf Pro-Urokinase basieren, wurde durch Ersetzen der üblichen
4 Aminosäurereste
N-terminal von der Aktivierungsstelle durch eine Erkennungssequenz
aus 4 Resten erhalten, die von der Zielprotease erkennbar und spaltbar
ist. Dieser Ansatz war bei zahlreichen Proteasen, wie beispielsweise
MMPs, Granzym B und Cathepsinen erfolgreich.
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Bei
einigen Enzyme, wie beispielsweise bei dem TNFα-umwandelnden Enzym TACE (ADAM-17) und Aggrecanase
(ADAM TS4) führte
dieser Ansatz (3a, 4a) zu
sehr unwirksamen Substraten. Sehr viel bessere Substrate konnten
durch Einbringen einer längeren
Erkennungssequenz erhalten werden. Das Einbringen einer vollständigen Domäne aus dem
natürlichen
Domänensubstrat
N-terminal von der Pro-Urokinaseaktivierungsstelle (3b, 4b)
führte
zu sehr viel besseren Pro-Urokinasesubstraten. Dieser Ansatz führte zu
verhältnismäßig wirksamen
Substraten für
die Aggrecanase (ADAM TS4) und für
das TNFα-umwandelnde
Enzym TACE (ADAM-17) (3c, 4c).
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Die
Verwendung von Serin-Proteasen als Nachweisenzym weist bestimmte
Vorteile auf, wie beispielsweise den leichten Nachweis des aktivierten
Enzyms, die Stabilität
des Proenzyms und die Verfügbarkeit
von zahlreichen möglichen
Kandidaten-Enzymen, was eine Optimierung für bestimmte Zwecke ermöglicht.
Eine wesentliche Beschränkung
wurde entdeckt; die Aminosäuresequenz
im C-terminalen Teil der Spaltungsstelle kann nicht frei gewählt werden,
sondern weist Einschränkungen
auf, die auf strukturellen und mechanistischen Beschränkungen
basieren, welche eng mit den Serin-Proteasen verbunden sind. Aufgrund
dieser Einschränkungen
hat sich die Entwicklung von wirksamen Substraten für mehrere
Proteasen von Interesse als schwer durchführbar erwiesen. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung beschreiben wir eine wesentliche Verbesserung
bezüglich
der Technologie mit modifizierten Proenzymen, die nicht durch die
für Serin-Proteasen üblichen Beschränkungen
eingeschränkt
ist, und die im Prinzip eine Entwicklung von Substraten für eine beliebige
Zielprotease ermöglicht.
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Die
Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung einer
Protease oder ihres Vorläufers nach
der Aktivierung bereit, bei dem man eine Probe mit einem Ziel dieser
Protease inkubiert, die proteolytische Spaltung des Ziels bestimmt
und die daraus erhaltenen Daten korreliert, um die Protease zu bestimmen, wobei
das Ziel eine modifizierte Pro-Kaspase ist, die eine Aktivierungsstelle
umfasst, welche von der Protease spaltbar ist. Die proteolytische
Spaltung der modifizierten Pro-Kaspase aktiviert die Pro-Kaspase
und die resultierende Aktivität
wird unter Verwendung eines geeigneten Substrats der aktivierte
Pro-Kaspase bestimmt.
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Die
Probe kann ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus einer biologischen Flüssigkeit,
einer Fraktion derselben, einem biologischen Gewebe, einem Extrakt
desselben, einer Fraktion eines solchen Extrakts, einem Kulturmedium,
das durch in vitro wachsende Zellen, Gewebe oder Organismen konditioniert
ist, einem Extrakt eines solchen Kulturmediums und einer Fraktion
eines solchen Kulturmediums. Die Organismen und/oder Zellen können von
beliebigem Ursprung sein, wie z.B. Viren, Bakterien, Pilze (einschließlich Hefe) und
Tiere. Die Erfindung ist gut bei Proben einsetzbar, die von Säugetieren
stammen, insbesonde re von Menschen, z.B. von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten.
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Die
zu untersuchende Protease kann eine beliebige Protease sein, wobei
die Protease jedoch vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Aspartyl-Proteasen und Metalloproteasen;
noch stärker
bevorzugt ist es, dass die Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Aggrecanase (ADAM TS4), ADAM TS1, TACE (ADAM-17), BACE 1, BACE
2, HIV-Protease und Hepatitis C-Protease. Eine nicht erschöpfende Zusammenfassung
von Proteasen, die möglicherweise
für eine
Messung von Interesse sein könnten,
kann in Tabelle II gefunden werden.
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Die
modifizierte Pro-Kaspase kann von einer Pro-Kaspase abgeleitet werden,
indem ihre Aktivitätsstelle
durch eine Aktivitätsstelle
ersetzt wird, die von der zu bestimmenden Protease spaltbar ist,
wie beispielsweise durch Entfernen der Aktivitätsstelle und Einbringen (nicht
notwendigerweise in derselben Position) einer Aktivierungsstelle,
die von der zu bestimmenden Protease spaltbar ist. Alternativ dazu
wird die modifizierte Pro-Kaspase von Pro-Kaspase abgeleitet, indem
ihre Aktivierungsstelle verändert
wird, so dass diese in Bezug auf ihr natürliches Substrat inaktiv ist,
und eine Aktivierungsstelle (nicht notwendigerweise an derselben
Position) eingebracht wird, die von der zu bestimmenden Protease
spaltbar ist. Die modifizierte Pro-Kaspase ist vorzugsweise ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Pro-Kaspase-1, Pro-Kaspase-3, Pro-Kaspase-7, Pro-Kaspase-8,
Pro-Kaspase-9 und Pro-Kaspase-10.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung, die besonders nützlich
ist, ist ein Verfahren, bei dem die modifizierte Pro-Kaspase Pro-Kaspase-3
oder Pro-Kaspase-7 ist, und bei dem die Modifikation der Pro-Kaspase-3 oder
der Pro-Kaspase-7 ein Ersetzen von D175 in der Wildtyp-Pro-Kaspase-3
oder von D198 in der Wildtyp-Pro-Kaspase-7 durch eine Sequenz ist,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe von Sequenzen, die ähnlich sind zur Aggrecanase-Erkennungssequenz
von Aggrecan (GSDMELPLPRNITEGE^ARGSVILTVKPIFEEF), zur TACE-Erkennungssequenz
von TNFα (GSPLAQA^VRSSSRSG)
oder zur BACE-Erkennungssequenz des β-Amyloid-Vorläuferproteins (GSKTEEISEVNL^DAEFRHDS),
wobei das Symbol ^ die Spaltungsstelle in dem physiologischen Ziel
bezeichnet.
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Das
Kaspase-Substrat ist eine Verbindung, die eine Aminosäuresequenz
umfasst, welche von Kaspase spaltbar ist und darüber hinaus einen Teil aufweist,
der nach der Spaltung leicht nachzuweisen ist. Beispiele für solche
Substrate sind in Tabelle IV zusammengefasst, und Sequenzen von
einigen bekannten Kaspase-Substraten werden in Tabelle V aufgeführt. Vorzugsweise
wird eine Verbindung verwendet, die die Aminosäuresequenz AspGluValAsp-pNA
umfasst, wobei pNA p-Nitroanilid ist.
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Die
Erfindung stellt ferner die modifizierte Pro-Kaspase als solche
bereit, insbesondere eine modifizierte Pro-Kaspase, die von einer
Pro-Kaspase abgeleitet wird, indem ihre natürliche Aktivierungsstelle ersetzt wird,
oder, indem eine Aminosäuresequenz
in der Region ihrer natürlichen
Aktivierungsstelle durch eine modifizierte Aktivierungsstelle ersetzt
wird, welche durch eine Protease spaltbar ist, die sich von derjenigen
unterscheidet, welche die unmodifizierte Pro-Kaspase aktiviert oder,
alternativ dazu, durch Einbringen einer modifizierten Aktivierungsstelle
in die natürliche
Sequenz der Pro-Kaspase.
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Vorzugsweise
ist die modifizierte Pro-Kaspase von Pro-Kaspase-3 oder Pro-Kaspase-7 abgeleitet.
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Die
Erfindung stellt ferner ein Kit zur Bestimmung einer Protease oder
ihres Vorläufers
nach der Aktivierung in einer Probe bereit, dass eine modifizierte
wie vorliegend definierte Pro-Kaspase zusammen mit den normalen
Bestandteilen eines solchen Kits umfasst, wie beispielsweise Substrate
für aktivierte
Pro-Kaspase, Pufferlösungen,
Standardpräparationen,
Tenside, spezifischen Antikörper,
Mikrotiterplatten und Instruktionen zur Verwendung. In einer weiteren
Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung einer Protease
oder ihres Vorläufers
nach der Aktivierung in einer Probe bereit, die eine wie vorliegend
definierte Pro-Kaspase umfasst.
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BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1:
Schematische Darstellung des Konzepts der Substraterkennung durch
Proteasen im Allgemeinen; das für
die Umwandlung des Substrats verantwortliche proteolytische Enzym
umfasst die Aminosäurereste
s3, s2, s1, S1',
s2' und s3', die im gezeigten
Beispiel an der Erkennung der Aminosäurereste P3, P, P1, P1', P2' und P3' beteiligt sind,
welche die Erkennungsstelle für
die Spaltung des Substrats bilden; die Proteasewirkung führt zur
Spaltung der Peptidbindung zwischen den Resten P1 und P1'.
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2:
Schematische Darstellung des Prinzips des Protease-Assays. Die zu bestimmende
Protease wandelt ein Proenzym in ein aktives Enzym um. Das aktive
Enzym wird anschließend
durch Umwandlung eines Substrats zu einem nachweisbaren Produkt
gemessen. Die Reaktion der Proenzym-Umwandlung und die Reaktion
der Substratumwandlung (Detektion) können gleichzeitig in einem
Inkubationsschritt durchgeführt werden,
oder sie können
in zwei aufeinanderfolgenden Inkubationen durchgeführt werden.
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3A:
Struktur eines modifizierten Pro-Urokinasse-Zielsubstrats mit kurzer
Erkennungs- und Aktivierungsstelle für das TNFα-umwandelnde Enzym (TACE).
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3B Konstruktion
und Struktur einer modifizierten Pro-Urokinase mit erweiterter Erkennungs-
und Spaltungsstelle für
das TNFα-umwandelnde Enzym
(TACE), die auf einer vollständigen
Domäne
von TNFα basiert.
Die Reste 5-158 der Pro-Urokinase wurden durch die Reste 57-76 von
Prä-Pro-TNFα ersetzt.
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3C Demonstration
des TACE-Nachweises unter Verwendung der modifizierten Pro-Urokinase
mit erweiterter TACE-Erkennungsstelle. Kulturmedium (100 μl), das etwa
0,6 μg/ml
Pro-Urokinase enthielt,
die wie in 3B beschrieben modifiziert worden
war, wurde für
2 bis 24 Stunden bei 4 bis 37°C
auf einer Mikrotiterplatte inkubiert, welche mit anti-Urokinase-Antikörper beschichtet
war. Anschließend
wurde die Platte gewaschen, und es wurden 0,8 mM Urokinase-Substrat
pyroGlu-Gly-Arg-pNA in 100 ml 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1,5 mM NaCl,
0,5 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2 und
wie oben beschrieben gereinigtes TACE zugegeben. Die Absorption wurde
bei 405 nm nach verschiedenen Inkubationszeiten bei 37°C gemessen.
Die Aktivität
wurde ausgedrückt als
1000·ΔA405 geteilt durch das Quadrat der Inkubationszeit
in Stunden.
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4A:
Struktur einer modifizierten Pro-Urokinase mit kurzer Erkennungsstelle
für Aggrecanase (ADAM
TS4).
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4B Konstruktion
und Struktur einer modifizierten Pro-Urokinase mit einer erweiterten
Aggrecanase (ADAM TS4)-Erkennungsstelle und -Spaltungsstelle, die
auf einer vollständigen
IgD-Domäne
von Aggrecan basiert. Die Reste 1-158 der Pro-Urokinase wurden durch
die Reste 350-392 von Aggrecan ersetzt.
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4C Nachweis
von Aggrecanase unter Verwendung der modifizierten Pro-Urokinase
mit erweiterter Aggrecanase-Erkennungsstelle. Reaktionsbedingungen
wie in 3C beschrieben, wobei entweder
etwa 3 μg/ml
(durchgezogene Linie, schwarze Balken) oder 30 μg/ml (gestrichelte Linie, offene
Balken) der modifizierten Pro-Urokinase verwendet wurden. Die Aggrecanase-Aktivität konnte
durch das chelatierende Mittel EDTA und den spezifischen Metalloprotease-Inhibitor
Batimastat (BB94) (Brown P.D., 1994, Clinical trials of a low molecular
weight matrix metalloproteinase inhibitor in cancer, Ann N Y Acad
Sci. 6; 732: 217-21) inhibiert werden.
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5:
Schematischer Überblick über die
Struktur von Pro-Kaspasen.
Pro-Kaspasen sind einzelkettige Polypeptide, die aus einer Pro-Domäne, einer
großen
Untereinheit, einer Verbindungseinheit (linker) und einer kleinen
Untereinheit bestehen. Der entscheidende Schritt, der zur Aktivierung
führt,
ist eine Dimerisierung, die durch Spaltung in der Region der Verbindungseinheit
ausgelöst
werden kann. Die Spaltung der Pro-Domäne scheint
weniger bedeutsam zu sein. Die Bereiche der Verbindungseinheit variieren
hinsichtlich ihrer Größe zwischen
den verschiedenen Pro-Kaspasen, und sie können bis zu einem Rest kurz
sein. Die Spaltungsstellen, die zur Aktivierung führen, sind
selbst durch Kaspasen spaltbar. Dies führt zu einer Kaskade von Aktivierungsreaktionen.
Regelmäßig tritt
eine Autoaktivierung auf. Die Figur stammt aus Cohen, G. M., Biochem
J. (1997) 326, 1-16.
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6:
Aktivität
von Präparationen
mit mutierter Urokinase mit einer Vielzahl von Sequenzen C-terminal
von der Aktivierungssequenz.
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7A:
Konstruktion eines Kassetten-Expressionsvektors für die einfache
Konstruktion und Expression von modifizierten Pro-Kaspase-3-Molekülen.
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7B Konstruktion
eines Expressionsvektors für
modifizierte Pro-Kaspase-3
mit einer Erkennungs-/Spaltungsstelle für TACE unter Verwendung des
Kassettenvektors von 7A und einer Gruppe von spezifischen
Oligonukleotid-Verbindungseinheiten.
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8:
Aufreinigung von bakteriell exprimierter modifizierter Pro-Kaspase-3
auf einer Nickel-Chelat-Säule.
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9:
SDS-PAGE von bakteriellen Extrakten und gereinigten Fraktionen von
modifizierten Versionen der Pro-Kaspase-3 und der Pro-Kaspase-7.
Bahn 1 und Bahn 10 enthalten einen Molekulargewichtsmarker (Rainbow
marker, Amersham Biosciences), Bahnen 2-8 sind Extrakte aus Bakterien,
die mit einem Expressionsplasmid transformiert worden waren, das
für modifizierte
Pro-Kaspase-7 mit einer Aktivierungssequenz, die durch TACE erkennbar
ist, kodierte, wobei diese vorliegend als Qz7.2TACE bezeichnet wird
(siehe Beispiel 3), geerntet bei 90 Minuten (Bahnen 2, 3), 180 Minuten
(Bahnen 4, 5) und 270 Minuten (Bahnen 6, 7), ohne (Bahnen 2, 4,
6) oder mit (Bahnen 3, 5, 7) IPTG. Bahn 9 ist Kontrollextrakt von
Stamm Qz3, der unmodifizierte Wildtyp-Pro-Kaspase-3 exprimiert,
bei 45 Minuten +IPTG, nach Reinigung auf einer Nickel-Chelat-Säule.
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10: Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit
des Aggrecanase-Assays
unter Verwendung von modifizierter Pro-Kaspase-3 mit einer Aggrecanase-Erkennungssequenz
als Ziel.
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11: Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit
des TACE-Aktivitätsassays
unter Verwendung von modifizierter Pro-Kaspase-3 mit einer TACE-Erkennungssequenz
als Ziel.
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12: Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit
des BACE-Assays unter Verwendung von modifizierter Pro-Kaspase-3
als Ziel.
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13: Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit
des TACE-Aktivitätsassays
unter Verwendung von modifizierter Pro-Kaspase-3 mit einer TACE-Erkennungssequenz
als Ziel nach Einfangen von TACE mit einem auf die Mikrotiterplatte
geschichteten spezifischen monoklonalen Antikörper.
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Die
Erfindung kann verwendet werden, um katalytisch aktive Proteasen
zu bestimmen, die an biotechnologisch oder (patho-)physiologisch
interessanten Prozessen beteiligt sind. "Bestimmung einer Protease" bedeutet sowohl
eine qualitative Analyse, d.h. der Nachweis des Vorhandenseins der
Protease, insbesondere ihrer Aktivität, als auch die quantitative
Analyse, d.h. die Quantifizierung der Proteaseaktivität, die in
einer Probe vorhanden ist.
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Beispiele
für interessante
Proteasen sind in Tabelle II zusammengestellt. Diese Tabelle umfasst
Proteasen mit etablierter klinischer oder biotechnologischer Relevanz,
sowie auch Proteasen, die basierend auf dem gegenwärtigen Wissensstand
an relevanten (patho-)physiologischen Prozessen beteiligt sein könnten. Die
Erfindung offenbart Verfahren, die geeignet sind, um Mitglieder
aller vier bekannten Protease-Familien (Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Metalloproteasen
und Aspartyl-Proteasen)
zu untersuchen. Im Gegensatz zu der bestehenden Technologie offenbart
die Erfindung Verfahren, um Proteasen mit einer beliebigen Zielerkennungssequenz
zu untersuchen. In zahlreichen Fällen
treten Proteasen in biologischen Flüssigkeiten nicht in der katalytisch
aktiven Form auf, sondern in einer inaktiven Zymogen-Form oder Proenzym-Form.
In solchen Fällen
ist vor der Messung die Umwandlung in die aktive Form erforderlich.
Abhängig
von dem Zymogen kann die Umwandlung in eine aktive Protease durch
einen beschränkten
proteolytischen Verdau, durch Behandlung mit bestimmten Chemikalien
oder durch milde Denaturierung durch Anwendung von Hitze oder z.B.
Natriumdodecylsulfat, erreicht werden. Verfahren, die auf dieser
Erfindung basieren, können
sehr sensitiv und spezifisch sein, und sie können problemlos unter Verwendung
einer allgemein verfügbaren
Labor-Ausrüstung
für die
Automatisierung angepasst werden. Die Erfindung scheint am besten
im Bereich der Biotechnologie, in Forschungslaboratorien zur tierischen
oder menschlichen Gesundheit und in Krankenhäusern und klinischen Laboratorien
und in pharmazeutischen Forschungslaboratorien einsetzbar zu sein.
Andere Anwendungen können
bei der Qualitätskontrolle
in der pharmazeutischen oder nahrungsmittelverarbeitenden Industrie
sein.
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Die
Erfindung verwendet ein Proenzym, welches durch ein oder mehrere
spezifische proteolytische Ereignisse in ein aktives Enzym umgewandelt
werden kann, als Zielsubstrat für
die zu untersuchende Protease, und anschließend wird die Aktivität des aktiven
Enzyms unter Verwendung einer im Stand der Technik bekannten Technologie
nachgewiesen (2). Die Erfindung betrifft insbesondere
die Auswahl des Proenzyms. Obwohl zahlreiche Proenzyme als Ausgangspunkt
für die
Modifikation und Entwicklung eines Assays für eine bestimmte Protease ausgewählt werden
können,
weisen die meisten Proenzyme bestimmte Beschränkungen hinsichtlich der Sequenz
auf, die modifiziert werden kann, und somit hinsichtlich der Proteasen,
die gemessen werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschreiben wir ein verbessertes
Verfahren, das auf einer bestimmten Gruppe von Proenzymen basiert,
welche diese Beschränkungen
nicht aufweisen, wodurch die Entwicklung eines Assays für nahezu
eine beliebige Protease unabhängig
von deren Substratpräferenzen ermöglicht wird.
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Die
gegenwärtige
Methodik basiert im Wesentlichen auf Proenzymen, die zur Familie
der Serin-Proteasen gehören,
obwohl sie sicherlich nicht auf diese Familie beschränkt ist.
Die Aktivierungserkennungsstellen der meisten bekannten Proteasen
aus der Familie der Serin-Proteasen zeigen eine gewisse Ähnlichkeit.
Obwohl die Sequenz an der N-terminalen Seite der Aktivierungsstelle
sehr variabel ist, weist die Sequenz auf der C-terminalen Seite
der Aktivierungsstelle in einer großen Vielzahl von Proenzymen,
die zur Familie der Serin-Proteasen gehören, einen hohen Grad an Ähnlichkeit
auf (Tabelle III). Es scheint, dass geladene Aminosäurereste
an den Positionen P1' oder
P2' nicht toleriert
werden. Des Weiteren scheint es eine starke Präferenz für aliphatische Aminosäureseitenketten
zu geben, da an diesen Positionen bei einer Vielzahl von Serin-Proteasen fast ausschließlich Ile-,
Val-, Leu- oder Ala-Reste vorkommen. Ferner scheint es an den Positionen
P3' und P4' eine starke Einschränkung hinsichtlich
der Sequenzvielfalt mit einer starken Präferenz für kleine ungeladene Aminosäurereste
wie Gly zu geben. Die Einschränkung
hinsichtlich der Sequenz scheint eng mit dem Aktivierungsmechanismus
in dieser Familie von Proenzymen gekoppelt zu sein.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart, dass modifizierte Pro-Kapasen ideale Kandidaten
zur Verwendung als Ziel-Substrate für Proteasen sind. Pro-Kaspasen
bilden eine Familie von Cystein-Protease-Proenzymen, die an der
Apoptose beteiligt sind, dem regulierten Zelltod (5).
Die Kaspasen bilden eine Kaskade, in der eine aktive Kaspase eine
(andere) Pro-Kaspase aktivieren kann, was zu einer Kettenreaktion
in der Zelle führt,
und im Zelltod resultiert. Des Weiteren zeigen zahlreiche Kaspasen
eine autokatalytische Aktivierung ihrer Proenzym-Form. Kaspasen sind sehr spezifische
Proteasen. Sie erkennen Sequenzen mit mehreren negativ geladenen
Aminosäureresten
wie Glu oder Asp und spalten C-terminal von solchen Sequenzen. Typische
Erkennungssequenzen innerhalb der Kaspase-Familie sind in Tabelle
IV zusammengefasst. Jedes Mitglied der Kaspase-Familie hat eine bestimmte Präferenz für eine bestimmte
Sequenz, obwohl es ein beträchtliches Überlappen
mit der Substratsequenz von anderen Kaspasen gibt. Die Aktivierungssequenz
zahlreicher (wenn nicht aller) Pro-Kaspasen ist eine Sequenz, die
selbst von einer oder von mehreren aktiven Kaspasen gespalten werden
kann. Wegen ihrer Beteiligung an der Apoptose, einem Vorgang der
wahrscheinlich an zahlreichen Erkrankungen wie beispielsweise Krebs
beteiligt ist, sind eine große
Vielzahl von Peptidsubstraten, die von Kaspasen spaltbar sind und
die zur Freisetzung einer gefärbten
oder fluoreszenten Gruppe führen,
entwickelt worden und diese sind kommerziell verfügbar (Tabelle
V).
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird offenbart, dass die Einbringung
einer neuen, nicht natürlich
vorkommenden Zielspaltungsstelle für eine Protease, die untersucht
werden soll, in den normalen Aktivierungsbereich einer Pro-Kaspase
zu einer modifizierten Pro-Kaspase führt, die von der gewählten Protease
gespalten und aktiviert werden kann. Somit sind solche modifizierten
Pro-Kaspasen ideal für
die Verwendung als Nachweisenzyme zur Entwicklung von Assays für eine Vielzahl
von Proteasen geeignet. Es wird ferner gezeigt, dass die neuen nicht
natürlich
vorkommenden Spaltungsstelle so gewählt werden können, dass
sie beträchtlich
hinsichtlich ihrer Länge
und ihrer tatsächlichen
Aminosäuresequenz
variieren, ohne die Einschränkungen,
wie sie für
Serin-Proteasen im Stand der Technik gefunden wurden. Es wird jedoch
angemerkt, dass weiterhin Sorge dafür getragen werden muss, dass
die modifizierte Pro-Kaspase
in der Lage ist, in eine aktive Kaspase aktiviert zu werden, welche
in der Lage ist, ihre normale proteolytische Aktivität auszuüben. Die
Bestimmung, ob die Modifikationen die Funktion der Kaspase intakt
lassen, liegen im Bereich des Könnens
des Fachmanns.
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Die
vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren modifizierte Pro-Kaspasen,
die verwendet werden können,
um Proteasen nachzuweisen, die mit der bisherigen Methodik nicht
oder nur mit großen
Schwierigkeiten oder mit geringer Effizienz nachweisbar waren. Vorzugsweise
ist die Modifikation der Pro-Kaspase derart, dass die normale Aktivierungsreaktion,
beispielsweise durch andere Mitglieder der Kaspase-Familie oder durch
Auto-Aktivierung
verhindert wird. Dies kann erreicht werden, indem man die normale
Aktivierungssequenz verändert
oder sogar vollständig
entfernt. Die neue Ziel-Aktivierungssequenz, die von der gewählten Protease
erkannt und gespalten werden kann, kann die normale Aktivierungssequenz
ersetzen, sie kann jedoch auch anderweitig in die Sequenz der Pro-Kaspase
eingebracht werden. Die Stelle für
die Einbringung einer Ziel-Sequenz ist nicht entscheidend, obwohl
dafür gesorgt
werden sollte, dass die Spaltung der modifizierten Pro-Kaspase weiterhin
zur Bildung einer aktiven Kaspase führt. Die Überprüfung, ob eine solche Aktivität beibehalten
wird, und die Anpassung der Insertionsstelle liegen wiederum im
Bereich des Könnens
des Fachmanns.
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Neben
den Modifikationen um die Aktivierungsstelle können weitere sekundäre Modifikationen
eingebracht werden, die sich auf die Verbesserung der Eigenschaften
der Pro-Kaspase oder der nach der Aktivierung gebildeten Kaspase
für die
bestimmte Anwendung richten. Nützliche
sekundäre
Modifikationen umfassen: Modifikationen, die die (thermale) Stabilität der Pro-Kaspase
oder der aktivierten Kaspase erhöhen,
die Resistenz gegenüber
anderen Nicht-Ziel-Proteasen verleihen, die Resistenz gegenüber natürlich vorkommenden
oder synthetischen Inhibitoren verleihen, die Reaktivität gegenüber Antikörpern oder
Liganden verleihen, die bei der Expression und/oder Aufreinigung
helfen oder Veränderungen,
die die Aktivität
der aktivierten Formen erhöhen
oder die Aktivität
der Pro-Form verringern. Im Allgemeinen (jedoch nicht immer) werden
solche sekundären
Modifikationen in einem anderen Teil der Kaspase liegen, und nicht
in der Nähe
der Aktivierungsstelle. Es ist ferner möglich, mehr als eine neue Aktivierungsstelle
einzubringen, was dann zu einem Zielsubstrat führt, das für eine Vielzahl von Proteasen
mit unterschiedlicher Substratspezifität verwendet werden kann.
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Zahlreiche
Mitglieder der Kaspase-Familie sind potentiell für eine Modifikation geeignet,
die als Ziel für eine
Protease verwendet werden kann. Insbesondere Kaspase-3 und Kaspase-7
sind sehr geeignet, da diese zwei Kaspasen sehr stabil und leicht
durch bestehende Methoden herzustellen sind. Es scheint darüber hinaus,
dass die Aktivierung von Pro-Kaspase-3 und Pro-Kaspase-7 entscheidend
von der proteolytischen Spaltung in der Aktivierungsregion abhängt. Darüber hinaus
gibt es sehr wirksame Substrate für diese Kaspasen (Tabelle V).
Zum Nachweis der Kaspase-Aktivität
sollten diese Substrate Aminosäuresequenzen
aufweisen, die von der Kaspase, welche in dem Test verwendet wird
(Tabelle V zeigt mehrere bekannte Sequenzen und die erkennenden
Kaspasen), erkannt und gespalten werden. Am stärksten bevorzugt ist die Verwendung
der Aminosäuresequenz
DEVD (asp-glu-val-asp). Darüber
hinaus sollte das gespaltene Substrat ein Signal für die Detektion
ergeben. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem para-Nitroanilid,
7-Amino-4-trifluormethylcumarin,
Aminomethylcumarin oder eine beliebige andere Verbindung, die Farbe,
Fluoreszenz oder Lumineszenz erzeugt, direkt an den C-Terminus der
Peptidsequenz geknüpft
wird, welche durch die Kaspase erkannt wird. Dann werden diese Verbindungen
als Ergebnis der Wirkung der Kaspase in die Testlösung freigesetzt,
und das Vorhandensein dieser Verbindungen kann quantitativ nachgewiesen
werden, z.B. durch Spektrophotometrie, Fluorimetrie oder Luminometrie.
Andere Ausführungsformen,
die zu einem qualitativen oder quantitativen Signal nach Spaltung
durch die Kaspase führen,
sind im Stand der Technik bekannt und können problemlos vom Fachmann
in den erfindungsgemäßen Assay
eingebaut werden. Solche Ausführungsformen können beispielsweise
Antikörper
verwenden, die spezifisch die aktive Form der Kaspase erkennen,
sowie zelluläre
Assays zum Nachweis der Kaspasewirkung.
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Um
eine neue Aminosäuresequenz,
die eine neue erwünschte
Zielspezifität
für eine
Protease verleiht, in eine bestehende Pro-Kaspase einzubringen,
kann der Fachmann mehrere ihm bekannte Methoden anwenden. Insbesondere
die rekombinante DNA-Technologie
scheint eine attraktive Option zu sein. Eine cDNA-Sequenz, die für eine bestimmte
Pro-Kaspase kodiert, muss ver fügbar
sein. Solche Sequenzen sind bekannt und können aus öffentlich zugänglichen
Datenbanken erhalten werden. Eine solche cDNA-Sequenz kann anhand von
bestehender Technologie erhalten werden, beispielsweise ausgehend
von mRNA, die aus einer geeigneten Zelllinie oder aus einem Gewebe
isoliert wurde, durch reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung von Primern, die mit Hilfe der bekannten Sequenz erstellt
wurden. Zahlreiche alternative Verfahren sind im Stand der Technik
bekannt, um eine spezifische cDNA-Sequenz zu erhalten. Die kodierende Sequenz
kann angepasst werden, um die spätere
Expression in Protein zu verbessern, und, um das spätere Einbringen
von Veränderungen
zu ermöglichen,
die auf eine Veränderung
der Aktivierungsspezifität
der resultierenden Pro-Kaspase
nach der Expression gerichtet sind. Ferner müssen ein geeigneter Promotor
und andere regulatorische Sequenzen zugefügt werden, wie es im Stand
der Technik bekannt ist. Die kodierende Sequenz oder die veränderte kodierende
Sequenz wird in einen Vektor, wie beispielsweise in ein Plasmid
oder in einen Virus, eingebracht, um das Einschleusen in ein Zellsystem
für die
Expression zu ermöglichen.
Die Expression kann im Allgemeinen in einem eukaryotischen Tierzell-Expressionssystem
oder in einem Hefe-Expressionssystem oder in prokaryontischen bakteriellen
Expressionssystemen durchgeführt
werden. Diese Systeme sind im Stand der Technik bekannt und in vielen
Fällen
in kommerzieller Form verfügbar.
Nach dem Expressionsschritt sind im Allgemeinen Verfahren zur Freisetzung
des exprimierten Proteins aus den Zellen oder zur Isolierung desselben
aus dem Kulturmedium erforderlich. Sehr wahrscheinlich wird eine
weitere Aufreinigung des exprimierten Proteins erforderlich sein.
Zahlreiche Verfahren für
diese Schritte sind im Stand der Technik bekannt.
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Wenn
ein Expressionsplasmid konstruiert wird, das die natürliche unmodifizierte
kodierende Sequenz einer Pro-Kaspase enthält, können geeignete Modifikationen
durch ein beliebiges be kanntes Verfahren der zielgerichteten Mutagenese
oder durch neuere Verfahren, die eine Polymerasekettenreaktion umfassen,
zugefügt
werden. Um die Konstruktion einer großen Vielzahl von verschiedenen
kodierenden Sequenzen zu erleichtern, die sich hinsichtlich der
Sequenz unterscheiden, welche für
die neue Aktivierungsstelle in dem exprimierten Protein kodiert,
könnte
es praktisch sein, einige weitere Veränderungen in die kodierende
Sequenz einzubringen, die zu neuen Restriktionsstellen führen, welche
verwendet werden können,
um auf einfache und schnelle Weise durch Einbringen von synthetischen
Oligonukleotiden zwischen diesen Restriktionsstellen zahlreiche
verschiedene Modifikationen in die Aktivierungsstelle einzubringen.
Diese zusätzlichen
Veränderungen
können
entweder sogenannte stille Mutationen sein, welche die Aminosäuresequenz
nicht verändern, oder
es können
Veränderungen
sein, welche die Proteinsequenz verändern, jedoch keine nachteiligen
Wirkungen auf die Funktion des Proteins haben. Ein weiterer Vorteil
dieser Vorgehensweise, bei der neue Restriktionsschnittstellen eingebracht
und anschließend
Oligos eingesetzt werden, ist die geringere Möglichkeit für unerwünschte Sekundärmutationen,
die während
der Verfahren, die auf einer Polymerasekettenreaktion beruhen, auftreten
können.
Auf die gleiche Weise können
weitere Modifikationen eingebracht werden, um die Eigenschaften
der Pro-Kaspase zu verbessern. Eine solche modifizierte Pro-Kaspase kann Teil
eines Assay-Kits sein, das alle notwendigen Materialien enthält, um eine
oder mehrere Bestimmungen durchzuführen. Üblicherweise enthält ein solches
Kit Behälter
mit ausreichenden Mengen der modifizierten Pro-Kaspase, ein geeignetes
Substrat, um die Kaspase-Aktivität
nachzuweisen, eine geeignete Standardpräparation, um die zu messende
Protease zu quantifizieren, sowie Materialien zur Herstellung von
Pufferlösungen.
Darüber
hinaus kann ein Kit auch spezifische Antikörper enthalten, welche die
zu untersuchende Protease erkennen, um die Spezifität des Assays
durch spezifisches Quenching der Aktivität einer spezifischen Protease,
einer interferie renden Protease oder durch spezifische Bindung einer
Protease. Ein Kit kann darüber
hinaus eine oder mehrere Assay-Platten enthalten, z.B. im üblichen
Format mit 96 Vertiefungen, mit 384 Vertiefungen oder mit 1536 Vertiefungen.
Es könnte
vorteilhaft sein, stabilisierende Mittel zu der modifizierten Pro-Kaspase
zu geben, um die Stabilität
während
des Transports und der Lagerung zu erhöhen. Solche stabilisierenden
Mittel können
andere Proteine, wie beispielsweise Albumin oder Gelatine, Kohlenhydrate,
wie beispielsweise Mannitol, Antioxidantien, Tenside oder andere
organische Chemikalien sein. Des Weiteren können anorganische Salze ebenfalls vorteilhafte
Wirkungen auf die Stabilität
haben. Praktischerweise ist die Pro-Kaspase in lyophilisierter Form vorhanden
und muss durch Zusatz von Puffer oder Wasser kurz vor der Benutzung
hergestellt werden. Darüber
hinaus wird eine Beschreibung zugefügt, die angibt, wie die Nachweisreaktion
durchzuführen
ist, wie die Proben herzustellen sind, und wie die Aktivität zu berechnen
ist. Andere Möglichkeiten
zur Erhöhung
der Spezifität,
die im Stand der Technik bekannt ist, besteht darin, ein Immun-"Einfang"-Verfahren anzuwenden: zunächst wird
die zu messende Protease unter Verwendung eines spezifischen, immobilisierten
(monoklonalen oder polyklonalen) Antikörpers eingefangen, und es folgt
die Messung der Aktivität
der eingefangenen Protease. Alternativ dazu kann ein Kit oder eine
Vorrichtung vom Messstäbchen
(dipstick)-Typ sein, bei dem alle notwendigen Reagenzien einer trockenen
Form auf einem Streifen oder auf einem Punkt des Materials immobilisiert
sind. Die nachfolgenden Beispiele sind lediglich Veranschaulichungen
der Erfindung und schränken
die Verwendbarkeit oder den Bereich der Erfindung nicht ein.
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Beispiele
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Beispiel 1: Einschränkungen von Proenzymen von
Serin-Proteasen als Nachweisenzym
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In
diesem Beispiel werden die Einschränkungen bei Verwendung von
Proenzymen aus der Familie der Serin-Proteasen als Nachweisenzym
gezeigt. Proenzyme aus der Familie der Serin-Proteasen, wie beispielsweise Pro-Urokinase,
haben eine Vielzahl von geeigneten Eigenschaften für eine Verwendung
als Nachweisenzyme zur Messung der Aktivität von Proteasen: Die aktive
Form der Serin-Proteasen wird problemlos mit chromogenen oder fluorogenen
Peptidsubstraten gemessen; der Unterschied hinsichtlich der Aktivität zwischen
Proenzym und aktivem Enzym ist im Allgemeinen hoch; die Enzyme sind
im Allgemeinen stabil und können
sehr spezifisch sein. Ein wesentlicher Nachteil der Verwendung von
Mitgliedern aus der Familie der Serin-Proteasen als Nachweisenzyme
sind die Sequenzeinschränkungen
im C-terminalen Teil der Aktivierungssequenz. Der neu gebildete
N-Terminus, der aus der Spaltung der Aktivierungssequenz resultiert,
spielt eine wichtige Rolle bei der Erzeugung des aktiven Enzyms.
Ein Vergleich dieser Sequenzen aus mehreren Mitgliedern der Familie
der Serin-Proteasen (Tabelle II) zeigt eine starke Homologie in
dieser Region, was auf eine Beteiligung in der Funktion hindeutet.
Die Flexibilität
hinsichtlich der Sequenz in dieser Region wurde bei der Pro-Urokinase
ausführlicher
untersucht. Die vollständige
cDNA, die für
die humane Pro-Urokinase kodiert, wurde in einen Expressionsvektor
kloniert, der die Expression des Proteins in eukaryotischen Zellen
ermöglicht (
EP 691 409 ). Mittels Polymerasekettenreaktion
unter Verwendung der Primer 5'-ACC
ATC GAt AAC CAG CCC TGG-3' und
5'-CCG CCT cga gGT
CTT TTG GCC-3' (Mutationen
sind als Kleinbuchstaben gezeigt) wurden die beiden neuen, einzeln
vorkommenden Restriktionsschnittstellen ClaI und XhoI eingebracht,
welche den Bereich flankieren, der für die Aktivierungsstelle kodiert.
Der resultierende Plasmidvektor wurde verwendet, um eine Vielzahl
von für
Pro-Urokinase kodierende Sequenzen zu konstruieren, die für Pro-Urokinase-Moleküle mit verschiedenen
Aktivierungsstellen kodierten, indem das Plasmid mit ClaI und XhoI
geschnitten wurde und zwei partiell komplementäre Oligonukleotide, welche
für die
erforderliche mutierte Aminosäuresequenz kodierten,
eingebracht und ligiert wurden. Die Oligonukleotidpaare, die für die Konstruktion
der verschiedenen Expressionsplasmide verwendet wurden, sind in
Tabelle VI zusammengefasst. Die neu konstruierten Plasmide wurden
in CHO-Zellen transfiziert, und das Medium der transient transfizierten
Zellen wurde gesammelt. Die Konzentrationen der Pro-Urokinase-Varianten
in den konditionierten Medien wurde durch eine ELISA bestimmt, der
die Proteasedomäne
des Moleküls
erkannte, wodurch eine ähnliche
Reaktion für
alle Varianten sichergestellt wurde. Die Pro-Urokinase-Varianten
wurden auf einer Platte "immun-eingefangen" (immuno-captured),
die mit Antikörpern
beschichtet war, welche sowohl Pro-Urokinase als auch aktive Urokinase
erkennen und die Aktivität
der letztgenannten nicht inhibieren und die Umwandlung der Proenzym-Form
in die aktive Form nicht stören.
Anschließend
wurden die Pro-Urokinase-Varianten mit Plasmin aktiviert, und nach
Waschen der Platte wurde die resultierende Urokinase-Aktivität durch
Zugabe von Puffer und pyro-Glu-Gly-Arg-pNA (S2444, ein kommerziell
erhältliches
Urokinase-Substrat) bestimmt. Die Ergebnisse, die in
6 zusammengefasst
sind, zeigen, dass ein Ile-, Leu- oder Val-Rest an der Position
P1' wichtig ist.
An der Position P2' besteht ferner
eine starke Präferenz
für aliphatische
Reste, wobei andere Reste toleriert werden, obwohl dies zu einer stark
verringerten Aktivität
führt.
Das Vorhandensein von Gly an Position P3' und P4' scheint entscheidend zu sein. Aus diesen
Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die Möglichkeit zur Veränderung
in der Sequenz P1'-P4' sehr begrenzt ist,
was es unmöglich
macht, Pro-Urokinase und andere Mitglieder aus der Familie der Serin- Proteasen als Nachweisenzyme
für solche
Proteasen zu verwenden, die eine Erkennungssequenz aufweisen, welche
bei Verwendung der direkten Aktivierungsmethode nicht mit den oben
genannten Einschränkungen
im Bereich P1'-P4' kompatibel ist.
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Beispiel 2: Herstellung von modifizierter
Pro-Kaspase-3 mit Aggrecanase- oder TACE-spezfischer Spaltungsstelle.
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Es
wurde von der ATCC eine für
Kaspase-3 kodierende cDNA erhalten, die kloniert in einem Expressionsvektor
vorlag, welcher eine für
einen His-Anhang (His-tag) kodierende Sequenz aufwies, die eine
schnelle Aufreinigung unter Verwendung von Ni-Chelat-Chromatographie
ermöglichte,
sowie regulatorische Sequenzen, die eine Expression in E. coli ermöglichten.
Dieses Plasmid wurde als Basis für
die Konstruktion von ähnlichen
Plasmiden verwendet, die für
eine Vielzahl von Kaspase-3-Varianten
mit Modifikationen in ihrer Aktivierungssequenz kodierten. Um die
schnelle Konstruktion von Varianten zu ermöglichen, wurden zwei neue stille Restriktionsschnittstellen
durch PCR eingebracht (7a). Nach einem Verdau mit BamHI
und EcoRI kann eine neue kodierende Sequenz unter Verwendung von
zwei Oligonukleotiden eingebracht werden. Um die Tauglichkeit von
Kaspase-3 als Nachweisenzym zu untersuchen, wurden zwei verschiedene
Sequenzen eingebracht, die für
eine Aktivierungssequenz für
Aggrecanase (ADAMTS-4) bzw. für
TNFα-umwandelndes Enzym
(TACE/ADAM 17) kodierten, wobei geeignete Oligonukleotide verwendet
wurden (7b und Tabelle VII). Sowohl
Aggrecanase als auch TACE konnten bei Verwendung eines Substrates,
das von einer Pro-Urokinase abgeleitet war, nicht oder nur in sehr
geringem Ausmaß gemessen
werden. Die resultierenden Plasmide wurden verwendet, um E. coli
(Stamm B121 (DE3) pLys) zu transformieren. Die Kulturen wurden bis
zu einer OD von 0,45 bis 0,7 angezüchtet, auf 30°C abgekühlt und
mit 1 mM IPTG induziert. Nach 45 Minuten Schütteln bei 30°C wurden
die Zellen zentrifugiert (10 Minuten, 6000 UpM (ca. 5000 × g) bei
4°C) und
entweder direkt verwendet oder bei –20°C eingefroren gelagert. Die
Bakterien-Pellets wurden mit Lysepuffer (50 mM Tris HCl pH 8,0,
300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) und BugbusterTM (Novagen)
gemischt, und bei 4°C
inkubiert, wobei für
30 Minuten gerührt
und bei 6000 UpM (ca. 5000 × g)
für 10
Minuten bei 4°C
zentrifugiert wurde.
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Der Überstand
wurde auf eine Nickel-Sepharose (Amersham Biosciences)-Säule aufgetragen
(2 ml Säulenvolumen
für 30-50 ml des ursprünglichen
Kulturvolumen) und anschließend
mit 20 Säulenvolumen
50 mM Tris HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol gewaschen (Waschpuffer)
und mit Elutionspuffer (50 mM Tris HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 250
mM Imidazol) eluiert. Die Peakfraktionen wurden unter Verwendung
einer PD-10-Säule
(Amersham Biosciences) entsalzt, die mit 10 mM Tris HCl pH 7,0,
1,5 mM NaCl, 0,01 % (v/v) BRIJ 35-Puffer äquilibriert worden war (8).
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Beispiel 3: Herstellung von modifizierter
Pro-Kaspase-7.
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Wie
es sinngemäß für die Pro-Kaspase-3
in Beispiel 2 beschrieben ist, wurden cDNA und Expressionsvektoren
konstruiert, die für
Varianten der Pro-Kaspase-7 kodierten und Sequenzen enthielten,
die für Pro-Kaspase-7-Varianten
mit Aktivierungssequenzen für
TACE und Aggrecanase kodierten. Die Oligonukleotide zur Einbringung
der neuen Aktivierungssequenzen waren exakt dieselben, die für die Pro-Kaspase-3-Varianten
verwendet wurden (siehe Tabelle VII).
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Die
Transformation, Expression und Aufreinigung der Pro-Kaspase-7-Varianten
wurde wie für
die Pro-Kaspase-3-Varianten in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
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Beispiel 4: Charakterisierung von modifizierten
Pro-Kaspasen
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Die
Gelelektrophorese zeigte, dass alle Kaspase-Varianten vornehmlich
in der einzelkettigen Form von 32 kD vorlagen (9).
Die Kaspase-Aktivität
wurde wie folgt gemessen: 10 μl
(1-100 ng) gereinigte modifizierte Kaspase-3 oder Kaspase-7 mit
einer Aggrecanase- oder TACE-spezifischen Spaltungsstelle (siehe Beispiel
2 und Tabelle VII) wurden mit 60 ml Assaypuffer (50 mM Tris HCl
pH 7,6, 1,5 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2, 0,01 % (v/v) BRIJ 35) und 10 μl gereinigte
Aggrecanase (ADAMTS-4) oder TACE (ADAM-17) gemischt.
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Nach
einer Inkubation über
Nacht bei Raumtemperatur wurden 10 μl 100 mM DTT und 10 μl 8 mM DEVD-pNA
(BioSource) zugegeben, und die A405 wurde nach 0 bis 6 Stunden Inkubation
bei 37°C
in einer Feuchtigkeitskammer gemessen. Die Assays wurden in Polystyrol-Flachboden-Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen durchgeführt,
und die Absorptionsmessungen wurden mit einem Titertek-MultiskanTM-Plattenlesegerät durchgeführt. Es wurde eine geringe
Hintergrundaktivität
bei den Pro-Kaspase-3-Varianten und den Pro-Kaspase-7-Varianten
nachgewiesen, die sehr wahrscheinlich durch das Vorhandensein geringer
Mengen von kontaminierenden aktiven Formen verursacht wurde. Bei
Inkubation der verschiedenen Pro-Kaspase-Varianten mit ihren entsprechenden
Zielenzymen konnte eine klare Steigerung der Kaspase-Aktivität beobachtet
werden.
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Beispiel 5: Bestimmung der Aggrecanase-Aktivität unter
Verwendung modifizierter Pro-Kaspasen
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Protokoll
zum Nachweis der Aggrecanase-Aktivität unter Verwendung von Pro-Kaspase-3-
oder Pro-Kaspase-7-Varianten mit einer Aggrecanase-spaltbaren Aktivierungssequenz
(siehe Beispiel 2 und Tabelle VII). Der Nachweis wird in zwei Schritten
durchgeführt;
im ersten Schritt wird die Pro-Kaspase-Variante mit ihrem Zielenzym
inkubiert, und im zweiten Schritt wird die Menge der Pro-Kaspase-Variante,
die in die aktive Kaspase-Variante umgewandelt wurde, durch Inkubation
mit einem Kaspase-Substrat nachgewiesen.
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Die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit
10 μl (1-100
ng) Pro-Kaspase-3- oder Pro-Kaspase-7-Variante und 60 μl Assaypuffer (50 mM Tris HCl,
1,5 mM NaCl, 0,5 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2, 0,01 % (v/v) BRIJ35) gefüllt. 10 μl Aggrecanase,
die wie angegeben in Assaypuffer verdünnt war, wurden zugesetzt.
Nach Inkubation bei 37°C über Nacht
wurden 10 μl
100 mM DTT und 10 μl
8 mM DEVD-pNA (BioSource) in Wasser zugegeben. Die Platte wurde
bei 37°C
in einer Feuchtigkeitskammer für
0 bis 6 Stunden inkubiert, und die A405 wurde in regulären Intervallen
unter Verwendung eines Titertek-MultiskanTM-Plattenlesegeräts gemessen. Für jede Enzym-Konzentration
wurde die Veränderung
der Absorption gegen die Inkubationszeit aufgetragen (10a). Die Steigungen dieser Kurven wurden gegen
die Aggrecanase-Konzentration aufgetragen (10b).
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Beispiel 6: Bestimmung der Aktivität des TNFα-umwandelnden
Enzyms unter Verwendung von modifizierten Pro-Kaspasen
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Ähnlich wie
für die
Aggrecanase (Beispiel 5) beschrieben, wurden geeignete Pro-Kaspase-3-
und Pro-Kaspase-7-Varianten mit gereinigtem TACE inkubiert, wobei
ein Protokoll verwendet wurde, das ähnlich war zu dem, das in Beispiel
5 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in den 11a, 11b gezeigt.
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Beispiel 7: Bestimmung von β-Amyloid-umwandelndem
Enzym (BACE-1) unter Verwendung von modifizierten Pro-Kaspasen
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Ähnlich wie
für Aggrecanase
und TACE beschrieben wurde eine Pro-Kaspase-3-variante erzeugt,
die eine Sequenz enthielt, die von einem β-Amyloid-umwandelndem Enzym
(BACE-1) spaltbar war (siehe Tabelle VII und 7a und 7b).
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10 μl gereinigte
modifizierte Kaspase-3 mit einer für BACE-1 spezifischen Spaltung
wurden mit 300 μl 10
mM Na-Acetat pH 5,1, 1,5 mM NaCl, 0,01 % (v/v) BRIJ35 und 10 μl BACE-1)-Enzym
gemischt. Nach einer Aktivierung über Nacht bei Raumtemperatur
wurden 10 μl
100 mM DTT, 10 μl
8 mM DEVD-pNA (BioSource) und 30 μl
100 mM Tris HCl pH 8,0, 1,5 mM NaCl, 0,01 % (v/v) BRIJ 35 zugesetzt,
und die A405 wurde in regulären
Intervallen nach 0 bis 6 Stunden Inkubation bei 37°C in einer
Feuchtigkeitskammer gemessen. Die Assays wurden in Polystyrol-Flachboden-Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen durchgeführt,
und die Absorptionsmessungen wurden mit einem Titertek-MultiskanTM-Plattenlesegerät durchgeführt.
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Die
Ergebnisse für
den Nachweis der BACE-1-Aktivität
sind in den 12a und 12b gezeigt.
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Beispiel 8: Immun-"Einfang"-Assay für TACE
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Für einige
Proteasen oder Anwendungen ist ein Immun-"Einfang"-Format
nützlich.
In einem solchen Format wird die nachzuweisende Protease, die im
Allgemeinen in einer biologischen Probe in geringer Konzentration
und in Gegenwart einer Vielzahl von störenden Verbindungen, wie beispielsweise
Salzen, anderen Proteasen, Proteaseinhibitoren, usw., vorliegt,
spezifisch aus der biologischen Probe entfernt, wobei beispielsweise
eine Mikrotiterplatte verwendet wird, die mit einem Antikörper be schichtet
ist, der die Zielprotease spezifisch erkennt und an diese bindet.
Nach Binden der Zielprotease an die Platte wird die Probe, welche
die störenden
Substanzen enthält,
entfernt, die Platte kann (sofern erforderlich) gewaschen werden,
und es kann eine eindeutig definierte Lösung aus gereinigten Komponenten
zugesetzt werden. Eine solche Vorgehensweise hat mehrere Vorteile
und wird regelmäßig für den Nachweis
von nahe verwandten Proteasen mit überlappender Substratspezifität verwendet,
wie beispielsweise bei der Familie der MMP-Proteasen.
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Eine
Mikrotiterplatte (Costar EIA/RIA, Flachboden, 8 Vertiefungen) wird über Nacht
bei 4°C
in Natriumcarbonatpuffer pH 9,6 mit 100 μl pro Vertiefung 10 μg/ml Ziege-Anti-Maus-IgG und 2 μg/ml monoklonalem Maus-Antikörper, der
TACE erkennt, beschichtet. Nach viermaligem Waschen mit 0,01 M Naphosphat
pH 7,0, 0,15 M NaCl, 0,05 % (v/v) wird die Platte als Immun-"Einfang"-Platte verwendet.
Proben, die TACE enthalten, werden in die Platte pipettiert und über Nacht
bei 4°C
inkubiert. Nach dem Einfangen wird die Platte geleert und gewaschen
und anschließend
mit 10 μl
(1-100 ng) Pro-Kaspase-3-Variante
mit TACE-Spaltungsstelle (siehe Tabelle VII) und 60 μl Assaypuffer
befüllt
und bei 37°C
für 2 Stunden
inkubiert. Anschließend
wird DEVD-pNA zugesetzt, und es wird erneut bei 37°C inkubiert;
die Absorption wird nach 0 bis 6 Stunden Inkubation gemessen. Eine
Auftragung der Absorption gegen die Inkubationszeit sowie der Absorption
gegen die TACE-Konzentration
ist in
13A,
13B gezeigt. Tabelle I: Protease-Klassen
| Name | EC-Nummer | Reste
des | aktiven
Z | entrums |
| Serin-Proteasen | 3.4.21 | Ser | His | Asp* |
| Cystein-Proteasen | 3.4.22 | Cys | His | Asp* |
| Asparagin-Proteasen | 3.4.23 | Asp | Asp | |
| Metalloproteasen | 2.4.24 | His | His | Me2+** |
- * Asp nicht immer vorhanden
- ** His-Rest an der Chelatierung eines Metallions beteiligt.
Metallion ist oftmals Zn2+
Tabelle II: Einige klinisch bedeutende
Proteasen | Protease | Beteiligt
an | Erkrankungen |
| Faktor
VIIa | Blutgerinnung | Blutung/Thrombolyse |
| Faktor
IXa | Blutgerinnung | Blutung/Thrombolyse |
| Faktor
Xa | Blutgerinnung | Blutung/Thrombolyse |
| APC | Blutgerinnung | Blutung/Thrombolyse |
| Thrombin | Blutgerinnung | Blutung/Thrombolyse |
| t-PA | Fibrinolyse/perizelluläre Proteolyse | |
| u-PA | Fibrinolyse/perizelluläre Proteolyse | Knochenabbau |
| Plasmin | Fibrinolyse/perizelluläre Proteolyse | Lungenemphysem |
| Trypsin | Verdau | Pankreatitis |
| Chymotrypsin | Verdau | Pankreatitis |
| Enterokinase | Verdau
() | Pankreatitis |
| Pepsin | Verdau | Pankreatitis |
| Cathepsin
B, H, D | Lysosomaler
Verdau | |
| Cathepsin
K | Lysosomaler
Verdau | Knochenabbau |
| Cathepsin
G | Lysosomaler
Verdau | Lungenemphysem |
| Cathepsin
L | Lysosomaler
Verdau | |
| Cathepsin
V | Lysosomaler
Verdau | |
| Cathepsin
S | Lysosomaler
Verdau | |
| Renin | Blutdruckregulation | Bluthochdruck |
| ACE | Blutdruckregulation | Bluthochdruck |
| MMPs | Invasion,
Gewebeneubildung | Krebs,
Arthritisentzündung |
| Elastase | Elastin-Abbau | Lungenemphysem |
| Cir | Komplement-Aktivierung | Entzündung |
| Cis | Komplement-Aktivierung | Entzündung |
| HIV-Protease | Virus-Zusammenbau | AIDS |
| Kaspasen | Apoptose | Krebs |
Tabelle III: Beispiele für Proenzyme
aus der Familie der Serin-Proteasen | Proenzym | Bei
Aktivierung gespaltene Bindung |
| | P4-P3-P2-P1 ↑ P'1-P'2-P'3-P'4 |
| Pro-Thrombin | Glu-Gly-Arg ↑ Ile-Val-Glu-Gly |
| Pro-Urokinase | Arg-Phe-Lys ↑ Ile-Ile-Gly-Gly |
| Trypsinogen | Asp-Asp-Lys ↑ Ile-Val-Gly-Gly |
| Chymotrypsinogen | Leu-Ser-Arg ↑ Ile-Val-Asn-Gly |
| Pro-Elastase | Val-Tyr-Arg ↑ Val-Val-Gly-Glu |
| Pro-Subtilisin | Ala-Gly-Lys ↑ Ser-Asn-Gly-Glu |
| Koagulationsfaktor
V | Gly-Ile-Arg ↑ Ser-Phe-Arg-Phe |
| Koagulationsfaktor
VII | Pro-Gln-Arg ↑ Ile-Val-Gly-Gly |
| Koagulationsfaktor
IX | Asp-Phe-Thr-Arg ↑ Val-Val-Gly-Gly |
| Koagulationsfaktor
X | Asn-Leu-Thr-Arg ↑ Ile-Val-Gly-Gly |
| Koagulationsfaktor
XII | Ser-Met-Thr-Arg ↑ Val-Val-Gly-Gly |
| Koagulationsfaktor
XI | Ile-Lys-Pro-Arg ↑ Ile-Val-Gly-Gly |
| Kallikrein | Thr-Ser-Thr-Arg ↑ Ile-Val-Gly-Gly |
| Plasminogen | Pro-Gly-Arg ↑ Val-Val-Gly-Gly |
| Cathepsin
G | Ala-Gly-Glu ↑ Ile-Ile-Gly-Gly |
-
Sequenzen
wurden aus der Datenbank SWISS-PROT, GenBank oder PIR erhalten.
-
Tabelle IV: Einige Substrat-Spaltungsstellen
für verschiedene
Kaspasen
| Bevorzugte
Sequenzen |
| Kaspase-1 | YEVD | ↑ | WEHD | ↑ | LEVD | ↑ | WVAD | ↑ |
| Kaspase-2 | VDVAD | ↑ | DEHD | ↑ | LDESD | ↑ | | |
| Kaspase-3 | IETD | ↑ | DMQC | ↑ | | | | |
| Kaspase-4 | LEVD | ↑ | WEHD | ↑ | LEHD | ↑ | WVAD | ↑ |
| Kaspase-5 | WEHD | ↑ | LEHD | ↑ | LEAD | ↑ | | |
| Kaspase-6 | VEID | ↑ | VEHD | ↑ | VKMD | ↑ | VNLD | ↑ |
| Kaspase-7 | DEVD | ↑ | | | | | | |
| Kaspase-8 | IETD | ↑ | LEID | ↑ | | | | |
| Kaspase-9 | LEHD | ↑ | VEHD | ↑ | | | | |
| Kaspase-10 | IEAD | ↑ | AEVD | ↑ | VEHD | ↑ | | |
Tabelle V: Peptidsubstrate zum Nachweis
der Kaspase-Aktivität
| Substrat | Bevorzugte
Kaspase |
| VAD-X | 1 |
| DEVD-X | 3,
6, 7, 8 |
| VEID-X | 6,
8 |
| IETD-X | 8,
9, 10 |
| WEHD-X | 1,
4, 5 |
| YVAD-X | 1,
4, 5 |
| VDVAD-X | 2 |
-
X
kann -pNA (para-Nitroanilid), -AFC (7-Amino-4-trifluormethylcumarin),
-AMC (Aminomethylcumarin) oder eine beliebige andere chromogene
oder fluorogene Abspaltungsgruppe sein.
-
Tabelle
VI: Oligonukleotide, die für
die Konstruktion der Pro-Urokinase-Varianten
verwendet wurden
-
Tabelle
VII: Oligonukleotidkassetten, die für die Konstruktion von Expressionsvektoren
für modifizierte
Kaspase verwendet wurden. Aggrecanase
(ADAM TS4)
-
TACE
(TNFα-umwandelndes
Enzym)
-
BACE
(β-Amyloid-umwandelndes
Enzym)
-
Die
dargestellten Oligonukleotidpaare wurden in Pro-Kaspase-3- oder Pro-Kaspase-7-Expressionsvektoren
ligiert, die mit BamHI und EcoRI verdaut worden waren, wodurch Expressionsvektoren
erhalten wurden, die für
Pro-Kaspase-Varianten mit Spaltungsstellen/Aktivierungsstellen für ADAMTS4,
TACE und BACE kodierten. Die Erkennungssequenzen der Proteine sind
in Fettdruck über
den Oligonukleotiden gezeigt, die Spaltungsstellen sind mit einem
^ angegeben. Siehe auch 7.